TW571096B - Methods for quantitating high-density lipoprotein cholesterol - Google Patents

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571096 A7 _B7___ 五、發明説明（1 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於不需使用離心分離等操作方法’而以少 量的試藥、簡便的方法從高比重脂蛋白（H D L )以外的 脂蛋白（lipoprotein )中之膽固醇裡高效率地分離出只 在HD L中的膽固醇並定量的方法。 膽固醇等脂質在血淸中與Αρ 〇蛋白質（apoprotein )結合而形成脂蛋白。依物理性質的不同脂蛋白可分類爲 乳靡微粒、超低比重脂蛋白（V L D L )、低比重脂蛋白 (LDL)、高比重脂蛋白（HDL)等。這些脂蛋白當 中L D L是引起動脈硬化的原因物質之一，而另一方面 H D L則具有抗動脈硬化的作用已被揭示。 經濟部智慧財產局員工消費合作抂卬,-..'>.人 在免疫學上指出H D L中的膽固醇値與動脈硬化性疾 病之發病頻率成逆相關，而且在現今裡H D L中的膽固醇 的測定已廣泛地被利用作爲預防或診斷虛血性心臟病之目 的。至於H D L中的膽固醇的測定法，例如有超離心分離 法把H D L從其他脂蛋白中分離後，測定其膽固醇之方法 或經由電泳的分離後進行脂質的染色，並測定其發色強度 的方法。但是這些方法都需要繁雜的操作過程或多數檢體 無法作則處理等問題，以至於幾乎不能被使用在日常生活 裡。 在現代臨床檢驗的領域裡，一般廣泛被使用之H d L 中的膽固醇測定法係以檢體裡加入沈澱劑來凝聚Η 〇 l以 外的脂蛋白後’闬離心法來分離去除，再測定只含H D L 的上淸欲中之膽固醇的沈澱方法。此方法雖比超離心法與 電泳法更簡便，但因包含了韵入沈薇劑之分離操作過程， 本紙張尺度·中酬家標準（CNS ) Μ規格（2】GX 297讀） -4- 571096 經濟部智慧財產局员工消费合作社.？，¾ A7 __B7五、發明説明（2 ) 相較之下必須需要更多的檢體量，而且分析上產生誤差的 可能性也高，況且此全分析工程要完全地自動化是難以達 成的。 另一方面，利用酵素反應來分別定量H D L中的膽固 醇之方法也被討論著。例如已知使用膽汁酸鹽與非離子性 界面活性劑的存在下進行酵素反應的方法（特開昭6 3 -1 2 6 4 9 8號公報）。此種方法是利用當反應初期時酵 素反應與LD L的濃度成正比，然後又與HD L中的膽固 醇濃度成正比的原理，但是因H D L中的膽固醇與其他的 脂蛋白中的膽固醇反應無法完全區分，故其準確性發生了 問題。 已知另一方法係預先將H D L以外的脂蛋白凝集起來 ，再將H D L中的膽固醇單獨與酵素反應後，使酵素活性 失去的同時將凝集體開始再溶解而測定其吸光度的方法（ 特開昭6 - 2 4 2 1 1 0號）。但是此種方法因爲必須添 加至少3次試藥的操作過程，只適用於某特定的自動分析 裝置上，而無法廣泛地被使用。而且將沈澱物再溶解時， 使用了高濃度的鹽類等原因造成分析儀器的損壞，而試藥 的廢棄物處理問題也無法讓人滿意。 於特許第2 6 0 0 0 6 5號中已提出並用一般被使用 之沈澱法裡沈澱H D L以外的脂蛋白之沈澱劑與一般膽固 醇測定試藥之組合，再測定不沈澱之H D L中的膽固醇之 方法。但是依iit專利的實施例，不可能測定出H D L中的 膽固醇，因被考慮爲因發明之錯誤構造要素而導致有欠 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本纸張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 5- 571096 經濟部智¾財產局員工消费合作社口製 A7 ____B7五、發明説明（3 ) 缺之專利’故不能被視爲先前之技術。 本發明群對於血淸裡脂蛋白中之膽固醇測定進行種種 檢討結果，已知可溶解脂蛋白之特定界面活性劑存在下， 進行血淸與膽固醇測定用酵素試藥反應時，首先只有 H D L中的膽固醇進行反應，再來係比η D L的反應還慢 之V L D L中的膽固醇進行反應，最後則由最慢之l D L 中的膽固醇進行反應。 於是進一步的硏究結果，因適當地選擇出可測定依存 H D L膽固醇最初濃度之反應之測定關鍵點，故可測定只 在H DL中的膽固醇之量，而且因在系統內因阻礙血淸脂 蛋白內的膽固醇與膽固醇測定用酵素反應的物質存在，故 只依存H D L膽固醇濃度之反應將能維持較長時間，而且 明顯地這些方法能適用於自動分析裝置，因此完成本發明 〇 即本發明係一種H D L中的膽固醇定量法，其特徵系 於血淸中添加選自聚氧化乙烯伸烷基苯醚與聚氧化乙烯伸 烷基三苯甲基苯醚的界面活性劑，以及膽固醇測定用酵素 試藥，於脂蛋白中H D L的膽固醇優先與膽固醇測定用酵 素試藥反應之時間內測定此膽固醇之方法。 本發明又提供一種物質，其系添加於上述之膽固醇定 量法中，對血淸脂蛋白中之膽固醇與膽固醇測定用酵素試 藥的反應有阻礙效果之物質。 而且本發明對上述各方法提供能有利於實施之測定用 試藥與試藥套組。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 571096 經濟部智慧財產局貞工消費合作.吐：;-;3:κ A7 __B7_五、發明説明（4 ) 圖1爲有關實施例1中，本發明方法與沈澱法的分析 質相關關係圖；圖2爲有關實施例2中，本發明方法與沈 澱法的分析質相關關係圖。 使用於本發明方法之界面活性劑（以下以「溶解促進 性活性劑」表示）’係選自於聚氧化乙烯伸烷基苯醚與聚 氧化乙烯伸烷基三苯甲基苯醚之具有可溶解脂蛋白作用之 界面活性劑。此兩種中前者之市販品例子可舉出 Emarn gen A - 6 0 (花王社製）等，後者之市販品例子 可舉出 Emarugen B — 66 (花王社製）等。 此界面活性劑可單獨、或兩種以上組合而使用。而且 其使用量係隨化合物而不同，雖無特別之限制，但其試藥 必須於適用之分析裝置上，且每次之感度能達到期望之測 定時間內檢驗出H D L中的膽固醇，符和實驗室之要求， 通常使用0 · 0 1 - 5重量％之濃度爲最理想。 而且關於本發明之測定方法，當血淸脂蛋白的膽固醇 與膽固醇測定用酵素試藥進行反應時，最好有具阻礙反應 效果之物質（以下以「反應阻礙物質」表示）存在，這與 不存在情況相比較下，僅依存H D L膽固醇濃度之反應會 維持較長的時間。 本發明所使用之反應阻礙物質，有對脂蛋白有結合親 合力之物質或不溶解脂蛋白之界面活性劑被舉出，各個皆 能以單獨或多種物質結合之形式使用。 對齒蛋白具有結合親合力之狡/質（以下以「結合性物 質」表示）的偶子中，雖可提岀生成多價陰離子與2價金 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公t ) -7- 571096 經濟部智M財產局員工消贷合作社x A7 _____ __B7__五、發明説明（5 ) 屬鹽的物質之組合，即使這物質會與H d L結合而產生沈 潑亦無關緊要。多價陰離子的具體例子有葡聚糖硫酸、磷 鶴酸、肝素（heparin )等；而產生2價金屬鹽之物質的 例子有MgCl2、 CaCl2、MnCl2、 NiCl2 等之2價金屬鹽化物或這些之水和物等被提出。使用這些 結合性物質時，能以單獨或2種以上之組合形式，而且其 使用量依物質種類而不同，雖無特別的限制，但對於理想 之反應終點濃度，多價陰離子爲〇·〇〇2—10重量％ ，生成2價金屬鹽之物質爲〇 · 〇 1 — 5重量％。 而對於不溶解脂蛋白之界面活性劑（以下以「溶解阻 礙性活性劑」代表），例如有聚氧化乙烯伸烷基醚、聚氧 化乙烯伸烷基苯醚、聚氧化乙烯-聚氧化乙烯伸丙基縮合 物、聚氧化乙烯伸烷基醚硫酸鹽、伸烷基苯磺酸鹽中所選 出之界面活性劑被舉出。 上述之中以聚氧化乙烯伸烷基醚、聚氧化乙烯十六烷 基醚（市販品有 Emarugen 2 2 0 (花王社製）等）、 聚氧化乙燒伸院基苯醚（市販品有 Emarugen 9 1 3 ( 花王社製）等）；聚氧化乙烯-聚氧化乙烯伸丙基縮合物 之 P]uronic F — 8 8 (旭電化社製）；聚氧化乙烯伸烷 基醚硫酸鹽則爲聚氧化乙烯十六烷基醚硫酸鈉（市販品有 E m a r υ 2 0 C (花王社製）等）；院基苯基磺酸鹽則以 十二烷基苯基磺酸鈉最理想。 這些溶解浞進活性劑可以1種或2種以上之組合形式 使吊，雖未特別匿制其使周量，但與試料混合時之濃度爲 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） 571096 A7 B7 五、發明説明（6 ) 〇· 01—5重量％、特別以0·05—1重量％之範圍 爲最理想。 溶解促進活性劑與膽固醇測定用酵素試藥（以下以Γ 膽固醇試藥」代表）加入檢體血淸方式，可個別添加或以 同時混合添加，而且不管溶解促進活性劑與膽固醇試藥以 個別或混合方式，皆可添加反應阻礙物質。.更進一步地， 使用複數之反應阻礙物質時，不但可混合而以同單獨的方 式使用，而且溶解促進活性劑與膽固醇測定用酵素試藥可 分別添加。 本發明中爲測定膽固醇而使用之膽固醇試藥，爲公知 之酵素試藥，例如膽固醇脂酶與膽固醇氧化酶之組合、膽 固醇脂酶與膽固醇脫氫酶之組合被提出。這其中以膽固醇 脂酶與膽固醇氧化酶之組合最爲理想。 添加以上之膽固醇試藥後，最終所使用之測定膽固醇 反應量無特定限制，例如有過氧化物酶與原色體組合而進 行之吸光度分析、直接檢驗出補酵素或過氧化氫等方法。 關於本發明方法，必須於H D L膽固醇優先與膽固醇 酵素試藥之反應時間內檢驗出其反應，爲此有溶解促進性 活性劑與膽固醇試藥與試料相混合後，反應之進行可以動 力學探測的方法’或以反應終末點法測定Η 〇 L膽固醇之 反應終點作爲空白値以修正之方法（二點檢驗法）等。而 且右必乐長H D L的反應時間於探測的情況，可添加反 應阻礙物質，緩遲膽固醇之檢驗時間，而延長僅依存 H D L· Μ — _濃度之反應時間^ 本纸張尺度適财關家標準（格（2】GX297公梦）~~~一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 •f 經濟部智毯財產局员工^^合作社力·〆、 571096 經濟部智慧財產局8工消費合作吐:::-¾ A7 ___ _B7_五、發明説明（7 ) 爲有利於實施而使用之試藥或試藥組套，可列舉出下 列幾項： (1)包含下列2成分①與②之物質 ① 溶解促進性活性劑 ② 膽固醇試劑 (2 )下列成分①至③ ① 溶解促進性活性劑 ② 反應阻礙物質（結合性性質、溶解阻礙性活性劑） ③ 膽固醇試劑 如此之試藥或試藥組套，可與上述的溶解促進性活性 劑、膽固醇試劑（膽固醇脂酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫 氫酶）、反應阻礙物質（結合性物質、溶解阻礙性活性劑 )、過氧化物酶、色原體、補酵素等或其他、適當之p Η 緩衝劑、氧化防止劑、擔體等組合。而且關於試藥或試藥 組套的形式，可利用液體狀或其他，將此冷凍乾燥處理後 之物質等。 雖然於以下舉出本發明之實施例說明，但本發明不受 此限制。 實施例1 對於5 0個含有脂蛋白之血淸檢體樣品，以下述之本 發明方法及過去之沈澱法，定量H D L中之膽固醇，比較 雨者之定値。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公嫠） -10- 571096 Α7 Β7 經濟部智慧財產局gv一消^合作-·.!..;:!:;· 五、發明説明（8 ) 於本發明方法，添加1 0 0 m Μ之Μ E S緩衝劑（第 一試劑；ρ Η 6 . 5 ) 3 0 0 //丨於各3 // 1血淸檢體， 約5分鐘後添加包含 Emarugen Β — 6 6 1%、膽固醇 脂酶1 U / m 1、膽固醇氧化酶1 U / m 1、過氧化物酶 5 U /m 1、二磺丁基間位苯胺0 · 〇 4 %與4 —胺基安 替比林0 · 0 4 % 1 0 ◦ m Μ的Μ E S緩衝劑（p Η 6 · 5 )之膽固醇測定試藥（第二試劑）1 〇 〇 // 1 ，添 加第二劑之前與添加之後5分鐘測兩者於6 Ο Ο n m (副 波長7 0 0 nm)之吸光度，由兩者之差即可求出血淸檢 體中H D L膽固醇之濃度（二點檢驗法）。而使用既知濃 度之對照組血淸作爲修正用。以上之操作已使用於日立 7 1 5 0型自動分析裝置上。 另一方面，以沈澱法測定H D L中之膽固醇‘時， 2 0 0 // 1之檢體與含有葡聚糖硫酸〇 · 3 %與氯化鎂 2 %之水溶液2 0 0 // 1相混合，再以3 0 0 0 r p m離 心1 0分鐘。取上淸液5 Ο μ 1 ，添加含有 TritonX-lOO 1 %、膽固醇脂酶1 U / m 1、膽固醇氧化酶1 U / m 1 、過氧化物酶5 U / m 1及二磺丁基間位苯胺〇 . 〇 4 % 之1 0 0 m Μ Μ E S緩衝液（ρ Η 6 · 5 )之膽固醇測 定試藥2 3 m 1混合，於3 7 °C培養1 0分鐘後，測定其 6 0 0 n m之吸光度，求得H D L中之膽固醇之濃度。 圖1爲本發明方法與沈澱法的結果之相關圖，如圖所 示本發明方法不僅操作簡單，顯示其結果比過去之沈澱法 有梠當好的梠關性。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中.國國家標孪（CNS ) A4規格（210X297公楚） -11 - 571096 A7 經濟部智慧財產局員工消费合作-1:;ϋ B7五、發明説明（9 ) 實施例2 除第2試藥中之 Emarugen B — 6 6由 Emarugen A — 6 0 1 %、代替添加之外，其他與實施例1使用相 同之試藥、使用相同的方法定量含有脂蛋白之5 0個血淸 檢體樣品的H D L中之膽固醇。 即於3 // 1之檢體中添加3 0 0 // 1之第一試劑，約 5分鐘後添加1 0 0 // 1之第二試劑。在第二試劑添加之 後1 2秒至2 4秒中測定其於5 4 6 n m (副波長6 6 ◦ n m )之吸光度變化，求得H D L膽固醇的濃度。並使用 修正用物質即既知濃度之兩種對照組血淸（低濃度與高濃 度）。以上之操作已使用於日立7 1 5 0型自動分析裝置 上。 與實施例1相同，對於相同之檢體以過去之沈澱法定 量H D L中之膽固醇，將比較其測定値，結果如圖2所示 〇 從圖2之結果可看出本發明方法不僅操作簡單，顯示 比過去之沈澱法有相當好的相關性。 實施例3 使用與實施例2相同之第二試藥，與下列之第一試劑 ，對於含有脂蛋白之5 0個血淸檢體樣品，使用本發明方 法與過去之沈澱法定量HD L中之膽固醇，並比較其測定 値。並且加上作爲對照之第一試藥Α (與實施例相同） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2】〇Χ29*7公嫠） -12- 571096 A7 __B7 五、發明説明（10) 〔第一試藥〕 第一試藥A : 1 0 0 m Μ 之 Μ E S 緩衝液（p Η 6 · 5 ) 第一試藥Β :

Pluronic F - 8 8 (旭電化社製）〇 · 2 %水溶液 第一試藥C :含有磷鎢酸鈉〇 · 2 %與氯化鎂 1 0 0 m Μ之水溶液（p Η 6 · 4 ) 第一試藥D :含有 Pluronic F — 88 0 · 2%、磷鎢 酸鈉0 · 2 %與氯化鎂1 0 0 m Μ之水溶液（p Η 6 . 4 ) 吸光度的測定目的係爲確定反應阻礙物.質的添加效果 ，使用日立7 1 5 0測定第二試藥添加後1 2秒至2 4秒 後、1 2秒至1 6秒後以及1 2秒至3 1 2秒後之各種不 同測光時間。 另一方面，H d L的測定採用與實施例1相同之沈澱 法，調查與本發明方法於各條件下之相關關係。表1所示 爲其相關係數。

經濟部智慈財產局負工消赀合作-U (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

用 適 度 尺 張 纸 本 準 標 I I國 國 一釐 公 97 經濟部智慧財產局負工消費合作社印公 571096 Α7 ____Β7 五、發明説明（11) _ 表 1 12-2 4秒 12-1 6 8秒 1 2 -3 1 2秒 .第一試樂A 0.922 0.488 0.336 第一試藥B 0.739 0.900 0.846 第一試藥C 0.543 0.946 0.747 第一試藥D 0 .045 0.972 0.988 如同這結果所示，對於不含反應阻礙物質之第一試藥 ，僅在反應初期時顯示良好的吸光度測定結果。.另一方面 ，含有反應阻礙物質之 Pluronic F - 8 8 (旭電化社製 )0 · 2%水溶液、含有磷鎢酸鈉〇 · 2 %與氯化鎂 1 0 0 m Μ之水溶液（p Η 6 · 4 )以及含有 PluronU F — 8 8 0 · 2 %、磷鎢酸鈉〇.2 %與氯化鎂1 0 m Μ之水溶液（p Η 6 · 4 )分別作爲第一試劑所測出之 結果爲每個在長時間的測定下皆呈現良好的相關性（愈接 近1其相關性愈高），因此確認反應阻礙物質於依存 H D L膽固醇量之反應有著延長的效果。 關於本發明，不僅不需離心分離等前處理，而且能夠 以簡單的操作與良好效率定量出H D L中之膽固醇。進一 步地，因爲少量的試料、簡便的操作而可能可以作出特殊 之測定方法，故適用於種種的自動分析裝置，而且對於臨 丨末檢驗的領域裡極爲有用。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29*7公嫠） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-14- 571096 - c之數値具有極高的相關性。 本案之界面活性劑以外之界面活性劑與以往方法之HDL-C 之數値不具有相關性。 ⑵與總膽固醇値之關係（第2表） 本案之界面活性劑1不論測定時間，與總膽固醇値不具相關性。 本案之界面活性劑2在短測定時間下，與總膽固醇値不具相關 性。 以往之界面活性劑不論時間長短，與總膽固醇値具有極高相關 性。 不會溶解脂蛋白之界面活性劑與總膽固醇値不具相關性。 特開昭63-126498之界面活性劑隨著測定時間之延長，與總膽固 醇値之相關性增加。 結論： 本案發明之界面活性劑1及2係對於H D L分離份具有選擇性 產生作用的界面活性劑。 然而，以往之界面活性劑，不會溶解脂蛋白之界面活性劑及特開 昭63-126498之界面活性劑對於H D L分離份不具選擇性，即使使用 這些界面活性劑也無法得到本案發明的效果（不需分離步驟，且以酵 素僅測定試料中之HD L — C)。 571096 第1表與HDL-C之相關係數 12-36 秒 測定時間 12-120 秒 12-300 秒 聚氧化乙烯烷撐三苄基醚Emulgen B-66 0.969 0.977 0.987 聚氧化乙烯烷撐苯醚Emulgen A-60 0.906 0.767 0.364 聚氧化乙烯辛基苯醚Triton X-100 0.093 0.029 -0.012 聚氧化乙烯高級醇醚Emulgen 709 -0.017 -0.041 -0.047 聚氧化乙烯2級烷醚Nikkol BT 9 0.033 -0.016 -0.025 聚氧化乙烯-聚氧化丙烯縮合物Pronik F-88 -0.006 0.022 0.148 膽酸鈉 0.226 0.328 0.044 571096 第2表與總膽固醇之相關係數 12-36 秒 測定時間 12-120 秒 12-300 秒 聚氧化乙嫌院撐三苄基醚Emulgen B-66 0.012 •0.034 0.063 聚氧化乙嫌院撐苯醚Emulgen A-60 0.341 0.578 0.852 聚氧化乙烯辛基苯醚Triton X-100 0.890 0.982 0.988 聚氧化乙烯高級醇醚Emulgen 709 0.976 0.989 0.989 聚氧化乙烯2級烷醚Nikkol BT 9 0.981 0.990 0.991 聚氧化乙烯-聚氧化丙烯縮合物Pronik F-88 0.041 0.231 0.268 膽_ 0.263 0.555 0.685

Claims (1)

1. 公告本 A8 B8 C8 D8 571096U'2Q 修正 I干月日9 補充; 々、申請專利範圍 第R 7 Ί ‘ ’ 1 1 4 〇〇2號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 民國9 2年1 1月20日修正 1 . 一種闻比重脂蛋白膽固醇定量法，其特徵係於含 血淸的試料中，添加選自於聚氧化乙烯伸烷基苯醚與聚 氧化乙燦伸院基三苯甲基苯醚之界面活性劑、以及選自 膽固酶與膽固醇氧化酶或組合膽固醇酶與膽固醇氧化 酶的膽固醇測定用酵素試藥，於脂蛋白中高比重脂蛋白中 的膽固醇優先與膽固醇測定用酵素試藥反應時機內測定該 膽固醇反應量之方法。 2 · —種高比重脂蛋白膽固醇定量法，其特徵係於含 血淸的試料中，添加（1 ) 0 · 0 i〜5重量％選自於聚氧化 乙烯伸烷基苯醚與聚氧化乙烯伸烷基三苯甲基苯醚之界面 活性劑、（2) (a) 〇·〇ι〜5重量％ ( *〇.〇5〜1重量％ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 )的不溶於聚脂蛋白的界面活性劑、（b )對選自生成 0.0 2〜1 0重量％的多價陰離子與〇 . 〇丨〜5重量％的2價 金屬離子之物質組合、或（a )與（b )的組合之血淸脂 蛋白中之膽固醇與膽固醇測定用酵素試藥反應具有阻礙效 果之物質、（3 )選自膽固醇酶與膽固醇氧化酶或組合膽 固醇酶與膽固醇氧化酶的膽固醇測定用酵素試藥，於脂 蛋白中高比重脂蛋白中的膽固醇優先地與膽固醇測定用酵 素試藥反應時機內測定該膽固醇反應量之方法。 3 .如申請專利範圍第2項之高比重脂蛋白膽固醇的 定量方法，其中該不溶於脂蛋白之界面活性劑係至少一種 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 571096 Α8 Β8 C8 D8 i、申請專利範圍 選自於聚氧化乙嫌炼基醚、聚氧化乙燃院基苯醚、聚氧乙 嫌一聚氧化乙燃伸丙基縮合物、聚氧化乙細丨兀基酿硫酸鹽 、烷基苯磺酸鹽所成群之界面活性劑。 4 . 一*種含有局比重脂蛋白膽固醇測疋用試劑，其特 徵爲含有 ① 選自0.01〜5重量％的聚氧化乙烯伸院基苯醚與聚 氧化乙烯伸烷基三苯甲基苯醚之界面活性劑 ② 選自膽固醇酶與膽固醇氧化酶或組合膽固醇酶與 膽固醇氧化酶的膽固醇測定用酵素試藥。 · 5 · —種含有高比重脂蛋白膽固醇測定用試劑之試藥 套組，其特徵爲含有. ① 選自0.01〜5重量％的聚氧化乙烯伸烷基苯醚與聚 氧化乙烯伸烷基三苯甲基苯醚之界面活性劑 ② 選自膽固醇酶與膽固醇氧化酶或組合膽固醇酶與 膽固醇氧化酶的膽固醇測定用酵素試藥。 6 · —種含有高比重脂蛋白膽固醇測定用試劑，其特 徵爲含有以下①〜③成份者， ① 0·01〜5重量％的選自聚氧化乙烯伸烷基苯醚與聚 氧化乙烯伸烷基三苯甲基苯醚之界面活性劑 ② 對（a) 0.01〜5重量％ ( *〇·〇5〜1重量％)的不 溶於聚脂蛋白的界面活性劑、（b )對選自生成〇 . 〇 2〜1 〇 重量％的多價陰離子與〇·〇1〜5重量％的2價金屬離子 之物質組合、或（a )與（b )的組合之血淸脂蛋白中之 膽固醇與膽固醇測定用酵素試藥反應具有阻礙效果之物質 Λ * ϋϋ - ϋϋ ιϋ« a— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210χ：297公董） 2 571096 A8 B8 C8 D8 ^、申請專利敕圍 ③選自膽固醇酶與膽固醇氧化酶或組合膽固醇酶與 膽固醇氧化酶的膽固醇·々則定用酵素試藥。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 7 · —種含有高比重脂蛋白膽固醇測定用試劑之試藥 套組，其特徵爲含有以下①〜③成份者， ① 0.01〜5重量％的選自聚氧化乙燃伸院基苯醚與聚 氧化乙烯伸烷基三苯甲基苯醚之界面活性劑 ② 對（a) 0.01〜5重量％ ( *〇.〇5〜1重量％)的不 溶於聚脂蛋白的界面活性劑、（b )對選自生成0.0 2〜1 0 重量％的多價陰離子與0·01<5重量％的2價金屬灕子 之物質組合、或（a )與（b )的組合之血淸脂蛋白中之 膽固醇與膽固醇測定用酵素試藥反應具有阻礙·效果之物質 ③ 選自膽固醇酶與膽固醇零化酶或，組合膽固醇酶與 膽固醇氧化酶的膽固醇測定用酵素試藥。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 8 ·如申請專利範圍第6項之高比重脂蛋白膽固醇的 測疋用試樂’其中該成分②的不溶於脂蛋白之界面活性劑 係至少一種選自於聚氧化乙烯烷基醚、聚氧化乙烯烷基苯 醚、聚氧乙烯一聚氧化乙烯伸丙基縮合物、聚氧化乙烯烷 基醚硫酸鹽、烷基苯磺酸鹽所成群之界面活性劑。 9 ·如申請專利範圍第7項之高比重脂蛋白膽固醇 的測定用試藥之試藥套組，其中該成分②的不溶於脂蛋白 之界面活性劑係至少一種選自於聚氧化乙烯烷基醚、聚氧 化乙Μ院基苯醚、聚氧乙烯一聚氧化乙烯伸丙基縮合物、 聚氧化乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基苯磺酸鹽所成群之界面活 性劑。 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（21〇χ297公釐） 571096

   第87 1 1 4002號專利申請案 補充實驗例 (實驗方法） 依據實施例1〜3記載條件，對於（1 )本發明的界 面活性劑、（2 )膽固醇測定用酵素試藥、（3 )具有阻礙 血淸脂蛋白中的膽固醇與膽固醇測定用酵素試藥反應的 效果之物質，調製出（1 )〜（3 )各物質的不同濃度試 藥進行試驗。 3 // L血淸中，添加300 // L的試藥欄所記載的各試 藥，測定添加後立即（作爲〇分鐘）〜10分鐘的600nm(副 波長700nm)之吸光度。且爲使各物質的濃度表示更爲明 瞭，於單一試藥之測定系統中進行測定。 使用日立7150自動分析裝置進行測定，求得25個 血淸檢體中本發明方法所得測定値’與先分離的過去沈 澱法所得測定値之間的相關係數’並評估其結果。 (試藥） \ 試驗 1 : l〇〇mM 0.01 〜5% 1U / m L 1U/ mL 5U/ mL 0.04% 0.4% MES 緩衝液（ρΗ6·5 ) Emarugen B66 膽固醇脂酶 膽固醇氧化酶 過氧化物酶 4-胺基安替比林 二磺丁基間位苯胺 571096 試驗 2 : 100mM 0.01 1 〜10U/ mL 1 〜10U/ mL 5U/ mL 0.04% 0.4% MES 緩衝液（ρΗ6·5 ) Emarugen B66 膽固醇脂酶 膽固醇氧化酶 過氧化物酶 4 ·胺基安替比林 二磺丁基間位苯胺 試驗 3 : 100mM 3% 5U/ mL 5U/ mL 5U/ mL 0.04% 0.4% MES 緩衝液（ρΗ6·5 ) Emarugen B66 膽固醇脂酶 膽固醇氧化酶 過氧化物酶 4 -胺基安替比林 二磺丁基間位苯胺 0 〜1 % PluronicF- 88 (效果） 1.試驗1 如補充表1所示，測定含有0.01〜5重量％的 Emarugen B66之試藥時，發現除0.01重量％的試藥以外， 顯示良好相關性（幾乎接近1的高相關性，其中以0.9爲 基準）的測定時機。 2.試驗2 如補充表2所示，Emarugen B66的濃度固定在0.01 571096 重量％ ’對膽固醇測定用酵素試藥，使用膽固醇脂酶及 膽固醇氧化酶所調製的1〜1 〇 u/ mL濃度各組合之試藥 進行測定時，發現膽固醇脂酶及膽固醇氧化酶各濃度爲5 U/ mL以上的組合，其相關係數爲〇.9以上之測定時機。 3.試驗3 如補充表3所示，將Emariigen B66的濃度固定在3 重量％ ’膽固醇脂酶及膽固醇氧化酶的濃度各固定在5U /1111^’調製出含有〇.〇5〜1重量％的具有阻礙血淸脂蛋 白中的膽固醇與膽固醇測定用酵素試藥反應之效果的物 質PluronicF-88試藥進行測定時，發現相關係數爲〇.9以 上的測定時機，又，確認相關係數隨PlnronicF-88濃度降 低的測定時機變慢（添加試藥至測定間的時間變長）。 (結論） 本發明爲依據說明書及實施例所記載的條件下，可 確認當適宜地選擇本發明的界面活性劑、膽固醇測定用 酵素及具有血淸脂蛋白中的膽固醇與膽固醇測定用酵素 試藥反應阻礙效果之物質等後，僅變動其濃度等便可實 施。 3 571096 補充表1試驗1的結果 本發明的界 面活性劑 測定時機（由添加試藥至測定的時間） 1分 2分 3分 4分 5分 6分 7分 8分 9分 10分 0.01% -0.291 0.088 0.317 0.360 0.357 0.270 0.183 0.120 0.041 -0.024 0.05% 0.907 0.918 0.912 0.941 0.965 0.965 0.952 0.935 0.920 0.905 0.1% 0.926 0.930 0.964 0.978 0.968 0.952 0.934 0.918 0.903 0.887 1% 0.931 0.969 0.983 0.967 0.945 0.915 0.881 0.844 0.803 0.760 3% 0.942 0.984 0.974 0.940 0.889 0.815 0.731 0.636 0.537 0.442 5% 0.946 0.983 0.955 0.891 0.791 0.667 0.529 0.394 0.277 0.177 (棚縣數：Γ ) 補充表2 試驗2的結果 (相關係數：r) 膽固醇測定用 酵素 測定時機（由添加試藥至測定的時間)_ 1分 2分 3分 4分 5分 6分 7分 8分 9分 10分 C01/CE1 - 0.291 0.088 0.317 0.360 0.357 0.270 0.183 0.120 0.041 -0.024 C05/CE5 0.840 0.905 0.863 0.787 0.691 0.573 0.455 0.337 0.246 0.177 C010/CE10 0.944 0.946 0.903 0.838 0.768 0.688 0.607 0.538 0.483 0.438 C〇：膽固醇氧化酶 C E :膽固醇脂酶: 單位：U/mL 補充表3試驗3的結果 (相關係數：r) 具有阻礙反應效 果之物質 測定時機（由添加試藥至測定的時間V1 1分 2分 3分 4分 5分 6分 7分 8分 9分 10分 0% 0.924 0.988 0.967 0.926 0.865 0.787 0.689 0.579 0.468 0.364 0.05% 0.924 0.986 0.967 0.928 0.873 0.806 0.720 0.620 0.519 0.420 0.1% 0.918 0.985 0.970 0.933 0.884 0.817 0.736 0.642 0.545 0.450 0.5% 0.901 0.966 0.967 0,940 0.899 0.863 0.811 0.756 0.697 0.636 1% 0.907 0.904 0.932 0.928 0.914 0.884 0.853 0.819 0.788 0.758 4