JP2002045196A - 混成型糖鎖の酵素的合成方法 - Google Patents
混成型糖鎖の酵素的合成方法Info
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- JP2002045196A JP2002045196A JP2000234814A JP2000234814A JP2002045196A JP 2002045196 A JP2002045196 A JP 2002045196A JP 2000234814 A JP2000234814 A JP 2000234814A JP 2000234814 A JP2000234814 A JP 2000234814A JP 2002045196 A JP2002045196 A JP 2002045196A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 β１−２ アセチルグルコサミン転移酵
素Ｉの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセチルグルコ
サミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を有する複合
糖質を、β１−２ アセチルグルコサミン転移酵素Ｉお
よびβ１−４ ガラクトース転移酵素共存下にてＮ−ア
セチルグルコサミニル化およびガラクトシル化すること
を特徴とする、混成型糖鎖を持つ複合糖質の製造方法。 【効果】 本発明の製造方法により、従来、安定且つ大
量の供給が困難とされていた混成型糖鎖を有する複合糖
質を簡便に製造できる。当該混成型糖鎖は糖鎖工学の基
礎分野や診断用途に広く利用することができる。
素Ｉの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセチルグルコ
サミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を有する複合
糖質を、β１−２ アセチルグルコサミン転移酵素Ｉお
よびβ１−４ ガラクトース転移酵素共存下にてＮ−ア
セチルグルコサミニル化およびガラクトシル化すること
を特徴とする、混成型糖鎖を持つ複合糖質の製造方法。 【効果】 本発明の製造方法により、従来、安定且つ大
量の供給が困難とされていた混成型糖鎖を有する複合糖
質を簡便に製造できる。当該混成型糖鎖は糖鎖工学の基
礎分野や診断用途に広く利用することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、診断用途あるいは
糖鎖工学研究用途として有用な混成型糖鎖の酵素を用い
た簡便な製造方法に関する。
糖鎖工学研究用途として有用な混成型糖鎖の酵素を用い
た簡便な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の研究により糖鎖が生体機能、ある
いは癌等の種々の疾病に深く関与していることが明らか
となってきた。この糖鎖の一形態である糖タンパク質糖
鎖はペプチド鎖のアスパラギンと糖鎖が結合したN−結
合型糖鎖、ペプチド鎖のセリンまたはトレオニンと糖鎖
が結合したO−結合型糖鎖に分類される。このうち、N−
結合型糖鎖はコア構造となるトリマンノース構造のマン
ノースにマンノースのみが結合した高マンノース型糖
鎖、Ｎ−アセチルグルコサミンのみが結合した複合型糖
鎖、マンノースとＮ−アセチルグルコサミンが結合した
混成型糖鎖に分類される。これら３種類の内、複合型糖
鎖および高マンノース型糖鎖と種々の疾病との関連につ
いては解析が進んでいるが、混成型糖鎖についてはあま
り解析が進んでいないのが現状で、さらなる解析が望ま
れている。このような混成型糖鎖の解析には分析の標準
品として使用される、あるいは混成型糖鎖形成に関与す
る糖転移酵素の基質として使用される、混成型糖鎖の標
品が必要となる。
いは癌等の種々の疾病に深く関与していることが明らか
となってきた。この糖鎖の一形態である糖タンパク質糖
鎖はペプチド鎖のアスパラギンと糖鎖が結合したN−結
合型糖鎖、ペプチド鎖のセリンまたはトレオニンと糖鎖
が結合したO−結合型糖鎖に分類される。このうち、N−
結合型糖鎖はコア構造となるトリマンノース構造のマン
ノースにマンノースのみが結合した高マンノース型糖
鎖、Ｎ−アセチルグルコサミンのみが結合した複合型糖
鎖、マンノースとＮ−アセチルグルコサミンが結合した
混成型糖鎖に分類される。これら３種類の内、複合型糖
鎖および高マンノース型糖鎖と種々の疾病との関連につ
いては解析が進んでいるが、混成型糖鎖についてはあま
り解析が進んでいないのが現状で、さらなる解析が望ま
れている。このような混成型糖鎖の解析には分析の標準
品として使用される、あるいは混成型糖鎖形成に関与す
る糖転移酵素の基質として使用される、混成型糖鎖の標
品が必要となる。
【０００３】混成型糖鎖の疾病との関連については遺伝
性の貧血疾患であるＨＥＭＰＡＳ病（hereditary eryth
roblastic multinuclearity associated with positive
acidified serum lysis test）における混成型糖鎖の
増加が知られている。すなわち、赤血球表面糖タンパク
質であるＢａｎｄ３あるいはＢａｎｄ４．５は、正常時
には、下記式
性の貧血疾患であるＨＥＭＰＡＳ病（hereditary eryth
roblastic multinuclearity associated with positive
acidified serum lysis test）における混成型糖鎖の
増加が知られている。すなわち、赤血球表面糖タンパク
質であるＢａｎｄ３あるいはＢａｎｄ４．５は、正常時
には、下記式
【０００４】
【化５】
【０００５】（式中、Ｒ２はポリペプチド鎖を示し、Ｍ
ａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセ
チルグルコサミン残基を示し、Ｇａｌはガラクトース残
基を示し、Ｓｉａはシアル酸残基を示す）で示されるよ
うに、糖鎖部分として、ポリラクトサミン構造を有する
複合型糖鎖を有しているが、ＨＥＭＰＡＳ病患者では
ａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセ
チルグルコサミン残基を示し、Ｇａｌはガラクトース残
基を示し、Ｓｉａはシアル酸残基を示す）で示されるよ
うに、糖鎖部分として、ポリラクトサミン構造を有する
複合型糖鎖を有しているが、ＨＥＭＰＡＳ病患者では
【０００６】
【化６】
【０００７】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る）で示されるように、糖鎖部分が混成型糖鎖へと変化
している（M.N. Fukudaら, J. Biol. Chem. 262, 7195
(1987)、M.N. Fukudaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
27, 7443 (1990)）。これらの疾病と糖鎖構造変化の関
連性の解明、あるいは治療用途や診断用途として、
る）で示されるように、糖鎖部分が混成型糖鎖へと変化
している（M.N. Fukudaら, J. Biol. Chem. 262, 7195
(1987)、M.N. Fukudaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
27, 7443 (1990)）。これらの疾病と糖鎖構造変化の関
連性の解明、あるいは治療用途や診断用途として、
【０００８】
【化７】
【０００９】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る）で表される化合物およびそれらの前駆体である式
（I）
る）で表される化合物およびそれらの前駆体である式
（I）
【００１０】
【化８】
【００１１】（式中、Ｒ１は水酸基、２−アミノピリジ
ル基、アスパラギンあるいはその類似体、またはポリペ
プチド鎖を示し、その他の記号の定義は前述の通りであ
る）あるいは式（II）
ル基、アスパラギンあるいはその類似体、またはポリペ
プチド鎖を示し、その他の記号の定義は前述の通りであ
る）あるいは式（II）
【００１２】
【化９】
【００１３】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る）で表される混成型糖鎖を有する複合糖質が有用であ
る。
る）で表される混成型糖鎖を有する複合糖質が有用であ
る。
【００１４】また、Clostridium botulinumのＣ２毒素
が細胞毒性を発揮するには下記式
が細胞毒性を発揮するには下記式
【００１５】
【化１０】
【００１６】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る）に表される様な混成型糖鎖を有する構造が必要であ
ることが知られている（M. Eckhardtら、J. Biol. Che
m., 275, 2328, (2000)）。このClostridium botulinum
の感染予防あるいは治療、Clostridium botulinum毒素
の検出にこれらの混成型糖鎖が有用と考えられている。
る）に表される様な混成型糖鎖を有する構造が必要であ
ることが知られている（M. Eckhardtら、J. Biol. Che
m., 275, 2328, (2000)）。このClostridium botulinum
の感染予防あるいは治療、Clostridium botulinum毒素
の検出にこれらの混成型糖鎖が有用と考えられている。
【００１７】この様に、糖鎖工学研究用途あるいは種々
の疾病の研究用途、医薬品・診断薬用途に混成型糖鎖の
安定且つ大量な供給が重要になるが、これら糖鎖を天然
から高純度で大量且つ安定に供給することは非常に困難
であった。また、化学的に合成することも煩雑且つ低収
率であるため事実上困難であった。天然からの抽出ある
いは化学合成の他に酵母に混成型糖鎖を持つ糖タンパク
質を生産させる試みが為されている。すなわち、通常高
マンノース型糖鎖しか作らない酵母細胞にマンノース分
解酵素遺伝子とβ１−２ Ｎ−アセチルグルコサミン転
移酵素Ｉ遺伝子を導入し、
の疾病の研究用途、医薬品・診断薬用途に混成型糖鎖の
安定且つ大量な供給が重要になるが、これら糖鎖を天然
から高純度で大量且つ安定に供給することは非常に困難
であった。また、化学的に合成することも煩雑且つ低収
率であるため事実上困難であった。天然からの抽出ある
いは化学合成の他に酵母に混成型糖鎖を持つ糖タンパク
質を生産させる試みが為されている。すなわち、通常高
マンノース型糖鎖しか作らない酵母細胞にマンノース分
解酵素遺伝子とβ１−２ Ｎ−アセチルグルコサミン転
移酵素Ｉ遺伝子を導入し、
【００１８】
【化１１】
【００１９】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る）で表される混成型糖鎖を有する糖タンパク質を酵母
に生産させることに成功している（地神芳文、第17回バ
イオテクノロジーシンポジウム予稿集、第24頁、1999
年）。しかしながら、さらにガラクトースが付加された
式（I）あるいは式（II）で表されるような構造の糖鎖
は未だ得られていない。また、酵母の粗酵素液から糖鎖
を抽出するため、目的の混成型糖鎖を得るためには煩雑
な操作が必要であるといった問題点があった。
る）で表される混成型糖鎖を有する糖タンパク質を酵母
に生産させることに成功している（地神芳文、第17回バ
イオテクノロジーシンポジウム予稿集、第24頁、1999
年）。しかしながら、さらにガラクトースが付加された
式（I）あるいは式（II）で表されるような構造の糖鎖
は未だ得られていない。また、酵母の粗酵素液から糖鎖
を抽出するため、目的の混成型糖鎖を得るためには煩雑
な操作が必要であるといった問題点があった。
【００２０】この様に、糖鎖工学研究用途あるいは種々
の疾病の研究用途、医薬品・診断薬用途として重要な混
成型糖鎖を安定且つ大量に供給することは事実上困難で
あった。
の疾病の研究用途、医薬品・診断薬用途として重要な混
成型糖鎖を安定且つ大量に供給することは事実上困難で
あった。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、糖鎖工学や
診断用途として有用な混成型糖鎖を安定且つ大量に供給
することを目的とするものである。
診断用途として有用な混成型糖鎖を安定且つ大量に供給
することを目的とするものである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、β１−２ Ｎ−アセチ
ルグルコサミン転移酵素Ｉ（以下ＧｎＴＩとも略する）
の基質となり且つ非還元末端にＮ−アセチルグルコサミ
ンあるいはグルコースを持たない糖鎖を有する複合糖質
を、ＧｎＴＩおよびβ１−４ ガラクトース転移酵素
（以下β１−４ＧａｌＴとも略する）共存下にてＮ−ア
セチルグルコサミニル化およびガラクトシル化すること
により、混成型糖鎖を持つ複合糖質を酵素的に一段階で
簡単に製造することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は以下の通りである。 （１）ＧｎＴＩの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセ
チルグルコサミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を
有する複合糖質を、ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴ共
存下にてＮ−アセチルグルコサミニル化およびガラクト
シル化することを特徴とする、混成型糖鎖を持つ複合糖
質の製造方法。 （２）ＧｎＴＩの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセ
チルグルコサミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を
有する複合糖質が、式（Ia）
に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、β１−２ Ｎ−アセチ
ルグルコサミン転移酵素Ｉ（以下ＧｎＴＩとも略する）
の基質となり且つ非還元末端にＮ−アセチルグルコサミ
ンあるいはグルコースを持たない糖鎖を有する複合糖質
を、ＧｎＴＩおよびβ１−４ ガラクトース転移酵素
（以下β１−４ＧａｌＴとも略する）共存下にてＮ−ア
セチルグルコサミニル化およびガラクトシル化すること
により、混成型糖鎖を持つ複合糖質を酵素的に一段階で
簡単に製造することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は以下の通りである。 （１）ＧｎＴＩの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセ
チルグルコサミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を
有する複合糖質を、ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴ共
存下にてＮ−アセチルグルコサミニル化およびガラクト
シル化することを特徴とする、混成型糖鎖を持つ複合糖
質の製造方法。 （２）ＧｎＴＩの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセ
チルグルコサミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を
有する複合糖質が、式（Ia）
【００２３】
【化１２】
【００２４】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る）で表される化合物であり、混成型糖鎖を持つ複合糖
質が、式（I）
る）で表される化合物であり、混成型糖鎖を持つ複合糖
質が、式（I）
【００２５】
【化１３】
【００２６】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る）で表される化合物である、上記（１）記載の製造方
法。 （３）ＧｎＴＩの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセ
チルグルコサミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を
有する複合糖質が、式（IIa）
る）で表される化合物である、上記（１）記載の製造方
法。 （３）ＧｎＴＩの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセ
チルグルコサミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を
有する複合糖質が、式（IIa）
【００２７】
【化１４】
【００２８】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る）で表される化合物であり、混成型糖鎖を持つ複合糖
質が、式（II）
る）で表される化合物であり、混成型糖鎖を持つ複合糖
質が、式（II）
【００２９】
【化１５】
【００３０】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る）で表される化合物である、上記（１）記載の製造方
法。 （４）当該Ｎ−アセチルグルコサミニル化およびガラク
トシル化が、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとも略する）、ＵＤＰ−ガラクト
ース（以下ＵＤＰ−Ｇａｌとも略する）、緩衝液、およ
び２価金属の共存下にて行なわれることを特徴とする上
記（２）または（３）記載の製造方法。 （５）当該緩衝液の濃度が、10〜100mMである、上記
（４）記載の製造方法。 （６）当該緩衝液のpHが5.0〜8.5である、上記（４）記
載の製造方法。 （７）２価金属がマンガン塩、就中塩化マンガンであ
る、上記（４）記載の製造方法。 （８）マンガン塩の濃度が5〜50mMである、上記（７）
記載の製造方法。
る）で表される化合物である、上記（１）記載の製造方
法。 （４）当該Ｎ−アセチルグルコサミニル化およびガラク
トシル化が、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとも略する）、ＵＤＰ−ガラクト
ース（以下ＵＤＰ−Ｇａｌとも略する）、緩衝液、およ
び２価金属の共存下にて行なわれることを特徴とする上
記（２）または（３）記載の製造方法。 （５）当該緩衝液の濃度が、10〜100mMである、上記
（４）記載の製造方法。 （６）当該緩衝液のpHが5.0〜8.5である、上記（４）記
載の製造方法。 （７）２価金属がマンガン塩、就中塩化マンガンであ
る、上記（４）記載の製造方法。 （８）マンガン塩の濃度が5〜50mMである、上記（７）
記載の製造方法。
【００３１】本発明の混成型糖鎖を持つ複合糖質の製造
方法は、ＧｎＴＩの基質となり且つ非還元末端にＮ−ア
セチルグルコサミンあるいはグルコースを持たない糖鎖
を有する複合糖質を、ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴ
共存下にてＮ−アセチルグルコサミニル化およびガラク
トシル化することを特徴とする。
方法は、ＧｎＴＩの基質となり且つ非還元末端にＮ−ア
セチルグルコサミンあるいはグルコースを持たない糖鎖
を有する複合糖質を、ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴ
共存下にてＮ−アセチルグルコサミニル化およびガラク
トシル化することを特徴とする。
【００３２】本明細書における「複合糖質」なる用語
は、当分野で通常用いられている「糖質と他の化合物の
複合体」を意図するのに加え、より広義には糖質そのも
のならびにその修飾物をも包含する。当該他の化合物と
しては、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、脂質あるいは他
の天然または合成の高分子化合物（ウシ血清アルブミン
に化学結合させた糖、ポリアクリルアミドに付加させた
糖等）、低分子化合物（４−アミノ安息香酸エチルエス
テル（ABEE）、４−アミノ安息香酸オクタンエチルエス
テル（ABOS）、２−アミノベンズアミド（２−AB）等）
ならびにそれらの混合物等が挙げられる。本発明におい
て好適に用いられるアミノ酸としては、アスパラギンお
よびその類似体が挙げられる。本明細書において、「類
似体」とは、アナログ体もしくは化学修飾されたもの
で、具体的にはｔ−ブトキシカルボニル基（ｔ−Ｂｏｃ
基）、フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ
基）等の保護基で修飾されたもの等が挙げられる。糖質
の修飾物としては、例えば２−アミノピリジル化等で標
識化したもの等が挙げられる。より具体的には当該「複
合糖質」としては、糖質、糖タンパク質、プロテオグリ
カン、糖脂質が例示される。
は、当分野で通常用いられている「糖質と他の化合物の
複合体」を意図するのに加え、より広義には糖質そのも
のならびにその修飾物をも包含する。当該他の化合物と
しては、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、脂質あるいは他
の天然または合成の高分子化合物（ウシ血清アルブミン
に化学結合させた糖、ポリアクリルアミドに付加させた
糖等）、低分子化合物（４−アミノ安息香酸エチルエス
テル（ABEE）、４−アミノ安息香酸オクタンエチルエス
テル（ABOS）、２−アミノベンズアミド（２−AB）等）
ならびにそれらの混合物等が挙げられる。本発明におい
て好適に用いられるアミノ酸としては、アスパラギンお
よびその類似体が挙げられる。本明細書において、「類
似体」とは、アナログ体もしくは化学修飾されたもの
で、具体的にはｔ−ブトキシカルボニル基（ｔ−Ｂｏｃ
基）、フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ
基）等の保護基で修飾されたもの等が挙げられる。糖質
の修飾物としては、例えば２−アミノピリジル化等で標
識化したもの等が挙げられる。より具体的には当該「複
合糖質」としては、糖質、糖タンパク質、プロテオグリ
カン、糖脂質が例示される。
【００３３】当該Ｎ−アセチルグルコサミニル化および
ガラクトシル化を施す、出発材料としての複合糖質とし
ては、ＧｎＴＩの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセ
チルグルコサミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を
有するものであれば特に限定されない。ＧｎＴＩの基質
となり得る必須の条件としては、(1)Ｍａｎβ１−４Ｇ
ｌｃＮＡｃのマンノース部分がマンノースであるか、あ
るいは他の糖であってもその２位のＯＨ基がマンノース
と同じ立体構造であること、(2)当該マンノース部分の
４位がＯＨ基であることが挙げられる。具体的には以下
の式（Ia）、（IIa）、（IIIa）あるいは（IVa）で表さ
れる化合物ならびにそれらの誘導体が基質として用いら
れる。
ガラクトシル化を施す、出発材料としての複合糖質とし
ては、ＧｎＴＩの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセ
チルグルコサミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を
有するものであれば特に限定されない。ＧｎＴＩの基質
となり得る必須の条件としては、(1)Ｍａｎβ１−４Ｇ
ｌｃＮＡｃのマンノース部分がマンノースであるか、あ
るいは他の糖であってもその２位のＯＨ基がマンノース
と同じ立体構造であること、(2)当該マンノース部分の
４位がＯＨ基であることが挙げられる。具体的には以下
の式（Ia）、（IIa）、（IIIa）あるいは（IVa）で表さ
れる化合物ならびにそれらの誘導体が基質として用いら
れる。
【００３４】
【化１６】
【００３５】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る）
る）
【００３６】ここで誘導体とは、当該Ｎ−アセチルグル
コサミニル化およびガラクトシル化の妨げにならない程
度に化学修飾が為されているものを意味し、例えば上記
式中の糖鎖部分において１乃至数個の糖残基が付加乃至
は除去されたものや、Ｒ１において種々の官能基が除
去、付加あるいは置換されたもの等も包含される。例え
ばＲ１において２−アミノピリジル基が別の蛍光物質で
置換されたものも、出発材料の複合糖質として使用可能
である。
コサミニル化およびガラクトシル化の妨げにならない程
度に化学修飾が為されているものを意味し、例えば上記
式中の糖鎖部分において１乃至数個の糖残基が付加乃至
は除去されたものや、Ｒ１において種々の官能基が除
去、付加あるいは置換されたもの等も包含される。例え
ばＲ１において２−アミノピリジル基が別の蛍光物質で
置換されたものも、出発材料の複合糖質として使用可能
である。
【００３７】本発明において、β１−２ Ｎ−アセチル
グルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）とは、例えば式
（Ia）あるいは式（IIa）で表されるような構造の糖鎖
のマンノースα１−３（以下Ｍａｎα１−３）分岐のマ
ンノースにのみβ１−２結合でＮ−アセチルグルコサミ
ン（以下ＧｌｃＮＡｃ）を付加することができるもので
ある。
グルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）とは、例えば式
（Ia）あるいは式（IIa）で表されるような構造の糖鎖
のマンノースα１−３（以下Ｍａｎα１−３）分岐のマ
ンノースにのみβ１−２結合でＮ−アセチルグルコサミ
ン（以下ＧｌｃＮＡｃ）を付加することができるもので
ある。
【００３８】また、本発明において、β１−４ ガラク
トース転移酵素（β１−４ＧａｌＴ）とは、例えば下記
式(1)あるいは式(2)
トース転移酵素（β１−４ＧａｌＴ）とは、例えば下記
式(1)あるいは式(2)
【００３９】
【化１７】
【００４０】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る）で表されるような構造の糖鎖のＧｌｃＮＡｃにβ１
−４結合でガラクトースを付加することができるものを
いう。上記式（1）あるいは式（2）で表される構造を有
する複合糖質は、それぞれ式（Ia）あるいは式（IIa）
で表される複合糖質のＧｎＴＩ反応産物である。式
（1）あるいは式（2）のβ１−４ＧａｌＴ反応産物は、
それぞれ式（I）あるいは式（II）で表される混成型糖
鎖を有する複合糖質である。
る）で表されるような構造の糖鎖のＧｌｃＮＡｃにβ１
−４結合でガラクトースを付加することができるものを
いう。上記式（1）あるいは式（2）で表される構造を有
する複合糖質は、それぞれ式（Ia）あるいは式（IIa）
で表される複合糖質のＧｎＴＩ反応産物である。式
（1）あるいは式（2）のβ１−４ＧａｌＴ反応産物は、
それぞれ式（I）あるいは式（II）で表される混成型糖
鎖を有する複合糖質である。
【００４１】本発明の製造方法で用いる糖転移酵素（Ｇ
ｎＴＩ、β１−４ＧａｌＴ）は、天然由来のものでも、
遺伝子組換えにより生産されたものでもよい。
ｎＴＩ、β１−４ＧａｌＴ）は、天然由来のものでも、
遺伝子組換えにより生産されたものでもよい。
【００４２】天然由来のβ１−４ＧａｌＴとしては、牛
乳、ヒト乳由来のものが商業的に入手可能である（シグ
マ社、ベーリンガーマンハイム社、オックスフォードグ
ライコシステム社等）。組換え型β１−４ＧａｌＴとし
ては、牛乳由来のβ１−４ＧａｌＴを昆虫細胞で生産し
たものがカルビオケム社から、ヒト由来のβ１−４Ｇａ
ｌＴを大腸菌で生産したものが東洋紡社からそれぞれ市
販されている。
乳、ヒト乳由来のものが商業的に入手可能である（シグ
マ社、ベーリンガーマンハイム社、オックスフォードグ
ライコシステム社等）。組換え型β１−４ＧａｌＴとし
ては、牛乳由来のβ１−４ＧａｌＴを昆虫細胞で生産し
たものがカルビオケム社から、ヒト由来のβ１−４Ｇａ
ｌＴを大腸菌で生産したものが東洋紡社からそれぞれ市
販されている。
【００４３】天然由来のＧｎＴＩとしては、各種起源か
ら公知の手法により採取、精製することによって得るこ
とができる。例えばウサギ肝臓から精製した報告（Oppe
mheimer, C.L.ら、J. Biol. Chem., 256, 799 (1981)；
Y. Nishikawaら、J. Biol. Chem., 263, 8270 (199
8)）、ウシ初乳から精製した報告（Harpaz, N.ら、J. B
iol. Chem., 255, 4885 (1980)；Vella, G. ら、Can.
J. Biochem, Cell Biol., 62, 409 (1984)）、ブタ肝臓
から精製した報告（Oppemheimer, C.L.ら、J. Biol.Che
m., 256, 11477 (1981)）等に基いて調製することがで
きる。また、ヒト由来ガン細胞（Ａ４３１）等の細胞を
起源として調製することも可能である。組換え型ＧｎＴ
Ｉとしては、例えば、既知のＧｎＴＩ遺伝子配列（Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9948 (1990) 参照）を
もとにＰＣＲ反応により遺伝子を入手し、大腸菌のマル
トース結合タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子を持つベクター
ｐＭＡＬｃ２にＧｎＴＩ遺伝子を組み込み大腸菌にＭＢ
Ｐ−ＧｎＴＩ融合タンパク質として生産させることによ
り調製できる。当該ベクターならびに宿主となる大腸菌
等は商業的に入手可能である。好ましくは、入手が容易
であるという点から、遺伝子組換えにより生産されたも
のを用いることが望ましい。
ら公知の手法により採取、精製することによって得るこ
とができる。例えばウサギ肝臓から精製した報告（Oppe
mheimer, C.L.ら、J. Biol. Chem., 256, 799 (1981)；
Y. Nishikawaら、J. Biol. Chem., 263, 8270 (199
8)）、ウシ初乳から精製した報告（Harpaz, N.ら、J. B
iol. Chem., 255, 4885 (1980)；Vella, G. ら、Can.
J. Biochem, Cell Biol., 62, 409 (1984)）、ブタ肝臓
から精製した報告（Oppemheimer, C.L.ら、J. Biol.Che
m., 256, 11477 (1981)）等に基いて調製することがで
きる。また、ヒト由来ガン細胞（Ａ４３１）等の細胞を
起源として調製することも可能である。組換え型ＧｎＴ
Ｉとしては、例えば、既知のＧｎＴＩ遺伝子配列（Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9948 (1990) 参照）を
もとにＰＣＲ反応により遺伝子を入手し、大腸菌のマル
トース結合タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子を持つベクター
ｐＭＡＬｃ２にＧｎＴＩ遺伝子を組み込み大腸菌にＭＢ
Ｐ−ＧｎＴＩ融合タンパク質として生産させることによ
り調製できる。当該ベクターならびに宿主となる大腸菌
等は商業的に入手可能である。好ましくは、入手が容易
であるという点から、遺伝子組換えにより生産されたも
のを用いることが望ましい。
【００４４】上記糖転移酵素は、固定化された糖転移酵
素を使用しても問題はない。当該担体への酵素の固定化
は、例えば糖転移酵素の別のタンパク質との融合タンパ
ク質および当該タンパク質に特異的に結合するリガンド
を有する担体を用いることによって好適に実施できる。
該担体としては、マルトオリゴ糖、グルタチオン、ニッ
ケル、キチン、セルロース等をリガンドとして側鎖に持
つ担体が挙げられ、該リガンドは糖転移酵素に結合して
いる別のタンパク質の種類によって適宜選択される。例
えばマルトオリゴ糖を側鎖に持つ担体のマルトオリゴ糖
部分をＭＢＰ−β１−４ＧａｌＴやＭＢＰ−ＧｎＴＩの
ＭＢＰ部分に特異的に結合させることによって固定化糖
転移酵素を得ることができる。
素を使用しても問題はない。当該担体への酵素の固定化
は、例えば糖転移酵素の別のタンパク質との融合タンパ
ク質および当該タンパク質に特異的に結合するリガンド
を有する担体を用いることによって好適に実施できる。
該担体としては、マルトオリゴ糖、グルタチオン、ニッ
ケル、キチン、セルロース等をリガンドとして側鎖に持
つ担体が挙げられ、該リガンドは糖転移酵素に結合して
いる別のタンパク質の種類によって適宜選択される。例
えばマルトオリゴ糖を側鎖に持つ担体のマルトオリゴ糖
部分をＭＢＰ−β１−４ＧａｌＴやＭＢＰ−ＧｎＴＩの
ＭＢＰ部分に特異的に結合させることによって固定化糖
転移酵素を得ることができる。
【００４５】使用する糖転移酵素の濃度は、基質の量、
反応温度、pH等の反応条件によって適宜決定され得る
が、数μU／ml〜数mU／mlの範囲内で使用できる。１μU
／ml程度の低濃度でも十分に目的を達成することができ
る。
反応温度、pH等の反応条件によって適宜決定され得る
が、数μU／ml〜数mU／mlの範囲内で使用できる。１μU
／ml程度の低濃度でも十分に目的を達成することができ
る。
【００４６】本発明の製造方法は、好ましくは当該酵素
反応に必須の上記二種の酵素に加え、当該反応を好適に
実施するのに必要な糖供与体、適切な緩衝液、２価金属
の共存下で実施する。
反応に必須の上記二種の酵素に加え、当該反応を好適に
実施するのに必要な糖供与体、適切な緩衝液、２価金属
の共存下で実施する。
【００４７】糖供与体としては、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ
およびＵＤＰ−Ｇａｌが使用され、その濃度は、好まし
くは基質糖鎖に対するＫｍ値の１〜５倍、より好ましく
は該Ｋｍ値の２〜３倍、さらに好ましくはＫｍ値の２倍
程度であるが、さらに低濃度のものでも十分に目的を達
成することができる。これらの糖供与体は商業的に入手
可能である。
およびＵＤＰ−Ｇａｌが使用され、その濃度は、好まし
くは基質糖鎖に対するＫｍ値の１〜５倍、より好ましく
は該Ｋｍ値の２〜３倍、さらに好ましくはＫｍ値の２倍
程度であるが、さらに低濃度のものでも十分に目的を達
成することができる。これらの糖供与体は商業的に入手
可能である。
【００４８】反応系に含まれる適切な緩衝液としては、
ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴが十分に機能しうる至
適条件を達成し得るものであれば特に限定されないが、
好ましくはpH5.0〜8.5、より好ましくはpH6.0〜7.5程度
の緩衝液、就中ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｔｒ
ｉｓ緩衝液等が用いられる。当該至適ｐＨ範囲をはずれ
ると当然のことながら酵素反応は著しく低下する。当該
緩衝液の濃度も特に限定されないが、通常10〜100mM程
度であり、好ましくは10〜20mM程度である。当該濃度が
低すぎると十分な緩衝能が得られず、又、高すぎると酵
素活性そのものを阻害する恐れがある。特に好ましい緩
衝液としてはpH6.0〜7.5、10〜20mM程度のＨＥＰＥＳ緩
衝液である。当該緩衝液は自体公知の方法で調製するこ
とができる。
ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴが十分に機能しうる至
適条件を達成し得るものであれば特に限定されないが、
好ましくはpH5.0〜8.5、より好ましくはpH6.0〜7.5程度
の緩衝液、就中ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｔｒ
ｉｓ緩衝液等が用いられる。当該至適ｐＨ範囲をはずれ
ると当然のことながら酵素反応は著しく低下する。当該
緩衝液の濃度も特に限定されないが、通常10〜100mM程
度であり、好ましくは10〜20mM程度である。当該濃度が
低すぎると十分な緩衝能が得られず、又、高すぎると酵
素活性そのものを阻害する恐れがある。特に好ましい緩
衝液としてはpH6.0〜7.5、10〜20mM程度のＨＥＰＥＳ緩
衝液である。当該緩衝液は自体公知の方法で調製するこ
とができる。
【００４９】本発明において使用する２価金属として
は、ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴの両活性に必要と
されるマンガン塩が望ましく、塩化マンガンを用いるの
がより好ましい。当該マンガン塩の濃度は通常5〜50mM
であり、好ましくは10〜20ｍMの範囲で使用する。
は、ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴの両活性に必要と
されるマンガン塩が望ましく、塩化マンガンを用いるの
がより好ましい。当該マンガン塩の濃度は通常5〜50mM
であり、好ましくは10〜20ｍMの範囲で使用する。
【００５０】本発明において行なわれるＮ−アセチルグ
ルコサミニル化およびガラクトシル化の反応は、上述の
ように例えば式（Ia）あるいは（IIa）のような構造の
複合糖質を基質として、ＧｎＴＩおよびβ１−４Ｇａｌ
Ｔ共存下、好ましくは糖供与体（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ
およびＵＤＰ−Ｇａｌ）、適切な緩衝液、２価金属の共
存下で行なわれるが、当該反応は、通常両糖転移酵素の
至適温度である30℃〜37℃で、1〜24時間、好ましくは1
0〜16時間行なう。当該反応では、必要成分を一度に混
合することができ、従って当該反応を一段階で完了させ
ることができる。
ルコサミニル化およびガラクトシル化の反応は、上述の
ように例えば式（Ia）あるいは（IIa）のような構造の
複合糖質を基質として、ＧｎＴＩおよびβ１−４Ｇａｌ
Ｔ共存下、好ましくは糖供与体（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ
およびＵＤＰ−Ｇａｌ）、適切な緩衝液、２価金属の共
存下で行なわれるが、当該反応は、通常両糖転移酵素の
至適温度である30℃〜37℃で、1〜24時間、好ましくは1
0〜16時間行なう。当該反応では、必要成分を一度に混
合することができ、従って当該反応を一段階で完了させ
ることができる。
【００５１】本発明の製造方法によって得られた混成型
糖鎖を有する複合糖質は、種々の糖転移酵素や糖鎖分解
酵素等の酵素的手法、ヒドラジン分解等の化学的手法、
加熱等の物理的手法等、公知の手法により糖鎖を切り出
し、適宜所望の態様に改変することができる。
糖鎖を有する複合糖質は、種々の糖転移酵素や糖鎖分解
酵素等の酵素的手法、ヒドラジン分解等の化学的手法、
加熱等の物理的手法等、公知の手法により糖鎖を切り出
し、適宜所望の態様に改変することができる。
【００５２】
【実施例】以下、本発明を実施例にて具体的且つ詳細に
説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものでは
ない。
説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものでは
ない。
【００５３】実施例１：Ｍａｎ５混成型糖鎖の合成
【００５４】
【化１８】
【００５５】（式中、ＰＡは、２−アミノピリジル基を
示し、その他の定義は前述の通りである） 式（3）で表される複合糖質を含む表１記載の組成の反
応液500μlを37℃にて保温し、反応を行なった。尚、β
１−４ＧａｌＴはシグマ社製品を、ＭＢＰ−ＧｎＴＩは
ＧｎＴＩ遺伝子（既知のＧｎＴＩ遺伝子配列をもとにＰ
ＣＲ反応により調製；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
7, 9948 (1990)、参照）を含んだｐＭＡＬｃ２ベクター
（New England Bio Labs社製）により形質転換された大
腸菌（E.Coli BL21）を培養、誘導し、得られた粗酵素
液をAmylose（New England Bio Labs社製）カラムクロ
マトグラフィーにより精製したものを使用した。
示し、その他の定義は前述の通りである） 式（3）で表される複合糖質を含む表１記載の組成の反
応液500μlを37℃にて保温し、反応を行なった。尚、β
１−４ＧａｌＴはシグマ社製品を、ＭＢＰ−ＧｎＴＩは
ＧｎＴＩ遺伝子（既知のＧｎＴＩ遺伝子配列をもとにＰ
ＣＲ反応により調製；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
7, 9948 (1990)、参照）を含んだｐＭＡＬｃ２ベクター
（New England Bio Labs社製）により形質転換された大
腸菌（E.Coli BL21）を培養、誘導し、得られた粗酵素
液をAmylose（New England Bio Labs社製）カラムクロ
マトグラフィーにより精製したものを使用した。
【００５６】
【表１】
【００５７】反応開始後、０．５時間毎に反応液20μl
をサンプリングし、表２記載の条件の高速液体クロマト
グラフィー（以下、ＨＰＬＣともいう）に供した。ＨＰ
ＬＣにより検出される各ピークの同定は各種ピリジルア
ミノ化糖鎖の標準品（図１）を用いて行なった。
をサンプリングし、表２記載の条件の高速液体クロマト
グラフィー（以下、ＨＰＬＣともいう）に供した。ＨＰ
ＬＣにより検出される各ピークの同定は各種ピリジルア
ミノ化糖鎖の標準品（図１）を用いて行なった。
【００５８】
【表２】
【００５９】その結果、反応初期から中期にかけては式
（3）で表される未反応基質、式（4）で表される反応中
間体、式（5）で表される最終反応物が混在しているが
（図２、図４参照）、反応時間１０時間経過時では、式
（5）で表される最終反応物、即ち混成型糖鎖を有する
複合糖質に１００％変換されていることが確認された
（図３、図４参照）。
（3）で表される未反応基質、式（4）で表される反応中
間体、式（5）で表される最終反応物が混在しているが
（図２、図４参照）、反応時間１０時間経過時では、式
（5）で表される最終反応物、即ち混成型糖鎖を有する
複合糖質に１００％変換されていることが確認された
（図３、図４参照）。
【００６０】実施例２：Ｍａｎ３混成型糖鎖の合成
【００６１】
【化１９】
【００６２】（式中各記号の定義は前述の通りである） 式（6）で表される複合糖質を含む表３記載の組成の反
応液500μlを37℃にて保温し、反応を行なった。尚、実
施例１同様、β１−４ＧａｌＴはシグマ社製品を、ＭＢ
Ｐ−ＧｎＴＩはＧｎＴＩ遺伝子を含んだｐＭＡＬｃ２ベ
クターにより形質転換された大腸菌を培養、誘導し、得
られた粗酵素液をAmyloseカラムクロマトグラフィーに
より精製したものを使用した。
応液500μlを37℃にて保温し、反応を行なった。尚、実
施例１同様、β１−４ＧａｌＴはシグマ社製品を、ＭＢ
Ｐ−ＧｎＴＩはＧｎＴＩ遺伝子を含んだｐＭＡＬｃ２ベ
クターにより形質転換された大腸菌を培養、誘導し、得
られた粗酵素液をAmyloseカラムクロマトグラフィーに
より精製したものを使用した。
【００６３】
【表３】
【００６４】反応開始から１５時間、反応液20μlをサ
ンプリングし、実施例１同様、表２記載の条件のＨＰＬ
Ｃに供した。ＨＰＬＣにより検出される各ピークの同定
は各種ピリジルアミノ化糖鎖の標準品（図５）を用いて
行なった。
ンプリングし、実施例１同様、表２記載の条件のＨＰＬ
Ｃに供した。ＨＰＬＣにより検出される各ピークの同定
は各種ピリジルアミノ化糖鎖の標準品（図５）を用いて
行なった。
【００６５】その結果、反応時間１５時間経過時では、
式（8）で表される最終反応物、即ち混成型糖鎖を有す
る複合糖質に１００％変換されていることが確認された
（図６参照）。
式（8）で表される最終反応物、即ち混成型糖鎖を有す
る複合糖質に１００％変換されていることが確認された
（図６参照）。
【００６６】実施例３：ＲＮａｓｅＢの糖鎖の混成型糖
鎖への変換 高マンノース型糖鎖を持つＲＮａｓｅＢ（ブタ膵臓由
来、シグマ社製）上の糖鎖を、本発明の製造方法を用い
て、混成型糖鎖へと変換した。
鎖への変換 高マンノース型糖鎖を持つＲＮａｓｅＢ（ブタ膵臓由
来、シグマ社製）上の糖鎖を、本発明の製造方法を用い
て、混成型糖鎖へと変換した。
【００６７】
【化２０】
【００６８】（式中、各記号は前述の通りである） ＲＮａｓｅＢからヒドラジン分解法により糖鎖を切り出
し、常法に従いピリジルアミノ化を行なった。得られた
ピリジルアミノ化糖鎖を実施例１と同様にして、表２記
載の条件のＨＰＬＣに供した。その結果、５本のピーク
が検出された（図７）。ＨＰＬＣにより検出される各ピ
ークの同定はマンノース標準品（図８）を用いて行なっ
た。各マンノース標準品は、それぞれ宝酒造社製のピリ
ジルアミノ化糖鎖を用いた。結果、一番目のピークはマ
ンノース標準品のＭ５に位置することから、式（9）で
表される化合物と推測された。
し、常法に従いピリジルアミノ化を行なった。得られた
ピリジルアミノ化糖鎖を実施例１と同様にして、表２記
載の条件のＨＰＬＣに供した。その結果、５本のピーク
が検出された（図７）。ＨＰＬＣにより検出される各ピ
ークの同定はマンノース標準品（図８）を用いて行なっ
た。各マンノース標準品は、それぞれ宝酒造社製のピリ
ジルアミノ化糖鎖を用いた。結果、一番目のピークはマ
ンノース標準品のＭ５に位置することから、式（9）で
表される化合物と推測された。
【００６９】次に基質としてＲＮａｓｅＢ、糖転移酵素
としてＭＢＰ−ＧｎＴＩのみを含む表４記載の反応液50
0μlを37℃にて保温して反応行なった。尚、実施例１同
様、ＭＢＰ−ＧｎＴＩはＧｎＴＩ遺伝子を含んだｐＭＡ
Ｌｃ２ベクターにより形質転換された大腸菌を培養、誘
導し、得られた粗酵素液をAmyloseカラムクロマトグラ
フィーにより精製したものを使用した。
としてＭＢＰ−ＧｎＴＩのみを含む表４記載の反応液50
0μlを37℃にて保温して反応行なった。尚、実施例１同
様、ＭＢＰ−ＧｎＴＩはＧｎＴＩ遺伝子を含んだｐＭＡ
Ｌｃ２ベクターにより形質転換された大腸菌を培養、誘
導し、得られた粗酵素液をAmyloseカラムクロマトグラ
フィーにより精製したものを使用した。
【００７０】
【表４】
【００７１】反応開始から１５時間後、ヒドラジン分解
法により糖鎖を切り出し、常法に従いピリジルアミノ化
を行なった。得られたピリジルアミノ化糖鎖を実施例１
と同様にして、表２記載の条件のＨＰＬＣに供した。そ
の結果、Ｍ５の位置のピークが消失し、マンノース標準
品Ｍ５に糖残基が１つ付加されたＭ６の位置にピークの
増加が見られた（図９）。本ピリジルアミノ化糖鎖をＮ
−アセチルグルコサミニダーゼ処理した後、ＨＰＬＣに
供した結果、Ｍ６の位置のピークが減少し、Ｍ５の位置
のピークが現れた（図１０）。本結果から、式（9）で
表される化合物がＧｎＴＩで処理することにより、Ｎ−
アセチルグルコサミン残基が１つ付加された式（10）で
表される化合物へと変換され、Ｍ６の位置でピークとな
って検出されることが確認された。これらの結果からＲ
ＮａｓｅＢがＧｎＴＩの基質となり得ることが確認され
た。
法により糖鎖を切り出し、常法に従いピリジルアミノ化
を行なった。得られたピリジルアミノ化糖鎖を実施例１
と同様にして、表２記載の条件のＨＰＬＣに供した。そ
の結果、Ｍ５の位置のピークが消失し、マンノース標準
品Ｍ５に糖残基が１つ付加されたＭ６の位置にピークの
増加が見られた（図９）。本ピリジルアミノ化糖鎖をＮ
−アセチルグルコサミニダーゼ処理した後、ＨＰＬＣに
供した結果、Ｍ６の位置のピークが減少し、Ｍ５の位置
のピークが現れた（図１０）。本結果から、式（9）で
表される化合物がＧｎＴＩで処理することにより、Ｎ−
アセチルグルコサミン残基が１つ付加された式（10）で
表される化合物へと変換され、Ｍ６の位置でピークとな
って検出されることが確認された。これらの結果からＲ
ＮａｓｅＢがＧｎＴＩの基質となり得ることが確認され
た。
【００７２】
【化２１】
【００７３】（式中、各記号の定義は前述の通りであ
る） 次に、基質としてＲＮａｓｅＢを含む表５記載の組成の
反応液500μlを37℃にて保温し、反応を行なった。尚、
β１−４ＧａｌＴは東洋紡社製品（組換え型ヒト由来）
を、ＭＢＰ−ＧｎＴＩは実施例１同様、ＧｎＴＩ遺伝子
を含んだｐＭＡＬｃ２ベクターにより形質転換された大
腸菌を培養、誘導し、得られた粗酵素液をAmyloseカラ
ムクロマトグラフィーにより精製したものを使用した。
る） 次に、基質としてＲＮａｓｅＢを含む表５記載の組成の
反応液500μlを37℃にて保温し、反応を行なった。尚、
β１−４ＧａｌＴは東洋紡社製品（組換え型ヒト由来）
を、ＭＢＰ−ＧｎＴＩは実施例１同様、ＧｎＴＩ遺伝子
を含んだｐＭＡＬｃ２ベクターにより形質転換された大
腸菌を培養、誘導し、得られた粗酵素液をAmyloseカラ
ムクロマトグラフィーにより精製したものを使用した。
【００７４】
【表５】
【００７５】反応開始から１５時間後、ヒドラジン分解
法により糖鎖を切り出し、常法に従いピリジルアミノ化
を行なった。得られたピリジルアミノ化糖鎖を実施例１
と同様にして、表２記載の条件のＨＰＬＣに供した。そ
の結果、Ｍ５の位置のピークが消失し、マンノース標準
品Ｍ５に糖残基が２つ付加されたＭ７の位置にピークの
増加が見られた（図１１）。ガラクトシダーゼ処理およ
びＮ−アセチルグルコサミニダーゼ処理を同時に行なっ
た結果、Ｍ７のピークが消失し、Ｍ５のピークが現れた
（図１２）。本結果から、式（9）化合物がＧｎＴＩお
よびβ１−４ＧａｌＴでの処理により、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン残基およびガラクトース残基がそれぞれ付加
された式（11）化合物へと変換され、Ｍ７の位置でピー
クとなって検出されることが確認された。
法により糖鎖を切り出し、常法に従いピリジルアミノ化
を行なった。得られたピリジルアミノ化糖鎖を実施例１
と同様にして、表２記載の条件のＨＰＬＣに供した。そ
の結果、Ｍ５の位置のピークが消失し、マンノース標準
品Ｍ５に糖残基が２つ付加されたＭ７の位置にピークの
増加が見られた（図１１）。ガラクトシダーゼ処理およ
びＮ−アセチルグルコサミニダーゼ処理を同時に行なっ
た結果、Ｍ７のピークが消失し、Ｍ５のピークが現れた
（図１２）。本結果から、式（9）化合物がＧｎＴＩお
よびβ１−４ＧａｌＴでの処理により、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン残基およびガラクトース残基がそれぞれ付加
された式（11）化合物へと変換され、Ｍ７の位置でピー
クとなって検出されることが確認された。
【００７６】さらに、確認の為、ＲＮａｓｅＢの糖鎖を
ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴで処理して得られる反
応産物のＨＰＬＣ画分であるＭ７ピークを分取し、表６
記載の条件のＨＰＬＣに供した結果、別に調製した式
（11）化合物標準品（Palacpac, N. Q.,ら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 96, 4692 (1999)）とピーク位置が
一致したことからＭ７ピークは式（11）で表される化合
物であることが明らかとなった。Ｍ７ピークのＨＰＬＣ
分析の結果を図１３に、式（11）化合物標準品のＨＰＬ
Ｃ分析の結果を図１４に示す。以上の結果から、複合糖
質を直接基質として本発明の製造方法により混成型糖鎖
を持つ複合糖質へ変換可能であることが確認された。
ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴで処理して得られる反
応産物のＨＰＬＣ画分であるＭ７ピークを分取し、表６
記載の条件のＨＰＬＣに供した結果、別に調製した式
（11）化合物標準品（Palacpac, N. Q.,ら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 96, 4692 (1999)）とピーク位置が
一致したことからＭ７ピークは式（11）で表される化合
物であることが明らかとなった。Ｍ７ピークのＨＰＬＣ
分析の結果を図１３に、式（11）化合物標準品のＨＰＬ
Ｃ分析の結果を図１４に示す。以上の結果から、複合糖
質を直接基質として本発明の製造方法により混成型糖鎖
を持つ複合糖質へ変換可能であることが確認された。
【００７７】
【表６】
【００７８】
【発明の効果】本発明の製造方法により、従来、安定且
つ大量の供給が困難とされていた混成型糖鎖を有する複
合糖質を簡便に製造できる。当該混成型糖鎖は糖鎖工学
の基礎分野や診断用途に広く利用することができる。
つ大量の供給が困難とされていた混成型糖鎖を有する複
合糖質を簡便に製造できる。当該混成型糖鎖は糖鎖工学
の基礎分野や診断用途に広く利用することができる。
【図１】実施例１で使用した、ピリジルアミノ化糖鎖標
準品のＨＰＬＣチャート図である。
準品のＨＰＬＣチャート図である。
【図２】ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴを用いたＭａ
ｎ５混成型糖鎖の合成反応（実施例１）における、反応
１５０分後の反応産物のＨＰＬＣチャート図である。
ｎ５混成型糖鎖の合成反応（実施例１）における、反応
１５０分後の反応産物のＨＰＬＣチャート図である。
【図３】ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴを用いたＭａ
ｎ５混成型糖鎖の合成反応（実施例１）における、反応
１０時間後の反応産物のＨＰＬＣチャート図である。
ｎ５混成型糖鎖の合成反応（実施例１）における、反応
１０時間後の反応産物のＨＰＬＣチャート図である。
【図４】ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴを用いたＭａ
ｎ５混成型糖鎖の合成反応（実施例１）における、反応
時間と各種反応産物の割合の変化を示すグラフである。
ｎ５混成型糖鎖の合成反応（実施例１）における、反応
時間と各種反応産物の割合の変化を示すグラフである。
【図５】実施例２で使用した、ピリジルアミノ化糖鎖標
準品のＨＰＬＣチャート図である。
準品のＨＰＬＣチャート図である。
【図６】ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴを用いたＭａ
ｎ３混成型糖鎖の合成反応（実施例２）における、反応
１５時間後の反応産物のＨＰＬＣチャート図である。
ｎ３混成型糖鎖の合成反応（実施例２）における、反応
１５時間後の反応産物のＨＰＬＣチャート図である。
【図７】ＲＮａｓｅＢの糖鎖のＨＰＬＣチャート図であ
る。
る。
【図８】実施例３で使用した、マンノース標準品のＨＰ
ＬＣチャート図である。
ＬＣチャート図である。
【図９】ＧｎＴＩ反応後のＲＮａｓｅＢの糖鎖のＨＰＬ
Ｃチャート図である。
Ｃチャート図である。
【図１０】ＧｎＴＩ反応後のＲＮａｓｅＢの糖鎖をさら
にＮ−アセチルグルコサミニダーゼ処理した後の該糖鎖
のＨＰＬＣチャート図である。
にＮ−アセチルグルコサミニダーゼ処理した後の該糖鎖
のＨＰＬＣチャート図である。
【図１１】ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴ反応後のＲ
ＮａｓｅＢの糖鎖のＨＰＬＣチャート図である。
ＮａｓｅＢの糖鎖のＨＰＬＣチャート図である。
【図１２】ＧｎＴＩおよびβ１−４ＧａｌＴ反応後のＲ
ＮａｓｅＢの糖鎖をさらにガラクトシダーゼ処理および
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ処理した後の該糖鎖の
ＨＰＬＣチャート図である。
ＮａｓｅＢの糖鎖をさらにガラクトシダーゼ処理および
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ処理した後の該糖鎖の
ＨＰＬＣチャート図である。
【図１３】Ｍ７ピーク画分のＨＰＬＣチャート図であ
る。
る。
【図１４】式（11）化合物の標準品のＨＰＬＣチャート
図である。
図である。
フロントページの続き (72)発明者 三崎 亮 大阪府豊中市刀根山４−３−31−301 (72)発明者 井戸 芳博 大阪府茨木市下穂積２−２−24 ヤングヴ ィレッジ茨木1110号 Ｆターム(参考） 4B064 AF21 CA21 CC03 CC07 CC09 CD02 CD12 CD15 DA13
Claims (9)
- 【請求項１】 β１−２ アセチルグルコサミン転移酵
素Ｉの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセチルグルコ
サミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を有する複合
糖質を、β１−２ アセチルグルコサミン転移酵素Ｉお
よびβ１−４ガラクトース転移酵素共存下にてＮ−アセ
チルグルコサミニル化およびガラクトシル化することを
特徴とする、混成型糖鎖を持つ複合糖質の製造方法。 - 【請求項２】 β１−２ アセチルグルコサミン転移酵
素Ｉの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセチルグルコ
サミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を有する複合
糖質が、式（Ia） 【化１】 （式中、Ｒ１は水酸基、２−アミノピリジル基、アスパ
ラギンあるいはその類似体、またはポリペプチド鎖を示
し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ
−アセチルグルコサミン残基を示す）で表される化合物
であり、混成型糖鎖を持つ複合糖質が、式（I） 【化２】 （式中、Ｒ１は水酸基、２−アミノピリジル基、アスパ
ラギンあるいはその類似体、またはポリペプチド鎖を示
し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ
−アセチルグルコサミン残基を示し、Ｇａｌはガラクト
ース残基を示す）で表される化合物である、請求項１記
載の製造方法。 - 【請求項３】 β１−２ アセチルグルコサミン転移酵
素Ｉの基質となり且つ非還元末端にＮ−アセチルグルコ
サミンあるいはグルコースを持たない糖鎖を有する複合
糖質が、式（IIa） 【化３】 （式中、Ｒ１は水酸基、２−アミノピリジル基、アスパ
ラギンあるいはその類似体、またはポリペプチド鎖を示
し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ
−アセチルグルコサミン残基を示す）で表される化合物
であり、混成型糖鎖を持つ複合糖質が、式（II） 【化４】 （式中、Ｒ１は水酸基、２−アミノピリジル基、アスパ
ラギンあるいはその類似体、またはポリペプチド鎖を示
し、Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ
−アセチルグルコサミン残基を示し、Ｇａｌはガラクト
ース残基を示す）で表される化合物である、請求項１記
載の製造方法。 - 【請求項４】 当該Ｎ−アセチルグルコサミニル化およ
びガラクトシル化が、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミ
ン、ＵＤＰ−ガラクトース、緩衝液、および２価金属の
共存下にて行なわれることを特徴とする請求項２または
３記載の製造方法。 - 【請求項５】 当該緩衝液の濃度が、10〜100mMであ
る、請求項４記載の製造方法。 - 【請求項６】 当該緩衝液のpHが5.0〜8.5である、請求
項４記載の製造方法。 - 【請求項７】 ２価金属がマンガン塩である、請求項４
記載の製造方法。 - 【請求項８】 マンガン塩の濃度が5〜50mMである、請
求項７記載の製造方法。 - 【請求項９】 マンガン塩が塩化マンガンである、請求
項７または８記載の製造方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000234814A JP2002045196A (ja) | 2000-08-02 | 2000-08-02 | 混成型糖鎖の酵素的合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000234814A JP2002045196A (ja) | 2000-08-02 | 2000-08-02 | 混成型糖鎖の酵素的合成方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002045196A true JP2002045196A (ja) | 2002-02-12 |
| JP2002045196A5 JP2002045196A5 (ja) | 2007-06-28 |
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ID=18727132
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000234814A Withdrawn JP2002045196A (ja) | 2000-08-02 | 2000-08-02 | 混成型糖鎖の酵素的合成方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002045196A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2004058984A1 (ja) * | 2002-12-24 | 2004-07-15 | Otsuka Chemical Co., Ltd. | 糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖ならびにそれらの製造法 |
| CN100413889C (zh) * | 2002-12-24 | 2008-08-27 | 大塚化学株式会社 | 糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺和糖链以及它们的制造方法 |
-
2000
- 2000-08-02 JP JP2000234814A patent/JP2002045196A/ja not_active Withdrawn
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| AU2003296067B2 (en) * | 2002-12-24 | 2007-08-23 | Glytech, Inc. | Sugar chain asparagine derivatives, sugar chain asparagine, sugar chain, and processes for producing these |
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| US8158763B2 (en) | 2002-12-24 | 2012-04-17 | Yasuhiro Kajihara | Sugar chain asparagine derivatives, sugar chain asparagine, sugar chain and processes for producing these |
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