TW403786B

TW403786B - Process for producing recombinant human serum albumin

Info

Publication number: TW403786B
Application number: TW084107771A
Authority: TW
Inventors: Toyoo Ouda; Wataru Otani; Tomosuke Ooya; Shinobu Kuwae; Kenji Tomomitsu
Original assignee: Yoshitomi Pharmaceutical Lndus
Priority date: 1994-05-18
Filing date: 1995-07-27
Publication date: 2000-09-01
Also published as: EP0683233A3; CA2149579A1; KR950032617A; JPH07308199A; KR100404273B1; EP0683233A2; US5612197A

Description

A7 B7 403^86 五、發明説明（發明領域本發明係經由培養利用基因操縱處理技術轉形之寄主而生產重組人類血清白蛋白（後文稱為” HSA”）之方法之改良。發明背景 HS A為血漿蛋白質之一種主要成分，用於大出血、休克、燒傷、低蛋白血症、胎兒紅血球母细胞瘤病等治療用之醫藥製劑。目前，HS A主要圼採集血液之部份產物生產。但此種生產方法有經濟缺點，且血液的供應量不足。此外，血液本身也有問題，血液經常含有不期望的物質，如肝炎病毒。欲解決此得問題，嘗試經由發酵其中引進HS A基因之微生物，因而利用進來開發的重組DNA技術生產HSA。但此種 DNA技術，就工業大量生產HSA方面而言，無法獲得滿意的结果。因此，眾人注意力集中在K低成本大量生產重組HSA之工業方法。發明之概述本發明之目的係利用基因工程技術，提高重組H S A製法之生產力，特別藉單純改變HSA-生產寄主之培養條件進行犬規模HS A之生產方法。欲解決前述問題進行徹底調查研究结果，發明人發現當藉基因操縱處理技術製備的HSA-生產寄主於含胺基酸之培養基中培養時，可提高HSA之生產力。如此，本發明係關於一種生產重組H S A之方法，包括於本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'〆297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 -4 - A7 B7 403186 五、發明説明（2 含胺基酸之培養基中培養藉基因操縱技術製備的HSA-生產寄主。特別，本發明係關於一種生產重組H S A之方法，包括：（1)製備培養基含有至少一種選自下列之胺基酸、丙胺酸（後文稱為” A 1 a ”）、天冬胺酸（後文稱為” As p ”）、精胺酸（後文稱為” A r g ”）、半胱胺酸（後文稱為” C y s ”）、麩胺酸（後文稱為”Glu”）、組胺酸（後文稱為”His”）、異白胺酸 (後文稱為” I 1 e ”）、苯基丙胺酸（後文稱為” P h e ”）、絲胺酸 (後文稱為”Ser”）、色胺酸（後文稱為”Τγρ”）及纈胺酸（後文稱為”Val”），及（2)於該培養基中培養HSA-生產寄主。本發明之另一具體例中，培養基含有至少一種選自A 1 a 、Asp、Glu、His、Ser、Phe、Trp及 Val 之胺基酸。本發明之又一具體例中，培養基含有至少一種選自Ala 、Asp、His、Ser、Trp 及 Val 之胺基酸—。本發明之又一具體例中，培養基含有至少一種選自A 1 a 、Arg、His、Phe、Ser、Τγρ及 Val 之胺基酸。本發明之另一具體例中，培養基含有H is。培養基含有數量由0.08至20w/v%之如前述培養基中所述的胺基酸。此外，HSA-生產寄主可為酵母種株。圖式之簡單說明第1画顯示表現媒傳者p Η 0 0 5 9之營構計劃發明之詳细說明本發明使用之HSA-生產寄主並無特殊限制，但唯藉基因操縱處理技術製備之細胞寄主。任何公開報告中揭示之寄本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ;裝---

n I 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 5 — A7 B7 403^86 五、發明説明（3 ) 主，及未來將開發之寄主皆可使用。寄主之說明例包含生物(文腸桿菌、酵母種株，枯草桿菌等）及動物细胞’其已 • 經利用基因操縱處理技術，轉成H SA-生產细胞。根據本發 gg，希望使用酵母種株作為寄主’特別屬於酵母菌屬，如啤酒酵母，比奇菌屬（P i c h i a )如巴斯多比奇菌(P i c h i a P a s t o r i s ) >克維羅菌(Kluyveromyces)屬如乳克維羅菌 (Kluyveromyces 1 a c t i s)或漢森努拉(Hansenula)菌屬如多形漢森努拉菌（Hansenula. polymo.rpha)。也可使用營養缺陷種株或抗生素易感性種株。其特例包含G41 8易感性種株如啤酒酵母.AH22(a，his4， leu2，canl)，巴斯多比弯星GTS115(his4)及乳克維羅菌 MW98-8c(a , uraA, arg, lysk + , p〇1° )。較佳使用巴斯多比奇菌’特別巴斯曼比奇菌GTS 115 ° HSA-生產寄主之製備，經由培養及由培養醪中分離及收H S Α之H S Α之生產，皆係根據已知方法進行，但可略為修改。例如HSA-生產寄主（或H S A生產性種株）之製備可使用天然人類血清白蛋白基因之方法進行（JP-A-58-56684對應於 EP-A-73646, JP-A-58-90515對應於 EP-A-79739及 JP-A- 58-150517對應於EP-A-91527)，使用改質人類血清白蛋白基因之方法（JP-A-62-29985 及 JP-A-1-98486 對應於 EP-A-206733 )，使用合成信號序列之方法（JP-A-1 -240 1 9 1對應於EP-A-329127)，使用血清白蛋白信號序列之方法（《ΙΡ-Α-2-167095對應於EP-A-319641)，簠組質體引進染色體之方法（JP-A-3-72889對應於EP-A-399 455)，寄主融合之方法（本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 11 n I. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6 - 403786 A7 B7 五、發明説明（4 ) JP-A-3-53877對應於EP-A-409156)，於含甲醇之培養基中產生突變之方法，使用突變的纟(^2啟動基因之方法（EP-A-506040)，於枯草稈菌表現HSA之方法（JP-A-62-215393對應於 EP-A-229712)，於酵母表現 HSA之方法（J.P-A-60-41487 尉應於EP-A-123544 ， JP-A-63-39576對應於EP-A-248657 及JP-A-63-74493對應於EP-A-251744)及於比奇菌表現HSA 之方法（JP-A-2-104290對應於EP-A-344459)。（此處使用 ” J P - A ” 一詞表示”日本特許公開案”）。此等方法中*於含甲醇之培養基誘生突變之方法係K下述方式進行。適當寄主，較佳為比奇酵母菌例如種株GTS115 (NRRL寄存編號Y-15851)，之轉形株係Μ尋常方式經由將質體（含轉錄單位，藉該轉錄單位HSA於AOXi啟動基因控制下表現）引進寄主之AOXti基因區（參考JP-A-2-104290)而獲得，此種轉形株幾乎無法於含甲醇之培養基生長。结果，此種轉形株於含甲醇培着基上培養時產生突變，及該可於培養經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 基内生長的種株被分離出。培養基之甲醇濃度例如於 0 . 000 1至5¾之範圍。培着基可為合成或天然培養基。培養例如於1 5至4 0 t：溫度進行1至1 , 〇〇〇小時。 HS A-生產寄主之培養（亦即H SA之製法）可藉下列方法進行：前述專利案揭示之各種方法，其中生產者，細胞及產物係藉分批進料培養，而Μ高濃度獲得之方法，該方法係逐漸供應適當小量高濃度葡萄糖溶液，Μ避免高濃度酶基質對生產者细胞產生抑制作用而進行（J Ρ - A - 3 - 8 3 5 9 5 )，其本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 403^86_b7 _ 五、發明説明（5 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 中H S A生產力係藉添加脂肪酸至培養基而改良之方法（J P -A-4-293495對應於 EP-A-504823及美國專利案 5,334,512) 或其中HSA之著色儀藉於二胺類等存在下培養寄主而抑制之方法（JP-A-5-260986對應於EP-A-59 1605及美國專利案 5,369,020)。本發明之生產方法使用的培養基為含胺基酸培養基’特別含有至少一種選自下列之胺基酸之培養基：中性胺基酸如甘胺酸（後文稱為” Gl〆’），Ala、Ser、Val’白胺酸(後文稱為"Leu’，）Ile、Cys、Phe、Trp或脯胺酸（後文稱為” Pro”）酸性胺基酸如Asp或Glu，及鹼性胺基酸如Arg或His 。用於培養HSA生產性寄主時，可顯著增高HSA生產力之培養基範例為含有至少一種選自Ala、Arg、Asp、Glu、Gly 、His、Phe、Ser、Trp、Cys.、lie 及 Val 之 fe 基酸之 L 養. 基，較佳含有至少一種選自Ala、Asp、Glu、His、Phe、經濟部中夬標準局員工消費合作社印製

Ser、Trp及Val之胺基酸之培養基，更佳含有至少一種選自Ala.、Asp、His、Ser、Trp及Val之胺基酸之I養基。他方面，與不含胺基酸之培養基相較，含有至少一種選自Ala .、Arg、His、Ser、Trp、Phe及Val之fe基酸之丨13養基當用於培養寄主時，可有效生產大量H S A，而不會使H s A —生產寄主本身生長。可生產大量HSA而不會使寄主细胞本身明顯生長者，於表現糸統中H S A分泌入培養上清液之場合特別優異，其原因為培養上清液對培養醪（培養基）數量之比變大，故可K較高產率回收HSA〇含H i s之培養基為供本發明使用之特佳培養基°此種哮本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 403786 A7 _._B7_ 五、發明説明（6 ) 養基用於改良HS A之生產力特別良好，原因為其可顯著提高HSA之生產產率，而不影響HSA-生產寄主本身的生長。本發明使用之培養基可單獨含有前述胺基酸，或圼兩種或兩種K上胺基酸之混合物。培養基之胺基酸含量例如可於0.08至20 w/v%，較佳0.1 至lw/v%2範圍。 t 本發明使用之培養基之其它成分並無特殊限制，但培養基必須至少含有一種前述胺基酸。其它成分之範例為此種領域一般使用之已知培養基所含成分。概略而言，使用多種糖類作為碳源，使用尿素、銨鹽、硝酸鹽等作為氮源，及使用各種維生素，核苷酸等作為微量營養素，以及無機鹽類如 Mg、 Ca、 Fe、 Na、 K、 Ma、 Co、 Cu等。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 有用的培養基之說明例包含Y N B液態培養基（0 . 7纟酵母氮碱基不含胺基酸（Difco製造）及2¾葡萄糖），MeOH-乙酸銨培養基（組成：參見實例），Y P D液態培養基（1 %酵母萃取物 (Difco)，2¾巴克多-蛋白腺（Bacto-peptone) (Difco)及 2¾ 葡萄糖）等。當H S A生產性寄主為甲醇同化種株時，可使用含甲醇之培養基。該種例中，甲醇濃度約於0 . 0 1至5 %之範圍。 '換言之，本發明使用之培養基容易經由將前述胺基酸加至已知培養基製備。培養基之p Η可為中性，弱鹼性或弱酸性。較佳，培養基具有ρ Η值由約5 . 7至6 . 5。培養條件可Μ尋常方式選擇。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 9 - 403786_B7_ 五、發明説明（7 ) 培養溫度例如通常由約15至43 °C之範圍。當寄主為细菌時，係於由2 0至3 7 t之範圍。當寄主為酵母菌時，係於約 20至30 °C之範圍。特別，酵母菌寄主可一般於21至29 °C，較佳21至28 °C ，更佳23至28¾，最佳25至27t：之溫度培養。培養期約由1至1 0 0 0小時。希望使用例如前述YNB或YPD液態培養基進行主培着前進行種子培養。較佳，種子培養例如於酵母種株之例於約30 °C，或於细菌種株之例於約37 t：，進行約10至100小時。前述胺基酸也可用於種子培養。培養完成後，藉常用分離及純化手段，由培養上清液（濾液）或细胞收集HSA。此等手段之說明例包含一種方法，其中培養上清液（濾液）以超濾、熱處理、酸處理及超濾之順序，隨後，使用陽雛子交換劑、疏水層析及陰離子交換劑進行個別處理而純化之方法（J P - A - 5 - 3 1 7 0 7 9對應於E P -A-5709 16)，及其中HS A藉螯合劑樹脂處理脫色之方法UP-A-5-328991對應於 EP-A-570916)。經濟部中央標準局員工消費合作社印製提供下列實例供進一步擧例說明本發明，但絕非意圖囿限本發明之範圍。實例1 Π )使用種株之製備根據J P - A - 2 - 1 0 4 2 9 0之方法經由使用質體p P G P 1 (含有轉錄單位，藉此轉錄單位可於A 0 X t啟動基因控制之下表現 H S A之經N 〇 t I -消化Η段取代巴斯多比奇菌GTS115 (his4) 之A 0 X i基因區，獲得巴斯多比奇菌種株P C 4130。由於不本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -10 - •403· ^ 五、發明説明（β ) 存在有AOXi基因，此種種株於含有甲酵作碳源之培養基上，生長的能力減低（甲醇同化陰性種株；後文稱為” Mu t — ” 種株）。種株PC 4130接種於3ml YPD培養基（U酵母萃取物，2¾ 巴克多蛋白腺及2¾葡萄糖）。培養24小時後，细胞接種於 50ml YPD培養基，而將细胞密度調整為初濁度〇D54a 〇.1〇於30 t：培養3日後，所得细胞再度Μ初细胞濁度為0D 54〇 = 0.1接種於50ml YPD培養基。隨後，每隔3日Μ相同方式進行次培養。各次次培養後，细胞於無菌水稀釋，並Μ 107 细胞/平板之接種量倒至2¾ MeOH-YNBw/oa.a.平板（孓含胺基酸>7%酵母氮鹼基’，2%甲醇及1.5¾¾脂粉）上，接著於30¾培養5日* Μ判定是否存在有群落。連續次培養12 日後，於2%MeOH-YNBw/oa.a.平板上發規20個群落，Mut- 種株幾乎無法於2¾ MeOH-YNBw/oa.a.培養基上生長，而

Mu t ’種株（甲醇同化陽性種株）則生長良好。亦即，存在有群落表示種株獲得甲醇同化能力増高，如此獲得Mut +種株。如此所得群落之一使用無菌水適當稀釋，並展布於2!!! 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

MeOH-YNBw/oa . a .平板上，而分離單一群落。所得單一群落之一定名為SHG4105-4巴斯多比奇菌SHG 4105-4，1995 年1月13日Μ存取編號92 0 0 02寄存於台灣食品工業研究所。

所得突變株SHG 4105-4之Α0Χ2啟動基因利用PCR方法S 殖。亦即，P C R係使用於5 '端具有B a m Η I位置之D Ν Α片段 (5，-CCGGATCCACTMGCCiAGTCATCATC-3，）作為正股引子’及· 使用於5，-端具有E c 〇 R I位置之下列D Ν A片段作為反股引子-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X 297公釐） -11 - 403786 ' A7 ______B7_ 五、發明説明（9 ) :5'-CCGAATTCGACAATATTCTTTGATGC-3h 而使用突變種株 SHG4105-4染色體DNA進行。如所述擴大的Α0Χ2啟動基因片段選殖入PUC19之BamHI/ EcoRI位置。然後，測定於選殖載體之&〇乂2啟動基因片段之核苷酸序列。由種株SHG4105-4分離之Α0Χ2啟動基因中，天然Α0Χ2 啟動基因之開始密碼子上游第255鹼基（YE AST,!, 167-177， 1988; Mol. Cell Biol.， i, 1316-1323， 1989)由 T改成 c。營構可於選殖突變株纟0乂2啟動基因控制下，表現HSA的載體。首先，於突變株纟0爿2啟動基因5'端之BamHI位置轉成EcoRI位置，及使用EcoRI-SspI分離突變之A0Xz啟動基因片段。然後，於HSA表規載體 ρΜΜ〇41(ΕΡ-Α-506040 )之天然Α0Χ2啟動基因，Μ突變Α0Χ2啟動基因替代，獲得可於突變之Α0Χ2啟動基因控制下表現HSA的載體 ΡΗ0059 (點突變）（第1圖）。質體ΡΜΜ041於1995年1月13日Μ存取編號940067託存於台灣食品工業研究所。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 營構妥之H S Α表規載體ρ Η 0 0 5 9 M S t u I消化而調整至1 u g / « 1，然後整合至寄主巴斯多比奇菌GTS 115之[1154區，及使用鹼化酵母菌轉形套件組（B i ο 1 〇 1)及乙酸鋰方法製備轉形株 GTS115/pH0059。 (2)培養基組成 YPD培養基（2¾巴克多-蛋白脒，1%酵母萃取物及2¾葡萄糖）用於種籽培養。表1所示之Me 0 Η -乙酸銨培養基用於主本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐] -12 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 403^86 at __B7 五、發明説明（10 ) 培養。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 言 1-.-:..1=11-1:.-11.-^: 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -13 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 40 柳 6 A7 B7 五、發明説明（1 1 ) 表 1

MeOH-乙酸銨培養基組成成分濃度 (m g / 1 ) 甲醇 40m 1 甘油 1,000 CH aCOONH 4 5,000 KH2P0 4 10,000 CaC 1 Z2H zO 100 KC 1 2,000 NaC 1 100 MgSO 4 7H 20 2,000 ZnSO 4 7H zO 100 CuSO + 5H 20 5 FeC 1 3 6H 20 100 生物素 0.1 維生素B! 10 維生素B 8 1 泛酸納 10 肌糖醇 50 - ....... 11 H - 1— Ί— --- I - » m. - n、一IT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 14 A7 403186 B7 五、發明説明（12 ) (3)培養方法 i)種子培養 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 凍乾廢料小瓶所含1份lml種株接種於含50ml YPD培養基之300ml有擋板錐形瓶，並於30¾振搖培養24小時。 i i)主培養 1份lml種子培養基接種於300ml有擋板錐形瓶，瓶内含有50 ml MeOH-乙酸銨培養基，且補充各種胺基酸，獲得終濃度0.U，並調整至PH6.0，及於3〇υ振搖培養89小時。參考例1 细胞密度之測量於實例1 (3) i i)進行之主培養過程中，以選擇性間隔採樣培養醪，如此收集之樣品個別Μ蒸餾水稀釋，於測量時獲得0DS + Q值為0.3或以下，然後使用分光光度計（ϋν2〇〇，Shimadzu Corp.製造）測量於540mm之稀釋樣品吸光率。參考例2 rHSA生產力之評估經濟部中央標準局員工消費合作社印製培養完成後，整份培養醪回收，並接受3000 rpm離心20 分鐘。所得上清液通過 MILLEX-HV(Millip0re (：ογ·ρ.; 〇.45«m)過據，15m.l 據液 _使用 Amicon Centriprep 10(分丰·量截留1 0 , 0 0 0，A m i c ο n C o r p .製造）離心約2 0倍（4 °C， 3 0 0 0 r p m，約6小時），然後於下述條件下，接受Η P L C凝膠過濾分析，評估HSA生產力。柱：TSK凝腦 G3000SWxi(To.soh Corp.) 動相：0.3M NaCl， 50mM磷酸納，0,1¾ NaN3， pH6.5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 15 4037 86 A7 B7 五、發明説明（13) 流速：0 . 7 m 1 / m i η 注入：5 0 u 1 檢測：Α 2 Β α，A 3 5 □(雙重波長）參考例3 生產的HSA著色程度之評估使用對H S A生產力評估，進行Η P L C凝膠過濾分析结果，計算A 3 5 Q / Α 2 β α值，此等值用於評估本發明方法生產之H S A 之著色程度。試驗例1 檢視培養基所含各種胺基酸之效果。培養基之胺基酸含量固定於0 . 1 w / v %。其它條件包含培養條件述於實例1。结果示於表2至4。基於未添加胺基酸之例作為100¾，分別顯示HS A之生產力，细胞數量及著色程度。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) --------------------产、裝------訂----- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- 403786 五、發明説明（I4) A7 B7 表胺基酸及其它成分細胞產率著色程度產率（％) ⑴ U) 對照 100 100 100 酵母萃取物 157 118 127 蛋白腺 122 120 122 G 1 y 127 123 145 A 1 a 220 99 112 Asp 258 111 135 A r g 132 98 125 G 1 u 173 109 145 His 410 76 96 lie 144 105 118 L y s 42 83 104 Met 28 24 124 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 部 t 央標準局員工消費合社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 17 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4〇3«6 A7 __B7 五、發明説明（15 ) 表 3 胺基酸及其它成分细胞產率著色程度產率u) ⑴ ⑴ 對照 100 100 100 His 439 65 72 L y s 21 44 97 Ala 146 103 109 Asp 221 107 131 T r p 238 91 215 Va 1 235 87 102 Leu 117 102 111 S e r 200 91 105 Thr 105 103 137 A s n 119 121 139 Gin 78 113 105 Pro 114 115 135 泛酸鈣 72 106 120 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 18 — 五、發明説明（16 ) 表 4 胺基酸產率（％) 细胞產率 U) 著色程度 (%) 對照 100¾ 100¾ 100% Phe 165 89 112 C y s ‘ 134 98 161 (清先閲绩背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 試驗例2 訂檢査培養基中各種胺基酸濃度（0.01至之作用。組胺酸（H i s)用作胺基酸。其它條件含培養條件係如實例1 所述。結果示於表5。經濟部中央標準局員工消費合作社印製表胺基酸濃度 % ( tf / V ) 產率u) 细胞產率 ⑴ 著色程度 ⑴ 對照 100 100 100 His 0.1 326 82 112 His 0 . 2 214 67 88 His 0.3 188 86 71 His 0.4 185 89 71 His 0 . 6 159 71 76 His 1.0 133 85 71 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） J. -19 A7 B7 403786 五、發明説明（17 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由前述試驗结果顯然易知，當HSA-生產寄主於含胺基酸，特別 Ala、 Asp、 Glu、 His、 Phe、 Trp、 Val或 Ser之培養基中培養時，HS A產率顯著增高。當與不含胺基酸之培養糸統比較時，發現含有Ala、His、Phe、Trp、Val或Ser*之培養基，或含有Arg或Cys培養基之提高HSA產率之作用，並非因细胞產率增高所致。根據本發明，經由基因操縱處理技術製備的H SA-生產寄主產生HS Α之產率。可使用下述方法提高，該方法可單純經由改變培養條件容易Μ相當低成本進行。特別，當使用含有至少一種選自 Ala、Asp、Glu、His、Ph.e、Trp、

Val及Ser·之胺基酸之培養基培養時，HSA產率與未補充胺基酸培養之例相較，可提高1 . 5至5倍。此外，根據使用補充至少一種選自 Ala、 His、 Phe、 Trp、 Val、 Ser、 Arg及 Cys之胺基酸之培養基之方法，HSA產率可提高1.3至5倍，而不影響细胞生長。此種效果於含His之培養基特別顯著。又即使使用相對小量胺基酸含量0 . 0 8至1 w / v %，也可獲得HSA生產力提高之效果。經濟部中央標準局員工消費合作社印製此外，若干前述胺基酸可減少生產H S A之著色。基於此等效果，本發明之HSA生產方法可視為具有實際用途。雖然已經參照特定具體例詳细說明本發明，但業界人士可於未悖離其精髓及範圍下做出多種變化與修改。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） 20

Claims

403786 m_一 89. 3· η 修正本六、申請寻利範圍公告本 1. 一種生產重組人類血清白蛋白之方法，包括於含胺基酸之培養基中培養人類血清白蛋白-生產酵母菌f其中該培着基含有至少一種選自丙胺酸、天冬胺酸、精胺酸、半胧胺酸、麩胺酸、組胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、絲胺酸、色胺酸、纈胺酸所組成族群中之胺基酸，旦其量為0.08 -2 0 w / v % * 其中該酵母菌為酵母菌屬(Saccharomyces)，比奇菌屬 (P i c h i a )及漢森努拉菌屬(Hansenula)中之一員，並被一質體轉形，該質體包含（1)在酵母內能作用之啟動基因， (2)可使從寄主细胞分泌出之信號序列，（3)成熟化之編碼人類血清白蛋白之核酸序列* (4)轉錄終止序列及（5)同源於一部分寄主細胞序列之序列。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該胺基酸之量為 0.1-1.Ow/v% ° 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中除了申請專利範圍第1項所指定之胺基酸外，沒有其他胺基酸存在於培養 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 中基經濟部智慧財產局員工消費合作社印製培該中其法方之項 1 任中項 3 至 1 第圍範利專請串如員 I ο 之2) 屬 Η 菌A 母ae 酵S1 *1- 中 V . Θ 其 r Θ * C 法 S 方ce 之lny ί ο 項 Γ II 3 第ch 圍ac 〇範 < 酸利22 胺專AH 組請母有申酵含如酒基5.啤養為菌，奇' 比一中" 其‘ 法. 方之 3 項hi 11 C • 1 第 P 園 S 範GT 利菌專其請比申多如斯 6.巴為之員本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1 403786 A8 B8 C8 D8 147 申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1. 一種生產重組人類血清白蛋白之方法，包括於含胺基酸之培養基中培養人類血清白蛋白-生產酵母菌，其中該培養基含有至少一種選自丙胺酸、天冬胺酸、精胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、組胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、絲胺酸、色胺酸、纈胺酸所組成族群’中之胺基酸，且其量為0.08 -20w/vX 0 2 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該胺基酸之量為 O.l-l.Ow/ν% ° 3 .如申請專利範圍第1項之方法，其中除了申請專利範圍‘ 第1項所指定之胺基酸外，沒有其他胺基酸存在於培養基中。 4 .如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中該培養基含有組胺酸。 5.如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中該酵母菌為酵母菌屬(Saccharomyces)，比奇菌屬(P i c h i a )及漢森努拉菌屬(Hansenula)中之一員。 6 .如申請專利範圍第5項之方法，其中酵母菌屬之一員’ 為啤酒酵母 AH22 (Saccharomyces cerevisiae A Η 2 2) 0 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 7 .如申請專利範圍第5項之方法，其中比奇菌屬之一員為巴斯多比其菌 GTS(Pichia pastoris GTS 115)。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -1 - 403786 m_一 89. 3· η 修正本六、申請寻利範圍公告本 1. 一種生產重組人類血清白蛋白之方法，包括於含胺基酸之培養基中培養人類血清白蛋白-生產酵母菌f其中該培着基含有至少一種選自丙胺酸、天冬胺酸、精胺酸、半胧胺酸、麩胺酸、組胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、絲胺酸、色胺酸、纈胺酸所組成族群中之胺基酸，旦其量為0.08 -2 0 w / v % * 其中該酵母菌為酵母菌屬(Saccharomyces)，比奇菌屬 (P i c h i a )及漢森努拉菌屬(Hansenula)中之一員，並被一質體轉形，該質體包含（1)在酵母內能作用之啟動基因， (2)可使從寄主细胞分泌出之信號序列，（3)成熟化之編碼人類血清白蛋白之核酸序列* (4)轉錄終止序列及（5)同源於一部分寄主細胞序列之序列。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該胺基酸之量為 0.1-1.Ow/v% ° 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中除了申請專利範圍第1項所指定之胺基酸外，沒有其他胺基酸存在於培養 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 中基經濟部智慧財產局員工消費合作社印製培該中其法方之項 1 任中項 3 至 1 第圍範利專請串如員 I ο 之2) 屬 Η 菌A 母ae 酵S1 *1- 中 V . Θ 其 r Θ * C 法 S 方ce 之lny ί ο 項 Γ II 3 第ch 圍ac 〇範 < 酸利22 胺專AH 組請母有申酵含如酒基5.啤養為菌，奇' 比一中" 其‘ 法. 方之 3 項hi 11 C • 1 第 P 園 S 範GT 利菌專其請比申多如斯 6.巴為之員本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1