TW493001B - A process for producing trehalose and uses thereof - Google Patents

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TW493001B
TW493001B TW084107521A TW84107521A TW493001B TW 493001 B TW493001 B TW 493001B TW 084107521 A TW084107521 A TW 084107521A TW 84107521 A TW84107521 A TW 84107521A TW 493001 B TW493001 B TW 493001B
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sugar
glucose
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TW084107521A
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Tomoyuki Nishimoto
Hiroto Chaen
Toshiyuki Sugimoto
Toshio Miyake
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Hayashibara Biochem Lab
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493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7__五、發明説明（！） 發明背景 1 .發明領域 本發明是有關海藻糖及其製法及用途，特別是有關海 藻糖及含彼之醣，其可由在含有麥芽糖之營養培養基中培 養可產生麥芽糖/海藻糖轉化酵素之微生物而得，以及有 關彼之製法及用途。 2 _先前技藝說明 海藻糖（α，α_海藻糖）自古早已知是一種由葡萄 糖組成物的非還原醣，且如Advances in carbohydrate chemistry ，由 Academic Press INc., New York, New York, USA出版，Vol. 18，pp. 2 0 1 -22 5 ( 1 9 6 3 )及 Add 1 i ed and Environmental Microbiology. Vol.56, pp.3,213- 3 , 2 1 5 ( 1 9 9 0 )所述，其痕量及廣泛的分佈可見於微生物， 覃類及昆蟲中。因爲就如同海藻糖，非還原性醣並不會造 成攜有胺基之物質之胺基-羰基反應，如胺基酸及蛋白質 ，且因此既不破壞也不會改變他們，醣已被視爲可用於利 用及加工，而勿需畏懼有變棕及敗壞情況。因此發展使其 可具工業規模產製之方法極被期待。 海藻糖的製法有許多是已知的，如日本公開公告N 〇 • 154，485/75中利用微生物細胞，及如日本公 開公告No· 216’695/83中所揭示的經由麥芽 糖磷酸化酶及海藻糖磷酸化酶之組合轉化麥芽糖。前一方 法然而是因爲利用微生物細胞因此不適合工業規模產製， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） '~： (請先閱讀背面之注意事項寫本頁)
、1Τ
-4 一 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 ) 這是因爲微生物細胞中充作起始物的海藻糖含量通常很低 ，即少於1 5w/w% (下文出現的百分率除非另外有標 示否則表示Aw/w%")，且海藻糖的萃取及純化步驟 十分複雜。然而利用麥芽糖磷酸化酶及海藻糖磷酸化酶的 後一製法中，在工業規模上尙未被真正理解，這是因爲二 種酵素同經由葡萄糖- 1 -磷酸而作用之缺點，且此點阻 礙受質所需之較高濃度，且因二種酵素均不可逆地作用在 相同的反應系統中因此海藻糖的產率很低，且進一步地此 種反應系統十分難以穩定維持及平穩進行。 和此有關係的，Gekkan Food Chemical (Monthly Food Chemical ) ， Recent Aspects and Issues in
Utilization and Development of Starch# , August, pp. 6 7- 7 2 ( 1 9 9 2 )在 ^Oligosaccharides" —角中註解道 ，雖然海藻糖有極廣泛的用途，利用任何直接的醣-轉移 或水解反應的彼之酵素性產製，在目前被視爲是科學上不 可能的，證實利用酵素反應自充作原料之澱粉產製海藻糖 被視爲是科學上不可能的。 然而已知部份澱粉水解產物，如液化澱粉及麥芽寡醣 均產自澱粉，由於可還原其分子中之末端基團故通常可呈 現還原力。此種部份澱粉水解產物在本說明書中被命名爲 a還原性部份澱粉水解產物"。還原性部份澱粉水解產物 在乾固體基礎上之還原力通常以〜右旋糖當量〃或>DE 〃表示。同時也知有較高D E值的還原性部份澱粉水解產 物通常是較小的分子，呈現低粘性及強的甜化力，以及對 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 5 — (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 衣· 寫太
493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _ B7___五、發明説明（3 ) 具有胺基之物質（如胺基酸及蛋白質）有高的反應活性， 因造成胺基一羰基反應而導致變棕，不佳的氣體及破壞。 還原性部份澱粉水解產物之特性係依其D E之幅度而 變化且因此特定還原性部份澱粉水解產物與其D E值間之 關係十分重要。然而在技藝中咸信切斷此關係是不可能的 〇 切斷此關係的唯一方法是將還原性部份澱粉水解產物 改變成非還原性醣，如以高壓氫化作用將其還原基團轉化 成醇基。然而此方法需高壓之壓熱器，安全裝置及小心控 制以避免災害，以及耗損大量的氫及能源。再者所得的醣 醇和還原性部份澱粉水解產物相異點在於，還原性部份澱 粉水解產物由葡萄糖部份組成，而糖醇由葡萄糖及山梨醇 組成，且此可造成暫時的消化不良及下痢。因此極需發展 出可降低或甚至消除還原性部份澱粉水解產物還原力而不 改變組成還原性澱粉水解產物之葡萄糖分子之任何方法。 爲解決此，本發明者在日本專利案N 〇 . 1 4 4，0 9 2/9 4揭示一種新穎的酵素（下文稱之爲 〜麥芽糖/海藻糖轉化酶其可將麥芽糖轉化成海藻糖 ，因此可發展出方法利用此麥芽糖/海藻糖轉化酶自麥芽 糖中產生海藻糖或含彼之醣。 然而後來發現到，不幸地此一方法需長時間培養可產 生酵素的微生物，回收酵素及轉化麥芽糖成海藻糖之酵素 反應。因此極需發展出可以較不複雜的步驟自麥芽糖中更 容易產製海藻糖的任何方法，包括酵素之製法。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' '~： '~ -6 - (請先閲讀背面之注意事項
、11
493001 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 A7 __ _B7五、發明説明（4 ) 發明要點 本發明是發展出以縮短的處理時間自麥芽糖中容易地 生成海藻糖之新穎的方法，及提出彼之用途。 爲解決這些目的，本發明者積極致力於培養可產生麥 芽糖/海藻糖轉化酵素之微生物，及也自其中產製酵素。 結果，本發明者發現微生物在培養之早期階段產製酵素， 且在培養中將麥芽糖納入營養培養基中可容易地形成及累 積海藻糖。本發明者因而完成本發明。 更特別地，本發明藉著在有麥芽糖之營養培養基中培 養可產生麥芽糖/海藻糖轉化酶之微生物而開發出海藻糖 或含彼之醣，以及發展出彼之製法及用途。頃發現在本發 明中，較佳的麥芽糖製劑爲由將液化澱粉接受Θ —澱粉酶 或β -澱粉酶及澱粉脫支酶而得者，同時使用可產生麥芽 糖/海藻糖轉化酶之微生物，就海藻糖之產製而言是十分 有益的。海藻糖或含彼之醣得到後可有益地應用於各種組 成物中，包括食品，化粧品及藥品，此係因其提高的穩定 性及易處理性之故。 附圖說明 圖1示出溫度對衍自Pimelobacter種R 48之麥芽糖 /海藻糖轉化酶活性上之作用。 圖2示出p Η值對衍自Pimei〇bacter種R 4 8之麥芽 糖/海藻糖轉化酶活性上之作用。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項spi寫本頁) HI寫木 訂
-7 - 493001 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（5 ) 圖3示出衍自Pimelobacter種R 4 8之麥芽糖/海藻 糖轉化酶之熱穩定性。 圖4示出衍自Pimelobacter種R 4 8之麥芽糖/海藻 糖轉化酶之P Η穩定性。 圖5示出溫度對衍自惡臭假單胞菌（Pseudomonas Puti da) Η 2 6 2之麥芽糖/海藻糖轉化酶之活性上的作 用。 圖6示出pH值對衍自惡臭假單胞菌Η 2 6 2之麥芽 糖/海藻糖轉化酶活性上之作用。 圖7示出衍自惡臭假單胞菌Η 2 6 2之麥芽糖/海藻 糖轉化酶之熱穩定性。 圖8示出衍自惡臭假單胞菌Η 2 6 2之麥芽糖/海藻 糖轉化酶之Ρ Η穩定性。 圖9示出溫度對衍自水生棲熱菌（Thermus aquaticus) ( A T C C 3 3 9 2 3 )之麥芽糖 / 海藻 糖轉化酶活性上之作用。 圖1 0示出pH對衍自水生棲熱菌（ATCC 3 3 9 2 3 )之麥芽糖/海藻糖轉化酶活性上之作用。 圖1 1示出衍自水生棲熱菌之麥芽糖/海藻糖轉化酵 素之熱穩定性。 圖1 2示出衍自水生棲熱菌之麥芽糖/海藻糖轉化酵 素之ρ Η穩定性。 詳細說明 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐1 ~： 一 8 - (請先閲讀背面之注意事項spi寫本頁) 衣· ill寫太 訂
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493001 A7 B7 __ 五、發明説明（6 ) 可產製本發明可應用之麥芽糖/海藻糖轉化酶之微生 物爲產生可轉化麥芽糖成海藻糖之酵素者。此種酵素之實 例包括衍自Pimelobacter，假單胞菌種及熱棲菌種之微生 物者，其揭示於日本專利案No.144，092/94 中0 用於培養此種微生物所用之營養培養基爲含麥芽糖爲 受質以形成海藻糖者，且在其中微生物可生長及產製麥芽 糖/海藻糖轉化酶。若必要時，吾等可綜合其他碳源而任 意使用，包括醣如：葡萄糖，果糖，乳糖，蔗糖，甘露糖 ，山梨醇及糖蜜，有機酸如：檸檬酸及琥珀酸及其鹽類。 培養基中麥芽糖之較佳濃度爲2 Ow/ν%以下，欲求的 是1 5w/v%以下，更好是約5 — l〇w/v%。氮源 實例爲無機鹽類如銨鹽及硝酸鹽，及有機氮化合物如尿素 ，穀物浸漬液，酪蛋白，蛋白陳，酵母浸膏及肉膏。礦物 之實例有鈣鹽，鎂鹽，鉀鹽，鈉鹽，磷酸鹽，錳鹽，鋅鹽 ’鐵鹽，酮鹽，鉬鹽及鈷鹽。若必要時可任意使用胺基酸 及維生素。 培養通常在需氣條件下，在此微生物可生長，通常是 4-80°C，較好 20 — 75 °C，及 PH5 — 9，較好 P Η 6 - 8 . 5。培養時間是在微生物可增殖之層次上， 如1 0 - 1 0 0小時。對於培養物中之氧濃度並無特殊限 制，但以0· 5-20ppm爲較佳。針對此目的，吾等 可控制通氣’攪拌，添加之氧及/或提高醱酵槽中之壓力 。培養之進行可採批次，連續或半連續方式。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） '~' (請先閱讀背面之注意事項！|^寫本頁)
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493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（7 ) 因此在有麥芽糖之營養培養基中培養可產生麥芽糖/ 海藻糖轉化酶之微生物可形成及累積海藻糖。培養基於培 養中添加/補充另外製備之麥芽糖/海藻糖轉化酶，界面 活性劑如陰離子或非離子界面活性劑及/或溶解酵素如溶 菌酶，以促進海藻糖之形成是有益的。以此方式形成及累 積之海藻糖存在液體部份，可移去不溶性物質後得到。 含有海藻糖之培養物先製成無細胞之液體，可利用傳 統的固體/液體分離法，如過濾及離心分離，液體再濃縮 ，以活性碳脫色，以Η -及Ο Η -型離子交換器去離子水 化，再以傳統方式濃縮成糖漿產物。產物進一步乾燥成粉 末。若必要時，在產製海藻糖或含彼之醣中可將全部培養 物接受膜過濾，如普通的濾器或中空濾器以移去細胞及可 溶的聚合物如蛋白質及核酸，或以離心分離先移去不溶物 質，再於濃縮，脫色及去離子純化前以膜過濾移去可溶的 聚合物。 接下來解釋涉及於本發明海藻糖製法中之麥芽糖/海 藻糖轉化酶。可在細胞及培養物上清液中均見到酵素活性 ，因此吾等可以粗製酵素製劑回收彼等，或以粗製酵素製 劑使用完整的培養物。爲移去培養物中之細胞，可應用傳 統的固/液分離法。如吾等可任意選用培養物接受離心分 離之方法，培養物利用預塗層濾器過濾分離之方法，及培 養物利用普通膜及中空纖維行膜過濾之分離方法。無細胞 液體可以粗製酵素製劑而完整使用，但通常使用前先濃縮 。濃縮之進行可利用如硫酸銨沈澱法，丙酮/醇沈澱法及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項
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-10 - 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（8 ) 利用普通膜及中空纖維之膜濃縮法。 無細胞之液體及其濃縮物可以傳統方式固化。針對此 目的，可應用結合至離子交換器，共價粘附或吸附至樹脂 及膜，及利用聚合物截陷。自培養物中分出之細胞可以粗 製酵素製劑型式完整使用，或使用前先固化。如，細胞先 以藻酸鈉固定，再於氯化鈣溶液中滴入及凝膠化成顆粒型 式。顆粒進一步以聚乙烯亞胺或戊二醛處理。吾等可萃取 細胞中之酵素並以粗製酵素液體般應用萃取物。如，細胞 先接受超音波瓦解，利用玻璃珠及鋁或法式壓力瓦解器機 械地瓦解以萃取酵素，再離心分離或行膜過濾，由此得透 明的粗製酵素液體。 此一酵素液體可完整地使用，或使用前以傳統方式進 一步純化。如已接受硫酸銨鹽析及濃縮之得自培養物中之 粗製酵素製劑，先透析，再於陰離子交換管柱層析，利用 〜DEAE T0Y0PEARL"，疏水性管柱層析，利用、BUTYL T0Y0PEARI/及凝膠過濾層析，利用、T0Y0PEARL HW-55" 純化，以上均爲日本東京Tosoh Cor p之產品，由此得到電 泳上均質之酵素製劑。 如此得到的麥芽糖/海藻糖轉化酶通常具有以下物化 特性： (1 )作用 可轉化麥芽糖成海藻糖，以及海藻糖轉化成麥芽糖。 (2 )分子量 在SDS —凝膠電泳上爲約57，0〇〇 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項 衣-- spi寫本頁) 訂
- 11 - 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（9 ) 120，000道耳吞。 (3 )等電點 在 Ampholine 電泳上爲約 P I 3. 8 — 5. 1。 (4 )活性之抑制 可爲 ImM Cu2+，Hg 2 +及 5 0 m Μ T r i s 一 H C P緩衝溶液抑制。 (5 )來源 由微生物產製之酵素。 衍自不同微生物之許多酵素說明於下： 衍自Pimelobacter種R 4 8之麥芽糖/海藻糖轉化酶 (1 )作用 可轉化麥芽糖成海藻糖，以及轉化海藻糖成麥芽糖。 自1莫耳麥芽糖或海藻糖可分別形成約1莫耳海藻糖或麥 芽糖。 (2 )分子量 在SDS_凝膠電泳上爲約5 7，0 00_ 6 7，0 0 0道耳吞。 (3 )等電點 在 Ampholine 電泳上約 pI4. 1 — 5. 1。 (4 )活性之抑制 可爲 ImM Cu2+，Hg2 +及 50mM Tr i s 一 H C p緩衝溶液所抑制。 (5 )最適合溫度 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) SR寫太 訂
-12 - 493001 A7 B7 五、發明説明（1()) 當在ρΗ7· 〇下反應約60分鐘時約20°C。
(6)最適合pH
(請先閱讀背面之注意事項J 當在2 5°C下反應約6 0分鐘時約pH7. 0 — 8.0° (7 )熱穩定性 當在ρΗ7· 0下培育60分鐘時，可穩定達約 3 0 〇C。 (8 ) P Η穩定性 當在20 °C下培育60分鐘時，約pH 6_ 〇 — 9.0° 衍自惡臭假„里胞菌1^ 2 6 2之麥芽糖/沲蘊_|11^ (1 )作用 可轉化麥芽糖成海藻糖，以及轉化海藻糖成麥芽糖 可自1莫耳麥芽糖或海藻糖中分別形成約1莫耳海藻 糖 麥芽糖。 (2 )分子量 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在SDS —凝膠電泳上爲約1 ，〇〇〇〜 120，000道耳吞。 (3 )等電點 在Ampholine電泳上爲約p I 4 . 1 — 5 . 1 (4 )活性之抑制 可爲 ImM Cu2+，Hg 2 +及 5 0 m Μ τ 1 r i s 一 H C p緩衝溶液所抑制。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 13 493001 A7 ____ B7_ 五、發明説明（u) (5) 最適合溫度 當其在pH7_ 0下反應6 0分鐘時約3 7°C。
(6) 最適宜pH 當其在6 0°C下反應6〇分鐘時約pH7. 3 — 8 · 3 〇 (7 )熱穩定性 當在PH7. 0下培育60分鐘時可穩定達約40ΐ 〇 (8 ) ρ Η穩定性 當在35 °C下培育60分鐘時約ρΗ6. 0 — 9. 5 〇 衍..自水生棲塾_氤ATCC 33923之麥芽 轉化酶 (1 )作用 可轉化麥芽糖成海藻糖，以及轉化海藻糖成麥芽糖。 可自1莫耳麥芽糖或海藻糖中分別形成約i莫耳海藻糖或 麥芽糖。 (2 )分子量 在SDS -凝膠電泳上爲約1〇〇，〇〇〇_ 110，000道耳吞。 (3 )等電點 在 Anphl ine電泳上約 ρ I 3 . 8 — 4 . 8。 (4 )活性之抑制 (請先閱讀背面之注意事項
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493001 A7 B7 五、發明説明（12) 可爲 ImM Cu2+，Hg2 +及 50mM T r i s 一 H C 緩衝溶液所抑制。 (5 )最適宜溫度 當其在PH7. 0下反應6 0分鐘時爲約6 5°C。 (6 )最適合p Η 當其在3 5°C下反應6 0分鐘時爲約ρΗ6 . 0 — 6.7。 (7 )熱穩定性 當在ΡΗ7. 0下培育6 0分鐘時可穩定達約80°C 〇 (8 ) p U穩定性 當在60 °C下培育60分鐘時約PH5. 5 — 9. 5 (請先閲讀背面之注意事項
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 如下分析麥芽糖/海藻糖轉化酶：1毫升 2 〇w/ v%麥芽糖充作受質於1 〇mM磷酸鹽緩衝溶液（p Η 7. 0)，此中加入1毫升酵素液體，令其在25 °C， 3 5°C或6 0°C下反應6 0分鐘，再於1 〇 〇°C下加熱 1 0分鐘以懸浮反應。反應液體以5 0 m Μ磷酸鹽緩衝溶 液（ΡΗ7. 5)正確稀釋11倍，再加入0· 4毫升有 0. 1毫升 1單位/毫升海藻糖溶液之稀釋液體，在 4 5 °C下培育1 2 0分鐘，再以葡萄糖氧化酶方法決定葡 萄糖水平。至於對照組，在1 0 0 °C下加熱1 0分鐘已鈍 化的酵素液體及海藻糖則如上類似地處理。以由上述測法
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15 - 493001 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（13) 決定之增加的葡萄糖含量來估計由麥芽糖/海藻糖轉化酶 所形成的海藻糖含量，且將1單位酵素定義爲1分鐘可形 成1微莫耳海藻糖之酵素量。 在此分析法中，對衍自Pimelobacter*的麥芽糖/海藻 糖轉化酶，其反應溫度定在2 5 °C ;衍自假單胞菌種的酵 素則定在3 5 °C ;衍自熱棲菌種的酵素則定在6 0 °C。 可應用於本發明的澱粉爲陸上澱粉，如玉米澱粉，米 澱粉及小麥澱粉及地裏澱粉，如馬鈴薯澱粉，甘薯澱粉及 樹薯澱粉。爲液化此種澱粉，通常將其懸浮於水中，較欲 求的是1 0%以上，更好約2 0 — 5 0%，加熱並接受機 械，酵素或酸液化作用。液化程度相當低，就D E而言特 別是低於1 5，較好低於1 0。在以酸液化的例子中，首 先使用氫氯酸，磷酸或草酸，再使甩碳酸鈣，氧化鈣或碳 酸鈉以中和至指定的P Η值。於以酵素液化的例子中，使 用α -澱粉酶尤其是耐熱的液化α -澱粉酶較佳。 本發明中用來自液化澱粉溶液中產製麥芽糖之Θ -澱 粉酶，可以傳統方式製備自植物，如甘薯，大豆及小麥麩 ，及培養枯草桿菌屬微生物。當然，可任意使用商品化之 酵素製劑。而可應用於本發明之澱粉脫支酶·爲可作用在具 低D Ε之液化澱粉者，通常是D Ε 1 5以下以水解其上之 分支。因此目的，可有益的使用傳統的支鏈澱粉酶及異澱 粉酶，以及商品化之酵素製劑。 酵素之用量可依反應條件（包括反應時間）而任意選 用。通常在以液化澱粉溶液爲受質下，Θ -澱粉酶之用量 (請先閲讀背面之注意事¾ 衣-- 寫本頁) 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -16 - 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（14 ) 爲約1 — 1 0 0單位/克固體，而澱粉脫支酶爲約1 — 2，000單位/克固體。 如此得到的麥芽糖，可有益地充作依據本發明之培養 中，海藻糖或含彼之醣之醣源。將麥芽糖納入營養培養基 中之時機可任意選擇，且只要海藻糖可形成可在培養之前 或之中加入。在以連續或半連續方式培養之例子中，於培 養中已有海藻糖形成之部份培養物可取出，再添加相同體 積有麥芽糖之新鮮營養培養基。此種培養可以已納有点-澱粉酶或石-澱粉酶及澱粉脫支酶之營養培養基任意地進 行。 生成的具有海藻糖之培養物接受傳統方式之過濾及離 心，以移去不溶物如細胞，以活性炭脫色，去離子化，及 Η -及OH -型離子交換器之純化及濃縮成糖漿產物。產 物可任意地乾燥成粉末。以一種以上方法進一步純化糖漿 產物可容易地獲得具可能最高純度之海藻糖，如，利用管 柱層析分級分離，如離子交換管柱層析，活性炭管柱層析 及矽膠管柱層析，利用有機溶劑分級沈澱如醇及丙酮，利 用具適當分離能力之膜分離，以酵母醱酵處理及鹼處理， 如此必要時移去或分解留下來的具還原性的醣。 在工業規模產製上則較有益使用強酸性陽離子交換器 上之離子交換管柱層析，如揭示於日本公開公告Ν 〇 s : 23，799/83 及 72，598/83，以移去摻雜 的醣也可增加主題海藻糖之含量。在此例中，吾等可任意 使用固定床方法，移動床方法及模擬的移動床方法。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇Χ：297公釐) ~： (請先閱讀背面之注意事
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-17 - 493001 A7 B7 五、發明説明（15) 如此得到的含海藻糖之醣，依據本發明可接受進一步 處理’特別是爲葡糖澱粉酶或α 一葡糖替酶降解以控制其 甜度及還原力’以及降低其粘性，或氫化成醇類以消除由 於留下之還原性醣之還原力。 尤其是當含海藻糖之醣依據本發明接受葡糖澱粉酶或 α -葡糖苷酶作用成爲海藻糖及葡萄糖混合溶液時，其可 再接受如上述之純化，如移去葡萄糖之離子交換管柱層析 ’而得富含海藻糖之流份。流份可純化及濃縮成糖漿產物 ’其可再濃縮成過飽和狀態並結晶成晶狀海藻糖水合物或 無水晶狀海藻糖。 爲產生晶狀海藻糖水合物，則將純度約6 0%以上， 濃度約6 5 — 9 0%的高海藻糖含量液體置於結晶器中， 逐漸冷卻至9 5 °C以下，若必要時在1 〇 - 9 0 °C，並有 0 1 - 2 0 %種晶之存在以得含有晶狀海藻糖水合物之 糖膏。在此例中，吾等可有益地採用連續結晶法，其中海 藻糖被結晶而同時在減壓下濃縮。自糖膏中生成晶狀海藻 糖水合物或含彼之醣混合物質之方法包括··傳統的晶體分 離法，成塊粉碎法，流化床製粒法及噴灑乾燥法。 晶體分離法適用於產生具高純度之晶狀海藻糖水合物 ，而糖膏常填加至籃式離心機中，在此可分離成晶狀海藻 糖水合物及母液，之後前-晶體以少量冷卻水噴灑以洗滌 。於噴灑乾燥法中，濃縮7 0 - 8 5%，結晶比率高達 2 0 - 6 0%的糖膏通常經組合有高壓泵之噴嘴噴灑，在 晶體粉末不會熔化之溫度下之熱空氣蒸汽內乾燥，如6 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 18 - (請先閲讀背面之注意事_
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（16 ) 一 1 0 0°C，再於熱空氣蒸汽中老化，溫度3 0 — 6 0°C 歷約1 - 2 0小時，如此容易得無或少-吸濕性之晶狀混 合固體粒子。在成塊粉碎方法中，濕度含量1 0 — 2 0% ，結晶比率高達1 〇 - 6 0%之糖膏，其粉碎通常是先令 其靜置約0. 1 - 3天至成爲團塊型之固體粒子，其再粉 碎並以切削或刮取方式乾燥，如此得無或少吸濕性之晶狀 混合固體粒子。 而爲產生無水晶狀海藻糖，晶狀海藻糖水合物以乾燥 轉化，且另外濕度少於1 0 %之經濃縮的高海藻糖含量液 體常置於結晶器內，並在5 0 — 1 6 0 °C下較好8 0 — 1 4 0 °C下攪拌，並有晶種存在以得糖膏，其再結晶及粉 碎，如在相當熱且乾燥條件下採成塊粉碎法，流化床製粒 法及噴灑乾燥法。 如此得到之本發明的海藻糖或含彼之醣，既不會變棕 及不悅味道也不會破壞其他物質，特別是具胺基物質如胺 基酸，寡肽及蛋白質與之混合或加工，此乃因爲醣還原性 減低十分穩定之故。再者其低的還原力及粘性，共同呈現 出高品質及緩和甜度。 再者依據本發明之海藻糖因爲可被海藻醣所降解，故 口服時可消化，吸收及以熱量被利用。在充作較不造成齲 齒甜味劑上其十分適合，因其難以爲齲齒病因微生物所醱 酵之故。再者其具有其他欲求之特性，如滲透性控制能力 ，形狀授給能力，光澤授給能力，保濕能力，粘性，預防 其他醣類結晶能力，減低之醱酵力及預防凝膠化澱粉退化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) β 訂 0, -19 - 493001 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（17) 之能力。 依據本發明之海藻糖，可有益地充作活體能量之補足 物’因其易代謝及利用而勿需畏懼毒性及副作用，此係當 在插管餵食或以輸液型式腸外使用而言。晶狀海藻糖水合 物可1B合粘合劑有益地充作錠劑之塗覆劑，粘合劑如支鏈 澱粉’羥乙基澱粉及聚乙烯吡咯啶酮，因海藻糖作用如穩 定的甜味劑。 而無水晶狀海藻糖可有益地充作含水物質之乾燥劑， 如食品’化粧品，藥物及其原料及中間物，以促進穩定且 高品質固體產物之產製，如散劑，顆粒劑及錠劑。 因此依據本發明之海藻糖或含彼之醣，可有益地充作 甜味劑，口味改善劑，品質改善劑，穩定劑，形狀授給劑 及乾燥劑，應用於各種組成物中如食品，煙草，香煙，飼 料，化粧品及醫藥品。 依據本發明之海藻糖或含彼之醣，二者均可完整使用 充作甜化之調味料。若必要時，可混合一種以上適量的甜 味劑及/或充填劑，如澱粉糖槳粉末，葡萄糖，麥芽糖， 蔗糖，異構化糖，蜂蜜•楓糖，異麥芽寡糖，半乳寡醣， 岩藻寡糖，乳蔗糖，山梨醇，麥芽糖醇，乳糖醇，二氫(查 耳酮，斯替維苷，α -葡糖基斯替維替，如鮑載有：（ rhebaudioside) ’甘草素，L —天冬胺醯基—[—苯丙 胺酸甲酯，糖精，甘胺酸，丙胺酸，糊精，澱粉及乳糖。 呈粉末或結晶形之海澡糖或含彼之醣，依據本@@胃 完整成形’或右必要時配合充填劑’賦形劑及粘合齊彳使成 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' --：- (請先閲讀背面之注意事_
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493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（18 ) 欲求形狀，如顆粒，球狀，棒狀，板狀，小方塊及片錠。 海藻糖或含彼之醣，依據本發明可有益地用於甜化及 /或改善食品之口味及品質，因其可與具其他口味型式之 各樣物質極佳的調和，如酸性，鹼性，收歛性，鮮美及苦 味。 如，其可有益地用於各樣調味品中，如胺基酸，肽， 醬油，醬油粉末，味噌，味噌粉末，’moronic〃，’ hisho" ， ’furikake〃，蛋黃醬，調味汁，食用醋，A sanbaiz〆，、sushiA 用的醋粉，、chuka-no-moto^ ， 、tentsuyu〃 ，、mentsuyu〃，醬料，果醬，Ayakiniku -no-tare〃，咖喱粉，燉料，湯原汁，、dashi-no-moto "，核酸調味料，混合調味料，Amirin" ， 、shin-m i r i η 〃，食糖及咖啡用糖。 再者其可用益地用於甜化及/或改善各種日本式點心 之口味及品質，如' senbeiA ，'arare〃’ 'okoshi" ，Aame’ ， ，manju’ ，、uiro〃 ，豆糊，'y〇kanA ， 'mizuyokan’ ， 、k i ngyoku’ ，果醬，caste 1 1 a及、 amedama";西式點心如甜捲麵包，餅干，脆硬餅干，小 甜餅，派，布丁，奶油，奶油泡芙，威化餅，海棉蛋糕， 甜甜圈，巧克力，口香糖，牛奶糖及糖果；冷凍點心，如 冰淇淋及冰凍果子露；糖漿如蜜餞及、kori-mitsu〃 ；糊 如麵糊，花生糊，水果糊及塗料；加工的水果及蔬菜如果 醬，橘子醬，淹漬之水果及蔬菜及、toka〃 ；醃漬物及醃 漬產物如 fukuzin*~zuke Abettara-zuke〃，〜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' ": -21 - (請先閲讀背面之注意事
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493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（19 ) senmai -zukeA ，及、rakkyo-zuke 〃：醃漬產物原汁， 如 takuan—zuke—no—moto ，及 hakusai-zuke-no- mot〇A ;肉製品如火腿及臘腸；魚肉製品如魚肉火腿，魚 肉香腸；、kamaboko〃 ，'chikuwa，，及、、tenpura，； 佐料如、uni-n〇-shiokara" ，Mka-no-shioara"，、、 su- konbu ， saki-surume^ 及 fagu-no-mirin-b o s h i , tsukudan i 如海早，免 sansaiA ， ^ s u r u in 6 "，小魚及甲殼類；每天餐點如、nimame〃，馬鈴薯沙拉 及’ konbu-maki〃 ；乳製品如優酪及乳酪；罐裝及瓶裝 產品，如魚肉，肉類，水果及蔬菜；酒精飮品如清酒，合 成清酒，酒精飮料及西式酒精飮料；清涼飮料如咖啡，茶 ，可可，果汁，碳酸飮料，乳酸飮料及含乳酸菌之飮料； 方便的食品如布丁混合粉，熱蛋糕混合— shiruko 〃及方便的湯；及其他型式的食品如嬰兒食品， 加工食品，瓶漿飲料，肽食品，冷卻食品及乾燥食品。 再者其可有益地用於改善飼料口味品質，如供家畜， 家禽’蜜蜂，蠶及魚所用之飼料。其也可有益地應用於呈 固體，糊狀或液體型式之各種組成物中，如煙草，香煙， 化粧品及醫藥品中，包括牙膏，唇膏，口紅，內服藥，錠 劑，藥片，魚肝油球，口服清新劑及嗽口藥。 充作品質改善或穩定劑用途的包括應用於各種生物活 性物質及健康食品及含彼之藥物者，而其有效組份及活性 係易被鈍化的。此種生物活性物質之實例有淋巴激素，如 α —干抗素，Θ -干抗素，y -干抗素，α 一腫瘤壞死因 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） '： (請先閱讀背面之注意事項 -- 寫本頁) 訂
493001 附件2a第84107521號專利申請案A? 中文說明書修正頁民國87年1月修匿 五、發明説明（20) 斗 子，一腫瘤壞死因子，巨噬細胞轉移抑制因子，集落刺 激因子，轉移因子及間白素2 ;激素如胰島素，生長激素 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，泌乳激素，促紅血球生成素及濾泡刺激激素；生物製劑 如BCG疫苗，日本腦炎病毒疫苗，麻疹疫苗，脊髓灰質 炎，疫苗，天花疫苗，破傷風類毒素，Trimeresurus抗毒 素及人類免疫球蛋白；抗生素如青黴素，紅黴素，氯黴素 ，四環素，鏈霉素及硫酸康黴素；維生素如硫胺素，核黃 素，L 一抗壞血酸，鰭魚肝炎，類胡蘿蔔素，麥角固醇及 生育醇；酵素如脂酶，酯酶，尿激酶，蛋白酶，-澱粉 酶，異澱粉酶，葡聚糖酶及乳酸酶；萃取物如人參，鳥龜 ，綠藻，aroe及propolis，活的微生物如活病毒，乳酸菌 及酵母，及其他生物活性物質型式包括蜂王乳。因此吾等 可容易地產生穩定及高品質健康食品及藥物，呈被體，糊 狀或固體型式，而不致喪失其活性或有效組份。 爲將海藻糖或含彼之醣納入此種組成物中，可以傳統 方法納入，如在完全其加工前可採混合，溶解，熔化，浸 泡，滲透，塗佈，施加，塗覆，噴灑，注射，結晶及固化 。納入的量通常在0 . 1 %以上，較好是1 %以上。參照 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 許多實驗本發明可更具體地說明。 首先說明的是來自新穎微生物Pime 1 obacter R 4 8, 惡臭假單胞菌(Pseudomonas put ida) Η 2 6 2及水生棲 熱菌(T h e r m u s aquaticus, ATCC 33923)之麥 芽糖/海藻糖轉化酶，之後是來自已知微生物者。 Pimelobaoter R 4 8與惡臭假單胞菌H2 62於1 9 9 4年 7月2 8日寄存於食品工業發展硏究所其寄存編號分別爲 CCRC 9 1 0006&CCRC 910007。 23 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐）_ 493001 A7 B7 五、發明説明（21 ) 實驗1 酵素之產製_ 1 份1 0 0毫升的液體培養基含有： 2 . 0 w / V % 葡萄糖 ，0 • 5w/v%多蛋白腺，〇· 1 w / V %酵母 浸膏， 0 . lw/v%磷酸氫二鉀，〇. 0 6 w / V %隣 (請先閲讀背面之注意事 酸二氫鈉，0 05W/V%硫酸鎂七水合物，0· 5w /v%碳酸鈣及水，分佈於5 8 0毫升燒瓶中，在 1 1 5°C下壓熱滅菌30分鐘，冷卻，接種以 Pimelobacter種 R48 (FERM BP—4315)貯 液，並以2 7 °C及2 0 0 r p m在震盪條件下培養2 4小 時以得種子培養物。 訂
如上述約2 0升相同培養基之新鮮製劑置3 0升醱酵 槽中，加熱滅菌，冷卻至27°C，以1 v/v%種子培養 物接種，再於需氣及攪動條件，同時保留在2 7 °C，pH 6 . 0 — 8 . 0下培養約4 0小時。 培養物中麥芽糖/海藻糖轉化酶活性爲約0 . 5 5單 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 位/毫升。取出部份培養物，離心分出細胞及上清液，且 細胞再懸浮於50mM磷酸緩衝溶液（pH7. 0)中以 生成和取樣培養物相同體積，之後於細胞懸液及上清液中 決定酵素活性，顯示在細胞懸浮液中之酵素活性爲約 〇 5單位/毫升，而上清液中爲約〇. 05單位/毫升 。酵素活性在2 5 °C下決定。 實驗2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -24 - 493001 A7 __B7__ 五、發明説明（22 ) 酵素的純化 於實驗1中所得的培養物離心分離以收集細胞，淨重 約〇. 5公斤，其再懸浮於10mM磷酸鹽緩衝溶液中（ PH7. 0)。約5升的細胞懸液接受'VIBROGEN ZELLMUHLE 〃（一種購自Edmund Buhler之細胞瓦解器）以 瓦解細胞，且生成物在15，OOOrpm下離心30分 鐘以得到約4 . 5升上清液。上清液中加入硫酸銨使飽和 度達〇. 3，令其在4 °C下靜置4小時再離心，再回收上 清液。
上清液中再加硫酸銨使達飽和度0. 8，令其在4 °C 下靜置一夜並離心以回收沈積物。 沈積物溶於10mM磷酸鹽緩衝溶液中（pH7. 0 )以相同緩衝溶液之新鮮製劑透析2 4小時，離心以移去 不溶物質。經透析的溶液，約400毫升，分成二份再分 別填加至3 0 0毫升’ DEAE T0Y0PEARL"之離子交換管柱 層析中。 已吸附在>DEAE T0Y0PEARL 〃之本發明的麥芽糖/海 藻糖轉化酶，以相同緩衝溶液之新鮮製劑但另外含有氯化 鈉且其中溶離。如此得到的具酵素活性的流份，以相同緩 衝溶液但額外含有1 Μ硫酸銨之新鮮製劑透析，並離心以 移去不溶物質，之後所得的上清液接受3 0 0毫升〜 BUTYL T0Y0PEARL 6 5 0 "之疏水性管柱層析。已吸附在管 柱上之麥芽糖/海藻糖轉化酶，利用由1 Μ降至〇 Μ硫酸 銨之直線梯度自其中溶離，再回收具酵素活性之流份。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） " '~： -25 - (請先閱讀背面之注意事項
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493001 A7 _____B7 五、發明説明（23) 流份再填加至1 0毫升’ MONO Q HR5/5"(購自 Pharmacia LKB, Uppsala, Sweden)離子交換管柱，並回 收具酵素活性之流份。各別純化階段之酵素活性，比活性 及產率示於表1中。 表1 純化階段 酵素活性 比活性 產率 (單化）（單位/毫克pT) (%) (請先閲讀背面之注意事項'
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 瓦解培養物之上清液 7,310 0. 13 100 以硫酸銨鹽析及透析 後之液體 2,730 0.16 37.3 離子交換管柱層析 之溶離液 2, 290 0. 68 31.3 疏水性管柱層析 之溶離液 1,160 5. 4 15. 9 離子交換管柱層析 之溶離液 819 16. 8 11.2 訂
在凝膠濃度7. 5w/v%之聚丙烯醯胺凝膠竃泳上 檢查純化酵素之純度，由單一的蛋白質帶證實其係均質的 且有高純度。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 26 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493001 A7 B7 __ 五、發明説明（24 ) 實驗3 酵素特件 以實驗2方法所得的經純化的麥芽糖/海藻糖轉化酶 ，接受S D S聚丙烯醯胺凝膠電泳（凝膠濃度1 〇w/v %)，並與在相同凝膠上電泳的分子量標幟（購自Japan Bio-Rad Laboratories，日本東京）比較而決定分子量， 顯示酵素的分子量爲約57，000 — 67，000道耳 吞。 經純化的麥芽糖/海藻糖轉化酶在聚丙烯醯胺凝膠上 電泳，利用 2 w / v % Ampholine (購自 Pharma cia LKB，Uppsala，瑞典），並決定蛋白質帶及凝膠之pH水 平，顯示酵素的等電點爲約P14.1—5.1。 依據分析方法檢視溫度及P Η值對酵素活性之作用。 結果示於圖1爲溫度之效應，且圖2爲ρ Η之效應。當在 Ρ Η 7 . 0下反應6 0分鐘時，酵素之最佳溫度爲約 2 0°C，而當在2 5°C下反應6 0分鐘時，最佳pH值約 7· 0—8. 0。酵素熱穩定性之決定係將酵素培育於不 同溫度下之5 0mM磷酸鹽緩衝溶液中（PH7. 〇)歷 6 0分鐘，以水冷卻並分析殘留的活性。而ρ η穩定性之 決定’則是在有不同pH水平之5 OmM磷酸鹽緩衝溶液 中以2 0°C培育6 0分鐘，調至ρΗ7· 0再分析殘留的 酵素活性。個別結果示於圖3是熱穩定性，且圖4是ρ Η 穩定性。熱穩定性可高達約3 0 °C，而ρ Η穩定性約ρ Η 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）一 '~： " -27 - (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 寫本
493001 A7 B7 五、發明説明（25 ) 6. 0 — 9. 0。酵素活性可爲 ImM Cu2+，Hg2 + 及5 0 m Μ T r i s - H C $緩衝溶液抑制。 實驗4 #各種醣上之作用 測試各種醣充作受質之可行性。所提出的有葡萄糖， 麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖，麥 芽七糖，可溶性澱粉，平均聚合度1 8之直鏈澱粉，海藻 糖，新海藻糖，龍膽二糖，麴二糖，異麥芽糖，纖維二糖 ，麥芽糖醇，蔗糖，fflaltulose，松二糖，palatinose， trehalulose或乳糖及含有葡萄糖加上等量α —葡萄糖， 1 一磷酸或/3 -葡萄糖1 一磷酸之溶液。 各溶液中加入2單位/克受質固體的由實驗2方法所 得之經純化的麥芽糖/海藻糖轉化酶，調整使個別受質濃 度爲5w/v%，並在20°C，pH7. 0下反應24小 時。反應前及後溶液接受’KIESELGEL 60〃之薄層層析（ TLC)(此爲一鋁板長寬分別爲20公分，購自Merck & Co.，Inc., New Jersey, USA)以檢查個別醣上之酵素 作用。T L C在環境溫度下以1 — 丁醇，吡啶及水（6 : 4 =/按體積計）之溶劑混合物展開。顯色之進行係先噴 灑2 0%硫酸/甲醇溶液，再於1 1 〇°C下加熱1 〇分鐘 。結果示於表2。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項'
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -28 - 493001 A7 B7 五、發明説明（26 ) 表2 受質 酵素作用 葡萄糖 麥芽糖 + + 麥芽三糖 麥芽四糖 (請先閱讀背面之注意事¾
訂 麥芽五糖 麥芽六糖 麥芽七糖
經 濟 部 中 央 標 準 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 可溶性澱粉 平均聚合度18之直鏈澱粉 海藻糖 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 29 - 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（27 ) 表2 (續） 受質 酵素作用 新海藻糖 - 龍膽二糖 - 麹二糖 - 異麥芽糖 - 纖維二糖 - 麥芽糖醇 - 蔗糖 - Maltulose - 松二糖 - Palatinose - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ^ (請先閲讀背面之注意事項 -- 寫本頁)
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493001 Α7 _Β7 五、發明説明（28 ) 表2 (續） 受質 酵素作用
Trehalulose 乳糖 (請先閲讀背面之注意事
α -葡萄1-磷酸+葡萄糖
訂 註：符號〜-〃表示在反應前後無可觀察之變化；A +夕 受質點顯著減少且可測及反應產物；且> + + 〃爲受 質點實質地減少並測及反應產物。 由表2結果證知，在各種受測醣之中，依據本發明的 酵素僅作用在麥芽糖及海藻糖，但未作用在其他的醣，特 別是含葡萄糖及α-葡萄糖1一磷酸或葡萄糖1一磷 酸之系統，證明此酵素是新穎的，且異於傳統的麥芽糖磷 化酶及海藻糖磷酸化酶。 實驗 來麥芽糖/海蓬糠之產物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -31 - 493001 A7 B7 五、發明説明（29 )
終濃度5%之麥芽糖水溶液，加入2單位/克受質固 體之以實驗2方法所得之經純化的麥芽糖/海藻糖轉化酶 ，並在20°C及pH7_ 0下反應24小時。酵素反應液 體之醣組成在氣相層析（GL C)上分析。部份的酵素反 應液體乾燥固化之，溶於吡啶再三甲基矽烷基化後再行分 析。GLC裝置所使用的是>GC 16A〃 ，此購自 Shimazdu Crop·，Kyoto，日本，其中裝配有不銹鋼管柱 ，內徑爲3毫米長2米，充填有’ 2% SILICONE 〇ν~ΐγ/ CHR0M0 SORB ，此購自 GL Sciences, Tokyo，日本， 其內注入氮氣以充作載劑，流速爲4 0毫升/分，同時提 高管柱內部溫度由160 ΐ至320 °C，速率爲7. 5 °C /分。所使用之偵測器爲氫焰離子化偵測器。結果示於表 3中。 表3 (請先閲讀背面之注意事項寫本頁)
訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 反應產物中之醣 GLC上滯留時間 醣組成（％) 葡萄糖 3. 8>及 4. 70 4. 9 麥芽糖 11· 9及 12. 27 22.3 反應產物X 12.34" 72. 8 註：> * "符號表示滯留時間和海藻糖的相同。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210Χ297公釐）
493001 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（30 ) 由表3證知，發現可形成大量的反應產物〃 ，其 和商品化之海藻糖有相同的滯留時間。爲鑑定反應產物〜 X"，進行以下的證實試驗。充作受質之得自麥芽糖的部 份酵素反應產物稀釋使醣濃度爲2%於2 OmM醋酸鹽緩 衝溶液中（PH4. 5)，再取0. 5毫升生成物，加上 0 · 1單位葡糖澱粉酶（購自Seikagaku Crop.，Tokyo, Japan )，並在40 °C下反應20小時。 稀釋另一部份的酵素反應產物，使醣濃度爲2%於 20mM磷酸鹽緩衝溶液中（pH7. 0)，且0. 5毫 升生成物中加入0. 5單位的海藻糖，並在4 0 °C下反應 2 0小時。充作受質之來自麥芽糖之酵素反應產物及其葡 糖澱粉酶-或經海藻糖處理之產物在G L C上分析並互相 比較，證實麥芽糖爲葡糖澱粉酶完全降解成葡萄糖，而反 應產物〃並未降解並保持完整。 再者經海藻酶處理後，麥芽糖保持完整而反應產物〜 X"則完全降解成葡萄糖。考量葡糖澱粉酶及海藻糖之反 應特異性，則由本發明新穎的酵素自麥芽糖所形成之寡醣 證實是海藻糖。 又進一步的，充作受質之海藻糖接受如麥芽糖例中相 同條件下之純化的酵素作用，且反應液體在G L C上類似 地分析，證實依據本發明之酵素可自海藻糖形成麥芽糖。 上述G L C分析結果示於表4中。 由表4之結果證知，依據本發明之酵素可轉化麥芽糖 (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 衣· 寫本
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2ΐ〇χ297公釐） -33 - 493001 A7 B7五、發明説明（31 ) 成爲海藻糖，以及轉化海藻糖成麥芽糖。頃發現平衡點傾 向於海藻糖側，且因此由麥芽糖至海藻糖之轉化率較高， 特別是約70%以上。 表4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 受質 反應產物中之醣 A B C 葡萄糖 4. 9 27. 9 78. 5 麥芽糖 麥芽糖 22. 3 0. 0 21.5 海藻糖 72. 8 72. 1 0.0 葡萄糖 3. 2 10. 9 83.3 海藻糖 麥芽糖 17.2 0. 0 16. 7 海藻糖 79.6 80.1 0. 0 註：符號表示經本發明酵素作用之反應產物中之醣 組成（％ ) ; > B "表示經葡糖澱粉酶處理後之醣組 成（％);且>〇"爲經海藻糖處理後之醣組成（％ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項
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-34 - 493001 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（32) 眚驗6 麥芽糖濃度對海藻糖形成之影響 濃度爲2. 5%，5%，10%，20%或4〇%之 麥芽糖溶液，以每克麥芽糖固體加入2單位以實驗2方法 所得之經純化的麥芽糖/海藻糖轉化酵素，並在2 01¾ p Η 7 . 0下反應，且在反應中定期取樣，在l〇〇°c ^ 加熱1 0分鐘以鈍化酵素。 反應液體定量決定，對總糖利用Μ酮-硫酸方法，對 還原醣則利用S 〇 m 〇 g y i - N e 1 s ο η方法，且估計出還原醣對總 醣比率之還原力。 另外分開地，稀釋反應液體使個別的醣濃度爲約i % ，接受’MOLCUTII LGC"，一種購自日本東京Japan Mi 1 1 ipore Ltd之小型的超濾器，以移去蛋白質，再於高 性能液相層析（Η P L C )上分析醣組成。所使用之 HPLC 裝置爲、CCDD SYSTEM"，購自 Tosoh Cor ρ.， Tokyo，Japan，其並裝配有'YMC-DACK PA-03〃 ，內型 4. 6毫米長5 0毫米，及購自YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan之分析級管柱，其中注入之溶離劑爲乙腈及水（ 78:22按體積計）之混合物，流速1. 2毫升/分， 且以差示折射計進行偵測。結果示於表5。 由表5之結果證知，由麥芽糖至海藻糖之轉化可容易 地進行而和充作受質之麥芽糖濃度無關，所記錄之轉化率 爲約8 0 %。 (請先閲讀背面之注意事項'
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -35 — 493001
7 B 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（33 ) 表5 麥芽糖 反應時 還原力 醣組成（％) (%) 間（小時） (◦/〇) 葡萄糖 麥芽糖 海藻糖 0 50.3 0. 0 100.0 0. 0 2.5 2 36. 7 1. 3 68.8 2 9.9 8 21.2 2. 5 38. 7 58. 8 23 12.3 3. 8 17.2 79.0 48 14. 5 5.9 17. 1 7 9.5 5.0 2 34. 8 1.9 65.3 32.8 8 20. 2 2.6 35. 7 61.7 23 12. 0 3. 2 17.3 77. 0 48 14. 2 5. 7 17. 3 77. 0 10. 0 2 32.2 1. 3 63. 0 35. 7 8 19. 7 2.2 34. 2 63.6 23 12.5 3. 6 17. 5 78.9 48 14.0 6. 1 17.4 76. 5 (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 寫太 Γ
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36 - 493001 A7 B7 五、發明说明（34 ) 表5 (續） 麥芽糖 反應時 還原力 醣組成（％) (%) 間（小時） (%) 葡萄糖 麥芽糖 海藻糖 20.0 2 34. 0 2.0 63. 7 3 4.3 8 20.2 2. 9 35. 1 62. 0 23 12. 9 3. 4 17. 4 7 9.2 48 15.1 6. 0 17. 4 76.6 40.0 2 34. 8 1. 6 68. 2 3 0.2 8 21.2 2. 7 38. 6 58.7 23 12. 8 3.7 17. 7 78. 6 —— 48 14.9 5. 7 17. 5 76. 8 (請先閲讀背面之注意事項
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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實驗7 溫度對褒藻糖形成之影響 濃度各爲20%的麥芽糖溶液，調至ρΗ7· 0，且 每克麥芽糖固體加入2單位以實驗2方法所得之經純化的 麥芽糖/海藻糖轉化酶，並在5 °C，1 0 °C，1 5 °C， 2 0°C或2 5 °C下反應，且於反應中定期取出反應液體， 並在1 00°C下加熱1 0分鐘以鈍化酵素。在HPLC上 分析酵素反應液體中之醣組成，類似實驗6。個別反應溫 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -37 - 493001
7 B 五、發明説明（35 ) 度及時間下之海藻糖含量示於表6。 表6 反應時間 海藻糖含量（％ ) (小時） 5°C 10°c 15°C 2 0°C 25〇C 2 26. 1 28.9 32. 9 34. 6 3 4.7 8 49.5 54· 3 61.2 62. 0 61.1 23 78. 2 79.5 80. 9 79.2 76.7 48 81. 8 80. 9 80. 4 76. 6 72.7 (請先閱讀背面之注意事項 -- 寫本頁) 、τ Γ
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由表6結果證知，雖然海藻糖之形成率在較高溫度下 較容易，甚至在5 °C，自麥芽糖轉化成海藻糖可容易地進 行，所記之轉化率約8 2 %。 實驗8 启麥芽糖製備海蓬糖 10份按重計之麥芽糖（購自Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan，溶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -38 - 493001 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（36) 於40份按重計之水中’在15 °C及PH7. 0下加入2 單位/克麥芽糖固體，以實驗2方法所得的經純化的麥芽 糖/海藻糖轉化酶，反應4 8小時再於1 〇 〇。(：下加熱 1 0分鐘以鈍化酵素。生成的溶液含有約7 4%海藻糖（ (按乾重固體基礎計）。溶液再以活性炭脫色，去離子化 並以Η -及OH -型離子交換器純化，濃縮至約7 8%， 加入0 · 1 %晶狀海藻糖水合物爲種晶（按乾固體基礎計 )’並令其在環境溫度下靜置一夜以達成結晶作用。分出 所生成之糖膏且晶體噴以少量水以洗滌，如此可得約 3· 0份按重計之極純晶狀海藻糖水合物，99. 8%純 度。 實驗9 酵素之產製 每份10 0毫升的液體培養基，含有2. 0 w / V % 葡萄糖，1. Ow/ν%硫酸銨，〇. lw/v%磷酸氫 二鉀，0. 06w/v%磷酸二氫鈉，〇.〇5w/v% 硫酸鎂，0. 3w/v%硫酸鈣及水，分佈於500毫升 燒瓶中，在1 1 5°C下壓熱滅菌3 0分鐘，冷卻，接種以 惡臭假單胞菌（FERM BP - 4579)之貯存培養 物，並在2 7 °C及2 0 0 r pm之震盪條件下培養2 4小 時以得種子培養物。 約2 0升上述相同液體培養基之新鮮製劑置於3 0升 醱酵槽中，加熱滅菌，冷卻至2 7°C，再接種以1 v/v (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 衣 寫本
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -39 - 493001 Α7 Β7 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 五、發明説明（37) %種子培養物並以2 7 °C之需氣及攪動條件下培養2 0小 時，同時保持在27°C及pH6. 5 — 8. 0下。 培養物中麥芽糖/海藻糖轉化酶之活性約〇 . 1 2單 位/毫升。取出部份培養物，離心分離成細胞及上清液且 細胞再懸浮於5 OmM磷酸鹽緩衝溶液（PH7 . 0 )中 ’使有如取樣培養物之相同體積，再於細胞懸液及上清液 中決定酵素活性，顯示約0 . 1 1單位/毫升之酵素活性 可見於細胞懸液中，而約0 . 0 1單位/毫升於上清液中 。酵素活性是在3 5 t：下決定。 實驗1 0 酵素的純化 實驗9所得之培養物離心分離以收集細胞，得淨重約 〇 - 4 5公斤，其再懸浮於1 OmM磷酸鹽緩衝溶液中（ PH7. 0)。細胞懸液接受’MINILABO"，一種購自 Dainippon Pharmaceutical Co·, Ltd，日本東京之超高 壓細胞瓦解器，以打破細胞且生成物再於 1 5，0 0 0 r p m下離心3 0分可得到約1 . 7升上清 液。上清液中加入硫酸銨使達0 . 7飽和度，令其在4 °C 下靜置一夜再離心，再回收沈積物。 沈積物溶於1 OmM磷酸鹽緩衝溶液中（pH7. 0 )，以相同緩衝溶液之新鮮製劑透析2 4小時，離心移去 不溶物質，經透析的溶液約4 0 0毫升，分成二份再分別 填加至300毫升> DEAE TOY OPE ARL 〃上之離子交換管柱 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁)
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇Χ：297公釐） -40 - 493001 A7 B7 五、發明説明（38) 層析上。 已吸附至>DEAE TOYOPEARL 〃之本發明的麥芽糖/海 藻糖轉化酶，以相同緩衝溶液但另外有氯化鈉之新鮮製劑 自其中溶離。具酵素活性之流份再接受8 0毫升> DEAE TOYOPEARI/上之離子交換管柱層析。已吸附至管柱上之 麥芽糖/海藻糖轉化酵素以由Ο.1M增加至〇.3M氯 化鈉之直線梯度自其中溶離，再回收具酵素活性之流份。 流份填加至4 0 0毫升〜TOYOPEARL HW-55S〃之凝膠 過濾層析上，此購自Tosoh Corp., Tokyo, japan，且回 收具酵素活性之流份。在個階段中之酵素活性。比活性及 產率示於表7。 (請先閲讀背面之注意事-
訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 一 41 一 493001
B 五、發明説明（39 ) 表7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 純化步驟 酵素活性 (單位） 比活性 (單位/毫克pT) 產率 (¾) 打破培養物 之上清液 1,750 0. 04 100 以硫酸銨鹽 析及透析後 之液體 1,200 0. 07 6 8.5 第一離子交 換管柱層析 之溶離液 1,090 0. 53 62.3 第二離子交 換管柱層析 之溶離液 360 4. 5 20.6 凝膠過濾管 柱層析之 溶離液 156 6. 5 8. 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事 -- ^^寫本頁) 、v" Γ -42 - 493001 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（4()) 經純化的酵素在凝膠濃度7. 5w/v%之聚丙嫌醯 胺凝膠電泳上檢查純度，由單一的蛋白質帶可證實其係均 質的且具高純度。 實驗1 1 酵素的特件 以實驗1 0所得的經純化的麥芽糖/海藻糖轉化酶， 接受SDS -聚丙烯醯胺凝膠電泳（凝膠濃度7· 5 w / ν%)，並與由日本Bio-Rad Lab· Tokyo Japan出品之分 子量標誌比較以決定分子量，其則在相同凝膠上電泳，結 果顯示酵素的分子量是約1 1 〇，〇 〇 〇 — 120，000S道耳吞。 經純化的麥芽糖/海藻糖轉化酶在聚丙烯醯胺凝膠上 電泳，利用購自 Pharmacia LKB，Uppsala, Sweden的 2 w / ν % Ampholine，且決定蛋白質帶及凝膠之ρ η水平 ，結果顯示酵素之等電點爲約pi 4. 1 — 5. 1。 依據分析方法檢視溫度及ρ Η對酵素活性之效應。結 果τκ於圖5爲溫度之效應，圖6爲pH效應。酵素當在 ρΗ7· 0下反應6 0分鐘時酵素的最佳溫度約37〇c， 而當在3 5 °C下反應6 0分鐘時最佳pH值約7. 3- 8 . 3。酵素熱穩定性之決定係將酵素在$ 磷酸鹽 緩衝溶液（ρΗ7· 〇)中以不同溫度培育6 0分鐘，以 水冷卻再分析殘留的活性。而ρ Η穩定性之決定則在 (請先閲讀背面之注意事項
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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493001 A7 B7 五、發明説明（41 ) 3 5 °C的5 OmM磷酸鹽緩衝溶液中以不同PH水平培育 6 0分鐘，調至P Η 7 0再分析殘留的酵素活性。個別 結果示於圖7爲熱穩定性，及圖8爲ρ Η穩定性。熱穩定 性可高達約40°C，而pH穩定性約ρΗ6. 0 - 9. 5 。酵素活性可爲1 m M C u 2+，H g 2 +及5 0 m Μ T r i s - H C P緩衝溶液所抑制。 實驗1 2 在各樣醣上之作用 依據實驗4之方法測試各樣的醣充作於實驗1 〇所得 之自惡臭假單胞菌Η 2 6 2之純化酵素之受質的可行性， 除了反應溫度定在3 5 °C爲例外之外。結果，就如同來自 Pimelobacter種R 4 8之酵素，來自惡臭假單胞菌 H262之酵素僅作用在麥芽糖及海藻糖上，可轉化麥芽 糖成海藻糖以及海藻糖轉化成麥芽糖。頃發現平衡點傾向 海藻糖側，因此由麥芽糖至海藻糖的轉化率十分高，特別 是約7 0 %。 實驗1 3 麥芽糖濃度對海藻糖形成上之效應 濃度5%，10%，20%或30%的麥芽糖溶液加 入並與每克麥芽糖固體2單位由實驗10所得之純化的麥 芽糖/海藻糖轉化酶一起在35°C及pH7. 〇下反應， 反應中反應固體定期取樣，並在1 0 0°C下加熱1 〇分鐘 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2Κ)Χ297公釐) ' ~： -44 - (請先閲讀背面之注意事寫本頁) 衣· 寫太 訂 493001 A7 B7五、發明説明（42 ) 以鈍化酵素。 決定反應液體之還原力及醣組成，類似實驗6。其結 果示於表8中。 表8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 麥芽糖 反應時 還原力 醣組成（％) (%) 間（小時） (%) 葡萄糖 麥芽糖 海藻糖 0 50.3 0.0 100.0 0. 0 5. 0 2 43. 8 0. 8 88. 0 11.2 7 35. 0 0. 5 72. 7 2 6.8 24 17.2 0. 5 41. 8 57.7 48 10.3 1.8 29.7 68. 5 10. 0 2 46. 8 1. 2 86.5 12.3 7 34. 6 1.4 64. 9 33. 7 24 21.0 2.6 35.8 61.6 48 11.2 3. 9 27.0 69.1 20.0 2 44.9 0. 7 86. 6 12.7 7 32. 7 1. 2 66. 0 32.2 24 21.0 2. 6 35. 8 61.6 48 11.2 3. 9 27. 0 69.1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項
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-45 - 493001 Α7 Β7 五、發明説明（43 表8 (續） 麥芽糖 (%) 反應時 間（小時） 還原力 (%) 醣組成（％ ) 葡萄糖 麥芽糖 海藻糖 30.0 2 44.8 0.0 89. 5 10.5 7 38. 2 0. 6 72.5 26.9 24 17. 8 1. 8 41. 8 56. 4 48 12.9 3. 9 29. 6 66.5 (請先閱讀背面之注意事 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 由表8證知，由麥芽糖轉化成海藻糖可容易地進行， 和充作受質之麥芽糖濃度無關，使轉化率爲約7 0%。 實驗1 4 自麥芽糖製備海藻糖 1 0份按重計的麥牙糖’購自Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama Japan，溶 於40份按重計的水中，在3 5°C及pH7. 0下加入每 克麥芽糖固體2單位以實驗1〇方法所得之純化的麥芽糖 /海藻糖轉化酶，反應4 8小時，並在1 〇 〇°c下反應 1 0分鐘以鈍化酵素。生成溶液含有約6 9%海藻糖，以 乾固體基礎計。溶液以活性炭脫色，去離子化再以Η -及 〇Η-型離子交換器純化，濃縮至約78%，加0_ 1% 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） —46 — 493001 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（44) 晶狀'海藻糖水合物爲晶種（按乾固體基礎計），再置室溫 下一夜以達成結晶化作用。生成之糖膏分出，且晶體噴上 少量水以洗滌，如此可得約2 . 3份按重計之極純的晶狀 海藻糖水合物，純度爲99. 7%。 眚驗1 5 酵素之產製 1份10 0毫升的液體培養基含有0. 5w/v%多 蛋白陳’0_ lw/ν%酵母浸膏，〇. 〇7w/v%硝 酸銨，0 Olw/v%磷酸氫二鈉，〇. 〇2w/v% 硫酸鎂及水，調至pH7. 5，再分佈於500毫升燒瓶 •中，在120 °C下壓熱滅菌20分鐘，冷卻，接種水生棲 熱菌（ATCC 33923)之貯存培養物，在60 °C. 及2 0 0 r p m之震盪條件下培養2 4小時以得種子培養 物。 約2 0升如上相同液體培養基之新鮮製劑，置於二個 3 0升醱酵槽中，加熱滅菌，冷卻至6 0°C，再接種以1 v/v%種子培養物，並在6 0之需氣及攪動條件下培養 約24小時，同時保持在60°C及pH6. 5 — 8. 0下 〇 培養物中之麥芽糖/海藻糖轉化酶活性爲約0. 35 單位/毫升。取出部份培養物，並離心分離成細胞及上清 液，且細胞懸浮於50mM磷酸鹽緩衝溶液（pH7. 0 )中以生成和所取樣培養物相同的體積，並決定細胞懸液 (請先閱讀背面之注意事_
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -47 - 493001 A7 B7 五、發明説明（45) 及上清液中之酵素活性，結果顯示在細胞懸液中有約 0. 33單位/毫升酵素活性，在上清液中爲約0. 02 單位/毫升。酵素活性在6 0 °C下決定。 實驗1 ft 酵素之純化 實驗1 5所得之培養物離心分離以收集細胞，淨重約 0. 2 8公斤，其再懸浮於10mM磷酸鹽緩衝溶液（ PH7. 0)中。細胞懸液約1. 9升，接受、MODEL US3 0 0 ""，一種購自 Nippon Seiki Co·，Ltd·, Niigata, Japan之超音波細胞瓦解器，以打破細胞且生成物在 15，000rpm下離心30分鐘，得約1. 8升的上
清液。上清液加入硫酸銨便達0 . 7飽和度，令其在4 °C 下靜置一夜並離心，再回收沈積物。 沈積物溶於10mM磷酸鹽緩衝溶液（pH7. 0) ，以相同緩衝溶液之新鮮製劑透析2 4小時，再離心移去 不溶物質。約1 ，5 6 0毫升的經透析溶液，分成三份， 再分別填加至5 3 0毫升’DEAE T0Y0PEARL 6 5 0 〃之離子 交換管柱層析上。 已吸附在’DEAE T0Y0PEARL"之本發明的麥芽糖/海 藻糖轉化酶，以相同緩衝溶液但含氯化鈉之新鮮製劑自其 中溶離。回收如此得到之酵素活性流份，以相同緩衝溶液 但另外含1M硫酸銨的新鮮製劑透析，接受3 8 0毫升、 BUTYL T0Y0PEARL 6 5 0 〃之疏水管柱層析。已吸附在管柱 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'乂297公釐) " '~： -48 - (請先閱讀背面之注意事
訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493001 A7 B7 五、發明説明（46) 上之麥芽糖/海藻糖轉化酶，以由1 Μ降低至0M硫酸銨 之直線梯度溶離，再回收具酵素活性之流份。 流份填加至3 8 0毫升> T0Y0PEARL HW-55S〃之凝膠 過濾層析上，再回收具酵素活性之流份。 之後，流份接受1. 0毫升’ MONO Q HR5/5"之離子 交換層析’此管柱購自Pharmacia LKB，llppsaU，
Sweden，並以由0_ 1M增加至〇. 3 5M氯化鈉之直線 梯度溶離，再回收具酵素活性之流份。在個別純化階段中 之酵素活性，比活性及產率示於表9中。 以凝膠濃度5 w/v %之聚丙烯醯胺凝膠電泳檢查純 化酵素之純度後，其生成單一的蛋白質帶，由此證實其係 均質的且具高純度。 (請先閲讀背面之注意事寫本頁) 寫太
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 49 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 、發明説明（47) 表9 純化階段 酵素活性 比活性 產率 (單位） (單位/毫升ρΤ) (◦/〇) 經瓦解組織之 上清液 8, 800 0.10 100 以硫酸銨鹽析 及透析後之液體 8,710 0.16 99.0 離子交換管柱層 析之溶離液 5,690 2.5 64.7 疏水性管柱層析 之溶離液 2. 050 17.6 23.3 凝膠過濾管柱層 析之溶離液 937 113 10.6 離子交換管柱層 析之溶離液 467 135 5.3 (請先閱讀背面之注意事
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0X297公釐） -50 - 493001 A7 B7 五、發明説明（48) 實驗1 7 酵素夕特性 以實驗1 6方法所得之純化的麥芽糖/海藻糖轉化酶 ，接受SDS —聚丙烯醯胺凝膠電泳，凝膠濃度7. 5 w /v%，再與由 Japan Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan出品之分子量標幟比較而決定其分子量，其也在相 同凝膠上電泳，結果顯示酵素之分子量約100，000 —110，000道耳吞。 經純化的麥芽糖/海藻糖轉化酶在聚丙烯醯胺凝上凝 膠上電泳，利用購自Pharmacia LKB, Uppsala之2 w/v % Amphol ine，且決定蛋白質帶及凝膠之p Η水平，結 果顯示酵素的等電點爲約Ρ 13. 8 — 4. 8。 依據分析方法檢視溫度及ρ Η值對酵素活性之效應。 結果示於圖9爲溫度效應，圖10爲pH效應。酵素當在 Ρ Η 7 . 0下反應60分鐘時其最佳溫度爲約65 °C，而 當在6 0 °C下反應6 0分鐘時最佳pH值爲約6. 0 — 6· 7。酵素熱穩定性之決定係將其在5OmM磷酸鹽緩 衝溶液（ρ Η 7 . 0 )中以不同溫度培育6 0分鐘，以水 冷卻再分析殘留的活性。而ρ Η穩定性之決定係在6 0 °C 下於5 OmM磷酸鹽緩衝溶液但不同PH水平下培育6 0 分鐘，調至ρ Η 7 . 0再分析殘留的酵素活性。個別結果 示於圖1 1中爲熱穩定性，而圖1 2爲ρ Η值穩定性。熱 穩定性高達約80°C，而pH穩定性約ρΗ5_ 5 -9· 〇。酵素活性可爲ImM Cu2+，Hg2 +及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐) ''~： ~ -51 - (請先閱讀背面之注意事
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493001 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（49) 5 0 m Μ T r i s - H C j?緩衝溶液所抑制。 實驗1 8 &各樣醣上之作用 依據實驗4之方法測試各樣的醣充作於實驗1 6所得 之自水生棲熱菌（ATCC 3 3923)之純化酵素之 受質的可行性，除了反應溫度爲5 0 °C是例外。結果，類 似得自Pimelobacter種R4 8及惡臭假單胞菌H2 6 2之 酵素，得自水生棲熱菌（ATCC 3 3923)之酵素 僅作用在麥芽糖及海藻糖上，以轉化麥芽糖成海藻糖，以 及海藻糖轉化成麥芽糖。頃發現平衡點傾向海藻糖側，且 因此由麥芽糖至海藻糖之轉化比率很高，特別是7 0%以 上。 實驗1 9 麥芽糖濃度在海藻糖形成h之效應 濃度 2. 5%，5%，10%，20 %或 40% 的麥 芽糖溶液，加入每克麥芽糖固體2單位的由實驗1 6方法 所得之純化的麥芽糖/海藻糖轉化酶，並在6 0°C及p Η 6 · 5下反應，經7 2小時之時間後採樣，再於1 0 0 °C 下加熱3 0分以鈍化酵素。類似實驗6所述分析反應液體 之還原力及醣組成。結果示於表1 〇中。 (請先閲讀背面之注意事項_
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇'〆297公釐） - 52 - 493001 A7 B7 五、發明説明（5〇) 表1 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 麥芽糖 (%) 反應時 間（小時） 還原力 (%) 醣組成（％) 葡萄糖 麥芽糖 海藻糖 0 50.4 0.0 100. 0 0. 0 2.9 72 16. 3 4. 5 25.2 70. 3 5.0 72 15.9 4. 4 25. 6 7 0.0 10.0 72 16. 0 4.7 25. 6 69.7 20.0 72 16.6 4.4 26.2 69.4 40.0 72 16.8 5. 0 26.4 68.6 由表1 0結果證實，麥芽糖至海藻糖之轉化可容易地 進行，和充作受質之麥芽糖濃度無關，使轉化率約7 0% (請先閲讀背面之注意事寫本頁) 裝· 寫太 、11 實驗2 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -53 - 493001 A7 _B7__ 五、發明説明（51 ) 溫度對海藻糖形成上之效應
濃度各2 0%的麥芽糖溶液，以每克麥芽糖固體加入 2. 5單位以實驗16方法所得之水生棲熱菌（ATCC 3 3 9 2 3 )之純化的麥芽糖/海藻糖轉化酶，並在 40°C，50°C，60°C或70°C下反應，反應中反應液 體定期取樣並在1 0 0°C下加熱3 0分鐘以鈍化酵素。酵 素反應液體在Η P L C上如實驗6般分析醣組成。個別反 應溫度及時間下之海藻糖含量示於表1 1中。 表1 1 (請先閲讀背面之注意事 —£ 裝-- :寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 反應時間 海藻糖含量（％) (小時） 4 0°C 5 0°C 6 0°C 7 0°C 4 45.0 55.7 56. 8 50. 3 8 61.0 67. 3 64. 3 5 8.5 24 79. 1 76. 5 71. 1 6 4.3 48 80. 7 76.9 70.2 62.8 72 80.0 76.4 68. 5 60.2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 訂
一 54 - 493001 A7 ___B7五、發明説明（52 ) 由表6結果證知，雖然形成海藻糖在較低溫度（ 4 0°C)下較容易，而由麥芽糖至海藻糖之轉化可容易地 進行，轉率爲約80%。 實驗2 1 自其他微生物中麥芽糖/海蓬糠轉化酵素之產製及特件 (請先閲讀背面之注意事Ϊ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在傳統的微生物中，已證實可產生依據本發明的麥芽 糖/海藻糖轉化酶之特異微生物，依據實驗1 5之方法培 養在燒瓶中歷4 8小時。檢查各培養物之酵素活性，再依 據實驗1 6之方法接受細胞瓦解器，並透析上清液以得部 份純化的酵素，其再依實驗1 7之方法檢視特性。結果示 於表1 2。 將由熱棲菌傳統微生物中所衍生之部份純化之酵素， 依實驗1 8方法進行在各樣醣上作用之分析後，頃發現和 衍自水生棲熱菌（ATCC 33923)之酵素一樣的 ’其僅作用在麥芽糖及海藻糖上，由麥芽糖形成海藻糖及 由海藻糖形成麥芽糖。
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -55 - 493001 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（53 ) 表1 2 微生物 活性 (單位/毫升: 最佳溫度 ) 最佳pH 熱穩定性 pH穩定性 水生棲熱菌 (ATCC 27634) 0.30 約 65°C 約6.5-6. 8 高達約80〇C 約5. 5-9. 5 T.ruber (ATCC 35948) 0.26 約 50°C 約6. 0-7. 0 高達約50〇C 約 5.5-10.0 熱棲菌 (ATCC 43815) 0.25 約 65°C 約6. 0-6.5 高達約80〇C 約 5.5 - 9.5 Pimelobacter R48 於實驗卜3 0.55 約 20°C 約7· 0-8. 0 高達約30〇C 約6. 0-9. 0 惡臭假單胞菌 H262,於實驗 12-14 0.12 約 37〇C 約 7· 3-8.3 高達約40〇C 約6. 0-9. 5 水生棲熱菌 (ATCC 33923) 於實驗18-20 0.35 約 65°C 約6. 0-6. 7 高達約8〇C 約5. 5-9. 5 (請先閱讀背面之注意事
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -56 - 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（54 ) 也發現來自T. ruber(ATC C 3 5 9 4 8 )之麥 芽糖/海藻糖轉化酶，其最佳溫度及熱穩定性低於得自水 生棲熱菌（ATCC 33923)者，但來自其他微生 物之酵素，具有和水生棲熱菌（ATCC 3 3 9 2 3 ) 的相同特性，及高的抗熱性。 實驗2 2 海藻糖製劑之物化特件 以實驗8方法所得之高純度海藻糖，測試其物化特性 。熔點爲 9 7 . 0 °C，比旋光〔α〕P，+ 1 9 9 ° ( c =5);熔化熱，57. 8仟焦耳/莫耳；含水物質之溶 解度，7 7 . 0克於2 5 °C水中。物理特性和同時測試的 商品化晶狀海藻糖水合物（一種Wako Pure chemical Industries, Ltd.，Osaka, Japan 之產品）有良好的一致 性。 實驗2 3 活體內同化之測試 依據 Atsuji et al.，Rinsho Ziyo (Clinical Nutrition) ，Vol. 41, No. 2，pp200-208(1972)所報告 之方法，將30克實驗8所製備之高純度（99. 8 % ) 海藻糖製成2 Ow/ν%水溶液，再口服至年齡2 6， 2 7及3 0之健康男子三人，之後對其定期採血以偵測血 糖及胰島素水平。以葡萄糖爲對照組。結果，海藻糖的作 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事_
訂
-57 - 493001 A7 B7 五、發明説明（55 ) 用類似葡萄糖，且可在投藥後約〇. 5-1小時使血糖及 胰島素水平達最高值。其證實海藻糖可被容易地水解，吸 收再代謝及充作能量般利用。因此，海藻糖及含彼之醣適 合充作能量補充之醣源。 實驗2 4 急性毒性試驗 在以實驗A - 6製備之高純度海藻糖上進行急性毒性 試驗，在此其係口服至老鼠。結果海藻糖是一種低毒性物 質，在可能的最高劑量下也無死之例。因此L D 5 0大約 5 0克/公斤以上。 實驗2 5 麥芽糖濃度對培養中海藻糖形成之效應 測試麥芽糖濃度在培養物中海藻糖產率上之影響，係 在有2 - 2 0 %麥芽糖之營養培養基中培養不同型式可產 生麥芽糖/海藻糖轉化酶之微生物。特別的在 Pimelobacter 種 R4 8 ( F ERM BP — 4 3 1 5 )例 中，於2 7 °C下之醱酵槽中進行7 2小時的培養，類似實 驗1除了營養培養基中2. Ow/ν%葡萄糖換上2— 2〇|/〃％麥芽糖，其已分別滅菌，加入〇.lv/v % ’TWEEN 40〃 一種界面活性劑含有聚氧乙烯山梨醇糖棕 櫚酸鹽，購自 Wako Pure chemical Industrios, Ltd.， Osaka Japan，並再培養2 4小時。於水生棲熱菌（ I紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 58 - (請先閱讀背面之注意事 -- 寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493001 A7 B7 五、發明説明（56 ) ATCC 339 2 3)例中，在60 °C下之醱酵槽內進 行培養歷2 4小時，類似實驗1 5除了使用已分別滅菌之 有2_2 0w/v%麥芽糖之營養培養基，並加入0. 1 v / v %〜TWEEN 4 0"，再培養2 4小時。培養物離心分 離，且決定上清液中之海藻糖含量（毫克/毫升），利用 HPLC。結果示於表13。 由表1 3之結果證知，頃發現2 0 w / v %以下，較 好是1 5w/v%以下，更好是5_ 1 Ow/ν%之麥芽 糖濃度在海藻糖之產製上是有益的，因其可提高海藻糖之 產率。 (請先閲讀背面之注意事填寫本頁)
、1T
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -59 - 493001 A7 B7 五、發明説明（57 ) 表1 3 微生物 麥芽糖濃度 海藻糖濃度 (w/v°/o) (毫克/毫升） P i me 1 obacter R48 2 3.1 (FERM BP-4315) 5 20.6 10 30. 4 15 9. 8 20 2.7 水生棲熱菌 2 4.2 (ATCC 33923) 5 22. 5 10 34.6 15 8.1 20 2.0 (請先閱讀背面之注意事填寫本頁) 填寫太
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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 以下實例A說明利用本發明之麥芽糖/海藻糖轉化酶 產製海藻糖或含彼之醣之方法，而實例B說明含有其任一 者之組成物。 實例A — 1 約10%懸液（PH5. 5)中之馬鈴薯澱粉，在每 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -60 - 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（58 ) 克澱粉固體中加入2單位’SPITASE HS〃，一種購自 Nagas Biochemical Ltd., Kyoto, Japan之 α —澱粉酶， 凝膠化再於攪拌及加熱條件下液化，在1 2 0 °C下立即壓 熱處理20分，並調至50°C及pH5. 0。生成物中每 克澱粉固體中加入2 0單位石一澱粉酶，購自Nagase Biochemical Ltd·, Kyoto, Japan，加上 5 0 0 單位異激 粉酶，購自 Hayashibara Biochemical Lab. Inc.， Okayama, Japan，反應2 4小時，加熱至9 5 °C以鈍化酵 素，過濾再脫色可得麥芽糖含量約9 2%之醣液體。依據 實驗1之方法製備營養培養基，除了以上述之醣液體取代 2. Ow/ν%葡萄糖爲醣源，其已分別滅菌再以l〇w /v% (依固體計）之量納入其中，置醱酵槽中並以l v / v % Pimelobacter R48 ( F E R Μ BP—4315 )種子培養物接種，此微生物係可產生麥芽糖/海藻糖轉 化酶，在2 7 °C之需氣及攪動條件下培養7 2小時，類似 實驗 1，加入 0· 2v/v%、TRIT0NX-100，，一種界 面活性含有烷基酚聚氧乙烯醚，購自Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan，再培養 2 4 小時 。過濾培養物以移去不溶物質，生成之濾液加熱至9 5 °C 以滅活（鈍化）酵素，濃縮，以活性炭脫色，過濾，去離 子化及以Η -及OH -型離子交換器純化，再濃縮至約 7 5%，如此可得產率約6 5% (按乾固體基礎計）之糖 漿產物。產物中含有約4 4%海藻糖（按乾固體基礎計） ，其可有益地充作甜味劑，口味改善劑，穩定劑及形狀授 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ~ (請先閲讀背面之注意事寫本頁) 裝· 寫本 訂
-61 493001 A7 B7 五、發明説明（59) 予劑，應用於各種組成物中包括食品，化粧品及醫藥品中 ，因其具有緩和的甜度及適合的粘度及保濕能力。 實例A - 2 以實例A — 1方法所得之培養物的濾液，曝於1 〇單 位 / 克 'GLUCOZYME，一種購自 Nayase Biochemical Ltd. ，Kyoto Japan之葡糖澱粉酶，於PH5. 0及50 °C下 歷2 4小時，加熱鈍化酵素，脫色，去離子並純化以得醣 液體，其再以起始的醣溶液型式接受離子交換管柱層析， 利用 ’XT 0 1 0 1 6〃 ，一種購自 Tokyo Organic
Chemical Industries, Ltd·，Tokyo, Japan 之強酸陽離 子交換劑，鈉型，且有4 %交聯程度，如此以提高海藻糖 含量。離子交換劑充填在4個有汽套的不銹鋼管柱內，其 內徑各5. 4公分，再聯串使總長爲20米。管柱內溫度 保持在6 0 °C，並加入5 v / v %醣液以掊抗樹脂再注入 6 0°C的水（SV0. 15)，以分級分離移去葡萄糖， 再回收富含海藻糖之流份。流份純化，濃縮，真空乾燥及 粉碎，可得高海藻糖含量之粉末產物，產率約3 5%按乾 固體基礎計。產物含有約9 7 %海藻糖（按乾固體基礎計 )可有益地充作甜味劑，口味改善劑，品質改善劑，穩定 劑及形狀授予劑，應用於各種組成物中包括食品，化粧品 及藥品，因其具有極低的還原力且有緩和且溫和的甜度。 實例A — 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -62 - 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（6〇 ) 於實例A - 2方法所得之富含海藻糖之流份，以活性 炭脫色，去離子及利用離子交換器以一般方式純化，濃縮 至約7 0%，置於醱酵槽中，加入約2%晶狀海藻糖水合 物爲晶種，並緩緩冷卻以得結晶程度約4 5 %之糖膏。糖 膏再以1 5 0公斤/公分2，經由乾燥塔頂之高壓噴嘴噴 灑，且自乾燥塔頂供應8 5 °C空氣向下，並在乾燥塔底部 有金屬網之輸送帶上收集生成的結晶粉末。結晶粉末逐漸 移動並轉出乾燥塔，同時經由輸送帶向上供應4 5 °C空氣 。結晶粉末置於老化塔中，在此粉末於溫熱空氣氣流中老 化1 0小時，以完全結晶及乾燥，如此得晶狀海藻糖水合 物粉末，以乾固體基礎下對起始的富含海藻糖部份而言之 產率爲約9 0%。產物可有益地充作甜味劑，口味改進劑 及穩定劑，應用於各種組成物中包含食品，化粧品及藥品 ，因其實質上無吸濕性且易於處理。 實例A - 4 以實例A - 2所得之富含海藻糖之流份，類似實例A - 3般純化，置蒸發器中再於真空下煮沸以得水汽含量約 3. 0%之糖漿。糖漿置結晶器中，加入1 %無水晶狀海 藻糖爲晶種（按乾固體計），在12 0°C下結晶並攪拌， 分佈於鋁浴器中令其在1 0 0 °C下靜置6小時以結晶及老 化，如此得成塊型式之固體產物。產物接受切割機器並在 流份床上乾燥，可得無水晶狀海藻糖粉末，水汽含量約 0. 3%，對按固體基礎計之起始的富含海藻糖流份而言 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " ' (請先閱讀背面之注意事填寫本頁) 裝. 填寫太 、τ
63 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（61 ) 產率爲約8 5%。產物可有益地充作白色甜味劑粉末，有 緩和的甜度可應用於各樣組成物中包括食品，化粧品及藥 品’以及可充作食品，化粧品，藥品及其原料及中間物之 乾燥劑。 實例A - 5 33%玉米澱粉懸液加入〇.1%碳酸鈣，調至pH 6. 5，再加 〇. 2% 'TERM AMYL 60L"，一種 α - 澱粉 酶可購自 Novo Industri As, Copenhagen, Denmark (按 乾固體基礎計）再於9 5 °C下反應1 5分鐘。反應液體在 1 20 °C下壓熱滅菌3 0分，冷卻至5 5 °C，加入500 單位/克固體之異澱粉酶，購自Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama Japan，並 加上3 0單位/克固體的万―澱粉酶，購自Nagase Biochemical Ltd.，Kyoto, Japan，反應 4 8 小時再加熱 至9 5 °C以鈍化酵素，過濾並脫色得麥芽糖含量約8 0% 之醣液體。依實驗9方法製備營養培養基，除了充作醣源 之上述醣液體分別滅菌再以1 Ow/ν% (按固體計）之 量添加其中，置醱酵槽中，接種1 v/v %惡臭假單胞菌 H262 (FERM BP - 4579)之種子培養物， 此微生物可產製麥芽糖/海藻糖轉化酶，在2 7 °C之需氣 及攪動條件下類似實驗9般培養4 8小時，加入0 . 2 v / v % ’ TWEEN 4 0〃再培養4 8小時。過濾培養物以移去 不溶物，生成的濾液在9 5 °C下加熱以鈍化酵化，濃縮， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 64 — (請先閲讀背面之注意事寫本頁} 、一=口·
T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493001 A7 B7 五、發明説明（62) 以活性炭脫色，過濾，去離子化並以Η -及Ο Η -型離子 交換以一般方式純化，再進一步濃縮至約7 0%，如此可 得產率約5 0% (按乾固體基礎計）的糖漿產物。產物， 含有約6 4%海藻糖（按乾固體計），可有益地用於各樣 組成物中包括食品，化粧品及醫藥品，因其具有減低的還 原力，緩和的甜度，適合的粘度及保濕力。 實例Α - 6 以實例A - 5方法所得之糖漿濃縮至8 0 %，置結晶 器中，加入1 %晶狀海藻糖水合物爲晶種，並在攪拌下逐 漸冷卻以達成結晶作用。在所生成糖膏中之晶體，以籃式 離心機分離再噴灑少量水以洗滌，如此可得產率約2 0 % (按乾固體計）的高純度晶狀海藻糖水合物。此產物所具 有的物化特性類似實驗2 2中的，可有益地充作甜味劑， 口味改善劑，品質改善劑及穩定劑，應用於各種組成物中 包括食品，化粧品及醫藥品。產物也適用於工業試劑及化 學物質中。 實例A - 7 10%玉米澱粉懸液（ρΗ5· 5)中加入2單位/ 克澱粉固體之'SPITASE HS"，——種商品化α —澱粉酶， 凝膠化並在攪拌及加熱條件下液化，立即在1 2 0 °C下壓 熱滅菌20分，並調至55°C及pH5. 0。生成物中每 克澱粉固體中加入，30Q單位異澱粉酶，購自 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 訂
-65 - 493001 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（63) Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan，並加上2 0單位万—澱粉酶，購自 Nagase Biochemical Ltd., Kyoto, Japan，反應 2 4 小 時，加熱至9 5 °C以鈍化酵素，過濾及脫色以得麥芽糖含 量約9 2 %的醣液體。依實驗1 5方法製備營養培養基， 除了上述的醣液分別滅菌，並以1 Ow/ν% (按乾固體 計）之量充作醣源添加其中，置於醱酵槽中，接種以1 v /v%水生棲熱菌（ATCC 3 3923)之種子培養 物，此微生物可產製麥芽糖/海藻糖轉化酶，培養在 60 °C下40分鐘類似實驗15，此中並加入〇. lv/ v% ’TRITON X-100〃及5 0毫克/升培養的蛋白溶菌酶 ，再又培養1 6小時。過濾培養物以移去不溶物質，且生 成的濾液加熱至9 5 °C以鈍化酵素，濃縮，以活性炭脫色 ’過濾。去離子及以Η -及0H -型離子交換以一般方式 純化，再進一步濃縮至約7 0%，如此可得產率約5 5% (按乾固體計）的糖漿產物。產物中含有約6 8%海藻糖 (按乾固體計），可有益地充作甜味劑，口味改善劑，穩 定劑及形狀授予劑，應用於各樣組成物中包括食品，化粧 品及藥品，因其具有緩和的甜度，適合的粘度及保濕力。 實例A — 8 以實例A - 7方法所得的糖漿濃縮至約8 5%，置結 晶器中，加入1%晶種，分佈浴器中，令其在2 0°C下靜 置4天以達成結晶作用及固化作用，以切割機器粉碎並乾 (請先閲讀背面之注意事填寫本頁) 裝· 填寫太 、11
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -ββ 一 66 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（64 ) 燥以得晶體混合粉末，其中含產率約9 5 % (按乾固體計 )的海藻糖。產物可有益地充作甜味劑，口味改善劑，品 質改善劑及穩定劑，應用於各樣組成物中包括食品，化粧 品及藥品，因其實質上不具吸濕性且極易處理。 實例A — 9 以實例A — 7方法所得之糖漿濃縮至約8 0%，置結 晶器中如實例A - 6般地結晶，生成的晶體分出後可得產 率約2 0% (按乾固體計）的高純度晶狀海藻糖水合物。 此產物就如同實例A - 6中之產物，具有和實驗2 2相似 的物化特性，可有益地應用於各種組成物中，包括食品， 化粧品及藥品，以及於工業或化學試劑及物質中。 實例B — 1 甜味劑 1份按重計的以實例A - .3方法所得之晶狀海藻糖水 合物粉末，混合以0 . 0 1份按重計的' ALPHA G SWEET 夕，一種購自 Toyo Sugar Refining Lo·，Ltd., Tokyo， Japan之a —葡糖基斯替維苷，及0. 0 1 3份按重計之 ’ ASP ART ΑΜΕ 〃，一種L -天冬胺醯基—L —苯丙胺酸甲 酯’購自 Ajinomoto Inc.，Tokyo, Japan’ 混合至均句， 混合物填加至製粒機中得甜味劑之顆粒產物。產物具有作 甜味劑之絕佳品質，且甜度較庶糖強2倍，且熱量爲以每 甜化力計爲蔗糖的一半。由於產物有極佳穩定性，且對呈 1紙張尺度適用中國國家標準（€奶）八4規格（210/297公釐） 一 — 一 67 - (請先閲讀背面之注意事填寫本頁) 裝· 填寫太 訂
493001 A7 B7 五、發明説明（65 ) 現高甜化力之組份無分解力，其適合充作低熱量甜味劑可 甜化熱量攝取受限的糖尿病患或肥胖人士之低熱量食品。 再者產物適合甜化因齲齒而被節制之食品，因其較不易誘 導形成由齲齒肇因微生物所致之酸及不溶性多醣。 實例B — 2 硬糖果 1 0 0份按重計的5 5%蔗糖溶液，混合以3 0份按 重計，以實例A - 1方法所得之含海澡糖之糖漿，於加熱 下混合，並在真空下加熱以濃縮使水汽含量低於2 %，再 摻合1份按重計的檸檬酸及適量的檸檬香料及著色劑，再 以傳統方式成形得產物。產物爲高品質的硬糖果，其易碎 ，口味絕佳且無蔗糖結晶及變形。 實例B — 3 巧克力 4 0份按重計的可可糊，1 〇份按重計之可可油脂， 3 0份按重計的蔗糖，2 0份按重計的以實例A — 6方法 所得之高品質晶狀海藻糖水合物’混合，填加至精製機器 中以減少粒子大小並在5 0 t之鍋內捏合。在捏合中，加 入0 . 5份按重計的卵磷脂，並充份分散至均質。生成物 以溫控器調至3 1 °C，在奶油固化前立即分佈於模中，以 震盪器除去空氣並通過1 〇°C冷卻管歷2 0分以固化。內 容物自模中取出再包裝以得產物。產物無吸潮性，但有絕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇'乂297公釐） (請先閲讀背面之注意事 裝II 寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -68 - 493001 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（66 ) 佳顏色，光澤及質感，可在口中平滑地溶解以得緩和甜度 及緩和香味及口味。 實例B - 4 口香糖 3份按重計的膠基劑在加熱下熔融軟化，加入4份按 重計的蔗糖及3份按重計之以實例A - 3方法所得之晶狀 海藻糖水合物粉末，與適量的香料及著色劑混合，以輥在 傳統方式下捏合，成型及包裝以得產物。產物爲具絕佳質 感，香昧及口味之口香糖。 實例B — 5 甜化的煉乳 1 0 0份按重計的新鮮牛乳溶於3份按重計，以實例 A - 5方法所得之含海藻糖之糖漿，及1份按重計的蔗糖 ，且混合物在平板式加熱器上加熱，濃縮至7 0%並無菌 裝罐得產物。產物具緩和甜度及絕佳香味及口味，可有益 地用於嬰兒食品，水果，咖排，可可及茶中充作調味料。 實例B - 6 含乳酸菌之飲枓 1 7 5份按重計的脫脂乳，8份按重計之以實例A -2方法所得之高海藻糖含量之粉末，及5 0份按重計之高 乳蔗糖含量粉末，如日本公開公告Ν〇· 2 8 1 ? 7 9 5 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事 裝II :寫本頁) 訂
-69 - 493001 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（67 ) / 9 2所揭示，溶於1 2 0 0份按重計之水中，在6 5 °C 下滅菌3 0分鐘，冷卻至4 0°C，加入3 0份按重計之起 始物再於3 7 °C下以傳統方式培養8小時，可得含有乳酸 菌之飮料。產物口味及香味絕佳。產物中之寡糖可穩定地 維持乳酸菌並刺激兩裂桿菌（bifido-bacteria)之生長 〇 眚例B - 7 果汁粉 3 3份按重計之橘子汁粉（以噴灑乾燥法製備）在攪 拌下與5 0份按重計之以實例A - 6方法所得之高純度晶 狀海藻糖水合物，1 〇份按重計之蔗糖，〇 · 6 5份按重 計之無水檸檬酸，0. 1份按重計之蘋果酸，0. 1份按 重計之L一抗壞血酸，0.1份按重計之檸檬酸鈉， 0. 5份按重計之支鏈澱粉及適量的香料粉末混合均勻， 切成細碎粉末，填加至流化床製粒機上，以實例A - 5方 法所得之充作粘合劑的高海藻糖含量糖槳噴灑，在4 0 °C 之排氣溫度下進行，製粒3 0分鐘分成預定劑量再包裝可 得產物。產物爲水果汁含量約3 0%之果汁粉。產物無不 悅的口味及臭味，且可長期穩定。 實例B - 8 乳蛋糕乳脂 1 0 0份按重計之玉米澱粉，1 0 0份按重計之以實 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事填寫本頁) 裝· 填寫本
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-70 - 493001 A 7 B7 五、發明説明（68 ) 例A - 1方法所得之含海藻糖之糖漿，8 0份按重計之麥 芽糖，2 0份按重計之蔗糖及1份按重計之氯化鈉混合均 勻，加入280份按重計之蛋，攪拌，逐漸加1000份 按重計之煮沸的牛乳，再慢火上攪拌直到玉米澱粉完全凝 膠化，且內容物爲半透明爲止，之後生成物冷卻，加入適 量香草香料，分成預定部份及包裝可得產物。產物有平滑 光澤，緩和甜度及絕佳口味。 實例B — 9 .
」Uiro-n〇-mot〇A 9 0份按重計之米粉末混合以2 0份按重計之玉米澱 粉，4 0份按重計蔗糖，8 0份按重計之以實例A - 3方 法所得之晶狀海藻糖水合物粉末，及4份按重計支鏈澱粉 至均句’可得 >uir〇-no-moto〃 ，uiro-no-moto再與適量 的’ matcha"或於水中之綠茶粉捏合至均勻，置容器中再 蒸6 0分鐘以得〜matcha-uiro。產品之光擇，質感，口 味及香味絕佳。產物有延長之貯架期，因爲澱粉之敗壞可 有效地遏止。 實例B - 1 0 > A η (豆糊）〃 以傳統方式，1 0份按重計之adzuki豆充作原料加水 再煮沸，並移去收歛性，粗澀及水溶性雜質，以得約2 1 份按重計之凹凸不平未加工的adzuki豆糊。粗製的豆糊再 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 71 - (請先閱讀背面之注意事-
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493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7_________五、發明説明（69 ) 加入1 4份按重計之蔗糖，5份按重計之以實例A — 7方 法所得之含海藻糖糖漿，及4份按重計的水’煮沸’再加 少量沙拉油並小心地捏合不破壞adzuki豆之顆粒’如此得 約3 5份按重計之豆糊產物。此產物不變色且質感’口感 及香味絕佳，適合充作’anpan〃，’manju 〃 ’〜dango 〃，〜monaka〃及冷凍點心之原料。 實例B — 1 1 甜捲麵包 以傳統方式，1 0 0份按重計之麵粉，2份按重計之 酵母，5份按重計之蔗糖，1份按重計之以實例A - 2方 法所得之具高海藻糖含量之粉末，及0.1份按重計之無 機食品在水中捏合，在2 6 °C下醱酵2小時，老化3 0分 鐘再烘焙。產物爲高品質甜捲麵包，有絕佳顏色及質感， 適合的彈性及緩和甜味。 實例B - 1 2 火腿 1 0 0份按重計的豬腿上半部份，以1 5份按重計之 氯化鈉及3份按重計之硝酸鉀均勻醃上，再於冷處中疊好 一天。生成物浸於醃汁中再置冷處歷7天，其中含有 5 0 0份按重計的水，1 0 0份按重計的氯化鈉，3份按 重計的硝酸鉀，4 0份按重計之以實例A - 2方法所得之 具高海藻糖含量之粉末，再添加香料，以冷卻的水洗滌， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " (請先閲讀背面之注意事
訂
-72 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493001 A7 B7 五、發明説明（7〇 ) 綁好，煙勳，煮熟，冷卻並包裝以得產物。產物爲高品質 火腿，有絕佳顏色，口味及香味。 實例1 3 fl太粉末 1份按重計之’HIMUTES〃，一種可直接用於食品中 之大豆肽於4 0 %溶液中，可購自Fuji Oil Co., Ltd., Osaka Japan，混合以2份按重計之以實例A — 6方法所 得之高純度晶狀海藻糖水合物，置塑質浴器中，在5 0°C 真空下乾燥，並切割以得肽粉末產物。此產物口味及香味 絕佳，可有益地充作糕餅中之原料，如於混合物及冰品中 ’以及用於嬰兒食品及治療用之營養品中，如口服及腸外 液體食品。、 實例B - 1 4 昧噌粉末 1份按重計之紅色味噌混合以3份按重計之以實例A 一 4方法所得之無水晶狀海藻糖末，倒入金屬板上許多凹 處內，令其在環境溫度下靜置一夜以固化，再自板中倒出 以得味噌固體粒子，各約4克，其可再加至切割機中切成 粉末。產物可有益地充作中式麵條及”sui mono〃中之調 味料，後者爲一種清湯。而味噌固體粒子可完整地充作糕 餅，以及充作固體調味料。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）~ ~ (請先閲讀背面之注意事寫本頁) 、1Τ
-73 - 493001 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（71 ) 實例B — 1 5 蛋黃粉末 未加工之蛋黃在6 0 - 6 4°C之平板式加熱器上滅菌 ，所得之蛋黃液與4份按重計之以實例A - 4方法所得的 無水晶狀海藻糖粉末（對1份按重計蛋黃液體而言）混合 ，分佈於浴器中並令其靜置一夜以將海藻糖轉化成晶狀水 合物型式，如此可得成塊之固體產物。固體產物再填加至 切割機器中以得蛋黃粉末。產物可充作糕餅之原料，如混 合物，冰品及乳化劑，以及嬰兒食品及用於治療用途之營 養品，包括口服及腸外液體食品。 實例B — 1 6 化粧乳液 2份按重計之聚氧單硬脂酸乙二醇酯，5份按重計之 半乳化單硬脂酸甘油酯，2份按重計之以實例A — 2方法 所得之具高海藻糖含量粉末，1份按重計之α -葡糖基芸 香苷，1份按重計液體石蠟，1 0份按重計之甘油基之辛 酸酯及適量的抗菌劑，以傳統方式加熱溶解，加2份按重 計的L —乳酸，5份按重計的1，3 -丁二醇及6 6份按 重計精製水，填加至勻漿機中以乳化再加適量香料攪拌摻 合可得乳液產品。此產物具抗氧化活性及提高之穩定性， 可有益地充作高品質之防曬劑，皮膚粗製劑及皮膚漂白劑 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事
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- 74 - 493001 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（72 ) 實例B — 1 7 人蔘萃取物粉 1/2份按重計之人蔘萃取物與1 5份按重計之以 實例A - 4方法得之無水晶狀海藻糖粉末捏合一起，置浴 器中並令其靜置2天使海藻糖轉化成晶狀水合物型式，如 此得成塊的固體產物。固體產物再填加至切割機器中以粉 碎並過篩得人蔘萃浸物粉末。粉末填加至製粒機中，並加 上適量的維生素B 1及B 2，二者均爲粉末，使成爲含有 維生素之顆粒人蔘萃取物。產物可有益地充作補藥。再者 產物也可充作頭髮重健劑。 實例B — 1 8 固體作用物 購白 Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc. ，Okayama, Jpana之天然人類a —干擾素製劑，填加至經 囿化之抗一人類a —干擾素抗體管柱中，以傳統方式吸附 人類a —干擾素，且也通過牛血清白蛋白爲穩定劑，所吸 附之天然人類a -干擾素以生理食鹽水溶離，其中含有以 實例A — 6方法所得之5%高純度晶狀海藻糖水合物，同 時改變食鹽水中之P Η水平。所得的液體經膜過濾，加 2 0 倍量的〜FINET0SE〃，一 種購自 Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.，Okayama, Japan之無 水晶狀麥芽糖，以乾燥，粉碎並填加至製錠機中以得錠劑 ，各約2 0 0毫克，其中含有1 5 0單位/錠之天然人類 (請先閱讀背面之注意事' 裝 :寫本頁) 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -75 - 493001 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（73 ) α -干擾素。產物可有益地充作舌下錠以治療病毒疾病， 過敏疾病，風濕症，糖尿病及惡性腫瘤，其中產物可口服 劑量爲1 一 1 0錠/天/成人。尤其產物可有益地用於治 療A I D S及肝病，此種病症之罹病率近年來快速增加。 產物可保持長期活性，即使是靜置於環境溫度下，因爲依 據本發明之無還原性醣及無水晶狀麥芽糖均充作穩定劑。 實例B — 1 9 糖衣錠 充作核心原料之未包衣之錠劑各1 5 0毫克，以襯底 液體塗覆，其中含有4 0份按重計之以實例A - 8方法所 得之高純度晶狀海藻糖水合物，2份按重計之平均分子量 200，000道耳吞之支鏈澱粉，30份按重計之水， 2 5份按重計滑石及3份按重計之氧化鈦，如此每錠生成 約2 3 0毫克，再進一步塗以最終之塗層液，其中含有 6 5份按重計之相同的晶狀海藻糖水合物，1份按重計支 鏈澱粉及3 4份按重計之水，再以液體石蠟打光以得有絕 佳光澤外表之糖衣錠。產物有絕佳之防震力，且可長期保 持高品質。 實例B — 2 0 牙膏 (請先閱讀背面之注意事
、τ
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -76 - 493001 A7 B7 五、發明説明（74 ) 調和物（按重計） 磷酸氫鈣 45.0 支鏈澱粉 2.95 硫酸十二酯鈉 1.5 甘油 2 0 . 0 聚氧乙烯山梨聚醣月桂酸酯 0.5 抗菌劑 0. 05 以實例A-8方法得之晶狀海藻 12.0 糖水合物粉末 甘露糖醇 5.0 水 13.0 (請先閱讀背面之注意事寫本頁) ►裝· 寫太 訂 上述原料以傳統方式混合以得牙膏。產物有適合的甜 度適合作兒童用牙膏。 寳例B — 2 1 液體食品用之固體作用物 含有5 0 0份按重計之以實例A - 6方法所製備之高 純度晶狀海藻糖水合物，2 7 0份按重計之蛋黃粉末， 4 . 4份按重計之氯化鈉，1 . 8份按重計之氯化鉀，4 份按重計之硫酸鎂，0 . 0 1份按重計之硫胺素，0 . 1
份按重計之抗壞血酸鈉，0. 6份按重計之醋酸維生素E 及0. 04份按重計之蔽鹼醯胺之組成物，分成每份25 克，再包裝於不透水之層壓袋中，經熱封口後可得產物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -77 - 493001 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 __五、發明説明（75 ) 一袋產物溶於約1 5 0 — 3 0 0毫升水中成爲液體食品， 其可經口或鼻腔投予或經胃或腸作爲活體之能量補充劑。 實例B — 2 2 輸注液劑 以實例A - 6方法所產生之高純度晶狀海藻糖水合物 ，溶於水中以得約1 0 w / v %，經膜移去熱原，無菌裝 瓶於塑質瓶內，再以傳統方式封口。產物爲一種穩定的輸 注液劑，其不因時間而變化且適合用於靜脈內及腹膜內投 藥。產物在1 Ow/v%時與血液呈等張性，且所補充的 能量較在葡萄糖例中強2倍多。 實例B - ？· 3 輸注液劑 以實例A - 9方法所得之高純度晶狀海藻糖水合物， 與下述調和物之胺基酸混合物混合，並溶於水中使分別爲 5w/v%及3 Ow/ν%，類似實例B — 2 2般純化以 移去熱原，再分佈於塑質袋中再封口。 (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 裝· 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） -78 - 493001 A7 B7 五、發明説明（76 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 胺基酸混合物之調和物（毫克/100毫升）： L 一異白胺酸 180 L 一白胺酸 410 L -賴胺酸鹽酸鹽 620 L 一甲硫胺酸 240 L 一苯丙胺酸 290 L 一蘇胺酸 180 L 一色胺酸 60 L 一纈胺酸 200 L -精胺酸鹽酸鹽 270 L -組胺酸鹽酸鹽 130 甘胺酸 340 產物爲穩定的輸注液劑， 其不因時間而變化且可有益 地經靜脈內及腹膜內路徑投藥 ，因爲海藻糖即使在醣及胺 基酸此型式組成物中也不呈現還原力。產物可有益地充作 活體之熱量及胺基酸補充劑。 眚例Β - 2 4 治療外傷用油膏 2 0 0份按重計之以實例A - 8方法所製備之晶狀海 藻糖水合物粉末及3 0 0份按重計之麥芽糖’先摻合3份 按重計之碘於5 0份按重計之甲醇中，再加2 0 0份按重 計之1 Ow/ν%支鏈澱粉水溶液，如此可得有適合的延 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事寫本頁) 裝· 寫太
-79 - 493001 A7 B7 五、發明説明（77 ) 長力及粘附性之油膏。在短期治療中使用產物有絕佳的外 傷癒合力，因爲產物中之碘及海藻糖可分別作爲活細胞之 清毒劑及能量補充劑。 由上文明顯看出，以較少時間可自培養物中十分容易 地產生無還原性之醣，即在有麥芽糖之營養培養基中培養 可產生麥芽糖/海藻糖轉化酶之微生物，有助於海藻糖或 含彼之醣之工業規模之產製。將液化澱粉接受Θ -澱粉酶 或，-澱粉酶及澱粉脫支酶所得之麥芽糖，使用此麥芽糖 極可增加由澱粉至海藻糖之產率，更有助海藻糖之工業規 模產製。海藻糖或含彼之醣具有極佳穩定性，以及具高品 質及緩和的甜味。再者其口服攝取可被消化及以熱量來源 被吸收。特別地，即使經腸外使用海藻糖可容易地代謝及 利用。因此依據本發明之無還原力醣及含彼之較不具還原 力之醣可有益地充作甜味劑，口味改善劑，品質改善劑， 穩定劑及形狀授予劑，以應甩於各樣組成物中包括食品， 化粧品及藥品。 本發明對工業規模之產製打開一個完全新穎的方向， 在低費用下提供欲求含量之海藻糖或含彼之醣，其係有極 大需求但不易得自澱粉，爲便宜且無限量之來源。因此本 發明之結果可應用於農業，漁業及畜牧業及化學工業上， 以及至食品，化粧品及藥學工業，且其工業意義無可估量 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事-
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Claims (1)

  1. 493001 A8 B8 C8 D8 申請專利_ 年月e9a 2 修iL 索 附件1i:
    第8 4 1 G 7 5 2 1號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國90年9月修正 1. 一種產製海藻糖之方法，包括下列步驟： 在含有2 Ow/v%以下之麥芽糖之營養培養基中， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於p Η 5 — 9，溫度介於2 0 糖/海藻糖轉化酶之微生物歷 由麥芽糖生產海藻糖，但不能 物係選自Pimelohacter屬，假 熱棲菌屬（Thermus );及 自生成之培養物中收集海 2 .如申請專利範圍第1 與麥芽糖一起納入營養培養基 3 .如申請專利範圍第1 批次，連續或半連續方式進行 4 .如申請專利範圍第1 與葡萄糖及/或麥芽糖共存。 5. —種製備海藻糖之方 在含有2 Ow/v%以下 一 7 5°C，培養可產生麥芽 1 0 — 1 0 0小時，該酶可 由蔗糖生產海藻糖，該微生 單胞菌屬（Pseudomonas)及 藻糖。 項之方法〃其中界面活性劑 中〇 項之方法，其中培養係以分 Ο 項之方法，其中該海藻糖係 法，其包括下列步驟： 之麥芽糖之營養培養基中， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於p Η 5 糖/海藻糖轉化酶之微生物歷 由麥芽糖生產海藻糖，但不能 物係選自Pimel obacterM，假 溫度介於2 0 — 7 5 °C，培養可產生麥芽 0 - 1 0 0小時，該酶可 由蔗糖生產海藻糖，該微生 單胞菌屬（Pseudomonas)及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1 493001 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 _ 六、申請專利範圍 熱棲菌屬（Thermus ); 令培養物與葡糖澱粉酶或α -葡糖苷酶作用；及 自生成之混合液回收海藻糖。 6.如申請專利範圍第5項之方法，其中該海藻糖係 與葡萄糖及/或麥芽糖共存。 7 . —種製備海藻糖之方法，其包括下列步驟： 在含有2 Ow/ν%以下之麥芽糖之營養培養基中， 於pH5 - 9 ，溫度介於20 — 75 °C，培養可產生麥芽 糖/海藻糖轉化酶之微生物歷1 0 - 1 0 0小時，該酶可 由麥芽糖生產海藻糖，但不能由蔗糖生產海藻糖，該微生 物係選自Pimelobacter屬，假單胞菌屬（PseudDmonas)及 熱棲菌屬（Ther mus ); 自培養物回收含有海藻糖、麥芽糖與葡萄糖之醣類； 令葡糖澱粉酶或α -葡糖苷酶作用於該醣類；及 自生成之混合液回收海藻糖。 / 8.如申請專利範圍第7項之方法，其中該海藻糖係 與葡萄糖及/或麥芽糖共存。 9 . 一種製備營養食品組成物之方法，包括下列步驟 在含有2 Ow/ν%以下之麥芽糖之營養培養基中’ 於pH5 - 9 ，溫度介於20 — 75 °C，培養可產生麥芽 糖/海藻糖轉化酶之微生物歷1 〇 - 1 〇 〇小時，該酶可 由麥芽糖生產海藻糖，但不能由蔗糖生產海藻糖’該微生 物係選自Pi mfil ohacterM，假單胞菌屬（PseudoilLQiL^l及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' -2 - i-m —^^1· up ^v—·· m —^ϋ am mu mi mu fmmml H>1— 一 α, ιϋϋ mu HI— mu ·ϋϋ ml (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 493001 A8 B8 C8 —08 六、申請專利範圍 熱棲 Η 屬（Thermus ); (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 回收所生成之海藻糖（與或不與麥芽糖及/或葡萄糖 );及 將該海藻糖（與或不與麥芽糖及/或蔔萄糖）併入營 養物質中。 1 〇 ·如申請專利範圍第9項之方法，其中該海藻 糖呈含水結晶型或無水結晶型。 1 1 . 一種製備化粧用組成物之方法，包括下列步驟 在含有2 Ow/ν%以下之麥芽糖之營養培養基中， 於PH5 — 9，溫度介於2 0 - 75°C，培養可產生麥芽 糖/海藻糖轉化酶之微生物歷1 〇 — 1 〇 〇小時，該酶可 由麥芽糖生產海藻糖，但不能由蔗糖生產海藻糖，該微生 物係選自P-imelobacterM，假單胞菌屬（Lseud〇mnnM)及 熱棲菌屬（Thermns )； 所生成之海藻糖與或不與麥芽糖及/或蔔萄糖一併回 收；及 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將該海藻糖與或不與麥芽糖及/或葡萄糖併Λ化粧上 可接受之物質中。 1 2 ·如申請專利範圍第1 1項之方法，其中該海藻 糖呈含水結晶型或無水結晶型。 13. —種製備藥學組成物之方法，包括下列步驟： 在含有2 Ow/v%以下之麥芽糖之營養培養基中， S>pH5 — 9 ’溫度介於2 0 — 7 5 C ’培養可產生麥芽 本^張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公'〜-— —- 493001 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 糖/海藻糖轉化酶之微生物歷1 0 - 1 0 0小時，該酶可 由麥芽糖生產海藻糖，但不能由蔗糖生產海藻糖，該微生 物係選自Pimelobacter屬，假單胞囷屬（Psendomonas)及 熱棲菌屬（Thermus ); 所生成之海藻糖與或不與麥芽糖及/或葡萄糖一併回 收；及 將該海藻糖與或不與麥芽糖及/或葡萄糖併入藥學上 可接受之物質中。 1 4 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該海藻 糖呈含水結晶型或無水結晶型。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、^τ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）
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