TW590772B - Combination preparation for use in dementia - Google Patents

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590772 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明（i ) 本發明係有關一種醫藥結合製劑，係用於治療因神經 變性病變伴隨出現膽鹼激導性神經元受損及膽鹼激導性不 足之痴呆症（妥奇（Tohgi)等人，Neurosci，Lett· 177(1994)， P-1939-1942)。此等結合製劑可利用蕈毒素受體刺激作用誘 發依賴Ca2+之訊號傳遞提高，補充膽鹼激導性不足。這種 提高作用顯然可利用協同的腺苷作用來達成，亦即結合使 用可提高細胞外腺苷濃度之物質與輩毒素受體促效劑或乙 醯膽鹼酯酶抑制劑(AChE抑制劑）。迄今醫藥界對老年痴呆 症的療法為投與蕈毒素激導性促效劑或AChE抑制劑，以 提高受體處之内因性乙醯膽鹼(ACh)濃度，保持蕈毒素受 體活化作用。但由於膽驗激導性神經元系統持續破壞，真 正因AChE抑制作用而提南之ACh量是否足以應付適當之 細胞功能仍令人懷疑。此外，AChE抑制劑有相當大副作 用，同時缺少專一性。因此需要利用其他機轉加強蕈毒素 受體調節不足之ACh濃度之作用，且可作為適當結合療法 之發展基礎。 已知ACh不僅影響神經細胞之功能，亦影響神經膠質 細胞（星形細胞）之功能（米賽摩（Messam〇re)等人， neur〇report，5(1994)，R1473-1476)。由於病理性神經膠質細 胞反應顯然在痴呆症之生理學上扮演重要角色(Akiyama等 人，Brain Res. 632 (1993)，P.249-259)，因此選擇星形細胞 作為试管内模式系統。藉動態螢光顯影法之助，探討對受 蕈毒素受體誘發之細胞内Ca2+釋出之影響。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公f ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

、1T 590772 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 kl B7 五、發明説明（2 ) 現已發現，Cl-腺苷會隨濃度提高而加強培養之老鼠星 形細胞中蕈毒素受體誘發之細胞内Ca2+釋出（見圖1至3 ; 表1與2)。因此即使在1/zMcl_腺苷之存在下，仍可測得 ACh所誘發之細胞内Ca2+釋出加強約30倍。此效應不受 菸鹼ACh受體拮抗劑抑制，但可利用蕈毒素受體拮抗劑阻 斷（表3)。C1-腺苷亦加強蕈毒素激導性促效劑氧化震顫素 -M(oxofrem〇rine-X)所誘發之細胞内Ca2+釋出（表4)。有許 多實驗證實加強C1-腺苷之效應(n> 2〇〇)係於ACh濃度為 ΙΟΟηΜ下進行。ACh本身在此低濃度下無活性。C1_腺苷 在試驗濃度範圍内(3nM至3//M)亦無活性。由劑量對效應 之實驗可決定併用100 nM ACh時誘發Ca2+訊號時之必要 C1-腺苷濃度，結果發現在微莫耳體積濃度之C1腺苷濃度 下即展現加強效應。其濃度閥值為1"M。由於C1腺苷之 受體親和力相當於内因性腺苷（達利(Daly)等人，Life SCI.， 28 (1981)，P.2083-2097)，此表不細胞外腺苷量由生理性之 宅微莫耳體積濃度範圍（巴拉林(Ballariu)等人，Acta Physiol.

Scand.，142 (1991)，R97-103)提高至 1//Μ 時，亦相應地足 以使蕈毒素受體外之閥值以下ACh濃度發揮效應。 由此等實驗結果可知，可提高細胞外腺苷濃度，以改 善痴呆症中對受蕈毒素受體調節之膽鹼激導性功能之不良 效應。其可能之作法為同時投與腺苷吸收抑制劑如：普本 菲靈（propentofylline)(巴金森（parkimson)等人，Gem. Phermacol.25(1994)，R1053-1058)。在藥理上提高細胞外腺 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

I 590772 ΑΊ ___.____ 五、發明説明（3 ) 〜^〜 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 苷濃度時，亦可使結合療法中視需要選用之AchE抑制劑 或蕈毒素受體促效劑之劑量減少，此舉將降低不要之副作 用之危險。 因此本發明係有關一種結合製劑，其至少包含 1. 一種抑制乙醯膽驗酶之化合物（即所謂之“AchE —抑制 劑”）或具有蕈毒素激導性作用之化合物， 2·可提高内因性細胞外腺苷量之化合物，及 3.醫藥賦形劑， 其係用於同時，分開或連續投藥，在神經變性疾病中對提 高蕈毒作用具有超過加成性之效應。 已知具有AChE —抑制作用之化合物為例如：9-胺基 -l、2、3、4-四氳吖啶(塔克靈(tacrine)，COGNEX)及l-苄 基-4-【（5,6-二甲氧基_1_節滿酮）-2·基】甲基六氣σ比σ定(E2020, ARICEPT)。已知之蕈毒素促效劑為例如：米拉美林 (milameline) 〇 可提高内因性細胞外腺苷量之化合物為例如：式I之 黃嘌呤衍生物：

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 及/或式I化合物之生理上可耐受之鹽，其中R1為 a)具有3至8個碳原子之氧炫基，其碳鍵可為直鍵或分支； 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X297公釐） 590772 kl B7 五、發明説明（4 ) b) 具有1至8個碳原子之羥烷基，其碳鏈可為直鏈或分支， 且其羥基為第一、第二或第三醇官能基，或 c) l至6個碳原子之烷基，其碳鏈可為直鏈或分支， R2為 a) 氫原子或 b) 具有1至4個碳原子之烷基，其碳鏈可為直鏈或分支， R3為 a) 氫原子， b) 具有1至6個碳原子之烷基，其碳鏈可為直鏈或分支， c) 具有1至6個碳原子之烷基，其碳鏈可穿插一個氧原子， 或 d) 具有3至8個碳原子之氧烷基，其碳鏈可為直鏈或分支。 較佳者，係採用式I化合物，其中 R1為 a) 具有4至6個碳原子之氧烧基，其碳鏈為直鏈，或 b) 具有3至6個碳原子之烷基， R2為具有1至4個碳原子之烷基， R3為 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) a) 具有1至4個碳原子之烷基，或 b) 具有3至6個碳原子之氧烷基。 特別佳者係採用1-(5-氧己基）-3-甲基-7-正丙基黃嘌 呤（普本菲靈）。 可述及下列式I化合物實例： -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 590772 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（5 ) 1-（5-羥基一5-曱基-己基）-3-甲基黃嘌呤， 7-（乙氧甲基-1-（5-羥基-5-甲基己基）-3-甲基黃嘌呤， 1-（5-氧己基）-3,7-二曱黃嘌呤， 7-（2-氧丙基）一1，3-二正丁基黃嘌呤，或 1-己基一3, 7-二甲基黃嘌呤。 式I黃嘌呤衍生物之合適之生理上可耐受之鹽為例 如：鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽或銨鹽，包括彼等生理上可耐 受之有機銨鹼之鹽。 式I化合物係於標準條件下，依已知方式製備 (US4, 289, 776, US 4, 833, 146, US3, 737, 433)。 反應之起始物為已知者或容易經文獻上已知方法製 備。“超過加成性”一詞咸了解係指其作用程度大於個別 作用程度之總和。 較佳結合製劑含有普本菲靈與1-苄基-4-【（5,6_二甲 氧基-1_茚滿酮）-2-基】甲基六氫外!:0定。 根據本發明之結合製劑適於例如：治療痴呆症，特定 言之老年痴呆症。 根據本發明之結合製劑亦可包括組合包或組合物，其 中組成份係併排放置，因此可同時，分開或連續投與同一 位人體或動物體。 本發明亦有關一種製造結合製劑之方法，該方法包括 依一般方式處理： 1)具有乙醯膽鹼酯酶抑制作用或簟毒素激導性作用之化合 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） 590772 kl B7 五、發明説明（ 物 2) 可提高内因性細胞外腺苷量之化合物，及 3) 醫藥賦形劑， 以形成醫藥投藥形式。 根據本發明之結合製劑可呈單位醫藥劑型，如：膠囊 (包括微膠囊，其通常不含任何醫藥賦形劑）、藥片（包括 包衣藥片或丸劑）或塞劑，其中當使用膠囊時，膠囊材料 可提供賦形劑之功能，且其内含物可呈例如：粉末、凝膠、 乳液、勻散液或溶液形式。然而特別方便及簡便之作法為 由二種活性化合物成份1)與2)製備口服用調配物，其中 包含計算量之活性化合物及各所需之醫藥賦形劑。亦可採 用用於直腸療法之適當調配物（塞劑）。同樣地，亦可採用 含有根據本發明組合之軟膏或乳霜之經皮式施藥形g、# 經腸式（腹膜式、皮下、靜脈内、動脈内、肌内）注射或、、霍 流溶液或口服投藥溶液。軟膏、糊劑、乳霜及散劑中除了 活性化合物外’尚可包含一般賦形劑，例如：動物性及植 物性脂肪、蠛類、石躐、殿粉、黃蓍膠、纖維素衍生物 聚乙二醇、石夕_、皂土、滑石、氧化鋅、乳糖、矽酸、装 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 = JH - - - — I— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁 土、矽酸鈣及聚醯胺粉未或此等物質之混合物。 藥片、丸劑或粒劑可依一般方法製備，如：壓、缩、$ 潰或流化床法或盤式包覆法，且包含賦形劑及其他雙 ξ知輔 劑如··明膠、瓊脂糖、澱粉（例如：馬鈐薯、玉米或〗麥 殿粉）、纖維素如·乙基纖維素、石夕石、各種糖類如·々 •乳 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210Χ 297公釐） 77 907 A7 ----------ΒΊ 五、發明説明（7 ) " --一 糖、破酸鎮及/或磷酸舞。包衣溶液通常由糖及/或澱粉 糖浆組成，且大多另包含明膠、阿拉伯膠、聚乙·比㈣ 銅、合成性纖維酿、界面活性劑、增塑劑、色素及先前技 藝中之^似添加物。製造醫藥形式時，可使用任何習知之 抓動調㈤滑劑或流動劑，如：硬脂酸钱及釋出劑。 該等製劑最好呈包衣/核心藥片或多層藥片，活性成 份2)係於包衣内或核心内或其中一層，而活性成份⑽ 在核'。内或包衣内或另一層中。活性化合物成份亦可製成 緩釋形式或吸附於緩釋材料上或包括於緩釋材料中（例 如··彼等以纖維素或聚苯乙稀樹脂為主者，例如：經乙基 纖維素）。活性化合物之緩釋法亦可由採用習知之腸溶性 包衣形成分層或分隔達成。 經濟部中央標準局負工消費合作社印聚 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 所採用之劑里g然依各種因素而定如··待處理之生物 (即人類或動物）、年齡、體重、_般健康狀況、病症嚴重 程度、待處理之病症、可能併發之病症（若出現時）、與其 他醫藥併行處理之性質、或處理之頻率。其劑量通常為每 日投與數次，且每日投與丨至3次較佳。所採用之個別活 性化合物量以本文所建議個別活性化合物之每日劑量為 主，且於結合製劑中通常應佔建議每日劑量之10%至100〇/〇, 以20%至80%較佳，特定言之50%。因此採用根據本發明結 合製劑之合適療法包括例如：投與根據本發明結合製劑之 個別劑量，其包括 1)100毫克至600毫克普本菲靈，以200毫克至400毫克 -9- 本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X297公釐） 590772 A7 --—-------- B7 五、發明説明（） ~~ 〜 8 / 較佳’特定言之300毫克，及 2)2毫克至20毫克卜节基一4【（5,6—二甲氧基一卜雖滿酮） 2一基】甲基六氫吼咬，以5毫克至1G毫克較佳， 其=該含量依個別劑量次數及待處理之疾病而定，且個別 劑畺可包括數個同時投藥之劑量單位。 醫藥實例 星形細胞培養物 皮質星形細胞培養物係來自在醚麻醉下殺死母鼠後所 取出< 19至20天之威斯塔（Wistar)老鼠胚胎之腦皮質。處 里腦邛後，以吸管吸出皮質組織，溶於添加1⑽胎牛血清 之杜氏改良伊格培養基（Dulbecc〇，s m〇dif ied Eagle (DMEM)中。經拭鏡紙（lens tissue)過濾後，細胞懸浮液 移植至塗佈聚乙二胺之載玻片上，於培養瓶中，於標準條 件下之培養箱中培養，每週更換培養基二次。約7天後， 收集細胞，經胰蛋白酶處理後（以消除神經細胞），於5χΐ〇4 個細胞/平方公分之濃度下再移植一次，再培養6至8天， 直到實驗開始為止。此等培養物含有95%以上對可標記星 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 -= J---:=「--1 ϋϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 形細胞之GFAP(酸性神經膠微纖維蛋白質）具有陽性免疫反 應之星形細胞。 測定細胞内Ca2+濃度之螢光顯像實驗及其實驗性影響 實驗開始時（再移植後6至8天），在培養之星形細胞 中添加Ca2+螢光性標記，與5/z Μ糠-2-乙醯氧甲自旨（分子探 針公司（Molecular Probes)於BHKR(碳酸氫化，HEPES-緩衝 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X297公釐） 590772 A7 B7 五、發明説明（9) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 之克氏一林格溶液（Krebs-Ringer Solution)中，於 370c 下培養一小時，進行專一性標識。添加後，將含有培養之 星形細胞之載玻片移至測定箱中，固定在屬於螢光顯像測 定站之反轉螢光顯微鏡上（Zeiss Axiovert 100, Zeiss Fluar 40X接物鏡）。實驗期間（通常20至30分鐘）在測定 箱中連續注入定溫（37Gc)之BHKR，流速600微升/分鐘。採 用FUCAL螢光顯像系統（T. I.L.L光學公司（TILL Photonics GmbH，Planegg)進行測定，經340及380nm二種激發波長激 發後，藉由CCD相機（CS90，席塔系統（Thetan system，Gr6benxell))之助，測定在420nM以上波長發散 之螢光，並計算相應之Ca2+濃度，在添加各種不同試驗物 質至經灌注之培養基之前、之期間及之後，分別每隔12 秒即測定一次。測定各細胞含量下，尤其在分別適當限定 條件下之各種不同測定窗口中，測定細胞内Ca2+濃度變化。 各種不同試驗物質（含或不含C1-腺苷之乙醯膽鹼或氧 化震顫素）通常加至灌注培養基中一分鐘。由於所誘發之 細胞内Ca2+上升為暫時性，因此下表及圖中所示之細胞内 Ca2+濃度變化結果係根據各測定之波峯值得到。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公漦） 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 90

I五 A7 _____ B7發明説明（1〇 ) 表1 ·· 細胞内Ca2+濃度之提高（nM) 乙醯膽鹼 [nM] 細胞内Ca2+濃度[nM] 不添加 +1/ZM C卜腺苷— 3 14.17 ±2.87 10 23.59 ±4.25 100 2.18 ±1.8 56.27 士 6.7 300 1.4 ±1.57 107.27 ±9.41 1 000 19.83 士 3.24 3 000 41.91 ±5.59 182.18 ±12.27 6 000 73.79 ±10.94 10 000 126.79 土 12.07 220.99 ± 10.97 30 000 214.20 ±1〇.38 100 000 19274 ±16.61 300 000 203.49 ±15.46 平均值土SEM，測定細胞數n=45(每次測定） 表1出示ACh誘發星形細胞之細胞内Ca2+提高之劑量一 效應曲線，該曲線顯示，當受到1 “MCI-腺苷刺激作用時， 曲線顯著向左移。ACh量在此時僅需ΙΟΟηΜ，即產生一樣大 小之Ca2+訊號，若沒有腺苷協同作用時，則必須30倍以上 之ACh濃度（超過3//M)方可達此大小之訊號。此協同效應 所需之腺苷提高限度在醫藥上利用腺苷吸收阻斷劑普本菲 靈之療法寸達到之範圍内。 -12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規栳（210X 297公#_ ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 590772 A 7 _— _ B7 五、發明説明（u ) 表2 : C1-腺苷 細胞内Ca2+濃度[nM] [nM] — 不添加 +100nM乙醯膽鹼 3 10.54 土 1.57 1.57 土 2 30 8.29 ±1.69 5.06 土 3.28 100 11.31 土 1.92 4.82 土 3.43 _ 300 8.45 士 1.64 11.56 ±4.42 1 000 14.2 ±2.23 32.35 土 5.49 3 000 15.99 土 2.26 104.16 士 13.82 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 平均值士SEM，測定細胞數n=40(每次測定） 表2出示在100nM ACh存在下，固定Ca2+所需之C1-腺苷濃度。 表3 : 於驗乙醢膽驗受體（六經季銨（Rexamethonium)及蕈毒素乙 醯膽鹼受體（pFHHSiD)對培養之皮質星形細胞中受ΙΟΟηΜ乙 醯膽鹼及1//M C1-腺苷提高之細胞内Ca2+濃度之拮抗劑效 應 試驗物質 Ca2+增加 [佔對照組％] 1〇"Μ六羥季銨 _ 90.7 土 6.26 n=13 50 nM pFHHSiD 53.9 土 7.2 n=19 200 nM pFHHDSiD 22 土 4.7 n=5 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 pFHHSiD(六氫石夕二吩哚（hexahydrosiladifenidol)鹽酸 鹽，對氟類似物）；製造商：RBI(國際生化研究公司（Research Biochemicals International) )° -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） 590772 kl ________ B7 五、發明説明（12 ) 以百分比表示之細胞内Ca2+提高量平均值土SEM係於 不含拮抗劑下，由ΙΟΟηΜ乙醯膽鹼與1//M C1-腺苷達成（對 照值=100%)。對照值測得之細胞内Ca2+提高量為98. 4士 6·4nM (n=125)。 由表3可知，受Cl-腺苷加強之ACh效應為由簟毒素 受體調節之代表性Ach效應，其係受蕈毒素受體阻斷劑拮 抗，但不受菸鹼受體阻斷劑拮抗。 表4 : C1 -腺苷及蕈毒素乙醯膽驗受體促效劑氧化震顫素一Μ對培 養之皮質星形細胞中細胞内Ca2+含量之效應。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 乙醯膽鹼受體促效劑 Ca2+提高量[nM] 100 nM氧化震顫素-Μ 3·3±5·7 100 ηΜ氧化震顫素 +1 // M Cl_腺甘 3. 3土5.7 平均值土SEM (n=6) 、11 由表4可見’ Cl-腺菩亦加強蕈毒素受體促效劑所誘 發之Ca2+訊號。 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 圖1出示第10頁所述之螢光顯像實驗結果。僅單獨 施用100nM ACh與1//M C1-腺苷時，無活性。其組合則使 培養之星形細胞中細胞内Ca2+大幅提高。於不含Ca2+之培 養基中進行相同實驗，顯示當共同施用ACh與C卜腺苷時， 培養之星形細胞中之細胞内Ca2+提高量雖較低，但仍相當 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規栳（210X297公f ) 590772 A7 B7五、發明説明（13 ) 大幅度；此表示細胞内Ca2+已固定化。 圖2出示第10頁所述之螢光顯像實驗，其中星形細 胞中受ACh誘發之細胞内Ca2+提高量之劑量一效應曲線， 當同時受到1//MC1-腺苷之作用時，曲線會大幅向左移。 此時ACh量僅須達到1 OOnM即可產生同樣大小之Ca2+訊號， 若沒有腺苷之協同作用時，則ACh濃度必須高30倍以上（3 以上）方具有相同效果。 圖3顯示原文第10頁所述之螢光顯像實驗結果，其 中測得在lOOnM ACh下固定Ca2+時所必需之α-腺苷濃度。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公f )

Claims (1)

1. 590772 六、申請專利範圍

   5 專利申請案第87102577號 ROC Patent Appln. No. 87102577 修正後無劃線之申請專利範圍中文本-附件(二） Amended Claims in Chinese - Enel. (IT) (民國92年12月Θ日送呈） (Submitted on December /^,2003) 1· 一種組合製劑，其至少包含 10 1) 具有乙醯膽鹼酯酶抑制作用或具有蕈毒素激導性作用 之化合物，其中該化合物為選自·· 9-胺基〜^‘四 氫《、1-节基-4-【（5，6_二曱氧基-1 -茚滿酮)么基】 甲基六氫吼咬及米拉美林(melameline); 2) 可提向内因性細胞外腺苷量之化合物，其中該化合物 係選自式I黃嘌呤衍生物： 15

   經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 0 5 2 2 及/或式I化合物之生理上可耐受之鹽，其中R1為 a) 具有3至8個碳原子之氧院基，其碳鏈可為直鏈或分 支； b) 具有1至8個碳原子之羥烷基，其碳鏈可為直鏈或分 支’且其羥基為第一、第二或第三醇官能基，或 幻具有1至6個碳原子之烷基，其碳鏈可為直鏈或分 支， R2為 16 -

   87051B-接 2 六、申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 a) 氫原子或 b) 具有1至4個碳原子之烷基，其碳鏈可為直鏈或分 支， R3為 a) 氫原子， b) 具有1至6個碳原子之烷基，其碳鏈可為直鏈或分 支， c) 具有1至6個碳原子之烷基，其碳鏈可穿插一個氧原 子，或 d) 具有3至8個碳原子之氧烷基，其碳鏈可為直鏈或分 支；及 3)醫藥賦形劑， 其係用於同時，分開或連續投藥，在神經變性疾病中， 對提高蕈毒素作用具有超過加成性之效應。 2·根據申請專利範圍第1項之組合製劑，其中所包含之化 合物為普本菲靈(pr〇pent〇pfymne)及1-节基_4·【（56_二 甲氧基滿嗣)-2_基】甲基六氮π比咬。 3.根據申睛專利範圍第1項之組合製劑，其係用於 經變性疾病，特定言之老年痴呆症。 、一 訂 域 -17 -