TWI330641B - Sugar chain asparagine derivatives - Google Patents

Description

1330641 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發月係關於糖鏈天冬酿胺衍生物、糖鏈天冬酿胺及 糖鏈與其製造法。 、 又，本發明系關於含岩藻糖之糖鏈天冬醯胺衍生物及 其製造方法。 【先前技術】 近年來，僅次於核酸（DNA )、蛋白質之第三個受注 目之鏈狀生命分子為，糖鏈分子。人體由約60兆個細胞所 成之大細胞社會，其全部細胞表面由糖鏈分子所蓋。 如ABO式血型由細胞表面之糖鏈之不同而決定。 糖鏈，含有關於細胞間之辨認及相 構成細胞社會之要點。該細胞社會之混 疾患、感染症、老化等。 互作用之機能，是 亂，導致癌、慢性 又，霍亂菌 侵入細胞後 如細胞癌化時可以看到糖鏈之結構變化 感病毒等，係根據與特定糖鏈辨認結合 感染而引起之。 口 之Η發：力此之解析’會帶來根據新原理之醫藥品或食; 二、預防疾病、貢獻於治療等、期待更廣之應用£ 糖從單糖之排列、結合方式.部位、鏈長.分咕 4相=高級結構等多樣性來看，與核酸或蛋白質々 與核酸或蛋由I。構而來之生物學上資t1 重要性’胃#種m雖然知道對糖鏈研究 因該結構之複雜性及多樣性，研究之推動與相 315343 6 133U041 又本1明提供，在非還原末端上含至少一種以上 之唾液酸或唾㈣衍生物之新穎糖鏈，及其製造方法。 本發明提供’由脂溶性保護基保護天冬醯胺之胺基氮 之糖鏈天冬醯胺之非還原末端側之N•乙醯基葡糖胺上，含 至少一個以上石藻糖之新穎糖鏈天冬醢胺衍生物、及其製 造方法。 【發明内容】 本發明係有關以下發明。 1.式（1)所示之含11至7糖之α2,3糖鏈天冬醯胺衍生物 及其製造法。

Rl\

[式中、R1及R2為’氫原子、與式（2)至（5)所表 示之基，可為相同或不同。但Rl及R2之一方必須為式（2 ) 所表示之基。] H0

315343 8 1330641

(a) R = F, Rr —OH. K" =OH

(b) R = OH. R' R" -OH

(c) R二OH、R’ =OH、R” =F

(d) R-OH, R' -〇H. R" =OH

⑷

2.式（6)所表示之含氟之具有11至7糖之α2,6糖鏈天冬 醯胺衍生物及其製造法。

(5> [式中、Rx及以為氫原子、式（7)所表示之基、或 式（3 )至（5)所表示之基。但Rx及RY之一方必須為式（7 ) 所表示之基。] 9 315343 1330641

R,R’，R”表示以下組合。

(a) R-F, R* =OH. R" =OH

(b) R = OH, R' =F* R*' =OH

(c) R = OH, R' =OH, R" =F 3.式（8)所表示之含11至7糖之a 2,3糖鏈天冬醯胺及其 製造法。

[式中、R1及R2為同上述之含義。] 4.式（9)所表示之含氟之具有11至7糖之α2,6糖鏈天冬 醯胺及其製造法。

[式中、Rx及RY為同上述之含義。] 5.式（10)所表示之含11至7糖之α2,3糖鏈及其製造法。 10 315343 1330641

OH η α) [式中、R1及R2為同上述之含義。] 6.式（11)所表示之含氟之具有11至7糖之α2,6糖鏈及 其製造法。 OH ^〇H iy . Wa

OH (1 [式中、Rx及RY為同上述之含義。] 7.式（22)所表示之含11糖之（α2,3) ( α2,6)糖鏈天冬 醯胺衍生物。

[式中、R1為式（2)所表示之基、Rx為下式（7)所 表示之基。]

R，R’，R”表示以下組合。

(a) R —F, R :〇H、R"= :0H ίο). R — OK, Rf r^>· -¾ »* =i·、 Λ = =OH (c) R = OH、 = 01-1， =F (d) R = OH, R, = OH, =OH 11 315343 1330641 引入苄基’得到糖鏈天冬醯胺衍生物混合物之步驟， (6)糖鏈天冬醯胺之製造方法，其包含 (a )含1種或2種以上糖鏈天冬醯胺之混合物中，在 含該糖鏈天冬醯胺中引入脂溶性保護基，得到糖鏈天冬醯 胺讨生物混合物之步驟、 (b)將該糖鏈天冬醯胺衍生物混合物或該糖鏈天冬醯 胺衍生物混合物中所含之糖鏈天冬醯胺衍生物，加水分解 後知到之混合物’用層析法分離各糖鏈天冬醯胺衍生物之 步驟、以及 (¢)除去步驟（b)中經分離之糖鏈天冬醯胺衍生物 之保護基’得到糖鏈天冬醯胺之步驟， (7) (6)之糖鏈天冬醯胺之製造方法，其復包含 (b) 在步驟（b)中經分離之糖鏈天冬醯胺衍生物， 用糖加水分解酶加水分解之步驟、 (c) 在步驟（c)中得到之糖鏈天冬醯胺，用糖加水 勿解酶加水分解之步驟， 述（6)或（7)之糖鏈天冬醯胺之製造方法， 其中3 1種或2種以上糖鏈天冬醯胺之混合物為，含下 化α物及/或該化合物中欠缺丨個以上糖殘基之 造方法，並中，日匕—liL , 、 中月曰〉谷性保護基為Fmoc基， (10)上述（6)至〔8κ 製造方牛 中任一項之糖鏈天冬酿胺 象、万法’其中，步驟（ )為，含1種或2種以上在非 315343 14 ^^0641 “非還原末端之糖殘基之糖鏈之化合物。本發明人，意外 發現以天然之糖蛋白質為起源之糖鏈，具體為在糖鏈天冬 酿胺之混合物所含之該糖鏈天冬醯胺中’引入脂溶性保護 基’將引入該保護基之糖鏈天冬醯胺衍生物之混合物，用 衆所周知之層析法，很容易分離各個糖鏈天冬醯胺衍生 物°根據該方法，可以配製大量之含各種結構之糖鏈天冬 酿胺衍生物。如’可以分離先前很難分離之結構類似之糖 鍵天冬醯胺衍生物、容易配製大量之該化合物。又，將得 到之糖鏈天冬醯胺衍生物為起源，如，依次用糖加水分解 酶除去糖殘基，可以合成各種糖鏈天冬醢胺衍生物。 如上述’根據在糖鏈天冬醯胺中引入脂溶性保護基之 付生物化，可以分離各個糖鏈天冬醯胺衍生物，但因引入 脂溶性保護基，糖鏈天冬醯胺衍生物全體之脂溶性提高， 如，因格外提高適合使用之逆相系統管柱之相互作用，使 能靈敏的反映糖鏈結構之差別，而能分離各個糖鏈天冬醯 胺衍生物。 ^再者，在先申請案中，根據除去得到之糖鏈天冬醯胺 衍生物之保護《，用Λ工之方法容易得到大量之各種糖鏈 天冬酿胺。 但上述先申請案中得到之糖鏈天冬醯胺衍生物、糖鏈 天冬酿胺及糖鏈全部為α2,6結合體。 又’上述先申請案中得到之糖鏈天冬酿胺衍生物、糖 鏈天冬酿胺及糖鏈全部為不結合岩藻糖之糖鏈天冬酿胺衍 315343 16 1330641 本發明可得到在上述先申請案中未揭示之α2,3結合 ::糖鏈天冬醯胺衍生物、糖鏈天冬醯胺及糖鏈、及α2 6 ”。〇體之含氟之新穎糖鏈天冬醯胺衍生物、糖鏈天冬醯胺 及糖鍵。 本發明還可以得到在上述先申請案中未揭示之岩藻糖 t δ體之糖鏈天冬醯胺衍生物。 下面，δ兒明有關α 2，3結合體和α 2,6結合體之不同 點。 。 α 2,3結合體、α 2,6結合體，表示與唾液酸和半乳糖 之、δ方式。前者為，唾液酸之2位之碳和、半乳糖之3 位之碳以α結合者，後者為’唾液酸之2位之碳和、半乳 糠之6位之碳以α結合者。此處與半乳糖結合之碳不同。 然而該不同點，如，在流感病毒♦，以在末端含唾液 酸之糖鏈為受體來辨認。但人和鳥之流感病毒中受體之特 異性不同。前者辨認，唾液酸在半乳糖上α 2,6結合之糖 鏈、後者辨認’唾液酸在半乳糖上α 2,3結合之糖鏈。根 據唾液酸·半乳糖之間之結合方式不同、再加上唾液酸之不 同’而了解完成了流感病毒宿主領域之界限之分派作用。 本發明係有關，在先申請案中未揭示之新穎糖鏈天冬 醯胺衍生物、糖鏈天冬醯胺及糖鏈、與其製造法。 關於本發明之方法’首先’起始化合物之脂溶性保護 基經保護之糖鏈天冬酿胺（9糖-Asn-Fmoc)，用唾液酸轉 移酶將唾液酸或唾液酸之衍生物轉移，將得到之脂溶性保 護基經保護之糖鏈天冬醯胺，用層析法分離，得到脂溶性 315343 17 1330641 根據上述操作，如’當保護基為Fmoc基時，可以將 式（12)'(13)'(17)、（18)、（22)'(23)之糖鏈天冬醯 胺衍生物’以單獨或混合物之形式得到。 再者’上述經分離之糖鏈天冬醯胺衍生物加水分解 後’可以有效地得到含所要求糖鏈結構之糖鏈天冬醯胺衍 生物。如，當糖鏈天冬醯胺衍生物分離時，限制混合物中 所含之糖鏈天冬醯胺衍生物之種類，大致分離出糖鏈天冬 醯胺衍生物，之後加水分解，如利用糖加水分解酶進行加 水分解’有效地得到含所要求糖鏈結構之糖鏈天冬醯胺衍 生物。加水分解可以和上述同樣進行。特別是從可以有效 地得到含所要求糖鏈結構之糖鏈天冬醯胺衍生物之觀點來 看，使用糖殘基之切斷方式為明確之糖加水分解酶進行加 水分解為佳。 如去半乳糖殘基之除去係將經加水分解之化合物溶解 於緩衝液（如，磷酸緩衝溶液、乙酸緩衝溶液、良好緩衝 溶液等）中，在衆所周知之條件下用半乳糖加水分解酶進 行半乳糖殘基之切斷反應而成之。又，加水分解之化合物 可以是各個單離之物質也可以是混合物。用於該反應之半 礼糖加水分解酶，使用市面上出售之衆所周知之外切型酶 (exo-euzyme)為佳。又，具同樣活性之物質的話，新單離 之轉’在基因工程學中研究製造之酶亦可。之後同上述， 將反應後得到之反應液（切斷糖殘基之糖鏈天冬醯胺衍生 物之混合物）用層析法，得到各糖鏈天冬酿胺衍生物。如 刀碓時用HPLC(ODS管柱、展開溶劑為5〇mM乙酸銨水溶 20 315343 1330641 液：乙腈=82 : 18)進行為佳。 N-乙醯基葡糖胺殘基之除去係將經加水分解之化合 物溶解於緩衝液（如，磷酸緩衝溶液、乙酸緩衝溶液、良 好緩衝溶液等）中，在衆所周知之條件下用N_乙醯基葡糖 胺加水分解酶進行N-乙醯基葡糖胺殘基之切斷反應而成 之又，也可以使用N-乙醯基己糖胺tase加水分解酶。加 水分解之化合物可以是各個單離之物質也可以是混合物。 用於该反應之各酶，使用市面上出售之衆所周知之外切型 酶為佳。又，具同樣活性之物質的話，新單離之酶，在基 因工私學中研究製造之酶為亦可。之後同上述，將反應後 件到之反應液（切斷糖殘基之糖鏈天冬醯胺衍生物之混合 物）用層析法’得到各糖鏈天冬醯胺彳m如分離時用 hplc(ods管柱、展開溶劑為5〇福乙酸銨水溶液甲醇 = 65: 35或50mM乙酸銨水溶液：乙腈=82: 18)進行為佳。 甘路醇殘基時之除去係將經加纟分解之化合物溶解於 緩衝液（>’磷酸緩衝溶液、乙酸緩衝溶液、良好緩衝溶 液等）中’在衆所周知之條件下用甘露醇加水分解酶進行 甘露醇殘基之切斷反應而成之^加水分解之化合物可以是 各個單離之物質也可n 人& m J 乂疋混5物。用於該反應之甘露醇加 水分解酶，使用市面上出隹之耷所 工33 來所周知之外切型酶為佳。 又’具同樣活性之物皙的·，雜gg Μ . 心柳貝扪活，新早離之酶，在基因工程學 中研究製造之酶亦可你I·、+- 衣&心興J j之後问上述，將反應後得到之反應 液 法 (切斷糖殘基之糖鏈天冬醯 ’得到各糖鏈天冬醯胺衍生 胺衍生物之混合物）用層析 物。如分離時用hplc(ods 315343 21 mi 结、展開溶㈣10至2罐K乙酸料緩衝溶液和乙 腈、或乙醇、或甲醇、或丁醇、或丙醇等具脂溶性之水溶 性有機溶劑適宜混合而A。該例子中展開溶劑為，5峰 乙酸銨水溶液：乙腈=82:18)進行為佳。 由此得到各糖鏈天冬醯胺衍生物後，根據轉移岩藻 糖:可以製造為本發明之脂溶性保護基之天冬酿胺之胺基 亂經保護之糖鍵天久酿胺之非、萝；S 士 , 八、醖胺之非還原末端側之N•乙醯基葡 糖胺中至少含1個以上岩萍嫌新 石凓糖·之新穎糖鏈天冬醯胺衍生 物。 岩藻糖可使用 之物質。 般用市面上出售之岩藻糖或化學合成 岩藻糖轉移酶為，一般之市面上出售者、天然者、根 據基因重組生産之物質，比轉移之岩藻糖之種類更適宜選 擇具體可列舉如，轉移糖鏈天冬酿胺之非還原末端側之 N-乙醯基葡糖胺中之岩蕩糖之酶之岩藻糖基轉移 V(F_syltransferase v)(人類重組物、血漿起源血清起 源礼汁起源、肝臟起源）等。又，用岩藻糖加水分解酶， 可根據PH調整等錯開平衡，轉矛多岩藻糖。 上述糖鏈天冬醯胺衍生物之層析法分離，可將適宜、 衆所周知之層析法’單獨或複數組合使用。 可列舉如，將得到之糖鏈天冬醯胺衍生物混合物用凝 膠過慮管柱層析法純化後’帛Ηριχ純化。用於Ηριχ之 官枉中逆相系列管柱為適宜，可列舉如，、phenyl系 列、腈基系列、陰離子交換系列之管柱、具體可列舉如， 22 315343 1330641

Pharmacia 公司製 MonoQ 管柱、Iatron 公司製 Iatro beads 嘗柱專刀離條件等可以參照適宜、衆所周知之條件而調 整。根據上述操作，可以從糖鏈天冬醯胺衍生物混合物中 知到所要求之各糖鏈天冬醯胺衍生物。 如上述’得到各糖鏈天冬醯胺衍生物後，用各種糖加 火刀解酶’將該衍生物進行加水分解，根據除去糖鏈之非 還原末端之糖殘基，如，可以將糖鏈末端之分岐結構不均 一之各樣之糖鏈天冬醯胺衍生物製得各種單一化合物之物 frfr __ " t 貝 用各種糖加水分解酶，改變加水分解之順序及其 種類，可以製造更多種類之糖鏈天冬醢胺衍生物。 根據習知之方法，得到含極限糖鏈結構之糖鏈天冬醯 胺何生物之分析規模，需要膨脹時間和成本但本發明， 不而要特殊裝置及試劑，使用慣用之凝膠過濾管柱、hplc s柱及、至少3種糖加水分解酶（如，半乳糖加水分解酶、 甘露醇加水分解酶、N_乙醯基葡糖胺加水分解酶）等，2 周門可以調製1克左右之含所要求之糖鏈結構之糖鏈天冬 醯胺衍生物。 根據上述操作，如，當保護基為Fmoc基時，可以將 式（丨4)至（16)、（19)至（21)之糖鏈天冬醯胺衍生物， 以單獨或混合物之形式得到。 本發明提供，可以得到大量之各種單離之糖鏈天冬醯 胺之糖鏈天冬酿胺製造方法。該方法為，繼續根據上述糖 :醯胺衍生物之製造方法之糖鏈天冬醯胺衍生物之製 坆步驟’ X ’包括從得到之糖鏈天冬醯胺衍生物中除去保 315343 23 1330641 護基之步驟。 從糖鏈天冬醯胺衍生物中除去保護基之步驟，可以根 據衆所周知之方法進行（如參照，Protecting groups in Organic chemistry,John Wiley & Sons INC.,New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)。如，當保護基為 Fmoc 基時， 在N，N-二甲基甲醯胺（DMF )中，糖鏈天冬酿胺衍生物中 加入嗎琳進行反應，可以除去Fmoc基。又，Boc基為以 弱酸反應可以除去。將保護基除去後，根據要求而使用適 宜、衆所周知之方法，如，凝膠過濾管柱、離子交換管柱 等之各種層析法或、HPLC之分離之方法純化，得到糖鏈 天冬醯胺。 根據上述操作，如’將式（8)、（9)之糖鏈天冬醯胺， 以單獨或混合物之形式得到。 本發明提供’可以得到大量之各種單離之糖鏈之糖鏈 製造方法。該方法為，繼續根據上述糖鏈天冬醯胺之製造 方法之糖鏈天冬醯胺之製造步驟，又，包括從得到之糖鏈 天冬醯胺中除去天冬酿胺殘基之步驟。 糖鏈天冬醯胺中天冬醯胺殘基之步驟，可以根據衆所 #之方法進行° 可將糖鏈天冬si胺與無水反應後， 根據乙酿基化除去天冬酿胺殘基得到糖鏈。又，將糖鏈天 冬醯胺在鹼性水溶液中加熱回流後，根據乙醯基化，也可 以除去天冬ϋ胺殘基得到糖鏈。除去天冬酿胺殘基後，根 ，要求而使適宜、衆所周知之方法為，如，根據凝膠過渡 &柱離子乂換柱等之各種層析法或、HPLC之分離之 315343 24 丄丄 結乾燥後’殘留物用凝膠過遽管柱層析法（sephadexG_ / X lm展開冷劑為水、流速為1 〇m1/min)純化 2次，得到α 2,6-二涎糖鏈天夂醯 八；® 胺 1.3g(5 55/z mol)。得到 之涎糖鏈天冬醯胺之物理資料如下。 'H-XMR (〇,〇, 3 〇r) 5 5.13(s，lH，Man4-H-l) ’ 5.〇7(d,lH，J = 9 5H) z, 〇 I cNAc I-H-l). 4. 9 5 (s. 1 H. Man4-：i_1) 4.77 (s. 1H. Man3-H~l). 4. 6 1 (d, 1 H. G! CNAC2~H_1)^ 4·60 <d· 2H· ^ = 7. 6H2, GlcNAc. 5. 5-H-l), 4. 4 4 <d, 2H. J =8. OWz, Ga i 6, 6-H- 1), 4.2 5 (bd, 1 H. Man3-H-2). 4.20 (bdd ih Man4-H-2), 4.12 (bd· 1H’ Man4-H-2).2j4 (dd, 1H, ；-4.5Hz, 17. 2Hz. Asn~0CH), 2.8$ (cld 1R J 客7.0Hz, 1 7. 2H7., As n - /3CH), 2. 6 7, 2. 6 6 (d d 2 H. J = 4. 6 Hz, 12.4H2, NeuAc7, 7-H—3 ) 2 0 7 (s. 3H, AC), 2.06 (s, 6H, ACX2), 2.〇2 (°s 6H Ac X2), 2.01 (s. 3H. AO. 1.71 (dd. 2Hf ；,12.4H2> 1 2. 4H2, Ne u Ac 7，7-H —3ax.>

參考例2化合物1、2、3及4之合成 315343 26 丄 各幻為水、流速為1 ·0ιη1/ι^η )精制’得到化合物1、化合 味 3化s物4之混合物309mg»該混合物用hplc(ODS 嘗才主、展開溶劑為5〇mM乙酸敍水溶液：甲醇=65 : 35、 *〇 % X 25cm、流速為3ml/min)純化，5 1分鐘後溶出化合 物1、67分鐘後溶出化合物2及3之混合物、93分鐘後溶 出化合物4。該化合物分開凍結乾燥後，用凝膠過濾管柱 層析法（Sephadex G-25、2.5 p X 30cm、展開溶劑為水、 流速為1 .Oml/min )進行脱鹽，得到目的化合物2及3之現 合物l50mg。 得到之化合物1之物理資料如下。 lH-N'MR (D.O. 3 0*0 7.9 9 (2H, d, Fmoc), 7,7 9 (2H. d. Fmoc), 7.5 5 (4 H. m. Fmc c ), 5.15 (1 H. s, Ma n 4 -H 1), 5.0 6 ( 1 H, d, G 1 c NAc 1 -HI), 4.95 (1H· s, Man4' -HI). 4, 82 (\ H. s . Ma n 3 - H 1 ), 4. 6 9 (1 H, d. G 1 C N A c 2 — H l), 4. 6 7 (2H, d, GlcNAc5,5，-HI), 4.5 3 (2H, d, Oa l 6. 6' -HI), 4.34 (lHr cl, Man3-H2). 4.2 7 (1H, d. Ma n4( -H2), 4.19 <1H, d, Man4-H2). 3.0 3 {1H. bdcl, AsN-j3CH). 3-0 0 (IH, bdd, AsN-^CH), 2.7 6 (2H, dd, NeuAc7.7' -H3e〇), 2.15 (ISH, sX6, -Ac), I. 79 (2H, cid. ^euAc7, 7* -H3ax);HRMS Calcd for C103H15.,NeNaO“ [M + NS+] 2 5 8 1. 8 8 3 8, f oun d. 258 1.8821

HO^O (l) 28 315343 1330641 上述糖鏈結構之記號表示如下，

NeuAc:唾液酸 Gal:D-半乳糖 GlcNAc:N-乙醯基葡糖胺 Man :D-甘露醇 Asn:天冬醯胺

NeuAc〇c2-^6Ga： j0 I _ Q 2Man a \ 'Ίαη 0 ) —扣丨c?v’Ac一Asn-Fmoc

Neuiic a 1— 6GaI ΰ ： — iClcfiAc ^ l-*· l^fan a v a - a) 得到之化合物2及3之混合物之物理資料如下。 lH-NMR (D2〇. 3 Ot：) 7.9 9 (cl, Fmoc), 7.79 (d, Fmoc). 7.5 5 <m, Fmoc). 5.14 (s. Man4-Hl), 5. 1 2 ( s . M. a n 4 - H), 5,0 0 (d, GecNAcL-H1), 4.94 (s. Man4f -HI). 4.93 Cs, Ma n4’ -HI), 4.82 (s, Nian3-Hl), 4.60 (d. G3cNrAc2 -HI), 4. S 3 (d, G 1 cNAc 5, S' 4.46 (dd, Gal 6, 6* -Hi), 4.4 4 (d. G a 1 6, 6 ' -HI). 4.2 4 (d. Ma n 3 -H2), 4. 1 9 (d. Ma n 4 ' -H 2), 4. 1 I (d, M & n 4 -H2). 2.9 7 (b d d, A s (3 CH), 2.7 2 (del, N e u A c 7 - H 3 e q, NeuAc7-H3eq), 2.64 (bdd. AsN-j3CH), 2.15 <sx 5, -Ac), 1.79 (ddt NeuAc?-H3ax, NeuAc?1 -H3 a x) 得到之化合物4之物理資料如下。 'K-NMR {D20, 3 01C) 7.9 9 (2 H. d. Fmoc), 7.7 9 (2H. d, Fmoc), 7.5 5 (4 H. m, Fmoc), S. I 2 ( 1 H, s , M a n 4 - K 1), 5.0 6 < 1 H, d, G l c NAc 1 -H i), 4. 9 3 (1 H. s. Man4f -HI), 4. 8 2(: H, s. Man3-Hl), 4, 6 S {1H, d, G:cNAc2-Hl), 4.6 ? (2H. d, G l cMAc 〇. S' -HI), 4. 5 3 (2H, d. Ga 1 6. 29 315343 1330641 官柱（Cosmosil75C18-OPN、15x 100mm、最初通入 h2〇 5〇mL、之後通入25%之乙腈，而溶出）脫鹽，得到目的化 合物2之苄基體1.6mg、化合物3之苄基體1 8mg。 將化合物2之苄基體（10糖、l3.6mg、5.8mmol)，冰 冷下溶解於NaOHaq.(pH=12)1.4ml中。邊用HPLC監視反 應邊攪拌約8小時。當反應進行結束時，使反應液用 40mMHCl調整到pH = 7.0。將中和後之溶液用膜濾器過濾 後、濃縮、之後用 HPLC(YMC—Pack ODS—AM, SH— 343 — 5AM, 20x 250mm,AN/25mM AcONH4 buffer=20/80,7.0ml/min.，wave length;274nm)均分.純化。 將均分液濃縮後，用〇DS管柱（Cosmosil75C18-OPN,Nacalai tesque公司製）進行脫鹽處理、濃縮、凍結 乾燥，得到目的化合物2 ( 6.2mg，47.4% )。 得到之化合物之物理資料如下。化合物2之簡單結構 式示於表1中。 Ή NMR (4 0 0MHz. D20, 3 H〇D=4.81) 6 8. 0 0 (d, 2H, J =7. 2. Fmo c), 7.7 9 (d, 2H. J = 7. 2, Fmoc). 7. 5 9 (dd, 2H. i«7. 2, Fmoc). 7.53 (d d, 2 H, J = 7. 2, Fmoc), 5.2 2 (s. 1 Η, M a n 4 -H 1), 5.09 (d, 1H，8, G l cNAc 1-Hi), 5.01 (s. 1 H,

Man4, -H-l), 4.85 (s, 1H), 4.58-4.75 (m. 5H), 4.57 <dd, 2H, J- 8.0), 4.3 8 - 4.4 8 (m, 2H)t 4.3 3 (s , i H), 4.28 (b s , 1 Η, M a n 4 - H 2 ), 4. 1 9 (b s , I H). 31 315343 1330641 2.6 4 - 2,8 5 (m< 3H. As π-QCHx2. KeuAc?-H3eq), 2.16, 2,13, 2.12 (e a c h 5 . 1 2 H, A c x 4), 1.98 (s 3H, Ac) 1.8 0 (d d. 1H, Ja=I2.〇, Jb-12.0. NcuA c7—H3ax). 將化合物3之苄基體（10糖、5.0mg、2. lmmol )，冰 冷下溶解於NaOHaq.(pH=12)2.0ml中》邊用HPLC監視反 應邊攪拌約5小時。當反應進行結束時，使反應液用 40mMHCl調整到pH=7.0。將中和後之溶液用膜濾器過濾 後、濃縮、之後用 HPLC(YMC—Pack ODS—AM, SH— 343一5AM, 20x 250mm,AN/25mM AcONH4 buffer=20/80,7.0ml/min.，wave length;274nm)均分·系屯 4匕。 將均分液濃縮後，用ODS管柱（Cosmosil75C18-OPN， Nacalai tesque公司製）進行脫鹽處理、濃縮、康結乾燥， 得到目的化合物3 ( 2.5mg，52.0%)。 得到之化合物之物理資料如下。化合物3之簡單結構 式示於表1中。 Ή NMR (4 0 OMHii, DaO, 3 OX：. HOD = 4. 8 1) δ 8.0 1 (d. 2 H, J = 7. 6, Fmo c), 7.80 (d, 2 H, J = 7. 6, Fmo c), 7.5 9 (d df 2 H. J - 7. 6 , Fmo c), 7.52 (d d, 2 H, J = 7. 6 , Fmoc), 5.21 (s, 1H, Man4—HI), 5.0 9 (d, 1H. J = 9, 5, GlcNAcl-Hl), 5.03 (s, 1H, Man4t-H-i), 4.58-4.71 (m, 5H>, 4.S4 (t, 2H, J = 7.5)，4.4 0 -4.5 0 (b, 2H), 4. 3 4 (5 , 1 H), 4. 2 8 (b s, IH, Man4-H2}( 4. 1 9 (os, IH), 2.70-2.85 Cm, 2 H, Asn-j3CH. Ne u Ac 7-H 3 e q). 2.5 5 - 2.7 0 (m. 1 Ht Asn-/3CH), 2.16. 2.15, 2.13, 2.11 (eachs, 1 2 H, 32 315343 1330641 A s N - C Η), 2 · 7 ^ ί1 H, d d, N e u A c 7 ' - Η 3 e q), 2. S ： <1H, odcl, AsN-^CK), 2. 1 5 ί l 5 H, SX5, -Ac). 1.7 9 “ H, d d. NeuAc 7，-H3 ax) : HRMS Calcd for [M十 2 1 28. 7356. found, 2 1 2 8.7 3 6 3 得到之化合物6之物理資料如下。 lH-NMR (Ds〇. 3 Ot：) 7.99 <2H. d. Fmoc), 7.7 9 (2H, d. pmoc). 7.5 5 (4 H- m, Fmo ch 5. 1 5 (1 H, S, (vU π 4 ~H 1)，5.0 6 < 1 H, cl. GlcNAcl - HI)，4.95 (1H, s , M a n 4 * —HI), 4.82 < 1 H, s. Man3-Hl), 4.6 9 CIH, d, GlcMAc2-Hl), 4.6 7 (2H. d, GLcNAcS.5^ -HI), 4.5 3 (1 H, d, Gal6-

Hl), 4.3 4 <1H» Man3-H2), 4.2 7 (i H. d, Man4' -H2), 4. 1 9 (1H. d, Man 4-H 2), 2.9 7 (1 H. bdd, As N-jSCH), 2.76 (1H, dd, N e u A c ?-H 3 e a). 2.6 0 (1 H, bdd, AsN-0CH). 2. 15 (15H. sX5, -Ac), 1.7 9 (1 H, dd, NeuAc7-H3ax)：HRMS Calcd for CBeHl25 N,NaaOSJ + 2 1 7 2.6 9 9 5, found, 2 1 7 2. 7 0 8 4 參考例5化合物7及8之合成

將参考例4中得到之化合物5及6之混合物 (9 0mg，47.3 // mol )不要各自分離，與牛血清白蛋白8mg 一起溶解於HEPES緩衝溶液（5〇mM，pH6.0 ) 8. lml中，加 入牛腎（Bovine Kidney)而來之石-葡糖胺酶（Nacalai tesque公司製、來自牛腎）2·88ι^在37°C下將該溶液靜置 18小時後’凍結乾燥，殘留物用hplC(ODS管柱、2·0ρ X 315343 34 丄JJVJUH丄 25cm、展開溶劑為5〇m ^ 乙駄鉍水溶液：甲醇=65 : 35、 '"il 迷為 3ηι1/πιίη)έ,φ>ί卜，1!，、k — 、 为鐘後溶出化合物7、1 27分鐘 =出化合物8。各自分開，康結乾燥。之後用肌c(〇ds :、2.〇”25Cm、展開溶劑為最初之15分鐘為水、16 分至30分鐘為水：乙猜= u王〇5. 15' 31分至45分 鐘為水：乙腈= 85: 15 $ ，λ 至80. 20而成之梯度。流速為 3.〇ml/min)進行脫鹽處理，得到4〇mg目的化合物7、‘37 目的化合物8。 mg 得到之化合物7之物理資料如下。 ιΗ-ΝΜΚ (D20, 3 01C) 8.01 (2Η. d. Fmoc), 7.8 0 <2H, d. Fmoc). 7.56 (4 H, m, Fmoc), 5.2 2 (IH. s. Man 4-HD, 5.0 8 (1H. d GlcNAcl-Hl), 4.94 (1 H, s, Man4· -HI), 4.84 (l H, s. Man3-Hl>( 4.6 9 (1 H. d, GlcHAc2-Hl). 4.6 7 (IH. ύ, G 1 cNAc 5-*Hl), 4.5 5 < 1H. d, Gal6-Hl), 4.3 3 (IH, dd. Maa3-H2)t 4.2 0 (i H, dd. Man4-H 2), 4. 15 (IH, dd, Man4r -H2), 2.9 7- (IH, bdd, As N*-0CH), 2.76 (2H, dd, NeuAc7. 7' -H3eq), 2.6 2 (IH, bdd, AsN-^CH), 2.15 (1 2 H. s X 4. —Ac). 17 9 (2H, dd. NeuAc7, T -H3ax)；HRMS C a l c d f or C78Hti4N6Na04e [M-fNa-f] 1 9 2 5.6 5 6 2, found, 1 9 2 5.6 5 3 9 得到之化合物8之物理資料如下。 lH-NMR (D.O. 3 CC) 7.99 (2 H, d, Fmoc), 7.79 (2 H, d, Fmoc), 7,55 (4 H, m, Fmoc), 5.15 (IH, S, Man4-Hl), 5.0 6 (1 H, d 315343 35 1330641 G t c N A c i - Η I ), 4,9 5 ( 1 H, s , M a n. 4 ' -HI), 4.S2 (1 H, s, 4.69 (1H, d, GicNAc2-HI), 4.6 7 (2H, d, GlcNAcS.S1 -Hi). 4.5 3 (2H; d. Ga-5f 6 * -H 1). 4. 3 4 C1 H. d . Ma n 3 - H 2), 4.2 7 ( I H. d, Ma n4* -H2). 2.9 7 (1H, bdd, AsN-jSCH2), 2.7 6 ( 1 H, dd, NeuAc?* -H3eq), 2.6 1 (1H, bcid, AsN-0CH 2), 2.15 (1 2H, s x 4. -Ac). 1.79 (1H, dd. NeuAc 7f -H3 a x) ； HRM3 C a l c d for C^H, MNsNa04S [M 十 Na 十]1 9 2 5. 5 S 6 2, found, 1 9 2 5,6 533 參考例6化合物9之合成 將参考例5中得到之化合物7 ( 30rng，473 // mol )和牛 血清白蛋白3mg溶解於HEPES緩衝溶液（50mM，pH6_0 ) 6ml中，加入洋刀豆（Jack Beans)而來之α-甘露糖苷酶 10U。在37°C下將該溶液靜置2 1小時後，凍結乾燥，之後 用HPLC(ODS管柱、2.0 p X 25cm、展開溶劑為最初之15 分鐘為水、16分至30分鐘為水：乙腈=1〇: 〇至85: 15、 31分至45分鐘為水：乙腈=8 5 : 15至80 : 20而成之梯度。 &速為3 · 〇 m 1 / m i η )純化’得到2 〇 m g目的化合物9。 传到之化合物9之物理資料如下。 lH~NMR (DaO, 3 〇〇 8 0 1 (2H. d, Fmoc), 7.80 (2H, d, Fmoc), 7.5 6 (4 in. FmoO, 5.00 (iH. d, GlcNAci-Hl). 4.9 5 (1

K· s. Man 4' -HI), 4. 8 4 (1 k, s. Man 3-HU. 4. 6 7 (1H* dt GlcNAc2-Hl)( 4.56 (l H, d, G^cNAcS-H !)’ 4, 4 4 .(1 H, d, C- a l 6 - H 1)· 4. I l (l H, d d, Ma n 4， 36 315343 1330641 —H2), 4.07 (if.； »

siM-aCH), 2.76 du Man3"-H2)* 2 Sr (lbL bddi A UH.㈣ AsN:HCeuAc?，一 …2 Q ^CH), 2.15 (12H. SX4. -Ac), 1.7 9 (2H( dd. NcuAc ^H3ax);HRMS C a ； c c for C”H1(MNejsf a〇 o u π d. l 7 a 十"7 6 3, 6 0 3 4, f 6 3.6 0 7 4 參考例7化合物10之合成 將多考例5中得到之化合物8 ( 40mg,630 " mol )和牛 jk ’月白蛋白5g溶解於HEpES緩衝溶液（5〇mM pH6 〇) 7·8γπ1 中，加入 、年刀立而來之α-甘露糖苷酶tase3 8U。在 c下將4 /谷液靜置6 3小時後，来結乾燥，之後用 HPLC(ODS管柱、2 〇 $ χ 25cm、展開溶劑為最初之15分 I里為水、16分至3〇分鐘為水：乙腈=1〇:〇至85: 15 31 分至45分鐘為水：乙腈=85 :丨5至8〇 : 2〇而成之梯度。 流速為3.0ml/min)純化，得到30mg目的化合物10。 得到之化合物1 〇之物理資料如下。 •K-NMR (DjO, 3 ot；) 8.01 (2H. d. Fmoc), 7.80 (2H, d. Fmoc). 7.56 (4 H, m, Fmoc), 5.23 (1H, s, Man 4—Hi). 5.08 (1H, d,

GicNAcl-HU. 4.53 (1H, d· Gal6_HU, 4.32 (lHr dd, Man3-H2), 4,2 8 C1 H, dd, Man4-H2), 2.8 1 (1 H, b d d. As Ν-β CH), 2.76 (1H. dd, NeuAc7-H3e q), 2. 5 9 (1 Ht b dd. As NT-0CH), 2,13 (1 2H, s X4.-Ac), 1.80 (1H. dd, NeuAc7H3ax)；HRMS Cased f ΰ r C^H.o.N.NaO.j [M + Na-i-] 1 7 6 3.6 0 3 4. f 〇Un d, 1 7 6 3.6 0 4 1 參考例8化合物11之合成 37 315343 1330641 將化合物5( 28mg,21.3/z mol)和牛血清白蛋白l.Omg 溶解於HEPES緩衝溶液（50mM，pH5.0,454 " L )中，加入 神經氨酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio Cholerae，198mU)。在37°C下將該溶液靜置20小時後，根 據HPLC分析確認反應結束。將反應液用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178 ' 20x 2 5 0mm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=80 : 20、 流速為4mL/min)純化。之後用ODS管柱 (Comosil75C18-OPN、15x 100mm、最初通入 H20 50mL、 之後通入25%之乙腈，使溶出）脫鹽，得到目的化合物1 1 (1 7mg、收率70% )。得到之化合物1 1之物理資料如下。 化合物11之簡單結構式在表2中表示。 Ή-NNiR (3 Ot：) ¢7,91 (d, 2 H, J = 7,5Hz, Fmoc). 7.7 1 (d, 2 H, J-7.5Hz. Fmoc), 7. 5 1 (d ¢3, 2H, J = 7. 5 H ^ . Fmoc), 7.4 3 <dd, 2H, Ι = 7,5Ηχ, Fmoc). 5.12 (s, 1H, Man 4 -Η- 1), 4,9 9 (d, 1 H. J =* 9. 5 H z . G l c N A c 1 -H - 1), 4.9 2 Cs , 1 H( Ma n 4 ' -H- 1), 4.7 6 (s , 1 H, Ma n 3 -H -i>, 4, 5 8 (d. 1H, J = 8.0Hz, G E C NAc 2 -H-1), 4.5 5 Cd, 1H, J = 8.4Hz, GlcNAc5’4.47 (d, 1 H_，I = 7. 8 Hz, Gal 6' —H-l). 4.34 (t,, ih, Fmoc), 4. 2 4 (b d, 1H, J = 1.9Hz, Man3-H-2), 4.18 (bdd, JK, J = 1.4Hz( 3.3Hz. Man4-H^2), 4. 1 1 (b d d. 1H,

J = 3.5Hz, Man4" -H-2). 2.72 (bdd, IH, J 38 315343 1330641 =3.0 Hz, 15.7Hz. AsN- j3CH). 2.52 (bdd. 1H, J-S.7Hz. 1 5. 7 Η ε . A s N - 3 CH>. 2 . 0 6. 2.0 5, 2.0 4, 1 8 S (each s , each 3 H, Ac) ： HRM3 Calcd f o r Ci3Htl〇N3N&045 [M-N'a-i-] 1 8 3 7.6 4 0 2, found 1 8 3 7.6 471 參考例9化合物1 2之合成 將化合物6 (20mg,9.4//mol)和牛血清白蛋白1.6mg 溶解於HEPES緩衝溶液（50mM，pH5.0,323 y L)中，加入 神經氨酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio Cholerae，141mU)。在37°C下將該溶液靜置18小時後，根 據HPLC分析確認反應結束。之後用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020 1 78'20x 250mm > 展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=80 : 20、流速為 4mL/min)純化。之後用 ODS 管柱（Cosmosil75C18-OPN、 15x 100mm、最初通入H20 5 0mL、之後通入25%之乙腈， 使溶出）脫鹽，得到目的化合物12 ( 13mg、收率76% )。 確認得到之化合物之結構為1H-NMR與標準品一致。 化合物1 2之簡單結構式示於表2中。 參考例10化合物13之合成 將化合物7 (45mg，24/zmol)和牛血清白蛋白1.7mg 溶解於HEPES緩衝溶液（50mM，pH5_0,820 # L )中，加入 神經教酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio Cholerae，134mU)。在37°C下將該溶液靜置14小時後，根 據HPLC分析確認反應結束。之後將反應液用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178 ' 20x 39 315343 1330641 25 0mm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=8〇 ·2〇、 流速為4mL/min)純化。之後用〇DS管柱 (Cosmosil75Cl 8-OPN、15x 100mm、最初通入 η η 以 2VJ ^OmL ' 之後通入25%之乙腈，使溶出）脫鹽，得到目的化4物i3 (2 8mg、收率74% )。得到之化合物之物理資料如下 化合物13之簡單結構式示於表2中。 •H-NNifR (3 0X) ¢7-92 (d, 2PI, J = 7.5Mz, Fmoc), 7-71 (d, 2H, je 7. 5Hz, Fmo c), 7.5 1 (dd, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo 〇, 7.4 4 (dd, 2H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 5.10 (s, 1M, n 4-H-l), 4.99 (d, 1H. J=9.5H2, GicNAcl-H~i) 4,9 2 (s, 1H, Ma n 4 ' -Η- 1), 4. 7 s (s , l ^ m a n 3 ~ H -1). 4.58 Cd. 2 H, GlcNAc2.5· -H-l), 4.4 7 (d, r H, J=8.〇Hz, Gal 6' —Η—l), 4,35 (t, 1 H, Fmo c), 4.24 (bd, XH. J = l. 9Hz, Man3-H-2), 4. 1 1 (bs, χ H, Ma n4f -H- 2), 4. 0 ? (b s. 1H. Ma n4 -H- 2), 2.72 (bd, 1H, ASN-0CH), 2.5 2 (bddi. l H, J=8,7Hz, 1 5. 5Hz( As N-/JCH), 2.0 6, 2.0 4, 1.8 9 (each s r each 3H, Ac) ; HRMS C a 1 c d for c s,H”NsNa〇4S [M 十 Ma 十 1 6 3 4.5 6 0 8, found, 1 5 3 4. 5 5 6 4 參考例11化合物14之合成

將化合物8(47mg，25/zmol)和牛血清白蛋白1.9mg 溶解於HEPES緩衝溶液（50mM,pH5.0,840 /z L)中，加入 神經氨酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio Cholerae,3 69mU)。在37°C下將該溶液靜置37小時後，根 據HPLC分析確認反應結束。之後將反應液用HPLC(YMC 40 315343 1330641

Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178、20χ 2 5 0mm、展開溶劑為5 OmM乙酸錢水溶液：乙腈=8〇:2〇、 流速為4mL/min)純化。之後用ODS管柱 (Cosmosil75C18-OPN、15x 100mm、最初通入 h2〇 5〇mL、 之後通入25%之乙腈，使溶出）脫鹽，得到目的化合物14 (26mg、收率65% )。得到之化合物之物理資料如下。 化合物14之簡單結構式示於在表2中。 lH-HMR (3 0*〇 5 7.92 (d, 2 H, J=7,5H2, Fmoc), 7.71 (dt 2 H. J = 7‘SHz. Fmoc), 7. 5 1 (dd, 2I-I. J = 7. S H z， Fmo c ), 7.4 3 (dd, 2H, J = 7.5H2. Fmoc), 5.12 (s, 1H, Man ^ — 1)» 4.9 9 (d, 1 H, J = 9.4H2, GlcNAcl—H—1) 4.91 (s, 1H. Man4' -H-l), 4.7 7 (Sf iH, Man3^H -1). 4.5 7 (bd. 2H, GicNAc2.0* -H-1). 4.4 6 (d, IH, J = 7.5H2, Gale1 -H-l), 4.3 4 Ct, 3 H, Fmoc), 4. 2 4 (b s, 1H, Man 41 -H-2), 4. 19 (bs, 1H, Man4 -H-2), 2.7 2 Cbdt l H, J = 15.5Hz, AsN-jSCH), 2,52 (bdd, 1H, J = 3. 2Hz , 15.5 Hz. AsN — i3CH), 2.0 6, 2.05, 1.89 (each 5, each 3H, Ac);HRMS Calcd for C67HS7NsNa04<) [M+Na 十】1 6 3 4-5 6 0 8， found, 163 4.5644 參考例12化合物15之合成 將化合物9( 32mg，18.4；w mol)和牛血清白蛋白2.5mg 溶解於HEPES緩衝溶液（50mM，pH5.0,713" L)中，加入 神經氨酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio Cholerae，134mU)。在37°C下將該溶液靜置17小時後，根 41 315343 1330641 據HPLC分析確認反應結束。之後將反應液用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178 ' 20x 250mm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=80 : 20、 流速為4mL/min)純化。之後用ODS管柱 (Comosil75C 1 8-OPN、15x 100mm、最初通入 H2〇5〇mL、 之後通入25%之乙腈，使溶出）脫鹽，得到目的化合物i 5 (13mg、收率52% )。得到之化合物之物理資料如下。 化合物15之簡單結構式示於表2中。 lH-NMR (3 0*0) ^7.92 (σ. 2Η, J = 7.5H2, Fmoc), 7. 7 1 (d, 2 H. J» 7. 5 H z , Fmo c ), 7.51 (dcL 2 H, J — 7. 5 H 2 , F m o c), 7.44 Cdd, 2H, J — 7.5Hz, Fmoc), 5.00 (d. 1H, Jsr 9.9Hz, G 1 cNAc 1-H-1). 4.9 2 (s, 1 H( Man4* ~H~ 1)，4.75 (s, 1H, Man3-H-1), 4. S8 (d, 2 H, J=7 5 Hz, GlcNAc2,5' 4.4 7 (d, 1 H, 1-7, 8Hz,

Gal6* -H-l), 4.34 (t, 1 H, Fmo c ), 4.10 (b d, t H Wan3-H-2), 4.07 (bs, 1H, Man4f —H-2), 2.72 (¾ del, 1H. J = 15.5Hz, ASN-/3CH), 2. S 2 (bdd, 1H. j 2Hz, 1 5. 5Ηϊ, AsN-/3CH). 2.0 7, 2.0 5, i. 8 9 (each s, each 3Ht Ac);MS (Fab). Caicd f 〇 ^6ΐΗβΒΝ303Γ, [M + H+} 1450.5, found, 1450.3 參考例13化合物16之合成 將化合物10 ( 28mg，16 a mol )和牛血清白蛋白i 7mg 溶解於HEPES緩衝溶液（5 0mM，pH5.0,624 " L)中，加入 神經氨酶（Sigma-Aldrich公司製、來自Viblio Cholerae，11 7mU)。在37°C下將該溶液靜置1 7小時後，根 315343 42 1330641 據HPLC分析確認反應結束。之後將反應液用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178 ' 20x 250mm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈=80 : 20、 流速為4mL/min)純化。之後用ODS管柱 (Comosil75Cl 8-OPN、1 5x 100mm、最初通入 H2O50mL、 之後通入25%之乙腈，使溶出）脫鹽，得到目的化合物1 6 (l4.6mg、收率68% )。得到之化合物之物理資料如下。 化合物16之簡單結構式示於表2中。 aH-NMR ('3 0Ό) <5 7,92 (d, 22i, J = 7.5HZ, Fm〇C). 7.7 1 (d, 2H, 7. 5Hz, Fmo c), 7.5 0 Cdd. 2 H. J = 7. 5 H z , Fmo c ), 7.43 (d d, 2 H, J - 7. 5Hz , Fmo c ), 5.12 (s , 1 H. Man 4-H-l), 4.9 9 (df XH, J-9.5Hz, G 1 c NA C 1-H-1), 4. 7 7 (5. lHf Ma η 3-H- 1), 4. 5 7 (d, 2 H. J = 7, 2Hz. G ! c NAc 2-M- 1), 4, 4 6 (d, 1 H, i==7.8Hz, Gaf6-H - 1), 4.34 (t, 1 H. Fmo 〇, 4. 2 2 (bd, 1 H, J = 2. 7 H z ,

Man 3 -H~2). 4.19 (b, 1 H. Ma n 4 -Ή- 2). 2.7 2 (b d dt 1 H, J = 1 5-5Hz，AsN 一 0CH), 2, 5 2 (bdcl, 1 H, J =9. 8 Hz, 1 5. 5 Hz, As N~0 CH). 2. 05 (s , 6H. AcX2), 1. 8 9 ts, 3H, Ac) ; MS (Fab). Ca i c d for 0^Η"Ν5Ο3 5 [iVl + H + ] 14 5 0. 5, found, 1 4 5 0.3 參考例14 ( 5-乙醯胺_3,5,7-三去氧氟-D-甘油-々-D- 半乳糖-2-唾液吡喃苷酸（7-氟唾液酸） 5-Ace tamide-3. 5. 7-t r ideoxy-7 - f luoro-D~s 1 yce ro-0-D-ga 1 ac ^""^-nonu I opyrano sidonic acid 25 之合成） 43 315343 1330641

(1 )化合物1 7之合成 乙酸酐（60ml)中溶解乙酸鈉（5g,69mmol)，加熱後 加入少量之D-半乳糖（G ) (10g，55mmol)。加熱回流2小 時後用TLC(甲苯：乙酸乙酯=5 : 1)確認反應結束。回到室 溫後在反應溶液中，注入冰水3 0 0 c c。過遽後收集沈澱物。 將沈澱物溶解於乙醇中（14ml)進行再結晶，得到9.0g(收 率41%)化合物17。 (2 )化合物1 8之合成 將化合物17( 4.3g，llmmol)溶解於二氣曱烧（120ml) 後’在氬氣流下冷卻至-20°C。之後’在反應液中加入四氣 化錫（3.1g，12mmol )攪拌20分鐘後，加入苯曱醇 (2.3g，22mmol)使反應溫度回到室溫。用TLC(己烷：乙 酸乙酯=1 : 1)確認反應結束後，將反應溶液注入到飽和碳 酸·氫鈉水溶液中’用二氣甲烷萃取。將二氯甲烷層用硫酸 酐鎂乾燥後，過濾、減壓濃縮。殘渣用乾燥器乾燥後，溶 解於經蒸餾之曱醇（80ml)中，加入曱醇鈉（431 mg， 5.5mm〇i)在氬氣流下攪拌。用ΤΙχ (乙酸乙酯：甲醇： 艮1 〇 . 5 · 1 )確認反應結束後，用陽離子交換樹脂IR_丨2〇 (+)中和使反應結束。過濾除去樹脂後，將溶液減壓濃 縮。殘渣用乾燥器乾燥後，溶解於吡啶（44ml )中，反應 溶液冷卻至0度。反應溶液中加入三甲基乙醯氣（4 6g广 315343 44 1330641 38.5mm〇1)後，回到室溫後在氬氣流下攪拌1小時。用TLC (己烷：乙酸乙酯=2 : 1 )確認反應結束後冷卻至〇度後， 加入曱醇使反應結束。將反應溶液照原樣減壓濃縮後殘 渣溶解於乙酸乙酯中，用飽和食鹽水溶液、水洗淨，用疏 酸奸鎮乾燥乙酸乙醋。過濾除去硫酸鎂後，將溶液減壓濃 縮。殘渣用矽膠管柱層析法（展開溶劑為己烷：乙酸乙酯 2 · 1 )純化’得到化合物丨8 ( 2 8g，收率58% )。

(3)化合物19之合成

將化合物18 ( 200mg，0.455_〇1)溶解於二氣甲产 (7.8ml)和吡啶（1.3ml)中，加入氣乙酸酐（155叫疋 0.91mm〇l)，在氩氣流、_15。〇下，邊攪拌使反應進行 分鐘。確認反應結束後，用甲醇（5ml)料氯乙酸軒， 用曱苯邊共沸3次邊減壓濃縮。殘渣用乙酸乙酯萃取4， 用飽和食鹽水洗淨。有機層用硫酸酐鎂乾燥、過濾後=^ 殘渣用矽膠管柱層析法（乙酸乙酯：己烷=1 : 4 )純—C 得到化合物1 9 (收量1 7 2 m g，收率7 3.5 % )。 »H-NMR (4 0 OMHz, CDC13) ό 7.37-7.29 (m，5H ph) 5 3 9 (以 ih, l p 8.0H7,, Ja.3=l〇.4Hz, H-2). 4.8 9 (d c, 1 H. ] ^ 3.4Hz. H- 3). 4.8 9. 4. 6 2 (2 d. 2 H, J = 12.5H7.. 〇c 315343 45 1330641 H^Ph), 4.53 (d. 1H. H-1J, 4.3 7 (d d 1H τ 1 ； Π· J 6i. «„ = 11.5Hz, JSu 5 — 6,0Hz, H~Sa), 4.32 (dd IK J. =6. 6H7., H-6 b), 4. 0 0 (m, 1H, H-4}, 3. 9 〇 (5 2H COCH2CJ>_ 3.75 (del, 1H, H_5}， 】.23, ^ 19 [2s * 1 8H, COC (CHJ J ' 13 C N M R (400MHz, CDCis) S 178.33, 177,57, 16 5. 92, (C=〇>, x 3 6 g 6>

1 2 8. 4 8, 1 2 8. 0 7. 1 2 7. 8 9 (Ph). 9 9. 1 6 (c-U 7 2.8 2 (C-3}. 7 2.3 5 (C- 5), 7 0.9 2 (C~2>, 70 49 (OCH2Ph), 6 7.2 9 CC-4). 6 2.3 0 <C-6), 4〇.4〇 (C〇 £H2Ci), 3 8.9S, 3 S. SO CC〇_C (C Hs) 2714

2 6,98 CCOC (Ο,Ηϊ) J 用 iH-NMR, “c_NMRiiBeukerC)AVAKcE (書寫成 400MHz )測定。當溶劑為重氣仿時使用内部標準之三甲基 矽烷。使用其他重溶劑時以溶劑峰值為標準。化學位移表 示為（5 (ppm)、結合定數表示為J(Hz)。矽膠管柱層析 法使用 Merck Si , icasei60, 7〇一23〇心〇或 23〇_ 400mesh、球狀矽膠使用關東化學公司製造之SiHca以丨6〇 (Spherical )、反應檢查用（以下為TLC )使用E.Merk公 司製造Kieselgei 6〇F254 (Artl， 05715 )。高速液體層析法（HPLC)之管柱使用Nacalai tesque 公司製造之 C0SM0SIL 5Ci8_Ar Packe(J column(少 4.6x l5〇mm)、分光螢光光度計使用jASCO公司製造之 FP-210 Spectrofluorometer 〇 (4 )化合物20之合成 將化合物19 ( 300mg，0.583mmol)溶解於二氯甲院 (5.8ml)中，在氬氣流、_丨5〇C下，邊攪拌邊加入二乙胺 46 315343 1330641 基確胺三氟（DAST)〇DAST加入10分鐘後回到室溫使反 應進行1小時。用TLC確認原料消失，用甲醇（3mi )驟 冷DAST後減壓濃縮。殘渣用矽膠管柱層析法（乙酸乙醋： 己烧=1 : 6 )純化，得到化合物20(收量2 11 mg，收率70% )。 Ή-NMR (4 0 0MHz. CDC^) $ 7-37-7.27 (m, SH. Ph), 5-3 1· (ddd，1 H, J 3 1 4. 3 Hz, J ,, 4=5. 6 9 . J 5. 3=9. 6 3H?. H- 3). 5. 〇 4 (d d, 1H, Jli2=7.93Hz, H-2). 4.8 6 Cdt 1 H. Jr, 1 2. 2 Hz, OCH2Phh 4. 6 0 (d, I Η, H- 1). 4. 5 9 (d, 1 H, OCHaPh). 4. 44 (ddd, 1 Hf J s= 9. 0 4H&. J , ?= 5 0. 6Hz, H-4), 4. 4 3 (ddd, 1 H. J β3. β6= 1 2. 1 Hz, J 6,. s — 2- 4 1 H z , J 6a. 2· 2 3 H z , H~6a), 4.2 4 ( d d d, 1H. J,,. s=5. 67Hz, J6b. F=l. 2 8 Hz. H-6 b), 3. 9 3 (s. 2H. OCOCH.2C \), 3. 7 o Cm. 1 Η. H- 5). 1.2 5, I. 1 g [2 s, 1 8H, OCOC (CH3) j ) 15C-NMR U 0 0MHz . CDC 1 3) a 1 7 7.9 4, 1 1 7.4 3, 1 6 5.8 8 (C^OL 1 3 6.3 4, 1 2 8.5 5. 1 3 8.2 3, 1 2 7.9 2 (P h). 9868 (C- 1), 8 7.3 5 (d, I ,, ,= ： 8 8. 6 2 Hz . C~4}, 72,65 (d J ,,= 7. 9 6 Hi. C- 2). 7 2.0 5 (d, J 3. 2 0. 〇 2 H z . C~3). 7 1.49 (d, Jj j.s23.09Hz, C~S)f 7〇.gQ (〇CHzPh)

6 2.12 (C-6), 4 0, 3 0 (OCO垃HjC U, 3 8, 8 7 C〇c〇C (CHa), ), 2 7. 1 7f 2 6.9 2 COCOC (CHa) 3 ) 化合物20 —

PivO N3 PivO^i^OQn OH 2 1 2 2 (5 )化合物2 1之合成 將化合物20(62511^’1.21111111〇1)溶解於曱醇（24.21111) 中’在氬氣流、-15°C下’邊授拌邊加入甲醇納（131mg, 315343 47 1330641 0.6mmol)。30分鐘後用TLC確認原料消失後，用陽離子 交換樹脂IR-120 ( + )中和（pH6-7 )，過濾樹脂後減壓濃 縮。殘渣用矽膠管柱層析法（乙酸乙酯：己烷=1 : 4 )純 化’得到化合物2 1 (收量3 9 5 m g，收率7 4 % )。

Ή-NMR (4 0 0MHz, CDC I <3 7.38-7,29 (mf 5H, P h). S, 1 8 (ddd, l H. J 3. 1 4. 8Ha, J 3 4 = 9, 5 1 Hz, J, , = 8. 9 9 Hz, H-3), 4.9 0 (d, 1H. J = 1 1. 7. 〇CH2Ph), 4. 6 3 (d. 1 H. OCH,Ph), 4. 4 7 (ddd, iH, Js. “=2. 43Hz, 一 2. 2 Hz, H-6 a), 4. 4 7 (d, 1 H, J r 2 = 7. 7FU, H-1}，4‘ 3 8 (d dd, 1H, J 5 = 8. 9 6Hz . J ar 4-9. 6 7 Hz ; J 4, F=5 0. 8Hz, H~ 4), 4.2 3 (ddd, 1 H, J 6 Jf 1 2. 0 H 2 , J b. 5= 6. 0 5 H z . J65), 57=1.26Ηζ, H-6b), 3.75 (m, I Hf H - 5), 3.5 4 (m,

1H, J 2. ow=2. 7 0Hz, H-2}, 1. 2 7, 1. 2 6〔2 s, 1 8 Η, O COC (CHS) 3) taC-NMR (4 0 0MHz. C D C l sj 6 17 8-17，1 7 7.9 4 (0 = 0}. 1 3 6.54, 1 2 8. 〇 4, 128.17. 1 2 8.1 2 (P h)r 101.31 (C- U. 8 7. 4 5 (d. J,,. ρ=1δ7.39Ηχ, C-4). 7 4. 1 7 (d. J j. p= i 81 8 8 H /,, C- 3), 7 2.4 5 <d. J2.r=7.56H2, C-2J. 71.45 (d. J Si P = 2 3- 2 6 Hz.. C-S). 7 1.09 (OCH?Ph), 6 2.4 4 (〇- 6). 38.90, 38.85 (0 COC (CH3)SJ, 27.14, 26.99 (OCOC (CH5) s ) (6 )化合物22之合成 在0度下溶解°比咬（22·2#1，〇.274mmol)之二氯甲 烷（370 /z 1)溶液中滴入三氟曱烷磺酸酐（40 " 1， 0.274mmol )，15分鐘後，在〇度下滴入溶解化合物21之 二氣甲烷（1 ml )。用TLC確認原料消失，用二氯甲烷將反 315343 48 1330641 應混合物稀釋。有機層依次用碳酸氫鈉、飽和食鹽水、水 洗淨，用硫酸酐鎂乾燥後濃縮。殘渣再用真空泵乾燥後溶 解於苯（lml)中’在氬氣流、室溫下加入疊氮化鈉（13mg， 0.206mmol)、四敍氣（57mg，〇.206mmol)在 40 度下進行 反應。2小時後用TLC確認原料消失後減壓濃縮。殘渣用 乙酸乙酯萃取，用飽和食鹽水、水洗淨，用硫酸酐鎂乾燥 後濃縮。殘渣用矽膠管柱層析法（乙酸乙酯：己烷=1 : 4 ) 純化’付到化合物2 2 (收量3 0.4 m g，收率9 5 % )。 'H-NMR (4 0 0MHz, CDC1.3) <5 7.3 9-7.3 2 (m, 5H, ?h). 4.9 9 (dda. 1H, J = 13.18Hz, J 3. 4= 9· 2 7 H 2 , J j, 3. 8 7 H ?. t H-3). 9 3 (d, I H. i = 1 2. 0 7 Hx , 〇CH,p h), 4. 6 7 (d, 1 H, JK ,= 1,18Η2, H~U, 4.63 (d( 1 H, 〇CH2Ph>, 4. 5 1 (d d d, L H, J 1 1- 9 5 H z , s= 2- 5 4 , 2. 0 SHx. H-6 a)f 4.2 3 (ddd, l H, J 〇11 5=δ. 1 4H^, J 6b. F*I. 1 4Hx. H-6 b), 4. 0 S (m, \ Η. H- 2), 3. 6 4 (m. 1H. H-5), 1.26 C 2 s . 1 8 H, OCOC (CH3)3 ) lJC-NMR (4〇〇MHz, CDCIj) δ 1 7 8. 0 1, 1 7 7,68 (C=OJ. 1 3 6.0 6, 1 2 S.63, 1 2 8. 3 1( 1 2 8. 1 4 CP h). 9 7.2 5 CC-1L S 5. 5 1 id, J 4. P= 1 8 3. 9 7. C-4), 7 2. 0 I (d. J3, F= 2 3. 8 9, C-5). 7 1. 7 3 (d, J j, 1 S. 9 8 , C- 3) 7 0.5 7 (OCHjF 62. 42 (C-2, C-6), 3 9.0 8, 3 S. 9 0 CGCO£ (CHS> 3〕，2 7.1 8, 2 6. 9 5 COCOC (CHS),) HO> HO-s NHAc f匕合物2 2 — Pj^ 2 3 2 4 (7)化合物23 之合成 將化合物22 ( 180mg，〇.387mmol)溶解於甲醇（8mi) 49 315343 1330641 中，加入曱醇鈉（922mg，9.67mmol)，在40。(3卞邊授掉 邊反應。4.5小時後用TLC確認1斑點結束，用陽離子交 換樹脂IR-120 (+)中和後，過濾濃縮。殘渣用矽膠官柱 層析法（乙酸乙酯：己烷=1 : 1 )純化，得到化合物23 (收 量 105.3mg，收率 91.6%)。 >H-NMR C4 0 0MHzt CDCI,). d 7.40-7.31 (mf δ H, Ph). 4.9 6 <d, 1 Hf 1 = 12.13

Hi；, OCH^Ph). 4. 7 l (d, 1H. J u , = 1. 3 3 H z .. H - 1}. 4.6 9 (d, IH, 〇CH,Ph>, 4.4 9 (ddd, i H, P=5i.〇 6 H z . J 5 = 9. 1 9 H z , J , ^ = 9. 2 0 Η λ . H - 4), 4.02 (m, lH, H-2). 3, 93 idddd. 1H, J“.“=l2_19H2r J“‘5 =2. 3 1H2，J“ p= 2 3 2 Hz. 〇H=6. 2.0Hl H-6 a}. 3.8 9 -3.7 7 Cm. 2 H, H - 3 . H - 6 fc>), 3. 3 9 (m. 1 Η. H-S). 13C-NMR(4〇〇m'Hz, CDC13), 1 3 6.3 9, 1 2 8.6 2, 1 2 8.2 4. 1 2 7.8 3 (Phi, 98.63 H 88.19 (d_ = 178, 91H2, C - 73.95 (d, ^ s, P=2 5, 4 8 Hz, G-5), 71.18 (OC.HaPh), 7l，i6 r=l 9. 69HZ. C-3), 64.48 (d. Ja.f=8.42H2, C-2). 6 1.39 (C-6) ’ (8 )化合物24之合成 將化合物23 ( 1 05mg，〇.353mmol )溶解於甲醇（7mi) 中’加入乙酸酐（333//1，3.53mmol)後’在氬氣流下加 入催化劑量之10%之Pd/C，氫取代後於室溫下授拌。2小 時後用TLC確認原料消失，用活性炭過濾後濃縮。殘渣用 石夕膠管柱層析法（乙酸乙酯：曱醇=5 : 1 )純化，得到化 合物24 (收量57mg，收率72% )。 50 315343 1330641 lH-NMR (4 0 0MHz, DaO), Q 5.2 3 (del, 1H, J;. 3=2. 6 9Hz, J F= 1. 4 4 H 2 . M- 1 -a), 4. 6 5 (d d d, 1 H. J, F=5 0. 9 4Hz, J 3 4= 9. 0 6 H ^. ^4.5 = 9·58Ηζ, H~4'-aJ, 4.4 7 (m, 1 Hr H-2-a), 4. 4 3 (d dd, 1H, J j. P=1 4. 2 8Hz, J 2, ., = 4. 9Hx. H-3 -a). 4.16 (m, 1H, H-S-cr), 3.95 (m, 2H. H-6a-a, H-6b-a). 2.14 (ϊ· 3H, NKCOCH^-a) •}C-NMR (4 0 0MHi. D,0).

δ i 7 5, 2 7 (C =〇-a) . 9 3-4 6 (C ~ i— a). 8 8. 3 〇 ， J 4 ?=t77.00Hz. C-4-o), 59.91 (cl, J5F=2 4- 4lHz. C- 5 -Q), 6 7.6 0 (d, J η. ΐί= 1 8. 7 4H C - 3 - a), 6 0.3 6 (C-6). 5 4.12 <d, ?~8.68H&. C-2-αϊ- 2 2.31 (NHCOCHj-&)

(9)化合物25之合成 將化合物 24( 50mg，0.224mmol)丙_ 酸納（123mg， 1.12mmol)和牛血清白蛋白（5mg)溶解於麟酸鋼緩衝溶 液（100mM，pH7.5，3.4ml )中，之後加入唾液酸酿縮酶 (5 0U )在室溫下開始反應。24小時後將反應溶液束結乾 燥，溶解于少量之水中，用陰離子交換樹脂管柱（AG 1-X8，200-400mesh，甲酸鹽型式）展開。通入3〇〇ml水後， 用1 Μ甲酸溶出目的物後減壓濃縮，用凝膠過渡管柱 (Sephadex G-15，水）純化，得到化合物25 (收量4〇mg， 收率 58.9%)。 315343 51 1330641 Ή-NMR (4 0 0MHX. D,〇}(

δ 4.61 (dd. 1H, JT-s=8.97Hz, J 7. 4 5. 5 6 Η z , H -7). 4. 1 8 (d d, 1H. ； 5. e = 1 0. 5 3 H z . j 6. F= 2 9. 8 6 H 2 . H- 6), 4. 1 5 Cm, i Η. H - 4), 4. 0 ? Cm, 1 il. H- 8), 4. 0 2 (d d, 1 H, J ,,, 5= 1 0. 1 Ο H , H~ 5), 3.9 0 (d d d , ： H. J 9lSb=i 2. 1 8K7.r J 3a. s= 2. 7 7Hz, J9it, ,-=2, S6HZ, H- 9 ah 3.7 6 (ddd, 1 H; ； ,b 3 = 5. 3 3 H 2 . J 9li, ,.= U b H z ; H- 9 b}. 2.4 0 (d d. 1 H, J Jc u. 3 a, = i 3. 0 0 . = 8H?, H-3 e q), 2.15 (s t 3H, OCOCH,), 2.00 (dd, 1 H, J 3βκ. ,= 1 1. 7 0Hz , H-3ax). iSC-NMR (4 0 0MHz, D 20), δ 17 5. 17. 1 7 3.6 8 (C = 0}. 96.01 (C-I)t 89.12 Cd. J 7. ?= 1 7 9. 2 3 Hz, C 一 7) . 6 9. 6 7 Cd，J 6. ?= 1 7. 4H C-6), 68.31 (d, J F=2 6. 5 0 Ki：, C-S), 6 7.2 6 (C-4), 6 2.7 0 (C-5), 52.17 (C-S). 3 9. 1 9 {C-3). 2 2, 5 1 (NHCO£Hj), 參考例15 ( 5-乙醯胺-3,5,8-三氧基-8-氟-D-甘油-/5 -D-半 乳糖-2-唾液吡喃苷酸（8-氟唾液酸） 5—Ace lamide-3, 5,8— t r ideoxy — 8— f 1 uoro-D -glycero — i3-D — ga 1 ac to-2-nonulopyranos i d ο n i c acid 27 之合成） 根據下述流程圖從唾液酸（26)合成5-乙醯胺-3,5,8-三氧基-8-氟-D-甘油-冷-D-半乳糖-2-唾液吡喃苷酸（27)。 52 315343 1330641

c

hc\Jh ^ 8n0 d 0%Μ〇 e

OMe i^iZZ^hco^ 〇n〇 OWe 8nO

θη〇Ρκ 〇Mb SitO

HO 27 8-氟唾液酸之NMR資料如下。 lH-N*MR (4 0 0MHr,. Dj〇), *5 4,6 9 (d d d d, l H, ptr?4 8. 7H^. J?. 〇Hzf J «, SHt, H-8), 4.03 (ddd. 1 H, J 4t S=1 0. 0H2 , J A=l 1. 1Hz . j3cc：. 4—4, 7H?., H^4), 3.95 (dd, 1H. J4g—lO.OH^. e=9*9Hzt H—5). 3,9 4 (d d d, 1 H* j6 7=〜〇Hz, J7 8 —6.8Hz, J 7, jr =14,0Ηζ, H-7), 3.8 8 (ddd, lHf J^j9b=^3-3Hz, Jy0.3~3.5Hzr J3t> F=2 8.0Hz， H-9b)， 3.86 (dd， J5.ii ㈡ 〜 0Hz, H~6}» 3-7 2 (ddd* 1H# j.33Hz^ J q — S.OHz, J9,.,-3〇.6H2( H-9a). 2.2 8 (dd. 1 H. i.Jcq, ,=13.00. J 3cn^ = 4· H-3ea), 2.0 5 (s, 3H, A 3 ή X e)】g? (ddt ?3；|Χ·4;11·1Η2ι 13.00, H^3 ax) 參考例1 6 ( 5_乙醯胺_3 ’ 5 ’ 9-二氧基-9-既-D-甘油-泠-d_ 半乳糖_2_喳液。比喃苷酸（9-氟唾液酸） .e - 3. 5. 9 - i r i d e ο X y - 9 - ? I u 〇 r 〇 - 〇 5 - A c e t * , 〇^D-ga I ac to-2-nonul 〇pyranos -r1yc e r i d 0 n i c a e i d 2 8之合成） 根據5述流程圖從唾液酸（26)合成5·乙酿胺·3 9-三氧基氟-D_甘油_5_D·半乳糖_2_吡喃苷nic酸 > 315343 53 1330641 (28) 〇

HO 26

h<Lj0，> BnO 丄1

P«e

Sfesj^〇iKc 知d 參考例17 CMP-唾液酸之合成

HO HO OH 7FiH · Fv R* · R-sOH 5P：R*R-.〇H,B».f 9P：R* fr *〇H, R-.J? ΟΗΛ- R#«fT^〇^ 7F^{ * f, ft* * R^-OAC ei^ft-R^OA^IToF C為e dF:R· R> »〇A^ ftH«l OM：R« R' · R"-OK X8, Me OH, {2) Ac.O, 6 0%1-IC l

7ftR - F, Π' -8Ρ;«-Β^=〇Η,«··Ρ R·*»!5 〇H：R« R* - R--CH 將 0. (a)⑴ Dow ex 50 (b) (1) lH^Te I; r a^o 1 e, CH3CN\ (2) t-BuOOH,

CH5CN, (3) DBOf CHaCK, (4) NaOMe, McOH. UzO 唾液酸（〇.〇74mmol )溶解於蒸餾曱醇（3ml)中，在氬氣 流室溫下邊攪拌邊加入D〇we X-50W-X8 (6 5m&>，反應3小 時。確認反應結束後，過濾、減壓濃縮。將殘渣溶解於乙 酸酐（200 # 1 )中，在-20°C下邊攪拌邊加入乙酸酐：60% 高氣酸= 15: 1溶液（22μ1)，在1〇°C下反應40分鐘。確 認反應結束後，將反應液用乙酸乙酯稀釋，用飽和碳酸氫 鈉洗淨。有機層用硫酸酐鎂乾燥，過濾後減壓濃縮，得到 含羧基經保護之唾液酸（29 )之殘渣。將残渣和CMP-5 ’ · 亞磷醯胺衍生物（3〇) ( 0.23mmol )與苯各自共沸3次，各 自溶解於蒸餾之乙腈（100 V 1 )中混合。在氬氣流下，在 冰水中邊攪拌邊加入1H·四唑（I7mg，〇,2 3mmol)。5分鍾 後回到室溫，再反應1 〇分鐘。確認反應驟冷後，用乙酸乙 54 315343 1330641 鐘後各自溶出單涎10糖化合物（C1-2)及（Cl-3 )。各自 分取後，脫鹽處理，之後進行凍結乾燥，化合物1、2、3 各自得到 〇.7mg ( 2.7% )、1.9mg ( 8.3% )、3.5mg ( 15.3% )。 各化合物之NMR資料如下。 化合物（C 1 — 1) Ή NMR (4 0 0MHz. D,0. 3 Ot：, HOD = 4. S I) δ 7.9 0 (d, 2 H. Fmo c), 7.6 9 (d. 2 H. Fmo c), 7.4 9

Cd d. 2H, Fmo c), 7. 4 2 (d d. 2 K. Fmo c )_ 5-10 (s, 1 H. Man4-Hl)( 4. 9 7 (d. 1 H, G 1 cNAc l -H 1J, 4. 9 l C S , 1H, Man4* -H-l), 4.50-4.60 Cm, 4 H>. 4,3 4 (1 H, Fmo c ). 4.2 4 ( b s . I H, Ma n 3 -H2), 4. 1 S (b s , 1H, Niajn4-H2), 4. 10 (τη, 2 H), 2.7 4 (m. 3 H, As η-β CH, HeuAc7, 7' -H3eq), 2,40-2. 60 <m, 1 H. As n -β CH), 2. 0 5, 2. 0 3 , 2. 0 2 (e a c h s . Ac), 1.77 (d d, 2H, NeuAc7, 7' —H3ax). 化合物（C 1 - lH NMR (4 0 0MHz, D2Or 3 Ot：, H〇D = 4.8l) δ 7.9 0 {d, 2H，Fmo c), 7.6 9 (d, 2 H， Fmo c). 7.4 9 (d d r 2H, Fmoc), 7.42 (dd, 2H, Fmoc). 5.10 (s, 1 H. Man 4-HI), 4. 9 7 (d. 1 H, G 1 c NAc 1 -H 1), 4.9 0 (s , 1 H, Ma a 4 * -H- l), 4.47-4.60 Cm). 4.4 3 (d. 1 H). 4.32 (1H, Fmoc), 4.2 2 (bs, 2H), 4.17 (b s , l H,

Man4-H2), 4,06-4.13 (m, 2H), 2.7 2 (m. 2H, Asn -0CH.. Ne uAc 7-H 3 e q), 2 50-2.60 Cm. 1 H, As n- i3 C H>., 2.0 5, 2.03, 2. 0 L (each 5 , Ac), 1.77 (d d, 1H, NsuAc7-H3£.-<.). 58 315343 1330641 化合物（c卜3> SH NMR (4 Ο 0MH2. D；jO, 3 0*0. HOD 二 4_ 8 1> δ 7. 90 (d. 2H，Fmoc〉，7. 69 (d, 2H, Fm〇C>· 7’49 (dd, 2H, Fmoc), 7.42 (dd. 2 H. Fmoc), 5- 1 0 is' 、^ 9 0

Hr Man4-Hl), 4. 9 7 (d. 1 H, G 1 C N A c l-Η 1 >· u (s. 1H. Ma n4' -H-l). 4. 5 0 - 4. 6 0 (m), 4. 4 5 Cd. 1 H). 4. 3 3 (IH, Fmo c). 4. 2 2 (m. 2H). 4. 1 7 〇>s，1 H· Man4-H2), 4.0 9 (m. 2H). 2.7 4 (m. 2 H. Asn^^CH, Ne uAc 7-H3 e q), 2.4 5-2.6 0 (m. 1 H. Asn*-^CH)， 2.0 5, 2.0 3, 2.0 2, 2.0 0 (each s, Ac). 1. 7 7 idd, I H, NeuAc7—H3ax)

Mani3 J-*-4ClcHAc<i l-^«ClcKAc—Asa'Fl"〇C

Nci?Accr2^3€al 0 J-*-4ClcKAc5 1-^iMan a J (C 1 - 1) (laf 0 [—4GfcWAc 3 J—ZXan a \ ^Mati 8 ί·*-4Γ.Ις»Αο/3 1^-4C1cK.\c—A$〇-?"·0«

NcuAc 〇f2*^3<3al l-^4ClcMc β Ι-^2Μ»π q (C 1 - 2)

SeuAcai-^SCat B l-^4GlcUAc S l*«ian * /an P l—iGlcWc3 i—4GlcWc_Asi»-f®扣

Cal 51—4C1cNAcfl ί'-ϊϋαηα Iy (C 1 - 3> 實施例2 實施例1中得到之化合物（Cl-2)(2mg，〇.88"mol) 和牛血清白蛋白lmg溶解於HEPES緩衝溶液（50mM， pH5.0) 100# 1中，加入召-半乳糖苷酶（生化學工業公司 製造、來自Jack Beans ’ 5 " L，l〇〇mU)。將該溶液在37 °C下靜置15小時後，用膜濾器過濾。濾液用HPLC ( ODS 管柱、2.0 Φ X 25cm、展開溶劑為5〇mM乙酸銨水溶液：乙 59 315343 1330641 腈=82 : 1 8、流速7.5ml/min )純化後，濃縮溶劑，之後凍 結乾燥。將殘留物溶解於200〆1水中，用ODS-管柱層析 法（Cosmosil75C〗8-opn、最初用水洗淨，之後用25%乙腈 水溶液溶出）進行脫鹽處理，得到目的化合物（C2 ) 0.5 "g。NMR數據如下。 lH NMR (4 0 0MHz. D,0, 30t：. H〇D = 4.81) 5 7.9 0 (d, 2H，Fcnoc), 7.6 9 (d. 2H. Fmoc), 7.4 9 (dd, 2H, Fmoc), 7.4 2 (dd, 2H, Fmoc), 5. 10 (S, 1 H, Man 4-HI), 4. 9 8 (d. IH, G1 cNAc 1-Hl), 4. 9 0 (s, 1H, Man4f -H~l). 4.5 0-4.6 0 (m), 4.3 3 (1H, Fmoc). 4,22 (m, 2H), 4.17 (bs, χ H, Man4-H2), 4.10 Cm, 2H), 2.7 4 (m, 2 H, Asn-j3CHt NeuAc7-H 3eq), 2.4 5 -2.6 0 (m, 1H, Asn~/3CH), 2.0 5, 2.0 3, 2‘01 (each s, Ac). 1.78 (dd. i H, NeuAc7-H3a X) 6\1jrj3 40UNAC 3 l-*-4GlcNAC"^Asn-pJr,f)c Λ

Ni:uAc eZ-^aGbl β 3-^4G{cNAc0 J-*-2Manc Γ (C 2) 實施例3 實施例2中得到之化合物（C2 ) ( 1.8mg，0.86 # mol ) 和牛血清白蛋白lmg溶解於HEPES緩衝溶液（50mM， ρΗ5·0) 90/zl中，加入N-乙酿基-/5 -葡糖胺酶（Sigma-Aldrich 公司製造、來自 Jack Beans ) 4// 1 ( 250mU )。將 該溶液在37°C下靜置24小時後，用膜濾器過濾。濾液用 HPLC ( ODS管柱、2.0Φ X 25cm、展開溶劑為50mM乙酸 銨水溶液：乙腈=82 : 18、流速7.5ml/min)純化後，濃縮 60 315343 1330641 浴劑，之後凍結乾燥。將殘留物溶解於2〇〇 " 1水中，用 ODS-管柱層析法、最初用水洗淨之 後用25%乙腈水溶液溶出）進行脫鹽處理，得到目的化合 物（C3 ) 0.9 y g。 ° m NMR (4 0 〇MHzf D2〇, 3 Ot：, HOD = 4. 8 1) 〇 8.0 1 (d, 2Hr 1 = 7.$, Fmoc), 7.8 0 (d, 2H, J = ? 6. Fmoc), 7.60 (dd. 2H, J=7,6, Fmoc), 7.5 3 (d d 2H, J=T.6, Fmoc), 5.2 1 (s. iH. Man4-Hl), 5. 〇 9 (d, 1H, J = 8.8, GlcNAcl-Hl), 5.0 0 (s. IH. Man 4' -H-l). 4.8 7 (s, 1H), 4,6 0-4.7 8 (m, 5H>, 4. 4 〇 -4. 5 0 (bm, 2H), 4. 3 4 (s , 1 H), 4. 28(bs, IH, Man 4 -H 2), 4.2 0 (d d. 1 H, J a = 3. 0, i b = 9. 9), 2.8 0-2,9 5 (m, 2H, Asn-j3CH, N e u Ac 7-H 3 e q), 2.65-2,7 5 (m, I H, As n-f3CH), 2. 1 6. 2. 1 4, 2.12 (each s, Ac x3>，l. 9 S (s, 3H. Ac). !, 8 9 (dd, L [-1. j 12.1, NeuAc7-H3ax).

Mac a、 i3 i^^ClcKAc^ [-*^<iClLNAc-^A3n-?ci〇c

NeuAca^3Cali3 l-^^lcNAc β (03) 實施例4 實施例3中得到之化合物（C3 ) ( 0.8mg，0.42 // mol ) 和牛血清白蛋白Img溶解於HEPES緩衝溶液（50mM， pH5,0 ) 50yl中，加入α-甘露糖符酶（Sigma-Aldrich公 司製造、來自Jack Beans) 30//1 (2.9U)。將該溶液在37 。(：下靜置63小時後’用膜濾器過濾。濾液用HPLC ( 〇DS 管柱、2.0 Φ X 2 5 cm、展開溶劑為5 OmM乙酸銨水溶液：乙 腈=8 0 : 20、流速7.5ml/min )純化後，濃縮溶劑，之後康 61 315343 1330641 结乾燥。將殘留物溶解於2 0 0 // 1水中，用〇 〇 S -管柱層析 法（Cosmosil75C丨s-opn、最初用水洗淨，之後用25%乙腈 水溶液溶出）進行脫鹽處理’得到目的化合物（C 4 ) 0 · 6 U g。 lH NMR (4 0 0MH25, D2〇, 30〇C, HOD = 4.8i) s 8. 00 (d. 2H, J=7.2, Fmoc). 7.7 9 (d, 2H / = 7-2· Fmoc), 7.5 9 (d d, 2 H, J *7. 2r Fm〇 〇r 7 5 2 d. 2 H, J =7. 2, Fmo c). 5.2 1 (s . J.H, Ma η 4-H I), 5 0 9 1H. J = 10.〇, GlcNAcl-Hl), 4.60-4,75 (m,)t 4.40-4.5 0 <m, 2H). 4.3 2 (bd. IH. ； = 2.3), 4 28 <t>«, i H), 4, 2 2 (b d d, 1H, J a = 9. 7, j b = 2. 8.

Man4-H2h 2.80-2.95 Cm, 2H. Asn-0CH, NeuAc 7-H 3 e q), 2.60-2.75 (m, L Hr As n-j3CH). 2. 1 4, 2. 14, 2,12 (eachs. Acx3), 1-98 (S. 3 H. Ac), 1,8 δ (d d, IK. J a = 1 2. 1, Jb=l2.0. NeuAc7-H3ax)-

Map·幻一 4G1 cNAc_ Ain-Fitoc «euAc otZ-^SGal 〇 l->4ClcSAc 31—2Mea e (C 4) 實施例5 實施例1中得到之化合物（Cl-3 ) ( lmg，0.44 // mol ) 和牛jk清白蛋白1 mg溶解於HEPES缓衝溶液（50mM， PH5.0) 50// 1中，加入卢-半乳糖苷酶（生化學工業公司製 造、來自 JackBeans，5//L，100mU)。將該溶液在 37°C 下靜置1 5小時後，用膜濾器過濾。濾液用HPLC ( ODS管 桎、2.0 φ X 25cm、展開溶劑為50mM乙酸銨水溶液：乙腈 =82 : 18、流速7_5ml/min)純化後，濃縮溶劑，之後凍結 乾燥。將殘留物溶解於200 // 1水中，用ODS-管柱層析法 (€〇3111〇31175〇18-〇卩11、最初用水洗淨，之後用25%乙腈水 62 315343 1330641 溶液溶出）進行脫鹽處理，得到目的化合物（C5 ) 0.3 // g。 !H NMR(4 0 0MH7.. d2o, 3 or.. HOD = 4. 8 π δ 8. Ο I (d. 2H. J =7. 2. Fmo c), 7. 8 1 (d. 2H. J = 7.2, Fmoc), 7. 6 0 <dd, 2 H. J = 7. 2. Fmo c), 7.5 3 (d d, 2 H, J = 7. 2. Fmo c), 5. 2 l (s . I H, Ma η 4-H1 >. 5. 0 9 (d, 1 H, J =9. 6. G 1 cNAc 1 -H 1). 5. 〇 2 (s. 1 H,

Man4' —H—i). 4.55—4.70 (m), 4.44 (lHf Fmoc), 4. 3 0 - 4. 3 8 (bmf 2H). 4.2 8 (bof 1 H, Ma η 4-H2). 4.【7 -4. 2 5 (rru 2H)·· 2. 7 S - 2, 9 5 (m_ 2H, As u Ac 7 *-143 e q), 2.55-2.70 (m> 1 H, Asn - /3CH). 2-16, 2.15. 2.14. 2.12 (eachs, 12H. Acx4), ^98 <s, 3H, Ac>, 1.89 (dd. 1H. Ja = i2.2, Jb== 12.0. NeuAc7-H3ax) iNsii.\c o 2— aca I β!—iClcffAc β J—ZMan a lx 6 l-^4G!cKAc^ l-^fiGlcNAc-^Asn-rsicc

CicNAci31—2to a (C 5) 實施例6 貫施例5中得到之化合物（c 5 ) ( 1 _ 0 m g，0 · 4 8 // m o 1 ) 和牛血清白蛋白lmg溶解於HEPES緩衝溶液（50mM， pH5.0) 50以1中，加入N-乙醯基-yj-葡糖胺酶（Sigma-

Aldrich 公司製造、來自 jack Beans ) 4 " 1 ( 25OmU )。將該

溶液在37°C下靜置22小時後，用膜濾器過濾。濾液用HPLC (ODS管柱、2.0Φ X 25cm、展開溶劑為5〇mM乙酸銨水 溶液.乙腈=82 : 1 8、流速7.5ml/min )純化後，濃縮溶劑， 之後束結乾燥。將殘留物溶解於2 〇〇 # 1水中，用〇ds-管 柱層析法（Cosmosil75Ci8-opn、最初用水洗淨，之後用25〇/〇 乙腈水溶液溶出）進行脫鹽處理，得到目的化合物（C6 ) 〇·6 y g。 63 315343 1330641 1H NMR (4 0 0MHz, DL.Or 30V, HOD = 4. SU 6 8. Ο \ (d. 2H. J = 7.6. Fmoc). 7.8 0 (d, 2H. J = 7. 5, Fmoc), 7. 6 0 (d d. 2 H, J = 7. 6, Fmoc). 7.53 (d d, 2Hf J = 7, 6, Fmoc). 5. 1 S is, 1 H, Man 4-Hl>, 5.0 9 id. 1H. J =9, 2. G 1 cNAc 1 -H 1). 5.0 2 is . 1 H,

Man4, -H-l), 4.3 5 (s, 1 H) 4.58-4,75 (m, oH). 4.3 8 - 4.4 8 (m, 2 H. Fmoc).. 4 40 ibci, J = 2.4. 1H). 4.18-4.25 (m, 2 H)r 4.15 (m. i H), 2.8 0 - 2.9 5 (cn, 2H. Asn-βΟΗ. N e u A c 7 - H 3 c q). 2.6S-2.75 Cm, 1 H, A s η-β CH), 2.16, 2.13, 2. 1 2 (c a C h S . 9 H, AC x 3)r 1.9 8 (s, 3H( Ac). 1.8 9 (d d, !H，Ja=12.2. Jb-l2.〇, Ne：uAc7-H3ax).

MeuAc〇2-^3Gal 0 3-^^fr£cNAci I—ZMaao： 1\ 、3n 0 】♦奴UNAc 泠 /3

Man Of r (C 6) 實施例7 實施例6中得到之化合物（C6) ( l.Omg，0.5 3/z mol) 和牛血清白蛋白lmg溶解於HEPES緩衝溶液（50mM， pH5.〇) 50/zl 中’加入 α-甘露糖昔酶（Sigma-Aldrich 公 司製造、來自Jack Beans ) 10"1 (0.9U)。將該溶液在37 C下靜置20小時後，用膜濾器過濾。濾液用HPLC ( ODS 管柱、2.0 φ X 25cm、展開溶劑為5〇mM乙酸銨水溶液：乙 腈=80 : 20、流速7.5ml/min )純化後，濃縮溶劑，之後；東 乾燥。將殘留物溶解於200/zl水中，用〇DS -管柱層析 法（Cosmosil75C丨《-όρη、最初用水洗淨，之後用25%乙腈 水溶液溶出）進行脫鹽處理，得到目的化合物（C7 ) 〇.5 A g。 315343 1330641 造、75μ1，34mU)在37°C下靜置3.5小時。用HPLC監視 反應，當原料消失時結束反應，反應液用膜濾器過濾。濃 縮濾液使液量減少後，用HPLC分取管柱純化（YMC—Pack R 5 D ODS，D-ODS-5-A， 20x 250mm > AN/25mM AcONH4 buffer=l 8/82，7.5ml/min.，wave length ; 274nm)，25 分鐘 後溶出化合物（C7A )。分取後，脫鹽處理，之後進行凍結 乾燥，得到化合物（C7A) 1.3mg ( 67.8% )。化合物之NMR 資料如下。 5H NMR (4 Ο 0 MHz, DaO, 3 0*C, HOD =4. 8 1) δ 8.00 (d, 2H, J =7. 2r Ftno c). 7. 7 9 (d, 2H. J = 7. 2. Fmo c). 7.6 0 (d d, 2 H, J = 7. 2r Fmo c), 7.5 2 Cd d, 2H, J=7. 2, Fmoc), 5.2 1 (s，l H, Man4-Hl), 5.09 (d. 1 H. J =8. 8, G I c NAc I -H 1). 5.03 (s, 1 H.

Ma.n 4 -K - 1), 4.8 6 (s , 1 H). 4. 5 8 -4. 7 2 (m. 5H), 4.5 4 <d. 1H, J = 8. 0), 4,3 8 -4.4 8 <m, 2 H) 4.34 (bs, 1H). 4-28 (bs, 1H), 4.15-4.25 (m, 2 H), 2.80 — 2,8 6 (dd, 1H, Ja = 4,4, J I 2. 4, NsuAc 7—H3gq), 2. 7 3 - 2. 8 3 (m, dd, 3H. Ja = 4.4, Jb=12.4, Asn — /3 CH. Ne u Ac 7-H3 e q). 2.6 0 - 2.7 2 (m. 1 H, A s n - i3 C H), 2.16. 2. I o, 2.14, 2.12 (each s. Ac x 5), 1. 9 8 (s. 3H. Ac). 1.8 9 (del, 1 H, J a= l 2, 4, ； b = 12.0. Ν'euAc7-H3ax). 1.81 (dd, 1H, Ja=12,4,

Jb=i 2. 0, NeuAc 7—H3ax> .

KsuAc a2—cGj] β !—·1Π!^4ς；31—2.v：3r.a !χ [-^4C!cNAc-<-Asn-?.ti〇i; |iauA^a2-^3C3! Q 1—4Clc^Ac3 I一〆

實施例7B 以Fmoc基保護天冬醯胺之胺基氮之二涎（a 2,3 ) ( a 2,6)糖鏈天冬醯胺之合成 66 315343 1330641 7FNcuAc g 2—ffial β 1—4ClciiAc β 1—2Mar.a ^Mar.5 1^4ClcHAci3 l-^dClc.te-^Asn-Fau>c IFNciMc ar2·说il 3 l‘4GkiWci3 i.2Mana 1〆 (C 8 - I)

Cal 2-^-^5β〇 Ιχ ^Man β 5-^4ClcMc j3 l-^4Glc?fAc-^ASn-Fa;6C TFN*euAt<i2--*-3Cai β l-^4C!cNAcj3 E-^2feno 1^" <C 8 - 2) ??i!euAc a2.SGaUJ 丨一4(ilc«Ac们♦Silaniif I、 %aiv51-^^CicNAci? i'^i5GlcN'Ac^*A5ft-Fiicc G3i B i*4ClcKAc Q l-^2MaRa Γ (C 8 - 3) 實施例9 以實施例8中得到之化合物（C8-2 )替代實施例2之 化合物（c 1 -2 )以外，同實施例2 —樣之方法，得到目的 化合物（C 9 )。 CIc^Aci ί*^2Μ3εαΙν 'g U^fi !-^4ClcKAc β 1-*-40ΙεΝΑ<τ*Ά5β-Ριηοε 7FNCUAC aZ—3ϋΰΙ B 1-^^lcNAc^ 2-»2Man a (C9) 實施例i 〇 以實施例9中得到之化合物（C9 )替代實施例3之化 合物（C2 )以外，同實施例3 —樣之方法，得到目的化合 物（C10)〇 ΜΛΠ <1 1-y ^lan/3 J^-lGkh'Acj? [—iClcNAc-'-Asn-Fmoc β l-^4ClclfAc3 l—2Xa.ia CC 1 0) 實施例Π 以實施例1 0中得到之化合物（C 1 0 )替代實施例4之 化合物（C3 )以外，同實施例4 一樣之方法，得到目的化 69 315343 1330641 合物（C11 )。

Man β l-*-4〇fcNAc β l-*~4GlcNAc-^Asn-Fooc TFHeuAcλ2—3Cal 01—4GlcNftc & l^-2Man α Γ (C 1 1) 實施例12 以實施例8中得到之化合物（C8-3 )替代實施例5之 化合物（C1 -3 )以外，同實施例5 —樣之方法，得到目的 化合物（C 1 2 )。 7FNeuAc a 2 3Ca 1 ΰ 1—4CI cffAc β * ly ^Han^ 1-^4〇1〇{ίΛο β !·*·401οΝΑ〇-*-Α5π-?ιπΌε

GlcHAcjS ]-^2ManQrl^ (C 1 2) 實施例13 以實施例1 2中得到之化合物（C1 2 )替代實施例6之 化合物（C 5 )以外，同實施例6 —樣之方法，得到目的化 合物（C 13 )。 ?Risuj\cff2—3Gal 3 I一4Gld\ci31—2Man〇：

Vian/J l—4CilcNAci3 !-^4f.lcNAc-*-As,i-Fmoc Manet l〆3 (C 1 3) 實施例14 以實施例1 3中得到之化合物（c 1 3 )替代實施例7之 化合物（C 6 )以外，同實施例7 —樣之方法，得到目的化 合物（C14)。 7FKcuAc « 0 !-*-4C|cKAc0 l~*-2Man〇：.、 6Ma»i3 !*4GlcNAc/3 ]—<JGlcNAc-*-Asn-Fsioc (Cl 4) 70 315343 1330641 醯胺衍生物。 8FNcuAca2"^6Gal /3 1^4GlcNAcβ l-^2Uana 6Nan0 l-^4GlcNA〇i3 l-^4GlcNAc-^Asn-Fraoc >3 8FNeuAc a2-^6Cal β l-^4GIcNAc 0 l***2Man a r (C 3 6 - 1)

Gal β l-^4GlcNAc/3 l-^2Manaly ^Man0 1-^4G1cNAc0 l*^4GlcNAc-^Asn-Finoc 8FNeuAc a2"*-6Gal β 1-^-401εΝΆο β I-^2Man 〇t i (C 3 6 - 2) 8FNeuAc a2-^6Gal β I-**4GlcNAc 0 I-^2Man cc ly ^Man β l-^4GIcNAc* β l-^4GlcNAc-^Asn*Finoc

Cal β l-^4ClcNAc β l-^2Man a / (C 3 6-3)

GlcNAc β 2Man a ly ^Man/3 l-^4GlcNAc£f I-^4GlcNAc-^Asn-Finoc /3 8FNc uAc a 2B(ia 1 /3 1-^ 4G ] cNAc 0 !-► 2Man a lx (C3 7) 80 315343 1330641

Manalv

Manj3 i-^4Glc.NAc/3 l-^4GlcNAc-^Asn-faoc e /3 8FNeuAca2 — 6Cal β l-^4GlcNAc/3 l-*-2Man or r (C3 8)

Man/3 l-^4GlcNAc β l*^4GlcNAc-^Asn-Fmoc 8FNeuAca2-^6Cal β 1-^4G1cNAc0 l-^2Man a (C 3 9) 3 8FNeuAca2-^6Gal β !-^4(iIcNAc0 l-^2Manalx

CilcNAc0i-^2Manal*/ (C4 0)

Man /3 l，*4GlcNA(： 0 )+4GUNAc-^Asn-Finoc 8FNeuAca2^6GaI 0 l-^4GlcNAc/3 l-^2Mana lv 6

Mani3 l-^4GlcNAc/3 1^4GIcNAc-^Asn-Fmoc

Man a 1’ (C4 1) 8FNeuAc a2-^6Gal β l-^4G!cNAc)3 l-^2Manaly 6Man ]3 l*^4GlcNAc β 1^4GlcNAc-^Asn-Fmoc (C4 2) 9FNeuAc a2-^6Gal β 1—4GlcNAc β l-^2Man a ly 6 ΛΜαηβ ]-^4ClcNAc/3 l-^4GlcNAc-^Asn-Fn)〇c /3 9FNeuAca2-^6Gal β 1-^4G1cNAc0 l-^-2Mana r (C4 3-1) 81 315343 1330641

Man)31^4GlcNAc0 l-^4GlcNAc-^AsnfcFraoc

Gal β 1—4GlcNAc0 I-^2Man a \ 9FNcuAca2-^6Gal β l-^4GlcNAci3 l-^2ManalX (C 4 3 - 2) 9FNcuAca2-^6Gal β l-*-4GlcNAc/3 l-^2Man a

GaI01-^4GlcNTAci31-^2Mana 3

Man/31-^4GlcNAci3 l-^4ClcNAc-^Asn-Fooc (C4 3 — 3)

GlcNAc 0 1-*-2Μαπ a \ 6

Mani3 l-»-4GlcNAc β l-^4ClcNAc-^Asn-Fmoc 9FKeuAc a2-^6Gal β 1^4G!cNAc0 l»2Man a (C44)

Man a iy 9FNeuAc a2-^6Cal β l-^4GlcNAc β l-^2Man a

Man /3 ]-^4GlcKAc β l-^^GlcNAc-^Asn-Fmoc (C4 5)

Man 0 l-*-4G!cNAc β l-^4CilcNAc-^Asn-FiB〇c 9FNeuAc〇i2^6Galfll-^4GlcNAc01—2Manar (C4 6) 9FNeuAcai2 + 6Gal 0 l+4GlcNAc0 l—"2MaDQ： ly

Man/3 l*^4GlcNAc β I-*-4GlcNAc-^Asn-Fraoc

GlcNAc β J-^2Man a r (C4 7) 9FNeuAc a2-^6Gal β !-^4GlcNAci3 l-^2Manalx

Man0 l-^4GlcNAc£i l-^4GlcNAc-^Asn-Fjn〇c

Man a (C4 8) 9FNeuAc〇f2^6Gal β l-^4GlcNAc)3 l-^2Manaly ^Man/5 I-^4GlcNAc3 l-^4GlcNA(r^Asn-FiD〇c (C4 9) 82 315343 1330641 其中’代表例 8Fa-2,6-ll 糖- Asn-Fmoc(C36-l)之 NMR資料如下。 lH NMR (4 Ο Οί^Ηζ , D,0. 3 01：, HOD = 4. 8 1) δ 8 01 (d, 2H, J =7. 4, Fmo c). 7.8 0 (d, 2H, J = 7. 4. Fmo c), 7.5 9 (d d. 2 H, J =7. 4, Fmo c). 7.5 2 (〇 dd, 2 H, J = 7. 4, Fmo c), 5.22 (s, 1H: Man 4-HU, 5-08 <d, 1 H, J = 9. 4. G l c NAc 1 -H 1), 5.0 5 ( s . 1 H.

Man4’ 一H-i>，4.35-4.95 (m· l H), 4. 5 5 - 4. 7 5 (m), 4.53 (d, 1H. J = 7. 9), 4.4 3 (m. 1 H), 4.35 (bs, 2Hr Man3-H2), 4. 2 8 (b s, 1 H, Man 4-H 2). 4. 1 0-4. 2 5 (m, 2 H), 2.7 5 - 2.8 5 (m, 1 H, A s n - j3 CH), 2.63-2.7 〇 (dd, 2H, Ja*3.9, Jb=12.〇, NeuAc7, 7' -H3e Q), 2.5 5 - 2,6 5 Cm, 1H, A s n-j9 CH), 2. 16, 2. 11, 2.0 8 (e a c h s , 1 5H. Ac x 5). 1.8 4 (s , 3H, Ac), 1. ? 4 (dd, lH, Ja—12.3, Jb—12.2, NeuAc7—H3ax) 實施例50 (糖鏈天冬醢胺衍生物之Fmoc基之脫保護） 在全部之糖鏈天冬醯胺衍生物中，根據下面之順序進 行Fmoc之脫保護。首先’在糖鏈天冬醯胺Fmoc體每1 μηι〇1 中加入240μ1之Ν，Ν-二甲基甲醯胺、160μ1之嗎啉，在室 溫·氬氣氛下進行反應。之後用TLC (展開溶劑為1Μ乙 酸銨：異丙醇=8 : 5 )確認反應結束後，用冰水冷卻。在 該溶液中加入反應溶液10倍量之二乙鍵，授拌15分鐘後， 將析出之沈殿物過遽。將得到之殘造溶解於水中，在3 5 °c 下蒸發沈積物。再加入3ml甲苯後，反複進行3次蒸發沈 積物之操作。殘留物用逆相管柱層析法（（：〇5〇1〇8丨175(：18-OPN、I5x 100mm、展開溶劑為水）純化，得到對應之糖 S3 315343 ^30641 鏈天冬醯胺。 實施例5 1 (糖鏈天冬醯胺之天冬醯胺殘基之除去） 將實施例50中得到之糖鏈天冬醯胺與無水肼反應 後’根據乙醯化除去天冬醯胺殘基，得到對應之糖鏈。 實施例52至69 在參考例2、3、8至13、實施例1至7中製造之各 Fmoc-糖鏈天冬醯胺2nmol ’溶解於約1 〇mi之Tris-鹽酸緩 衝液中。在該溶液中加入20nmol之GDP-岩藻糖、〇.5mU 之岩藻糖轉移酶（Fucosyltransferase) V (人類，重組物）， 在37°C下靜置2小時，進行反應。反應液用2〇ml之超純 水稀釋後’用毛細官電氣泳動（fused si 1 ica capi 11 ary，5 0mm i.d.,60cm,buffer; 1 OOmM Tris-borate,pH=8.3 > lOOmM Heptane sulfonate ’ 施加電壓 27KV，溫度 25°C，214mm ) 進行分離，得到各目的物。 各實施例之原料及目的物如下。 表1 實施例5 2 84 315343 1330641 原料

NeuAc a2+6Cal fl l+4GlcNTAc 0 l+2Man〇r 1、 ^Man0 l-^4GlcNAci3 l-^4GlcNAc-^Asn-Finoc

Gal β 1—4GlcNAc β l*2Man a / (化合物2) 目的物

FucaU 3

NeuAc or2+6Gal /3 丨+4GlcNAc 0 丨~^2Man a: 1、 ^Mani3 ]-^4GlcNAci3 l-*"4(ilcNAc-^Asn-Finoc /3

Gal 0 l+4GlcNAc 0 l+2Man a lx Fuc a r

Fucalv 3

NeuAc a2-^6Gal β I-^4GlcNAc 0 l-^2Mana ly

Mam3 I-^4tilcXAc0 l-^4GlcNAc*^Asn-Fnjoc

Gai01 4GlcNAci31—2Manal

NeuAca2**-6GaI β 1-^401 cNAc/3 l*2Man a ly

Man/3 l-^4G!cNAc/3 l-^4G!cNAc-*fcAsn-Fnioc

Gal β l-*-4GlcNAc β I—2Man a Fucar 實施例53 85 315343 1330641 原料

Cal β 1-^4G1cNAc0 l-^2Mana lv ^Manfi l-^4GicNAc0 !-^4GJcNAc-»-AsD-Fnioc NeuAc o2-^6Gal β 1-^4G1cNAc0 l-^2Man a r(化☆物3)

Fuc a lv 3 Gal 0 l-^4GlcNAc β l-*-2Man a l*y NeuAca2—6Gal β l—4r.lcNAc/31—2Mana Fuc a Γ Fuc a Iv 3 Gal β l-^4GlcNAc β l-^2Man a )y XeuAc a2-^6Ga! β l-^4GlcNAc β l-*^2Mana

Man/3 Ι·*·4ϋΙοΚΑο)3 l-^4CIcNAc-^Asn-Finoc ^Μαηβ 1-^4G1cKAc0 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc

Gal β l"^4GlcNAc 0 l-*"2Man a Iv 6 /3 NcuAc a 2-*"6Cal β 1-^4GIcNAc β I-^2Man a v /3 Fucar

Mani3 1-^4G)cNAc0 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc 表2 實施例54 86 3)5343 61330641 原料

Gal β l-^4ClcNAc β I—2Man a Ix

Man0 1~^4G1cNAc0 l-^4GIcNAc-^Asn-Finoc y 3

Gal 0 l-^4GlcNAc β l-^2Man a r (化合物4) 目的物

Fuc a 1χ 3

Gal 0 l-^4GlcNAc β l-^2Man a lx

Man/? l-*-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-^Asn-Fm〇c ί

Gal β l-^4GlcNAc β l-^2Man a ly3 y3

FucaT

Fuc a lv 3

Gal 0 l-^4G!cNAc/3 1—2Mana lx

GaI/31*4GlcNAc/31-^2Man a〆3

Man0 I-*-4GlcNAc0 I-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc

Cal β l-^4GlcNAc β l-*^2Man a Iv 6

Manj3 I-^4GIcNAc0 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc

Ga! β 1—4GlcNAc β 1—2Man a Fucaf 實施例55 87 315343 1330641 原料

Gal /3)-^4GlcNAci31-^2Mana

GlcNAt/3 l-*-2MaDa

Man/3 l-*-4GlcNAc/3 l*^4GlcNAc-^Asn-Finoc (化合物1 1) 目的物

Flic a lv 3，

Gal β l-^4GlcNAc $ l-^2Mana lv 6 ΛΜβη $ l-^4GlcNAc β l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc /3

GlcNAci3 l-^2Mana r 實施例56 原料

GlcNAc β l—2Man α： I、 ^Manj3 1-*>4G1cNAc/3 l-*-4GlcNAc-^Asn-Fmoc Λ

Gal j3 l-^-4GlcNAc β I-*-2Man a \ (化合物1 2 ) 目的物

GlcNAc^ l-*-2Mana \

Man/3 )-^4GlcNAc/3 l-*-4ClcNAc-^Asn-Fmoc

Gal β 1—4GlcNAc β l-^2Man a ly 3

Fuca 1’ 實施例57 88 315343 1330641 原料

Ga 1 β 1-»-40 cNAc (3 l-^2Man α 1χ

Man/3 1**MGIcNAcj3 l+4GlcNAc+Asn-Fm〇c ι y

Man α γ (化合物1 3〉 目的物

Fucalx 3

Gal β l-^4GlcNAc β l-^2Man a lx 6

Mani3 l-^4GlcNAci3 l-^4C!cNAc-^Asn*Fmoc

Man a v 實施例58 原料

Man a ly

Man/3 1-^4G1cNAcj3 l-^4GlcNAc-^Asn-Finoc

Gal β l-^4GlcNAc/3 l-»^2Mane 1;

(化合物1 4) 目的物

Man α 1、

Manj3 l-^4GlcNAcj3 I-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc

Gal β l*^4GlcNAc/3 l-*-2Manal^ y3

Fuc α r 實施例59 89 315343 61330641 原料

Gal β 1-^4G1cNAc0 l-^ZMana 1χ

Man/3 l+4GlcNAci3 l-^4GIcMc+Asn-Fmoc (化合物1 5) 目的物

Fuc α \ 3

Gal β l-*^4GlcNAc β l~^2Man a ly

Man /3 l-*-4GlcNAc β l-*-4GlcNAc-^Asn-Fmoc

實施例60 原料

Man /3 !-► 4G1 cNAc β 4G1 cNAc-^-Asn-Fmoc

Gal β l-^-4GlcNAc β 1-^-2Man at (化合物1 6 )

目的物

Man )3 1-^4GIcNAcj3 1^4GlcNAc-^Asn-Fmoc

Gal β l-^4GlcNAc j3 l-^2Man a 1

Fuc α Γ

實施例6 1 90 315343 61330641 原料

NeuAc a 2-^3Cal β 4GIcNAc β 1—2Man α 1χ

Hanfi l-^4GlcNAc/3 )-^4GlcNAc-^A$o-Fnioc

NcuAca2-^3GaI β I-^4GlcNAc β l-^2Mana r (化合物1 7) 目的物

Fuc a lv 3

NeuAc a2—3Gal β l-^4GIcNAc β l-^2Man o lx l-*-4GlciiAc0 l-^4GlcNAc-^Asn-Fraoc

KeuAc a2-*3Gal β 1-^4G1cNAc0 l-*-2Man a \^' y3

Fuc α Γ Fuc a ly 3

NeuAca2-^3Gal β l-^4GlcNAc/31^2Man oc \ t Man)3 l-^4GicKAc5 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc

NcuAc a2***3Cal β l-^4GlcNAc l-^2Man a

NeuAc a2*^3Gal β l-*~4GlcNAc β l-^2Man ct Iv 6 ^Mani3 l-^4GlcNAc/S l-^^GIcNAc-^Asn-Fmoc

NeuAc a2-*-3Cal β l-^-4GlcNAc β ]-^2Man a FucaT 實施例62 91 315343 1330641 原料

NeuAc a2-^3Cal 0 l*4GlcNAciJ l-^2Man a Iy

Man3 l-^4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc

Gal β 1^4GlcNAc β l-^2Man α Γ (化合物1 8) 目的物

Fuc a lv 3

NeuAca2-^3Gal β j-^4GlcNAc β l-^-2MaDal-y ^Man^ l-*-4GlcKAc/5 ]-^4GlcNAc*Asn-Fnioc

Gal β l*4GlcNAc β l*2Mana Γ Fuca r

Fucalv

NeuAc a2"^ 3 3Gal β l-^4Glc.VAc β 1-^ZMan a ly ^Man0 !-^4GIcNAc0 l-^4(ilcNAc-^Asn-Fnioc y3

Cal β l+4GlcNAci3】_2Mana

NeuAc β 1-^4G1cKAc0 l-*-2Man a

Cal β l-*-4GlcNAc β l-^2Man a /3 Fucar ^Man/3 1-^4G1cNAcj3 I-^4GlcNAc-*^Asn-Finoc 表4 實施例63

92 315343 1330641 原料

Gal β 4GlcNAc β l-^2Mana 1ν $Man£M+4GlcNAcβ l+4Glc!VAc命Asn-Fmoc

NeuAc a2-^3Gal 0 l-^4GlcNAc β l-^2Mana r (化合物1 9) 目的物

Fuc α }χ 3

Gal β l-^4GlcNAc β l-^2Man a lv 6 ^Ηηηβ 1-^4G1cNAc0 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc

NeuAc a2-^3Cal 01^4GlcNAc β I—2Man a Fuca r

Gal β 丨♦AGlcNAc β i+2Man a Ιχ

Mani3 l-*-4GlcNAcj3 l-^4GlcNAc^"Asn**Ftnoc

NeuAc a2-*-3Gal β l-^4GlcNAc β I-^2Man a Fuca〆

Fuca ly

NeuAc a2-^3Gal β 1-^4G1cNAc0 l-^2Mana

Man/3 1~^4G1cNAc5 l-^4GlcNAc-*-Asa-Fmoc

Gal/3 1-^4GIcNAc3 1^2Man〇! 實施例64 93 315343

1330641 原料

GlcNAc01-^2Manalx ^Man0 1-*^4〇ΙοΝΑο/3 l-^4GlcNAc-^Asn-Fnioc

NeuAc a2-^3Gal β l-^4GlcNAc β l-^2Man α r (化合物2 0) 目的物

GlcNAc0 l-^2Man〇；

NeuAc cr2-^3Gal β l-^4GlcNAc)3 l-^2Mana Fuc α I /

Manfl 】*^4GlcNAc)3 l-^4CkNA<r^Asn-Fni〇c

實施例65 原料

Man a lv 6 rtMan/3 1-^4G1cNAcj3 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc y3

NeuAca2-^3Cal β 1-^4G1cNAcj3 I-^2Manar (化合物2 1)

目的物

Man a \

Manj3 l，4GlcMc；3 l_4GlcNAc~^Asn-Fraoc

NeuAc a2-^3Gal β l-^4GlcKAc 01-^2Manct Γ Λ

Fuc a Γ 實施例66 94 315343 1330641 原料

Man β l-*-4GlcNAc β l-^4GlcNAc-^Asn-F®oc

NcuAc a2-^3Gal 0 I-^-4GlcNAc β )-»-2Man a r (化合物2 2) 目的物

Man0 1.4GlcNAc 0 I_4GlcNAc+Asji-Fmoc

NeuAc a2-^3Gal 0 l-^4GIcNAc 8 l-^2Man a ：

A

Fucar 實施例67 原料

NeuAc a2-^3Gal β I—4GlcNAc β 1—2Man α lx 6

Man 5 1-*-4GIcNAc0 )-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc

GlcNAc0 I-^2Man a r (化合物2 3) 目的物

Fuca 1、 3

NcuAc tt2*^3Gal β l*^4GlcNAc 0 l-^2Man a K

GlcNAcS l*^2Mana 1 y3

Man/31-^4GIcNAc0 l-^4GlcNAc-^Asn-Fmoc 實施例68 95 315343 I1330641 原料

NeuAc a2-^3Gai β 4GI cNAc β l-^2Man a ly

Man/3 1-^4G1cNAc0 l-»-4G]cNAc*^Asn-Fnioc

Man a 〆 (化合物2 4) 目的物

Fuc a ly 3

NcuAc 〇：2-»-3Gal /3 l+4GlcNAc /3 】+2Man a 1、

Man a 1 y3

Man)3 l-^4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-*-Asn-Fioc 實施例69 原料

NeuAc a2-^3Gal β l-*^4GlcNAc /3 l-*-2Man a 1-y ^Man/3 l-^4GlcNAc β l-*^4GlcNAc-^Asn-Fmoc (化合物2 5) 目的物

Fuc a Jv 3

NeuAc a2-^3Gal β l-**4GlcNAc 0 l-^2Man a ly

Man0 J+4GlcNAc/3 l+^lcNAc-HVsn-Fnioc 96 315343

Claims (1)

1330641 第92136364號專利申請案 I 5. 12修正 (99年5月12曰） 年月曰> 補充 拾、申請專利範圍： 1. 一種糖鏈天冬醯胺衍生物，係如下式（22)所示之含11 糖之（α2,3)(α2,6)糖鏈天冬醯胺衍生物，

[式中、R1為式（2)所表示之基、RY為下式（7)所表示之

R，R’，R”表示以下組合 (d) R=OH、R，= OH、R” = OH， Asn為天冬醢胺，Fmoc為第基甲氧基缚基， AcHN為乙醯胺基。 97 (修正本)315343 1330641 第92136364號專利申請案 (99年5月 12日） 2. —種糖鏈天冬醯胺衍生物，係如下式（23)所示之含11 糖之（〇:2,3)(〇:2,6)糖鏈天冬醯胺衍生物、

Asn-Fxnoc (23) [式中、R2為式（2)所表示之基、Rx為下式（7)所表示之

R，R’，R”表示以下組合 (d) R=OH、R，= OH、R，，= OH， Asn為天冬酿胺，Fmoc為苐基甲氧基裁基， AcHN為乙醯胺基。 98 (修正本)315343