TW202144578A - 用於治療人類個體之非年齡相關性聽力障礙的組成物及方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供包括至少兩種不同核酸載體之組成物，其中該至少兩種不同載體中之每一者均包括編碼耳畸蛋白之蛋白的不同部分的編碼序列，以及此等組成物治療個體之聽力損失的用途。

Description

用於治療人類個體之非年齡相關性聽力障礙的組成物及方法
本揭示案大體上係關於核酸治療人類個體之聽力損失的用途。
耳為一種複雜器官，其經典地描述為包括外耳、中耳、內耳、聽力(聽)神經及聽覺系統(當聲音自耳傳播至腦時會對其進行處理)。除偵測聲音，耳亦有助於維持平衡。因此，內耳病症可引起聽力損失、耳鳴、眩暈及失衡。眩暈為運動之幻覺，且為前庭系統疾病之主要症狀。眩暈可由內耳或中樞神經系統中之問題引起。眩暈之常見內耳原因包括：前庭神經炎(突發性單側前庭功能損失)，美尼爾氏病(Meniere's disease)(間歇性眩暈)、良性陣發性位置性眩暈(BPPV)及雙側前庭功能損失。眩暈之常見中樞神經系統原因包括：震盪後症候群、頸性眩暈、前庭偏頭痛、腦血管疾病及聽神經瘤。
聽力損失為最常見之人類感覺缺陷之一，且可由於多種原因而發生。一些人可天生患有聽力損失，而另一些人則可隨時間緩慢損失其聽力。老年失聰(Presbycusis，亦拼寫為presbyacusis)為與年齡相關性聽力損失。約3600萬名美國成人報告某種程度之聽力損失，且三分之一年齡大於60歲之人及一半年齡大於85歲之人經歷聽力損失。
聽力損失可由於環境因素或遺傳與環境因素之組合造成。所有患有耳鳴，即聽覺系統中有幻像噪音(鈴聲、嗡嗡聲、啁啾聲、哼哼聲或敲打聲)之人中約一半對某些聲音頻率及音量範圍過度敏感/耐受性降低，此稱為聽覺過敏(hyperacusis，亦拼寫為hyperacousis)。威廉姆斯症候群(Williams syndrome)(亦稱為威廉姆斯-伯恩症候群(Williams-Beuren Syndrome))為一種多系統病症，其藉由7q11.23處1.6 Mb區域之半合子缺失引起，該1.6 Mb區域涵蓋約26種基因，包括編碼LIM激酶1 (LIMK1)之基因。患有威廉姆斯症候群之個體表現為聽覺過敏及進 行性聽力損失，且聽覺過敏早期發作表明其可與缺失基因之一相關。
聽力損失之環境原因包括某些藥物、出生之前或之後的特定感染及長時間段暴露於大噪音。聽力損失可由噪音、耳毒性劑、老年失聰、疾病、感染或影響耳特定部分之癌症引起。缺血性損傷可經由引發之病理生理學機制引起聽力損失。作為另一實例，自體免疫性內耳疾病(AIED)之特徵為快速進行性雙側感覺神經性聽力損失，在身體之免疫系統攻擊誤認為病毒或細菌之內耳中之細胞時發生。
1000名兒童中約1.5名出生時患有重度聽力損失，且每1000名兒童中另有2至3名出生時患有部分聽力損失(Smith等人，2005, Lancet 365:879-890)。此等病例中超過一半由遺傳原因造成的(Di Domenico等人，2011, J. Cell. Physiol. 226:2494-2499)。
非症候群性耳聾為與其他病徵及症狀無關之聽力損失。相反地，症候群性耳聾涉及與身體其他部位異常一起發生之聽力損失。大多數遺傳性耳聾病例(70%至80%)為非症候群性；其餘病例由特定遺傳症候群引起。
聽力損失可為傳導性(由耳道或中耳引起)、感覺神經性(由內耳或聽覺神經引起)或混合性的。非症候群性耳聾之大多數形式與由內耳中結構受損引起之永久聽力損失(感覺神經性耳聾)相關。人類感覺神經性聽力損失中之大部分由耳蝸中柯蒂氏器官(organ of Corti)之毛細胞異常引起。亦存在極不常見之感覺神經性聽力障礙，該等感覺神經性聽力障礙涉及第八腦神經(前庭耳蝸神經)或腦之聽覺部分。在此等種類聽力損失中之最罕見情形下，僅腦之聽覺中樞受影響。在此情況下，可發生皮質性耳聾，其中可以正常臨限值聽到聲音，但所感知聲音之品質不良，無法理解語音。然而，大多數感覺神經性聽力損失由毛細胞功能不良所致。毛細胞可在出生時為異常的，或在個體之一生期間受損。損傷有外部原因，如噪音創傷及感染，亦有內在異常，如先天性基因突變，其在耳蝸之解剖或生理學中起重要作用。
中耳變化引起之聽力損失稱為傳導性聽力損失。非症候群性耳聾之一些形式涉及內耳與中耳兩者之變化，稱為混合性聽力損失。在兒童學習說話前存在之聽力損失歸類為語前或先天性的。言語發育後發生之聽力損失歸類為語後的。大多數體染色體隱性基因座會引起語前嚴重至重度聽力損失。
非症候群性耳聾可具有不同遺傳模式，且可在任何年齡發生。非症候群性耳聾之類型根據其遺傳模式來命名。體染色體顯性形式命名為DFNA，體染色體隱性形式命名為DFNB，且X連鎖形式命名為DFN。各類型亦按其描述之順序編號。例如，DFNA1為非症候群性耳聾之第一種描述之體染色體顯性類型。
75%至80%之病例以體染色體隱性模式遺傳，此意謂各細胞中該基因之兩個複本均具有突變。通常，患有體染色體隱性耳聾之個體的父母中之每一者均為突變基因之一個複本的攜帶者，但不受此種形式之聽力損失的影響。
另外20%至25%之非症候群性耳聾病例為體染色體顯性的，此意謂各細胞中改變基因之一個複本足以引起聽力損失。患有體染色體顯性耳聾之人最常自患有聽力損失之父母中之一者遺傳基因之改變複本。
1%至2%之病例展示X連鎖遺傳模式，此意謂負責該疾患之突變基因位於X染色體(兩個性染色體之一)上。患有X連鎖非症候群性耳聾之男性與遺傳相同基因突變之複本的女性相比，在生命早期傾向於產生更嚴重聽力損失。X連鎖遺傳之一特徵為父親不能將X連鎖性狀傳至其兒子。
在美國，少於1%之病例中發生由粒線體DNA變化引起之粒線體非症候群性耳聾。改變粒線體DNA自母親傳至其所有兒子及女兒。此類耳聾不遺傳自父親。
聽神經病譜系障礙(ANSD)為一種特徵為正常外毛細胞功能及異常或缺乏聽覺腦幹反應之聽力障礙，該疾病為引起嬰兒及幼兒聽力及言語交流障礙之最常見疾病之一。患有永久聽力損失之兒童中約10%可患有ANSD。OTOF基因為為體染色體隱性非症候群性ANSD鑑別之第一基因，且發現OTOF突變佔一些群體中所有體染色體隱性非症候群性聽力損失病例之約5% (Rodriguez-Ballesteros 等人，2008Human Mut 29(6):823-831)。
非症候群性耳聾之原因很複雜。研究者已鑑別出超過30種基因，該超過30種基因在改變時與非症候群性耳聾相關，然而，此等基因中之一些尚未完全表徵。相同基因之不同突變可與聽力損失之不同類型相關，且一些基因與症候群性耳聾及非症候群性耳聾兩者均相關。
例如，與非症候群性耳聾相關之基因包括(但不限於) ATP2B2、ACTG1、CDH23、CLDN14、COCH、COL11A2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、ESPN、EYA4、GJB3、KCNQ4、LHFPL5、MYO1A、MYO15A、MYO6、MYO7A、OTOF、PCDH15、SLC26A4、STRC、TECTA、TMC1、TMIE、TMPRSS3、TRIOBP、USH1C及WFS1。
聽力損失之最常見原因為非症候群性聽力損失及耳聾，即DFNB1 (亦稱為GJB2相關性DFNB1非症候群性聽力損失及耳聾；體染色體隱性耳聾1型；神經感覺性非症候群性隱性耳聾1型)。非症候群性聽力損失及耳聾(DFNB1)之特徵為先天性非進行性輕度至重度感覺神經性聽力障礙。其由GJB2 (其編碼蛋白質連結蛋白26)及GJB6 (其編碼蛋白質連結蛋白30)中之突變引起。DFNB1之診斷取決於分子遺傳學測試以鑑別GJB2及上游順式調節元件中致耳聾突變，該等突變改變間隙接合β-2蛋白(連結蛋白26)。GJB2之分子遺傳學測試偵測到此等基因中大於99%之致耳聾突變。與聽力損失之一些其他形式不同，DFNB1非症候群性聽力損失及耳聾不影響平衡或運動。聽力損失之程度難以基於所具有之基因突變來預測。即使同一家庭之成員受DFNB1非症候群性聽力損失及耳聾之影響，聽力損失之程度亦可因人而異。
編碼連結蛋白26 (Cx26)及/或Cx30之基因中的突變與人類體染色體非症候群性語前耳聾所有病例中之約一半有關。Cx26及Cx30為在耳蝸中發現之兩種主要Cx同功型，且其共同組裝形成雜交(異質及異型)間隙接合(GJ)(Ahmad等人，Proc. Natl. Acad. Sci., 2007, 104(4):1337-1341)。非症候群性聽力損失及耳聾DFNA3由分別改變蛋白質連結蛋白26 (Cx26)或連結蛋白30 (Cx30)之於GJB2或GJB6基因中之顯性陰性致病變體引起，且特徵為語前或語後輕度至重度進行性高頻感覺神經性聽力障礙。
OTOF相關性耳聾(DFNB9非症候群性聽力損失)之特徵為兩種表現型：語前非症候群性聽力損失及不太常見之溫度敏感性非症候群性聽覺神經病(TS-NSAN)。進行性聽力障礙之另一形式與耳畸蛋白基因中之突變(例如，I1573T突變或P1987R突變及/或E1700Q突變)相關，或對溫度不敏感。
彭德萊症候群(Pendred syndrome)/DFNB4 (伴甲狀腺腫性耳聾)為一種體染色體隱性遺傳病症，且佔所有先天性耳聾病例之7.5%。彭德萊症候群與染色體7 (7q31)長臂上編碼潘蛋白(pendrin protein)之PDS基因(亦稱為DFNB4、EVA、PDS、TDH2B及溶質載體家族26成員4即SLC26A4)中之突變相關。此基因中之突變亦引起大前庭導水管症候群(EVA或EVAS)，此為耳聾之另一先天性原因；特定突變更可能引起EVAS，而其他突變更與彭德萊症候群相關。(Azaiez等人，(2007年12月), Hum. Genet. 122 (5): 451-7)。
跨膜絲胺酸蛋白酶3為由TMPRSS3基因(亦稱為DFNB10、DFNB8、ECHOS1及TADG12)編碼之酶。該基因藉由與先天性及兒童期發作性體染色體隱性耳聾相關鑑別。TMPRSS3中之突變與語後及快速進行性聽力障礙相關。由TMPRSS3基因編碼之蛋白質含有絲胺酸蛋白酶域、跨膜域、LDL受體樣域及富含半胱胺酸之清除劑受體域。已知絲胺酸蛋白酶參與多種生物學過程，其功能失常通常引起人類疾病及病症。此基因在胎兒耳蝸及多個其他組織中表現，且認為與內耳之發育及維持或外淋巴及內淋巴之含量有關。此基因亦鑑別為在卵巢腫瘤中過表現之腫瘤相關基因。已描述四種選擇性剪接之變體，其中兩種編碼相同產物。
DFN3耳聾由位於X染色體上之POU3F4基因中的突變引起。在患有此疾患之人中，中耳中小骨(鐙骨)之一不能正常移動，從而乾擾聽力。DFN3之此特徵性病徵稱為鐙骨固定。X染色體之至少四個其他區域與聽力損失有關，但尚未發現負責基因。DFNB59 (耳聾體染色體隱性59型蛋白)，亦稱為Pejvakin或PJVK，為一種屬於脊椎動物焦孔素家族之352個胺基酸的蛋白質。DFNB59由映射至人類染色體2q31.2之基因編碼，其對於聽覺途徑神經元之正常功能及外毛細胞功能至關重要。認為DFNB59中之突變會引起非症候群性感覺神經性耳聾體染色體隱性59型，感覺神經性聽力障礙之一種形式，其特徵為聽覺腦幹反應缺乏或嚴重異常，但光聲發射正常(聽覺神經病或聽覺不同步)。DFNB59與DFNA5具有顯著類似性，此指示此等基因具有共同起源。
阿爾波特症候群(Alport syndrome)由與膠原生物合成有關之COL4A3、COL4A4及COL4A5基因中之突變引起。此等基因中任一者中之突變均阻止IV型膠原網路之正常產生或組裝，IV型膠原網路為腎臟、內耳及眼中基底膜之重要結構組分。用於診斷阿爾波特症候群之標準之一為2000至8000 Hz範圍內之雙側感覺神經性聽力損失。聽力損失逐漸發展，在嬰兒早期不存在，且通常在30歲之前出現。
離子通道中之缺陷與耳聾相關：DFNA2非症候群性聽力損失以KCNQ4基因中之體染色體顯性突變遺傳，該基因編碼鉀電壓門控通道亞家族KQT成員4，亦稱為電壓門控鉀通道亞基Kv7.4。DFNA2非症候群性聽力損失之特徵為對稱，主要高頻感覺神經性聽力損失(SNHL)，其在所有頻率下均為進 行性的。在較年輕之年齡時，聽力損失趨向於在低頻下為輕度，且在高頻下為中度；在老年人中，聽力損失在低頻下為中度，且在高頻下為嚴重至重度。儘管聽力障礙通常在學齡兒童之常規聽力評定期間偵測到，但很可能聽力自出生起即受損，尤其在高頻下。最初，大多數受影響之人在10至40歲之間需要助聽器來協助聲音放大。至70歲時，所有患有DFNA2聽力損失之人均患有嚴重至重度聽力障礙。
KCNE1及KCNQ1基因中之突變引起珍維-蘭格-尼爾遜症候群(Jervell and Lange-Nielsen syndrome；JLNS)，該症候群為一種長QT症候群，與嚴重雙側聽力損失相關。此疾患為體染色體隱性病症，估計每1百萬名兒童中會影響1.6至6名，且佔所有長QT症候群病例之少於10%。其在挪威及瑞典之發病率明顯更高，高達1:200,000。由KCNE1及KCNQ1基因產生之蛋白質共同作用，形成鉀通道，該通道將帶正電之鉀離子轉移出細胞。鉀離子藉由此等通道之運動對於維持內耳及心肌之正常功能至關重要。
認為特徵為智力低下、共濟失調、癲癇發作、聽力損失及腎性失鹽之EAST/SeSAME症候群由內向整流鉀通道之KCNJ10中之突變引起。
患有巴特氏症候群(Bartter's syndrome)伴感覺神經性耳聾4型(亦稱為巴特症候群IV型或BSND)之個體在Cl--通道輔助次單元中存在缺陷。
腎臟及耳蝸中均表現之ATP6V1B1基因中的突變與遠端腎小管性酸中毒(DRTA)相關。亦發現大百分比之患有體染色體隱性DRTA之兒童經歷進行性雙側感覺神經性聽力損失。
亞瑟症候群(Usher syndrome)(亦稱為霍爾格倫症候群(Hallgren syndrome)、亞瑟-霍爾格倫症候群(Usher-Hallgren syndrome)、視網膜色素變性-聽力減退症候群及視網膜發育不良聽力減退症候群)為一種由至少十個基因中任一者中之突變引起，導致聽力損失合併逐漸視力障礙之罕見病症，且為盲聾之主要原因。聽力損失由缺陷之內耳引起，而視力損失由視網膜色素變性(RP)(一種視網膜細胞退化)引起。亞瑟症候群具有三種臨床亞型，分別命名為I、II及III。患有亞瑟I型之個體出生時重度耳聾，且在生命前十年開始失去視力，由於前庭系統問題而學習如兒童般緩慢行走，且展現出平衡困難。患有亞瑟II型之個體並非在出生時耳聾，但確實患有聽力損失，但似乎無明顯平衡問題；其亦會在以後(生命第二個十年)開始損失其視力，且甚至在中年時可保留一些視力。患有亞瑟症候群III型之個體並非在出生時耳聾，但經歷其聽力及視力之逐漸損失；其可具有或可無平衡困難。
藉由在編碼囊泡麩胺酸轉運子-3 (VGLUT3)之基因中進行無效突變產生先天性耳聾之小鼠模型。最近，使用病毒介導之基因療法在VGLUT3敲除小鼠中恢復了聽力(Akil等人，2012, Neuron 75:283-293)。
Math1 (ATH1之小鼠同源物)；亦稱為HATH1或Atonal，(ATOH1)之果蠅同源物，對於內耳毛細胞發育至關重要；因此，建議將Math1用作發育中之感覺上皮中的「有毛細胞促進性基因」(Bermingham等人，1999, Science 284:1837-1841)。數項研究現已展現，藉由病毒介導之Math1遞送，可再生受損小鼠耳蝸中之毛細胞以及改良聽力及平衡兩者(Baker等人，2009, Adv. Otorhinolaryngol. 66:52-63；Husseman及Raphael, 2009, Adv. Otorhinolaryngol. 66:37-51；Izumikawa等人，2008, Hear. Res. 240:52-56；Kawamoto等人，2003, J. Neurosci. 23:4395-4400；Praetorius等人，2010, Acta Otolaryngol. 130:215-222；Staecker等人，2007, Otol. Neurotol. 28:223-231)。
WFS1基因突變引起沃夫蘭症候群(Wolfram syndrome) 1型病例中之超過90%；沃夫蘭症候群為一種影響身體諸多系統之疾患，其最常見特徵為由激素胰島素缺乏引起之高血糖水準(糖尿病)，以及因將資訊自眼帶至腦之神經退化引起的進行性視力損失(視神經萎縮)。然而，患有沃夫蘭症候群之人經常亦患有引起過量尿液排泄(尿崩症)之垂體腺功能障礙、由內耳變化引起之聽力損失(感覺神經性耳聾)、尿道問題、男性性激素睪固酮量減少(性腺低能症)或神經或精神病症。患有沃夫蘭症候群之人中約65%患有感覺神經性耳聾，其嚴重程度可介於出生時開始之耳聾至青春期開始之輕度聽力損失且隨時間加重。此外，患有沃夫蘭症候群之人中約60%產生神經或精神病症，最常見平衡及協調問題(共濟失調)，典型地始於成年早期。
WFS1基因編碼稱為沃夫蘭素(wolframin)之蛋白，認為該蛋白調節細胞中鈣之量。當沃夫蘭症候群由WFS1基因中之突變引起時，其以體染色體隱性模式遺傳，且沃夫蘭素蛋白之功能降低或缺乏。因此，不能調節細胞內之鈣水準，且內質網不能正常工作。當內質網無足夠功能性沃夫蘭素時，細胞觸發其自身細胞死亡(細胞凋亡)。胰腺中之細胞，尤其製造胰島素之細胞(β細胞)的死亡使患有沃夫蘭症候群之人患糖尿病。沿視神經逐漸損失之細胞最終導致受影響個體失明。其他身體系統中之細胞的死亡可能引起沃夫蘭症候群1型之各種病徵及症狀。
已發現粒線體基因MT-TS1及MT-RNR1中之突變會增加產生非症候群性耳聾之風險。非症候群性粒線體聽力損失及耳聾之特徵為中度至重度聽力損失。MT-TS1中之致病變體通常與兒童期感覺神經性聽力損失之發作相關。MT-RNR1中之致病變體在暴露於稱為胺基糖苷之某些抗生素藥物時與易患聽力損失相關(耳毒性)相關，及/或與遲發性感覺神經性聽力損失相關；然而，一些具有MT-RNR1基因中之突變的人即使未暴露於此等抗生素，亦會出現聽力損失。與胺基糖苷耳毒性相關之聽力損失為雙側且嚴重至重度的，發生在投與任何量(甚至單次劑量)之胺基糖苷抗生素(諸如慶大黴素(gentamycin)、妥布黴素(tobramycin)、阿米卡星(amikacin)、卡那黴素(kanamycin)或鏈黴素(streptomycin))後數天至數週內。
目前，聽力損失之治療由以下組成：對於輕度至嚴重損失，放大聽力，以及對於嚴重至重度損失，植入耳蝸(Kral及O'Donoghue, 2010, N. Engl. J. Med. 363:1438-1450)。迄今為止，此領域中之大多數研究均集中在耳蝸毛細胞再生上，其可用於最常見聽力損失形式，包括老年失聰、噪音損害、感染及耳毒性。
在耳蝸缺血之動物模型中，可藉由化合物諸如胰島素樣生長因子(IGF-1)、AM-111 (凋亡抑制子)、依達拉奉(edarabone)(自由基清除劑)、人參皂苷RB 1 (Kappo)、神經膠質細胞衍生之神經營養因子(GDNF)、BDNF、CNTF、SOD1、SOD2、壞死抑素-1、DFNA5及MSRB3來預防缺血性損傷。然而，似乎物質之組合可比單一化合物更有效(例如，補充療法可調節氧化應激、外毒素、血流、鈣及刺激超負荷、凋亡途徑、神經營養或激素控制機制)。
JNK-1誘導之凋亡(粒線體誘導)的抑制可藉由化合物諸如顯性陰性JNK-1及d-立體異構物JNK-1預防(Mol. Pharmacol. 2007 March; 71(3):654-66；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
對於用於預防或逆轉耳聾之藥劑及方法仍存在長期需求。
本揭示案基於以下發現：可使用包括至少兩種不同核酸載體之組成物在哺乳動物細胞中產生編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)之序列，從而治療有需要之個體的非症候群性感覺神經性聽力損失，其中該至少兩種不同載體中之每一者均包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列。
本文提供包括至少兩種不同核酸載體之組成物，其中：該至少兩種不同載體中之每一者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，該等編碼部分中每一者之長度為至少30個胺基酸殘基，其中編碼部分中每一者之胺基酸序列可視情況與編碼部分中另一者之胺基酸序列部分重疊；至少兩種不同載體中單一載體均不編碼全長耳畸蛋白之蛋白；編碼序列中之至少一者包括跨越耳畸蛋白基因體DNA之兩個相鄰外顯子的核苷酸序列，且缺乏兩個相鄰外顯子之間的內含子序列；且當引入哺乳動物細胞中時，至少兩種不同載體彼此進行多聯化或同源重組，從而形成編碼全長耳畸蛋白之蛋白之重組核酸。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者為質體、轉位子、黏接質體、人工染色體或病毒載體。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者為人類人工染色體(HAC)、酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生之人工染色體(PAC)。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者為選自腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體、慢病毒載體或逆轉錄病毒載體之病毒載體。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者為AAV載體。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，編碼部分中一者之胺基酸序列與編碼部分中另一者之胺基酸序列重疊。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，編碼部分中每一者之胺基酸序列與不同編碼部分之胺基酸序列重疊。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，重疊胺基酸序列之長度為約30個胺基酸殘基至約1000個胺基酸殘基。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體包括兩種不同載體，其中每一者包括內含子之不同區段，其中內含子包括存在於耳畸蛋白基因體DNA中之內含子的核苷酸序列，且其中兩種不同區段之序列重疊至少100個核苷酸。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，兩種不同區段之序列重疊約100個核苷酸至約800個核苷酸。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，至少兩種不同載體中每一者之核苷酸序列的長度為約500個核苷酸至約10,000個核苷酸。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，至少兩種不同載體中每一者之核苷酸序列的長度為500個核苷酸至5,000個核苷酸。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，組成物中不同載體之數目為兩種。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，兩種不同載體中之第一者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的編碼序列。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的長度為30個胺基酸至1600個胺基酸。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的長度為200個胺基酸至1500個胺基酸。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，第一載體還包括啟動子及Kozak序列中之一者或兩者。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，第一載體包括為誘導型啟動子、組成型啟動子或組織特異性啟動子之啟動子。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，兩種載體中之一者包含SEQ ID NO: 39 (或包含與SEQ ID NO: 39至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致之序列)，且兩種載體中之第二者包含SEQ ID NO: 40 (或包含與SEQ ID NO: 40至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致之序列)。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，兩種載體中之一者包含SEQ ID NO: 41 (或包含與SEQ ID NO: 41至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致之序列)，且兩種載體中之第二者包含SEQ ID NO: 42 (或包含與SEQ ID NO: 42至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致之序列)。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，兩種載體中之一者包含SEQ ID NO: 84 (或包含與SEQ ID NO: 84至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致之序列)，且兩種載體中之第二者包含SEQ ID NO: 85 (或包含與SEQ ID NO: 85至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致之序列)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，其中至少兩種不同載體之一者包含編碼NTF3蛋白之序列。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，其中編碼NTF3蛋白之序列與SEQ ID NO: 78至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，第一載體還包括編碼去穩定域之編碼序列，其中去穩定域在編碼耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的編碼序列的3'端。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，編碼耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的編碼序列包含人類耳畸蛋白基因之同功型5的外顯子1-21。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，兩種不同載體中之第二者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之C末端部分的編碼序列。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，耳畸蛋白之蛋白之C末端部分的長度為30個胺基酸至1600個胺基酸。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，耳畸蛋白之蛋白之C末端部分的長度為200個胺基酸至1500個胺基酸。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，第二載體還包括poly(dA)訊號序列。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，編碼耳畸蛋白之蛋白之C末端部分的編碼序列包含人類耳畸蛋白基因之同功型5的外顯子22-48。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，第二載體還包括用於mRNA穩定化之序列。本文所述組成物中任一者之一些實施例還包括醫藥學上可接受之賦形劑。
本文亦提供包括本文所述組成物中任一者之套組。本文所述套組中任一者之一些實施例還包括含有該組成物之預負載注射器。
本文亦提供包括將治療有效量之本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物耳蝸中之方法。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，哺乳動物為人類。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，先前已鑑別出哺乳動物具有缺陷耳畸蛋白基因。
本文亦提供增加哺乳動物細胞中活性耳畸蛋白(例如全長耳畸蛋白)之蛋白之表現的方法，該等方法包括將本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物細胞中。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，哺乳動物細胞為耳蝸內毛細胞。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，哺乳動物細胞為人類細胞。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，先前已確定哺乳動物細胞具有缺陷耳畸蛋白基因。
本文亦提供增加哺乳動物耳蝸中內毛細胞中活性耳畸蛋白(例如全長耳畸蛋白)之蛋白之表現的方法，該等方法包括：將治療有效量之本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物耳蝸中。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，先前已鑑別出哺乳動物具有缺陷耳畸蛋白基因。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，哺乳動物為人類。
本文亦提供治療鑑別為具有缺陷耳畸蛋白基因之個體的非症候群性感覺神經性聽力損失的方法，該等方法包括向個體之耳蝸中投與治療有效量之本文所述組成物中任一者之組成物。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，個體為人類。本文所述方法中任一者之一些實施例還包括在投與步驟之前，確定個體具有缺陷耳畸蛋白基因。
本文亦提供包括兩種不同核酸載體之組成物，其中：兩種不同核酸載體中之第一核酸載體包括啟動子、位於啟動子3'端之編碼耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的第一編碼序列及位於第一編碼序列3'末端之剪接供體訊號序列；且兩種不同核酸載體中之第二核酸載體包括剪接受體訊號序列、位於剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之C末端部分的第二編碼序列及在第二編碼序列3'末端之聚腺苷酸化序列；其中編碼部分中之每一者之長度為至少30個胺基酸殘基，其中編碼部分之胺基酸序列不重疊，其中兩種不同載體中單一載體均不編碼全長耳畸蛋白之蛋白，且當編碼序列在哺乳動物細胞中轉錄以產生RNA轉錄本時，在一個轉錄本上之剪接供體訊號序列與另一轉錄本上之剪接受體訊號序列之間發生剪接，從而形成編碼全長耳畸蛋白之蛋白之重組RNA分子。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，該等載體中至少一者之編碼序列包括跨越耳畸蛋白基因體DNA之兩個相鄰外顯子的核苷酸序列，且缺乏兩個相鄰外顯子之間的內含子序列。
本文亦提供包括以下之組成物：第一核酸載體，其包括啟動子、位於啟動子3'端之編碼耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的第一編碼序列、位於第一編碼序列3'末端之剪接供體訊號序列及位於剪接供體訊號序列3'端之第一可偵測標記基因；及第二核酸載體，與第一核酸載體不同，其包括第二可偵測標記基因、位於第二可偵測標記基因3'端之剪接受體訊號序列、位於剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之C末端部分的第二編碼序列及在第二編碼序列3'末端之聚腺苷酸化序列；其中編碼部分中之每一者之長度為至少30個胺基酸殘基，其中編碼部分之各別胺基酸序列彼此不重疊，其中兩種不同載體中單一載體均不編碼全長耳畸蛋白之蛋白，且當編碼序列在哺乳動物細胞中轉錄以產生RNA轉錄本時，在一個轉錄本上之剪接供體訊號與另一轉錄本上之剪接受體訊號之間發生剪接，從而形成編碼全長耳畸蛋白之蛋白之重組RNA分子。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，該等載體中至少一者之編碼序列包括跨越耳畸蛋白基因體DNA之兩個相鄰外顯子的核苷酸序列，且缺乏兩個相鄰外顯子之間的內含子序列。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，第一或第二可偵測標記基因編碼鹼性磷酸酶。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，第一及第二可偵測標記基因相同。
本文亦提供包括以下之組成物：第一核酸載體，其包括啟動子、位於啟動子3'端之編碼耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的第一編碼序列、位於第一編碼序列3'末端之剪接供體訊號序列及位於剪接供體訊號序列3'端之高度重組序列(例如，F1噬菌體重組區，例如，SEQ ID NO: 66)；及第二核酸載體，與第一核酸載體不同，其包括第二高度重組序列(例如，F1噬菌體重組區，例如，SEQ ID NO: 67，或鹼性磷酸酶重組區，例如，SEQ ID NO: 89)、位於第二高度重組序列(例如，F1噬菌體重組區或鹼性磷酸酶重組區) 3'端之剪接受體訊號序列、位於剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之C末端部分的第二編碼序列及在第二編碼序列3'末端之聚腺苷酸化序列；其中編碼部分中之每一者之長度為至少30個胺基酸殘基，其中編碼部分之各別胺基酸序列彼此不重疊，其中兩種不同載體中單一載體均不編碼全長耳畸蛋白之蛋白，且當編碼序列在哺乳動物細胞中轉錄以產生RNA轉錄本時，在一個轉錄本上之剪接供體訊號序列與另一轉錄本上之剪接受體訊號序列之間發生剪接，從而形成編碼全長耳畸蛋白之蛋白之致重組RNA分子。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，該等載體中至少一者之編碼序列包括跨越耳畸蛋白基因體DNA之兩個相鄰外顯子的核苷酸序列，且缺乏兩個相鄰外顯子之間的內含子序列。
本文亦提供包括本文所述組成物中任一者之套組。本文所述套組中任一者之一些實施例還包括含有該組成物之預負載注射器。
本文亦提供包括將治療有效量之本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物耳蝸中之方法。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，哺乳動物為人類。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，先前已鑑別出哺乳動物具有缺陷耳畸蛋白基因。
本文亦提供增加哺乳動物細胞中全長耳畸蛋白之蛋白之表現的方法，該等方法包括將本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物細胞中。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，哺乳動物細胞為耳蝸內毛細胞。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，哺乳動物細胞為人類細胞。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，先前已確定哺乳動物細胞具有缺陷耳畸蛋白基因。
本文亦提供增加哺乳動物耳蝸中內毛細胞中全長耳畸蛋白之蛋白之表現的方法，該等方法包括：將治療有效量之本文所述組成物中之任一者引入耳蝸中。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，先前已鑑別出哺乳動物具有缺陷耳畸蛋白基因。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，哺乳動物為人類。
本文亦提供治療鑑別為具有缺陷耳畸蛋白基因之個體的非症狀性感覺神經性聽力損失的方法，該等方法包括向個體之耳蝸中投與治療有效量之本文所述組成物中之任一者。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，個體為人類。本文所述方法中任一者之一些實施例還包括在投與步驟之前，確定個體具有缺陷耳畸蛋白基因。
本文提供包括複數種腺相關病毒(AAV)載體之治療組成物，其中該複數種AAV載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成聽覺多肽信使RNA。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，該複數種AAV載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成全長聽覺多肽信使RNA。
本文所述治療組成物中任一者之一些實施例還包括第一AAV載體及第二AAV載體，其中第一及第二AAV載體獨立地含有小於約6 kb之包裝能力。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，聽覺多肽信使RNA編碼選自耳畸蛋白及其異種同源物或同源物之群的聽覺多肽。
本文所述治療組成物中任一者之一些實施例還可包括核酸(例如，載體)，該核酸包括編碼聽覺多肽信使RNA之核酸序列，該聽覺多肽信使RNA編碼選自由以下組成之群的聽覺多肽：Cav 1.3；選自巴松蛋白(bassoon)、皮卡諾蛋白(piccolo)、肋眼蛋白(ribeye)及和諧素之支架蛋白；Vglut3；突觸結合蛋白；囊泡連繫/對接蛋白；囊泡激發蛋白；囊泡融合蛋白；GluA2/3；及GluA4。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，第一AAV載體還包括選自CBA、CMV或CB7啟動子之至少一種啟動子序列。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，第一AAV載體還包括選自耳蝸特異性啟動子之至少一種啟動子序列。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以用於耳蝸內投與。在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括脂質奈米粒子。在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括聚合物奈米粒子。在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括小環DNA。在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括CELiD DNA。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括合成外淋巴溶液。在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括合成外淋巴溶液，該合成外淋巴溶液包括20-200 mM NaCl；1-5 mM氯化鉀；0.1-10 mM CaCl2 ；1-10 mM葡萄糖；及2-50 mM HEPES；且pH為約6至約9。
本文亦提供包括聽覺多肽信使RNA之治療組成物。
本文亦提供包括一種或複數種腺病毒(AV)載體之治療組成物，其中該一種或複數種AV載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成聽覺多肽信使RNA。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，該一種或複數種AV載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成全長聽覺多肽信使RNA。
本文亦提供包括一種或複數種慢病毒載體之治療組成物，其中該一種或複數種慢病毒載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成聽覺多肽信使RNA。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，該一種或複數種慢病毒載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成活性(例如全長)聽覺多肽信使RNA。
本文亦提供包括以下步驟之外科方法：i)向人類個體之耳蝸中在第一切口點處引入第一切口；ii)耳蝸內投與有效劑量之治療組成物(例如，本文所述治療組成物中之任一者)。
在本文所述方法中任一者之一些實施例中，在第一切口點處向個體投與治療組成物。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，在第一切口中或經由第一切口向個體投與治療組成物。
在本文所述方法中任一者之一些實施例中，在耳蝸卵圓窗膜中或經由耳蝸卵圓窗膜向個體投與治療組成物。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，在耳蝸圓窗膜中或經由耳蝸圓窗膜向個體投與治療組成物。
在本文所述方法中任一者之一些實施例中，使用能夠在圓窗膜中產生複數個切口之醫療裝置來投與治療組成物。
在本文所述方法中任一者之一些實施例中，醫療裝置包括複數個微針。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，醫療裝置包括複數個微針，該複數個微針包括大致圓形第一外觀，其中各微針之直徑為至少約10微米。
在本文所述方法中任一者之一些實施例中，醫療裝置包括基座及/或能夠容納治療組成物之儲器。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，醫療裝置包括複數個空心微針，該複數個空心微針分別包括能夠轉移治療組成物之內腔。
在本文所述方法中任一者之一些實施例中，醫療裝置包括用於產生至少部分真空之構件。
本文亦提供包括以下之治療遞送系統：i)能夠在有需要之人類個體之內耳的圓窗膜中產生複數個切口的醫療裝置，及ii)有效劑量之包括複數種腺相關病毒(AAV)載體之治療組成物，其中該複數種AAV載體能夠在內耳之標靶細胞中構成活性(例如全長)聽覺多肽信使RNA。
本文亦提供用於執行包括如下步驟之外科方法的手段：i)向有需要之人類個體耳蝸內投與有效劑量之治療組成物(例如，本文所述治療組成物中之任一者)，其中該治療組成物能夠藉由使用如下醫療裝置來投與，該醫療裝置包括a)用於在圓窗膜中產生複數個切口之構件；及b)有效劑量之治療組成物。
在本文所述用於執行外科方法之手段中任一者的一些實施例中，醫療裝置包括複數個微針。
本文亦提供包括單一腺相關病毒(AAV)載體之治療組成物，其中該AAV載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成聽覺多肽信使RNA。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，該單一AAV載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成全長聽覺多肽信使RNA。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，可向個體投與包括編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，本文所述全長或截短活性耳畸蛋白之蛋白中之任一者)之序列的單一載體(例如，本文所述載體中之任一者)。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物還包括除AAV載體以外之第二載體，其中單一AAV載體及第二載體獨立地含有小於約6 kb之包裝能力。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，聽覺多肽信使RNA編碼選自耳畸蛋白及其異種同源物或同源物之群的聽覺多肽。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，聽覺多肽信使RNA編碼選自耳畸蛋白及其截短突變體之群的聽覺多肽。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，耳畸蛋白截短突變體包括至少一種以下之單一C2域：
C2域 a.a. 名稱(來自Pangrsic等人，2012Trends Neurosci 35(11):671-680
C2A 1-121
C2B 256-378
C2C 419-542
C2D 962-1095
C2E 1494-1622
C2F 1734-1895
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，耳畸蛋白截短突變體不包括內源耳畸蛋白多肽C末端區。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，聽覺多肽信使RNA編碼選自由以下組成之群的聽覺多肽：Cav 1.3；選自巴松蛋白、皮卡諾蛋白、肋眼蛋白及和諧素之支架蛋白；Vglut3；突觸結合蛋白；囊泡連繫/對接蛋白；囊泡激發蛋白；囊泡融合蛋白；GluA2/3；及GluA4。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，單一AAV載體還包括選自CBA、CMV或CB7啟動子之至少一種啟動子序列。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，單一AAV載體還包括選自耳蝸特異性啟動子之至少一種啟動子序列。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以用於耳蝸內投與。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括脂質奈米粒子。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括聚合物奈米粒子。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括小環DNA。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括CELiD DNA。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括合成外淋巴溶液。
在本文所述治療組成物中任一者之一些實施例中，治療組成物經調配以包括合成外淋巴溶液，該合成外淋巴溶液包括20-200 mM NaCl；1-5 mM氯化鉀；0.1-10 mM CaCl2 ；1-10 mM葡萄糖；2-50 mM HEPES；pH為約6至約9。
本文亦提供如下治療組成物，其包括編碼耳畸蛋白截短突變體之聽覺多肽信使RNA。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本揭示案所屬技術之一般技術者通常所理解相同之含義。
術語「一(a/an)」指本文語法對象中之一者或超過一者(即，至少一者)。例如，「元件」涵蓋一個元件及超過一個元件。
當提及可量測值諸如量、持續時間及其類似參數時，術語「約」意欲涵蓋至多±20%之變化。此等變化可為例如至多指定值±10%，或在一些情況下±5%，或在一些情況下±1%，或在一些情況下±0.1%，因為此類變化適合執行所揭示方法。
術語「訊號傳導域」指蛋白質之功能部分，其藉由在細胞內傳遞資訊來起作用，以藉由產生第二信使或藉由響應於此類信使用作效應子來經由指定訊號傳導途徑調節細胞活性。認為耳畸蛋白為內毛細胞中胞吐作用以及未成熟外毛細胞中神經遞質釋放所需之鈣感測器。耳畸蛋白之蛋白六個C2域中之五個(C2B-F)與鈣離子以中等及低親和力常數在溶液中結合(Kd分別為25-95 μM及400-700 μM)(Padmanarayana等人，2014Biochem 53:5023-5033)。在磷脂醯絲胺酸(PS)存在下，10 µM之鈣濃度使C2-脂質體與耳畸蛋白之C2C-C2E域發生大量相互作用。因此，耳畸蛋白具有似乎使用「靜電開關」機制起作用之域，以及與鈣無關而結合之域。PI(4,5)P2為突觸前之主要訊號傳導分子，已顯示其以鈣非依賴性方式與耳畸蛋白之C2C及C2F域相互作用(Padmanarayana等人，2014Biochem 53:5023-5033)。
如本文所用，術語「抗體」指來源於免疫球蛋白分子之蛋白質或多肽序列，其與抗原特異性結合。抗體可為多株或單株、多鏈或單鏈或完整免疫球蛋白，且可來源於天然來源或重組來源。抗體可為免疫球蛋白分子之四聚物。術語「抗體片段」指完整抗體或其重組變體之至少一部分，且指足以賦予抗體片段與標靶諸如抗原之識別及特異性結合的抗原結合域，例如完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段、scFv抗體片段、線性抗體、單域抗體諸如sdAb (VL或VH)、駱駝科VHH域及由抗體片段形成之多特異性抗體。術語「scFv」指一種融合蛋白，其包括至少一個包括輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包括重鏈可變區之抗體片段，其中該等輕鏈及重鏈可變區經由短撓性多肽連接子連續連接，且能夠表現為單鏈多肽，且其中scFv保留其所衍生之完整抗體的特異性。除非有規定，否則如本文所用，scFv可具有任一順序之VL及VH可變區，例如，相對於多肽之N末端及C末端，scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。
術語「重組多肽」指使用重組DNA技術產生之多肽，諸如，由病毒載體表現系統表現之多肽。該術語亦應視為意謂藉由合成以下產生之多肽：編碼該多肽之DNA分子，且該DNA分子表現蛋白質；或指定該多肽之胺基酸序列，其中該DNA或胺基酸序列使用重組DNA或胺基酸序列技術獲得，且為此項技術中所熟知。
術語「耳畸蛋白基因中之突變」指野生型耳畸蛋白基因中之修飾，該修飾產生與野生型耳畸蛋白之蛋白相比具有以下中之一或多者的耳畸蛋白之蛋白：一或多個胺基酸缺失、一或多個胺基酸取代及一或多個胺基酸插入，及/或使哺乳動物細胞中編碼之耳畸蛋白之蛋白的表現水準與無該突變之哺乳動物細胞中編碼之耳畸蛋白之蛋白的表現水準相比降低。在一些實施例中，突變可產生具有一或多個胺基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸)缺失之耳畸蛋白之蛋白。在一些實施例中，突變可使耳畸蛋白基因框移。術語「框移」在此項技術中已知涵蓋編碼序列中引起編碼序列之閱讀框中移位的任何突變。在一些實施例中，框移可產生無功能蛋白。在一些實施例中，點突變可為無義突變(亦即，在基因外顯子中產生提前終止密碼子)。無義突變可產生可有或可無功能之截短蛋白(與相應野生型蛋白相比)。在一些實施例中，該突變可引起耳畸蛋白mRNA或耳畸蛋白之蛋白或者mRNA與蛋白兩者之表現喪失(或水準降低)。在一些實施例中，與野生型耳畸蛋白之蛋白相比，該突變可產生一或多種生物學活性(功能)喪失或降低的改變之耳畸蛋白之蛋白。
在一些實施例中，突變為將一或多個核苷酸插入耳畸蛋白基因中。在一些實施例中，突變在耳畸蛋白基因之調節序列中，亦即，該基因中不為編碼序列之一部分中。在一些實施例中，調節序列中之突變可在啟動子或增強子區中，且阻止或減少耳畸蛋白基因之適當轉錄。
可藉由此項技術中已知之標準技術將修飾引入核苷酸序列中，諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發。
術語「保守序列修飾」指如下胺基酸修飾，其不顯著影響或改變抗體或含有該胺基酸序列之抗體片段的結合特徵。此類保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。可藉由此項技術中已知之標準技術將修飾引入本揭示案之抗體或抗體片段中，諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發。保守胺基酸取代為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基取代的胺基酸取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族已在此項技術中定義。此等家族包括具有以下之胺基酸：鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸及組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸及麩胺酸)、不帶電荷之極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸及色胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸及甲硫胺酸)、β支鏈側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸及異白胺酸)及芳族側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及組胺酸)。
術語「編碼」指多核苷酸中特定核苷酸序列(諸如基因、cDNA或mRNA)用作模板來根據遺傳密碼合成指定胺基酸序列的固有特性。因此，若對應於基因、cDNA或RNA之mRNA的轉錄及轉譯產生蛋白質，則該基因、cDNA或RNA編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常在序列表中提供之編碼股與用作轉錄模板之非編碼股均可稱為編碼蛋白質產物。
術語「同源」或「一致性」指兩個聚合分子之間，例如兩個核酸分子諸如兩個DNA分子或兩個RNA分子之間，或兩個多肽分子之間的次單元序列一致性。當兩個分子中之次單元位置由相同單體次單元佔據時；例如，若兩個DNA分子中每一者之位置由腺嘌呤佔據，則其在該位置處為同源或一致的。兩個序列之間的同源性為匹配或同源位置數目之直接函數；例如，若兩個序列中位置之一半(例如，長度為十個次單元之聚合物中之五個位置)為同源的，則兩個序列為50%同源；若位置之90% (例如，10個中之9個)為匹配或同源的，則兩個序列為90%同源。
除非另外規定，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括彼此為簡併形式且因此編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。編碼蛋白質之核苷酸序列亦可包括內含子。
術語「內源」指來自生物體、細胞、組織或系統或者在生物體、細胞、組織或系統內產生之任何物質。
術語「外源」指自生物體、細胞、組織或系統之外部引入或在外部產生之任何物質。
術語「分離」意謂自自然狀態改變或去除。例如，天然存在於活動物中之核酸或肽未「分離」，但與天然狀態之共存物質部分或完全分離之相同核酸或肽經「分離」。經分離核酸或蛋白質可以大體上純化形式存在，或可存在於非天然環境，諸如宿主細胞中。
術語「實質上純化之細胞」指基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上純化之細胞亦指如下細胞，其已與在其天然存在狀態下其通常結合之其他細胞類型分離。在以下情況下，實質上純化細胞之群指同源細胞群。在其他情況下，該術語簡單地指如下細胞，其已與在其天然狀態下其天然結合之細胞分離。在一些態樣中，細胞在活體外培養。在其他態樣中，細胞未在活體外培養。
術語「轉染」或「轉化」或「轉導」指將外源核酸轉移或引入宿主細胞中之過程。經「轉染」或「轉化」或「轉導」之細胞為已用外源核酸轉染、轉化或轉導之細胞。該細胞包括原代個體細胞及其後代。
術語「表現」指由啟動子驅動之特定核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。
如本文所用，「瞬時」指非整合轉殖基因表現數小時、數天或數週之時段，其中該表現時間段小於該基因在整合至基因體中或包含在宿主細胞中之穩定質體複製子內時的表現時間段。
術語「個體」意欲包括可在其中引發免疫反應之活生物體(例如，哺乳動物、人類)。在一些實施例中，個體為囓齒動物(例如，大鼠或小鼠)、兔、綿羊、狗、貓、馬、非人類靈長類動物或人類。在一些實施例中，個體患有非症候群性耳聾或具有產生非症候群性耳聾之風險。在一些實施例中，個體先前已鑑別為在耳畸蛋白基因中具有突變。在一些實施例中，個體已鑑別為在耳畸蛋白基因中具有突變且已診斷患有非症狀性感覺神經性聽力損失。在一些實施例中，個體已鑑別為患有非症狀性感覺神經性聽力損失。
如本文所用之術語「治療(therapeutic)」指治療(treatment)。治療效果藉由減少、抑制、緩解或根除疾病病態獲得。
如本文所用之術語「預防」意謂疾病或疾病病態之預防或防護性治療。在本上下文中，「預防」包括降低個體經歷疾病之可能性。
術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，且指有效實現特定生物學結果之本文所述化合物、調配物、材料或組成物之量。在一些實施例中，治療有效量之組成物可使活性耳畸蛋白之蛋白(例如，野生型、全長耳畸蛋白之蛋白或具有所需活性之耳畸蛋白之蛋白的變體)的表現水準增加(例如，與用組成物治療前之表現水準相比)。在一些實施例中，治療有效量之組成物可使標靶細胞(例如，耳蝸內毛細胞)中活性耳畸蛋白之蛋白(例如，野生型、全長耳畸蛋白之蛋白或活性變體)的表現水準增加。在一些實施例中，治療有效量之組成物可使標靶細胞(例如，耳蝸內毛細胞)中活性耳畸蛋白之蛋白(例如，野生型、全長耳畸蛋白之蛋白或活性變體)的細胞定位不同。在一些實施例中，治療有效量之組成物可使活性耳畸蛋白之蛋白(例如，野生型、全長耳畸蛋白之蛋白或活性變體)的表現水準增加，及/或使標靶細胞中耳畸蛋白之蛋白的一或多種活性增加(例如，與參考水準相比，諸如治療前個體中之水準、耳畸蛋白基因中具有突變之個體中的水準或患有非症狀性感覺神經性聽力損失之個體或個體群體中的水準)。
術語「非經腸」投與組成物包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌內(i.m.)或胸骨內注射或輸注技術。
術語「核酸」或「多核苷酸」指單股或雙股形式之脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特別限制，否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物的核酸，該等核酸具有與參考核酸類似之結合特性且以與天然存在核苷酸類似之方式代謝。除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含其保守修飾之變體(例如，簡併密碼子取代)、對偶基因、異種同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定言之，簡併密碼子取代可藉由產生如下序列來實現，其中一或多個所選(或全部)密碼子之第三個位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；及Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
在本文所述核酸中任一者之一些實施例中，核酸為DNA。在本文所述核酸中任一者之一些實施例中，核酸為RNA。
在本揭示案之上下文中，使用以下常見核酸鹼基之縮寫。「A」指腺苷，「C」指胞嘧啶，「G」指鳥苷，「T」指胸苷，且「U」指尿苷。
如本文所用，「活體外轉錄之RNA」指在活體外合成之RNA，較佳mRNA。一般而言，活體外轉錄之RNA由活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包括用於產生活體外轉錄RNA之模板。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且指包含由肽鍵共價連接之胺基酸殘基的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且對可構成蛋白質或肽序列之最大胺基酸數目無限制。多肽包括如下任何肽或蛋白質，其包括由肽鍵彼此接合之兩個或更多個胺基酸。如本文所用，該術語指短鏈，其在此項技術中通常亦稱為例如肽、寡肽及寡聚物；且指長鏈，其在此項技術中通常稱為蛋白質，其中存在諸多類型。「多肽」包括例如尤其生物學活性片段、實質上同源之多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽變體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽或其組合。
術語「訊號轉導途徑」指在訊號自細胞之一部分傳遞至細胞之另一部分中起作用的多種訊號轉導分子之間的生化關係。短語「細胞表面受體」包括能夠接收訊號且跨細胞膜傳遞訊號之分子及分子複合物。
術語「活性耳畸蛋白之蛋白」意謂由如下DNA編碼之蛋白，該DNA若取代編碼聽覺毛細胞(例如，聽覺內毛細胞)中之全長耳畸蛋白之蛋白的兩個野生型對偶基因(否則該動物為野生型動物)，且若表現在該哺乳動物之聽覺毛細胞中，將使該哺乳動物之聽力水準接近完全野生型類似哺乳動物之正常聽力水準。活性耳畸蛋白之蛋白的非限制性實例為全長耳畸蛋白之蛋白(例如，本文所述全長耳畸蛋白之蛋白中的任一者)。
例如，活性耳畸蛋白之蛋白可包括野生型全長耳畸蛋白之蛋白(例如，野生型人類全長耳畸蛋白之蛋白)的序列，該序列包括1個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約120個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約115個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約110個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約105個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約100個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約95個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約90個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約85個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約80個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約75個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約70個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約65個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約60個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約55個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約50個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約45個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約40個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約35個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約30個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約25個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約20個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約15個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約10個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約9個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約8個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約7個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約6個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約5個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約4個胺基酸取代、1個胺基酸取代至約3個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約120個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約115個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約110個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約105個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約100個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約95個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約90個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約85個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約80個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約75個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約70個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約65個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約60個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約55個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約50個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約45個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約40個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約35個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約30個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約25個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約20個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約15個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約10個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約9個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約8個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約7個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約6個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約5個胺基酸取代、約2個胺基酸取代至約4個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約120個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約115個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約110個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約105個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約100個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約95個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約90個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約85個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約80個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約75個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約70個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約65個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約60個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約55個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約50個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約45個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約40個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約35個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約30個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約25個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約20個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約15個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約10個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約9個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約8個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約7個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約6個胺基酸取代、約3個胺基酸取代至約5個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約120個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約115個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約110個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約105個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約100個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約95個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約90個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約85個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約80個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約75個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約70個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約65個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約60個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約55個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約50個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約45個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約40個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約35個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約30個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約25個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約20個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約15個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約10個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約9個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約8個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約7個胺基酸取代、約4個胺基酸取代至約6個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約120個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約115個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約110個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約105個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約100個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約95個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約90個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約85個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約80個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約75個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約70個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約65個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約60個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約55個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約50個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約45個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約40個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約35個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約30個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約25個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約20個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約15個胺基酸取代、約5個胺基酸取代至約10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約185個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約120個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約115個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約110個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約105個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約100個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約95個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約90個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約85個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約80個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約75個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約70個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約65個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約60個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約55個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約50個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約45個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約40個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約35個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約30個胺基酸取代、約20個胺基酸取代至約25個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約10個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約120個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約115個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約110個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約105個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約100個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約95個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約90個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約85個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約80個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約75個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約70個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約65個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約60個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約55個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約50個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約45個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約40個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約35個胺基酸取代、約25個胺基酸取代至約30個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約120個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約115個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約110個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約105個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約100個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約95個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約90個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約85個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約80個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約75個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約70個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約65個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約60個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約55個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約50個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約45個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約40個胺基酸取代、約30個胺基酸取代至約35個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約120個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約115個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約110個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約105個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約100個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約95個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約90個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約85個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約80個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約75個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約70個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約65個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約60個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約55個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約50個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約45個胺基酸取代、約35個胺基酸取代至約40個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約120個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約115個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約110個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約105個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約100個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約95個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約90個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約85個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約80個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約75個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約70個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約65個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約60個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約55個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約50個胺基酸取代、約40個胺基酸取代至約45個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約120個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約115個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約110個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約105個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約100個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約95個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約90個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約85個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約80個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約75個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約70個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約65個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約60個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約55個胺基酸取代、約45個胺基酸取代至約50個胺基酸取代、約50個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約50個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約50個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約50個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約50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20個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約120個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約120個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約120個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約120個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約120個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約120個胺基酸取代至約130個胺基酸取代、約120個胺基酸取代至約125個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約140個胺基酸取代、約130個胺基酸取代至約135個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約160個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約150個胺基酸取代、約140個胺基酸取代至約145個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約150個胺基酸取代至約160個胺基酸取代或約150個胺基酸取代至約155個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約170個胺基酸取代、約160個胺基酸取代至約165個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約180個胺基酸取代、約170個胺基酸取代至約175個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約190個胺基酸取代、約180個胺基酸取代至約185個胺基酸取代、約190個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約190個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約190個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約190個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約190個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約190個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約190個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約190個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約190個胺基酸取代至約200個胺基酸取代、約190個胺基酸取代至約195個胺基酸取代、約200個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約200個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約200個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約200個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約200個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約200個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約200個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約200個胺基酸取代至約205個胺基酸取代、約205個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約205個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約205個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約205個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約205個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約205個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約205個胺基酸取代至約210個胺基酸取代、約210個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約210個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約210個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約210個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約210個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約210個胺基酸取代至約215個胺基酸取代、約215個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約215個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約215個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約215個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約215個胺基酸取代至約220個胺基酸取代、約220個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約220個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約220個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約220個胺基酸取代至約225個胺基酸取代、約225個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約225個胺基酸取代至約235個胺基酸取代、約225個胺基酸取代至約230個胺基酸取代、約230個胺基酸取代至約240個胺基酸取代、約230個胺基酸取代至約235個胺基酸取代。熟習此項技術者應理解，來自不同物種之野生型耳畸蛋白之蛋白之間的不保守胺基酸可突變而不會損失活性，而來自不同物種之野生型耳畸蛋白之蛋白之間的彼等保守胺基酸不應突變，因為其更可能(比不同物種之間的不保守胺基酸)參與活性。
活性耳畸蛋白之蛋白可包括例如野生型全長耳畸蛋白之蛋白(例如，野生型人類全長耳畸蛋白之蛋白)的序列，該序列具有1個胺基酸至約200個胺基酸、1個胺基酸至約195個胺基酸、1個胺基酸至約190個胺基酸、1個胺基酸至約185個胺基酸、1個胺基酸至約180個胺基酸、1個胺基酸至約175個胺基酸、1個胺基酸至約170個胺基酸、1個胺基酸至約165個胺基酸、1個胺基酸至約160個胺基酸、1個胺基酸至約155個胺基酸、1個胺基酸至約150個胺基酸、1個胺基酸至約145個胺基酸、1個胺基酸至約140個胺基酸、1個胺基酸至約135個胺基酸、1個胺基酸至約130個胺基酸、1個胺基酸至約125個胺基酸、1個胺基酸至約120個胺基酸、1個胺基酸至約115個胺基酸、1個胺基酸至約110個胺基酸、1個胺基酸至約105個胺基酸、1個胺基酸至約100個胺基酸、1個胺基酸至約95個胺基酸、1個胺基酸至約90個胺基酸、1個胺基酸至約85個胺基酸、1個胺基酸至約80個胺基酸、1個胺基酸至約75個胺基酸、1個胺基酸至約70個胺基酸、1個胺基酸至約65個胺基酸、1個胺基酸至約60個胺基酸、1個胺基酸至約55個胺基酸、1個胺基酸至約50個胺基酸、1個胺基酸至約45個胺基酸、1個胺基酸至約40個胺基酸、1個胺基酸至約35個胺基酸、1個胺基酸至約30個胺基酸、1個胺基酸至約25個胺基酸、1個胺基酸至約20個胺基酸、1個胺基酸至約15個胺基酸、1個胺基酸至約10個胺基酸、1個胺基酸至約9個胺基酸、1個胺基酸至約8個胺基酸、1個胺基酸至約7個胺基酸、1個胺基酸至約6個胺基酸、1個胺基酸至約5個胺基酸、1個胺基酸至約4個胺基酸、1個胺基酸至約3個胺基酸、約2個胺基酸至約200個胺基酸、約2個胺基酸至約195個胺基酸、約2個胺基酸至約190個胺基酸、約2個胺基酸至約185個胺基酸、約2個胺基酸至約180個胺基酸、約2個胺基酸至約175個胺基酸、約2個胺基酸至約170個胺基酸、約2個胺基酸至約165個胺基酸、約2個胺基酸至約160個胺基酸、約2個胺基酸至約155個胺基酸、約2個胺基酸至約150個胺基酸、約2個胺基酸至約145個胺基酸、約2個胺基酸至約140個胺基酸、約2個胺基酸至約135個胺基酸、約2個胺基酸至約130個胺基酸、約2個胺基酸至約125個胺基酸、約2個胺基酸至約120個胺基酸、約2個胺基酸至約115個胺基酸、約2個胺基酸至約110個胺基酸、約2個胺基酸至約105個胺基酸、約2個胺基酸至約100個胺基酸、約2個胺基酸至約95個胺基酸、約2個胺基酸至約90個胺基酸、約2個胺基酸至約85個胺基酸、約2個胺基酸至約80個胺基酸、約2個胺基酸至約75個胺基酸、約2個胺基酸至約70個胺基酸、約2個胺基酸至約65個胺基酸、約2個胺基酸至約60個胺基酸、約2個胺基酸至約55個胺基酸、約2個胺基酸至約50個胺基酸、約2個胺基酸至約45個胺基酸、約2個胺基酸至約40個胺基酸、約2個胺基酸至約35個胺基酸、約2個胺基酸至約30個胺基酸、約2個胺基酸至約25個胺基酸、約2個胺基酸至約20個胺基酸、約2個胺基酸至約15個胺基酸、約2個胺基酸至約10個胺基酸、約2個胺基酸至約9個胺基酸、約2個胺基酸至約8個胺基酸、約2個胺基酸至約7個胺基酸、約2個胺基酸至約6個胺基酸、約2個胺基酸至約5個胺基酸、約2個胺基酸至約4個胺基酸、約3個胺基酸至約200個胺基酸、約3個胺基酸至約195個胺基酸、約3個胺基酸至約190個胺基酸、約3個胺基酸至約185個胺基酸、約3個胺基酸至約180個胺基酸、約3個胺基酸至約175個胺基酸、約3個胺基酸至約170個胺基酸、約3個胺基酸至約165個胺基酸、約3個胺基酸至約160個胺基酸、約3個胺基酸至約155個胺基酸、約3個胺基酸至約150個胺基酸、約3個胺基酸至約145個胺基酸、約3個胺基酸至約140個胺基酸、約3個胺基酸至約135個胺基酸、約3個胺基酸至約130個胺基酸、約3個胺基酸至約125個胺基酸、約3個胺基酸至約120個胺基酸、約3個胺基酸至約115個胺基酸、約3個胺基酸至約110個胺基酸、約3個胺基酸至約105個胺基酸、約3個胺基酸至約100個胺基酸、約3個胺基酸至約95個胺基酸、約3個胺基酸至約90個胺基酸、約3個胺基酸至約85個胺基酸、約3個胺基酸至約80個胺基酸、約3個胺基酸至約75個胺基酸、約3個胺基酸至約70個胺基酸、約3個胺基酸至約65個胺基酸、約3個胺基酸至約60個胺基酸、約3個胺基酸至約55個胺基酸、約3個胺基酸至約50個胺基酸、約3個胺基酸至約45個胺基酸、約3個胺基酸至約40個胺基酸、約3個胺基酸至約35個胺基酸、約3個胺基酸至約30個胺基酸、約3個胺基酸至約25個胺基酸、約3個胺基酸至約20個胺基酸、約3個胺基酸至約15個胺基酸、約3個胺基酸至約10個胺基酸、約3個胺基酸至約9個胺基酸、約3個胺基酸至約8個胺基酸、約3個胺基酸至約7個胺基酸、約3個胺基酸至約6個胺基酸、約3個胺基酸至約5個胺基酸、約4個胺基酸至約200個胺基酸、約4個胺基酸至約195個胺基酸、約4個胺基酸至約190個胺基酸、約4個胺基酸至約185個胺基酸、約4個胺基酸至約180個胺基酸、約4個胺基酸至約175個胺基酸、約4個胺基酸至約170個胺基酸、約4個胺基酸至約165個胺基酸、約4個胺基酸至約160個胺基酸、約4個胺基酸至約155個胺基酸、約4個胺基酸至約150個胺基酸、約4個胺基酸至約145個胺基酸、約4個胺基酸至約140個胺基酸、約4個胺基酸至約135個胺基酸、約4個胺基酸至約130個胺基酸、約4個胺基酸至約125個胺基酸、約4個胺基酸至約120個胺基酸、約4個胺基酸至約115個胺基酸、約4個胺基酸至約110個胺基酸、約4個胺基酸至約105個胺基酸、約4個胺基酸至約100個胺基酸、約4個胺基酸至約95個胺基酸、約4個胺基酸至約90個胺基酸、約4個胺基酸至約85個胺基酸、約4個胺基酸至約80個胺基酸、約4個胺基酸至約75個胺基酸、約4個胺基酸至約70個胺基酸、約4個胺基酸至約65個胺基酸、約4個胺基酸至約60個胺基酸、約4個胺基酸至約55個胺基酸、約4個胺基酸至約50個胺基酸、約4個胺基酸至約45個胺基酸、約4個胺基酸至約40個胺基酸、約4個胺基酸至約35個胺基酸、約4個胺基酸至約30個胺基酸、約4個胺基酸至約25個胺基酸、約4個胺基酸至約20個胺基酸、約4個胺基酸至約15個胺基酸、約4個胺基酸至約10個胺基酸、約4個胺基酸至約9個胺基酸、約4個胺基酸至約8個胺基酸、約4個胺基酸至約7個胺基酸、約4個胺基酸至約6個胺基酸、約5個胺基酸至約200個胺基酸、約5個胺基酸至約195個胺基酸、約5個胺基酸至約190個胺基酸、約5個胺基酸至約185個胺基酸、約5個胺基酸至約180個胺基酸、約5個胺基酸至約175個胺基酸、約5個胺基酸至約170個胺基酸、約5個胺基酸至約165個胺基酸、約5個胺基酸至約160個胺基酸、約5個胺基酸至約155個胺基酸、約5個胺基酸至約150個胺基酸、約5個胺基酸至約145個胺基酸、約5個胺基酸至約140個胺基酸、約5個胺基酸至約135個胺基酸、約5個胺基酸至約130個胺基酸、約5個胺基酸至約125個胺基酸、約5個胺基酸至約120個胺基酸、約5個胺基酸至約115個胺基酸、約5個胺基酸至約110個胺基酸、約5個胺基酸至約105個胺基酸、約5個胺基酸至約100個胺基酸、約5個胺基酸至約95個胺基酸、約5個胺基酸至約90個胺基酸、約5個胺基酸至約85個胺基酸、約5個胺基酸至約80個胺基酸、約5個胺基酸至約75個胺基酸、約5個胺基酸至約70個胺基酸、約5個胺基酸至約65個胺基酸、約5個胺基酸至約60個胺基酸、約5個胺基酸至約55個胺基酸、約5個胺基酸至約50個胺基酸、約5個胺基酸至約45個胺基酸、約5個胺基酸至約40個胺基酸、約5個胺基酸至約35個胺基酸、約5個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約20個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約5個胺基酸至約10個胺基酸、約5個胺基酸至約9個胺基酸、約5個胺基酸至約8個胺基酸、約5個胺基酸至約7個胺基酸、約6個胺基酸至約200個胺基酸、約6個胺基酸至約195個胺基酸、約6個胺基酸至約190個胺基酸、約6個胺基酸至約185個胺基酸、約6個胺基酸至約180個胺基酸、約6個胺基酸至約175個胺基酸、約6個胺基酸至約170個胺基酸、約6個胺基酸至約165個胺基酸、約6個胺基酸至約160個胺基酸、約6個胺基酸至約155個胺基酸、約6個胺基酸至約150個胺基酸、約6個胺基酸至約145個胺基酸、約6個胺基酸至約140個胺基酸、約6個胺基酸至約135個胺基酸、約6個胺基酸至約130個胺基酸、約6個胺基酸至約125個胺基酸、約6個胺基酸至約120個胺基酸、約6個胺基酸至約115個胺基酸、約6個胺基酸至約110個胺基酸、約6個胺基酸至約105個胺基酸、約6個胺基酸至約100個胺基酸、約6個胺基酸至約95個胺基酸、約6個胺基酸至約90個胺基酸、約6個胺基酸至約85個胺基酸、約6個胺基酸至約80個胺基酸、約6個胺基酸至約75個胺基酸、約6個胺基酸至約70個胺基酸、約6個胺基酸至約65個胺基酸、約6個胺基酸至約60個胺基酸、約6個胺基酸至約55個胺基酸、約6個胺基酸至約50個胺基酸、約6個胺基酸至約45個胺基酸、約6個胺基酸至約40個胺基酸、約6個胺基酸至約35個胺基酸、約6個胺基酸至約30個胺基酸、約6個胺基酸至約25個胺基酸、約6個胺基酸至約20個胺基酸、約6個胺基酸至約15個胺基酸、約6個胺基酸至約10個胺基酸、約6個胺基酸至約9個胺基酸、約6個胺基酸至約8個胺基酸、約7個胺基酸至約200個胺基酸、約7個胺基酸至約195個胺基酸、約7個胺基酸至約190個胺基酸、約7個胺基酸至約185個胺基酸、約7個胺基酸至約180個胺基酸、約7個胺基酸至約175個胺基酸、約7個胺基酸至約170個胺基酸、約7個胺基酸至約165個胺基酸、約7個胺基酸至約160個胺基酸、約7個胺基酸至約155個胺基酸、約7個胺基酸至約150個胺基酸、約7個胺基酸至約145個胺基酸、約7個胺基酸至約140個胺基酸、約7個胺基酸至約135個胺基酸、約7個胺基酸至約130個胺基酸、約7個胺基酸至約125個胺基酸、約7個胺基酸至約120個胺基酸、約7個胺基酸至約115個胺基酸、約7個胺基酸至約110個胺基酸、約7個胺基酸至約105個胺基酸、約7個胺基酸至約100個胺基酸、約7個胺基酸至約95個胺基酸、約7個胺基酸至約90個胺基酸、約7個胺基酸至約85個胺基酸、約7個胺基酸至約80個胺基酸、約7個胺基酸至約75個胺基酸、約7個胺基酸至約70個胺基酸、約7個胺基酸至約65個胺基酸、約7個胺基酸至約60個胺基酸、約7個胺基酸至約55個胺基酸、約7個胺基酸至約50個胺基酸、約7個胺基酸至約45個胺基酸、約7個胺基酸至約40個胺基酸、約7個胺基酸至約35個胺基酸、約7個胺基酸至約30個胺基酸、約7個胺基酸至約25個胺基酸、約7個胺基酸至約20個胺基酸、約7個胺基酸至約15個胺基酸、約7個胺基酸至約10個胺基酸、約7個胺基酸至約9個胺基酸、約8個胺基酸至約200個胺基酸、約8個胺基酸至約195個胺基酸、約8個胺基酸至約190個胺基酸、約8個胺基酸至約185個胺基酸、約8個胺基酸至約180個胺基酸、約8個胺基酸至約175個胺基酸、約8個胺基酸至約170個胺基酸、約8個胺基酸至約165個胺基酸、約8個胺基酸至約160個胺基酸、約8個胺基酸至約155個胺基酸、約8個胺基酸至約150個胺基酸、約8個胺基酸至約145個胺基酸、約8個胺基酸至約140個胺基酸、約8個胺基酸至約135個胺基酸、約8個胺基酸至約130個胺基酸、約8個胺基酸至約125個胺基酸、約8個胺基酸至約120個胺基酸、約8個胺基酸至約115個胺基酸、約8個胺基酸至約110個胺基酸、約8個胺基酸至約105個胺基酸、約8個胺基酸至約100個胺基酸、約8個胺基酸至約95個胺基酸、約8個胺基酸至約90個胺基酸、約8個胺基酸至約85個胺基酸、約8個胺基酸至約80個胺基酸、約8個胺基酸至約75個胺基酸、約8個胺基酸至約70個胺基酸、約8個胺基酸至約65個胺基酸、約8個胺基酸至約60個胺基酸、約8個胺基酸至約55個胺基酸、約8個胺基酸至約50個胺基酸、約8個胺基酸至約45個胺基酸、約8個胺基酸至約40個胺基酸、約8個胺基酸至約35個胺基酸、約8個胺基酸至約30個胺基酸、約8個胺基酸至約25個胺基酸、約8個胺基酸至約20個胺基酸、約8個胺基酸至約15個胺基酸、約8個胺基酸至約10個胺基酸、約10個胺基酸至約200個胺基酸、約10個胺基酸至約195個胺基酸、約10個胺基酸至約190個胺基酸、約10個胺基酸至約185個胺基酸、約10個胺基酸至約180個胺基酸、約10個胺基酸至約175個胺基酸、約10個胺基酸至約170個胺基酸、約10個胺基酸至約165個胺基酸、約10個胺基酸至約160個胺基酸、約10個胺基酸至約155個胺基酸、約10個胺基酸至約150個胺基酸、約10個胺基酸至約145個胺基酸、約10個胺基酸至約140個胺基酸、約10個胺基酸至約135個胺基酸、約10個胺基酸至約130個胺基酸、約10個胺基酸至約125個胺基酸、約10個胺基酸至約120個胺基酸、約10個胺基酸至約115個胺基酸、約10個胺基酸至約110個胺基酸、約10個胺基酸至約105個胺基酸、約10個胺基酸至約100個胺基酸、約10個胺基酸至約95個胺基酸、約10個胺基酸至約90個胺基酸、約10個胺基酸至約85個胺基酸、約10個胺基酸至約80個胺基酸、約10個胺基酸至約75個胺基酸、約10個胺基酸至約70個胺基酸、約10個胺基酸至約65個胺基酸、約10個胺基酸至約60個胺基酸、約10個胺基酸至約55個胺基酸、約10個胺基酸至約50個胺基酸、約10個胺基酸至約45個胺基酸、約10個胺基酸至約40個胺基酸、約10個胺基酸至約35個胺基酸、約10個胺基酸至約30個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約10個胺基酸至約20個胺基酸、約10個胺基酸至約15個胺基酸、約15個胺基酸至約200個胺基酸、約15個胺基酸至約195個胺基酸、約15個胺基酸至約190個胺基酸、約15個胺基酸至約185個胺基酸、約15個胺基酸至約180個胺基酸、約15個胺基酸至約175個胺基酸、約15個胺基酸至約170個胺基酸、約15個胺基酸至約165個胺基酸、約15個胺基酸至約160個胺基酸、約15個胺基酸至約155個胺基酸、約15個胺基酸至約150個胺基酸、約15個胺基酸至約145個胺基酸、約15個胺基酸至約140個胺基酸、約15個胺基酸至約135個胺基酸、約15個胺基酸至約130個胺基酸、約15個胺基酸至約125個胺基酸、約15個胺基酸至約120個胺基酸、約15個胺基酸至約115個胺基酸、約15個胺基酸至約110個胺基酸、約15個胺基酸至約105個胺基酸、約15個胺基酸至約100個胺基酸、約15個胺基酸至約95個胺基酸、約15個胺基酸至約90個胺基酸、約15個胺基酸至約85個胺基酸、約15個胺基酸至約80個胺基酸、約15個胺基酸至約75個胺基酸、約15個胺基酸至約70個胺基酸、約15個胺基酸至約65個胺基酸、約15個胺基酸至約60個胺基酸、約15個胺基酸至約55個胺基酸、約15個胺基酸至約50個胺基酸、約15個胺基酸至約45個胺基酸、約15個胺基酸至約40個胺基酸、約15個胺基酸至約35個胺基酸、約15個胺基酸至約30個胺基酸、約15個胺基酸至約25個胺基酸、約15個胺基酸至約20個胺基酸、約20個胺基酸至約200個胺基酸、約20個胺基酸至約195個胺基酸、約20個胺基酸至約190個胺基酸、約20個胺基酸至約185個胺基酸、約20個胺基酸至約180個胺基酸、約20個胺基酸至約175個胺基酸、約20個胺基酸至約170個胺基酸、約20個胺基酸至約165個胺基酸、約20個胺基酸至約160個胺基酸、約20個胺基酸至約155個胺基酸、約20個胺基酸至約150個胺基酸、約20個胺基酸至約145個胺基酸、約20個胺基酸至約140個胺基酸、約20個胺基酸至約135個胺基酸、約20個胺基酸至約130個胺基酸、約20個胺基酸至約125個胺基酸、約20個胺基酸至約120個胺基酸、約20個胺基酸至約115個胺基酸、約20個胺基酸至約110個胺基酸、約20個胺基酸至約105個胺基酸、約20個胺基酸至約100個胺基酸、約20個胺基酸至約95個胺基酸、約20個胺基酸至約90個胺基酸、約20個胺基酸至約85個胺基酸、約20個胺基酸至約80個胺基酸、約20個胺基酸至約75個胺基酸、約20個胺基酸至約70個胺基酸、約20個胺基酸至約65個胺基酸、約20個胺基酸至約60個胺基酸、約20個胺基酸至約55個胺基酸、約20個胺基酸至約50個胺基酸、約20個胺基酸至約45個胺基酸、約20個胺基酸至約40個胺基酸、約20個胺基酸至約35個胺基酸、約20個胺基酸至約30個胺基酸、約20個胺基酸至約25個胺基酸、約25個胺基酸至約200個胺基酸、約25個胺基酸至約195個胺基酸、約25個胺基酸至約190個胺基酸、約25個胺基酸至約185個胺基酸、約25個胺基酸至約180個胺基酸、約25個胺基酸至約175個胺基酸、約25個胺基酸至約170個胺基酸、約25個胺基酸至約165個胺基酸、約25個胺基酸至約160個胺基酸、約25個胺基酸至約155個胺基酸、約25個胺基酸至約150個胺基酸、約25個胺基酸至約145個胺基酸、約25個胺基酸至約140個胺基酸、約25個胺基酸至約135個胺基酸、約25個胺基酸至約130個胺基酸、約25個胺基酸至約125個胺基酸、約25個胺基酸至約120個胺基酸、約25個胺基酸至約115個胺基酸、約25個胺基酸至約110個胺基酸、約25個胺基酸至約105個胺基酸、約25個胺基酸至約100個胺基酸、約25個胺基酸至約95個胺基酸、約25個胺基酸至約90個胺基酸、約25個胺基酸至約85個胺基酸、約25個胺基酸至約80個胺基酸、約25個胺基酸至約75個胺基酸、約25個胺基酸至約70個胺基酸、約25個胺基酸至約65個胺基酸、約25個胺基酸至約60個胺基酸、約25個胺基酸至約55個胺基酸、約25個胺基酸至約50個胺基酸、約25個胺基酸至約45個胺基酸、約25個胺基酸至約40個胺基酸、約25個胺基酸至約35個胺基酸、約25個胺基酸至約30個胺基酸、約30個胺基酸至約200個胺基酸、約30個胺基酸至約195個胺基酸、約30個胺基酸至約190個胺基酸、約30個胺基酸至約185個胺基酸、約30個胺基酸至約180個胺基酸、約30個胺基酸至約175個胺基酸、約30個胺基酸至約170個胺基酸、約30個胺基酸至約165個胺基酸、約30個胺基酸至約160個胺基酸、約30個胺基酸至約155個胺基酸、約30個胺基酸至約150個胺基酸、約30個胺基酸至約145個胺基酸、約30個胺基酸至約140個胺基酸、約30個胺基酸至約135個胺基酸、約30個胺基酸至約130個胺基酸、約30個胺基酸至約125個胺基酸、約30個胺基酸至約120個胺基酸、約30個胺基酸至約115個胺基酸、約30個胺基酸至約110個胺基酸、約30個胺基酸至約105個胺基酸、約30個胺基酸至約100個胺基酸、約30個胺基酸至約95個胺基酸、約30個胺基酸至約90個胺基酸、約30個胺基酸至約85個胺基酸、約30個胺基酸至約80個胺基酸、約30個胺基酸至約75個胺基酸、約30個胺基酸至約70個胺基酸、約30個胺基酸至約65個胺基酸、約30個胺基酸至約60個胺基酸、約30個胺基酸至約55個胺基酸、約30個胺基酸至約50個胺基酸、約30個胺基酸至約45個胺基酸、約30個胺基酸至約40個胺基酸、約30個胺基酸至約35個胺基酸、約35個胺基酸至約200個胺基酸、約35個胺基酸至約195個胺基酸、約35個胺基酸至約190個胺基酸、約35個胺基酸至約185個胺基酸、約35個胺基酸至約180個胺基酸、約35個胺基酸至約175個胺基酸、約35個胺基酸至約170個胺基酸、約35個胺基酸至約165個胺基酸、約35個胺基酸至約160個胺基酸、約35個胺基酸至約155個胺基酸、約35個胺基酸至約150個胺基酸、約35個胺基酸至約145個胺基酸、約35個胺基酸至約140個胺基酸、約35個胺基酸至約135個胺基酸、約35個胺基酸至約130個胺基酸、約35個胺基酸至約125個胺基酸、約35個胺基酸至約120個胺基酸、約35個胺基酸至約115個胺基酸、約35個胺基酸至約110個胺基酸、約35個胺基酸至約105個胺基酸、約35個胺基酸至約100個胺基酸、約35個胺基酸至約95個胺基酸、約35個胺基酸至約90個胺基酸、約35個胺基酸至約85個胺基酸、約35個胺基酸至約80個胺基酸、約35個胺基酸至約75個胺基酸、約35個胺基酸至約70個胺基酸、約35個胺基酸至約65個胺基酸、約35個胺基酸至約60個胺基酸、約35個胺基酸至約55個胺基酸、約35個胺基酸至約50個胺基酸、約35個胺基酸至約45個胺基酸、約35個胺基酸至約40個胺基酸、約40個胺基酸至約200個胺基酸、約40個胺基酸至約195個胺基酸、約40個胺基酸至約190個胺基酸、約40個胺基酸至約185個胺基酸、約40個胺基酸至約180個胺基酸、約40個胺基酸至約175個胺基酸、約40個胺基酸至約170個胺基酸、約40個胺基酸至約165個胺基酸、約40個胺基酸至約160個胺基酸、約40個胺基酸至約155個胺基酸、約40個胺基酸至約150個胺基酸、約40個胺基酸至約145個胺基酸、約40個胺基酸至約140個胺基酸、約40個胺基酸至約135個胺基酸、約40個胺基酸至約130個胺基酸、約40個胺基酸至約125個胺基酸、約40個胺基酸至約120個胺基酸、約40個胺基酸至約115個胺基酸、約40個胺基酸至約110個胺基酸、約40個胺基酸至約105個胺基酸、約40個胺基酸至約100個胺基酸、約40個胺基酸至約95個胺基酸、約40個胺基酸至約90個胺基酸、約40個胺基酸至約85個胺基酸、約40個胺基酸至約80個胺基酸、約40個胺基酸至約75個胺基酸、約40個胺基酸至約70個胺基酸、約40個胺基酸至約65個胺基酸、約40個胺基酸至約60個胺基酸、約40個胺基酸至約55個胺基酸、約40個胺基酸至約50個胺基酸、約40個胺基酸至約45個胺基酸、約45個胺基酸至約200個胺基酸、約45個胺基酸至約195個胺基酸、約45個胺基酸至約190個胺基酸、約45個胺基酸至約185個胺基酸、約45個胺基酸至約180個胺基酸、約45個胺基酸至約175個胺基酸、約45個胺基酸至約170個胺基酸、約45個胺基酸至約165個胺基酸、約45個胺基酸至約160個胺基酸、約45個胺基酸至約155個胺基酸、約45個胺基酸至約150個胺基酸、約45個胺基酸至約145個胺基酸、約45個胺基酸至約140個胺基酸、約45個胺基酸至約135個胺基酸、約45個胺基酸至約130個胺基酸、約45個胺基酸至約125個胺基酸、約45個胺基酸至約120個胺基酸、約45個胺基酸至約115個胺基酸、約45個胺基酸至約110個胺基酸、約45個胺基酸至約105個胺基酸、約45個胺基酸至約100個胺基酸、約45個胺基酸至約95個胺基酸、約45個胺基酸至約90個胺基酸、約45個胺基酸至約85個胺基酸、約45個胺基酸至約80個胺基酸、約45個胺基酸至約75個胺基酸、約45個胺基酸至約70個胺基酸、約45個胺基酸至約65個胺基酸、約45個胺基酸至約60個胺基酸、約45個胺基酸至約55個胺基酸、約45個胺基酸至約50個胺基酸、約50個胺基酸至約200個胺基酸、約50個胺基酸至約195個胺基酸、約50個胺基酸至約190個胺基酸、約50個胺基酸至約185個胺基酸、約50個胺基酸至約180個胺基酸、約50個胺基酸至約175個胺基酸、約50個胺基酸至約170個胺基酸、約50個胺基酸至約165個胺基酸、約50個胺基酸至約160個胺基酸、約50個胺基酸至約155個胺基酸、約50個胺基酸至約150個胺基酸、約50個胺基酸至約145個胺基酸、約50個胺基酸至約140個胺基酸、約50個胺基酸至約135個胺基酸、約50個胺基酸至約130個胺基酸、約50個胺基酸至約125個胺基酸、約50個胺基酸至約120個胺基酸、約50個胺基酸至約115個胺基酸、約50個胺基酸至約110個胺基酸、約50個胺基酸至約105個胺基酸、約50個胺基酸至約100個胺基酸、約50個胺基酸至約95個胺基酸、約50個胺基酸至約90個胺基酸、約50個胺基酸至約85個胺基酸、約50個胺基酸至約80個胺基酸、約50個胺基酸至約75個胺基酸、約50個胺基酸至約70個胺基酸、約50個胺基酸至約65個胺基酸、約50個胺基酸至約60個胺基酸、約50個胺基酸至約55個胺基酸、約55個胺基酸至約200個胺基酸、約55個胺基酸至約195個胺基酸、約55個胺基酸至約190個胺基酸、約55個胺基酸至約185個胺基酸、約55個胺基酸至約180個胺基酸、約55個胺基酸至約175個胺基酸、約55個胺基酸至約170個胺基酸、約55個胺基酸至約165個胺基酸、約55個胺基酸至約160個胺基酸、約55個胺基酸至約155個胺基酸、約55個胺基酸至約150個胺基酸、約55個胺基酸至約145個胺基酸、約55個胺基酸至約140個胺基酸、約55個胺基酸至約135個胺基酸、約55個胺基酸至約130個胺基酸、約55個胺基酸至約125個胺基酸、約55個胺基酸至約120個胺基酸、約55個胺基酸至約115個胺基酸、約55個胺基酸至約110個胺基酸、約55個胺基酸至約105個胺基酸、約55個胺基酸至約100個胺基酸、約55個胺基酸至約95個胺基酸、約55個胺基酸至約90個胺基酸、約55個胺基酸至約85個胺基酸、約55個胺基酸至約80個胺基酸、約55個胺基酸至約75個胺基酸、約55個胺基酸至約70個胺基酸、約55個胺基酸至約65個胺基酸、約55個胺基酸至約60個胺基酸、約60個胺基酸至約200個胺基酸、約60個胺基酸至約195個胺基酸、約60個胺基酸至約190個胺基酸、約60個胺基酸至約185個胺基酸、約60個胺基酸至約180個胺基酸、約60個胺基酸至約175個胺基酸、約60個胺基酸至約170個胺基酸、約60個胺基酸至約165個胺基酸、約60個胺基酸至約160個胺基酸、約60個胺基酸至約155個胺基酸、約60個胺基酸至約150個胺基酸、約60個胺基酸至約145個胺基酸、約60個胺基酸至約140個胺基酸、約60個胺基酸至約135個胺基酸、約60個胺基酸至約130個胺基酸、約60個胺基酸至約125個胺基酸、約60個胺基酸至約120個胺基酸、約60個胺基酸至約115個胺基酸、約60個胺基酸至約110個胺基酸、約60個胺基酸至約105個胺基酸、約60個胺基酸至約100個胺基酸、約60個胺基酸至約95個胺基酸、約60個胺基酸至約90個胺基酸、約60個胺基酸至約85個胺基酸、約60個胺基酸至約80個胺基酸、約60個胺基酸至約75個胺基酸、約60個胺基酸至約70個胺基酸、約60個胺基酸至約65個胺基酸、約65個胺基酸至約200個胺基酸、約65個胺基酸至約195個胺基酸、約65個胺基酸至約190個胺基酸、約65個胺基酸至約185個胺基酸、約65個胺基酸至約180個胺基酸、約65個胺基酸至約175個胺基酸、約65個胺基酸至約170個胺基酸、約65個胺基酸至約165個胺基酸、約65個胺基酸至約160個胺基酸、約65個胺基酸至約155個胺基酸、約65個胺基酸至約150個胺基酸、約65個胺基酸至約145個胺基酸、約65個胺基酸至約140個胺基酸、約65個胺基酸至約135個胺基酸、約65個胺基酸至約130個胺基酸、約65個胺基酸至約125個胺基酸、約65個胺基酸至約120個胺基酸、約65個胺基酸至約115個胺基酸、約65個胺基酸至約110個胺基酸、約65個胺基酸至約105個胺基酸、約65個胺基酸至約100個胺基酸、約65個胺基酸至約95個胺基酸、約65個胺基酸至約90個胺基酸、約65個胺基酸至約85個胺基酸、約65個胺基酸至約80個胺基酸、約65個胺基酸至約75個胺基酸、約65個胺基酸至約70個胺基酸、約70個胺基酸至約200個胺基酸、約70個胺基酸至約195個胺基酸、約70個胺基酸至約190個胺基酸、約70個胺基酸至約185個胺基酸、約70個胺基酸至約180個胺基酸、約70個胺基酸至約175個胺基酸、約70個胺基酸至約170個胺基酸、約70個胺基酸至約165個胺基酸、約70個胺基酸至約160個胺基酸、約70個胺基酸至約155個胺基酸、約70個胺基酸至約150個胺基酸、約70個胺基酸至約145個胺基酸、約70個胺基酸至約140個胺基酸、約70個胺基酸至約135個胺基酸、約70個胺基酸至約130個胺基酸、約70個胺基酸至約125個胺基酸、約70個胺基酸至約120個胺基酸、約70個胺基酸至約115個胺基酸、約70個胺基酸至約110個胺基酸、約70個胺基酸至約105個胺基酸、約70個胺基酸至約100個胺基酸、約70個胺基酸至約95個胺基酸、約70個胺基酸至約90個胺基酸、約70個胺基酸至約85個胺基酸、約70個胺基酸至約80個胺基酸、約70個胺基酸至約75個胺基酸、約75個胺基酸至約200個胺基酸、約75個胺基酸至約195個胺基酸、約75個胺基酸至約190個胺基酸、約75個胺基酸至約185個胺基酸、約75個胺基酸至約180個胺基酸、約75個胺基酸至約175個胺基酸、約75個胺基酸至約170個胺基酸、約75個胺基酸至約165個胺基酸、約75個胺基酸至約160個胺基酸、約75個胺基酸至約155個胺基酸、約75個胺基酸至約150個胺基酸、約75個胺基酸至約145個胺基酸、約75個胺基酸至約140個胺基酸、約75個胺基酸至約135個胺基酸、約75個胺基酸至約130個胺基酸、約75個胺基酸至約125個胺基酸、約75個胺基酸至約120個胺基酸、約75個胺基酸至約115個胺基酸、約75個胺基酸至約110個胺基酸、約75個胺基酸至約105個胺基酸、約75個胺基酸至約100個胺基酸、約75個胺基酸至約95個胺基酸、約75個胺基酸至約90個胺基酸、約75個胺基酸至約85個胺基酸、約75個胺基酸至約80個胺基酸、約80個胺基酸至約200個胺基酸、約80個胺基酸至約195個胺基酸、約80個胺基酸至約190個胺基酸、約80個胺基酸至約185個胺基酸、約80個胺基酸至約180個胺基酸、約80個胺基酸至約175個胺基酸、約80個胺基酸至約170個胺基酸、約80個胺基酸至約165個胺基酸、約80個胺基酸至約160個胺基酸、約80個胺基酸至約155個胺基酸、約80個胺基酸至約150個胺基酸、約80個胺基酸至約145個胺基酸、約80個胺基酸至約140個胺基酸、約80個胺基酸至約135個胺基酸、約80個胺基酸至約130個胺基酸、約80個胺基酸至約125個胺基酸、約80個胺基酸至約120個胺基酸、約80個胺基酸至約115個胺基酸、約80個胺基酸至約110個胺基酸、約80個胺基酸至約105個胺基酸、約80個胺基酸至約100個胺基酸、約80個胺基酸至約95個胺基酸、約80個胺基酸至約90個胺基酸、約80個胺基酸至約85個胺基酸、約85個胺基酸至約200個胺基酸、約85個胺基酸至約195個胺基酸、約85個胺基酸至約190個胺基酸、約85個胺基酸至約185個胺基酸、約85個胺基酸至約180個胺基酸、約85個胺基酸至約175個胺基酸、約85個胺基酸至約170個胺基酸、約85個胺基酸至約165個胺基酸、約85個胺基酸至約160個胺基酸、約85個胺基酸至約155個胺基酸、約85個胺基酸至約150個胺基酸、約85個胺基酸至約145個胺基酸、約85個胺基酸至約140個胺基酸、約85個胺基酸至約135個胺基酸、約85個胺基酸至約130個胺基酸、約85個胺基酸至約125個胺基酸、約85個胺基酸至約120個胺基酸、約85個胺基酸至約115個胺基酸、約85個胺基酸至約110個胺基酸、約85個胺基酸至約105個胺基酸、約85個胺基酸至約100個胺基酸、約85個胺基酸至約95個胺基酸、約85個胺基酸至約90個胺基酸、約90個胺基酸至約200個胺基酸、約90個胺基酸至約195個胺基酸、約90個胺基酸至約190個胺基酸、約90個胺基酸至約185個胺基酸、約90個胺基酸至約180個胺基酸、約90個胺基酸至約175個胺基酸、約90個胺基酸至約170個胺基酸、約90個胺基酸至約165個胺基酸、約90個胺基酸至約160個胺基酸、約90個胺基酸至約155個胺基酸、約90個胺基酸至約150個胺基酸、約90個胺基酸至約145個胺基酸、約90個胺基酸至約140個胺基酸、約90個胺基酸至約135個胺基酸、約90個胺基酸至約130個胺基酸、約90個胺基酸至約125個胺基酸、約90個胺基酸至約120個胺基酸、約90個胺基酸至約115個胺基酸、約90個胺基酸至約110個胺基酸、約90個胺基酸至約105個胺基酸、約90個胺基酸至約100個胺基酸、約90個胺基酸至約95個胺基酸、約95個胺基酸至約200個胺基酸、約95個胺基酸至約195個胺基酸、約95個胺基酸至約190個胺基酸、約95個胺基酸至約185個胺基酸、約95個胺基酸至約180個胺基酸、約95個胺基酸至約175個胺基酸、約95個胺基酸至約170個胺基酸、約95個胺基酸至約165個胺基酸、約95個胺基酸至約160個胺基酸、約95個胺基酸至約155個胺基酸、約95個胺基酸至約150個胺基酸、約95個胺基酸至約145個胺基酸、約95個胺基酸至約140個胺基酸、約95個胺基酸至約135個胺基酸、約95個胺基酸至約130個胺基酸、約95個胺基酸至約125個胺基酸、約95個胺基酸至約120個胺基酸、約95個胺基酸至約115個胺基酸、約95個胺基酸至約110個胺基酸、約95個胺基酸至約105個胺基酸、約95個胺基酸至約100個胺基酸、約100個胺基酸至約200個胺基酸、約100個胺基酸至約195個胺基酸、約100個胺基酸至約190個胺基酸、約100個胺基酸至約185個胺基酸、約100個胺基酸至約180個胺基酸、約100個胺基酸至約175個胺基酸、約100個胺基酸至約170個胺基酸、約100個胺基酸至約165個胺基酸、約100個胺基酸至約160個胺基酸、約100個胺基酸至約155個胺基酸、約100個胺基酸至約150個胺基酸、約100個胺基酸至約145個胺基酸、約100個胺基酸至約140個胺基酸、約100個胺基酸至約135個胺基酸、約100個胺基酸至約130個胺基酸、約100個胺基酸至約125個胺基酸、約100個胺基酸至約120個胺基酸、約100個胺基酸至約115個胺基酸、約100個胺基酸至約110個胺基酸、約100個胺基酸至約105個胺基酸、約105個胺基酸至約200個胺基酸、約105個胺基酸至約195個胺基酸、約105個胺基酸至約190個胺基酸、約105個胺基酸至約185個胺基酸、約105個胺基酸至約180個胺基酸、約105個胺基酸至約175個胺基酸、約105個胺基酸至約170個胺基酸、約105個胺基酸至約165個胺基酸、約105個胺基酸至約160個胺基酸、約105個胺基酸至約155個胺基酸、約105個胺基酸至約150個胺基酸、約105個胺基酸至約145個胺基酸、約105個胺基酸至約140個胺基酸、約105個胺基酸至約135個胺基酸、約105個胺基酸至約130個胺基酸、約105個胺基酸至約125個胺基酸、約105個胺基酸至約120個胺基酸、約105個胺基酸至約115個胺基酸、約105個胺基酸至約110個胺基酸、約110個胺基酸至約200個胺基酸、約110個胺基酸至約195個胺基酸、約110個胺基酸至約190個胺基酸、約110個胺基酸至約185個胺基酸、約110個胺基酸至約180個胺基酸、約110個胺基酸至約175個胺基酸、約110個胺基酸至約170個胺基酸、約110個胺基酸至約165個胺基酸、約110個胺基酸至約160個胺基酸、約110個胺基酸至約155個胺基酸、約110個胺基酸至約150個胺基酸、約110個胺基酸至約145個胺基酸、約110個胺基酸至約140個胺基酸、約110個胺基酸至約135個胺基酸、約110個胺基酸至約130個胺基酸、約110個胺基酸至約125個胺基酸、約110個胺基酸至約120個胺基酸、約110個胺基酸至約115個胺基酸、約115個胺基酸至約200個胺基酸、約115個胺基酸至約195個胺基酸、約115個胺基酸至約190個胺基酸、約115個胺基酸至約185個胺基酸、約115個胺基酸至約180個胺基酸、約115個胺基酸至約175個胺基酸、約115個胺基酸至約170個胺基酸、約115個胺基酸至約165個胺基酸、約115個胺基酸至約160個胺基酸、約115個胺基酸至約155個胺基酸、約115個胺基酸至約150個胺基酸、約115個胺基酸至約145個胺基酸、約115個胺基酸至約140個胺基酸、約115個胺基酸至約135個胺基酸、約115個胺基酸至約130個胺基酸、約115個胺基酸至約125個胺基酸、約115個胺基酸至約120個胺基酸、約120個胺基酸至約200個胺基酸、約120個胺基酸至約195個胺基酸、約120個胺基酸至約190個胺基酸、約120個胺基酸至約185個胺基酸、約120個胺基酸至約180個胺基酸、約120個胺基酸至約175個胺基酸、約120個胺基酸至約170個胺基酸、約120個胺基酸至約165個胺基酸、約120個胺基酸至約160個胺基酸、約120個胺基酸至約155個胺基酸、約120個胺基酸至約150個胺基酸、約120個胺基酸至約145個胺基酸、約120個胺基酸至約140個胺基酸、約120個胺基酸至約135個胺基酸、約120個胺基酸至約130個胺基酸、約120個胺基酸至約125個胺基酸、約125個胺基酸至約200個胺基酸、約125個胺基酸至約195個胺基酸、約125個胺基酸至約190個胺基酸、約125個胺基酸至約185個胺基酸、約125個胺基酸至約180個胺基酸、約125個胺基酸至約175個胺基酸、約125個胺基酸至約170個胺基酸、約125個胺基酸至約165個胺基酸、約125個胺基酸至約160個胺基酸、約125個胺基酸至約155個胺基酸、約125個胺基酸至約150個胺基酸、約125個胺基酸至約145個胺基酸、約125個胺基酸至約140個胺基酸、約125個胺基酸至約135個胺基酸、約125個胺基酸至約130個胺基酸、約130個胺基酸至約200個胺基酸、約130個胺基酸至約195個胺基酸、約130個胺基酸至約190個胺基酸、約130個胺基酸至約185個胺基酸、約130個胺基酸至約180個胺基酸、約130個胺基酸至約175個胺基酸、約130個胺基酸至約170個胺基酸、約130個胺基酸至約165個胺基酸、約130個胺基酸至約160個胺基酸、約130個胺基酸至約155個胺基酸、約130個胺基酸至約150個胺基酸、約130個胺基酸至約145個胺基酸、約130個胺基酸至約140個胺基酸、約130個胺基酸至約135個胺基酸、約135個胺基酸至約200個胺基酸、約135個胺基酸至約195個胺基酸、約135個胺基酸至約190個胺基酸、約135個胺基酸至約185個胺基酸、約135個胺基酸至約180個胺基酸、約135個胺基酸至約175個胺基酸、約135個胺基酸至約170個胺基酸、約135個胺基酸至約165個胺基酸、約135個胺基酸至約160個胺基酸、約135個胺基酸至約155個胺基酸、約135個胺基酸至約150個胺基酸、約135個胺基酸至約145個胺基酸、約135個胺基酸至約140個胺基酸、約140個胺基酸至約200個胺基酸、約140個胺基酸至約195個胺基酸、約140個胺基酸至約190個胺基酸、約140個胺基酸至約185個胺基酸、約140個胺基酸至約180個胺基酸、約140個胺基酸至約175個胺基酸、約140個胺基酸至約170個胺基酸、約140個胺基酸至約165個胺基酸、約140個胺基酸至約160個胺基酸、約140個胺基酸至約155個胺基酸、約140個胺基酸至約150個胺基酸、約40個胺基酸至約145個胺基酸、約145個胺基酸至約200個胺基酸、約145個胺基酸至約195個胺基酸、約145個胺基酸至約190個胺基酸、約145個胺基酸至約185個胺基酸、約145個胺基酸至約180個胺基酸、約145個胺基酸至約175個胺基酸、約145個胺基酸至約170個胺基酸、約145個胺基酸至約165個胺基酸、約145個胺基酸至約160個胺基酸、約145個胺基酸至約155個胺基酸、約145個胺基酸至約150個胺基酸、約150個胺基酸至約200個胺基酸、約150個胺基酸至約195個胺基酸、約150個胺基酸至約190個胺基酸、約150個胺基酸至約185個胺基酸、約150個胺基酸至約180個胺基酸、約150個胺基酸至約175個胺基酸、約150個胺基酸至約170個胺基酸、約150個胺基酸至約165個胺基酸、約150個胺基酸至約160個胺基酸、約150個胺基酸至約155個胺基酸、約155個胺基酸至約200個胺基酸、約155個胺基酸至約195個胺基酸、約155個胺基酸至約190個胺基酸、約155個胺基酸至約185個胺基酸、約155個胺基酸至約180個胺基酸、約155個胺基酸至約175個胺基酸、約155個胺基酸至約170個胺基酸、約155個胺基酸至約165個胺基酸、約155個胺基酸至約160個胺基酸、約160個胺基酸至約200個胺基酸、約160個胺基酸至約195個胺基酸、約160個胺基酸至約190個胺基酸、約160個胺基酸至約185個胺基酸、約160個胺基酸至約180個胺基酸、約160個胺基酸至約175個胺基酸、約160個胺基酸至約170個胺基酸、約160個胺基酸至約165個胺基酸、約165個胺基酸至約200個胺基酸、約165個胺基酸至約195個胺基酸、約165個胺基酸至約190個胺基酸、約165個胺基酸至約185個胺基酸、約165個胺基酸至約180個胺基酸、約165個胺基酸至約175個胺基酸、約165個胺基酸至約170個胺基酸、約170個胺基酸至約200個胺基酸、約170個胺基酸至約195個胺基酸、約170個胺基酸至約190個胺基酸、約170個胺基酸至約185個胺基酸、約170個胺基酸至約180個胺基酸、約170個胺基酸至約175個胺基酸、約175個胺基酸至約200個胺基酸、約175個胺基酸至約195個胺基酸、約175個胺基酸至約190個胺基酸、約175個胺基酸至約185個胺基酸、約175個胺基酸至約180個胺基酸、約180個胺基酸至約200個胺基酸、約180個胺基酸至約195個胺基酸、約180個胺基酸至約190個胺基酸、約180個胺基酸至約185個胺基酸、約185個胺基酸至約200個胺基酸、約185個胺基酸至約195個胺基酸、約185個胺基酸至約190個胺基酸、約190個胺基酸至約200個胺基酸、約190個胺基酸至約195個胺基酸、約195個胺基酸至約200個胺基酸缺失。在野生型全長耳畸蛋白之蛋白的序列中缺失兩個或更多個胺基酸的一些實施例中，該兩個或更多個缺失胺基酸在野生型全長蛋白之序列中可為連續的。在野生型全長耳畸蛋白之蛋白的序列中缺失兩個或更多個胺基酸的其他實例中，該兩個或更多個缺失胺基酸在野生型全長蛋白之序列中不為連續的。熟習此項技術者應理解，來自不同物種之野生型全長耳畸蛋白之蛋白之間的不保守胺基酸可缺失而不會損失活性，而來自不同物種之野生型全長耳畸蛋白之蛋白之間的彼等保守胺基酸不應缺失，因為其更可能(比不同物種之間的不保守胺基酸)參與活性。
在一些實例中，活性耳畸蛋白之蛋白可例如包括野生型全長耳畸蛋白之蛋白的序列，該序列自其N末端及/或自其C末端移除1個胺基酸至約100個胺基酸、1個胺基酸至約95個胺基酸、1個胺基酸至約90個胺基酸、1個胺基酸至約85個胺基酸、1個胺基酸至約80個胺基酸、1個胺基酸至約75個胺基酸、1個胺基酸至約70個胺基酸、1個胺基酸至約65個胺基酸、1個胺基酸至約60個胺基酸、1個胺基酸至約55個胺基酸、1個胺基酸至約50個胺基酸、1個胺基酸至約45個胺基酸、1個胺基酸至約40個胺基酸、1個胺基酸至約35個胺基酸、1個胺基酸至約30個胺基酸、1個胺基酸至約25個胺基酸、1個胺基酸至約20個胺基酸、1個胺基酸至約15個胺基酸、1個胺基酸至約10個胺基酸、1個胺基酸至約9個胺基酸、1個胺基酸至約8個胺基酸、1個胺基酸至約7個胺基酸、1個胺基酸至約6個胺基酸、1個胺基酸至約5個胺基酸、1個胺基酸至約4個胺基酸、1個胺基酸至約3個胺基酸、約2個胺基酸至約100個胺基酸、約2個胺基酸至約95個胺基酸、約2個胺基酸至約90個胺基酸、約2個胺基酸至約85個胺基酸、約2個胺基酸至約80個胺基酸、約2個胺基酸至約75個胺基酸、約2個胺基酸至約70個胺基酸、約2個胺基酸至約65個胺基酸、約2個胺基酸至約60個胺基酸、約2個胺基酸至約55個胺基酸、約2個胺基酸至約50個胺基酸、約2個胺基酸至約45個胺基酸、約2個胺基酸至約40個胺基酸、約2個胺基酸至約35個胺基酸、約2個胺基酸至約30個胺基酸、約2個胺基酸至約25個胺基酸、約2個胺基酸至約20個胺基酸、約2個胺基酸至約15個胺基酸、約2個胺基酸至約10個胺基酸、約2個胺基酸至約9個胺基酸、約2個胺基酸至約8個胺基酸、約2個胺基酸至約7個胺基酸、約2個胺基酸至約6個胺基酸、約2個胺基酸至約5個胺基酸、約2個胺基酸至約4個胺基酸、約3個胺基酸至約100個胺基酸、約3個胺基酸至約95個胺基酸、約3個胺基酸至約90個胺基酸、約3個胺基酸至約85個胺基酸、約3個胺基酸至約80個胺基酸、約3個胺基酸至約75個胺基酸、約3個胺基酸至約70個胺基酸、約3個胺基酸至約65個胺基酸、約3個胺基酸至約60個胺基酸、約3個胺基酸至約55個胺基酸、約3個胺基酸至約50個胺基酸、約3個胺基酸至約45個胺基酸、約3個胺基酸至約40個胺基酸、約3個胺基酸至約35個胺基酸、約3個胺基酸至約30個胺基酸、約3個胺基酸至約25個胺基酸、約3個胺基酸至約20個胺基酸、約3個胺基酸至約15個胺基酸、約3個胺基酸至約10個胺基酸、約3個胺基酸至約9個胺基酸、約3個胺基酸至約8個胺基酸、約3個胺基酸至約7個胺基酸、約3個胺基酸至約6個胺基酸、約3個胺基酸至約5個胺基酸、約4個胺基酸至約100個胺基酸、約4個胺基酸至約95個胺基酸、約4個胺基酸至約90個胺基酸、約4個胺基酸至約85個胺基酸、約4個胺基酸至約80個胺基酸、約4個胺基酸至約75個胺基酸、約4個胺基酸至約70個胺基酸、約4個胺基酸至約65個胺基酸、約4個胺基酸至約60個胺基酸、約4個胺基酸至約55個胺基酸、約4個胺基酸至約50個胺基酸、約4個胺基酸至約45個胺基酸、約4個胺基酸至約40個胺基酸、約4個胺基酸至約35個胺基酸、約4個胺基酸至約30個胺基酸、約4個胺基酸至約25個胺基酸、約4個胺基酸至約20個胺基酸、約4個胺基酸至約15個胺基酸、約4個胺基酸至約10個胺基酸、約4個胺基酸至約9個胺基酸、約4個胺基酸至約8個胺基酸、約4個胺基酸至約7個胺基酸、約4個胺基酸至約6個胺基酸、約5個胺基酸至約100個胺基酸、約5個胺基酸至約95個胺基酸、約5個胺基酸至約90個胺基酸、約5個胺基酸至約85個胺基酸、約5個胺基酸至約80個胺基酸、約5個胺基酸至約75個胺基酸、約5個胺基酸至約70個胺基酸、約5個胺基酸至約65個胺基酸、約5個胺基酸至約60個胺基酸、約5個胺基酸至約55個胺基酸、約5個胺基酸至約50個胺基酸、約5個胺基酸至約45個胺基酸、約5個胺基酸至約40個胺基酸、約5個胺基酸至約35個胺基酸、約5個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約20個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約5個胺基酸至約10個胺基酸、約5個胺基酸至約9個胺基酸、約5個胺基酸至約8個胺基酸、約5個胺基酸至約7個胺基酸、約6個胺基酸至約100個胺基酸、約6個胺基酸至約95個胺基酸、約6個胺基酸至約90個胺基酸、約6個胺基酸至約85個胺基酸、約6個胺基酸至約80個胺基酸、約6個胺基酸至約75個胺基酸、約6個胺基酸至約70個胺基酸、約6個胺基酸至約65個胺基酸、約6個胺基酸至約60個胺基酸、約6個胺基酸至約55個胺基酸、約6個胺基酸至約50個胺基酸、約6個胺基酸至約45個胺基酸、約6個胺基酸至約40個胺基酸、約6個胺基酸至約35個胺基酸、約6個胺基酸至約30個胺基酸、約6個胺基酸至約25個胺基酸、約6個胺基酸至約20個胺基酸、約6個胺基酸至約15個胺基酸、約6個胺基酸至約10個胺基酸、約6個胺基酸至約9個胺基酸、約6個胺基酸至約8個胺基酸、約7個胺基酸至約100個胺基酸、約7個胺基酸至約95個胺基酸、約7個胺基酸至約90個胺基酸、約7個胺基酸至約85個胺基酸、約7個胺基酸至約80個胺基酸、約7個胺基酸至約75個胺基酸、約7個胺基酸至約70個胺基酸、約7個胺基酸至約65個胺基酸、約7個胺基酸至約60個胺基酸、約7個胺基酸至約55個胺基酸、約7個胺基酸至約50個胺基酸、約7個胺基酸至約45個胺基酸、約7個胺基酸至約40個胺基酸、約7個胺基酸至約35個胺基酸、約7個胺基酸至約30個胺基酸、約7個胺基酸至約25個胺基酸、約7個胺基酸至約20個胺基酸、約7個胺基酸至約15個胺基酸、約7個胺基酸至約10個胺基酸、約7個胺基酸至約9個胺基酸、約8個胺基酸至約100個胺基酸、約8個胺基酸至約95個胺基酸、約8個胺基酸至約90個胺基酸、約8個胺基酸至約85個胺基酸、約8個胺基酸至約80個胺基酸、約8個胺基酸至約75個胺基酸、約8個胺基酸至約70個胺基酸、約8個胺基酸至約65個胺基酸、約8個胺基酸至約60個胺基酸、約8個胺基酸至約55個胺基酸、約8個胺基酸至約50個胺基酸、約8個胺基酸至約45個胺基酸、約8個胺基酸至約40個胺基酸、約8個胺基酸至約35個胺基酸、約8個胺基酸至約30個胺基酸、約8個胺基酸至約25個胺基酸、約8個胺基酸至約20個胺基酸、約8個胺基酸至約15個胺基酸、約8個胺基酸至約10個胺基酸、約10個胺基酸至約100個胺基酸、約10個胺基酸至約95個胺基酸、約10個胺基酸至約90個胺基酸、約10個胺基酸至約85個胺基酸、約10個胺基酸至約80個胺基酸、約10個胺基酸至約75個胺基酸、約10個胺基酸至約70個胺基酸、約10個胺基酸至約65個胺基酸、約10個胺基酸至約60個胺基酸、約10個胺基酸至約55個胺基酸、約10個胺基酸至約50個胺基酸、約10個胺基酸至約45個胺基酸、約10個胺基酸至約40個胺基酸、約10個胺基酸至約35個胺基酸、約10個胺基酸至約30個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約10個胺基酸至約20個胺基酸、約10個胺基酸至約15個胺基酸、約20個胺基酸至約100個胺基酸、約20個胺基酸至約95個胺基酸、約20個胺基酸至約90個胺基酸、約20個胺基酸至約85個胺基酸、約20個胺基酸至約80個胺基酸、約20個胺基酸至約75個胺基酸、約20個胺基酸至約70個胺基酸、約20個胺基酸至約65個胺基酸、約20個胺基酸至約60個胺基酸、約20個胺基酸至約55個胺基酸、約20個胺基酸至約50個胺基酸、約20個胺基酸至約45個胺基酸、約20個胺基酸至約40個胺基酸、約20個胺基酸至約35個胺基酸、約20個胺基酸至約30個胺基酸、約20個胺基酸至約25個胺基酸、約30個胺基酸至約100個胺基酸、約30個胺基酸至約95個胺基酸、約30個胺基酸至約90個胺基酸、約30個胺基酸至約85個胺基酸、約30個胺基酸至約80個胺基酸、約30個胺基酸至約75個胺基酸、約30個胺基酸至約70個胺基酸、約30個胺基酸至約65個胺基酸、約30個胺基酸至約60個胺基酸、約30個胺基酸至約55個胺基酸、約30個胺基酸至約50個胺基酸、約30個胺基酸至約45個胺基酸、約30個胺基酸至約40個胺基酸、約30個胺基酸至約35個胺基酸、約40個胺基酸至約100個胺基酸、約40個胺基酸至約95個胺基酸、約40個胺基酸至約90個胺基酸、約40個胺基酸至約85個胺基酸、約40個胺基酸至約80個胺基酸、約40個胺基酸至約75個胺基酸、約40個胺基酸至約70個胺基酸、約40個胺基酸至約65個胺基酸、約40個胺基酸至約60個胺基酸、約40個胺基酸至約55個胺基酸、約40個胺基酸至約50個胺基酸、約40個胺基酸至約45個胺基酸、約50個胺基酸至約100個胺基酸、約50個胺基酸至約95個胺基酸、約50個胺基酸至約90個胺基酸、約50個胺基酸至約85個胺基酸、約50個胺基酸至約80個胺基酸、約50個胺基酸至約75個胺基酸、約50個胺基酸至約70個胺基酸、約50個胺基酸至約65個胺基酸、約50個胺基酸至約60個胺基酸、約50個胺基酸至約55個胺基酸、約60個胺基酸至約100個胺基酸、約60個胺基酸至約95個胺基酸、約60個胺基酸至約90個胺基酸、約60個胺基酸至約85個胺基酸、約60個胺基酸至約80個胺基酸、約60個胺基酸至約75個胺基酸、約60個胺基酸至約70個胺基酸、約60個胺基酸至約65個胺基酸、約70個胺基酸至約100個胺基酸、約70個胺基酸至約95個胺基酸、約70個胺基酸至約90個胺基酸、約70個胺基酸至約85個胺基酸、約70個胺基酸至約80個胺基酸、約70個胺基酸至約75個胺基酸、約80個胺基酸至約100個胺基酸、約80個胺基酸至約95個胺基酸、約80個胺基酸至約90個胺基酸、約80個胺基酸至約85個胺基酸、約90個胺基酸至約100個胺基酸、約90個胺基酸至約95個胺基酸或約95個胺基酸至約100個胺基酸。
在一些實施例中，活性耳畸蛋白之蛋白可例如包括野生型全長耳畸蛋白之蛋白的序列，其中插入1個胺基酸至50個胺基酸、1個胺基酸至45個胺基酸、1個胺基酸至40個胺基酸、1個胺基酸至35個胺基酸、1個胺基酸至30個胺基酸、1個胺基酸至25個胺基酸、1個胺基酸至20個胺基酸、1個胺基酸至15個胺基酸、1個胺基酸至10個胺基酸、1個胺基酸至9個胺基酸、1個胺基酸至8個胺基酸、1個胺基酸至7個胺基酸、1個胺基酸至6個胺基酸、1個胺基酸至5個胺基酸、1個胺基酸至4個胺基酸、1個胺基酸至3個胺基酸、約2個胺基酸至50個胺基酸、約2個胺基酸至45個胺基酸、約2個胺基酸至40個胺基酸、約2個胺基酸至35個胺基酸、約2個胺基酸至30個胺基酸、約2個胺基酸至25個胺基酸、約2個胺基酸至20個胺基酸、約2個胺基酸至15個胺基酸、約2個胺基酸至10個胺基酸、約2個胺基酸至9個胺基酸、約2個胺基酸至8個胺基酸、約2個胺基酸至7個胺基酸、約2個胺基酸至6個胺基酸、約2個胺基酸至5個胺基酸、約2個胺基酸至4個胺基酸、約3個胺基酸至50個胺基酸、約3個胺基酸至45個胺基酸、約3個胺基酸至40個胺基酸、約3個胺基酸至35個胺基酸、約3個胺基酸至30個胺基酸、約3個胺基酸至25個胺基酸、約3個胺基酸至20個胺基酸、約3個胺基酸至15個胺基酸、約3個胺基酸至10個胺基酸、約3個胺基酸至9個胺基酸、約3個胺基酸至8個胺基酸、約3個胺基酸至7個胺基酸、約3個胺基酸至6個胺基酸、約3個胺基酸至5個胺基酸、約4個胺基酸至50個胺基酸、約4個胺基酸至45個胺基酸、約4個胺基酸至40個胺基酸、約4個胺基酸至35個胺基酸、約4個胺基酸至30個胺基酸、約4個胺基酸至25個胺基酸、約4個胺基酸至20個胺基酸、約4個胺基酸至15個胺基酸、約4個胺基酸至10個胺基酸、約4個胺基酸至9個胺基酸、約4個胺基酸至8個胺基酸、約4個胺基酸至7個胺基酸、約4個胺基酸至6個胺基酸、約5個胺基酸至50個胺基酸、約5個胺基酸至45個胺基酸、約5個胺基酸至40個胺基酸、約5個胺基酸至35個胺基酸、約5個胺基酸至30個胺基酸、約5個胺基酸至25個胺基酸、約5個胺基酸至20個胺基酸、約5個胺基酸至15個胺基酸、約5個胺基酸至10個胺基酸、約5個胺基酸至9個胺基酸、約5個胺基酸至8個胺基酸、約5個胺基酸至7個胺基酸、約6個胺基酸至50個胺基酸、約6個胺基酸至45個胺基酸、約6個胺基酸至40個胺基酸、約6個胺基酸至35個胺基酸、約6個胺基酸至30個胺基酸、約6個胺基酸至25個胺基酸、約6個胺基酸至20個胺基酸、約6個胺基酸至15個胺基酸、約6個胺基酸至10個胺基酸、約6個胺基酸至9個胺基酸、約6個胺基酸至8個胺基酸、約7個胺基酸至50個胺基酸、約7個胺基酸至45個胺基酸、約7個胺基酸至40個胺基酸、約7個胺基酸至35個胺基酸、約7個胺基酸至30個胺基酸、約7個胺基酸至25個胺基酸、約7個胺基酸至20個胺基酸、約7個胺基酸至15個胺基酸、約7個胺基酸至10個胺基酸、約7個胺基酸至9個胺基酸、約8個胺基酸至50個胺基酸、約8個胺基酸至45個胺基酸、約8個胺基酸至40個胺基酸、約8個胺基酸至35個胺基酸、約8個胺基酸至30個胺基酸、約8個胺基酸至25個胺基酸、約8個胺基酸至20個胺基酸、約8個胺基酸至15個胺基酸、約8個胺基酸至10個胺基酸、約10個胺基酸至50個胺基酸、約10個胺基酸至45個胺基酸、約10個胺基酸至40個胺基酸、約10個胺基酸至35個胺基酸、約10個胺基酸至30個胺基酸、約10個胺基酸至25個胺基酸、約10個胺基酸至20個胺基酸、約10個胺基酸至15個胺基酸、約15個胺基酸至50個胺基酸、約15個胺基酸至45個胺基酸、約15個胺基酸至40個胺基酸、約15個胺基酸至35個胺基酸、約15個胺基酸至30個胺基酸、約15個胺基酸至25個胺基酸、約15個胺基酸至20個胺基酸、約20個胺基酸至50個胺基酸、約20個胺基酸至45個胺基酸、約20個胺基酸至40個胺基酸、約20個胺基酸至35個胺基酸、約20個胺基酸至30個胺基酸、約20個胺基酸至25個胺基酸、約25個胺基酸至50個胺基酸、約25個胺基酸至45個胺基酸、約25個胺基酸至40個胺基酸、約25個胺基酸至35個胺基酸、約25個胺基酸至30個胺基酸、約30個胺基酸至50個胺基酸、約30個胺基酸至45個胺基酸、約30個胺基酸至40個胺基酸、約30個胺基酸至35個胺基酸、約35個胺基酸至50個胺基酸、約35個胺基酸至45個胺基酸、約35個胺基酸至40個胺基酸、約40個胺基酸至50個胺基酸、約40個胺基酸至45個胺基酸或約45個胺基酸至約50個胺基酸。在一些實例中，可將插入胺基酸以連續序列插入野生型全長蛋白之序列中。在一些實例中，將胺基酸以連續序列插入野生型全長蛋白之序列中。如此項技術中可瞭解，可將胺基酸插入野生型全長蛋白之序列中不為物種之間完全保守的一部分中。
範圍：在整個本揭示案中，本揭示案之各種態樣可以範圍格式來呈現。應瞭解，範圍格式之描述僅為方便及簡潔，而不應視為對本揭示案範圍之不靈活限制。因此，應將範圍之描述視為特別揭示所有可能之亞範圍以及該範圍內之個別數值。例如，範圍諸如1至6之描述應視為已特別揭示亞範圍諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及該範圍內之個別數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作為另一實例，諸如95-99%一致性之範圍包括95%、96%、97%、98%或99%一致性，且包括亞範圍諸如96-99%、96-98%、96-97%、97-99%、97-98%及98-99%一致性。無論範圍之廣度如何，此均適用。
在一態樣中，本揭示案提供SEQ ID NO: 96之重組AAV載體。在一態樣中，本揭示案提供SEQ ID NO: 105之重組AAV載體。
在一態樣中，本揭示案提供一種重組AAV載體，其按5'至3'之順序包含：SEQ ID NO: 97之5' ITR序列；CAG啟動子，其包含SEQ ID NO: 98之CMV早期增強子元件、SEQ ID NO: 99之雞β肌動蛋白基因序列及SEQ ID NO: 100之嵌合內含子；包含OTOF cDNA之外顯子1至(及貫穿至(and through)) 21的5'OTOF編碼區；    SEQ ID NO: 102之SD內含子序列；SEQ ID NO: 103之AK致重組序列；及 SEQ ID NO: 104之3' ITR序列。在一些實施例中，5'OTOF編碼區為SEQ ID NO: 101。在一些實施例中，5'OTOF編碼區與SEQ ID NO: 101至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%一致，且編碼與SEQ ID NO: 101所編碼相同之胺基酸序列。
在一態樣中，本揭示案提供一種重組AAV載體，其按5'至3'之順序包含：SEQ ID NO: 97之5' ITR序列；SEQ ID NO: 103之AK致重組序列；SEQ ID NO: 106之SA內含子序列；包含OTOF cDNA之外顯子22至(及貫穿至)外顯子48的3' OTOF編碼區；SEQ ID NO: 108之bgH polyA序列；及SEQ ID NO: 104之3' ITR序列。在一些實施例中，3'OTOF編碼區為SEQ ID NO: 107。在一些實施例中，3'OTOF編碼區與SEQ ID NO: 107至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%一致，且編碼與SEQ ID NO: 107所編碼相同之胺基酸序列。
在一態樣中，本揭示案提供一種rAAV粒子，其包含用Anc80衣殼殼體化之前述重組AAV載體中之一者。在一些實施例中，Anc80衣殼包含SEQ ID NO: 109之多肽。
在一態樣中，本揭示案提供一種組成物，其包含：包含SEQ ID NO: 96之重組AAV載體的第一rAAV粒子及包含SEQ ID NO: 105之重組AAV載體的第二rAAV粒子。在一些實施例中，第一rAAV粒子之重組AAV載體用Anc80衣殼殼體化。在一些實施例中，第二rAAV粒子之重組AAV載體用Anc80衣殼殼體化。在一些實施例中，第一及第二rAAV粒子之重組AAV載體各自獨立地用Anc80衣殼殼體化。在一些實施例中，Anc80衣殼包含SEQ ID NO: 109之多肽。
在一態樣中，本揭示案提供一種組成物，其包含(a)包含重組AAV載體之第一rAAV粒子，該重組AAV載體按5'至3'之順序包含：SEQ ID NO: 97之5' ITR序列；CAG啟動子，其包含SEQ ID NO: 98之CMV早期增強子元件、SEQ ID NO: 99之雞β肌動蛋白基因序列及SEQ ID NO: 100之嵌合內含子；包含OTOF cDNA之外顯子1至(及貫穿至) 21的5'OTOF編碼區；SEQ ID NO: 102之SD內含子序列；SEQ ID NO: 103之AK致重組序列；及 SEQ ID NO: 104之3' ITR序列；及 (b)包含重組AAV載體之第二rAAV粒子，該重組AAV載體包含SEQ ID NO: 97之5' ITR序列；SEQ ID NO: 103之AK致重組序列；SEQ ID NO: 106之SA內含子序列；包含OTOF cDNA之外顯子22至(及貫穿至)外顯子48的3' OTOF編碼區；SEQ ID NO: 108之bgH polyA序列；及SEQ ID NO: 104之3' ITR序列。在一些實施例中，5'OTOF編碼區為SEQ ID NO: 101。在一些實施例中，5'OTOF編碼區與SEQ ID NO: 101至少70%一致，且與SEQ ID NO: 101編碼相同胺基酸序列。在一些實施例中，3'OTOF編碼區為SEQ ID NO: 107。在一些實施例中，3'OTOF編碼區與SEQ ID NO: 107至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%或100%一致，且編碼與SEQ ID NO: 107所編碼相同之胺基酸序列。在一些實施例中，第一及第二rAAV粒子中之重組AAV載體各自獨立地用Anc80衣殼殼體化。在一些實施例中，Anc80衣殼包含SEQ ID NO: 109之多肽。
在一態樣中，當將前述組成物引入人類細胞中時，第一及第二rAAV粒子之重組AAV載體彼此發生多聯化或同源重組，從而在細胞內形成編碼全長耳畸蛋白之蛋白的重組核酸。
在一態樣中，本揭示案提供一種方法，其包含向哺乳動物(例如，人類)之耳蝸中引入治療有效量之前述組成物中之任一者。在一些實施例中，哺乳動物先前已鑑別為具有缺陷耳畸蛋白基因。
在一態樣中，本揭示案提供一種增加哺乳動物細胞中全長耳畸蛋白之蛋白之表現的方法，該方法包含將前述組成物中之任一者引入該哺乳動物細胞，例如內毛細胞，例如人類細胞中。在一些實施例中，先前已確定哺乳動物細胞具有缺陷耳畸蛋白基因。
在一態樣中，本揭示案提供一種增加哺乳動物例如人類耳蝸中內毛細胞中全長耳畸蛋白之蛋白之表現的方法，該方法包含將治療有效量之前述組成物中之任一者引入哺乳動物耳蝸中。在一些實施例中，哺乳動物先前已鑑別為具有缺陷型耳畸蛋白基因。
在一態樣中，本揭示案提供一種治療鑑別為具有缺陷耳畸蛋白基因之個體，例如人類的非症狀性感覺神經性聽力損失的方法，該方法包含向個體之耳蝸中投與治療有效量之前述組成物中之任一者。在一些實施例中，方法還包含在投與步驟之前，確定個體具有缺陷耳畸蛋白基因。在一些實施例中，使用微導管向耳蝸投與組成物。在一些實施例中，微導管經成形以使得其可經由外耳道進入中耳腔且使微導管之末端與RWM接觸。在一些實施例中，微導管之遠端包含至少一個直徑為10微米至1,000微米之微針。
在一態樣中，本揭示案提供一種包含前述組成物中任一者之套組。在一些實施例中，組成物預裝載在裝置例如微導管中。在一些實施例中，微導管經成形以使得其可經由外耳道進入中耳腔且使微導管之末端與RWM接觸。在一些實施例中，微導管之遠端包含至少一個直徑為10微米至1,000微米之微針。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本揭示案所屬技術之一般技術者通常所理解相同之含義。本文描述用於本揭示案之方法及材料；亦可使用此項技術已知之其他合適方法及材料。材料、方法及實例僅為說明性的，且不欲為限制性的。本文提及之所有公開案、專利申請案、專利、序列、資料庫條目及其他參考文獻以全文引用之方式併入。在衝突之情況下，以本說明書(包括定義)為準。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年2月21日提出申請之美國臨時專利申請案第62/979,792號之優先權，該案之全部內容以引用之方式併入本文中。序列表
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OTOF 中之突變引起DFNB9，一種隱性遺傳非症候群性語前聽力障礙。缺乏耳畸蛋白，即由OTOF 編碼之蛋白質，去除自聽覺內毛細胞(IHC)之快速胞吐作用。由於第一聽覺突觸處之神經傳遞受損，因此無聲音訊號傳遞至腦，從而解釋了重度耳聾。
發現當前主張之方法可使全長耳畸蛋白在內聽覺毛細胞中表現，且成功恢復聽力，其中在耳畸蛋白敲除小鼠中，ABR臨限值對於短音刺激為30 dB至70 dB，且對於純音為50 dB至90 dB。鑑於此發現，本文提供用於治療鑑別為具有缺陷耳畸蛋白基因之個體(例如，人類)的非症狀性感覺神經性聽力損失的組成物及方法。
本文提供包括至少兩種不同核酸載體之組成物，其中：該至少兩種不同載體中之每一者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，該等編碼部分中每一者之長度為至少30個胺基酸殘基，其中編碼部分中每一者之胺基酸序列可視情況與編碼部分中另一者之胺基酸序列部分重疊；至少兩種不同載體中單一載體均不編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)；編碼序列中之至少一者包含跨越耳畸蛋白基因體DNA之兩個相鄰外顯子的核苷酸序列，且缺乏兩個相鄰外顯子之間的內含子序列；且當引入哺乳動物細胞中時，至少兩種不同載體彼此進行同源重組，從而形成重組核酸，其中該重組核酸編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)。在一些實例中，編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)的重組核酸以游離基因體形式存在於哺乳動物細胞(例如，本文所述哺乳動物細胞類型中之任一者)中。亦提供包括本文所述組成物中任一者之套組。本文亦提供包括將治療有效量之本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物耳蝸中之方法。
本文亦提供增加哺乳動物細胞中活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)之表現的方法，該等方法包括將本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物細胞中。本文亦提供增加哺乳動物耳蝸中內毛細胞中活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)之表現的方法，該等方法包括將治療有效量之本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物耳蝸中。本文亦提供治療鑑別為具有缺陷耳畸蛋白基因之個體的非症狀性感覺神經性聽力損失的方法，該等方法包括向個體之耳蝸中投與治療有效量之本文所述組成物中之任一者。
組成物、套組及方法之其他非限制性態樣在本文中描述，且可無限制地以任何組合使用。耳畸蛋白
人類OTOF 基因編碼耳畸蛋白，耳畸蛋白為在一些實施例中，在聲音編碼期間在內毛細胞突觸之突觸囊泡的激發、融合及/或補充中起關鍵作用的蛋白質。迄今為止，已鑑別出人類OTOF 基因中之數百種突變引起重度語前耳聾DFNB9。此類突變為不同人群中出生時患有體染色體隱性遺傳非症候群性耳聾之人中2-8%耳聾的原因 (Rodríguez-Ballesteros等人，(2008) Hum. Mutat. 29 823-831；Choi 等人，(2009) Clinical Genetics 75 237-243；Duman等人，(2011) Genet Test Mol Biomarkers 15 29-33；Varga 等人，(2006) J Med Genet 43 576-581；Iwasa 等人，(2013) BMC Med. Genet. 14 95)。雙對偶基因耳畸蛋白基因突變引起毛細胞與聽覺神經之間的局部突觸傳遞缺陷。耳畸蛋白使感覺細胞響應於聲音刺激釋放神經遞質以活化聽覺神經元，且彼等神經元將電子編碼之聽覺資訊帶至腦以產生「聽力」。當OTOF中存在雙對偶基因突變時，該傳遞受損，因此，大多數個體患有先天性嚴重至重度感覺神經性聽力損失。例如，在耳畸蛋白之保守C2C域中，外顯子15中第490位及第515位之兩個取代引起DFNB9 (Mirqhomizadeh等人，(2002) Neurobiol. Dis. 10(2): 157-164)。Migliosi等人在患有語前非症候群性聽力損失之西班牙個體中發現OTOF中之新穎突變Q829X (Migliosi等人，(2002) J. Med. Genet. 39(7): 502-506)。
在患有聽力損失之個體中偵測耳畸蛋白基因中之其他例示性突變以及編碼耳畸蛋白之核酸的測序方法描述於例如Rodriguez-Ballesteros等人，(2003) Hum Mutat. 22: 451-456；Wang等人，(2010) BMC Med Genet. 11:79；Yildirim-Baylan等人，(2014) Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol 78: 950-953；Choi等人，(2009) Clin. Genet. 75(3): 237-243；及Marlin等人，(2010) Biochem Biophys Res Commun 394: 737-742中。
至少在生命之前十年，DFNB9個體之光聲發射為正常的，此指示內耳形態完整且外毛細胞功能正常。除缺乏突觸傳遞及隨後突觸損失以外，至少在人類生命之前十年期間，DFNB9中保留內耳之形態及生理學。因此，在一些實施例中，OTOF 及/或耳畸蛋白功能之恢復可用於減輕或預防一或多個耳蝸結構之繼發性退化。
小鼠模型中之研究揭示，突觸結構正常，且出生後第一週內之小鼠中IHC保留正常突觸數目。在P6與P15之間，約一半突觸損失(Roux等人，(2006) Cell 127 277-289)。動物模型允許藉由記錄囊泡融合後質膜電容之變化及聽覺神經之活性來研究耳畸蛋白中之突變對突觸傳遞的影響。在耳畸蛋白敲除(Otof-/-)小鼠中，藉由去極化誘導Ca2+流過電壓門控之Ca2+通道幾乎未能在IHC中觸發胞吐作用(Roux等人，(2006) Cell 127 277-289)。在C2F域中存在隨機點突變之重度聽力受損Pachanga (OtofPga/Pga)小鼠中，IHC之短時間(＜10 ms)去極化引發與野生型小鼠類似大小之囊泡融合，然而，持續刺激發現向易釋放池補充囊泡方面存在嚴重缺陷(Pangrsic等人，(2010) Nat. Neurosci. 13 869-876)。在僅聽力臨限值輕微提高，但言語理解嚴重降低且患有溫度依賴性耳聾之人類個體中發現的p.Ile515Thr突變(Varga等人，(2006) J Med Genet 43 576-581)在小鼠模型中進行研究時發現中間表現型(Strenzke等人，(2016) EMBO J. 35:2519-2535)。當藉由ABR評定時，此等OtofI515T/I515T小鼠展示聽力臨限值中度升高且I波振幅降低，但行為測試中之聽覺臨限值及單個聽覺神經單元之記錄正常。同樣，RRP之胞吐作用完整，但持續胞吐作用減少，儘管不如OtofPga/Pga中嚴重。在室溫下在野生型小鼠中，在持續刺激期間，各活性區處每秒可融合750個囊泡，而在OtofI515T/I515T小鼠中，該速率降至350個囊泡/s/活性區，且在OtofPga/Pga IHC中，該速率降至200個囊泡/s/活性區(Pangrsic等人，(2010) Nat. Neurosci. 13 869-876；Strenzke等人，(2016) EMBO J. 35 2519-2535)。此與IHC質膜處耳畸蛋白之蛋白的水準減少相關，從而指示耳畸蛋白之量隨胞吐作用及聽力而增加(Strenzke等人(2016)EMBO J. 35 2519-2535)。
偵測基因中之突變的方法為此項技術中眾所周知。此類技術之非限制性實例包括：即時聚合酶鏈反應(RT-PCR)、PCR、測序、Southern印跡及Northern印跡。
OTOF基因編碼耳畸蛋白，即參與耳蝸毛細胞中突觸囊泡胞吐作用之蛋白(參見例如Johnson及Chapman (2010) J. Cell Biol. 191(1):187-198；及Heidrych等人，(2008) Hum. Mol. Genet. 17:3814-3821)。
人類OTOF基因位於2p23.3染色體上。其含有48個外顯子，涵蓋約132千鹼基(kb)(NCBI登錄號NG009937.1)。編碼腦中表現之耳畸蛋白之長形式的mRNA包括48個外顯子(Yasunaga等人，Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000)。Yasunaga等人，Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000之表2中描述可用於擴增OTOF基因中48個外顯子的正向及反向引子。在一些實例中，全長OTOF蛋白為全長野生型OTOF蛋白。由人類OTOF基因表現之全長野生型OTOF蛋白的長度為1997個殘基。
例示性人類野生型耳畸蛋白之蛋白為或包括SEQ ID NO: 1-5中任一者之序列。人類耳畸蛋白之蛋白的同功型e (SEQ ID NO: 5)由包括耳畸蛋白基因之外顯子48且不包括外顯子47之mRNA編碼(Yasunaga等人，Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000)。在一些實施例中，活性耳畸蛋白之蛋白具有SEQ ID NO: 5之序列，但缺少Strenzke等人，EMBO J. 35(23):2499-2615, 2016中鑑別之包括RXR模體的20個胺基酸。編碼野生型耳畸蛋白之蛋白的核酸的非限制性實例為或包括SEQ ID NO: 7-11中之任一者。如此項技術中可瞭解，可對SEQ ID NO: 7-11中之至少一些或全部密碼子進行密碼子最佳化以允許在非人類哺乳動物或人類中最佳表現。人類耳畸蛋白之蛋白的異種同源物為此項技術所已知。人類耳畸蛋白之蛋白 cDNA 序列： 人類典型 ( 長 ) 同功型序列 ( 耳畸蛋白之蛋白 ) (SEQ ID NO: 1)(亦稱為耳畸蛋白同功型a)(NCBI登錄號AAD26117.1)人類同功型 2 ( 短 1)( 耳畸蛋白之蛋白 ) (SEQ ID NO: 2)(亦稱為耳畸蛋白同功型d)(NCBI登錄號NP_919304.1)人類同功型 3 ( 短 2)( 耳畸蛋白之蛋白 ) (SEQ ID NO: 3)(亦稱為耳畸蛋白同功型c)(NCBI登錄號NP_919303.1)人類同功型 4 ( 短 3)( 耳畸蛋白之蛋白 ) (SEQ ID NO: 4)(亦稱為耳畸蛋白同功型b)(NCBI登錄號NP_004793.2)人類同功型 5 ( 短 4)( 耳畸蛋白之蛋白 ) (SEQ ID NO: 5)(亦稱為耳畸蛋白同功型e)(NCBI登錄號NP_001274418.1)完整 cds ( 耳畸蛋白 cDNA) (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF107403.1) (SEQ ID NO: 6)(編碼SEQ ID NO: 1之蛋白)人類耳畸蛋白轉錄本變體 1 (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194248.2) (SEQ ID NO: 7)(編碼SEQ ID NO: 1之蛋白)人類耳畸蛋白轉錄本變體 2 (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004802.3) (SEQ ID NO: 8) (編碼SEQ ID NO: 4之蛋白)人類耳畸蛋白轉錄本變體 3 (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194322.2) (SEQ ID NO: 9) (編碼SEQ ID NO: 3之蛋白)人類耳畸蛋白轉錄本變體 4 (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194323.2) (SEQ ID NO: 10) (編碼SEQ ID NO: 2之蛋白)人類耳畸蛋白轉錄本變體 5 (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001287489.1) (SEQ ID NO: 11) (編碼SEQ ID NO: 5之蛋白)
人類野生型耳畸蛋白基因體DNA序列之非限制性實例為SEQ ID NO: 12。SEQ ID NO: 12中之外顯子為：核苷酸位置5001-5206 (外顯子1)、核苷酸位置25925-25983 (外顯子2)、核苷酸位置35779-35867 (外顯子3)、核苷酸位置44590-44689 (外顯子4)、核苷酸位置47100-47281 (外顯子5)、核苷酸位置59854-59927 (外顯子6)、核苷酸位置61273-61399 (外顯子7)、核苷酸位置61891-61945 (外顯子8)、核苷酸位置68626-68757(外顯子9)、核苷酸位置73959-74021 (外顯子10)、核苷酸位置74404-74488 (外顯子11)、核苷酸位置79066-79225 (外顯子12)、核苷酸位置80051-80237 (外顯子13)、核苷酸位置81107-81293 (外顯子14)、核苷酸位置82690-82913 (外顯子15)、核苷酸位置83388-83496 (外顯子16)、核苷酸位置84046-84226 (外顯子17)、核苷酸位置84315-84435 (外顯子18)、核苷酸位置85950-86050 (外顯子19)、核苷酸位置86193-86283 (外顯子20)、核苷酸位置86411-86527 (外顯子21)、核苷酸位置86656-86808 (外顯子22)、核苷酸位置87382-87571 (外顯子23)、核苷酸位置87661-87785 (外顯子24)、核苷酸位置88206-88340 (外顯子25)、核苷酸位置89025-89186 (外顯子26)、核苷酸位置89589-89708 (外顯子27)、核苷酸位置90132-90293 (外顯子28)、核苷酸位置90405-90567 (外顯子29)、核苷酸位置91050-91180 (外顯子30)、核苷酸位置92549-92578 (外顯子31)、核苷酸位置92978-93106 (外顯子32)、核苷酸位置95225-95291 (外顯子33)、核苷酸位置96198-96334 (外顯子34)、核苷酸位置96466-96600 (外顯子35)、核苷酸位置 96848-96985 (外顯子36)、核苷酸位置97623-97750 (外顯子37)、核苷酸位置97857-98027 (外顯子38)、核苷酸位置98670-98830 (外顯子39)、核苷酸位置99593-99735 (外顯子40)、核苷酸位置100128-100216 (外顯子41)、核苷酸位置101518-101616 (外顯子42)、核苷酸位置101762-102003 (外顯子43)、核苷酸位置102669-102847 (外顯子44)、核苷酸位置102952-103052 (外顯子45)、核苷酸位置103494-103691 (外顯子46)、核苷酸位置105479-106496 (外顯子47)及外顯子48 (該序列以CCGGCCCGAC起始；亦參見Yasunaga等人，Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000中此外顯子之描述)。
內含子位於SEQ ID NO: 12中每個相鄰外顯子對之間，亦即在核苷酸位置100-5001 (內含子1)、核苷酸5207-25924 (內含子2)、核苷酸位置25984-35778 (內含子3)、核苷酸位置35868-44589 (內含子4)、核苷酸位置44690-47099 (內含子5)、核苷酸位置47282-59853(內含子6)、核苷酸位置59928-61272 (內含子7)、核苷酸位置61400-61890 (內含子8)、核苷酸位置61946-68625 (內含子9)、核苷酸位置68758-73958 (內含子10)、核苷酸位置74022-74403 (內含子11)、核苷酸位置74489-79065 (內含子12)、核苷酸位置79226-80050 (內含子13)、核苷酸位置80238-81106 (內含子14)、核苷酸位置81294-82689 (內含子15)、核苷酸位置82914-83387 (內含子16)、核苷酸位置83497-84045 (內含子17)、核苷酸位置84227-84314 (內含子18)、核苷酸位置84436-85949 (內含子19)、核苷酸位置86051-86192 (內含子20)、核苷酸位置86284-86410 (內含子21)、核苷酸位置86528-86655 (內含子22)、核苷酸位置86809-87381 (內含子23)、核苷酸位置87572-87660 (內含子24)、核苷酸位置87786-88205 (內含子25)、核苷酸位置88341-89024 (內含子26)、核苷酸位置89187-89588 (內含子27)、核苷酸位置89709-90131 (內含子28)、核苷酸位置90294-90404 (內含子29)、核苷酸位置90568-91049 (內含子30)、核苷酸位置91181-92548 (內含子31)、核苷酸位置92579-92977 (內含子32)、核苷酸位置93107-95224 (內含子33)、核苷酸位置95292-96197 (內含子34)、核苷酸位置96335-96465 (內含子35)、核苷酸位置96601-96847 (內含子36)、核苷酸位置96986-97622 (內含子37)、核苷酸位置97751-97856 (內含子38)、核苷酸位置98028-98669 (內含子39)、核苷酸位置98831-99592 (內含子40)、核苷酸位置99736-100127 (內含子41)、核苷酸位置100217-101517 (內含子42)、核苷酸位置101617-101761 (內含子43)、核苷酸位置102004-102668 (內含子44)、核苷酸位置102848-102951 (內含子45)、核苷酸位置103053-103494 (內含子46)、核苷酸位置103692-105478 (內含子47)及核苷酸位置106497-108496 (內含子48)。
在一些實施例中，耳畸蛋白基因可在任何適當外顯子及/或內含子之間或之內分成兩個或更多個區段，其中各區段包括在本揭示案之不同載體中。在一些實施例中，耳畸蛋白基因在外顯子21處分裂，亦即外顯子1至(及貫穿至) 21在第一載體中，且外顯子22至(及貫穿至)外顯子48在第二載體中。在一些此類實施例中，第一及第二載體中之耳畸蛋白區段來源於耳畸蛋白cDNA序列，且缺乏內含子，亦即外顯子1至(及貫穿至) 21在第一載體中，且外顯子22至(及貫穿至)外顯子48在第二載體中，各載體缺乏耳畸蛋白內含子。在一些實施例中，耳畸蛋白基因可在一或多個其他外顯子及/或內含子處分裂，只要在與載體之所有其他組分組合時，未超過載體之包裝能力即可。人類耳畸蛋白基因序列 (ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/224465243) (SEQ ID NO: 12)小鼠耳畸蛋白之蛋白 (SEQ ID NO: 13) (NCBI登錄號NP_001300696.1)小鼠耳畸蛋白 cDNA (SEQ ID NO: 14) (NCBI登錄號NM_001313767.1)小鼠耳畸蛋白基因序列 (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/83762) (SEQ ID NO: 15)；登錄號：NC_000071；區域：補體(30367066..30462730) GPC_000000778；NCBI參考序列：NC_000071.6斑馬魚耳畸蛋白 A 基因序列 (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/557476) (SEQ ID NO: 16)；登錄號：NC_007131；區域：31173357..31310109 GPC_000001574 NCBI參考序列：NC_007131.7恆河猴耳畸蛋白基因序列 (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/696717) (SEQ ID NO: 17) ；登錄號NC_027905；區域：補體(26723411..26826586) GPC_000002105；NCBI參考序列：NC_027905.1狗耳畸蛋白基因序列 (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/607961) (SEQ ID NO: 18) 登錄號NC_006599；區域：補體(20518502..20619461)GPC_000000676；NCBI參考序列：NC_006599.3黑猩猩耳畸蛋白基因序列 (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/459083) (SEQ ID NO: 19)；登錄號：NC_006469；區域：補體(27006052..27107747) GPC_000002338；NCBI參考序列：NC_006469.4大鼠耳畸蛋白之蛋白 (SEQ ID NO: 20)斑馬魚耳畸蛋白之蛋白 (SEQ ID NO: 21)牛耳畸蛋白之蛋白 (SEQ ID NO: 22)狒狒耳畸蛋白之蛋白 (SEQ ID NO: 23)
在一些實施例中，第一載體包含OTOF cDNA之5'部分，例如，如SEQ ID NO: 94所示。在一些實施例中，第二載體包含OTOF cDNA之3'部分，例如，如SEQ ID NO: 95所示。5'mOTOF DNA 序列 (SEQ ID NO: 94) ATGGCCCTGATTGTTCACCTCAAGACTGTCTCAGAGCTCCGAGGCAAAGGTGACCGGATTGCCAAAGTCACTTTCCGAGGGCAGTCTTTCTACTCCCGGGTCCTGGAGAACTGCGAGGGTGTGGCTGACTTTGATGAGACGTTCCGGTGGCCAGTGGCCAGCAGCATCGACCGGAATGAAGTGTTGGAGATTCAGATTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTGATAGGGACCTTCTGCATGGTGCTGCAGAAAGTGGTGGAGGAGAATCGGGTAGAGGTGACCGACACGCTGATGGATGACAGCAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGAGCATGGAGGTCCGGTATCAGGCCACAGATGGCACTGTGGGCCCCTGGGATGATGGAGACTTCCTGGGAGATGAATCCCTCCAGGAGGAGAAGGACAGCCAGGAGACAGATGGGCTGCTACCTGGTTCCCGACCCAGCACCCGGATATCTGGCGAGAAGAGCTTTCGCAGAGCGGGAAGGAGTGTGTTCTCGGCCATGAAACTCGGCAAAACTCGGTCCCACAAAGAGGAGCCCCAAAGACAAGATGAGCCAGCAGTGCTGGAGATGGAGGACCTGGACCACCTAGCCATTCAGCTGGGGGATGGGCTGGACCCTGACTCCGTGTCTCTAGCCTCGGTCACCGCTCTCACCAGCAATGTCTCCAACAAACGGTCTAAGCCAGATATTAAGATGGAGCCCAGTGCTGGAAGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACAGTGATTGAGGCTCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGTGTGGAGGTGGGTGATGACAAGAAATACACGTCAATGAAGGAGTCCACAAACTGCCCTTACTACAACGAGTACTTTGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCTGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATCTCGGTTATCCATTCTAAGAACCTGCTTCGGAGCGGCACCCTGGTGGGTTCCTTCAAAATGGATGTGGGGACTGTGTATTCCCAGCCTGAACACCAGTTCCATCACAAATGGGCCATCCTGTCAGACCCCGATGACATCTCTGCTGGGTTGAAGGGTTATGTAAAGTGTGATGTCGCTGTGGTGGGCAAGGGAGACAACATCAAGACACCCCACAAGGCCAACGAGACGGATGAGGACGACATTGAAGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGCGTGCCCCCCGAACGGCAGTGGGCACGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGACTGCCCCGGATGAACACAAGCCTCATGGCCAACGTGAAGAAGGCGTTCATCGGTGAGAACAAGGACCTCGTCGACCCCTATGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGACAAAAGGGCAAAACATCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCGCTATGGAATGAGCAGGTCGTCTTCACAGACTTGTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGGGACTCTGACAAGGTCAATGATGTGGCCATCGGCACCCACTTCATCGACCTGCGCAAGATTTCCAACGATGGAGACAAAGGCTTCCTGCCTACCCTCGGTCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACGCGCAACTACACACTGCTGGACGAGCACCAGGACTTGAATGAAGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGCCTCATGTTGGGACTAGCTGTGGAGATCCTGGACACCTCCAACCCAGAGCTCACCAGCTCCACGGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCTGTCTCGGAGAGCTGCACAGGGAGAATGGAAGAATTTTTTCTATTTGGAGCCTTCTTGGAAGCCTCAATGATTGACCGGAAAAATGGGGACAAGCCAATTACCTTTGAGGTGACCATAGGAAACTACGGCAATGAAGTCGATGGTATGTCCCGGCCCCTGAGGCCTCGGCCCCGGAAAGAGCCTGGGGATGAAGAAGAGGTAGACCTGATTCAGAACTCCAGTGACGATGAAGGTGACGAAGCCGGGGACCTGGCCTCGGTGTCCTCCACCCCACCTATGCGGCCCCAGATCACGGACAGGAACTATTTCCACCTGCCCTACCTGGAGCGCAAGCCCTGCATCTATATCAAGAGCTGGTGGCCTGACCAGAGGCGGCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGATCACATTGCTGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAATGATGTACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCGGAGCGCCGCCTGCGGGGTGTGCTAGAGGAACTCAGCTGTGGCTGCCACCGCTTCCTCTCCCTCTCGGACAAGGACCAGGGCCGCTCGTCCCGCACCAGGCTGGATCGAGAGCGTCTTAAGTCCTGTATGAGGGAGTTGGAGAGCATGGGACAGCAGGCCAAGAGCCTGAGGGCTCAGGTGAAGCGGCACACTGTTCGGGACAAGCTGAGGTCATGCCAGAACTTTCTGCAGAAGCTACGCTTCCTGGCGGATGAG 3'mOTOF DNA序列(SEQ ID NO: 95) CCCCAGCACAGCATTCCGGATGTGTTCATTTGGATGATGAGCAACAACAAACGTATCGCCTATGCCCGCGTGCCTTCCAAAGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAACTGGGCAAGGACTGCGCCAAAGTCAAGACCCTCTTCCTGAAGCTGCCAGGGAAGAGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTACAGGCCAAGCTGGAGCTCTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAGCAGCGAAAGGACTTCCTGTGTGGTCTGCCCTGTGGCTTCGAGGAGGTCAAGGCAGCCCAAGGCCTGGGCCTGCATTCCTTTCCGCCCATCAGCCTAGTCTACACCAAGAAGCAAGCCTTCCAGCTCCGAGCACACATGTATCAGGCCCGAAGCCTCTTTGCTGCTGACAGCAGTGGGCTCTCTGATCCCTTTGCCCGTGTCTTCTTCATCAACCAGAGCCAATGCACTGAGGTTCTAAACGAGACACTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTATTTGACAACCTGGAGCTGTACGGTGAAGCTCACGAGTTACGAGATGATCCCCCCATCATTGTCATTGAAATCTACGACCAGGACAGCATGGGCAAAGCCGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAGCCCCTGGTGAAGATGGCAGATGAAGCATACTGCCCACCTCGCTTCCCGCCGCAGCTTGAGTACTACCAGATCTACCGAGGCAGTGCCACTGCCGGAGACCTACTGGCTGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGGCCATCAGGGAAGGCTGACCTGCCACCCATCAATGGCCCAGTGGACATGGACAGAGGGCCCATCATGCCTGTGCCCGTGGGAATCCGGCCAGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTGAGGGACCTAAAGAGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGACCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGAAAGGGGGTACAATCCTCCCTGATTCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACGCTGGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCGGAGAATGAGCTCCTGCACCCACCCTTGAACATCCGAGTGGTAGATTGCCGGGCCTTTGGACGATACACCCTGGTGGGTTCCCACGCAGTCAGCTCACTGAGGCGCTTCATCTACCGACCTCCAGACCGCTCAGCCCCCAACTGGAACACCACAGGGGAGGTTGTAGTAAGCATGGAGCCTGAGGAGCCAGTTAAGAAGCTGGAGACCATGGTGAAACTGGATGCGACTTCTGATGCTGTGGTCAAGGTGGATGTGGCTGAAGATGAGAAGGAAAGGAAGAAGAAGAAAAAGAAAGGCCCGTCAGAGGAGCCAGAGGAGGAAGAGCCCGATGAGAGCATGCTGGATTGGTGGTCCAAGTACTTCGCCTCCATCGACACAATGAAGGAGCAACTTCGACAACATGAGACCTCTGGAACTGACTTGGAAGAGAAGGAAGAGATGGAAAGCGCTGAGGGCCTGAAGGGACCAATGAAGAGCAAGGAGAAGTCCAGAGCTGCAAAGGAGGAGAAAAAGAAGAAAAACCAGAGCCCTGGCCCTGGCCAGGGATCGGAGGCTCCTGAGAAGAAGAAAGCCAAGATCGATGAGCTTAAGGTGTACCCCAAGGAGCTGGAATCGGAGTTTGACAGCTTTGAGGACTGGCTGCACACCTTCAACCTGTTGAGGGGCAAGACGGGAGATGATGAGGATGGCTCCACAGAGGAGGAGCGCATAGTAGGCCGATTCAAGGGCTCCCTCTGTGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAAGATGTATCTCGAGAAGCTGGCTATGATCCCACCTATGGAATGTTCCAGGGCATCCCAAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAATCTATGTGGTCCGGGCCACAGACCTGCACCCGGCCGACATCAATGGCAAAGCTGACCCCTATATTGCCATCAAGTTAGGCAAGACCGACATCCGAGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTGTTTGGGAAGTCCTTTGACATTGAGGCCTCCTTCCCCATGGAGTCCATGTTGACAGTGGCCGTGTACGACTGGGATCTGGTGGGCACTGATGACCTCATCGGAGAAACCAAGATTGACCTGGAAAACCGCTTCTACAGCAAGCATCGCGCCACCTGCGGCATCGCACAGACCTATTCCATACATGGCTACAATATCTGGAGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACACGCCTCTGTAAAGAGGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGTCCCCATGGGAGAGTGAGGGTTGCCAACCGTGTCTTCACGGGGCCTTCAGAAATAGAGGATGAGAATGGTCAGAGGAAGCCCACAGATGAGCACGTGGCACTGTCTGCTCTGAGACACTGGGAGGACATCCCCCGGGTGGGCTGCCGCCTTGTGCCGGAACACGTGGAGACCAGGCCGCTGCTCAACCCTGACAAGCCAGGCATTGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACACCTCTGGATATATCCCCCAGGAAACCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCGTGTGGAACACAGACGAGGTGGTCCTGGAAGACGATGATTTCTTCACGGGAGAGAAGTCCAGTGACATTTTTGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAACAGGACACAGATGTCCACTATCACTCCCTCACGGGGGAGGGCAACTTCAACTGGAGATACCTCTTCCCCTTCGACTACCTAGCGGCCGAAGAGAAGATCGTTATGTCCAAAAAGGAGTCTATGTTCTCCTGGGATGAGACGGAGTACAAGATCCCTGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGACGCTGACCACTTCTCGGCTGACGACTTCCTGGGGGCTATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGAGGGGCGCTAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTACCCCTGGTTTCCATCTTTAAACAGAAACGTGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAATGATGAGTTTGAGCTCACAGGCAAAGTGGAGGCGGAGCTACACCTACTCACGGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCTGTGGGCCTGGCTCGCAATGAACCTGATCCCCTAGAAAAACCCAACCGGCCTGACACGGCATTCGTCTGGTTCCTGAACCCACTCAAATCTATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTGATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGCTGGGGCTGCTCATGCTGGCCCTCTTCCTTTACAGCCTCCCAGGCTACATGGTCAAGAAGCTCCTAGGGGCCTGA
本文所述組成物中任一者之一些實施例可包括第一載體，該第一載體包括SEQ ID NO: 94之編碼序列(或包括與SEQ ID NO: 94至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致之序列)。本文所述組成物中任一者之一些實施例可包括第二載體，該第二載體包括SEQ ID NO: 95之編碼序列(或包括與SEQ ID NO: 95至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致之序列)。
本文所述組成物中任一者之一些實施例可包括具有5' OTOF編碼區之第一載體，該5' OTOF編碼區包含OTOF cDNA之外顯子1至(及貫穿至) 21。本文所述組成物中任一者之一些實施例可包括第一載體，該第一載體包含SEQ ID NO: 101之核苷酸序列(或與SEQ ID NO: 101之核苷酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致之序列)。本文所述組成物中任一者之一些實施例可包括第一載體，該第一載體包含與SEQ ID NO: 101之核苷酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致，且與SEQ ID NO: 101編碼相同胺基酸序列之核苷酸序列。在一些實施例中，本揭示案組成物包括第一載體，該第一載體包含SEQ ID NO: 101之密碼子最佳化形式，亦即如下核苷酸序列，其與SEQ ID NO: 101編碼相同胺基酸序列，但具有經最佳化以在特定細胞類型，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞中表現的密碼子。在一些實施例中，第一載體不包括OTOF 基因之任何其他部分。在一些實施例中，第一載體不包括OTOF cDNA之任何其他部分。
本文所述組成物中任一者之一些實施例可包括具有3' OTOF編碼區之第二載體，該3' OTOF編碼區包含OTOF cDNA之外顯子22至(及貫穿至)外顯子48。本文所述組成物中任一者之一些實施例可包括第二載體，該第二載體包含SEQ ID NO: 108之核苷酸序列(或與SEQ ID NO: 108之核苷酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致之序列)。本文所述組成物中任一者之一些實施例可包括第二載體，該第二載體包含與SEQ ID NO: 108之核苷酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%一致，且與SEQ ID NO: 108編碼相同胺基酸序列之核苷酸序列。在一些實施例中，本揭示案之組成物包括第二載體，該第二載體包含SEQ ID NO: 108之密碼子最佳化形式，亦即如下核苷酸序列，其與SEQ ID NO: 108編碼相同胺基酸序列，但具有經最佳化以在特定細胞類型，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞中表現的密碼子。在一些實施例中，第二載體不包括OTOF 基因之任何其他部分。在一些實施例中，第二載體不包括OTOF cDNA之任何其他部分。載體
本文提供用於使用核酸治療劑諸如聽覺多肽信使RNA治療疾病諸如非症候群性聽力損失之物質組成物及使用方法。較佳地，聽覺多肽核酸存在於病毒載體，諸如腺相關病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體及逆轉錄病毒載體中。
用於將重組載體包裝在期望AAV衣殼中以產生本揭示案rAAV (或rAAV粒子)之前述方法並不意欲為限制性的，且其他合適方法對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。
表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及增強子序列；有效RNA加工訊號，諸如剪接及聚腺苷酸化(polyA)訊號序列；穩定細胞質mRNA之序列；增強轉譯效率之序列(亦即，Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及當需要時，增強編碼產物分泌之序列。大量表現控制序列，包括天然、組成型、誘導型及/或組織特異性啟動子，為此項技術中所已知且可使用。
如本文所用，當核酸序列(例如，編碼序列)及調節序列以使核酸序列之表現或轉錄處於調節序列之影響或控制下之方式共價連接時，該等序列稱為「操作性」連接。在期望核酸序列轉譯成功能蛋白時，若5'調節序列中啟動子之誘導引起編碼序列之轉錄，且若兩個DNA序列之間的鍵聯之性質不會(1)引起框移突變之引入，(2)干擾啟動子區域指導編碼序列轉錄之能力，或(3)干擾相應RNA轉錄本轉譯成蛋白質之能力，則稱該兩個DNA序列為操作性連接的。因此，若啟動子區能夠實施核酸序列之轉錄，使得所得轉錄本可轉譯成所要蛋白或多肽，則該啟動子區與該DNA序列操作性連接。類似地，當兩個或更多個編碼區以某種方式連接以使其自共同啟動子之轉錄引起框內轉譯之兩種或更多種蛋白之表現時，其操作性連接。在一些實施例中，操作性連接之編碼序列產生融合蛋白。在一些實施例中，操作性連接之編碼序列產生功能RNA (例如，shRNA、miRNA、miRNA抑制子)。
對於編碼蛋白質之核酸，通常在轉殖基因序列之後且在3' AAV ITR序列之前插入聚腺苷酸化序列。可用於本揭示案之rAAV構築體亦可含有內含子，該內含宜位於啟動子/增強子序列與轉殖基因之間。一種可能內含子序列來源於SV-40，且稱為SV-40 T內含子序列。一種可能內含子序列具有SEQ ID NO: 100之核苷酸序列。可使用之另一載體元件為內部核糖體進入位點(IRES)。IRES序列用於自單一基因轉錄本產生超過一種多肽。IRES序列將用於產生含有一個以上多肽鏈之蛋白。此等及其他常見載體元件之選擇為習知的，且諸多此類序列可用[參見例如，Sambrook等人「Molecular Cloning. A Laboratory Manual」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)及其中在例如第3.18 3.26及16.17 16.27頁引用之參考文獻，及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989]。在一些實施例中，足口病病毒2A序列包括在聚蛋白中；其為一種小肽(長度為約18個胺基酸)，已展示其介導聚蛋白之裂解(Ryan, M D等人，EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M等人，J Virology, 1996年11月; 第8124-8127頁；Furler, S等人，Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；及Halpin, C等人，The Plant Journal, 1999; 4: 453-459)。2A序列之裂解活性先前已在包括質體及基因療法載體(AAV及逆轉錄病毒)之人工系統中展現(Ryan, M D等人，EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M等人，J Virology, 1996年11月; 第8124-8127頁；Furler, S等人，Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；及Halpin, C等人，The Plant Journal, 1999; 4: 453-459；de Felipe, P等人，Gene Therapy, 1999; 6: 198-208；de Felipe, P等人，Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931；及Klump, H等人，Gene Therapy, 2001; 8: 811-817)。
宿主細胞中基因表現所需之調節序列的精確性質可因物種、組織或細胞類型而變化，但通常應視需要包括分別參與轉錄及轉譯起始之5'非轉錄序列及5'非轉譯序列，諸如TATA盒、加帽序列、CAAT序列、增強子元件及其類似序列。尤其，此類5'非轉錄調節序列包括啟動子區，該啟動子區包括用於操作性連接之基因的轉錄控制的啟動子序列。調節序列亦可視需要包括增強子序列或上游活化子序列。本揭示案之載體可視情況包括5'前導序列或訊號序列。合適載體之選擇及設計在一般技術者之能力及判斷範圍內。
組成型啟動子之實例包括(但不限於)逆轉錄病毒勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus；RSV) LTR啟動子(視情況具有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(視情況具有CMV增強子)[參見例如，Boshart等人，(1985) Cell, 41:521-530]、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子(Gilham等人，J. Gene Med. 12(2):129-136, 2010)及EF1.α.啟動子[Invitrogen]。
誘導型啟動子可調節基因表現，且可藉由外源提供之化合物、環境因子諸如溫度、或存在特定生理學狀態例如急性期、細胞特定分化狀態或僅在復製細胞中調節。誘導型啟動子及誘導型系統可獲自多種商業來源，包括(但不限於)Invitrogen、Clontech及Ariad。已描述多種其他系統，且熟習此項技術者可容易地選擇。由外源提供之啟動子調節的誘導型啟動子的實例包括鋅誘導型綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(dexamethasone；Dex)誘導型小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088)；蛻皮激素昆蟲啟動子(No等人，(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351)、四環素抑制系統(Gossen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992))、四環素誘導系統(Gossen等人，Science, 268:1766-1769 (1995)，亦參見Harvey等人，Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998))、RU486誘導系統(Wang等人，Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)及Wang等人，Gene Ther., 4:432-441 (1997))及雷帕黴素(rapamycin)誘導系統(Magari等人，J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))。在此情形下可有用之誘導型啟動子之其他類型為藉由特定生理學狀態例如溫度、急性期、細胞特定分化狀態或僅在復製細胞中調節的彼等類型。
在另一實施例中，使用轉殖基因之天然啟動子。當期望轉殖基因之表現應模仿天然表現時，天然啟動子可為較佳。當必須在時間或發育上或以組織特異性方式或響應於特定轉錄刺激調節轉殖基因之表現時，可使用天然啟動子。在另一實施例中，其他天然表現控制元件，諸如增強子元件、聚腺苷酸化位點或Kozak共有序列亦可用於模擬天然表現。
在一些實施例中，調節序列賦予組織特異性基因表現能力。在一些情況下，組織特異性調節序列結合以組織特異性方式誘導轉錄之組織特異性轉錄因子。此類組織特異性調節序列(例如，啟動子、增強子等)為此項技術中所熟知。例示性組織特異性調節序列包括(但不限於)以下組織特異性啟動子：肝特異性甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子、胰島素啟動子、升糖素啟動子、生長抑素啟動子、胰多肽(PPY)啟動子、突觸蛋白-1 (Syn)啟動子(Kugler 等人，Virology 311:89-95, 2003；Hioki 等人，Gene Ther. 14:872-882, 2007；Kuroda 等人，J. Gene Med. 10:1163-1175, 2008)、肌酸激酶(MCK)啟動子(Wang等人，Gene Ther. 15:1489-1499, 2008；Talbot等人，Mol. Ther. 18:601-608, 2010；Katwal等人，Gene Ther. 20(9):930-938, 2013)、哺乳動物結蛋白(DES)啟動子(Talbot等人，Mol. Ther. 18:601-608, 2010)、C5-12 啟動子(Wang等人，Gene Ther. 15:1489-1499, 2008)、α-肌球蛋白重鏈(a-MHC)啟動子、PDGF啟動子(Patterna,Gene Ther. 7(15):1304-1311, 2000；Hioki等人，Gene Ther. 14:872-882, 2007)、MecP2啟動子(Rastegar等人，PLoS One 4:e6810, 2009；Gray等人，Human Gene Ther. 22:1143-1153, 2011)、CaMKII啟動子(Hioki等人，Gene Ther. 14:872-882, 2007；Kuroda等人，J. Gene Med. 10:1163-1175, 2008)、mGluR2啟動子(Brene等人，Eur. J. Eurosci. 12:1525-1533, 2000；Kuroda等人，J. Gene Med. 10:1163-1175, 2008)、NFL啟動子(Xu等人，Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001；Xu等人，Gene Ther. 8:1323-1332, 2001)、NFH啟動子(Xu等人，Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001；Xu等人，Gene Ther. 8:1323-1332, 2001)、nJ2啟動子(Xu等人，Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001；Xu等人，Gene Ther. 8:1323-1332, 2001)、PPE啟動子(Xu等人，Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001；Xu等人，Gene Ther. 8:1323-1332, 2001)、Enk啟動子(Xu等人，Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001；Xu等人，Gene Ther. 8:1323-1332, 2001)、EAAT2啟動子(Su等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:1955-1960, 2003；Kuroda等人，J. Gene Med. 10:1163-1175, 2008)、GFAP啟動子(Brenner等人，J. Neurosci. 14:1030-1037, 1994；Xu等人，Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001；Xu等人，Gene Ther. 8:1323-1332, 2001；Lee等人，Glia 56:481-493, 2008；Dirren等人，Human Gene Ther. 25:109-120, 2014)；MBP啟動子(Chen等人，Gene Ther. 5(1):50-58, 1998)或心肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子。其他例示性啟動子尤其包括β-肌動蛋白啟動子、B型肝炎病毒核心啟動子(Sandig等人，Gene Ther., 3:1002-9 (1996))；α-甲胎蛋白(AFP)啟動子(Arbuthnot等人，Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996))、骨之骨鈣素啟動子(Stein等人，Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997))；骨唾液蛋白啟動子(Chen等人，J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996))、CD2啟動子(Hansal等人，J. Immunol., 161:1063-8 (1998))；免疫球蛋白重鏈啟動子；T細胞受體α-鏈啟動子、神經元諸如神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子(Andersen等人，Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)；Xu等人，Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001；Xu等人，Gene Ther. 8:1323-1332, 2001)、神經絲輕鏈基因啟動子(Piccioli等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991))及神經元特異性vgf基因啟動子(Piccioli等人，Neuron, 15:373-84 (1995))，該等啟動子對於熟練技術者顯而易見。
在一些實施例中，將一或多種miRNA之一或多個結合位點併入rAAV載體之轉殖基因中，以抑制轉殖基因在具有該轉殖基因之個體的一或多個組織中的表現。熟習此項技術者應瞭解，可選擇結合位點而以組織特異性方式控制轉殖基因之表現。例如，可將肝特異性miR-122之結合位點併入轉殖基因中，以抑制該轉殖基因在肝中之表現。mRNA中之標靶位點可在5' UTR、3' UTR或編碼區中。典型地，標靶位點在mRNA之3' UTR中。此外，轉殖基因可經設計以使得多個miRNA藉由識別相同或多個位點來調節mRNA。多個miRNA結合位點之存在可引起多個RISC之協同作用，且提供高效表現抑制。標靶位點序列可包含總共5-100、10-60個或更多個核苷酸。標靶位點序列可包含標靶基因結合位點序列之至少5個核苷酸。聽覺多肽及聽覺多肽轉殖基因編碼序列
rAAV載體之聽覺多肽轉殖基因序列的組成取決於產生所得載體之用途。因此，本揭示案涵蓋編碼一或多種聽覺多肽、肽或蛋白之rAAV載體的遞送，該一或多種聽覺多肽、肽或蛋白可用於治療或預防與哺乳動物個體之聽力損失相關的疾病病態。例示性治療蛋白包括選自由以下組成之群的一或多種多肽：耳畸蛋白；Cav 1.3；選自巴松蛋白、皮卡諾蛋白、肋眼蛋白及和諧素之支架蛋白；Vglut3；突觸結合蛋白；囊泡連繫/對接蛋白；囊泡激發蛋白；囊泡融合蛋白；GluA2/3；或GluA4。
AAV組成物中視情況包括多肽報告蛋白。可在轉殖基因中提供之報告序列包括(但不限於)編碼以下之DNA序列：β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、鹼性磷酸酶、胸苷激酶、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、螢光素酶及此項技術中熟知之其他物質。報告序列在與驅動其表現之調節元件結合時提供可藉由習知手段偵測之訊號，該等習知手段包括酶促、放射線照相、比色測定、螢光或其他光譜檢定、螢光活化細胞分選檢定及免疫檢定，包括酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)及免疫組織化學。例如，在標記序列為LacZ基因之情況下，藉由J-半乳糖苷酶活性檢定來偵測攜帶訊號之載體的存在。當轉殖基因為綠色螢光蛋白或螢光素酶時，可藉由在發光計中藉由顏色或發光來目測帶有訊號之載體。此類報告基因可例如用於驗證rAAV之組織特異性靶向能力及組織特異性啟動子調節活性。
在另一實例中，轉殖基因編碼意欲用於產生疾病動物模型之蛋白質或功能RNA。合適轉殖基因編碼序列為熟習此項技術者所顯而易見。
rAAV載體可包含編碼聽覺多肽之基因或基因之一部分以轉移至個體來治療與聽覺多肽基因或聽覺多肽功能途徑中另一基因之表現降低、表現缺乏或功能障礙相關的疾病。
在一第一態樣中，提供包括複數種腺相關病毒(AAV)載體之治療組成物，其中該複數種AAV載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成聽覺多肽信使RNA。較佳地，該複數種AAV載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成全長聽覺多肽信使RNA。複數種AAV載體包括第一AAV載體及第二AAV載體，其中第一及第二AAV載體獨立地含有小於約6 kb之包裝能力。例如，如本文所提供，聽覺多肽信使RNA編碼選自由耳畸蛋白及其異種同源物或同源物組成之群的聽覺多肽。AAV載體含有至少一種選自CBA、CMV或CB7啟動子之啟動子序列，或者一或多種耳蝸特異性啟動子。在一些實施例中，AAV載體可包括CMV增強子及啟動子序列，例如SEQ ID NO: 70。在一些實施例中，AAV載體可包括CMV增強子及雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子，例如SEQ ID NO: 61。在一些實施例中，AAV載體可包括CMVd啟動子序列，例如SEQ ID NO: 86。在一些實施例中，AAV載體可包括如下啟動子，其包含CMV增強子及CBA啟動子，例如SEQ ID NO: 98及99之核苷酸序列。在一些實施例中，SEQ ID NO: 98之核苷酸序列在SEQ ID NO: 99之核苷酸序列之前，且視情況後接嵌合內含子，例如SEQ ID NO: 100之核苷酸序列。
本文所提供之組成物包括至少兩種(例如，兩種、三種、四種、五種或六種)核酸載體，其中：至少兩種不同載體中之每一者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，該等編碼部分中之每一者為至少30個胺基酸(例如，約30個胺基酸至約1950個胺基酸、約30個胺基酸至約1900個胺基酸、約30個胺基酸至約1850個胺基酸、約30個胺基酸至約1800個胺基酸、約30個胺基酸至約1750個胺基酸、約30個胺基酸至約1700個胺基酸、約30個胺基酸至約1650個胺基酸、約30個胺基酸至約1600個胺基酸、約30個胺基酸至約1550個胺基酸、約30個胺基酸至約1500個胺基酸、約30個胺基酸至約1450個胺基酸、約30個胺基酸至約1400個胺基酸、約30個胺基酸至約1350個胺基酸、約30個胺基酸至約1300個胺基酸、約30個胺基酸至約1250個胺基酸、約30個胺基酸至約1200個胺基酸、約30個胺基酸至約1150個胺基酸、約30個胺基酸至約1100個胺基酸、約30個胺基酸至約1050個胺基酸、約30個胺基酸至約1000個胺基酸、約30個胺基酸至約950個胺基酸、約30個胺基酸至約900個胺基酸、約30個胺基酸至約850個胺基酸、約30個胺基酸至約800個胺基酸、約30個胺基酸至約750個胺基酸、約30個胺基酸至約700個胺基酸、約30個胺基酸至約650個胺基酸、約30個胺基酸至約600個胺基酸、約30個胺基酸至約550個胺基酸、約30個胺基酸至約500個胺基酸、約30個胺基酸至約450個胺基酸、約30個胺基酸至約400個胺基酸、約30個胺基酸至約350個胺基酸、約30個胺基酸至約300個胺基酸、約30個胺基酸至約250個胺基酸、約30個胺基酸至約200個胺基酸、約30個胺基酸至約150個胺基酸、約30個胺基酸至約100個胺基酸、約30個胺基酸至約50個胺基酸、約50個胺基酸至約1950個胺基酸、約50個胺基酸至約1900個胺基酸、約50個胺基酸至約1850個胺基酸、約50個胺基酸至約1800個胺基酸、約50個胺基酸至約1750個胺基酸、約50個胺基酸至約1700個胺基酸、約50個胺基酸至約1650個胺基酸、約50個胺基酸至約1600個胺基酸、約50個胺基酸至約1550個胺基酸、約50個胺基酸至約1500個胺基酸、約50個胺基酸至約1450個胺基酸、約50個胺基酸至約1400個胺基酸、約50個胺基酸至約1350個胺基酸、約50個胺基酸至約1300個胺基酸、約50個胺基酸至約1250個胺基酸、約50個胺基酸至約1200個胺基酸、約50個胺基酸至約1150個胺基酸、約50個胺基酸至約1100個胺基酸、約50個胺基酸至約1050個胺基酸、約50個胺基酸至約1000個胺基酸、約50個胺基酸至約950個胺基酸、約50個胺基酸至約900個胺基酸、約50個胺基酸至約850個胺基酸、約50個胺基酸至約800個胺基酸、約50個胺基酸至約750個胺基酸、約50個胺基酸至約700個胺基酸、約50個胺基酸至約650個胺基酸、約50個胺基酸至約600個胺基酸、約50個胺基酸至約550個胺基酸、約50個胺基酸至約500個胺基酸、約50個胺基酸至約450個胺基酸、約50個胺基酸至約400個胺基酸、約50個胺基酸至約350個胺基酸、約50個胺基酸至約300個胺基酸、約50個胺基酸至約250個胺基酸、約50個胺基酸至約200個胺基酸、約50個胺基酸至約150個胺基酸、約50個胺基酸至約100個胺基酸、約100個胺基酸至約1950個胺基酸、約100個胺基酸至約1900個胺基酸、約100個胺基酸至約1850個胺基酸、約100個胺基酸至約1800個胺基酸、約100個胺基酸至約1750個胺基酸、約100個胺基酸至約1700個胺基酸、約100個胺基酸至約1650個胺基酸、約100個胺基酸至約1600個胺基酸、約100個胺基酸至約1550個胺基酸、約100個胺基酸至約1500個胺基酸、約100個胺基酸至約1450個胺基酸、約100個胺基酸至約1400個胺基酸、約100個胺基酸至約1350個胺基酸、約100個胺基酸至約1300個胺基酸、約100個胺基酸至約1250個胺基酸、約100個胺基酸至約1200個胺基酸、約100個胺基酸至約1150個胺基酸、約100個胺基酸至約1100個胺基酸、約100個胺基酸至約1050個胺基酸、約100個胺基酸至約1000個胺基酸、約100個胺基酸至約950個胺基酸、約100個胺基酸至約900個胺基酸、約100個胺基酸至約850個胺基酸、約100個胺基酸至約800個胺基酸、約100個胺基酸至約750個胺基酸、約100個胺基酸至約700個胺基酸、約100個胺基酸至約650個胺基酸、約100個胺基酸至約600個胺基酸、約100個胺基酸至約550個胺基酸、約100個胺基酸至約500個胺基酸、約100個胺基酸至約450個胺基酸、約100個胺基酸至約400個胺基酸、約100個胺基酸至約350個胺基酸、約100個胺基酸至約300個胺基酸、約100個胺基酸至約250個胺基酸、約100個胺基酸至約200個胺基酸、約100個胺基酸至約150個胺基酸、約150個胺基酸至約1950個胺基酸、約150個胺基酸至約1900個胺基酸、約150個胺基酸至約1850個胺基酸、約150個胺基酸至約1800個胺基酸、約150個胺基酸至約1750個胺基酸、約150個胺基酸至約1700個胺基酸、約150個胺基酸至約1650個胺基酸、約150個胺基酸至約1600個胺基酸、約150個胺基酸至約1550個胺基酸、約150個胺基酸至約1500個胺基酸、約150個胺基酸至約1450個胺基酸、約150個胺基酸至約1400個胺基酸、約150個胺基酸至約1350個胺基酸、約150個胺基酸至約1300個胺基酸、約150個胺基酸至約1250個胺基酸、約150個胺基酸至約1200個胺基酸、約150個胺基酸至約1150個胺基酸、約150個胺基酸至約1100個胺基酸、約150個胺基酸至約1050個胺基酸、約150個胺基酸至約1000個胺基酸、約150個胺基酸至約950個胺基酸、約150個胺基酸至約900個胺基酸、約150個胺基酸至約850個胺基酸、約150個胺基酸至約800個胺基酸、約150個胺基酸至約750個胺基酸、約150個胺基酸至約700個胺基酸、約150個胺基酸至約650個胺基酸、約150個胺基酸至約600個胺基酸、約150個胺基酸至約550個胺基酸、約150個胺基酸至約500個胺基酸、約150個胺基酸至約450個胺基酸、約150個胺基酸至約400個胺基酸、約150個胺基酸至約350個胺基酸、約150個胺基酸至約300個胺基酸、約150個胺基酸至約250個胺基酸、約150個胺基酸至約200個胺基酸、約200個胺基酸至約1950個胺基酸、約200個胺基酸至約1900個胺基酸、約200個胺基酸至約1850個胺基酸、約200個胺基酸至約1800個胺基酸、約200個胺基酸至約1750個胺基酸、約200個胺基酸至約1700個胺基酸、約200個胺基酸至約1650個胺基酸、約200個胺基酸至約1600個胺基酸、約200個胺基酸至約1550個胺基酸、約200個胺基酸至約1500個胺基酸、約200個胺基酸至約1450個胺基酸、約200個胺基酸至約1400個胺基酸、約200個胺基酸至約1350個胺基酸、約200個胺基酸至約1300個胺基酸、約200個胺基酸至約1250個胺基酸、約200個胺基酸至約1200個胺基酸、約200個胺基酸至約1150個胺基酸、約200個胺基酸至約1100個胺基酸、約200個胺基酸至約1050個胺基酸、約200個胺基酸至約1000個胺基酸、約200個胺基酸至約950個胺基酸、約200個胺基酸至約900個胺基酸、約200個胺基酸至約850個胺基酸、約200個胺基酸至約800個胺基酸、約200個胺基酸至約750個胺基酸、約200個胺基酸至約700個胺基酸、約200個胺基酸至約650個胺基酸、約200個胺基酸至約600個胺基酸、約200個胺基酸至約550個胺基酸、約200個胺基酸至約500個胺基酸、約200個胺基酸至約450個胺基酸、約200個胺基酸至約400個胺基酸、約200個胺基酸至約350個胺基酸、約200個胺基酸至約300個胺基酸、約200個胺基酸至約250個胺基酸、約250個胺基酸至約1950個胺基酸、約250個胺基酸至約1900個胺基酸、約250個胺基酸至約1850個胺基酸、約250個胺基酸至約1800個胺基酸、約250個胺基酸至約1750個胺基酸、約250個胺基酸至約1700個胺基酸、約250個胺基酸至約1650個胺基酸、約250個胺基酸至約1600個胺基酸、約250個胺基酸至約1550個胺基酸、約250個胺基酸至約1500個胺基酸、約250個胺基酸至約1450個胺基酸、約250個胺基酸至約1400個胺基酸、約250個胺基酸至約1350個胺基酸、約250個胺基酸至約1300個胺基酸、約250個胺基酸至約1250個胺基酸、約250個胺基酸至約1200個胺基酸、約250個胺基酸至約1150個胺基酸、約250個胺基酸至約1100個胺基酸、約250個胺基酸至約1050個胺基酸、約250個胺基酸至約1000個胺基酸、約250個胺基酸至約950個胺基酸、約250個胺基酸至約900個胺基酸、約250個胺基酸至約850個胺基酸、約250個胺基酸至約800個胺基酸、約250個胺基酸至約750個胺基酸、約250個胺基酸至約700個胺基酸、約250個胺基酸至約650個胺基酸、約250個胺基酸至約600個胺基酸、約250個胺基酸至約550個胺基酸、約250個胺基酸至約500個胺基酸、約250個胺基酸至約450個胺基酸、約250個胺基酸至約400個胺基酸、約250個胺基酸至約350個胺基酸、約250個胺基酸至約300個胺基酸、約300個胺基酸至約1950個胺基酸、約300個胺基酸至約1900個胺基酸、約300個胺基酸至約1850個胺基酸、約300個胺基酸至約1800個胺基酸、約300個胺基酸至約1750個胺基酸、約300個胺基酸至約1700個胺基酸、約300個胺基酸至約1650個胺基酸、約300個胺基酸至約1600個胺基酸、約300個胺基酸至約1550個胺基酸、約300個胺基酸至約1500個胺基酸、約300個胺基酸至約1450個胺基酸、約300個胺基酸至約1400個胺基酸、約300個胺基酸至約1350個胺基酸、約300個胺基酸至約1300個胺基酸、約300個胺基酸至約1250個胺基酸、約300個胺基酸至約1200個胺基酸、約300個胺基酸至約1150個胺基酸、約300個胺基酸至約1100個胺基酸、約300個胺基酸至約1050個胺基酸、約300個胺基酸至約1000個胺基酸、約300個胺基酸至約950個胺基酸、約300個胺基酸至約900個胺基酸、約300個胺基酸至約850個胺基酸、約300個胺基酸至約800個胺基酸、約300個胺基酸至約750個胺基酸、約300個胺基酸至約700個胺基酸、約300個胺基酸至約650個胺基酸、約300個胺基酸至約600個胺基酸、約300個胺基酸至約550個胺基酸、約300個胺基酸至約500個胺基酸、約300個胺基酸至約450個胺基酸、約300個胺基酸至約400個胺基酸、約300個胺基酸至約350個胺基酸、約350個胺基酸至約1950個胺基酸、約350個胺基酸至約1900個胺基酸、約350個胺基酸至約1850個胺基酸、約350個胺基酸至約1800個胺基酸、約350個胺基酸至約1750個胺基酸、約350個胺基酸至約1700個胺基酸、約350個胺基酸至約1650個胺基酸、約350個胺基酸至約1600個胺基酸、約350個胺基酸至約1550個胺基酸、約350個胺基酸至約1500個胺基酸、約350個胺基酸至約1450個胺基酸、約350個胺基酸至約1400個胺基酸、約350個胺基酸至約1350個胺基酸、約350個胺基酸至約1300個胺基酸、約350個胺基酸至約1250個胺基酸、約350個胺基酸至約1200個胺基酸、約350個胺基酸至約1150個胺基酸、約350個胺基酸至約1100個胺基酸、約350個胺基酸至約1050個胺基酸、約350個胺基酸至約1000個胺基酸、約350個胺基酸至約950個胺基酸、約350個胺基酸至約900個胺基酸、約350個胺基酸至約850個胺基酸、約350個胺基酸至約800個胺基酸、約350個胺基酸至約750個胺基酸、約350個胺基酸至約700個胺基酸、約350個胺基酸至約650個胺基酸、約350個胺基酸至約600個胺基酸、約350個胺基酸至約550個胺基酸、約350個胺基酸至約500個胺基酸、約350個胺基酸至約450個胺基酸、約350個胺基酸至約400個胺基酸、約400個胺基酸至約1950個胺基酸、約400個胺基酸至約1900個胺基酸、約400個胺基酸至約1850個胺基酸、約400個胺基酸至約1800個胺基酸、約400個胺基酸至約1750個胺基酸、約400個胺基酸至約1700個胺基酸、約400個胺基酸至約1650個胺基酸、約400個胺基酸至約1600個胺基酸、約400個胺基酸至約1550個胺基酸、約400個胺基酸至約1500個胺基酸、約400個胺基酸至約1450個胺基酸、約400個胺基酸至約1400個胺基酸、約400個胺基酸至約1350個胺基酸、約400個胺基酸至約1300個胺基酸、約400個胺基酸至約1250個胺基酸、約400個胺基酸至約1200個胺基酸、約400個胺基酸至約1150個胺基酸、約400個胺基酸至約1100個胺基酸、約400個胺基酸至約1050個胺基酸、約400個胺基酸至約1000個胺基酸、約400個胺基酸至約950個胺基酸、約400個胺基酸至約900個胺基酸、約400個胺基酸至約850個胺基酸、約400個胺基酸至約800個胺基酸、約400個胺基酸至約750個胺基酸、約400個胺基酸至約700個胺基酸、約400個胺基酸至約650個胺基酸、約400個胺基酸至約600個胺基酸、約400個胺基酸至約550個胺基酸、約400個胺基酸至約500個胺基酸、約400個胺基酸至約450個胺基酸、約450個胺基酸至約1950個胺基酸、約450個胺基酸至約1900個胺基酸、約450個胺基酸至約1850個胺基酸、約450個胺基酸至約1800個胺基酸、約450個胺基酸至約1750個胺基酸、約450個胺基酸至約1700個胺基酸、約450個胺基酸至約1650個胺基酸、約450個胺基酸至約1600個胺基酸、約450個胺基酸至約1550個胺基酸、約450個胺基酸至約1500個胺基酸、約450個胺基酸至約1450個胺基酸、約450個胺基酸至約1400個胺基酸、約450個胺基酸至約1350個胺基酸、約450個胺基酸至約1300個胺基酸、約450個胺基酸至約1250個胺基酸、約450個胺基酸至約1200個胺基酸、約450個胺基酸至約1150個胺基酸、約450個胺基酸至約1100個胺基酸、約450個胺基酸至約1050個胺基酸、約450個胺基酸至約1000個胺基酸、約450個胺基酸至約950個胺基酸、約450個胺基酸至約900個胺基酸、約450個胺基酸至約850個胺基酸、約450個胺基酸至約800個胺基酸、約450個胺基酸至約750個胺基酸、約450個胺基酸至約700個胺基酸、約450個胺基酸至約650個胺基酸、約450個胺基酸至約600個胺基酸、約450個胺基酸至約550個胺基酸、約450個胺基酸至約500個胺基酸、約500個胺基酸至約1950個胺基酸、約500個胺基酸至約1900個胺基酸、約500個胺基酸至約1850個胺基酸、約500個胺基酸至約1800個胺基酸、約500個胺基酸至約1750個胺基酸、約500個胺基酸至約1700個胺基酸、約500個胺基酸至約1650個胺基酸、約500個胺基酸至約1600個胺基酸、約500個胺基酸至約1550個胺基酸、約500個胺基酸至約1500個胺基酸、約500個胺基酸至約1450個胺基酸、約500個胺基酸至約1400個胺基酸、約500個胺基酸至約1350個胺基酸、約500個胺基酸至約1300個胺基酸、約500個胺基酸至約1250個胺基酸、約500個胺基酸至約1200個胺基酸、約500個胺基酸至約1150個胺基酸、約500個胺基酸至約1100個胺基酸、約500個胺基酸至約1050個胺基酸、約500個胺基酸至約1000個胺基酸、約500個胺基酸至約950個胺基酸、約500個胺基酸至約900個胺基酸、約500個胺基酸至約850個胺基酸、約500個胺基酸至約800個胺基酸、約500個胺基酸至約750個胺基酸、約500個胺基酸至約700個胺基酸、約500個胺基酸至約650個胺基酸、約500個胺基酸至約600個胺基酸、約500個胺基酸至約550個胺基酸、約550個胺基酸至約1950個胺基酸、約550個胺基酸至約1900個胺基酸、約550個胺基酸至約1850個胺基酸、約550個胺基酸至約1800個胺基酸、約550個胺基酸至約1750個胺基酸、約550個胺基酸至約1700個胺基酸、約550個胺基酸至約1650個胺基酸、約550個胺基酸至約1600個胺基酸、約550個胺基酸至約1550個胺基酸、約550個胺基酸至約1500個胺基酸、約550個胺基酸至約1450個胺基酸、約550個胺基酸至約1400個胺基酸、約550個胺基酸至約1350個胺基酸、約550個胺基酸至約1300個胺基酸、約550個胺基酸至約1250個胺基酸、約550個胺基酸至約1200個胺基酸、約550個胺基酸至約1150個胺基酸、約550個胺基酸至約1100個胺基酸、約550個胺基酸至約1050個胺基酸、約550個胺基酸至約1000個胺基酸、約550個胺基酸至約950個胺基酸、約550個胺基酸至約900個胺基酸、約550個胺基酸至約850個胺基酸、約550個胺基酸至約800個胺基酸、約550個胺基酸至約750個胺基酸、約550個胺基酸至約700個胺基酸、約550個胺基酸至約650個胺基酸、約550個胺基酸至約600個胺基酸、約600個胺基酸至約1950個胺基酸、約600個胺基酸至約1900個胺基酸、約600個胺基酸至約1850個胺基酸、約600個胺基酸至約1800個胺基酸、約600個胺基酸至約1750個胺基酸、約600個胺基酸至約1700個胺基酸、約600個胺基酸至約1650個胺基酸、約600個胺基酸至約1600個胺基酸、約600個胺基酸至約1550個胺基酸、約600個胺基酸至約1500個胺基酸、約600個胺基酸至約1450個胺基酸、約600個胺基酸至約1400個胺基酸、約600個胺基酸至約1350個胺基酸、約600個胺基酸至約1300個胺基酸、約600個胺基酸至約1250個胺基酸、約600個胺基酸至約1200個胺基酸、約600個胺基酸至約1150個胺基酸、約600個胺基酸至約1100個胺基酸、約600個胺基酸至約1050個胺基酸、約600個胺基酸至約1000個胺基酸、約600個胺基酸至約950個胺基酸、約600個胺基酸至約900個胺基酸、約600個胺基酸至約850個胺基酸、約600個胺基酸至約800個胺基酸、約600個胺基酸至約750個胺基酸、約600個胺基酸至約700個胺基酸、約600個胺基酸至約650個胺基酸、約650個胺基酸至約1950個胺基酸、約650個胺基酸至約1900個胺基酸、約650個胺基酸至約1850個胺基酸、約650個胺基酸至約1800個胺基酸、約650個胺基酸至約1750個胺基酸、約650個胺基酸至約1700個胺基酸、約650個胺基酸至約1650個胺基酸、約650個胺基酸至約1600個胺基酸、約650個胺基酸至約1550個胺基酸、約650個胺基酸至約1500個胺基酸、約650個胺基酸至約1450個胺基酸、約650個胺基酸至約1400個胺基酸、約650個胺基酸至約1350個胺基酸、約650個胺基酸至約1300個胺基酸、約650個胺基酸至約1250個胺基酸、約650個胺基酸至約1200個胺基酸、約650個胺基酸至約1150個胺基酸、約650個胺基酸至約1100個胺基酸、約650個胺基酸至約1050個胺基酸、約650個胺基酸至約1000個胺基酸、約650個胺基酸至約950個胺基酸、約650個胺基酸至約900個胺基酸、約650個胺基酸至約850個胺基酸、約650個胺基酸至約800個胺基酸、約650個胺基酸至約750個胺基酸、約650個胺基酸至約700個胺基酸、約700個胺基酸至約1950個胺基酸、約700個胺基酸至約1900個胺基酸、約700個胺基酸至約1850個胺基酸、約700個胺基酸至約1800個胺基酸、約700個胺基酸至約1750個胺基酸、約700個胺基酸至約1700個胺基酸、約700個胺基酸至約1650個胺基酸、約700個胺基酸至約1600個胺基酸、約700個胺基酸至約1550個胺基酸、約700個胺基酸至約1500個胺基酸、約700個胺基酸至約1450個胺基酸、約700個胺基酸至約1400個胺基酸、約700個胺基酸至約1350個胺基酸、約700個胺基酸至約1300個胺基酸、約700個胺基酸至約1250個胺基酸、約700個胺基酸至約1200個胺基酸、約700個胺基酸至約1150個胺基酸、約700個胺基酸至約1100個胺基酸、約700個胺基酸至約1050個胺基酸、約700個胺基酸至約1000個胺基酸、約700個胺基酸至約950個胺基酸、約700個胺基酸至約900個胺基酸、約700個胺基酸至約850個胺基酸、約700個胺基酸至約800個胺基酸、約700個胺基酸至約750個胺基酸、約750個胺基酸至約1950個胺基酸、約750個胺基酸至約1900個胺基酸、約750個胺基酸至約1850個胺基酸、約750個胺基酸至約1800個胺基酸、約750個胺基酸至約1750個胺基酸、約750個胺基酸至約1700個胺基酸、約750個胺基酸至約1650個胺基酸、約750個胺基酸至約1600個胺基酸、約750個胺基酸至約1550個胺基酸、約750個胺基酸至約1500個胺基酸、約750個胺基酸至約1450個胺基酸、約750個胺基酸至約1400個胺基酸、約750個胺基酸至約1350個胺基酸、約750個胺基酸至約1250個胺基酸、約750個胺基酸至約1200個胺基酸、約750個胺基酸至約1150個胺基酸、約750個胺基酸至約1100個胺基酸、約750個胺基酸至約1050個胺基酸、約750個胺基酸至約1000個胺基酸、約750個胺基酸至約950個胺基酸、約750個胺基酸至約900個胺基酸、約750個胺基酸至約850個胺基酸、約750個胺基酸至約800個胺基酸、約800個胺基酸至約1950個胺基酸、約800個胺基酸至約1900個胺基酸、約800個胺基酸至約1850個胺基酸、約800個胺基酸至約1800個胺基酸、約800個胺基酸至約1750個胺基酸、約800個胺基酸至約1700個胺基酸、約800個胺基酸至約1650個胺基酸、約800個胺基酸至約1600個胺基酸、約800個胺基酸至約1550個胺基酸、約800個胺基酸至約1500個胺基酸、約800個胺基酸至約1450個胺基酸、約800個胺基酸至約1400個胺基酸、約800個胺基酸至約1350個胺基酸、約800個胺基酸至約1300個胺基酸、約800個胺基酸至約1250個胺基酸、約800個胺基酸至約1200個胺基酸、約800個胺基酸至約1150個胺基酸、約800個胺基酸至約1100個胺基酸、約800個胺基酸至約1050個胺基酸、約800個胺基酸至約1000個胺基酸、約800個胺基酸至約950個胺基酸、約800個胺基酸至約900個胺基酸、約800個胺基酸至約850個胺基酸、約850個胺基酸至約1950個胺基酸、約850個胺基酸至約1900個胺基酸、約850個胺基酸至約1850個胺基酸、約850個胺基酸至約1800個胺基酸、約850個胺基酸至約1750個胺基酸、約850個胺基酸至約1700個胺基酸、約850個胺基酸至約1650個胺基酸、約850個胺基酸至約1600個胺基酸、約850個胺基酸至約1550個胺基酸、約850個胺基酸至約1500個胺基酸、約850個胺基酸至約1450個胺基酸、約850個胺基酸至約1400個胺基酸、約850個胺基酸至約1350個胺基酸、約850個胺基酸至約1300個胺基酸、約850個胺基酸至約1250個胺基酸、約850個胺基酸至約1200個胺基酸、約850個胺基酸至約1150個胺基酸、約850個胺基酸至約1100個胺基酸、約850個胺基酸至約1050個胺基酸、約850個胺基酸至約1000個胺基酸、約850個胺基酸至約950個胺基酸、約850個胺基酸至約900個胺基酸、約900個胺基酸至約1950個胺基酸、約900個胺基酸至約1900個胺基酸、約900個胺基酸至約1850個胺基酸、約900個胺基酸至約1800個胺基酸、約900個胺基酸至約1750個胺基酸、約900個胺基酸至約1700個胺基酸、約900個胺基酸至約1650個胺基酸、約900個胺基酸至約1600個胺基酸、約900個胺基酸至約1550個胺基酸、約900個胺基酸至約1500個胺基酸、約900個胺基酸至約1450個胺基酸、約900個胺基酸至約1400個胺基酸、約900個胺基酸至約1350個胺基酸、約900個胺基酸至約1300個胺基酸、約900個胺基酸至約1250個胺基酸、約900個胺基酸至約1200個胺基酸、約900個胺基酸至約1150個胺基酸、約900個胺基酸至約1100個胺基酸、約900個胺基酸至約1050個胺基酸、約900個胺基酸至約1000個胺基酸、約900個胺基酸至約950個胺基酸、約950個胺基酸至約1950個胺基酸、約950個胺基酸至約1900個胺基酸、約950個胺基酸至約1850個胺基酸、約950個胺基酸至約1800個胺基酸、約950個胺基酸至約1750個胺基酸、約950個胺基酸至約1700個胺基酸、約950個胺基酸至約1650個胺基酸、約950個胺基酸至約1600個胺基酸、約950個胺基酸至約1550個胺基酸、約950個胺基酸至約1500個胺基酸、約950個胺基酸至約1450個胺基酸、約950個胺基酸至約1400個胺基酸、約950個胺基酸至約1350個胺基酸、約950個胺基酸至約1300個胺基酸、約950個胺基酸至約1250個胺基酸、約950個胺基酸至約1200個胺基酸、約950個胺基酸至約1150個胺基酸、約950個胺基酸至約1100個胺基酸、約950個胺基酸至約1050個胺基酸、約950個胺基酸至約1000個胺基酸、約1000個胺基酸至約1950個胺基酸、約1000個胺基酸至約1900個胺基酸、約1000個胺基酸至約1850個胺基酸、約1000個胺基酸至約1800個胺基酸、約1000個胺基酸至約1750個胺基酸、約1000個胺基酸至約1700個胺基酸、約1000個胺基酸至約1650個胺基酸、約1000個胺基酸至約1600個胺基酸、約1000個胺基酸至約1550個胺基酸、約1000個胺基酸至約1500個胺基酸、約1000個胺基酸至約1450個胺基酸、約1000個胺基酸至約1400個胺基酸、約1000個胺基酸至約1350個胺基酸、約1000個胺基酸至約1300個胺基酸、約1000個胺基酸至約1250個胺基酸、約1000個胺基酸至約1200個胺基酸、約1000個胺基酸至約1150個胺基酸、約1000個胺基酸至約1100個胺基酸、約1000個胺基酸至約1050個胺基酸、約1050個胺基酸至約1950個胺基酸、約1050個胺基酸至約1900個胺基酸、約1050個胺基酸至約1850個胺基酸、約1050個胺基酸至約1800個胺基酸、約1050個胺基酸至約1750個胺基酸、約1050個胺基酸至約1700個胺基酸、約1050個胺基酸至約1650個胺基酸、約1050個胺基酸至約1600個胺基酸、約1050個胺基酸至約1550個胺基酸、約1050個胺基酸至約1500個胺基酸、約1050個胺基酸至約1450個胺基酸、約1050個胺基酸至約1400個胺基酸、約1050個胺基酸至約1350個胺基酸、約1050個胺基酸至約1300個胺基酸、約1050個胺基酸至約1250個胺基酸、約1050個胺基酸至約1200個胺基酸、約1050個胺基酸至約1150個胺基酸、約1050個胺基酸至約1100個胺基酸、約1100個胺基酸至約1950個胺基酸、約1100個胺基酸至約1900個胺基酸、約1100個胺基酸至約1850個胺基酸、約1100個胺基酸至約1800個胺基酸、約1100個胺基酸至約1750個胺基酸、約1100個胺基酸至約1700個胺基酸、約1100個胺基酸至約1650個胺基酸、約1100個胺基酸至約1600個胺基酸、約1100個胺基酸至約1550個胺基酸、約1100個胺基酸至約1500個胺基酸、約1100個胺基酸至約1450個胺基酸、約1100個胺基酸至約1400個胺基酸、約1100個胺基酸至約1350個胺基酸、約1100個胺基酸至約1300個胺基酸、約1100個胺基酸至約1250個胺基酸、約1100個胺基酸至約1200個胺基酸、約1100個胺基酸至約1150個胺基酸、約1150個胺基酸至約1950個胺基酸、約1150個胺基酸至約1900個胺基酸、約1150個胺基酸至約1850個胺基酸、約1150個胺基酸至約1800個胺基酸、約1150個胺基酸至約1750個胺基酸、約1150個胺基酸至約1700個胺基酸、約1150個胺基酸至約1650個胺基酸、約1150個胺基酸至約1600個胺基酸、約1150個胺基酸至約1550個胺基酸、約1150個胺基酸至約1500個胺基酸、約1150個胺基酸至約1450個胺基酸、約1150個胺基酸至約1400個胺基酸、約1150個胺基酸至約1350個胺基酸、約1150個胺基酸至約1300個胺基酸、約1150個胺基酸至約1250個胺基酸、約1150個胺基酸至約1200個胺基酸、約1200個胺基酸至約1950個胺基酸、約1200個胺基酸至約1900個胺基酸、約1200個胺基酸至約1850個胺基酸、約1200個胺基酸至約1800個胺基酸、約1200個胺基酸至約1750個胺基酸、約1200個胺基酸至約1700個胺基酸、約1200個胺基酸至約1650個胺基酸、約1200個胺基酸至約1600個胺基酸、約1200個胺基酸至約1550個胺基酸、約1200個胺基酸至約1500個胺基酸、約1200個胺基酸至約1450個胺基酸、約1200個胺基酸至約1400個胺基酸、約1200個胺基酸至約1350個胺基酸、約1200個胺基酸至約1300個胺基酸、約1200個胺基酸至約1250個胺基酸、約1250個胺基酸至約1950個胺基酸、約1250個胺基酸至約1900個胺基酸、約1250個胺基酸至約1850個胺基酸、約1250個胺基酸至約1800個胺基酸、約1250個胺基酸至約1750個胺基酸、約1250個胺基酸至約1700個胺基酸、約1250個胺基酸至約1650個胺基酸、約1250個胺基酸至約1600個胺基酸、約1250個胺基酸至約1550個胺基酸、約1250個胺基酸至約1500個胺基酸、約1250個胺基酸至約1450個胺基酸、約1250個胺基酸至約1400個胺基酸、約1250個胺基酸至約1350個胺基酸、約1250個胺基酸至約1300個胺基酸、約1300個胺基酸至約1950個胺基酸、約1300個胺基酸至約1900個胺基酸、約1300個胺基酸至約1850個胺基酸、約1300個胺基酸至約1800個胺基酸、約1300個胺基酸至約1750個胺基酸、約1300個胺基酸至約1700個胺基酸、約1300個胺基酸至約1650個胺基酸、約1300個胺基酸至約1600個胺基酸、約1300個胺基酸至約1550個胺基酸、約1300個胺基酸至約1500個胺基酸、約1300個胺基酸至約1450個胺基酸、約1300個胺基酸至約1400個胺基酸、約1300個胺基酸至約1350個胺基酸、約1350個胺基酸至約1950個胺基酸、約1350個胺基酸至約1900個胺基酸、約1350個胺基酸至約1850個胺基酸、約1350個胺基酸至約1800個胺基酸、約1350個胺基酸至約1750個胺基酸、約1350個胺基酸至約1700個胺基酸、約1350個胺基酸至約1650個胺基酸、約1350個胺基酸至約1600個胺基酸、約1350個胺基酸至約1550個胺基酸、約1350個胺基酸至約1500個胺基酸、約1350個胺基酸至約1450個胺基酸、約1350個胺基酸至約1400個胺基酸、約1400個胺基酸至約1950個胺基酸、約1400個胺基酸至約1900個胺基酸、約1400個胺基酸至約1850個胺基酸、約1400個胺基酸至約1800個胺基酸、約1400個胺基酸至約1750個胺基酸、約1400個胺基酸至約1700個胺基酸、約1400個胺基酸至約1650個胺基酸、約1400個胺基酸至約1600個胺基酸、約1400個胺基酸至約1550個胺基酸、約1400個胺基酸至約1500個胺基酸、約1400個胺基酸至約1450個胺基酸、約1450個胺基酸至約1950個胺基酸、約1450個胺基酸至約1900個胺基酸、約1450個胺基酸至約1850個胺基酸、約1450個胺基酸至約1800個胺基酸、約1450個胺基酸至約1750個胺基酸、約1450個胺基酸至約1700個胺基酸、約1450個胺基酸至約1650個胺基酸、約1450個胺基酸至約1600個胺基酸、約1450個胺基酸至約1550個胺基酸、約1450個胺基酸至約1500個胺基酸、約1600個胺基酸至約1950個胺基酸、約1600個胺基酸至約1900個胺基酸、約1600個胺基酸至約1850個胺基酸、約1600個胺基酸至約1800個胺基酸、約1600個胺基酸至約1750個胺基酸、約1600個胺基酸至約1700個胺基酸、約1600個胺基酸至約1650個胺基酸、約1500個胺基酸至約1950個胺基酸、約1500個胺基酸至約1900個胺基酸、約1500個胺基酸至約1850個胺基酸、約1500個胺基酸至約1800個胺基酸、約1500個胺基酸至約1750個胺基酸、約1500個胺基酸至約1700個胺基酸、約1500個胺基酸至約1650個胺基酸、約1500個胺基酸至約1600個胺基酸、約1500個胺基酸至約1550個胺基酸、約1550個胺基酸至約1950個胺基酸、約1550個胺基酸至約1900個胺基酸、約1550個胺基酸至約1850個胺基酸、約1550個胺基酸至約1800個胺基酸、約1550個胺基酸至約1750個胺基酸、約1550個胺基酸至約1700個胺基酸、約1550個胺基酸至約1650個胺基酸、約1550個胺基酸至約1600個胺基酸、約1600個胺基酸至約1950個胺基酸、約1600個胺基酸至約1900個胺基酸、約1600個胺基酸至約1850個胺基酸、約1600個胺基酸至約1800個胺基酸、約1600個胺基酸至約1750個胺基酸、約1600個胺基酸至約1700個胺基酸、約1600個胺基酸至約1650個胺基酸、約1650個胺基酸至約1950個胺基酸、約1650個胺基酸至約1900個胺基酸、約1650個胺基酸至約1850個胺基酸、約1650個胺基酸至約1800個胺基酸、約1650個胺基酸至約1750個胺基酸、約1650個胺基酸至約1700個胺基酸、約1700個胺基酸至約1950個胺基酸、約1700個胺基酸至約1900個胺基酸、約1700個胺基酸至約1850個胺基酸、約1700個胺基酸至約1800個胺基酸、約1700個胺基酸至約1750個胺基酸、約1750個胺基酸至約1950個胺基酸、約1750個胺基酸至約1900個胺基酸、約1750個胺基酸至約1850個胺基酸、約1750個胺基酸至約1800個胺基酸、約1800個胺基酸至約1950個胺基酸、約1800個胺基酸至約1900個胺基酸、約1800個胺基酸至約1850個胺基酸、約1850個胺基酸至約1950個胺基酸、約1850個胺基酸至約1900個胺基酸、約1900個胺基酸至約1950個胺基酸)，其中編碼部分中每一者之胺基酸序列可視情況與編碼部分中另一者之胺基酸序列部分重疊；至少兩種不同載體中單一載體均不編碼活性耳畸蛋白之蛋白（例如，全長耳畸蛋白之蛋白（例如，全長野生型耳畸蛋白之蛋白））；且當引入哺乳動物細胞中時，該至少兩種不同載體彼此進行同源重組，從而形成重組核酸，其中該重組核酸編碼活性耳畸蛋白之蛋白（例如，全長耳畸蛋白之蛋白）。在一些實施例中，核酸載體中之一者可包括編碼耳畸蛋白之蛋白之一部分的編碼序列，其中該編碼部分之長度為例如約900個胺基酸至約1950個胺基酸、約900個胺基酸至約1900個胺基酸、約900個胺基酸至約1850個胺基酸、約900個胺基酸至約1800個胺基酸、約900個胺基酸至約1750個胺基酸、約900個胺基酸至約1700個胺基酸、約900個胺基酸至約1650個胺基酸、約900個胺基酸至約1600個胺基酸、約900個胺基酸至約1550個胺基酸、約900個胺基酸至約1500個胺基酸、約900個胺基酸至約1450個胺基酸、約900個胺基酸至約1400個胺基酸、約900個胺基酸至約1350個胺基酸、約900個胺基酸至約1300個胺基酸、約900個胺基酸至約1250個胺基酸、約900個胺基酸至約1200個胺基酸、約900個胺基酸至約1150個胺基酸、約900個胺基酸至約1100個胺基酸、約900個胺基酸至約1050個胺基酸、約900個胺基酸至約1000個胺基酸、約900個胺基酸至約950個胺基酸、約950個胺基酸至約1950個胺基酸、約950個胺基酸至約1900個胺基酸、約950個胺基酸至約1850個胺基酸、約950個胺基酸至約1800個胺基酸、約950個胺基酸至約1750個胺基酸、約950個胺基酸至約1700個胺基酸、約950個胺基酸至約1650個胺基酸、約950個胺基酸至約1600個胺基酸、約950個胺基酸至約1550個胺基酸、約950個胺基酸至約1500個胺基酸、約950個胺基酸至約1450個胺基酸、約950個胺基酸至約1400個胺基酸、約950個胺基酸至約1350個胺基酸、約950個胺基酸至約1300個胺基酸、約950個胺基酸至約1250個胺基酸、約950個胺基酸至約1200個胺基酸、約950個胺基酸至約1150個胺基酸、約950個胺基酸至約1100個胺基酸、約950個胺基酸至約1050個胺基酸、約950個胺基酸至約1000個胺基酸、約1000個胺基酸至約1950個胺基酸、約1000個胺基酸至約1900個胺基酸、約1000個胺基酸至約1850個胺基酸、約1000個胺基酸至約1800個胺基酸、約1000個胺基酸至約1750個胺基酸、約1000個胺基酸至約1700個胺基酸、約1000個胺基酸至約1650個胺基酸、約1000個胺基酸至約1600個胺基酸、約1000個胺基酸至約1550個胺基酸、約1000個胺基酸至約1500個胺基酸、約1000個胺基酸至約1450個胺基酸、約1000個胺基酸至約1400個胺基酸、約1000個胺基酸至約1350個胺基酸、約1000個胺基酸至約1300個胺基酸、約1000個胺基酸至約1250個胺基酸、約1000個胺基酸至約1200個胺基酸、約1000個胺基酸至約1150個胺基酸、約1000個胺基酸至約1100個胺基酸、約1000個胺基酸至約1050個胺基酸、約1050個胺基酸至約1950個胺基酸、約1050個胺基酸至約1900個胺基酸、約1050個胺基酸至約1850個胺基酸、約1050個胺基酸至約1800個胺基酸、約1050個胺基酸至約1750個胺基酸、約1050個胺基酸至約1700個胺基酸、約1050個胺基酸至約1650個胺基酸、約1050個胺基酸至約1600個胺基酸、約1050個胺基酸至約1550個胺基酸、約1050個胺基酸至約1500個胺基酸、約1050個胺基酸至約1450個胺基酸、約1050個胺基酸至約1400個胺基酸、約1050個胺基酸至約1350個胺基酸、約1050個胺基酸至約1300個胺基酸、約1050個胺基酸至約1250個胺基酸、約1050個胺基酸至約1200個胺基酸、約1050個胺基酸至約1150個胺基酸、約1050個胺基酸至約1100個胺基酸、約1100個胺基酸至約1950個胺基酸、約1100個胺基酸至約1900個胺基酸、約1100個胺基酸至約1850個胺基酸、約1100個胺基酸至約1800個胺基酸、約1100個胺基酸至約1750個胺基酸、約1100個胺基酸至約1700個胺基酸、約1100個胺基酸至約1650個胺基酸、約1100個胺基酸至約1600個胺基酸、約1100個胺基酸至約1550個胺基酸、約1100個胺基酸至約1500個胺基酸、約1100個胺基酸至約1450個胺基酸、約1100個胺基酸至約1400個胺基酸、約1100個胺基酸至約1350個胺基酸、約1100個胺基酸至約1300個胺基酸、約1100個胺基酸至約1250個胺基酸、約1100個胺基酸至約1200個胺基酸、約1100個胺基酸至約1150個胺基酸、約1150個胺基酸至約1950個胺基酸、約1150個胺基酸至約1900個胺基酸、約1150個胺基酸至約1850個胺基酸、約1150個胺基酸至約1800個胺基酸、約1150個胺基酸至約1750個胺基酸、約1150個胺基酸至約1700個胺基酸、約1150個胺基酸至約1650個胺基酸、約1150個胺基酸至約1600個胺基酸、約1150個胺基酸至約1550個胺基酸、約1150個胺基酸至約1500個胺基酸、約1150個胺基酸至約1450個胺基酸、約1150個胺基酸至約1400個胺基酸、約1150個胺基酸至約1350個胺基酸、約1150個胺基酸至約1300個胺基酸、約1150個胺基酸至約1250個胺基酸、約1150個胺基酸至約1200個胺基酸、約1200個胺基酸至約1950個胺基酸、約1200個胺基酸至約1900個胺基酸、約1200個胺基酸至約1850個胺基酸、約1200個胺基酸至約1800個胺基酸、約1200個胺基酸至約1750個胺基酸、約1200個胺基酸至約1700個胺基酸、約1200個胺基酸至約1650個胺基酸、約1200個胺基酸至約1600個胺基酸、約1200個胺基酸至約1550個胺基酸、約1200個胺基酸至約1500個胺基酸、約1200個胺基酸至約1450個胺基酸、約1200個胺基酸至約1400個胺基酸、約1200個胺基酸至約1350個胺基酸、約1200個胺基酸至約1300個胺基酸、約1200個胺基酸至約1250個胺基酸、約1250個胺基酸至約1950個胺基酸、約1250個胺基酸至約1900個胺基酸、約1250個胺基酸至約1850個胺基酸、約1250個胺基酸至約1800個胺基酸、約1250個胺基酸至約1750個胺基酸、約1250個胺基酸至約1700個胺基酸、約1250個胺基酸至約1650個胺基酸、約1250個胺基酸至約1600個胺基酸、約1250個胺基酸至約1550個胺基酸、約1250個胺基酸至約1500個胺基酸、約1250個胺基酸至約1450個胺基酸、約1250個胺基酸至約1400個胺基酸、約1250個胺基酸至約1350個胺基酸、約1250個胺基酸至約1300個胺基酸、約1300個胺基酸至約1950個胺基酸、約1300個胺基酸至約1900個胺基酸、約1300個胺基酸至約1850個胺基酸、約1300個胺基酸至約1800個胺基酸、約1300個胺基酸至約1750個胺基酸、約1300個胺基酸至約1700個胺基酸、約1300個胺基酸至約1650個胺基酸、約1300個胺基酸至約1600個胺基酸、約1300個胺基酸至約1550個胺基酸、約1300個胺基酸至約1500個胺基酸、約1300個胺基酸至約1450個胺基酸、約1300個胺基酸至約1400個胺基酸、約1300個胺基酸至約1350個胺基酸、約1350個胺基酸至約1950個胺基酸、約1350個胺基酸至約1900個胺基酸、約1350個胺基酸至約1850個胺基酸、約1350個胺基酸至約1800個胺基酸、約1350個胺基酸至約1750個胺基酸、約1350個胺基酸至約1700個胺基酸、約1350個胺基酸至約1650個胺基酸、約1350個胺基酸至約1600個胺基酸、約1350個胺基酸至約1550個胺基酸、約1350個胺基酸至約1500個胺基酸、約1350個胺基酸至約1450個胺基酸、約1350個胺基酸至約1400個胺基酸、約1400個胺基酸至約1950個胺基酸、約1400個胺基酸至約1900個胺基酸、約1400個胺基酸至約1850個胺基酸、約1400個胺基酸至約1800個胺基酸、約1400個胺基酸至約1750個胺基酸、約1400個胺基酸至約1700個胺基酸、約1400個胺基酸至約1650個胺基酸、約1400個胺基酸至約1600個胺基酸、約1400個胺基酸至約1550個胺基酸、約1400個胺基酸至約1500個胺基酸、約1400個胺基酸至約1450個胺基酸、約1450個胺基酸至約1950個胺基酸、約1450個胺基酸至約1900個胺基酸、約1450個胺基酸至約1850個胺基酸、約1450個胺基酸至約1800個胺基酸、約1450個胺基酸至約1750個胺基酸、約1450個胺基酸至約1700個胺基酸、約1450個胺基酸至約1650個胺基酸、約1450個胺基酸至約1600個胺基酸、約1450個胺基酸至約1550個胺基酸、約1450個胺基酸至約1500個胺基酸、約1500個胺基酸至約1950個胺基酸、約1500個胺基酸至約1900個胺基酸、約1500個胺基酸至約1850個胺基酸、約1500個胺基酸至約1800個胺基酸、約1500個胺基酸至約1750個胺基酸、約1500個胺基酸至約1700個胺基酸、約1500個胺基酸至約1650個胺基酸、約1500個胺基酸至約1600個胺基酸、約1500個胺基酸至約1550個胺基酸、約1550個胺基酸至約1950個胺基酸、約1550個胺基酸至約1900個胺基酸、約1550個胺基酸至約1850個胺基酸、約1550個胺基酸至約1800個胺基酸、約1550個胺基酸至約1750個胺基酸、約1550個胺基酸至約1700個胺基酸、約1550個胺基酸至約1650個胺基酸、約1550個胺基酸至約1600個胺基酸、約1600個胺基酸至約1950個胺基酸、約1600個胺基酸至約1900個胺基酸、約1600個胺基酸至約1850個胺基酸、約1600個胺基酸至約1800個胺基酸、約1600個胺基酸至約1750個胺基酸、約1600個胺基酸至約1700個胺基酸、約1600個胺基酸至約1650個胺基酸、約1650個胺基酸至約1950個胺基酸、約1650個胺基酸至約1900個胺基酸、約1650個胺基酸至約1850個胺基酸、約1650個胺基酸至約1800個胺基酸、約1650個胺基酸至約1750個胺基酸、約1650個胺基酸至約1700個胺基酸、約1700個胺基酸至約1950個胺基酸、約1700個胺基酸至約1900個胺基酸、約1700個胺基酸至約1850個胺基酸、約1700個胺基酸至約1800個胺基酸、約1700個胺基酸至約1750個胺基酸、約1750個胺基酸至約1950個胺基酸、約1750個胺基酸至約1900個胺基酸、約1750個胺基酸至約1850個胺基酸、約1750個胺基酸至約1800個胺基酸、約1800個胺基酸至約1950個胺基酸、約1800個胺基酸至約1900個胺基酸、約1800個胺基酸至約1850個胺基酸、約1850個胺基酸至約1950個胺基酸、約1850個胺基酸至約1900個胺基酸或約1900個胺基酸至約1950個胺基酸。
在此等組成物之一些實施例中，編碼序列中之至少一者包括跨越耳畸蛋白基因體DNA之兩個相鄰外顯子的核苷酸序列，且缺乏兩個相鄰外顯子之間天然存在之內含子序列。
在一些實施例中，無編碼部分之胺基酸序列與編碼部分中另一者之胺基酸序列甚至部分重疊。在一些實施例中，編碼部分中一或多者之胺基酸序列與編碼部分中另一者之胺基酸序列部分重疊。在一些實施例中，編碼部分中每一者之胺基酸序列與編碼部分中另一者之胺基酸序列部分重疊。
在一些實施例中，重疊胺基酸序列之長度為約30個胺基酸殘基至約1000個胺基酸之間(例如，或此本文所述範圍之任何亞範圍)。
在一些實例中，載體包括兩種不同載體，該等載體中之每一者不僅包含外顯子，而且包含內含子之不同區段，其中內含子包括內含子中存在於耳畸蛋白基因體DNA中之核苷酸序列(例如，本文所述SEQ ID NO: 12中之例示性內含子中的任一者)，且其中兩個不同區段之序列重疊至少100個核苷酸(例如，約100個核苷酸至約5,000個核苷酸、約100個核苷酸至約4,500個核苷酸、約100個核苷酸至約4,000個核苷酸、約100個核苷酸至約3,500個核苷酸、約100個核苷酸至約3,000個核苷酸、約100個核苷酸至約2,500個核苷酸、約100個核苷酸至約2,000個核苷酸、約100個核苷酸至約1,500個核苷酸、約100個核苷酸至約1,000個核苷酸、約100個核苷酸至約800個核苷酸、約100個核苷酸至約600個核苷酸、約100個核苷酸至約400個核苷酸、約100個核苷酸至約200個核苷酸、約200個核苷酸至約5,000個核苷酸、約200個核苷酸至約4,500個核苷酸、約200個核苷酸至約4,000個核苷酸、約200個核苷酸至約3,500個核苷酸、約200個核苷酸至約3,000個核苷酸、約200個核苷酸至約2,500個核苷酸、約200個核苷酸至約2,000個核苷酸、約200個核苷酸至約1,500個核苷酸、約200個核苷酸至約1,000個核苷酸、約200個核苷酸至約800個核苷酸、約200個核苷酸至約600個核苷酸、約200個核苷酸至約400個核苷酸、約400個核苷酸至約5,000個核苷酸、約400個核苷酸至約4,500個核苷酸、約400個核苷酸至約4,000個核苷酸、約400個核苷酸至約3,500個核苷酸、約400個核苷酸至約3,000個核苷酸、約400個核苷酸至約2,500個核苷酸、約400個核苷酸至約2,000個核苷酸、約400個核苷酸至約1,500個核苷酸、約400個核苷酸至約1,000個核苷酸、約400個核苷酸至約800個核苷酸、約400個核苷酸至約600個核苷酸、約600個核苷酸至約5,000個核苷酸、約600個核苷酸至約4,500個核苷酸、約600個核苷酸至約4,000個核苷酸、約600個核苷酸至約3,500個核苷酸、約600個核苷酸至約3,000個核苷酸、約600個核苷酸至約2,500個核苷酸、約600個核苷酸至約2,000個核苷酸、約600個核苷酸至約1,500個核苷酸、約600個核苷酸至約1,000個核苷酸、約600個核苷酸至約800個核苷酸、約800個核苷酸至約5,000個核苷酸、約800個核苷酸至約4,500個核苷酸、約800個核苷酸至約4,000個核苷酸、約800個核苷酸至約3,500個核苷酸、約800個核苷酸至約3,000個核苷酸、約800個核苷酸至約2,500個核苷酸、約800個核苷酸至約2,000個核苷酸、約800個核苷酸至約1,500個核苷酸、約800個核苷酸至約1,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約5,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約4,500個核苷酸、約1,000個核苷酸至約4,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約3,500個核苷酸、約1,000個核苷酸至約3,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約2,500個核苷酸、約1,000個核苷酸至約2,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約1,500個核苷酸、約1,500個核苷酸至約5,000個核苷酸、約1,500個核苷酸至約4,500個核苷酸、約1,500個核苷酸至約4,000個核苷酸、約1,500個核苷酸至約3,500個核苷酸、約1,500個核苷酸至約3,000個核苷酸、約1,500個核苷酸至約2,500個核苷酸、約1,500個核苷酸至約2,000個核苷酸、約2,000個核苷酸至約5,000個核苷酸、約2,000個核苷酸至約4,500個核苷酸、約2,000個核苷酸至約4,000個核苷酸、約2,000個核苷酸至約3,500個核苷酸、約2,000個核苷酸至約3,000個核苷酸、約2,000個核苷酸至約2,500個核苷酸、約2,500個核苷酸至約5,000個核苷酸、約2,500個核苷酸至約4,500個核苷酸、約2,500個核苷酸至約4,000個核苷酸、約2,500個核苷酸至約3,500個核苷酸、約2,500個核苷酸至約3,000個核苷酸、約3,000個核苷酸至約5,000個核苷酸、約3,000個核苷酸至約4,500個核苷酸、約3,000個核苷酸至約4,000個核苷酸、約3,000個核苷酸至約3,500個核苷酸、約3,500個核苷酸至約5,000個核苷酸、約3,500個核苷酸至約4,500個核苷酸、約3,500個核苷酸至約4,000個核苷酸、約4,000個核苷酸至約5,000個核苷酸、約4,000個核苷酸至約4,500個核苷酸、約4,500個核苷酸至約5,000個核苷酸)之長度。
不同載體中任兩者中之重疊核苷酸序列可包括耳畸蛋白基因之一或多個外顯子之部分或全部(例如，本文所述SEQ ID NO: 12中例示性外顯子中之任何一或多者)。
在一些實施例中，組成物中不同載體之數量為兩種、三種、四種或五種。在組成物中不同載體之數量為兩種之組成物中，兩種不同載體中之第一者可包括編碼耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的編碼序列。在一些實例中，耳畸蛋白基因之N末端部分的長度為約30個胺基酸至約1950個胺基酸(或上述此範圍之任何亞範圍)。在一些實例中，第一載體還包括啟動子(例如，本文所述或此項技術中已知啟動子中之任一者)及Kozak序列(例如，本文所述或此項技術中已知例示性Kozak序列中之任一者)中之一或兩者。在一些實例中，第一載體包括為誘導型啟動子、組成型啟動子或組織特異性啟動子之啟動子。在一些實例中，兩種不同載體中之第二者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之C末端部分的編碼序列。在一些實例中，耳畸蛋白之蛋白之C末端部分的長度為30個胺基酸至約1950個胺基酸(或上述此範圍之任何亞範圍)。在一些實例中，第二載體還包括poly(A)訊號序列。
在組成物中不同載體之數量为两種之一些實例中，由两種載體中之一者編碼之N末端部分可包括包含以下之部分：野生型耳畸蛋白之蛋白(例如，SEQ ID NO: 5)之胺基酸位置1至約胺基酸位置1,950、約胺基酸位置1,940、約胺基酸位置1,930、約胺基酸位置1,920、約胺基酸位置1,910、約胺基酸位置1,900、約胺基酸位置1,900、約胺基酸位置1,890、約胺基酸位置1,880、約胺基酸位置1,870、約胺基酸位置1,860、約胺基酸位置1,850、約胺基酸位置1,840、約胺基酸位置1,830、約胺基酸位置1,820、約胺基酸位置1,810、約胺基酸位置1,800、約胺基酸位置1,790、約胺基酸位置1,780、約胺基酸位置1,770、約胺基酸位置1,760、約胺基酸位置1,750、約胺基酸位置1,740、約胺基酸位置1,730、約胺基酸位置1,720、約胺基酸位置1,710、約胺基酸位置1,700、約胺基酸位置、約胺基酸位置1,690、約胺基酸位置1,680、約胺基酸位置1,670、約胺基酸位置1,660、約胺基酸位置1,650、約胺基酸位置1,640、約胺基酸位置1,630、約胺基酸位置1,620、約胺基酸位置1,610、約胺基酸位置1,600、約胺基酸位置1,590、約胺基酸位置1,580、約胺基酸位置1,570、約胺基酸位置1,560、約胺基酸位置1,550、約胺基酸位置1,540、約胺基酸位置1,530、約胺基酸位置1,520、約胺基酸位置1,510、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,500、約胺基酸位置1,490、約胺基酸位置1,480、約胺基酸位置1,470、約胺基酸位置1,460、約胺基酸位置1,450、約胺基酸位置1,440、約胺基酸位置1,430、約胺基酸位置1,420、約胺基酸位置1,410、約胺基酸位置1,400、約胺基酸位置1,390、約胺基酸位置1,380、約胺基酸位置1,370、約胺基酸位置1,360、約胺基酸位置1,350、約胺基酸位置1,340、約胺基酸位置1,330、約胺基酸位置1,320、約胺基酸位置1,310、約胺基酸位置1,300、約胺基酸位置1,290、約胺基酸位置1,280、約胺基酸位置1,270、約胺基酸位置1,260、約胺基酸位置1,250、約胺基酸位置1,240、約胺基酸位置1,230、約胺基酸位置1,220、約胺基酸位置1,210、約胺基酸位置1,200、約胺基酸位置1,190、約胺基酸位置1,180、約胺基酸位置1,170、約胺基酸位置1,160、約胺基酸位置1,150、約胺基酸位置1,140、約胺基酸位置1,130、約胺基酸位置1,120、約胺基酸位置1,110、約胺基酸位置1,100、約胺基酸位置1,090、約胺基酸位置1,080、約胺基酸位置1,070、約胺基酸位置1,060、約胺基酸位置1,050、約胺基酸位置1,040、約胺基酸位置1,030、約胺基酸位置1,020、約胺基酸位置1,010、約胺基酸位置1,000、約胺基酸位置990、約胺基酸位置980、約胺基酸位置970、約胺基酸位置960、約胺基酸位置950、約胺基酸位置940、約胺基酸位置930、約胺基酸位置920、約胺基酸位置910、約胺基酸位置900、約胺基酸位置890、約胺基酸位置880、約胺基酸位置870、約胺基酸位置860、約胺基酸位置850、約胺基酸位置840、約胺基酸位置830、約胺基酸位置820、約胺基酸位置810、約胺基酸位置800、約胺基酸位置790、約胺基酸位置780、約胺基酸位置770、約胺基酸位置760、約胺基酸位置750、約胺基酸位置740、約胺基酸位置730、約胺基酸位置720、約胺基酸位置710、約胺基酸位置700、約胺基酸位置690、約胺基酸位置680、約胺基酸位置670、約胺基酸位置660、約胺基酸位置650、約胺基酸位置640、約胺基酸位置630、約胺基酸位置620、約胺基酸位置610、約胺基酸位置600、約胺基酸位置590、約胺基酸位置580、約胺基酸位置570、約胺基酸位置560、約胺基酸位置550、約胺基酸位置540、約胺基酸位置530、約胺基酸位置520、約胺基酸位置510、約胺基酸位置500、約胺基酸位置490、約胺基酸位置480、約胺基酸位置470、約胺基酸位置460、約胺基酸位置450、約胺基酸位置440、約胺基酸位置430、約胺基酸位置420、約胺基酸位置410、約胺基酸位置400、約胺基酸位置390、約胺基酸位置380、約胺基酸位置370、約胺基酸位置360、約胺基酸位置350、約胺基酸位置340、約胺基酸位置330、約胺基酸位置320、約胺基酸位置310、約胺基酸位置300、約胺基酸位置290、約胺基酸位置280、約胺基酸位置270、約胺基酸位置260、約胺基酸位置250、約胺基酸位置240、約胺基酸位置230、約胺基酸位置220、約胺基酸位置210、約胺基酸位置200、約胺基酸位置190、約胺基酸位置180、約胺基酸位置170、約胺基酸位置160、約胺基酸位置150、約胺基酸位置140、約胺基酸位置130、約胺基酸位置120、約胺基酸位置110、約胺基酸位置100、約胺基酸位置90、約胺基酸位置80、約胺基酸位置70、約胺基酸位置60、約胺基酸位置50或約胺基酸位置40。
在組成物中不同載體之數量為兩種之一些實例中，前體耳畸蛋白之蛋白的N末端部分可包括包含以下之部分：野生型耳畸蛋白之蛋白(例如，SEQ ID NO: 5)的胺基酸位置1至胺基酸位置310、胺基酸位置1至約胺基酸位置320、胺基酸位置1至約胺基酸位置330、胺基酸位置1至約胺基酸位置340、胺基酸位置1至約胺基酸位置350、胺基酸位置1至約胺基酸位置360、胺基酸位置1至約胺基酸位置370、胺基酸位置1至約胺基酸位置380、胺基酸位置1至約胺基酸位置390、胺基酸位置1至約胺基酸位置400、胺基酸位置1至約胺基酸位置410、胺基酸位置1至約胺基酸位置420、胺基酸位置1至約胺基酸位置430、胺基酸位置1至約胺基酸位置440、胺基酸位置1至約胺基酸位置450、胺基酸位置1至約胺基酸位置460、胺基酸位置1至約胺基酸位置470、胺基酸位置1至約胺基酸位置480、胺基酸位置1至約胺基酸位置490、胺基酸位置1至約胺基酸位置500、胺基酸位置1至約胺基酸位置510、胺基酸位置1至約胺基酸位置520、胺基酸位置1至約胺基酸位置530、胺基酸位置1至約胺基酸位置540、胺基酸位置1至約胺基酸位置550、胺基酸位置1至約胺基酸位置560、胺基酸位置1至約胺基酸位置570、胺基酸位置1至約胺基酸位置580、胺基酸位置1至約胺基酸位置590、胺基酸位置1至約胺基酸位置600、胺基酸位置1至約胺基酸位置610、胺基酸位置1至約胺基酸位置620、胺基酸位置1至約胺基酸位置630、胺基酸位置1至約胺基酸位置640、胺基酸位置1至約胺基酸位置650、胺基酸位置1至約胺基酸位置660、胺基酸位置1至約胺基酸位置670、胺基酸位置1至約胺基酸位置680、胺基酸位置1至約胺基酸位置690、胺基酸位置1至約胺基酸位置700、胺基酸位置1至約胺基酸位置710、胺基酸位置1至約胺基酸位置720、胺基酸位置1至約胺基酸位置730、胺基酸位置1至約胺基酸位置740、胺基酸位置1至約胺基酸位置750、胺基酸位置1至約胺基酸位置760、胺基酸位置1至約胺基酸位置770、胺基酸位置1至約胺基酸位置780、胺基酸位置1至約胺基酸位置790、胺基酸位置1至約胺基酸位置800、胺基酸位置1至約胺基酸位置810、胺基酸位置1至約胺基酸位置820、胺基酸位置1至約胺基酸位置830、胺基酸位置1至約胺基酸位置840、胺基酸位置1至約胺基酸位置850、胺基酸位置1至約胺基酸位置860、胺基酸位置1至約胺基酸位置870、胺基酸位置1至約胺基酸位置880、胺基酸位置1至約胺基酸位置890、胺基酸位置1至約胺基酸位置900、胺基酸位置1至約胺基酸位置910、胺基酸位置1至約胺基酸位置920、胺基酸位置1至約胺基酸位置930、胺基酸位置1至約胺基酸位置940、胺基酸位置1至約胺基酸位置950、胺基酸位置1至約胺基酸位置960、胺基酸位置1至約胺基酸位置970、胺基酸位置1至約胺基酸位置980、胺基酸位置1至約胺基酸位置990、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,000、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,010、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,020、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,030、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,040、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,050、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,060、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,070、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,080、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,090、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,100、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,110、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,120、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,130、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,140、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,150、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,160、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,170、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,180、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,190、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,200、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,210、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,220、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,230、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,240、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,250、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,260、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,270、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,280、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,290、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,300、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,310、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,320、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,330、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,340、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,350、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,360、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,370、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,380、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,390、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,400、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,410、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,420、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,430、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,440、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,450、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,460、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,470、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,480、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,490、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,500、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,510、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,520、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,530、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,540、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,550、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,560、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,570、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,580、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,590、胺基酸位置1至約胺基酸位置1,600、胺基酸位置1至約胺基酸1,610、胺基酸位置1至約胺基酸1,620、胺基酸位置1至約胺基酸1,630、胺基酸位置1至約胺基酸1,640、胺基酸位置1至約胺基酸1,650、胺基酸位置1至約胺基酸1,660、胺基酸位置1至約胺基酸1,670、胺基酸位置1至約胺基酸1,680、胺基酸位置1至約胺基酸1,690、胺基酸位置1至約胺基酸1,700、胺基酸位置1至約胺基酸1,710、胺基酸位置1至約胺基酸1,720、胺基酸位置1至約胺基酸1,730、胺基酸位置1至約胺基酸1,740、胺基酸位置1至約胺基酸1,750、胺基酸位置1至約胺基酸1,760、胺基酸位置1至約胺基酸1,770、胺基酸位置1至約胺基酸1,780、胺基酸位置1至約胺基酸1,790、胺基酸位置1至約胺基酸1,800、胺基酸位置1至約胺基酸1,810、胺基酸位置1至約胺基酸1,820、胺基酸位置1至約胺基酸1,830、胺基酸位置1至約胺基酸1,840、胺基酸位置1至約胺基酸1,850、胺基酸位置1至約胺基酸1,860、胺基酸位置1至約胺基酸1,870、胺基酸位置1至約胺基酸1,880、胺基酸位置1至約胺基酸1,890、胺基酸位置1至約胺基酸1,900、胺基酸位置1至約胺基酸1,910、胺基酸位置1至約胺基酸1,920、胺基酸位置1至約胺基酸1,930、胺基酸位置1至約胺基酸1,940、胺基酸位置1至約胺基酸1,950、胺基酸位置1至約胺基酸1,960、胺基酸位置1至約胺基酸1,970、胺基酸位置1至約胺基酸1,980。
在一些實例中，組成物包括兩種載體，其中兩種載體中之第一者包括與SEQ ID NO: 62至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之編碼序列，且兩種載體中之第二者包括與SEQ ID NO: 63至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之編碼序列。
如本文所用，術語「載體」包括當與適當控制元件結合時能夠複製且可在細胞之間轉移基因序列的任何遺傳元件，諸如質體、噬菌體、轉位子、黏接質體、染色體、人工染色體、病毒、病毒體等。因此，該術語包括選殖及表現載體，以及病毒載體。在一些實施例中，有用載體預期為待轉錄核酸區段位於啟動子之轉錄控制下的彼等載體。
在一些實例中，載體可為人工染色體(例如，人類人工染色體(HAC)、酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或來源於P1之人工染色體(PAC))或病毒載體(例如，任何腺病毒載體(例如，pSV或pCMV載體)、本文所述之任何逆轉錄病毒載體及任何Gateway®載體)。載體可例如包括足夠表現用順式作用元件；其他表現用元件可由宿主哺乳動物細胞或在活體外表現系統中提供。
「啟動子」指由細胞之合成機制或引入之合成機制識別，起始多核苷酸序列(例如，基因)之特異性轉錄所需的DNA序列。短語「操作性定位」、「在控制下」或「在轉錄控制下」指啟動子相對於核酸處於正確位置及方向下以控制基因之RNA聚合酶起始及表現。術語「表現載體或構築體」指含有核酸之任何類型遺傳構築體，其中該核酸編碼序列之部分或全部能夠進行轉錄。在一些實施例中，表現包括核酸之轉錄，例如以自轉錄之基因產生生物學活性多肽產物或抑制性RNA (例如，shRNA、miRNA、miRNA抑制子)。
載體包括此項技術中所有彼等已知載體，包括併入重組多核苷酸之黏接質體、質體(例如，裸質體或包含在脂質體中之質體)及病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。熟習此項技術者將能夠選擇合適載體及哺乳動物細胞來製備本文所述核酸中之任一者。
在一些實施例中，載體為質體(亦即，可在細胞內自主複製之環狀DNA分子)。在一些實施例中，載體可為黏接質體(例如，pWE及sCos系列(Wahl等人，(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2160-2164，Evans等人，(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5030-5034)。
術語「轉移載體」指包括經分離核酸且可用於將經分離核酸遞送至細胞內部之物質組成物。此項技術中已知諸多載體，包括(但不限於)線性多核苷酸、與離子或兩親化合物結合之多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製質體或病毒。該術語亦應視為還包括有助於核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物，諸如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似物。病毒轉移載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體及其類似物。
術語「表現載體」指包括重組多核苷酸之載體，該重組多核苷酸包括操作性連接於待表現核苷酸序列之表現控制序列。表現載體包括足夠表現用順式作用元件；其他表現用元件可由宿主細胞或在活體外表現系統中提供。表現載體包括此項技術中所有彼等已知載體，包括併入重組多核苷酸之黏接質體、質體(例如，裸質體或包含在脂質體中之質體)及病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
在一些實施例中，載體為人工染色體。人工染色體為一種經遺傳工程改造之染色體，其可作為用來攜載大DNA插入片段之載體使用。在一些實施例中，人工染色體為人類人工染色體(HAC)(參見例如，Kouprina等人，Expert Opin. Drug Deliv 11(4): 517-535, 2014；Basu等人，Pediatr. Clin. North Am. 53: 843-853, 2006；Ren等人，Stem. Cell Rev. 2(1):43-50, 2006；Kazuki等人，Mol. Ther. 19(9):1591-1601, 2011；Kazuki等人，Gen. Ther. 18: 384-393, 2011；及Katoh等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 321:280-290, 2004)。
在一些實施例中，載體為酵母人工染色體(YAC)(參見例如，Murray等人，Nature 305: 189-193, 1983; Ikeno等人，(1998)Nat. Biotech. 16:431-439, 1998)。在一些實施例中，載體為細菌人工染色體(BAC)(例如，pBeloBAC11、pECBAC1及pBAC108L)。在一些實施例中，載體為來源於P1之人工染色體(PAC)。人工染色體之實例為此項技術中所已知。
在一些實施例中，載體為病毒載體(例如，腺相關病毒、腺病毒、慢病毒及逆轉錄病毒)。病毒載體之非限制性實例描述於本文中。重組 AAV 載體
本揭示案之「重組AAV載體」或「rAAV」典型地至少包含轉殖基因或其一部分及調節序列，以及視情況存在之5'及3' AAV反向末端重複序列(ITR)。將此重組AAV載體包裝至衣殼蛋白中且遞送至所選標靶細胞中。在一些實施例中，轉殖基因為與載體序列異源之核酸序列，其編碼目的多肽、蛋白、功能RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制子)或其他基因產物。該核酸編碼序列以允許轉殖基因在標靶組織之細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式與調節組分操作性連接。
在一些實施例中，載體為腺相關病毒載體(AAV)(參見例如，Asokan等人，Mol. Ther. 20: 699-7080, 2012)。「重組AAV載體」或「rAAV」典型地至少包含轉殖基因或其一部分及調節序列，以及視情況存在之5'及3' AAV反向末端重複序列(ITR)。將該重組AAV載體包裝至衣殼中以形成rAAV粒子，且遞送至所選標靶細胞(例如，內毛細胞)中。ITR
載體之AAV序列典型地包含順式作用性5'及3'反向末端重複序列(參見例如，B. J. Carter, 「Handbook of Parvoviruses」中, P. Tijsser編, CRC Press, 第155 168頁 (1990))。ITR序列之長度為約145 nt。較佳地，實質上將編碼ITR之整個序列用於分子中，但允許對此等序列進行某種程度之微小修飾。修飾此等ITR序列之能力在此項技術之技能範圍內。(參見例如，如下文章，諸如Sambrook等人「Molecular Cloning. A Laboratory Manual」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；及K. Fisher等人，J Virol., 70:520 532 (1996))。在本揭示案中使用之該分子之一實例為含轉殖基因之「順式作用」質體，其中所選轉殖基因序列及相關調節元件側接有5'及3' AAV ITR序列。AAV ITR序列可獲自任何已知AAV，包括目前鑑別之哺乳動物AAV類型。在一些實施例中，ITR為或包含145個核苷酸。在一些實施例中，ITR為野生型AAV2 ITR，例如SEQ ID NO: 97之5' ITR及SEQ ID NO: 104之3' ITR。在一些實施例中，ITR來源於野生型AAV2 ITR，且包括一或多種修飾，例如此項技術中已知之截短、缺失、取代或插入。在一些實施例中，ITR包含少於145個核苷酸，例如127、130、134或141個核苷酸。例如，在一些實施例中，ITR包含110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144或145個核苷酸。
5' AAV ITR序列之非限制性實例為SEQ ID NO: 59。3' AAV ITR序列之非限制性實例為SEQ ID NO: 60。在一些實施例中，本揭示案之載體及/或構築體包含5' AAV ITR及/或3' AAV ITR。在一些實施例中，5' AAV ITR序列為SEQ ID NO: 97。在一些實施例中，3' AAV ITR序列為SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，5' AAV ITR序列為SEQ ID NO: 97，且3' AAV ITR序列為SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，5'及3' AAV ITR (例如，SEQ ID NO: 97及104)側接包含OTOF 之一部分(例如，SEQ ID NO: 101或107)的轉殖基因及/或構築體之一部分。其他元件
除上文鑑別之重組AAV載體之主要元件外，載體亦包括習知控制元件，該等控制元件與轉殖基因以允許該轉殖基因在經質體載體轉染或用本揭示案產生之病毒感染之細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式操作性連接。如本文所用，「操作性連接」之序列包括與目的基因相鄰之表現控制序列及以反式或間隔方式作用以控制目的基因之表現控制序列兩者。
本文所述之AAV載體可包括本文所述調節元件中之任一者(例如，啟動子、polyA序列及IRES中之一或多者)。衣殼
在一些實施例中，將本揭示案之一或多種重組AAV載體包裝至AAV2、3、4、5、6、7、8、9、10、rh8、rh10、rh39、rh43或Anc80 血清型或其一或多種雜交體之衣殼中。在一些實施例中，衣殼來自祖先血清型。例如，在一些實施例中，衣殼為Anc80衣殼(例如，Anc80L65衣殼)。在一些實施例中，衣殼包含由SEQ ID NO: 109表示之多肽。在一些實施例中，衣殼包含與SEQ ID NO: 109表示之多肽具有至少85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的多肽。
ITR及衣殼之任何組合可用於本揭示案之重組AAV載體中，例如，野生型或變體AAV2 ITR及Anc80衣殼、野生型或變體AAV2 ITR及AAV6衣殼等。在本揭示案之一些實施例中，rAAV粒子為包含Anc80衣殼(例如，包含SEQ ID NO: 109之多肽)之rAAV2/Anc80粒子，該Anc80衣殼殼體化如下核酸載體，其中野生型AAV2 ITR (例如SEQ ID NO: 97及SEQ ID NO: 104)側接包含OTOF 之一部分(例如，SEQ ID NO: 101或107)的轉殖基因及/或構築體之一部分。重組 AV 及慢病毒載體
亦提供包括一或多種腺病毒(AV)載體之治療組成物，其中該一種或複數種AV載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成聽覺多肽信使RNA。較佳地，該一種或複數種AV載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成全長聽覺多肽信使RNA。
在一些實施例中，載體為腺病毒(參見例如Dmitriev等人，(1998)J. Virol. 72: 9706-9713；及Poulin等人，J. Virol 8: 10074-10086, 2010)。在一些實施例中，載體為逆轉錄病毒(參見例如，Maier等人，(2010)Future Microbiol 5: 1507-23)。
在一些實施例中，載體為慢病毒(參見例如，Matrai等人，(2010)Mol Ther. 18: 477-490；Banasik等人，(2010)Gene Ther. 17:150-7；及Wanisch等人，(2009)Mol. Ther. 17: 1316-32)。慢病毒載體指來源於慢病毒基因體之至少一部分的載體，尤其包括如Milone等人，Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)中提供之自滅活慢病毒載體。可在臨床中使用之非限制性慢病毒載體包括來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAX™載體系統及其類似物。慢病毒載體之其他類型亦可用，且可為熟習此項技術者所已知。
術語「慢病毒」指逆轉錄病毒科之屬。慢病毒在逆轉錄病毒中之獨特之處在於能夠感染非分裂細胞；其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其為基因遞送載體中最有效方法之一。HIV、SIV及FIV均為慢病毒之實例。
術語「慢病毒載體」指來源於慢病毒基因體之至少一部分的載體，尤其包括如Milone等人，Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)中提供之自滅活慢病毒載體。可在臨床中使用之慢病毒載體之其他實例包括(但不限於)例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAXTM 載體系統及其類似物。慢病毒載體之非臨床類型亦可用，且為熟習此項技術者所已知。
例如，提供包括一種或複數種慢病毒載體之治療組成物，其中該一種或複數種慢病毒載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成聽覺多肽信使RNA。在一個實施例中，該一種或複數種慢病毒載體能夠在該治療組成物所投與之人類個體之標靶細胞中構成全長聽覺多肽信使RNA。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，第一載體包括ITR (例如，本文所述例示性ITR序列中之任一者)、啟動子及/或增強子(例如，本文所述例示性增強子中之任一者及例示性啟動子中之任一者)、OTOF基因之內含子序列(例如，人類OTOF基因，例如本文所述人類OTOF基因之例示性內含子序列中之任一者)、Kozak序列(例如本文所述例示性Kozak序列中之任一者)以及編碼人類耳畸蛋白之蛋白之第一N末端部分的序列(例如，本文所述之編碼人類耳畸蛋白之蛋白之第一N末端部分的例示性序列中之任一者)、AK序列(例如，本文所述例示性AK序列中之任一者)及ITR (例如，本文所述例示性ITR序列中之任一者)。在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，第二載體包括ITR序列(例如，本文所述例示性ITR序列中之任一者)、AK序列(例如，本文所述例示性AK序列中之任一者)、剪接受體序列(例如，本文所述剪接受體序列中之任一者)、編碼人類耳畸蛋白之蛋白之第二部分的序列(例如，本文所述之編碼人類耳畸蛋白之蛋白之第二C末端部分的例示性序列中之任一者)、poly(A)訊號序列(例如，本文所述例示性poly(A)訊號序列中之任一者)、填充序列(例如，本文所述例示性填充序列中之任一者)及ITR序列(例如，本文所述例示性ITR序列中之任一者)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為圖11、圖17及圖56中描繪之pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB (SEQ ID NO: 39)，或為包括與SEQ ID NO: 39至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB載體之長度為7625 bp，且在核苷酸2-78位處具有AK序列，在核苷酸79-129位處具有剪接受體(SA)位點，在核苷酸130-3540位處具有3'mOTOF，在核苷酸490-891位處具有C2D，在核苷酸1996-2516位處具有C2E ，在核苷酸2749-3234位處具有C2F，在核苷酸3595-4188位處具有WPRE，在核苷酸5537-6537位處具有胺芐西林(ampicillin；AMP)抗性基因，在核苷酸4212-4422位處具有牛生長激素poly A尾(bGH pA)，在核苷酸4674-5133位處具有來源於噬菌體之f1(+)複製起點(ORI)，在核苷酸6787-7012位處具有複製起點(ORI)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為圖12、圖20及圖54中描繪之pAAV-SA-3'mOTOF-EWB (SEQ ID NO: 40)，或為包括與SEQ ID NO: 40至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。pAAV-SA-3'mOTOF-EWB載體之長度為7548 bp，且在核苷酸2-52位處具有剪接受體(SA)位點，在核苷酸53-3463位處具有3'mOTOF，在核苷酸413-814位處具有C2D，在核苷酸1919-2439位處具有C2E ，在核苷酸2672-3157位處具有C2F，在核苷酸3518-4111位處具有WPRE，在核苷酸5460-6460位處具有胺芐西林(AMP)抗性基因，在核苷酸4135-4345位處具有牛生長激素poly A尾(bGH pA)，且在核苷酸4597-5056位處具有來源於噬菌體之f1(+)複製起點(ORI)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為圖13、圖18及圖53中描繪之pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD (SEQ ID NO: 41)，或為包括與SEQ ID NO: 41至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD載體之長度為7346 bp，且在核苷酸662-667位處具有Kozak序列(*)，在核苷酸668-1384位處具有增強之綠色螢光蛋白(eGFP)序列，在核苷酸1391-1456位處具有P2A，在核苷酸1463-1468位處具有Kozak序列，在核苷酸1469-3988位處具有5' mOTOF序列，在核苷酸1469-1831位處具有C2A，在核苷酸2231-2599位處具有C2B，在核苷酸2720-3091位處具有C2C，在核苷酸3872-3988位處具有人類OTOF外顯子21，在核苷酸3989-4070位處具有剪接供體(SD)位點，在核苷酸5186-6186位處具有AMP抗性基因，在核苷酸4323-4782位處具有f1(+)ORI，在核苷酸6436-6661位處具有ORI，且在核苷酸7277-272位處具有人類巨細胞病毒(hCMV)增強子。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為圖14、圖19及圖55中描繪之pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK (SEQ ID NO: 42)，或為包括與SEQ ID NO: 42至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK之長度為7423 bp，且在核苷酸662-667位處具有Kozak序列(*)，在核苷酸668-1384位處具有增強之綠色螢光蛋白(eGFP)序列，在核苷酸1391-1456位處具有P2A，在核苷酸1463-1468位處具有Kozak序列，在核苷酸1469-3988位處具有5' mOTOF序列，在核苷酸1469-1831位處具有C2A，在核苷酸2231-2599位處具有C2B，在核苷酸2720-3091位處具有C2C，在核苷酸3872-3988位處具有人類OTOF外顯子21，在核苷酸3989-4070位處具有剪接供體(SD)位點，在核苷酸4071-4147位處具有AK序列，在核苷酸5263-6263位處具有AMP抗性基因，在核苷酸4400-4859位處具有f1(+)ORI，在核苷酸6513-6738位處具有ORI，且在核苷酸7354-272位處具有人類巨細胞病毒(hCMV)增強子。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAKOS102 (SEQ ID NO: 43)，或為包括與SEQ ID NO: 43至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。pAKOS102如圖21所示。pAKOS102載體之長度為7006 bp，且在核苷酸1-130位處具有AAV ITR序列，在核苷酸145-1144位處具有因子VIII填充序列，在核苷酸1145-1486位處具有人類巨細胞病毒(hCMV)增強子，在核苷酸1487-1869位處具有人類ACTB啟動子，在核苷酸1883-1888位處具有Kozak序列，在核苷酸1889-4411位處具有5' hOTOF同功型5序列，在核苷酸4412-4493位處具有SD內含子序列，在核苷酸4519-4659位處具有AAV2 ITR序列，在核苷酸4734-5189位處具有f1(+)ORI，在核苷酸5469-6278位處具有KAN抗性基因且在核苷酸6357-6945位處具有ORI。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAKOS104 (SEQ ID NO: 45)，或為包括與SEQ ID NO: 45至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。pAKOS104如圖24所示。pAKOS104載體之長度為7083 bp，且在核苷酸1-130位處具有AAV ITR序列，在核苷酸145-1144位處具有因子VIII填充序列，在核苷酸1145-1486位處具有人類巨細胞病毒(hCMV)增強子，在核苷酸1487-1869位處具有人類ACTB啟動子，在核苷酸1883-1888位處具有Kozak序列，在核苷酸1889-4411位處具有5' hOTOF同功型5序列，在核苷酸4412-4493位處具有SD內含子序列，在核苷酸4494-4570位處具有AK序列，在核苷酸4596-4736位處具有AAV2 ITR序列，在核苷酸4811-5266位處具有f1(+)ORI，在核苷酸5546-6355位處具有KAN抗性基因且在核苷酸6434-7022位處具有ORI。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為圖29中描繪之pAKOS105_GFP (SEQ ID NO: 48)，或為包括與SEQ ID NO: 48至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。pAKOS105_GFP載體之長度為7761 bp，且在核苷酸1-130位處具有AAV ITR序列，在核苷酸145-221位處具有AK序列，在核苷酸222-272位處具有SA位點序列，在核苷酸273-3740位處具有3' hOTOF同功型5序列，在核苷酸3750-3803位處具有T2A序列，在核苷酸3804-4499位處具有turboGFP序列，在核苷酸4509-4748位處具有bGH poly(A)訊號，在核苷酸4749-5248位處具有因子VIII填充序列，在核苷酸5274-5414位處具有AAV2 ITR序列，在核苷酸5489-5944位處具有f1(+)ORI，在核苷酸6224-7033位處具有KAN抗性基因且在核苷酸7112-7700位處具有ORI。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAKOS109 (SEQ ID NO: 52)，或為包括與SEQ ID NO: 52至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。pAKOS109如圖36所示，pAKOS109載體之長度為7056 bp，且在核苷酸1-130位處具有AAV ITR序列，在核苷酸145-524位處具有人巨細胞病毒(hCMV)增強子，在核苷酸527-802位處具有雞β-肌動蛋白啟動子，在核苷酸803-1815位處具有嵌合內含子，在核苷酸1856-1861位處具有Kozak序列，在核苷酸1862-4384位處具有5' hOTOF同功型5序列，在核苷酸4385-4466位處具有SD內含子序列，在核苷酸4467-4543位處具有AK序列，在核苷酸4569-4709位處具有AAV2 ITR序列，在核苷酸4784-5239位處具有f1(+)ORI，在核苷酸5519-6328位處具有KAN抗性基因，且在核苷酸6407-6995位處具有ORI。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為p109 (SEQ ID NO: 84)，或為包括與SEQ ID NO: 84至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。p109載體之長度為4,711 bp，且如圖38所示。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為p105 (SEQ ID NO: 85)，或為包括與SEQ ID NO: 85至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。p105載體之長度為4,664 bp，且如圖28及圖39所示。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為105.WPRE，如圖40所示。105.WPRE載體中存在之WPRE序列為SEQ ID NO: 69。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為p108，如圖41所示。p108載體包括SEQ ID NO: 58之FVIII填充序列及SEQ ID NO: 70之CMV增強子及啟動子序列。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為1OTOF18.CL1，如圖42所示。1OTOF18.CL1載體包括SEQ ID NO: 71之CL1降解序列。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為19OTOF48，如圖43所示。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為1OTOF20.CL1，如圖44所示。1OTOF20,CL1中之內含子21剪接供體序列為SEQ ID NO: 72。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為21OTOF48.WPRE，如圖45所示。內含子21剪接受體序列為SEQ ID NO: 73。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為1OTOF21.CL1，如圖46所示。內含子22剪接供體序列為SEQ ID NO: 74。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為22OTOF48.WPRE，如圖47所示。內含子22剪接受體序列為SEQ ID NO: 75。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為105.pA.NTF3.CMVd，如圖48所示。105.pA.NTF3.CMVd載體包括以下序列：SV40 polyA (SEQ ID NO: 76)、HSV-TK poly(A) (SEQ ID NO: 77)、編碼人類NTF3之序列(SEQ ID NO: 79)及CMVd (SEQ ID NO: 86)。
在一些實施例中，載體可包括CMV增強子及雞J-肌動蛋白啟動子，例如SEQ ID NO: 61之序列。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD (SEQ ID NO: 87)，或為包括與SEQ ID NO: 87至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD載體之長度為4,472 bp，且如圖53所示。pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD載體包括AAV ITR (SEQ ID NO: 59)、CMV增強子(SEQ ID NO: 70)、編碼5'mOTOF之一部分的序列(SEQ ID NO: 94)及剪接供體序列(SEQ ID NO: 64)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-SA-3'mOTOF.WPRE (SEQ ID NO: 88)，或為包括與SEQ ID NO: 88至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列的載體。pAAV-SA-3'mOTOF.WPRE載體之長度為4,674 bp，且如圖54所示。pAAV-SA-3'mOTOF.WPRE載體包括AAV ITR (SEQ ID NO: 59)、剪接受體序列(SEQ ID NO: 65)、編碼3'mOTOF之一部分的序列(SEQ ID NO: 95)、WPRE序列(SEQ ID NO: 69)、BGHpA序列(SEQ ID NO: 68)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD-AK，如圖55所示，且長度為4,549 bp。pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD-AK載體包括AAV ITR(SEQ ID NO: 59)、CMV增強子(SEQ ID NO: 70)、編碼5'mOTOF之一部分的序列(SEQ ID ID：94)、SD-內含子序列(SEQ ID NO: 72)及AK序列(SEQ ID NO: 67)及AAV ITR(SEQ ID NO: 60)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-AK-SA-3'mOTOF-WPRE，如圖56所示，且長度為4,751 bp。pAAV-AK-SA-3'mOTOF-WPRE載體包括AAV ITR (SEQ ID NO: 59)、AK序列(SEQ ID NO: 66)、編碼3' mOTOF之一部分的序列(SEQ ID NO: 95)、WPRE序列(SEQ ID NO: 69)、BGHpA序列(SEQ ID NO: 68)及AAV ITR (SEQ ID NO: 60)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK (p108質體)，如圖57所示，且長度為4,567 bp。The pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK載體包括AAV ITR (SEQ ID NO: 59)、FVII填充物(SEQ ID NO: 90)、FVII填充物(SEQ ID NO: 91)、CMV增強子及啟動子(SEQ ID NO: 70)、編碼5'hOTOF之序列的一部分(SEQ ID NO: 62)、SD內含子序列(SEQ ID NO: 72)、AK序列(SEQ ID NO: 67)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。在一些實施例中，載體包括與SEQ ID NO: 90至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列。在一些實施例中，載體包括與SEQ ID NO: 91至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AP，如圖58所示，且長度為4,540 bp。pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AP包括AAV ITR序列(SEQ ID NO: 59)、CMV增強子(SEQ ID NO: 70)、編碼5'hOTOF之一部分的序列(SEQ ID NO: 62)、AP rec序列(SEQ ID NO: 89)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AK ，如圖59所示，且長度為4,745 bp。pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AK包括AAV ITR序列(SEQ ID NO: 59)、FVIII填充(4677-5173)序列(SEQ ID NO: 90)、FVIII填充(3679-4177)序列(SEQ ID NO: 91)、CMV增強子(SEQ ID NO: 70)、編碼5'hOTOF之一部分的序列(SEQ ID NO: 62)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。在一些實施例中，載體包括與SEQ ID NO: 90至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列，或與SEQ ID NO: 91至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD-AK，如圖60所示，且長度為4,745 bp。pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK載體包括AAV ITR序列(SEQ ID NO: 59)、FVIII填充(4677-5173)序列(SEQ ID NO: 90)、FVIII填充(3679-4177)序列(SEQ ID: 91)、CMV增強子(SEQ ID NO: 70)、編碼5'OTOF codop序列中之一部分的序列(SEQ ID NO: 92)、AK序列(SEQ ID NO: 67)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。在一些實施例中，載體包括與SEQ ID NO: 90至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列。在一些實施例中，載體包括與SEQ ID NO: 91至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD，如圖61所示，且長度為4,668 bp。pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD載體包括AAV ITR序列(SEQ ID NO: 59)、FVIII填充(4677-5173)序列(SEQ ID NO: 90)、FVIII填充(3679-4177)序列(SEQ ID: 91)、CMV增強子(SEQ ID NO: 70)、編碼5'OTOF codop序列中之一部分的序列(SEQ ID NO: 92)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。在一些實施例中，載體包括與SEQ ID NO: 90至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列。在一些實施例中，載體包括與SEQ ID NO: 91至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%、至少99%或100%一致之序列。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-CMV-5'hOTOF-SD，如圖62所示，且長度為4,490 bp。pAAV-CMV-5'hOTOF-SD載體包括AAV ITR序列(SEQ ID NO: 59)、兩個FVIII填充序列、CMV增強子及啟動子(SEQ ID NO: 70)、編碼5'OTOF codop序列之一部分的序列(SEQ ID NO: 92)、SD-內含子序列(SEQ ID NO: 64)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK ，如圖63所示，且長度為4,567 bp。pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK載體包括AAV ITR序列(SEQ ID NO: 59)、兩個FVIII填充序列、CMV增強子及啟動子(SEQ ID NO: 70)、編碼5'OTOF codop序列中之一部分的序列(SEQ ID NO: 92)、剪接供體(SD)內含子序列(SEQ ID NO: 64)、AK序列(SEQ ID NO: 67)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-CBA-5'hOTOF-SD-AK ，如圖64所示，且長度為4,711 bp。pAAV-CBA-5'hOTOF-SD-AK載體包括AAV ITR序列(SEQ ID NO: 59)、CMV增強子及雞β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO: 61)、嵌合內含子序列、編碼5'hOTOF codop序列中之一部分的序列(SEQ ID NO: 92)、內含子序列、AK序列(SEQ ID NO: 67)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-CBA-5'hOTOF-SD，如圖65所示，且長度為4,634 bp。pAAV-CBA-5'hOTOF-SD載體包括AAV ITR序列(SEQ ID NO: 59)、CMV增強子及雞β-肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO: 61)、嵌合內含子序列、編碼5'OTOF codop序列中之一部分的序列(SEQ ID NO: 92)、內含子序列及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-SA-3'OTOF，如圖66所示，且長度為4,587 bp。pAAV-CBA-5'hOTOF-SD載體包括AAV ITR序列(SEQ ID NO: 59)、剪接受體序列(SEQ ID NO: 65)、編碼3'OTOF序列中之一部分的序列(SEQ ID NO: 63)、bGHpA序列(SEQ ID NO: 68)、FVIII填充9序列(SEQ ID NO: 57)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-AP-SA-3'OTOF，如圖67所示，且長度為4,959 bp。pAAV-AP-SA-3'OTOF載體包括AAV ITR序列(SEQ ID NO: 59)、AP rec序列(SEQ ID NO: 89)、剪接受體序列(SEQ ID NO: 65)、編碼3'OTOF序列中之一部分的序列(SEQ ID NO: 63)、bGHpolyA序列(SEQ ID NO: 68)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。
在本文所述組成物中任一者之一些實施例中，載體為pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop，如圖68所示，且長度為4,664 bp。pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop載體包括AAV ITR(SEQ ID NO: 59)、AK序列(SEQ ID NO: 66)、編碼3'OTOF codop序列中之一部分的序列(SEQ ID NO: 93)、bGH polyA序列(SEQ ID NO: 68)及AAV ITR序列(SEQ ID NO: 60)。
本文提供之載體可具有不同大小。在本文所述組成物、套組及方法中之任一者中使用的載體的選擇可取決於載體之大小。
在一些實施例中，載體為質體，且可包括為多達約1 kb、多達約2 kb、多達約3 kb、多達約4 kb、多達約5 kb、多達約6 kb、多達約7 kb、多達約8 kb、多達約9 kb、多達約10 kb、多達約11 kb、多達約12 kb、多達約13 kb、多達約14 kb或多達約15 kb之總長度。在一些實施例中，載體為質體且總長度可在以下之範圍內：約1 kb至約2 kb、約1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約1 kb至約6 kb、約1 kb至約7 kb、約1 kb至約8 kb、約1 kb至約9 kb、約1 kb至約10 kb、約1 kb至約11 kb、約1 kb至約12 kb、約1 kb至約13 kb、約1 kb至約14 kb、約1 kb至約15 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5 kb、約2 kb至約6 kb、約2 kb至約7 kb、約2 kb至約8 kb、約2 kb至約9 kb、約2 kb至約10 kb、約2 kb至約11 kb、約2 kb至約12 kb、約2 kb至約13 kb、約2 kb至約14 kb、約2 kb至約15 kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb、約3 kb至約6 kb、約3 kb至約7 kb、約3 kb至約8 kb、約3 kb至約9 kb、約3 kb至約10 kb、約3 kb至約11 kb、約3 kb至約12 kb、約3 kb至約13 kb、約3 kb至約14 kb、約3 kb至約15 kb、約4 kb至約5 kb、約4 kb至約6 kb、約4 kb至約7 kb、約4 kb至約8 kb、約4 kb至約9 kb、約4 kb至約10 kb、約4 kb至約11 kb、約4 kb至約12 kb、約4 kb至約13 kb、約4 kb至約14 kb、約4 kb至約15 kb、約5 kb至約6 kb、約5 kb至約7 kb、約5 kb至約8 kb、約5 kb至約9 kb、約5 kb至約10 kb、約5 kb至約11 kb、約5 kb至約12 kb、約5 kb至約13 kb、約5 kb至約14 kb或約5 kb至約15 kb。
在一些實施例中，載體為轉位子(例如，PiggyBac轉位子)，且可包括超過200 kb。在一些實例中，載體為總長度在以下之範圍內的轉位子：約1 kb至約10 kb、約1 kb至約20 kb、約1 kb至約30 kb、約1 kb至約40 kb、約1 kb至約50 kb、約1 kb至約60 kb、約1 kb至約70 kb、約1 kb至約80 kb、約1 kb至約90 kb、約10 kb至約20 kb、約10 kb至約30 kb、約10 kb至約40 kb、約10 kb至約50 kb、約10 kb至約60 kb、約10 kb至約70 kb、約10 kb至約90 kb、約10 kb至約100 kb、約20 kb至約30 kb、約20 kb至約40 kb、約20 kb至約50 kb、約20 kb至約60 kb、約20 kb至約70 kb、約20 kb至約80 kb、約20 kb至約90 kb、約20 kb至約100 kb、約30 kb至約40 kb、約30 kb至約50 kb、約30 kb至約60 kb、約30 kb至約70 kb、約30 kb至約80 kb、約30 kb至約90 kb、約30 kb至約100 kb、約40 kb至約50 kb、約40 kb至約60 kb、約40 kb至約70 kb、約40 kb至約80 kb、約40 kb至約90 kb、約40 kb至約100 kb、約50 kb至約60 kb、約50 kb至約70 kb、約50 kb至約80 kb、約50 kb至約90 kb、約50 kb至約100 kb、約60 kb至約70 kb、約60 kb至約80 kb、約60 kb至約90 kb、約60 kb至約100 kb、約70 kb至約80 kb、約70 kb至約90 kb、約70 kb至約100 kb、約80 kb至約90 kb、約80 kb至約100 kb、約90 kb至約100 kb、約1 kb至約100 kb、約100 kb至約200 kb、約100 kb至約300 kb、約100 kb至約400 kb或約100 kb至約500 kb。
在一些實施例中，載體為黏接質體，且總長度可為多達55 kb。在一些實例中，載體為黏接質體且核苷酸總數為約1 kb至約10 kb、約1 kb至約20 kb、約1 kb至約30 kb、約1 kb至約40 kb、約1 kb至約50 kb、約1 kb至約55 kb、約10 kb至約20 kb、約10 kb至約30 kb、約10 kb至約40 kb、約10 kb至約50 kb、約10 kb至約55 kb、約15 kb至約55 kb、約15 kb至約50 kb、約15 kb至約40 kb、約15 kb至約30 kb、約15 kb至約20 kb、約20 kb至約55 kb、約20 kb至約50 kb、約20 kb至約40 kb、約20 kb至約30 kb、約25 kb至約55 kb、約25 kb至約50 kb、約25 kb至約40 kb、約25 kb至約30 kb、約30 kb至約55 kb、約30 kb至約50 kb、約30 kb至約40 kb、約35 kb至約55 kb、約40 kb至約55 kb、約40 kb至約50 kb或約45 kb至約55 kb。
在一些實施例中，載體為人工染色體且核苷酸總數可為約100 kb至約2000 kb。在一些實施例中，人工染色體為人類人工染色體(HAC)且核苷酸總數可在以下之範圍內：約1 kb至約10 kb、1 kb至約20 kb、約1 kb至約30 kb、約1 kb至約40 kb、約1 kb至約50 kb、約1 kb至約60 kb、約10 kb至約20 kb、約10 kb至約30 kb、約10 kb至約40 kb、約10 kb至約50 kb、約10 kb至約60 kb、約20 kb至約30 kb、約20 kb至約40 kb、約20 kb至約50 kb、約20 kb至約60 kb、約30 kb至約40 kb、約30 kb至約50 kb、約30 kb至約60 kb、約40 kb至約50 kb、約40 kb至約60 kb或約50 kb至約60 kb。
在一些實施例中，人工染色體為酵母人工染色體(YAC)且核苷酸總數可為多達1000 kb。在一些實施例中，人工染色體為YAC，其核苷酸總數在以下之範圍內：約100 kb至約1,000 kb、約100 kb至約900 kb、約100 kb至約800 kb、約100 kb至約700 kb、約100 kb至約600 kb、約100 kb至約500 kb、約100 kb至約400 kb、約100 kb至約300 kb、約100 kb至約200 kb、約200 kb至約1,000 kb、約200 kb至約900 kb、約200 kb至約800 kb、約200 kb至約700 kb、約200 kb至約600 kb、約200 kb至約500 kb、約200 kb至約400 kb、約200 kb至約300 kb、約300 kb至約1,000 kb、約300 kb至約900 kb、約300 kb至約800 kb、約300 kb至約700 kb、約300 kb至約600 kb、約300 kb至約500 kb、約300 kb至約400 kb、約400 kb至約1,000 kb、約400 kb至約900 kb、約400 kb至約800 kb、約400 kb至約700 kb、約400 kb至約600 kb、約400 kb至約500 kb、約500 kb至約1,000 kb、約500 kb至約900 kb、約500 kb至約800 kb、約500 kb至約700 kb、約500 kb至約600 kb、約600 kb至約1,000 kb、約600 kb至約900 kb、約600 kb至約800 kb、約600 kb至約700 kb、約700 kb至約1,000 kb、約700 kb至約900 kb、約700 kb至約800 kb、約800 kb至約1,000 kb、約800 kb至約900 kb或約900 kb至約1,000 kb。
在一些實施例中，人工染色體為細菌人工染色體(BAC)且核苷酸總數可為多達750 kb。在一些實施例中，人工染色體為BAC且核苷酸總數在以下之範圍內：約100 kb至約750 kb、約100 kb至約700 kb、約100 kb至約600 kb、約100 kb至約500 kb、約100 kb至約400 kb、約100 kb至約300 kb、約100 kb至約200 kb、約150 kb至約750 kb、約150 kb至約700 kb、約150 kb至約600 kb、約150 kb至約500 kb、約150 kb至約400 kb、約150 kb至約300 kb、約150 kb至約200 kb、約200 kb至約750 kb、約200 kb至約700 kb、約200 kb至約600 kb、約200 kb至約500 kb、約200 kb至約400 kb、約200 kb至約300 kb、約250 kb至約750 kb、約250 kb至約700 kb、約250 kb至約600 kb、約250 kb至約500 kb、約250 kb至約400 kb、約250 kb至約300 kb、約300 kb至約750 kb、約300 kb至約700 kb、約300 kb至約600 kb、約300 kb至約500 kb、約300 kb至約400 kb、約350 kb至約750 kb、約350 kb至約700 kb、約350 kb至約600 kb、約350 kb至約500 kb、約350 kb至約400 kb、約400 kb至約750 kb、約400 kb至約700 kb、約450 kb至約600 kb、約450 kb至約500 kb、約500 kb至約750 kb、約500 kb至約700 kb、約500 kb至約600 kb、約550 kb至約750 kb、約550 kb至約700 kb、約550 kb至約600 kb、約600 kb至約750 kb、約600 kb至約700 kb或約650 kb至約750 kb。
在一些實施例中，人工染色體為P1源性人工染色體(PAC)且核苷酸總數可為多達300 kb。在一些實施例中，來源於P1之人工染色體之核苷酸總數可在以下之範圍內：約100 kb至約300 kb、約100 kb至約200 kb或約200 kb至約300 kb。
在一些實施例中，載體為病毒載體且核苷酸總數可為多達10 kb。在一些實施例中，病毒載體之核苷酸總數可在以下之範圍內：約1 kb至約2 kb、1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約1 kb至約6 kb、約1 kb至約7 kb、約1 kb至約8 kb、約1 kb至約9 kb、約1 kb至約10 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5 kb、約2 kb至約6 kb、約2 kb至約7 kb、約2 kb至約8 kb、約2 kb至約9 kb、約2 kb至約10 kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb、約3 kb至約6 kb、約3 kb至約7 kb、約3 kb至約8 kb、約3 kb至約9 kb、約3 kb至約10 kb、約4 kb至約5 kb、約4 kb至約6 kb、約4 kb至約7 kb、約4 kb至約8 kb、約4 kb至約9 kb、約4 kb至約10 kb、約5 kb至約6 kb、約5 kb至約7 kb、約5 kb至約8 kb、約5 kb至約9 kb、約5 kb至約10 kb、約6 kb至約7 kb、約6 kb至約8 kb、約6 kb至約9 kb、約6 kb至約10 kb、約7 kb至約8 kb、約7 kb至約9 kb、約7 kb至約10 kb、約8 kb至約9 kb、約8 kb至約10 kb或約9 kb至約10 kb。
在一些實施例中，載體為慢病毒且核苷酸總數可為多達8 kb。在一些實例中，慢病毒之核苷酸總數可為約1 kb至約2 kb、約1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約1 kb至約6 kb、約1 kb至約7 kb、約1 kb至約8 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5 kb、約2 kb至約6 kb、約2 kb至約7 kb、約2 kb至約8 kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb、約3 kb至約6 kb、約3 kb至約7 kb、約3 kb至約8 kb、約4 kb至約5 kb、約4 kb至約6 kb、約4 kb至約7 kb、約4 kb至約8 kb、約5 kb至約6 kb、約5 kb至約7 kb、約5 kb至約8 kb、約6 kb至約8kb、約6 kb至約7 kb或約7 kb至約8 kb。
在一些實施例中，載體為腺病毒且核苷酸總數可為多達8 kb。在一些實施例中，腺病毒之核苷酸總數可在以下之範圍內：約1 kb至約2 kb、約1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約1 kb至約6 kb、約1 kb至約7 kb、約1 kb至約8 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5 kb、約2 kb至約6 kb、約2 kb至約7 kb、約2 kb至約8 kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb、約3 kb至約6 kb、約3 kb至約7 kb、約3 kb至約8 kb、約4 kb至約5 kb、約4 kb至約6 kb、約4 kb至約7 kb、約4 kb至約8 kb、約5 kb至約6 kb、約5 kb至約7 kb、約5 kb至約8 kb、約6 kb至約7 kb、約6 kb至約8 kb或約7 kb至約8 kb。
在一些實施例中，載體為腺相關病毒(AAV載體)且可包括之核苷酸總數多達5 kb。在一些實施例中，AAV載體可包括之核苷酸總數在以下之範圍內：約1 kb至約2 kb、約1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb或約4 kb至約5 kb。
在一些實施例中，載體為Gateway®載體且可包括之核苷酸總數多達5 kb。在一些實施例中，各Gateway®載體包括之核苷酸總數在以下之範圍內：約1 kb至約2 kb、約1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5 kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb或約4 kb至約5 kb。
在本文提供之組成物、套組及方法中任一者之一些實施例中，至少兩種不同載體可為實質上相同類型之載體且可在大小上不同。在一些實施例中，至少兩種不同載體可為不同類型之載體，且可具有實質上相同之大小或具有不同大小。
在一些實施例中，至少兩種載體中之任一者之核苷酸總數可在以下之範圍中：約500個核苷酸至約10,000個核苷酸、約500個核苷酸至約9,500個核苷酸、約500個核苷酸至約9,000個核苷酸、約500個核苷酸至約8,500個核苷酸、約500個核苷酸至約8,000個核苷酸、約500個核苷酸至約7,800個核苷酸、約500個核苷酸至約7,600個核苷酸、約500個核苷酸至約7,400個核苷酸、約500個核苷酸至約7,200個核苷酸、約500個核苷酸至約7,000個核苷酸、約500個核苷酸至約6,800個核苷酸、約500個核苷酸至約6,600個核苷酸、約500個核苷酸至約6,400個核苷酸、約500個核苷酸至約6,200個核苷酸、約500個核苷酸至約6,000個核苷酸、約500個核苷酸至約5,800個核苷酸、約500個核苷酸至約5,600個核苷酸、約500個核苷酸至約5,400個核苷酸、約500個核苷酸至約5,200個核苷酸、約500個核苷酸至約5,000個核苷酸、約500個核苷酸至約4,800個核苷酸、約4,600個核苷酸、約500個核苷酸至約4,400個核苷酸、約500個核苷酸至約4,200個核苷酸、約500個核苷酸至約4,000個核苷酸、約500個核苷酸至約3,800個核苷酸、約500個核苷酸至約3,600個核苷酸、約500個核苷酸至約3,400個核苷酸、約500個核苷酸至約3,200個核苷酸、約500個核苷酸至約3,000個核苷酸、約500個核苷酸至約2,800個核苷酸、約500個核苷酸至約2,600個核苷酸、約500個核苷酸至約2,400個核苷酸、約500個核苷酸至約2,200個核苷酸、約500個核苷酸至約2,000個核苷酸、約500個核苷酸至約1,800個核苷酸、約500個核苷酸至約1,600個核苷酸、約500個核苷酸至約1,400個核苷酸、約500個核苷酸至約1,200個核苷酸、約500個核苷酸至約1,000個核苷酸、約500個核苷酸至約800個核苷酸、約800個核苷酸至約10,000個核苷酸、約800個核苷酸至約9,500個核苷酸、約800個核苷酸至約9,000個核苷酸、約800個核苷酸至約8,500個核苷酸、約800個核苷酸至約8,000個核苷酸、約800個核苷酸至約7,800個核苷酸、約800個核苷酸至約7,600個核苷酸、約800個核苷酸至約7,400個核苷酸、約800個核苷酸至約7,200個核苷酸、約800個核苷酸至約7,000個核苷酸、約800個核苷酸至約6,800個核苷酸、約800個核苷酸至約6,600個核苷酸、約800個核苷酸至約6,400個核苷酸、約800個核苷酸至約6,200個核苷酸、約800個核苷酸至約6,000個核苷酸、約800個核苷酸至約5,800個核苷酸、約800個核苷酸至約5,600個核苷酸、約800個核苷酸至約5,400個核苷酸、約800個核苷酸至約5,200個核苷酸、約800個核苷酸至約5,000個核苷酸、約800個核苷酸至約4,800個核苷酸、約800個核苷酸至約4,600個核苷酸、約800個核苷酸至約4,400個核苷酸、約800個核苷酸至約4,200個核苷酸、約800個核苷酸至約4,000個核苷酸、約800個核苷酸至約3,800個核苷酸、約800個核苷酸至約3,600個核苷酸、約800個核苷酸至約3,400個核苷酸、約800個核苷酸至約3,200個核苷酸、約800個核苷酸至約3,000個核苷酸、約800個核苷酸至約2,800個核苷酸、約800個核苷酸至約2,600個核苷酸、約800個核苷酸至約2,400個核苷酸、約800個核苷酸至約2,200個核苷酸、約800個核苷酸至約2,000個核苷酸、約800個核苷酸至約1,800個核苷酸、約800個核苷酸至約1,600個核苷酸、約800個核苷酸至約1,400個核苷酸、約800個核苷酸至約1,200個核苷酸、約800個核苷酸至約1,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約10,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約9,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約8,500個核苷酸、約1,000個核苷酸至約8,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約7,800個核苷酸、約1,000個核苷酸至約7,600個核苷酸、約1,000個核苷酸至約7,400個核苷酸、約1,000個核苷酸至約7,200個核苷酸、約1,000個核苷酸至約7,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約6,800個核苷酸、約1,000個核苷酸至約6,600個核苷酸、約1,000個核苷酸至約6,400個核苷酸、約1,000個核苷酸至約6,200個核苷酸、約1,000個核苷酸至約6,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約5,800個核苷酸、約1,000個核苷酸至約5,600個核苷酸、約1,000個核苷酸至約5,400個核苷酸、約1,000個核苷酸至約5,200個核苷酸、約1,000個核苷酸至約5,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約4,800個核苷酸、約1,000個核苷酸至約4,600個核苷酸、約1,000個核苷酸至約4,400個核苷酸、約1,000個核苷酸至約4,200個核苷酸、約1,000個核苷酸至約4,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約3,800個核苷酸、約1,000個核苷酸至約3,600個核苷酸、約1,000個核苷酸至約3,400個核苷酸、約1,000個核苷酸至約3,200個核苷酸、約1,000個核苷酸至約3,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約2,600個核苷酸、約1,000個核苷酸至約2,400個核苷酸、約1,000個核苷酸至約2,200個核苷酸、約1,000個核苷酸至約2,000個核苷酸、約1,000個核苷酸至約1,800個核苷酸、約1,000個核苷酸至約1,600個核苷酸、約1,000個核苷酸至約1,400個核苷酸、約1,000個核苷酸至約1,200個核苷酸、約1,200個核苷酸至約10,000個核苷酸、約1,200個核苷酸至約9,500個核苷酸、約1,200個核苷酸至約9,000個核苷酸、約1,200個核苷酸至約8,500個核苷酸、約1,200個核苷酸至約8,000個核苷酸、約1,200個核苷酸至約7,800個核苷酸、約1,200個核苷酸至約7,600個核苷酸、約1,200個核苷酸至約7,400個核苷酸、約1,200個核苷酸至約7,200個核苷酸、約1,200個核苷酸至約7,000個核苷酸、約1,200個核苷酸至約6,800個核苷酸、約1,200個核苷酸至約6,600個核苷酸、約1,200個核苷酸至約6,400個核苷酸、約1,200個核苷酸至約6,200個核苷酸、約1,200個核苷酸至約6,000個核苷酸、約1,200個核苷酸至約5,800個核苷酸、約1,200個核苷酸至約5,600個核苷酸、約1,200個核苷酸至約5,400個核苷酸、約1,200個核苷酸至約5,000個核苷酸、約1,200個核苷酸至約4,800個核苷酸、約1,200個核苷酸至約4,600個核苷酸、約1,200個核苷酸至約4,400個核苷酸、約1,200個核苷酸至約4,200個核苷酸、約1,200個核苷酸至約4,000個核苷酸、約1,200個核苷酸至約3,800個核苷酸、約1,200個核苷酸至約3,600個核苷酸、約1,200個核苷酸至約3,400個核苷酸、約1,200個核苷酸至約3,200個核苷酸、約1,200個核苷酸至約3,000個核苷酸、約1,200個核苷酸至約2,800個核苷酸、約1,200個核苷酸至約2,600個核苷酸、約1,200個核苷酸至約2,400個核苷酸、約1,200個核苷酸至約2,200個核苷酸、約1,200個核苷酸至約2,000個核苷酸、約1,200個核苷酸至約1,800個核苷酸、約1,200個核苷酸至約1,600個核苷酸、約1,200個核苷酸至約1,400個核苷酸、約1,400個核苷酸至約10,000個核苷酸、約1,400個核苷酸至約9,500個核苷酸、約1,400個核苷酸至約9,000個核苷酸、約1,400個核苷酸至約8,500個核苷酸、約1,400個核苷酸至約8,000個核苷酸、約1,400個核苷酸至約7,800個核苷酸、約1,400個核苷酸至約7,600個核苷酸、約1,400個核苷酸至約7,400個核苷酸、約1,400個核苷酸至約7,200個核苷酸、約1,400個核苷酸至約7,000個核苷酸、約1,400個核苷酸至約6,800個核苷酸、約1,400個核苷酸至約6,600個核苷酸、約1,400個核苷酸至約6,400個核苷酸、約1,400個核苷酸至約6,200個核苷酸、約1,400個核苷酸至約6,000個核苷酸、約1,400個核苷酸至約5,800個核苷酸、約1,400個核苷酸至約5,600個核苷酸、約1,400個核苷酸至約5,400個核苷酸、約1,400個核苷酸至約5,200個核苷酸、約1,400個核苷酸至約5,000個核苷酸、約1,400個核苷酸至約4,800個核苷酸、約1,400個核苷酸至約4,600個核苷酸、約1,400個核苷酸至約4,400個核苷酸、約1,400個核苷酸至約4,200個核苷酸、約1,400個核苷酸至約4,000個核苷酸、約1,400個核苷酸至約3,800個核苷酸、約1,400個核苷酸至約3,600個核苷酸、約1,400個核苷酸至約3,400個核苷酸、約1,400個核苷酸至約3,200個核苷酸、約1,400個核苷酸至約3,000個核苷酸、約1,400個核苷酸至約2,600個核苷酸、約1,400個核苷酸至約2,400個核苷酸、約1,400個核苷酸至約2,200個核苷酸、約1,400個核苷酸至約2,000個核苷酸、約1,400個核苷酸至約1,800個核苷酸、約1,400個核苷酸至約1,600個核苷酸、約1,600個核苷酸至約10,000個核苷酸、約1,600個核苷酸至約9,500個核苷酸、約1,600個核苷酸至約9,000個核苷酸、約1,600個核苷酸至約8,500個核苷酸、約1,600個核苷酸至約8,000個核苷酸、約1,600個核苷酸至約7,800個核苷酸、約1,600個核苷酸至約7,600個核苷酸、約1,600個核苷酸至約7,400個核苷酸、約1,600個核苷酸至約7,200個核苷酸、約1,600個核苷酸至約7,000個核苷酸、約1,600個核苷酸至約6,800個核苷酸、約1,600個核苷酸至約6,400個核苷酸、約1,600個核苷酸至約6,200個核苷酸、約1,600個核苷酸至約6,000個核苷酸、約1,600個核苷酸至約5,800個核苷酸、約1,600個核苷酸至約5,600個核苷酸、約1,600個核苷酸至約5,400個核苷酸、約1,600個核苷酸至約5,200個核苷酸、約1,600個核苷酸至約5,000個核苷酸、約1,600個核苷酸至約4,800個核苷酸、約1,600個核苷酸至約4,600個核苷酸、約1,600個核苷酸至約4,400個核苷酸、約1,600個核苷酸至約4,200個核苷酸、約1,600個核苷酸至約4,000個核苷酸、約1,600個核苷酸至約3,800個核苷酸、約1,600個核苷酸至約3,600個核苷酸、約1,600個核苷酸至約3,400個核苷酸、約1,600個核苷酸至約3,200個核苷酸、約1,600個核苷酸至約3,000個核苷酸、約1,600個核苷酸至約2,800個核苷酸、約1,600個核苷酸至約2,600個核苷酸、約1,600個核苷酸至約2,400個核苷酸、約1,600個核苷酸至約2,200個核苷酸、約1,600個核苷酸至約2,000個核苷酸、約1,600個核苷酸至約1,800個核苷酸、約1,800個核苷酸至約10,000個核苷酸、約1,800個核苷酸至約9,500個核苷酸、約1,800個核苷酸至約9,000個核苷酸、約1,800個核苷酸至約8,500個核苷酸、約1,800個核苷酸至約8,000個核苷酸、約1,800個核苷酸至約7,800個核苷酸、約1,800個核苷酸至約7,600個核苷酸、約1,800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約5,400個核苷酸至約9,500個核苷酸、約5,400個核苷酸至約9,000個核苷酸、約5,400個核苷酸至約8,500個核苷酸、約5,400個核苷酸至約8,000個核苷酸、約5,400個核苷酸至約7,800個核苷酸、約5,400個核苷酸至約7,600個核苷酸、約5,400個核苷酸至約7,400個核苷酸、約5,400個核苷酸至約7,200個核苷酸、約5,400個核苷酸至約7,000個核苷酸、約5,400個核苷酸至約6,800個核苷酸、約5,400個核苷酸至約6,600個核苷酸、約5,400個核苷酸至約6,400個核苷酸、約5,400個核苷酸至約6,200個核苷酸、約5,400個核苷酸至約6,000個核苷酸、約5,400個核苷酸至約5,800個核苷酸、約5,400個核苷酸至約5,600個核苷酸、約5,600個核苷酸至約10,000個核苷酸、約5,600個核苷酸至約9,500個核苷酸、約5,600個核苷酸至約9,000個核苷酸、約5,600個核苷酸至約8,500個核苷酸、約5,600個核苷酸至約8,000個核苷酸、約5,600個核苷酸至約7,800個核苷酸、約5,600個核苷酸至約7,600個核苷酸、約5,600個核苷酸至約7,400個核苷酸、約5,600個核苷酸至約7,200個核苷酸、約5,600個核苷酸至約7,000個核苷酸、約5,600個核苷酸至約6,800個核苷酸、約5,600個核苷酸至約6,600個核苷酸、約5,600個核苷酸至約6,400個核苷酸、約5,600個核苷酸至約6,200個核苷酸、約5,600個核苷酸至約6,000個核苷酸、約5,600個核苷酸至約5,800個核苷酸、約5,800個核苷酸至約10,000個核苷酸、約5,800個核苷酸至約9,500個核苷酸、約5,800個核苷酸至約9,000個核苷酸、約5,800個核苷酸至約8,500個核苷酸、約5,800個核苷酸至約8,000個核苷酸、約5,800個核苷酸至約7,800個核苷酸、約5,800個核苷酸至約7,600個核苷酸、約5,800個核苷酸至約7,400個核苷酸、約5,800個核苷酸至約7,200個核苷酸、約5,800個核苷酸至約7,000個核苷酸、約5,800個核苷酸至約6,800個核苷酸、約5,800個核苷酸至約6,600個核苷酸、約5,800個核苷酸至約6,400個核苷酸、約5,800個核苷酸至約6,200個核苷酸、約5,800個核苷酸至約6,000個核苷酸、約6,000個核苷酸至約10,000個核苷酸、約6,000個核苷酸至約9,500個核苷酸、約6,000個核苷酸至約9,000個核苷酸、約6,000個核苷酸至約8,500個核苷酸、約6,000個核苷酸至約8,000個核苷酸、約6,000個核苷酸至約7,800個核苷酸、約6,000個核苷酸至約7,600個核苷酸、約6,000個核苷酸至約7,400個核苷酸、約6,000個核苷酸至約7,200個核苷酸、約6,000個核苷酸至約7,000個核苷酸、約6,000個核苷酸至約6,800個核苷酸、約6,000個核苷酸至約6,600個核苷酸、約6,000個核苷酸至約6,400個核苷酸、約6,000個核苷酸至約6,200個核苷酸、約6,200個核苷酸至約10,000個核苷酸、約6,200個核苷酸至約9,000個核苷酸、約6,200個核苷酸至約8,500個核苷酸、約6,200個核苷酸至約8,000個核苷酸、約6,200個核苷酸至約7,800個核苷酸、約6,200個核苷酸至約7,600個核苷酸、約6,200個核苷酸至約7,400個核苷酸、約6,200個核苷酸至約7,200個核苷酸、約6,200個核苷酸至約7,000個核苷酸、約6,200個核苷酸至約6,800個核苷酸、約6,200個核苷酸至約6,600個核苷酸、約6,200個核苷酸至約6,400個核苷酸、約6,400個核苷酸至約10,000個核苷酸、約6,400個核苷酸至約9,500個核苷酸、約6,400個核苷酸至約9,000個核苷酸、約6,400個核苷酸至約8,500個核苷酸、約6,400個核苷酸至約8,000個核苷酸、約6,400個核苷酸至約7,800個核苷酸、約6,400個核苷酸至約7,600個核苷酸、約6,400個核苷酸至約7,400個核苷酸、約6,400個核苷酸至約7,200個核苷酸、約6,400個核苷酸至約7,000個核苷酸、約6,400個核苷酸至約6,800個核苷酸、約6,400個核苷酸至約6,600個核苷酸、約6,600個核苷酸至約10,000個核苷酸、約6,600個核苷酸至約9,500個核苷酸、約6,600個核苷酸至約9,000個核苷酸、約6,600個核苷酸至約8,500個核苷酸、約6,600個核苷酸至約8,000個核苷酸、約6,600個核苷酸至約7,800個核苷酸、約6,600個核苷酸至約7,600個核苷酸、約6,600個核苷酸至約7,400個核苷酸、約6,600個核苷酸至約7,200個核苷酸、約6,600個核苷酸至約7,000個核苷酸、約6,600個核苷酸至約6,800個核苷酸、約6,800個核苷酸至約10,000個核苷酸、約6,800個核苷酸至約9,500個核苷酸、約6,800個核苷酸至約9,000個核苷酸、約6,800個核苷酸至約8,500個核苷酸、約6,800個核苷酸至約8,000個核苷酸、約6,800個核苷酸至約7,800個核苷酸、約6,800個核苷酸至約7,600個核苷酸、約6,800個核苷酸至約7,400個核苷酸、約6,800個核苷酸至約7,200個核苷酸、約6,800個核苷酸至約7,000個核苷酸、約7,000個核苷酸至約10,000個核苷酸、約7,000個核苷酸至約9,500個核苷酸、約7,000個核苷酸至約9,000個核苷酸、約7,000個核苷酸至約8,500個核苷酸、約7,000個核苷酸至約8,000個核苷酸、約7,000個核苷酸至約7,800個核苷酸、約7,000個核苷酸至約7,600個核苷酸、約7,000個核苷酸至約7,400個核苷酸、約7,000個核苷酸至約7,200個核苷酸、約7,200個核苷酸至約10,000個核苷酸、約7,200個核苷酸至約9,500個核苷酸、約7,200個核苷酸至約9,000個核苷酸、約7,200個核苷酸至約8,500個核苷酸、約7,200個核苷酸至約8,000個核苷酸、約7,200個核苷酸至約7,800個核苷酸、約7,200個核苷酸至約7,600個核苷酸、約7,200個核苷酸至約7,400個核苷酸、約7,400個核苷酸至約10,000個核苷酸、約7,400個核苷酸至約9,500個核苷酸、約7,400個核苷酸至約9,000個核苷酸、約7,400個核苷酸至約8,500個核苷酸、約7,400個核苷酸至約8,000個核苷酸、約7,400個核苷酸至約7,800個核苷酸、約7,400個核苷酸至約7,600個核苷酸、約7,600個核苷酸至約10,000個核苷酸、約7,600個核苷酸至約9,500個核苷酸、約7,600個核苷酸至約9,000個核苷酸、約7,600個核苷酸至約8,500個核苷酸、約7,600個核苷酸至約8,000個核苷酸、約7,600個核苷酸至約7,800個核苷酸、約7,800個核苷酸至約10,000個核苷酸、約7,800個核苷酸至約9,500個核苷酸、約7,800個核苷酸至約9,000個核苷酸、約7,800個核苷酸至約8,500個核苷酸、約7,800個核苷酸至約8,000個核苷酸、約8,000個核苷酸至約10,000個核苷酸、約8,000個核苷酸至約9,500個核苷酸、約8,000個核苷酸至約9,000個核苷酸、約8,000個核苷酸至約8,500個核苷酸、約8,500個核苷酸至約10,000個核苷酸、約8,500個核苷酸至約9,500個核苷酸、約8,500個核苷酸至約9,000個核苷酸、約9,000個核苷酸至約10,000個核苷酸、約9,000個核苷酸至約9,500個核苷酸或約9,500個核苷酸至約10,000個核苷酸(包括端點)。
可使用此項技術中已知之多種不同方法將本文所揭示載體中之任一者引入哺乳動物細胞(例如，耳蝸內毛細胞)中。用於將核酸引入哺乳動物細胞中之方法的非限制性實例包括：脂質轉染、轉染(例如，磷酸鈣轉染、使用高度分支之有機化合物轉染、使用陽離子聚合物轉染、基於樹枝狀聚合物之轉染、光學轉染、基於粒子之轉染(例如，奈米粒子轉染)或使用脂質體(例如，陽離子脂質體)之轉染、顯微注射、電穿孔、細胞擠壓、音波穿孔、原生質體融合、穿刺轉染、流體動力學遞送、基因槍、磁轉染、病毒轉染及核轉染。
熟習此項技術者應理解，本文所述載體中之任一者可藉由例如脂質轉染引入哺乳動物細胞中。
可用於將突變及/或缺失引入內源基因中之各種分子生物學技術亦為此項技術中所已知。此類技術之非限制性實例包括定點突變誘發、CRISPR (例如，CRISPR/Cas9誘導之敲入突變及CRISPR/Cas9誘導之敲除突變)及TALEN。此等方法可用於校正存在於標靶細胞染色體中之缺陷內源基因之序列。
本文所述載體中之任一者還可包括控制序列，例如選自以下之群的控制序列：轉錄起始序列、轉錄終止序列、啟動子序列、增強子序列、RNA剪接序列、聚腺苷酸化(polyA)序列及Kozak共有序列。此等控制序列之非限制性實例描述於本文中。在一些實施例中，啟動子可為天然啟動子、組成型啟動子、誘導型啟動子及/或組織特異性啟動子。啟動子
啟動子之非限制性實例描述於本文中。啟動子之其他實例為此項技術中所已知。
在一些實施例中，編碼耳畸蛋白之蛋白(例如，人類耳畸蛋白之蛋白)之N末端部分的載體可包括啟動子及/或增強子。編碼耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的載體可包括本文所述或此項技術中已知啟動子及/或增強子中之任一者。
在一些實施例中，啟動子為誘導型啟動子、組成型啟動子、哺乳動物細胞啟動子、病毒啟動子、嵌合啟動子、經工程改造啟動子、組織特異性啟動子或此項技術中已知啟動子之任何其他類型。在一些實施例中，啟動子為RNA聚合酶II啟動子，諸如哺乳動物RNA聚合酶II啟動子。在一些實施例中，啟動子為RNA聚合酶III啟動子，包括(但不限於)H1啟動子、人類U6啟動子、小鼠U6啟動子或豬U6啟動子。啟動子通常為能夠在耳蝸細胞諸如毛細胞中促進轉錄之啟動子。在一些實例中，啟動子為耳蝸特異性啟動子或耳蝸定向啟動子。
可在本文中使用此項技術中已知之多種啟動子。可在本文中使用之啟動子之非限制性實例包括：人類延伸因子1α-次單元(EF1a)(Liu等人，(2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175; 登錄號J04617.1；Gill等人，Gene Ther. 8(20):1539-1546, 2001；Xu等人，Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001；Xu等人，Gene Ther. 8:1323-1332；Ikeda等人，Gene Ther. 9:932-938, 2002；Gilham等人，J. Gene Med. 12(2):129-136, 2010)、巨細胞病毒 (Xu等人，Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001；Xu等人，Gene Ther. 8:1323-1332；Gray等人，Human Gene Ther. 22:1143-1153, 2011)、人類立早巨細胞病毒(CMV) (美國專利第5,168,062號，Liu等人，(2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175；登錄號X17403.1或KY490085.1)、人類泛素C (UBC) (Gill等人，Gene Ther. 8(20):1539-1546, 2001；Qin等人，PLoS One 5(5):e10611, 2010)、小鼠磷酸甘油酸激酶1、多瘤腺病毒、猿猴病毒40 (SV40)、β-球蛋白、β-肌動蛋白、α-甲胎蛋白、γ-球蛋白、β-干擾素、γ-麩胺醯基轉移酶、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒、大鼠胰島素、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、金屬硫蛋白II (MT II)、澱粉酶、組織蛋白酶、MI毒蕈鹼受體、逆轉錄病毒LTR (例如，人類T細胞白血病病毒HTLV)、AAV ITR、介白素-2、膠原酶、來源於血小板之生長因子、腺病毒5 E2、基質溶素、鼠類MX基因、葡萄糖調節蛋白(GRP78及GRP94)、α-2-巨球蛋白、波形蛋白、MHC I類基因H-2κ b、HSP70、多育麴菌素、腫瘤壞死因子、甲狀腺刺激激素α基因、免疫球蛋白輕鏈、T細胞受體、HLA DQα及DQβ、介白素-2受體、MHC II類、MHC II類HLA-DRα、肌肉肌酸激酶、前白蛋白(轉甲狀腺素蛋白)、彈性蛋白酶I、白蛋白基因、c-fos、c-HA-ras、神經細胞黏著分子(NCAM)、H2B (TH2B)組蛋白、大鼠生長激素、人類血清澱粉樣蛋白(SAA)、肌鈣蛋白I (TN I)、杜氏肌營養不良症、人類免疫缺陷病毒、長臂猿白血病病毒(GALV)啟動子、HNRPA2B1-CBX1之啟動子(UCOE)(Powell及Gray (2015) Discov. Med. 19(102): 49-57；Antoniou等人，Human Gene Ther. 24(4):363-374, 2013)、β-葡萄糖醛酸酶 (GUSB) (Husain等人，Gene Ther. 16:927-932, 2009)、雞β-肌動蛋白(CBA) (Liu等人，(2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175；Stone等人，(2005) Mol. Ther. 11(6): 843-848；Klein等人，Exp. Neurol. 176(1):66-74, 2002；Ohlfest等人，Blood 105:2691-2698, 2005；Gray等人，Human Gene Ther. 22:1143-1153, 2011)、人類β-肌動蛋白啟動子(HBA) (登錄號Y00474.1)、鼠類肌球蛋白VIIA (musMyo7) (Boeda等人，(2001) Hum. Mol. Genet. 10(15): 1581-1589；登錄號AF384559.1)、人類肌球蛋白VIIA (hsMyo7) (Boeda等人，(2001) Hum. Mol. Genet. 10(15): 1581-1589；登錄號NG_009086.1)、鼠類聚(ADP-核糖)聚合酶2 (musPARP2) (Ame等人，(2001) J. Biol. Chem. 276(14): 11092-11099；登錄號AF191547.1)、人類聚(ADP-核糖)聚合酶2 (hsPARP2) (Ame等人，(2001) J. Biol. Chem. 276(14): 11092-11099；登錄號X16612.1或AF479321.1)、乙醯膽鹼受體ε次單元(AChε) (Duclert等人，(1993) PNAS 90(7): 3043-3047；登錄號S58221.1或CR933736.12)、勞斯肉瘤病毒(RSV) (Liu等人，(2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175；登錄號M77786.1)、(GFAP) (Liu等人，(2007) Exp. Mol. Med. 39(2): 170-175；Stone等人，(2005) Mol. Ther. 11(6): 843-848；登錄號NG_008401.1或M67446.1)、hAAT (Van Linthout等人，Human Gene Ther. 13(7):829-840, 2002；Cunningham等人，Mol. Ther. 16(6):1081-1088, 2008)及CBA雜交體(CBh) (Gray等人，(2011) Hum. Gen. Therapy 22: 1143-1153；登錄號KF926476.1或KC152483.1)。啟動子之其他實例為此項技術中所已知。參見例如，Lodish, Molecular Cell Biology, Freeman and Company, New York 2007。在一些實施例中，啟動子為CMV立早啟動子。
在一些實施例中，啟動子為CAG啟動子或CAG/CBA啟動子。在一些實施例中，本揭示案之載體或構築體包含CAG啟動子。在一些實施例中，CAG啟動子以5'至3'之順序包含SEQ ID NO: 98、99及100之核苷酸序列。在一些此類實施例中，CAG啟動子包含CMV早期增強子元件(例如，SEQ ID NO: 98)、雞β肌動蛋白(CBA)基因序列(例如，SEQ ID NO: 99)及來自兔β球蛋白基因之嵌合內含子/3'剪接序列(例如，SEQ ID NO: 100)。
術語「操作性連接」或「轉錄控制」指調節序列與異源核酸序列之間引起後者表現之功能性鍵聯。例如，當第一核酸序列與第二核酸序列處於功能關係時，第一核酸序列與第二核酸序列操作性連接。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則該啟動子與編碼序列操作性連接。操作性連接之DNA序列可彼此相鄰，且例如在需要連接兩個蛋白編碼區之情況下，在同一閱讀框中。
術語「組成型」啟動子指如下核苷酸序列，其在與編碼蛋白(例如，耳畸蛋白之蛋白)之核酸操作性連接時，在哺乳動物細胞中在大多數或所有生理學條件下使得自該核酸轉錄RNA。
術語「組成型」啟動子指如下核苷酸序列，其在與編碼或指定基因產物之多核苷酸操作性連接時，在細胞中在細胞之大多數或所有生理學條件下使得產生該基因產物。
組成型啟動子之實例包括(但不限於)逆轉錄病毒勞斯肉瘤病毒(RSV) LTR啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子(參見例如，Boshart等人，Cell 41:521-530, 1985)、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子及EF1-α啟動子(Invitrogen)。
術語「誘導型」啟動子指如下核苷酸序列，其在與編碼或指定基因產物之多核苷酸操作性連接時，在細胞中實質上僅在對應於啟動子之誘導物存在於細胞中時，才使得產生基因產物。
誘導型啟動子可調節基因表現，且可藉由外源提供之化合物、環境因子諸如溫度、或存在特定生理學狀態例如急性期、細胞特定分化狀態或僅在復製細胞中調節。誘導型啟動子及誘導型系統可獲自多種商業來源，包括(但不限於)Invitrogen、Clontech及Ariad。誘導型啟動子之其他實例為此項技術中所已知。
由外源提供之化合物調節的誘導型啟動子的實例包括鋅誘導型綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(dexamethasone；Dex)誘導型小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088)；蛻皮激素昆蟲啟動子(No等人，(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351)、四環素抑制系統(Gossen等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992))、四環素誘導系統(Gossen等人Science, 268:1766-1769 (1995)，亦參見Harvey等人Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998))、RU486誘導系統(Wang等人Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)及Wang等人，Gene Ther., 4:432-441 (1997))及雷帕黴素(rapamycin)誘導系統(Magari等人J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))。
術語「組織特異性」啟動子指僅在某些特定細胞類型及/或組織中具有活性之啟動子(例如，特定基因之轉錄僅在表現結合於組織特異性啟動子之轉錄調節蛋白的細胞內發生)。
術語「組織特異性」指如下核苷酸序列，其在與由基因編碼或指定之多核苷酸操作性連接時，在細胞中實質上僅在對細胞為對應於啟動子之組織類型的細胞時，才使得產生基因產物。
術語「調節序列」指如下核酸序列，其調節操作性連接於該調節序列之基因產物的表現。在某些情況下，此序列可為增強子序列及調節基因產物表現之其他調節元件。
在一些實施例中，調節序列賦予組織特異性基因表現能力。在一些情況下，組織特異性調節序列結合以組織特異性方式誘導轉錄之組織特異性轉錄因子。
在一些實施例中，組織特異性啟動子為耳蝸特異性啟動子。在一些實施例中，組織特異性啟動子為耳蝸毛細胞特異性啟動子。耳蝸毛細胞特異性啟動子之非限制性實例包括(但不限於)：ATOH1啟動子、POU4F3啟動子、LHX3啟動子、MYO7A啟動子、MYO6啟動子、α9ACHR啟動子及α10ACHR啟動子。增強子及 5' 帽
在一些情況下，載體可包括啟動子序列及/或增強子序列。術語「增強子」指可增加編碼目的蛋白(例如，耳畸蛋白之蛋白)之核酸的轉錄水準的核苷酸序列。增強子序列(長度為50-1500個鹼基對)通常藉由為轉錄相關蛋白(例如，轉錄因子)提供額外結合位點來增加轉錄水準。在一些實施例中，在內含子序列內發現增強子序列。與啟動子序列不同，增強子序列可在距轉錄起始位點更大之距離處起作用(例如，與啟動子相比)。增強子之非限制性實例包括RSV增強子、CMV增強子及SV40增強子。CMV增強子之實例描述於例如Boshart等人，Cell 41(2):521-530, 1985中。
如本文所用，5'帽(亦稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m.sup.7G帽)為經修飾鳥嘌呤核苷酸，其在轉錄開始後不久添加至真核信使RNA之「前」端或5'端。5'帽由連接於第一轉錄核苷酸之末端基團組成。其存在對於由核糖體識別及避免受RNase影響至關重要。帽添加與轉錄相結合，且在轉錄同時發生，從而彼此影響。轉錄開始後不久，正合成之mRNA的5'末端由與RNA聚合酶締合之帽合成複合物結合。該酶複合物催化mRNA加帽所需之化學反應。合成以多步生化反應進行。可修飾加帽部分以調節mRNA之功能性，諸如其穩定性或轉譯效率。Poly(A) 序列
在一些實施例中，本文所提供載體中之任一者可包括poly(A)序列。大多數新生真核mRNA在其3'末端具有poly(A)尾，該尾在復雜過程期間添加，該過程包括初級轉錄本之裂解及所結合聚腺苷酸化反應(參見例如Proudfoot等人，Cell 108:501-512, 2002)。poly(A)尾賦予mRNA穩定性及可轉移性(Molecular Biology of the Cell, 第三版, B. Alberts等人，Garland Publishing, 1994)。在一些實施例中，poly(A)序列位於編碼耳畸蛋白之蛋白C端的核酸序列的3'端。
如本文所用，「聚腺苷酸化」指聚腺苷醯基部分或其經修飾變體與信使RNA分子之共價連接。在真核生物中，大多數信使RNA (mRNA)分子在3'端聚腺苷酸化。3' poly(A)尾為經由酶聚腺苷酸聚合酶之作用添加至前mRNA之腺嘌呤核苷酸之長序列(通常為數百個)。在較高級真核生物中，將poly(A)尾添加至含有特定序列即聚腺苷酸化訊號之轉錄本上。poly(A)尾及與其結合之蛋白輔助保護mRNA避免由核酸外切酶降解。聚腺苷酸化對於轉錄終止、mRNA自細胞核輸出及轉譯亦很重要。聚腺苷酸化在DNA轉錄為RNA後立即在細胞核中發生，但此外隨後亦可在細胞質中發生。轉錄終止後，經由與RNA聚合酶相關之核酸內切酶複合物之作用裂解mRNA鏈。裂解位點通常以在裂解位點附近存在鹼基序列AAUAAA為特徵。mRNA裂解後，將腺苷殘基添加至裂解位點之3'末端。
如本文所用，「poly(A)訊號序列」為觸發mRNA之核酸內切酶裂解及在裂解mRNA之3'末端添加一系列腺苷之序列。
如本文所用，「poly(A)」為藉由聚腺苷酸化連接於mRNA之一系列腺苷。在用於瞬時表現之構築體的較佳實施例中，polyA為50至5000個，較佳大於64個，更較佳大於100個，最較佳大於300或400個。可以化學或酶學方式修飾poly(A)序列，以調節mRNA功能，諸如定位、穩定性或轉譯效率。
可使用數種poly(A)訊號序列，包括來源於以下之彼等poly(A)訊號序列：牛生長激素(bgh)(Woychik等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81(13):3944-3948, 1984；美國專利第5,122,458號；Yew等人，Human Gene Ther. 8(5):575-584, 1997；Xu等人，Human Gene Ther. 12(5):563-573, 2001；Xu等人，Gene Ther. 8:1323-1332, 2001；Wu等人，Mol. Ther. 16(2):280-289, 2008；Gray等人，Human Gene Ther. 22:1143-1153, 2011；Choi等人，Mol. Brain 7:17, 2014)、小鼠-β-球蛋白、小鼠-α-球蛋白(Orkin等人，EMBO J. 4(2):453-456, 1985；Thein等人，Blood 71(2):313-319, 1988)、人類膠原、多瘤病毒(Batt等人，Mol. Cell Biol. 15(9):4783-4790, 1995)、單純疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV TK)、IgG重鏈基因聚腺苷酸化訊號(US 2006/0040354)、人類生長激素(hGH)(Szymanski等人，Mol. Therapy 15(7):1340-1347, 2007；Ostegaard等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(8):2952-2957, 2005)、合成polyA (Levitt等人，Genes Dev. 3(7):1019-1025, 1989；Yew等人，Human Gene Ther. 8(5):575-584, 1997；Ostegaard等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(8):2952-2957, 2005；Choi等人，Mol. Brain 7:17, 2014)、HIV-1上游poly(A)增強子(Schambach等人，Mol. Ther. 15(6):1167-1173, 2007)、腺病毒(L3)上游poly(A)增強子(Schambach等人，Mol. Ther. 15(6):1167-1173, 2007)、hTHGB上游poly(A)增強子(Schambach等人，Mol. Ther. 15(6):1167-1173, 2007)、hC2上游poly(A)增強子(Schambach等人，Mol. Ther. 15(6):1167-1173, 2007)、由SV40 poly(A)訊號序列諸如SV40晚期及早期poly(A)訊號序列組成之群(Schek等人，Mol. Cell Biol. 12(12):5386-5393, 1992；Choi等人，Mol. Brain 7:17, 2014；Schambach等人，Mol. Ther. 15(6):1167-1173, 2007)。poly(A)訊號序列之非限制性實例為SEQ ID NO: 68、76或77。
poly(A)訊號序列可為序列AATAAA。AATAAA序列可經與AATAAA具有同源性之能夠進行訊號傳導聚腺苷酸化之其他六核苷酸序列取代，該等序列包括ATTAAA、AGTAAA、CATAAA、TATAAA、GATAAA、ACTAAA、AATATA、AAGAAA、AATAAT、AAAAAA、AATGAA、AATCAA、AACAAA、AATCAA、AATAAC、AATAGA、AATTAA或AATAAG (參見例如，WO 06/12414)。
在一些實施例中，poly(A)訊號序列可為合成聚腺苷酸化位點(參見例如Promega之pCl-neo表現載體，其基於Levitt等人，Genes Dev. 3(7):1019-1025, 1989)。在一些實施例中，poly(A)訊號序列為可溶性神經菌毛素-1 (sNRP)(AAATAAAATACGAAATG)的聚腺苷酸化訊號(參見例如，WO 05/073384)。在一些實施例中，poly(A)序列為牛生長激素poly(A)序列。在一些此類實施例中，bGH poly(A)序列包含或為SEQ ID NO: 108之序列。在一些實施例中，本揭示案之載體或構築體包含由SEQ ID NO: 108表示之牛生長激素polyA序列。poly(A)訊號序列之其他實例為此項技術中所已知。
在一些實施例中，本文所提供載體中之任一者可包括土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)，例如SEQ ID NO: 69。內部核糖體進入位點 (IRES)
在一些實施例中，編碼耳畸蛋白之蛋白C末端之載體可包括多核苷酸內部核糖體進入位點(IRES)。IRES序列用於自單一基因轉錄本產生超過一種多肽。IRES形成複雜二級結構，該二級結構允許緊鄰IRES所處位置下游之mRNA自任何位置發生轉譯起始(參見例如，Pelletier及Sonenberg,Mol. Cell. Biol. 8(3):1103-1112, 1988)。
熟習此項技術者已知數種IRES序列，包括來自以下之彼等IRES序列，例如：足口病病毒(FMDV)、腦心肌炎病毒(EMCV)、人類鼻病毒(HRV)、蟋蟀麻痺病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、A型肝炎病毒(HAV)、C型肝炎病毒(HCV)及脊髓灰質炎病毒(PV)。參見例如，Alberts, Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 2002；及Hellen等人，Genes Dev. 15(13):1593-612, 2001。
在一些實施例中，併入編碼耳畸蛋白之蛋白C末端的載體中的IRES序列為足口病病毒(FMDV)。足口病病毒2A序列為一種小肽(長度為約18個胺基酸)，已展示其介導聚蛋白之裂解(Ryan, M D等人，EMBO 4:928-933, 1994；Mattion等人，J. Virology 70:8124-8127, 1996；Furler等人，Gene Therapy 8:864-873, 2001；及Halpin等人，Plant Journal 4:453-459, 1999)。2A序列之裂解活性先前已在包括質體及基因療法載體(AAV及逆轉錄病毒)之人工系統中展現(Ryan等人，EMBO 4:928-933, 1994；Mattion等人，J. Virology 70:8124-8127, 1996；Furler等人，Gene Therapy 8:864-873, 2001；及Halpin等人，Plant Journal 4:453-459, 1999；de Felipe等人，Gene Therapy 6:198-208, 1999；de Felipe等人，Human Gene Therapy 11:1921-1931, 2000；及Klump等人，Gene Therapy 8:811-817, 2001)。報告序列
本文所提供載體中之任一者可視情況包括編碼報告蛋白之序列(「報告序列」)。報告序列之非限制性實例描述於本文中。報告序列之其他實例為此項技術中所已知。在一些實施例中，報告序列可用於驗證本文所述載體中之任一者的組織特異性靶向能力及組織特異性啟動子調節活性。NTF3
本文所提供載體中之任一者可視情況包括編碼神經營養蛋白-3 (NTF3)蛋白之序列。在一些實施例中，NTF3蛋白可具有與SEQ ID NO: 78至少70%一致、至少72%一致、至少74%一致、至少76%一致、至少78%一致、至少80%一致、至少82%一致、至少84%一致、至少86%一致、至少88%一致、至少90%一致、至少92%一致、至少94%一致、至少96%一致、至少98%一致、至少99%一致或100%一致之序列。在一些實施例中，NTF3蛋白可包括與SEQ ID NO: 78一致之序列，但其還包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代及/或缺失。
在一些實施例中，NTF3蛋白可由與SEQ ID NO: 79或80至少70%一致、至少72%一致、至少74%一致、至少76%一致、至少78%一致、至少80%一致、至少82%一致、至少84%一致、至少86%一致、至少88%一致、至少90%一致、至少92%一致、至少94%一致、至少96%一致、至少98%一致、至少99%一致或100%一致之序列編碼。
熟習此項技術者應瞭解，來自不同物種之相同蛋白質之間的不保守胺基酸的突變不太可能對蛋白質之功能具有影響，因此，應選擇此等胺基酸進行突變。來自不同物種之相同蛋白質之間的保守胺基酸不應突變，因為此等突變更可能引起蛋白質功能改變。來自其他哺乳動物物種之嗜中性粒細胞-3之非限制性實例如下所示。牛神經營養蛋白 -3 (SEQ ID NO: 81) 大鼠神經營養蛋白 -3 (SEQ ID NO: 82) 豬神經營養蛋白 -3 (SEQ ID NO: 83) 側接區非轉譯區 (UTR)
在一些實施例中，本文所述載體中之任一者(例如，至少兩種不同載體中之任一者)可包括非轉譯區。在一些實施例中，載體可包括5' UTR或3' UTR。
基因之非轉譯區(UTR)經轉錄但不轉譯。5' UTR在轉錄起始位點處開始，且繼續至起始密碼子，但不包括起始密碼子。3' UTR在緊鄰終止密碼子後開始，且持續直至轉錄終止訊號為止。愈來愈多證據表明UTR在核酸分子之穩定性及轉譯中起調節作用。可將UTR之調節特徵併入本文所述載體、組成物、套組或方法中之任一者中以增強耳畸蛋白之蛋白的穩定性。Kozak 序列
天然5' UTR包括在轉譯起始中起作用之序列。其具有如Kozak序列之印記，通常已知其參與核糖體起始多種基因轉譯所用之過程。Kozak序列具有共有序列CCR(A/G)CCAUGG，其中R為起始密碼子(AUG)上游三個鹼基之嘌呤(A或G)，其後為另一「G」。亦已知例如5' UTR形成參與伸長因子結合之二級結構。
例如，在一些實施例中，在本文所述載體中之任一者中包括5' UTR。可使用5' UTR之非限制性實例來增強核酸分子諸如mRNA之表現，該等實例包括來自以下基因之彼等5' UTR：白蛋白、血清澱粉樣蛋白A、載脂蛋白A/B/E、轉鐵蛋白、α-甲胎蛋白、促紅細胞生成素及因子VIII。
在一些實施例中，來自由耳蝸中之細胞轉錄的mRNA的5' UTR可包括在本文所述載體、組成物、套組及方法中之任一者中。
已知3' UTR中包埋有數段腺苷及尿苷。此等富含AU之印記在具有高翻轉率之基因中尤其普遍。根據富含AU之元件(ARE)的序列特徵及功能特性，其可分為三類(Chen等人，Mol. Cell. Biol. 15:5777-5788, 1995；Chen等人，Mol. Cell Biol. 15:2010-2018, 1995)：I類ARE在富U區域內含有數個AUUUA模體之分散複本。例如，c-Myc及MyoD mRNA含有I類ARE。II類ARE具有兩個或更多個重疊UUAUUUA(U/A) (U/A) 九聚物。GM-CSF及TNF-α mRNA為含有II類ARE之實例。III類ARE之定義不太明確。此等富含U之區域不含AUUUA模體。此類別之兩個經充分研究之實例為c-Jun及生肌蛋白mRNA。
已知大多數與ARE結合之蛋白質會使信使不穩定，而ELAV家族之成員(最尤其HuR)已證明可增加mRNA之穩定性。HuR結合於所有三種類別之ARE。將HuR特異性結合位點工程改造至核酸分子之3' UTR中將引起HuR結合，從而活體內 穩定訊息。
在一些實施例中，3' UTR ARE之引入、移除或修飾可用於調節編碼耳畸蛋白之蛋白的mRNA的穩定性。在其他實施例中，可移除或突變ARE以增加細胞內穩定性，因此增加耳畸蛋白之蛋白的轉譯及產生。剪接供體及剪接受體序列
在其他實施例中，可將非UTR序列併入5'或3' UTR中。在一些實施例中，可將內含子或內含子序列之部分併入本文所提供載體、組成物、套組及方法中任一者中之多核苷酸的側接區域中。併入內含子序列可增加蛋白質產量以及mRNA水準。內含子可為來自耳畸蛋白基因之內含子，或可為來自異源基因之內含子，例如，雜交腺病毒/小鼠免疫球蛋白內含子(Yew等人，Human Gene Ter. 8(5):575-584, 1997)、SV40內含子(Ostedgaard等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(8):2952-2957, 2005)、MVM內含子(Wu等人，Mol. Ther. 16(2):280-289, 2008)、因子IX截短內含子1 (Wu等人，Mol. Ther. 16(2):280-289, 2008；Kurachi等人,J. Biol. Chem. 270(10):5276-5281, 1995)、嵌合J-球蛋白剪接供體/免疫球蛋白重鏈剪接受體內含子(Wu等人，Mol. Ther. 16(2):280-289, 2008；Choi等人，Mol. Brain 7:17, 2014)、SV40晚期剪接供體/剪接受體內含子(19S/16S)(Yew等人，Human Gene Ther. 8(5):575-584, 1997)、雜交腺病毒剪接供體/IgG剪接受體(Choi等人，Mol. Brain 7:17, 1991；Huang及Gorman,Mol. Cell Biol. 10(4):1805-1810, 1990)。
剪接供體及剪接受體序列之非限制性實例分別為SEQ ID NO: 64及65；分別為SEQ ID NO: 72及73；且分別為SEQ ID NO: 74及75。在一些實施例中，剪接供體序列具有SEQ ID NO: 102之序列。在一些實施例中，本揭示案構築體之載體包含SEQ ID NO: 102之剪接供體序列。在一些此類實施例中，包含剪接供體序列(例如SEQ ID NO: 102)之載體或構築體亦在剪接供體序列之上游包含OTOF 基因或OTOF cDNA之5'部分(例如，SEQ ID NO: 101)。在一些實施例中，剪接受體序列具有SEQ ID NO: 106之序列。在一些實施例中，本揭示案之載體或構築體包含SEQ ID NO: 106之剪接受體序列。在一些此類實施例中，包含剪接受體序列(例如，SEQ ID NO: 106)之載體或構築體亦在剪接受體序列之下游包含OTOF 基因或OTOF cDNA之3’部分(例如，SEQ ID NO: 107)。去穩定域
本文所提供載體中之任一者可視情況包括編碼去穩定域之序列(「去穩定域序列」)。去穩定域為例如與缺乏穩定域之相同蛋白質相比，縮短包括去穩定域之蛋白質的活體內或活體外半衰期的胺基酸序列。例如，去穩定域可引起靶向包括去穩定域之蛋白質以用於蛋白質體降解。去穩定域之非限制實例包括 大腸桿菌(E. coli )二氫葉酸還原酶(DHFR)(Iwamoto等人，(2010) Chem. Biol. 17(9): 981-998)及FK-506結合蛋白(FKBP )(Wenlin等人，(2015) PLoS One 10(12): e0145783)之去穩定域。SEQ ID NO: 53為DHFR去穩定域之例示性胺基酸序列。去穩定域之其他實例為此項技術中已知。
在一些實施例中，本文所提供載體中之任一者可視情況包括降解序列，例如SEQ ID NO: 71之CL1降解序列。致重組序列
在一些實施例中，本揭示案之一或多種載體或構築體包含一或多個致重組序列。在一些實施例中，致重組序列為或包含基因序列之一部分。在一些實施例中，致重組序列來源於鹼性磷酸酶基因。在一些實施例中，致重組序列來源於F1噬菌體。在一些此類實施例中，致重組序列為來源於F1噬菌體之AK序列。在一些實施例中，此種AK致重組序列為SEQ ID NO: 103。在本揭示案之雙重載體系統之一些實施例中，兩種載體中之每一者均包含致重組序列。
在一些實施例中，本揭示案之組成物包含第一載體，該第一載體具有位於OTOF 基因或OTOF cDNA之5'部分(例如，SEQ ID NO: 101)下游及AK致重組序列(例如，SEQ ID NO: 103)上游的剪接供體序列(例如SEQ ID NO: 102)，及第二個載體，該第二載體具有位於OTOF 基因或OTOF cDNA之3'部分(例如，SEQ ID NO: 107)上游及AK致重組序列(例如，SEQ ID NO: 103)下游的剪接受體序列(例如SEQ ID NO: 106)。其他序列
本文所提供載體中之任一者可視情況包括其他核苷酸序列(「填充序列」)，以最佳化載體中鹼基對之總數。例如，為最佳化包裝，各載體可經設計以含有總共約4,000個鹼基對至約4,700個鹼基對，例如，約4,000個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,550個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,500個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,450個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,400個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,350個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,300個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,250個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,200個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,150個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,100個鹼基對、約4,000個鹼基對至約4,050個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,550個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,500個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,450個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,400個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,350個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,300個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,250個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,200個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,150個鹼基對、約4,050個鹼基對至約4,100個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,550個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,500個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,450個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,400個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,350個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,300個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,250個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,200個鹼基對、約4,100個鹼基對至約4,150個鹼基對、約4,150個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,150個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,150個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,150個鹼基對至約4,550個鹼基對、約4,150個鹼基對至約4,500個鹼基對、約4,150個鹼基對至約4,450個鹼基對、約4,150個鹼基對至約4,400個鹼基對、約4,150個鹼基對至約4,350個鹼基對、約4,150個鹼基對至約4,300個鹼基對、約4,150個鹼基對至約4,250個鹼基對、約4,150個鹼基對至約4,200個鹼基對、約4,200個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,200個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,200個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,200個鹼基對至約4,550個鹼基對、約4,200個鹼基對至約4,500個鹼基對、約4,200個鹼基對至約4,450個鹼基對、約4,200個鹼基對至約4,400個鹼基對、約4,200個鹼基對至約4,350個鹼基對、約4,200個鹼基對至約4,300個鹼基對、約4,200個鹼基對至約4,250個鹼基對、約4,250個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,250個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,250個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,250個鹼基對至約4,550個鹼基對、約4,250個鹼基對至約4,500個鹼基對、約4,250個鹼基對至約4,450個鹼基對、約4,250個鹼基對至約4,400個鹼基對、約4,250個鹼基對至約4,350個鹼基對、約4,250個鹼基對至約4,300個鹼基對、約4,300個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,300個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,300個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,300個鹼基對至約4,550個鹼基對、約4,300個鹼基對至約4,500個鹼基對、約4,300個鹼基對至約4,450個鹼基對、約4,300個鹼基對至約4,400個鹼基對、約4,300個鹼基對至約4,350個鹼基對、約4,350個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,350個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,350個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,350個鹼基對至約4,550個鹼基對、約4,350個鹼基對至約4,500個鹼基對、約4,350個鹼基對至約4,450個鹼基對、約4,350個鹼基對至約4,400個鹼基對、約4,400個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,400個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,400個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,400個鹼基對至約4,550個鹼基對、約4,400個鹼基對至約4,500個鹼基對、約4,400個鹼基對至約4,450個鹼基對、約4,450個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,450個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,450個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,450個鹼基對至約4,550個鹼基對、約4,450個鹼基對至約4,500個鹼基對、約4,500個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,500個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,500個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,500個鹼基對至約4,550個鹼基對、約4,550個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,550個鹼基對至約4,650個鹼基對、約4,550個鹼基對至約4,600個鹼基對、約4,600個鹼基對至約4,700個鹼基對、約4,600個鹼基對至約4,650個鹼基對或約4,650個鹼基對至約4,700個鹼基對(包括端點)。
填充序列可為可包括在本文所述載體中之任一者中以達成期望載體大小(例如，約4 kb至約5 kb之載體大小，或本文所提供載體大小中之任一者)的未轉錄且不具有調節功能的任何核苷酸序列，例如，高達1000 bp。例如，填充序列可為約100 bp至約1000 bp (例如，約100 bp至約900 bp、約100 bp至約800 bp、約100 bp至約700 bp、約100 bp至約600 bp、約100 bp至約500 bp、約100 bp至約400 bp、約100 bp至約300 bp、約100 bp至約100 bp、約200 bp至約1000 bp、約200 bp至約900 bp、約200 bp至約800 bp、約200 bp至約700 bp、約200 bp至約600 bp、約200 bp至約500 bp、約200 bp至約400 bp、約200 bp至約300 bp、約300 bp至約1000 bp、約300 bp至約900 bp、約300 bp至約800 bp、約300 bp至約700 bp、約300 bp至約600 bp、約300 bp至約500 bp、約300 bp至約400 bp、約400 bp至約1000 bp、約400 bp至約900 bp、約400 bp至約800 bp、約400 bp至約700 bp、約400 bp至約600 bp、約400 bp至約500 bp、約500 bp至約1000 bp、約500 bp至約900 bp、約500 bp至約800 bp、約500 bp至約700 bp、約500 bp至約600 bp、約600 bp至約1000 bp、約600 bp至約900 bp、約600 bp至約800 bp、約600 bp至約700 bp、約700 bp至約1000 bp、約700 bp至約900 bp、約700 bp至約800 bp、約800 bp至約1000 bp、約800 bp至約900 bp、約900 bp至約1000 bp、約100 bp、約150 bp、約200 bp、約250 bp、約300 bp、約350 bp、約400 bp、約450 bp、約500 bp、約550 bp、約600 bp、約650 bp、約700 bp、約750 bp、約800 bp、約850 bp、約900 bp、約950 bp或約1000 bp)之任何核苷酸序列。SEQ ID NO. 54-58、90及91為可用於本文所述載體中任一者之例示性人類因子VIII填充序列。其他填充序列為此項技術所已知。包括填充序列之例示性載體如圖21-31、圖36、圖37、圖59-63及圖66中所示。雙重 AAV 載體組成物
在一些實施例中，本揭示案提供包含一或多種載體以將治療基因(例如完整治療基因或其功能部分)遞送至有需要之個體的組成物。例如，在一些實施例中，耳畸蛋白基因過大而不能包裝至單一重組載體例如重組AAV載體中。因此，在一些實施例中，採用兩種或更多種載體將治療基因(例如完整治療基因)遞送至有需要之個體。例如，在一些實施例中，使用雙重載體系統，其中兩種載體中之每一者均包含人類耳畸蛋白基因之一部分，且當在活體內遞送時，構築體一起產生編碼全長功能性耳畸蛋白之蛋白的多核苷酸。在一些實施例中，使用一或多種策略，例如，(i)多聯化-反式剪接策略，(ii)雜交內含子-同源重組-反式剪接策略，及(iii)外顯子同源重組策略，如Pryadkina等人，Meth Clin Devel 2015, 2:15009所總結。哺乳動物細胞
本文亦提供一種細胞(例如，哺乳動物細胞)，其包括本文所述核酸、載體(例如，本文所述之至少兩種不同載體)或組成物中之任一者。熟悉此項技術者應瞭解，可將本文所述核酸及載體引入任何哺乳動物細胞中。載體之非限制性實例及用於將載體引入哺乳動物細胞中之方法如本文中所述。在一些實施例中，細胞為人類細胞、小鼠細胞、豬細胞、兔細胞、狗細胞、貓細胞、大鼠細胞、綿羊細胞、貓細胞、馬細胞或非人類靈長類細胞。在一些實施例中，細胞為耳蝸之特化細胞。在一些實施例中，細胞為耳蝸內毛細胞或耳蝸外毛細胞。在一些實施例中，細胞為耳蝸內毛細胞。在一些實施例中，細胞為耳蝸內毛細胞。
在一些實施例中，哺乳動物細胞為活體外 細胞。在一些實施例中，哺乳動物細胞存在於哺乳動物中。在一些實施例中，哺乳動物細胞係獲自個體。在一些實施例中，哺乳動物細胞為獲自個體之自體細胞及/或為離體 培養。使用方法 引導至耳蝸中之方法
本文亦提供將治療有效量之本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物(例如，人類)耳蝸中之方法。亦提供增加哺乳動物(例如，人類)耳蝸中內毛細胞中活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)之表現的方法，該等方法包括將治療有效量之本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物耳蝸中。亦提供治療鑑別為具有缺陷耳畸蛋白基因之個體(例如，人類)的非症狀性感覺神經性聽力損失的方法，其中該等方法包括向個體之耳蝸中投與治療有效量之本文所述組成物中之任一者。在一些實例中，本文所述方法可還包括向個體耳蝸投與神經營養因子(例如，與向個體投與本文所述組成物中之任一者基本上同時或在其之前或之後)。在一些實例中，本文所述方法可還包括向個體投與耳蝸植入物(例如，與向個體投與本文所述組成物中之任一者基本上同時或在其之前或之後)。
在此等方法中任一者之一些實施例中，哺乳動物先前已鑑別為具有缺陷耳畸蛋白基因(例如，具有如下突變之耳畸蛋白基因，該突變使該基因編碼之耳畸蛋白之蛋白的表現及/或活性降低)。此等方法中任一者之一些實施例還包括在引入或投與步驟之前，確定個體具有缺陷耳畸蛋白基因。此等方法中任一者之一些實施例還可包括偵測個體中耳畸蛋白基因中之突變。該等方法中任一者之一些實施例還可包括將個體識別或診斷為患有非症狀性感覺神經性聽力損失。
在此等方法中任一者之一些實施例中，向哺乳動物或個體之耳蝸中引入或投與兩次或更多次劑量之本文所述組成物中之任一者。此等方法中任一者之一些實施例可包括向哺乳動物或個體之耳蝸中引入或投與第一劑量之組成物，在引入或投與第一劑量後評定哺乳動物或個體之聽力功能，及向發現在正常範圍內不具有聽力功能(例如，如使用此項技術中已知之任何聽力測試所確定)之哺乳動物或個體之耳蝸中投與另一劑量之組成物。
在本文所述方法中任一者之一些實施例中，組成物可經調配以用於耳蝸內投與。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，本文所述組成物可經由耳蝸內投與或局部投與來投與。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，經由使用醫療裝置(例如，本文所述例示性醫療裝置中之任一者)來投與組成物。
在一些實施例中，可使用本文所述或此項技術中已知方法中之任一者進行耳蝸內投與。例如，可使用以下外科技術向耳蝸中投與或引入組成物：首先使用0度2.5-mm剛性內窺鏡進行可視化，清除外耳道，且使用圓刀鋒利地劃定約5-mm鼓膜瓣。隨後抬高鼓膜瓣，且向後進入中耳。鑑別且分割鼓索神經，且使用刮匙移除小骨，從而暴露圓窗膜。為增加所投與或引入組成物之頂端分佈，可使用外科雷射在卵圓窗中開2-mm之小窗，以允許在組成物之跨圓窗膜輸注期間進行外淋巴排出。隨後裝填微輸注裝置，且帶入外科區。操縱裝置至圓窗，且將尖端安放在骨圓窗懸垂物內，以允許微針穿透膜。將踏板接合以允許進行組成物之經計量穩定輸注。隨後撤出裝置，且用明膠泡沫貼片密封圓窗及鐙骨底板。
在一些實施例中，本揭示案描述利用廣為接受之微創外科技術經由外耳道通向中耳及/或內耳之遞送方法。程序包括打開卵圓窗處中耳與內耳之間之一個物理障壁，及隨後使用本文所揭示之裝置(例如如圖82-圖87中所顯示) (或微導管)以受控流量及固定體積經由圓窗膜遞送本文所揭示之組成物。
在一些實施例中，用於哺乳動物(例如嚙齒類動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠或兔)、靈長類動物(例如NHP (例如獼猴、黑猩猩、猴子或人猿)或人類)之外科程序可包括通氣以增加沿耳蝸長度之AAV載體轉導率。在一些實施例中，在手術期間不通氣可能導致AAV載體耳蝸細胞轉導率低於用通氣實施手術後之AAV載體耳蝸細胞轉導率。在一些實施例中，通氣會促進整個耳蝸中約75%-100%之IHC轉導率。在一些實施例中，通氣允許耳蝸基底處之IHC轉導率為約50%-70%、約60%-80%、約70%-90%或約80%-100%。在一些實施例中，通氣允許耳蝸頂點處之IHC轉導率為約50%-70%、約60%-80%、約70%-90%或約80%-100%。
本文所述之遞送裝置可置於手術室之無菌區中且管之末端可自無菌區取出並連接至已裝載有本文所揭示之組成物(例如一或多種AAV載體)且安裝於幫浦中之注射器。適當引動系統以去除任何空氣後，針隨後可在可視化下(外科顯微鏡、內視鏡及/或遠端照相機)穿過中耳。可使用針(或微針)刺穿RWM。可插入針直至塞子接觸RWM。然後可使裝置保持在該位置，同時將本文所揭示之組成物以受控流量遞送至內耳達所選持續時間。在一些實施例中，流量(或輸注速率)可包括以下速率：約30 μL/min、或約25 μL/min至約35 μL/min、或約20 μL/min至約40 μL/min、或約20 μL/min至約70 μL/min、或約20 μL/min至約90 μL/min、或約20 μL/min至約100 μL/min。在一些實施例中，流量為約20 μL/min、約30 μL/min、約40 μL/min、約50 μL/min、約60 μL/min、約70 μL/min、約80 μL/min、約90 μL/min或約100 μL/min。在一些實施例中，所選持續時間(亦即，本文所揭示之組成物流動期間之時間)可為約3分鐘、或約2.5分鐘至約3.5分鐘、或約2分鐘至約4分鐘、或約1.5分鐘至約4.5分鐘、或約1分鐘至約5分鐘。在一些實施例中，流動至內耳之本文所揭示組成物之總體積可為約0.09 mL、或約0.08 mL至約0.10 mL、或約0.07 mL至約0.11 mL。在一些實施例中，本文所揭示組成物之總體積等於內耳體積之約40%至約50%。
一旦完成遞送，便可立即移除裝置。在一些實施例中，本文所述之裝置可組態為一次性產品。在其他實施例中，本文所述之裝置可組態為例如具有可替代及/或可滅菌針子總成之多次使用之可滅菌產品。一次性裝置可在完成投與後適當丟棄(例如在生物危害性銳器容器中)。
在一些實施例中，本文所揭示之組成物包含一種或複數種AAV載體。在一些實施例中，當組成物中包括一種以上之AAV載體時，AAV載體各自係不同的。在一些實施例中，AAV載體包含OTOF編碼區，例如如本文所述。在一些實施例中，組成物包含含有本文所述之AAV載體之rAAV粒子。在一些實施例中，rAAV粒子用Anc80衣殼殼體化。在一些實施例中，Anc80衣殼包含SEQ ID NO: 109之多肽。個體
在本文所述方法中任一者之一些實施例中，個體或哺乳動物為囓齒動物、非人類靈長類動物或人類。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，個體或哺乳動物為成人、青少年、少年、兒童、學步兒童、嬰兒或新生兒。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，個體或哺乳動物為1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、2-5、2-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100、10-110、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-110、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、50-70、50-80、50-90、50-100、60-80、60-90、60-100、70-90、70-100、70-110、80-100、80-110或90-110歲。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，個體或哺乳動物為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個月。
在本文所述方法中任一者之一些實施例中，該等方法使有需要之個體的聽力(例如，本文所述用於確定聽力改良之量度中之任一者)改良至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天、至少75天、至少80天、至少85天、至少100天、至少105天、至少110天、至少115天、至少120天、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月或至少12個月。
在本文所述方法中任一者之一些實施例中，個體或哺乳動物患有非症候群性感覺神經性聽力損失或具有產生該疾病之風險。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，先前已鑑別出個體或哺乳動物在耳畸蛋白基因中具有突變。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，個體或哺乳動物在耳畸蛋白基因中具有如下突變中之任一者，該等突變如本文所述或在此項技術中已知與非症狀性感覺神經性聽力損失相關。
在本文所述方法中任一者之一些實施例中，個體或哺乳動物已鑑別為耳畸蛋白基因中之突變的運載體(例如，經由遺傳測試)。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，個體或人類已鑑別為在耳畸蛋白基因中具有突變且已診斷患有非症狀性感覺神經性聽力損失。在本文所述方法中任一者之一些實施例中，個體或人類已鑑別為患有非症狀性感覺神經性聽力損失。
在一些實施例中，可使用此項技術中已知之習知功能聽力測試中之任一者在個體中確定非症狀性感覺神經性聽力損失的成功治療。功能聽力測試之非限制性實例為各種類型之聽力測定檢定(例如，純音測試、語音測試、中耳測試、聽覺腦幹反應及光聲發射)。增加活性耳畸蛋白之表現
本文亦提供增加哺乳動物細胞中活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)之表現的方法，該等方法包括將本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物細胞中。在此等方法之一些實施例中，哺乳動物細胞為耳蝸內毛細胞。在此等方法之一些實施例中，哺乳動物細胞為人類細胞(例如，人類耳蝸內毛細胞)。在此等方法之一些實施例中，哺乳動物細胞為活體外 細胞。在此等方法之一些實施例中，哺乳動物細胞在哺乳動物中。在此等方法之一些實施例中，哺乳動物細胞最初獲自哺乳動物及/或離體 培養。在一些實施例中，先前已確定哺乳動物細胞具有缺陷耳畸蛋白基因。
用於將本文所述組成物中之任一者引入哺乳動物細胞中的方法為此項技術中所已知(例如，經由脂質轉染或經由使用病毒載體，例如，本文所述病毒載體中之任一者)。
在一些實施例中，本文所述活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)的表現增加係例如與對照或與引入載體前的活性耳畸蛋白之蛋白(例如全長耳畸蛋白之蛋白)的表現水準相比而言的。偵測耳畸蛋白之方法
偵測耳畸蛋白之表現及/或活性的方法為此項技術中所已知。在一些實施例中，可直接偵測耳畸蛋白之蛋白的表現水準(例如，偵測耳畸蛋白之蛋白或偵測耳畸蛋白mRNA)。可用於直接偵測耳畸蛋白之表現及/或活性的技術的非限制性實例包括：即時PCR、Western印跡、免疫沈澱、免疫組織化學或免疫螢光。在一些實施例中，可間接偵測耳畸蛋白之蛋白的表現(例如，經由功能聽力測試)。組成物
本揭示案尤其提供組成物。在一些實施例中，組成物包含如本文所述之構築體。在一些實施例中，組成物包含一或多種如本文所述之構築體。在一些實施例中，組成物包含複數種如本文所述之構築體。在一些實施例中，當組成物中包括一種以上之構築體時，構築體各自係不同的。
在一些實施例中，組成物包含如本文所述之AAV載體。在一些實施例中，組成物包含一或多種如本文所述之AAV載體。在一些實施例中，組成物包含複數種AAV載體。在一些實施例中，當組成物中包括一種以上之AAV載體時，AAV載體各自係不同的。在一些實施例中，AAV載體包含OTOF編碼區，例如如本文所述。
在一些實施例中，組成物包含一或多個重組AAV (rAAV)粒子。在一些實施例中，rAAV粒子包含重組AAV載體(rAAV)。在一些實施例中，rAAV粒子用Anc80衣殼殼體化。在一些實施例中，Anc80衣殼包含SEQ ID NO: 109之多肽。
在一些實施例中，組成物係或包含醫藥組成物。
在一些實施例中，本文所述之組成物呈溶液形式。給藥及投與體積
在一些實施例中，本文所揭示之組成物(例如一種或複數種本文所揭示之AAV載體)係以單劑量或以複數個劑量投與。
在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以單劑量投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以複數個劑量(例如2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個劑量)投與。
在一些實施例中，本文所揭示之組成物(例如包含一種或複數種本文所揭示之AAV載體之組成物)係以下列體積投與：約0.01 mL、約0.02 mL、約0.03 mL、約0.04 mL、約0.05 mL、約0.06 mL、約0.07 mL、約0.08 mL、約0.09 mL、約1.00 mL、約1.10 mL、約1.20 mL、約1.30 mL、約1.40 mL、約1.50 mL、約1.60 mL、約1.70 mL、約1.80 mL、約1.90 mL或約2.00 mL。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約0.01 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約0.02 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約0.03 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約0.04 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約0.05 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約0.06 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約0.07 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約0.08 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約0.09 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約1.00 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約1.10 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約1.20 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約1.30 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約1.40 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約1.50 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約1.60 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約1.70 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約1.80 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約1.90 mL之體積投與。在一些實施例中，本文所揭示之組成物係以約2.00 mL之體積投與。
在一些實施例中，本文所揭示之組成物(例如包含一種或複數種本文所揭示之AAV載體之組成物)係以下列體積投與：約0.01 mL至2.00 mL、約0.02 mL至1.90 mL、約0.03 mL至1.8 mL、約0.04 mL至1.70 mL、約0.05 mL至1.60 mL、約0.06 mL至1.50 mL、約0.06 mL至1.40 mL、約0.07 mL至1.30 mL、約0.08 mL至1.20 mL、或約0.09 mL至1.10 mL。在一些實施例中，本文所揭示之組成物(例如包含一種或複數種本文所揭示之AAV載體之組成物)係以下列體積投與：約0.01 mL至2.00 mL、約0.02 mL至2.00 mL、約0.03 mL至2.00 mL、約0.04 mL至2.00 mL、約0.05 mL至2.00 mL、約0.06 mL至2.00 mL、約0.07 mL至2.00 mL、約0.08 mL至2.00 mL、約0.09 mL至2.00 mL、約0.01 mL至1.90 mL、約0.01 mL至1.80 mL、約0.01 mL至1.70 mL、約0.01 mL至1.60 mL、約0.01 mL至1.50 mL、約0.01 mL至1.40 mL、約0.01 mL至1.30 mL、約0.01 mL至1.20 mL、約0.01 mL至1.10 mL、約0.01 mL至1.00 mL、約0.01 mL至0.09 mL。醫藥組成物及套組
本揭示案之醫藥組成物可包含核酸，例如本文所述之一種或複數種AAV載體，以及一或多種醫藥學上或生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一些實施例中，醫藥組成物可包含一或多種AAV載體，例如用一或多種AAV血清型衣殼殼體化之一或多種AAV構築體，如本文所述。在一些實施例中，醫藥組成物可包含緩沖劑，諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水及其類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或聚葡萄糖；甘露糖醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；及防腐劑。在一態樣中，本揭示案之組成物經調配以用於耳蝸內投與。在一態樣中，本揭示案之組成物經調配以用於靜脈內投與。
在一些實施例中，治療組成物經調配以用於耳蝸內投與。在一些實施例中，治療組成物經調配以包含脂質奈米粒子。在一些實施例中，治療組成物經調配以包含聚合奈米粒子。在一些實施例中，治療組成物經調配以包含小環DNA。在一些實施例中，治療組成物經調配以包含CELiD DNA。在一些實施例中，治療組成物經調配以包含合成外淋巴溶液。例示性合成外淋巴溶液包括20-200 mM NaCl；1-5 mM KCl；0.1-10 mM CaCl2 ；1-10 mM葡萄糖；及2-50 mM HEPES，其中pH為約6至約9。
在一些實施例中，本文所述組成物中之任一者還可包括一或多種促進核酸或本文所述載體中之任一者進入哺乳動物細胞中之劑(例如，脂質體或陽離子脂質)。
在一些實施例中，可使用天然及/或合成聚合物調配本文所述載體中之任一者。可包括在本文所述組成物中任一者中之聚合物的非限制性實例可包括(但不限於) DYNAMIC POLYCONJUGATE® (Arrowhead Research Corp., Pasadena, Calif.)、來自Mirus Bio (Madison, Wis.)及Roche Madison (Madison, Wis.)之調配物、PhaseRX聚合物調配物諸如但不限於SMARTT POLYMER TECHNOLOGY® (PhaseRX, Seattle, Wash.)、DMRI/DOPE、泊洛沙姆(poloxamer)、來自Vical (San Diego, Calif.)之VAXFECTIN®佐劑、殼聚糖、來自Calando Pharmaceuticals(Pasadena, Calif.)之環糊精、樹狀聚合物及聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合物、RONDELTM (RNAi/寡核苷酸奈米粒子遞送)聚合物(Arrowhead Research Corporation, Pasadena, Calif.)及pH反應性共嵌段聚合物，諸如但不限於PhaseRX (Seattle, Wash.)產生之聚合物。此等聚合物中之許多已在將寡核苷酸活體內 遞送至哺乳動物細胞中展現功效(參見例如，deFougerolles,Human Gene Ther. 19:125-132, 2008；Rozema等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007；Rozema等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007；Hu-Lieskovan等人，Cancer Res. 65:8984-8982, 2005；Heidel等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:5715-5721, 2007)。本文所述組成物中之任一者可為例如醫藥組成物。
在一些實施例中，組成物包括醫藥學上可接受之載劑(例如，磷酸鹽緩衝鹽水、鹽水或抑菌水)。在調配後，以與劑量調配物相容之方式且以該治療有效量來投與溶液。該等調配物易於以多種劑型投與，諸如可注射溶液、可注射凝膠、藥物釋放膠囊及其類似劑型。
如本文所使，術語「醫藥學上可接受之載劑」包括與醫藥投與相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑、抗真菌劑及其類似載劑。補充活性化合物亦可併入本文所述組成物中之任一者中。
在一些實施例中，本文所述組成物中之任一者的單次劑量可例如在緩衝溶液中包括如下量之總量之至少兩種不同載體：至少1 ng、至少2 ng、至少4 ng、約6 ng、約8 ng、至少10 ng、至少20 ng、至少30 ng、至少40 ng、至少50 ng、至少60 ng、至少70 ng、至少80 ng、至少90 ng、至少100 ng、至少200 ng、至少300 ng、至少400 ng、至少500 ng、至少1 μg、至少2 μg、至少4 μg、至少6 μg、至少8 μg、至少10 μg、至少12 μg、至少14 μg、至少16 μg、至少18 μg、至少20 μg、至少22 μg、至少24 μg、至少26 μg、至少28 μg、至少30 μg 至少32 μg、至少34 μg、至少36 μg、至少38 μg、至少40 μg、至少42 μg、至少44 μg、至少46 μg、至少48 μg、至少50 μg、至少52 μg、至少54 μg、至少56 μg、至少58 μg、至少60 μg、至少62 μg、至少64 μg、至少66 μg、至少68 μg、至少70 μg、至少72 μg、至少74 μg、至少76 μg、至少78 μg、至少80 μg、至少82 μg、至少84 μg、至少86 μg、至少88 μg、至少90 μg、至少92 μg、至少94 μg、至少96 μg、至少98 μg、至少100 μg、至少102 μg、至少104 μg、至少106 μg、至少108 μg、至少110 μg、至少112 μg、至少114 μg、至少116 μg、至少118 μg、至少120 μg、至少122 μg、至少124 μg、至少126 μg、至少128 μg、至少130 μg 至少132 μg、至少134 μg、至少136 μg、至少138 μg、至少140 μg、至少142 μg、至少144 μg、至少146 μg、至少148 μg、至少150 μg、至少152 μg、至少154 μg、至少156 μg、至少158 μg、至少160 μg、至少162 μg、至少164 μg、至少166 μg、至少168 μg、至少170 μg、至少172 μg、至少174 μg、至少176 μg、至少178 μg、至少180 μg、至少182 μg、至少184 μg、至少186 μg、至少188 μg、至少190 μg、至少192 μg、至少194 μg、至少196 μg、至少198 μg或至少200 μg。
本文所提供之組成物可例如經調配以與其預期投與途徑相容。預期投與途徑之非限制性實例為局部投與(例如，耳蝸內投與)。
在一些實施例中，治療組成物經調配以包括脂質奈米粒子。在一些實施例中，治療組成物經調配以包括聚合奈米粒子。在一些實施例中，治療組成物經調配以包含小環DNA。在一些實施例中，治療組成物經調配以包含CELiD DNA。在一些實施例中，治療組成物經調配以包含合成外淋巴溶液。例示性合成外淋巴溶液包括20-200 mM NaCl；1-5 mM KCl；0.1-10 mM CaCl2 ；1-10 mM葡萄糖；2-50 mM HEPES，其pH為約6至約9。
亦提供包括本文所述組成物中任一者之套組。在一些實施例中，套組可包括固體組成物(例如，包括本文所述之至少兩種不同載體之凍乾組成物)及用於溶解凍乾組成物之液體。在一些實施例中，套組可包括預裝載注射器，該預裝載注射器包括本文所述組成物中之任一者。
在一些實施例中，套組包括小瓶，該小瓶包含本文所述組成物中之任一者(例如，調配成水性組成物，例如水性醫藥組成物)。
在一些實施例中，套組可包括用於進行本文所述方法中任一者之說明書。投與途徑
適用於可注射用途之醫藥形式包括無菌水溶液或水性分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。分散液亦可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中及在油中製備。在普通儲存及使用條件下，此等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。在許多情況下，該形式為無菌且流動的以易於進行注射。其必須在生產及儲存條件下穩定，且必須經保存以防止微生物諸如細菌及真菌之污染作用。載劑可為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)、其合適混合物及/或植物油。可例如藉由使用包衣諸如卵磷脂，在分散液之情況下藉由維持所需粒徑以及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑來防止微生物之作用，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，較佳包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可藉由在組成物中使用延遲吸收之劑，例如單硬脂酸鋁及明膠，來延長可注射組成物之吸收。
為投與可注射水溶液，例如，若需要，可適當緩衝溶液，且首先用足夠鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。此等特定水溶液特別適用於靜脈內、肌內、皮下及腹膜內投與。在此方面，熟習此項技術者已知可使用之無菌水性介質。例如，可將一劑量溶解在1 ml等滲NaCl溶液中，且添加至1000 ml皮下灌注液中，或在建議之輸注部位注射(參見例如，「Remington's Pharmaceutical Sciences」 第15版, 第1035-1038頁及第1570-1580頁)。視宿主之狀況而定必然發生劑量之一些變化。在任何情況下，負責投與者決定個別宿主之適當劑量。
藉由將所要量之活性rAAV視需要與本文列舉之各種其他成分一起併入適當溶劑中，繼而過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將各種經滅菌活性成分併入無菌媒劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有基本分散介質及來自以上所列舉彼等成分之所要其他成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情形下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，該等技術自先前無菌過濾之溶液產生活性成分加任何其他所要成分之粉末。
本文所揭示之rAAV組成物亦可調配成中性或鹽形式。醫藥學上可接受之鹽包括酸加成鹽(與蛋白質之遊離胺基形成)，該等酸加成鹽係與無機酸諸如鹽酸或磷酸，或有機酸諸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸及其類似酸形成。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因(procaine)及其類似鹼。在調配後，以與劑量調配物相容之方式且以該治療有效量來投與溶液。該等調配物易於以多種劑型投與，諸如可注射溶液、可注射凝膠、藥物釋放膠囊及其類似劑型。
如本文所用，「載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、媒劑、包衣、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑、緩沖劑、載劑溶液、懸浮液、膠體及其類似物。此類介質及劑用於醫藥活性物質之用途為此項技術中所熟知。補充活性成分亦可併入組成物中。短語「醫藥學上可接受」指當向宿主投與時不產生過敏或類似不良反應之分子實體及組成物。
遞送媒劑諸如脂質體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質粒子、囊泡及其類似物可用於將本揭示案組成物引入合適宿主細胞中。詳言之，rAAV載體遞送之轉殖基因可經調配以用於以封裝在脂質粒子、脂質體、囊泡、奈米球或奈米粒子或其類似物中之形式遞送。
此類調配物對於引入本文所揭示之核酸或rAAV構築體之醫藥學上可接受之調配物可為較佳。脂質體之形成及用途為熟習此項技術者通常所已知。最近開發出具有改良血清穩定性及循環半衰期之脂質體(美國專利第5,741,516號)。此外，已描述脂質體及脂質體樣製劑作為潛在藥物載劑之各種方法(美國專利第5,567,434號；第5,552,157號；第5,565,213號；第5,738,868號；及第5,795,587號)。
脂質體已成功用於通常對藉由其他程序轉染具有抗性之多種細胞類型。此外，脂質體無病毒基遞送系統典型之DNA長度限制。脂質體有效用於將基因、藥物、放射治療劑、病毒、轉錄因子及變構效應子引入多種培養之細胞株及動物中。另外，已完成檢驗脂質體介導之藥物遞送之有效性的數種成功臨床試驗。
脂質體由分散在水性介質中之磷脂形成，且自發形成多層同心雙層囊泡(亦稱為多層囊泡(MLV))。MLV之直徑通常為25 nm至4 Tm。MLV之音波處理形成直徑在200至500埃範圍內之小單層囊泡(SUV)，其在核心中含有水溶液。
替代地，可使用rAAV之奈米膠囊調配物。奈米膠囊通常可以穩定且可再現之方式截留物質。為避免由於細胞內聚合物超載引起之副作用，應使用能夠在活體內降解之聚合物設計此類超細粒子(大小為約0.1 Tm)。預期使用滿足此等要求之可生物降解之聚烷基-氰基丙烯酸酯奈米粒子。
除上述遞送方法外，亦預期將以下技術作為將rAAV組成物遞送至宿主之替代方法。音波療法(亦即，超音波)已使用且在美國專利第5,656,016號中作為用於提高藥物滲透進入且穿過循環系統之速率及功效的裝置。涵蓋之其他藥物遞送替代物為骨髓腔內注射(美國專利第5,779,708號)，微晶片裝置(美國專利第5,797,898號)、眼科調配物(Bourlais等人，1998)、經皮基質(美國專利第5,770,219號及第5,783,208號)及反饋控制之遞送(美國專利第5,697,899號)。
本發明組成物之投與可以任何方便方式進行，包括藉由氣溶膠吸入、注射、攝入、轉輸、植入或移植。本文所述組成物可藉由靜脈內(iv)經動脈、皮下、皮內、結節內、髓內、肌內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內向個體投與。在一態樣中，本揭示案之核酸組成物藉由皮內或皮下注射向個體投與。在一態樣中，本揭示案之核酸組成物藉由i.v.注射投與。裝置及外科方法
本文提供在一些實施例中可用於治療耳聾及其他聽力相關疾病、病症及疾患之 技術(例如，系統、方法、裝置等)。此類技術之實例亦包括在例如WO2017223193 及WO2019084145中，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。在一態樣中，本揭示案提供用於治療耳聾及其他聽力相關疾病、病症及疾患之治療遞送系統。在一態樣中，提供包括以下之治療遞送系統：i)能夠在有需要之人類個體之內耳的圓窗膜中產生一個或複數個切口的醫療裝置，及ii)有效劑量之包含一種或複數種腺相關病毒(AAV)載體之治療組成物，其中該一種或複數種AAV載體能夠在內耳之標靶細胞中構成全長聽覺多肽信使RNA。在用於進行外科方法之手段之一些實施例中，該方法包括如下步驟：向有需要之人類個體耳蝸內投與有效劑量之本揭示案之治療組成物，其中該治療組成物能夠藉由使用如下醫療裝置來投與，該醫療裝置包括：a)用於在圓窗膜中產生一個或複數個切口之構件；及b)有效劑量之治療組成物。
本文提供用於治療聽力損失之外科方法。在一態樣中，該等方法包括如下步驟：向人類個體之耳蝸中在第一切口點處引入第一切口；及耳蝸內投與有效劑量之本文所提供之治療組成物(例如，本文所述組成物中之任一者)。在一個實施例中，在第一切口點向個體投與治療組成物(例如，本文所述組成物中之任一者)。在一個實施例中，在第一切口中或經由第一切口向個體投與治療組成物。在一個實施例中，在耳蝸卵圓窗膜中或經由耳蝸卵圓窗膜向個體投與治療組成物。在一個實施例中，在耳蝸圓窗膜中或經由耳蝸圓窗膜向個體投與治療組成物。
在一些實施例中，本文所揭示之組成物可使用外科程序投與個體。在一些實施例中，投與(例如經由外科程序)包括將本文所揭示之組成物經由如本文所述之遞送裝置注射至內耳中。在一些實施例中，本文所揭示之外科程序包括實施經外耳道鼓膜切開術；實施雷射輔助微鐙骨切開術；及將本文所揭示之組成物經由如本文所述之遞送裝置注射至內耳中。
在一些實施例中，外科程序包括實施經外耳道鼓膜切開術；實施雷射輔助微鐙骨切開術；將本文所揭示之組成物經由如本文所述之遞送裝置注射至內耳中；在個體之圓窗及/或卵圓窗周圍施加密封劑；及將個體之鼓膜耳道皮瓣降低至解剖位置。
在一些實施例中，外科程序包括實施經外耳道鼓膜切開術；準備個體之圓窗；實施雷射輔助微鐙骨切開術；準備用於遞送至內耳之如本文所述之遞送裝置及本文所揭示之組成物二者；將本文所揭示之組成物經由遞送裝置注射至內耳中；在個體之圓窗及/或卵圓窗周圍施加密封劑；及將個體之鼓膜耳道皮瓣降低至解剖位置。
在一些實施例中，實施雷射輔助微鐙骨切開術包括使用KTP耳科雷射及/或CO2耳科雷射。
在一些實施例中，組成物包含一種或複數種AAV載體。在一些實施例中，當組成物中包括一種以上之AAV載體時，AAV載體各自係不同的。在一些實施例中，AAV載體包含OTOF編碼區，例如如本文所述。在一些實施例中，組成物包含含有本文所述之AAV載體之rAAV粒子。在一些實施例中，rAAV粒子用Anc80衣殼殼體化。在一些實施例中，Anc80衣殼包含SEQ ID NO: 109之多肽。
例如，在一個實施例中，使用能夠在圓窗膜中產生複數個切口之醫療裝置來投與治療組成物。在一個實施例中，醫療裝置包括複數個微針。在一個實施例中，醫療裝置包括複數個微針，該複數個微針包括大致圓形第一外觀，其中各微針之直徑為至少約10微米。在一個實施例中，醫療裝置包括基座及/或能夠容納治療組成物之儲器。在一個實施例中，醫療裝置包括複數個空心微針，該複數個空心微針分別包括能夠轉移治療組成物之內腔。在一個實施例中，醫療裝置包括用於產生至少部分真空之構件。
作為另一實例，本文所揭示之組成物係使用經特定設計用於耳蝸內投與途徑之裝置及/或系統來投與。在一些實施例中， 本文所述裝置之設計要素可包括：維持所注射流體之無菌性；最小化引入內耳之氣泡；以受控速率精確遞送小體積之能力；由外科醫生經由外耳道遞送；最小化對圓窗膜(RWM)或對內耳(例如RWM以外之耳蝸結構)之損傷；及/或最小化經由RWM洩漏回之所注射流體。
本文所提供之裝置、系統及方法亦描述將組成物安全且有效地遞送至內耳來治療將受益於將本文所揭示之組成物遞送至內耳之疾患及病症之潛能，該等疾患及病症包括(但不限於)聽力病症，例如如本文所述。作為另一實例，藉由將通氣口置於鐙骨足板中且注射通過RWM，本文所揭示之組成物在作用位點以最小稀釋度分散在整個耳 蝸中。所述裝置之開發允許人類中經由外耳道實施外科投與程序。所述裝置可在將一定量之流體輸注至耳蝸之外淋巴中後自耳朵移除。在個體中，裝置可在外科顯微鏡控制下或與內視鏡一起經由外耳道推進。
用於任一本文所揭示方法中之例示性裝置描述於圖81-圖84中。圖81圖解說明用於將流體遞送至內耳之例示性裝置10。裝置10包括滾花手柄12及結合至伸縮式海波管針支架24之遠端手柄黏合劑14 (例如環氧化物，例如樂泰膠水4014)。滾花手柄12 (或手柄部分)可包括滾花特徵及/或凹槽以增強抓握。滾花手柄12 (或手柄部分)可為約5 mm至約15 mm厚或約5 mm至約12 mm厚、或約6 mm至約10 mm厚、 或約6 mm至約9 mm厚、或約7 mm至約8 mm厚。滾花手柄12 (或手柄 部分)可為中空的，使得流體可在使用期間穿過裝置10。裝置10亦可包括滾花手柄12之近端18處之近端手柄黏合劑16、裝置10之遠端20處之具有塞子28 (顯示於圖82中)之針子總成26 (顯示於圖82中)及應變消除 特徵22。應變消除特徵22可由Santoprene材料、Pebax材料、聚胺基甲 酸酯材料、聚矽氧材料、耐綸材料及/或熱塑性彈性體構成。伸縮式海波管針支架24圍繞且支持佈置在其中之彎針38 (顯示於圖82中)。
仍參考圖81，塞子28可由熱塑性材料或塑膠聚合物 (例如UV固化聚合物)以及其他適宜材料構成，且可用於防止彎針38插入耳道中太深(例如，以防止彎針38插入側壁或其他內耳結構中)。裝置10亦可包括錐形部分23，其佈置在滾花手柄12與結合至伸縮式海波管針 支架24之遠端手柄黏合劑14之間。滾花手柄12(或手柄部分)可包括手柄 部分12遠端之錐形部分23。裝置10亦可包括管36，其與裝置10之近端16流體連接且用作連接裝置與上游組件(例如幫浦、注射器及/或在一些實施例中可結合至控制系統及/或電源(未顯示)之上游組件)之流體入口線。在一些實施例中，彎針38(顯示於圖82中)自遠端20延伸穿過伸縮式海波管針支架24、穿過錐形部分23、穿過滾花手柄12並穿過應變消除特徵22且直接與管36流體連接。在其他實施例中，彎針38與滾花手柄之中空內部流體連接(例如經由伸縮式海波管針支架24)，該滾花手柄之中空內部進而在近端16處與管36流體連接。在彎針38不完全延伸穿過裝置10之內部之實施例中，介接組件之間之接觸面積(例如在重疊嵌套舌管42之間)、公差及/或密封劑必須足以防止治療性流體洩露出裝置10(其在相對較低之壓力(例如約1帕斯卡(Pascal)至約50 Pa、或約2 Pa至約20 Pa、或約3 Pa至約10 Pa)下操作)。
圖82圖解說明根據本文所揭示實施例之態樣之彎針子總成26之側視圖。彎針子總成26包括具有彎曲部分32之針38。彎針子總成26亦可包括結合至彎曲部分32之塞子28。彎曲部分32包括裝置10之遠端20處之成角度尖端34，用於刺穿耳膜(例如RWM)。針38、彎曲部分32及成角度頂部34係係中空的，使得流體可從中流過。彎曲部分32之角46 (如圖84中所顯示)可發生變化。塞子28之幾何形狀可為圓柱形、盤形、環形、圓頂形及/或其他適宜形狀。塞子28可模製至彎曲部分32上之位置。舉例而言，塞子28可使用黏合劑或壓縮配合同心地圍繞彎曲部分32定位。黏合劑之實例包括UV固化黏合劑(例如Dymax 203A-CTH-F-T)、彈性體黏合劑、熱固性黏合劑(例如環氧化物或聚胺基甲酸酯)或乳液黏合劑(例如聚乙酸乙烯酯)。塞子28同心地圍繞彎曲部分32配合，使得成角度尖端34以期望插入深度插入耳朵中。彎針38可使用增量成形以及其他適宜技術由直針形成。
圖83圖解說明用於將流體遞送至內耳之例示性裝置10之透視圖。管36之長度可為約1300 mm (圖83中之尺寸11)至約1600 mm、或約1400 mm至約1500 mm、或約1430 mm至約1450 mm。應變釋放特徵22之長度可為約25 mm至約30 mm (圖83中之尺寸15)，或長度為約20 mm至約35 mm。手柄12之長度可為約155.4 mm (圖83中之尺寸13)、或約150 mm至約160 mm、或約140 mm至約170 mm。伸縮式海波管針支架24可具有兩個或更多個嵌套海波管，例如三個嵌套海波管42A、42B及42C，或四個嵌套海波管42A、42B、42C及42D。海波管42A、42B、42C及尖端總成26之總長度(圖83中之尺寸17)可為約25 mm至約45 mm、或約30 mm至約40 mm、或約35 mm。另外，伸縮式海波管針支架24可具有約36 mm、或約25 mm至約45 mm、或約30 mm至約40 mm之長度。三個嵌套海波管42A、42B及42C各自可分別具有3.5 mm、8.0 mm及19.8 mm之長度，加或減約20%。伸縮式海波管針支架24之最內部嵌套海波管(或最狹窄部分)可同心地佈置在針38周圍。
圖84圖解說明根據本文所揭示實施例之態樣結合至裝置10之遠端20之彎針子總成26之透視圖。如圖84中所顯示，彎針子總成26可包括結合至彎曲部分32之針38。在其他實施例中，彎針38可為單針(例如隨後彎曲使得其包括期望角46之直針)。針38可為33號針，或可包括約32至約34號或約31至35號。在較細規格下，必須小心地確保管36不扭結或損壞。針38可附接至手柄12以安全且準確地將針38置於內耳中。如圖84中所顯示，彎針子總成26亦可包括佈置在彎曲部分32周圍之塞子28。圖84亦顯示，彎曲部分32可包括用於刺穿耳膜(例如RWM)之成角度尖端34。塞子28可具有約0.5 mm、或約0.4 mm至約0.6 mm、或約0.3 mm至約0.7 mm之高度48。彎曲部分32可具有約1.45 mm、或約1.35 mm至約1.55 mm、或約1.2 mm至約1.7 mm之長度52。在其他實施例中，彎曲部分32可具有大於2.0 mm之長度，使得塞子28之遠端與成角度尖端34之遠端之間的距離為約0.5 mm至約1.7 mm、或約0.6 mm至約1.5 mm、或約0.7 mm至約1.3 mm、或約0.8 mm至約1.2 mm。圖84顯示，塞子28可具有為圓柱形、盤形及/或圓頂形之幾何形狀。熟習此項技術者應了解，可使用其他幾何形狀。
本揭示案藉由提及以下實驗實例進一步詳細描述。提供此等實例僅出於說明之目的，且除非另有說明，否則不欲構成限制。因此，本揭示案絕不應視為限於以下實例，而應視為涵蓋由於本文提供之教導而變得顯而易見的任何及所有變型。
其他檢定，包括本文實例部分中描述之彼等檢定以及此項技術中已知之彼等檢定，亦可用於評價本揭示案之聽覺多肽核酸及核酸構築體。
在無進一步描述之情況下，相信一般技術者可使用前述描述及以下說明性實例來製備及利用本揭示案之化合物且實踐主張之方法。以下工作實例特別指出本揭示案之各種態樣，且不應視為以任何方式限制本揭示案之其餘部分。實例 實例 1 ：人類耳畸蛋白基因、同源物、異種同源物之表徵。
下文提供耳畸蛋白基因及相應mRNA。實例 2 ：病毒載體之構築
藉由用Xiao等人，J Virol 1999, 73(5):3994-4003所用之無腺病毒之方法轉染產生重組AAV。將具有AAV ITR之順式質體、具有AAV Rep及Cap基因之反式質體以及具有來自腺病毒基因體關鍵區域之輔助質體以1:1:2之比率共轉染至293細胞中。此處使用之AAV載體使用下述構築體，在多種雙重載體策略下表現人類耳畸蛋白或小鼠耳畸蛋白。分別準備AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43及Anc80以封裝三組耳畸蛋白構築體來測試(i)多聯化-反式剪接策略，(ii)雜交內含子-同源重組-反式剪接策略，及(iii)外顯子同源重組策略，如Pryadkina等人，Meth Clin Devel 2015, 2:15009所總結。實例 3 ：選殖 OTOF 組分
如Yasunaga等人，Am J Genet 2000, 67:591-600所述，由人類整個胎兒、成人腦、心臟、腎臟及鼠類胎兒心臟之poly(A)+ mRNA構築Oligo-dT及隨機引子cDNA文庫。使用連接子引子及選自耳畸蛋白cDNA序列之一系列引子對此等文庫進行RACE-PCR實驗。將PCR產物直接選殖至pGEM-T Easy載體中且測序。為分離人類cDNA長形式(7 kb)，自編碼耳畸蛋白之最初報告短形式之aa 63-70的序列(Yasunaga等人，1999) (GenBank 107403)設計反向引子(5'-TTCACCTGGGCCCGCA-GCATCCT-3' (SEQ ID NO: 29))。
使用Strenzke等人，EMBO J. 35(23):2519-2535, 2016中描述之方法自小鼠耳蝸提取總RNA。根據GeneAmp RNA PCR套組，在各種鼠類及人類RNA來源中進行RT-PCR實驗。使用兩個引子對來重構來源於腦及耳蝸之鼠類cDNA，一者來自外顯子1 5'-UTR (5'-AGGCGTGTGAGCCACACTCCACCA-3' (SEQ ID NO: 30))及外顯子22 (5'-CATAACCTCAGCTTGTCCCGAACA-3' (SEQ ID NO: 31))，且另一者來自外顯子18-19接合(5'-GGCCCCAGATCACGGACAGGAAC-3' (SEQ ID NO: 32))及外顯子48 3'-UTR (5'-GGCCAGTACACCTGATTCACACT-3' (SEQ ID NO: 33))。為重構人類腦cDNA長形式之完整5'部分，使用來源於5'-UTR外顯子1 (5'-GGAGGAGGCAGCGGCAGAGAAGA-3' (SEQ ID NO: 34))及外顯子22 (5'-TTCACCTGGGCCCGCAGCATCCT-3' (SEQ ID NO: 35))之引子。
對於多聯化-反式剪接策略，構成兩個盒，使得5'盒包括合成毛細胞定向啟動子、嵌合內含子(β-球蛋白)、共有Kozak序列、耳畸蛋白之外顯子1至26及耳畸蛋白之內含子26的一半(表示3,836 bp，或耳畸蛋白cDNA之3,494 bp，其對應於外顯子1至26加上內含子26之前342 bp)，且3'盒包括內含子26之後半部分(342 bp)、耳畸蛋白之外顯子27至48 (3,843 bp)及聚腺苷酸化訊號序列。在一些實例中，在聽覺內毛細胞中表現耳畸蛋白之蛋白無需毛細胞定向啟動子。對於內含子-同源重組-剪接策略，對來自上述多聯化-剪接策略之盒進行修飾，使得在兩個質體中內含子26一半之位置處添加耳畸蛋白之全長內含子26。
對於外顯子同源重組策略，構成兩個盒，使得5'盒包括毛細胞定向啟動子、嵌合內含子、共有Kozak序列及外顯子1至28 (耳畸蛋白cDNA之前3,776 bp)，且3'盒包括外顯子23至48(耳畸蛋白cDNA之最後4,446 bp)及聚腺苷酸化訊號序列。兩個盒之間的同源區域為885 bp。實例 4 ：產生及純化病毒粒子
使用三重轉染方案產生重組AAV-1，且藉由兩個依序氯化銫(CsCl)密度梯度純化，如Pryadkina等人，Mol Ther 2015, 2:15009所述。在第二次離心結束時，自CsCl密度梯度管回收11份500 μl級分，且藉由在1x PBS中透析來純化。藉由點印跡分析級分，以確定含有rAAV基因體之級分。使用對應於AAV載體基因體之ITR區的引子及探針，藉由基於定量即時PCR之滴定法確定每種製劑之病毒基因體數(vg)(Bartoli等人，Gene Ther 2006, 13:20-28)。實例 5 ：病毒粒子之調配
以3.2e13、1.0e13、3.2e12、1.0e12 vg/mL之稀釋度在人工外淋巴中製備在1e14 vg/mL之力價下產生之AAV。藉由組合以下試劑(以mM計)製備人工外淋巴：NaCl，120；KCl，3.5；CaCl2 ，1.5；葡萄糖，5.5；HEPES，20。用NaOH滴定人工外淋巴以將其pH值調節至7.5(總Na+ 濃度為130 mM)(Chen等人，J Controlled Rel 2005, 110:1-19)。實例 6 ： OTOF mRNA 及蛋白產生之活體外展現 ( 抗 OTOF 抗體 )
為證實AAV-OTOF載體能夠活體外 成功轉導哺乳動物細胞，將人類視網膜上皮細胞及新生小鼠耳蝸外植體與力價為3.2e13、1.0e13、3.2e12、1.0e12個含病毒基因體粒子(vg/mL)之AAV-OTOF一起培育，且如前述(Duncker等人，2013J Neurosci 33(22):9508-9519)檢定耳畸蛋白DNA、mRNA及蛋白之水準。自Abcam獲得針對小鼠耳畸蛋白之抗體，且如Engel等人，2006Neurosci 143:837-849所述使用。實例 7 ： 例示性 裝置描述
使用特化微導管將AAV-OTOF調配物遞送至耳蝸，該微導管經設計以持續且安全地穿透RWM。微導管經成形以使得執行遞送程序之外科醫生可經由外耳道進入中耳腔且使微導管之末端與RWM接觸。微導管之遠端包含至少一個直徑為10至1000微米之微針，該微針在RWM中產生穿孔，該等穿孔足以使AAV-OTOF以約1 μL/min之速度進入鼓階之耳蝸外淋巴，但無需外科修復即可癒合。微導管中接近微針之其餘部分，以約1e13 vg/mL之力價裝載AAV-OTOF/人工外淋巴調配物。微導管之近端與微操縱器連接，該微操縱器允許進行約1 TL/min之精確小體積輸注。實例 8 ：動物模型 1 ：老年小鼠
在三隻OTOF敲除小鼠模型中評定藉由耳蝸遞送AAV-OTOF進行之耳畸蛋白拯救(小鼠模型如Longo-Guess等人，Hearing Res 2007, 234(1-2):21-28；Roux等人，Cell 2006, 127:277-289；及Reisinger等人，J. Neurosci. 31(13):4886-4895, 2011中所述)。在新生(P1)、幼年(P6或P12)及成年(P42)小鼠中測試拯救實驗，以評價相對於耳蝸發育之出生後治療窗。
在幼年及成年小鼠(n = 32)中雙側量測基線聽覺腦幹反應(ABR)及畸變產物光聲發射(DPOAE)，以評定處理前內毛細胞(IHC)及外毛細胞(OHC)功能。預期所有動物均展現耳畸蛋白功能障礙之特徵性聽力測定特徵-亦即，在測試之聲音頻率中ABR異常，但DPOAE正常，此指示IHC訊號轉導功能異常及OHC功能正常(Yasunaga等人，2000,Am J Hum Genet 67:591-600)。
進行基線ABR及DPOAE量測後，如下所述將0.3 uL力價為1.0e13、3.2e12及1.0e12 vg/mL之AAV1-OTOF注射至幼年及成年小鼠(n = 32)之左鼓階中。將等效力價注射在新生小鼠之左鼓階中，但量為0.2 uL (n = 16)(下述外科程序)。將各動物之右耳留作未處理對照。外科程序後1、5及10天，再次在幼年及成年動物中兩側獲取ABR及和DPOAE量測值。在程序後4週(n = 24)及12週(n = 24)，自新生、幼年及成年組中之所有動物(總共n = 48)獲取額外雙側ABR及DPOAE量測值，隨後將該等動物處死且移出其耳蝸。
在經處死動物中之一半(來自處理後第4週及第12週組中之每一者，n = 4)中，進行免疫染色以鑑別毛細胞結構且評定沿耳蝸感覺上皮之OTOF蛋白表現。如先前所述使用針對毛細胞之標記物(Myo7a)、支持細胞之標記物(Sox2)及耳畸蛋白的抗體(Duncker等人，2013,J Neurosci 33(22):9508-9519)。在柯蒂氏器之基端、中端及頂端，在200 um區域內計數毛細胞及表現OTOF之彼等毛細胞之總數；將柯蒂氏器之完整長度分為等長之三片，稱為基區、中區及頂區。
在經處死動物中之其餘一半(來自處理後第4週及第12週組中之每一者的其餘4隻動物)中，如上所述自相同基區、中區及頂區收集耳蝸組織樣品，且如前述檢定耳畸蛋白mRNA轉錄本(Duncker等人，2013,J Neurosci 33(22):9508-9519；Heidrych等人，2008,Hum Mol Genet 17:3814-3821；Heidrych等人，2009,Hum Mol Genet 18:2779-2790)。實例 9 ：動物模型 1A ：老年小鼠中之外科方法
如Shu等人，2016 (Shu Yilai, Tao Yong, Wang Zhengmin, Tang Yong, Li Huawei, Dai Pu, Gao Guanping及Chen Zheng-Yi. Human Gene Therapy. 2016年6月, 印刷前 doi:10.1089/hum. 2016.053)所述，向小鼠之鼓階投與在人工外淋巴中製備之AAV-OTOF。使用腹膜內注射賽拉嗪(xylazine)(20 mg/kg)及氯胺酮(100 mg/kg)麻醉六週齡雄性小鼠。使用電熱墊使體溫維持在37℃下。自右耳後區產生切口，且暴露鼓泡。用外科針將鼓泡穿孔，且將小孔擴大以提供通向耳蝸之通道。用牙鑽使鼓階之耳蝸側壁之骨變薄，以使膜側壁保持完整。使用奈升微量注射系統以及玻璃微量移液器以2 nL/秒之速率將總共約300 nL含AAV-OTOF之人工外淋巴遞送至鼓階。將玻璃微量移液器在注射後保留在原位5分鐘。耳蝸造口術及注射後，用牙科膠合劑密封鼓泡之開口，且縫合肌肉及皮膚。使小鼠自麻醉中蘇醒，且用0.15 mg/kg鹽酸丁基原啡因(buprenorphine hydrochloride)控制其疼痛3天。實例 10 ：動物模型 2 ：豚鼠中之往復式微型泵 外科程序
向豚鼠投與在人工外淋巴中製備之AAV-OTOF，以評定用如Tandon等人，Lab Chip 2015 (DOI: 10.1039/c5lc01396h)所述之往復式微型泵耳蝸內遞送後之分佈及毒性。用戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium)(Nembutal；25 mg kg-1，腹膜內注射)、芬太尼(fentanyl)(0.2 mg kg-1，肌內)及氟哌啶醇(haloperidol)(10 mg kg-1，肌內)之組合麻醉每隻重約350 g之雄性豚鼠(n = 16)。在切口位點皮下給與利多卡因(Lidocaine)及腎上腺素作為局部麻醉劑。使用背側入路，在鼓泡內產生5 mm直徑之孔，且在距圓窗膜約0.5 mm遠處進行耳蝸造口術。將微型泵之套管(如下所述)插入耳蝸造口中，頂端插入耳蝸3 mm，且用常用之氰基丙烯酸酯膠膠黏至鼓泡。為進行複合動作電位(CAP)量測，將全氟烷氧基-烷烴絕緣之銀絲電極(無塗層直徑為203 μm)插入圓窗口附近且膠黏至鼓泡。
如先前在Tandon等人，Biomed Microdevices 2015, 17:3-21中所述，進行用於量測畸變產物光聲發射(DPOAE)及CAP之程序。在耳蝸造口術之前及之後，以32、24、16、12、8、5.6、4及2.78 kHz之特徵頻率量測DPOAE，以監測因外科手術發生之任何損傷。微型泵描述
使用如Tandon等人，Lab Chip 2015 (DOI: 10.1039/c5lc01396h)所述之微型泵向豚鼠投與最大力價為1e14 vg/mL之AAV-OTOF。微型泵系統具有4個可選端口。此等端口連接於：(i)用於人工外淋巴儲存之大型射流容流器；(ii)連接於耳蝸之出口；(iii)整合式AAV-OTOF儲器之出口；(iv)整合式AAV-OTOF儲器之入口。各端口射流連接於中央泵室，且各自用閥個別定址。往復式AAV-OTOF遞送事件之順序如下：(i)運行內部AAV-OTOF更新迴路，將AAV-OTOF自AAV-OTOF儲器轉移至主輸注-撤出管線中；(ii)將AAV-OTOF輸注至耳蝸中，且自人工外淋巴儲存容流器排出一些人工外淋巴；(iii)前兩個步驟可重複數次以獲得額外劑量；(iv)在允許AAV-OTOF擴散一定時間後，自耳蝸撤出與步驟(i)-(iii)中輸注之量相等的量的外淋巴，再填充人工外淋巴儲存容流器。該製程達成藥物淨遞送，而向耳蝸中添加之淨流體體積為零。
微型泵中之射流容流器為圓柱形室，其頂板為薄(25.4 μm)可撓性聚醯亞胺膜。泵室之直徑為3.5 mm，射流儲存容流器之直徑為14 mm，且其餘所有容流器之直徑均為4 mm。將相同膜偏轉以阻斷各閥門處之流動。閥室之直徑為3.1 mm。包含藥物儲器之蛇形通道的方形截面寬度為762 μm，且長度為410 mm，總體積為238 μL。泵中所有其他微通道之寬度為400 μm，且高度為254 μm。豚鼠中之急性藥物遞送
向微型泵裝載AAV-OTOF及人工外淋巴，且將套管插入耳蝸區中特徵頻率敏感度為24及32 kHz之位置之間產生的耳蝸造口中，且頂端插入3 mm，終止於12-16 kHz區。在開始AAV-OTOF/人工外淋巴輸注之前，進行基線DPOAE及CAP聽力測試。隨後啟動泵，每5分鐘輸注約1 μL人工外淋巴，直至將總共約10 μL人工外淋巴遞送至耳蝸。等待20 min之時間後，自耳蝸撤出約10 μL外淋巴。隨後以每5 min約1 μL之速率開始AAV-OTOF遞送，直至總共遞送約10 μL流體。
在處理後1週、1個月、3個月及6個月處死動物(每組n ＝ 4)，且提取其耳蝸。經由用抗OTOF抗體進行免疫染色來評定沿柯蒂氏器之AAV轉導及OTOF表現之程度。使用針對毛細胞之標記物(Myo7a)及支持細胞之標記物(Sox2)的抗體來定量IHC、OHC、支持細胞及靜纖毛形態。使用Annexin V染色來評定沿耳蝸感覺上皮之細胞中凋亡的證據。實例 11 ：動物模型 3 ：綿羊中之大型動物 Tox
向幼羊投與在人工外淋巴中製備之AAV-OTOF以評定經由反式RWM輸注遞送至耳蝸後之分佈及毒性。在3月齡雌性綿羊(n = 40)中雙側量測基線聽覺腦幹反應(ABR)及畸變產物光聲發射(DPOAE)，以評定處理前內毛細胞(IHC)及外毛細胞(OHC)功能。進行基線ABR及DPOAE量測後，將20 uL力價為1.0e14、3.2e13、1.0e13及3.2e12 vg/mL之AAV1-OTOF注射至綿羊(每組n = 10)之左鼓階中。將各動物之右耳留作未處理對照。外科程序後1、5及10天，再次兩側獲取ABR及和DPOAE量測值。在程序後6個月，自所有動物獲取額外雙側ABR及DPOAE量測值，隨後將該等動物處死且移出其耳蝸。
在經處死動物中之一半(來自劑量組中之每一者，n = 5)中，進行免疫染色以鑑別毛細胞結構且評定沿耳蝸感覺上皮之OTOF蛋白表現。如先前所述使用針對毛細胞之標記物(Myo7a)、支持細胞之標記物(Sox2)及耳畸蛋白的抗體(Duncker等人，2013,J Neurosci 33(22):9508-9519)。在柯蒂氏器之基端、中端及頂端，在200 um區域內計數毛細胞及表現OTOF之彼等毛細胞之總數。
在經處死動物中之其餘一半(來自各劑量組之其餘5隻動物)中，如上所述自相同基區、中區及頂區收集耳蝸組織樣品，且如前述檢定耳畸蛋白mRNA轉錄本(Duncker等人，2013,J Neurosci 33(22):9508-9519；Heidrych等人，2008,Hum Mol Genet 17:3814-3821；Heidrych等人，2009,Hum Mol Genet 18:2779-2790)。實例 12 ：動物模型 3A ： CRISPR 產生之轉殖基因大型動物模型 ( 綿羊 ) 共表現 Cas9 及 sgRNA 之質體的產生
用BsbI消化pX330-U6-嵌合_BB-CBh-hSpCas9質體(Addgene質體＃42230)，使用熱敏磷酸酶(Antartic Phosphatase)去磷酸，且對線性化載體進行凝膠純化。為產生表現Cas9及針對OTOF之sgRNA的雙順反子載體(pX330-cas9-OTOF)，將用於靶向耳畸蛋白外顯子1之寡核苷酸對退火，磷酸化且連接於線性化載體(Cong等人，2013Science 339(6121):819-23)。細胞中之基因體編輯檢定
將A15星形膠質綿羊細胞株(Vilette等人，2000In Vitro Cell Dev Biol Anim 36(1):45-9)維持在含10%胎牛血清、2 mM麩醯胺酸、1%丙酮酸鈉及1%青黴素/鏈黴素之DMEM中。在24孔板中使用lipofectamine LTX試劑用2 µg共表現Cas9及針對耳畸蛋白之sgRNA的pX330-cas9-OTOF轉染細胞。三天後，自轉染細胞提取基因體DNA，且使用NanoDrop2000分光光度計，量測A260/A280 及 A260/A230 比率以說明樣品純度 來定量。
使用T7EI錯配偵測檢定定量OTOF外顯子1之標靶基因座處sgRNA序列之基因突變活性。使用特異性引子，用高保真聚合酶(Herculase II融合聚合酶)對目的DNA序列進行PCR擴增。隨後將所得PCR產物變性，且緩慢再退火(95℃，2 min；95℃至85˚℃，-2℃/sec；85℃至25℃，-1℃/sec)，產生同雙鏈/異雙鏈混合物。隨後在37℃下用5U T7EI限制酶將其消化30分鐘。藉由2%瓊脂糖凝膠電泳分離消化產物。使用Image J軟體如前述(Menoret等人，2011Advanced protocols for Animal Transgenesis .An ISTT Manual . Heidelberg: Springer. 第117-36頁)使用裂解產物與未裂解產物之比率計算NHEJ頻率。NHEJ頻率之計算方式為：基因修飾% =100 x (1-(1-裂解分率)^(1/2)。sgRNA 及 Cas9 mRNA 之產生
如前述(Bellec等人，2015, Current Gene Ther)，藉由PCR擴增pX330-cas9-OTOF質體將T7啟動子添加至sgRNA模板中。使用NucleoSpin Gel及PCR Clean-up純化PCR產物。將其用作根據製造商之手冊使用MEGAshortscript T7套組進行活體外轉錄之模板。轉錄完成後，進行DNase I處理。
根據製造商之手冊，使用PmeI消化之Cas9表現JDS246質體(Addgene質體＃43861)及mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA轉錄套組轉錄Cas9 mRNA。轉錄完成後，進行poly(A)加尾反應及DNase I處理。使用MEGAclear套組純化Cas9 mRNA及sgRNA兩者，且在溶離緩衝液中溶離。胚胎之活體外產生
根據前述常規程序(Crispo等人，2014Transgenic Res , 24(1):31-41)，藉由活體外 受精產生胚胎。簡言之，將來自屠宰場之卵巢轉運至實驗室，且在回收培養基中吸出卵丘卵母細胞複合物(COC)。將所選COC置於39℃下濕潤空氣中5% CO2中之成熟培養基中24 h。隨後，將擴增之COC在100 μl具有1 x 106劑量之凍融精液的液滴中授精，該精液藉由在上游方法中上行遷移選擇。在39℃下在濕潤氛圍下在5% CO2中進行受精歷時22 h。顯微注射至受精卵中
受精後不久，將572個推定受精卵隨機分配至三個實驗組以進行顯微注射(CRISPR組，n = 200；及緩衝液組，n = 200)或不進行微注射(對照組，n = 200)。將CRISPR組與在注射緩衝液(10 mM Tris pH 7.5，0.1 mM EDTA)中稀釋之5 ng/μl sgRNA及20 ng/μl Cas9 mRNA一起顯微注射至細胞質中，而用相同程序注射緩衝液組，但僅用緩衝液。最後，將注射及未注射之胚胎在39℃下在濕潤氛圍下在5% CO2，5% O2及90% N2中轉移至礦物油下之培養基中。記錄所有實驗組第2天之裂解率(裂解受精卵/總卵母細胞)及第6天之發育率(桑椹胚及囊胚/總卵母細胞)。第6天後，藉由Sanger測序分析來自20個CRISPR組胚胎之DNA，以偵測OTOF基因水準下之突變。
為確定系統之活體內 效率，將CRISPR/Cas9受精卵顯微注射產生之53個囊胚轉移至29隻雌性接受者。受精後第6天，僅轉移分類為優良或良好(亦即，Stringfellow等人，2010,Manual of the International Embryo Transfer Society 中定義之1級)之早期囊胚、囊胚及擴張囊胚。藉由腹腔鏡術輔助之微創手術進行胚胎轉移以將胚胎置於黃體之同側子宮角的顱側。如Menchaca等人，2004,Reprod Fertil Dev. 16(4):403-413所述，事先如前述使用標準方案使母羊接受者同步至動情週期之第6天以控制排卵。胎羊及羔羊之監測
藉由使用配備有5及3.5 MHz探頭之B型超音波檢查術，分別在第30天及第105天進行妊娠診斷及胎兒發育檢查。將實驗第0天定義為胚胎受精之時刻。量測數個參數以研究妊娠第105天胎羊之發育：胸徑、雙頂徑、枕鼻長度及心率。分娩時，記錄妊娠長度、性別、直腸溫度、心率及呼吸速率、體重、胸圍、雙頂徑、冠臀及枕鼻長度、體高、臀高、臀寬及胸寬。在出生時以及15、30及60天後確定體重及形態計量變數。轉殖基因動物之鑑別及基因分型
出生後七天，自羔羊皮膚及肢體肌肉獲取樣品，且進行T7EI檢定、western墨點測試及組織學檢查，以鑑別及表徵KO首建羊及脫靶位點。自所有動物之皮膚活檢及一些動物之肌肉分離出總DNA。使用毛細管電泳法分析樣品。OTOF外顯子1之基因分型藉由對PCR擴增子進行直接測序來進行，且在肌肉活檢中藉由對具有個別擴增子序列之經分離細菌純系進行額外測序進行。耳畸蛋白表現之分析
進行Western印跡以確定肌肉纖維中肌生長抑制素之存在。使等量總蛋白在12% (v/v)凝膠電泳上運行，且電泳轉移至PVDF膜上。將單株小鼠抗耳畸蛋白抗體用於western印跡。將經洗滌膜與1:50000稀釋之連接於辣根過氧化物酶(HPR)之二級抗體一起培育。使用 western墨點化學發光偵測HPR活性。轉殖基因綿羊模型中之 AAV-OTOF 拯救療法
向OTOF敲除之轉殖基因綿羊投與在人工外淋巴中製備之AAV-OTOF以評定經由反式RWM輸注遞送至耳蝸後恢復正常聽力功能之能力。在3月齡雌性綿羊(n = 30)中雙側量測基線聽覺腦幹反應(ABR)及畸變產物光聲發射(DPOAE)，以評定處理前內毛細胞(IHC)及外毛細胞(OHC)功能。進行基線ABR及DPOAE量測後，將20 uL力價為1.0e14、3.2e13及1.0e13 vg/mL之AAV1-OTOF注射至綿羊(每組n = 10)之左鼓階中。將各動物之右耳留作未處理對照。外科程序後1、5及10天，再次兩側獲取ABR及和DPOAE量測值。在程序後6個月，自所有動物獲取額外雙側ABR及DPOAE量測值，隨後將該等動物處死且移出其耳蝸。
在經處死動物中之一半(來自劑量組中之每一者，n = 5)中，進行免疫染色以鑑別毛細胞結構且評定沿耳蝸感覺上皮之OTOF蛋白表現。如先前所述使用針對毛細胞之標記物(Myo7a)、支持細胞之標記物(Sox2)及耳畸蛋白的抗體(Duncker等人，2013,J Neurosci 33(22):9508-9519)。在柯蒂氏器之基端、中端及頂端，在200 um區域內計數毛細胞及表現OTOF之彼等毛細胞之總數。
在經處死動物中之其餘一半(來自各劑量組之其餘5隻動物)中，如上所述自相同基區、中區及頂區收集耳蝸組織樣品，且如前述檢定耳畸蛋白mRNA轉錄本(Duncker等人，2013,J Neurosci 33(22):9508-9519；Heidrych等人，2008,Hum Mol Genet 17:3814-3821；Heidrych等人，2009,Hum Mol Genet 18:2779-2790)。實例 13 ：人類臨床實例 ( 兒童治療 )
將個體全身麻醉。外科醫生自外耳道接近鼓膜，在外耳道之下邊緣與鼓膜相遇處產生小切口，且將鼓膜抬為瓣狀以暴露中耳空間。使用外科雷射在鐙骨底板中產生小開口(約2 mm)。隨後，外科醫生用微導管穿透圓窗膜，該微導管裝載有在人工外淋巴中製備之AAV-OTOF溶液，滴定量為1e13 vg/mL。將微導管連接於微操縱器，該微操縱器以約1 uL/min之速率輸注約20 uL AAV-OTOF溶液。在完成AAV-OTOF輸注後，外科醫生撤出微導管，且用凝膠泡沫貼片修補鐙骨底板及RWM中之孔。該程序以更換鼓膜瓣結束。實例 14 ：母體血液之非侵入性產前測試以偵測 OTOF 突變
將母體血液樣品(20-40 mL)收集至無細胞DNA管中。藉由2,000 g離心20分鐘，隨後3,220 g離心30分鐘之雙重離心方案，自各樣品分離至少7 mL血漿，其中在第一次旋轉後轉移上清液。使用QIAGEN QIAmp循環核酸套組自7-20 mL血漿分離cfDNA，且在45 µL TE緩衝液中溶離。自第一次離心後獲得之膚色血球層分離純母體基因體DNA。
藉由組合用於選擇具有最小化之探針-探針相互作用可能性之探針的檢定的熱力學模型化與前述擴增方法(Stiller等人. 2009Genome Res 19(10):1843-1848)，可達成11,000個檢定之多重化。使用11,000個標靶特異性檢定將母體cfDNA及母體基因體DNA樣品預擴增15個循環，且使用嵌套引子將等分試樣轉移至具有15個循環之第二PCR反應中。藉由在第三輪12個循環之PCR中添加條形碼標籤來製備測序用樣品。標靶包括對應於已知引起耳畸蛋白功能喪失之染色體2中100個突變的SNP (Zhang等人. 2016Clin Genetics 1月27日)。隨後使用Illumina HiSeq測序儀對擴增子進行測序。使用市售軟體進行基因體序列比對。實例 15 ：替代性實例 (mRNA 、單一病毒載體、非病毒載體 ) 單一病毒載體製備
缺失N末端域之小鼠耳畸蛋白可拯救耳畸蛋白敲除斑馬魚中之敲除表型(Chatterjee等人，Mol Cell Biol 2015, 35(6):1043-1054)。然而，在哺乳動物中，C2B及C2C域中之錯義突變與聽力損失有關(Longo-Guess等人，2007Hear Res , 234:21-28；Mirghomizadeh等人，2002Neurobiol Dis 10:157-164)，表明此等域對於高等物種之耳畸蛋白的正常聽力相關功能至關重要。在酸性脂質不存在下，哺乳動物耳畸蛋白之C2A域不結合Ca2+ ，而所有其他C2域以中等(20-50 μM)或低(400-700 μM)親和力結合Ca2+ 。C2D及C2E域以Ca2+ 依賴性方式結合Ca2+ 以及磷脂醯絲胺酸(PS)。所產生之cDNA編碼缺失C2A、C2D及C2E域之耳畸蛋白之截短形式。該cDNA適合包裝在AAV載體中。
如Padmanarayana等人，2014Biochem 53:5023-5033所述，自編碼完整OTOF基因之原始野生型耳畸蛋白質體產生且選殖截短之耳畸蛋白構築體(OTOF∆C2ADE)。藉由使用跨域寡核苷酸之PCR突變誘發及應用雙重突變誘發引子方法之QuikChange定點突變誘發套組進行C2域編碼區之缺失。簡言之，PCR如下進行：95℃持續3分鐘；在95℃下18個循環持續15秒，65℃下持續1分鐘，且68℃持續12分鐘；且68℃持續7分鐘。將PCR產物用DpnI消化，選殖至DSC-B載體中，且在DH5α或XL10-金細菌細胞中轉型。藉由小量製備分離質體DNA，隨後測序。
將含有CBA啟動子、嵌合內含子(β-球蛋白)、共有Kozak序列、OTOF∆C2ADE cDNA及聚腺苷酸化訊號序列之質體用於AAV構築體。藉由用Xiao等人，J Virol 1999, 73(5):3994-4003所用之無腺病毒之方法轉染產生重組AAV。將具有AAV ITR之順式質體、具有AAV Rep及Cap基因之反式質體以及具有來自腺病毒基因體關鍵區域之輔助質體以1:1:2之比率共轉染至293細胞中。分別製備AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43及Anc80來封裝OTOF∆C2ADE cDNA構築體。CELiD 製備
如Li等人. 2013,PLoS ONE 8(8):e69879所述製備耳畸蛋白基因以用於非病毒基因轉移。首先，使草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) Sf9細胞以懸浮形式在無血清培養基中生長。使用以下引子對自pIB/V5-His/CAT PCR擴增殺稻瘟菌素-S脫胺酶(blasticidin-S deaminase；bs)基因： 5'-ATAAGCTTACGCTCAGTGGAACGAAAAC-3' (SEQ ID NO: 36)及 5'-ATAAGCTTGACGTGTCAGTGTCAGTCCTGCTCCT-3' (SEQ ID NO: 37)。
用HindIII消化865 bp PCR產物，且連接於HindIII消化之pFBGR中。使用Cellfectin轉染試劑用pFBGR-bsd轉染Sf9細胞。轉染後三天，藉由向生長培養基中添加殺稻瘟菌素-S HCl (50 µg/mL)來選擇抗生素抗性細胞。在選擇性培養基中兩週後，藉由單細胞稀釋或直接菌落轉移技術獲得殺稻瘟菌素抗性(bsdr )純系。使bsdr 純系在添加有10% FBS及殺稻瘟菌素-S HCl (10 µg/mL)之昆蟲細胞培養基中再擴增2至3代，隨後返回含10 µg/mL殺稻瘟菌素-S HCl之無血清培養基中。再傳12代後，自培養基去除殺稻瘟菌素-S HCl，且擴增細胞株以進行分析。為進行功能篩選，用表現AAV 2型Rep78及Rep52蛋白之重組桿狀病毒Bac-Rep感染(MOI = 5)純系Sf9/ITR-OTOF細胞株，並分析誘導之OTOF表現。
擴增具有最高OTOF表現水準之純系Sf9/ITR-OTOF細胞以用於CELiD-OTOF DNA製備。
以2e6個細胞/mL接種純系Sf9/ITR-OTOF細胞，且用Bac-Rep感染(MOI = 1至3)。每天監測細胞活力及直徑，直至細胞直徑增加至18-20 µm (未感染細胞直徑14-15 µm)，指示該等細胞處於病毒感染之後期。使用市售質體分離套組自感染Bac-Rep之Sf9/ITR-GFP細胞提取染色體外DNA。藉由瓊脂糖凝膠電泳及染色體外DNA之溴化乙錠染色來監測CELiD產生。藉由用兩種單獨桿狀病毒表現載體(BEV)：Bac-Rep及帶有側接有ITR之轉殖基因之BEV諸如Bac-OTOF)共感染，在親代Sf9細胞中產生CELiD DNA。平均細胞直徑增加4-5 µm，且活力百分比降至80-90%後，即收穫經感染Sf9細胞。使用市售質體純化套組分離CELiD DNA。
用各種量之Bac-Rep原種接種純系Sf9/ITR-OTOF細胞。定期收穫細胞且使用市售DNA分離套組回收染色體外DNA。藉由瓊脂糖凝膠電泳或藉由用OTOF特異性引子對進行PCR來檢查所提取DNA，以定量確定CELiD DNA量。為進行western印跡，藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳將細胞蛋白分級分離，且轉移至硝酸纖維素膜上。使膜在環境溫度下在軌道式攪拌下在阻斷緩衝液(BB)中培育1 hr，該阻斷緩衝液包含含5%脫脂奶粉(w:v)之磷酸鹽緩衝鹽水加0.05% Tween-20 (PBST)。用包含含3%脫脂奶粉之PBST的洗滌緩衝液(WB)洗滌膜後，將膜與適當一級抗體溶液(用BB稀釋)在環境溫度(1 hr)或4℃(隔夜)下在連續軌道式攪拌下培育。使用以下一級抗體及稀釋率：抗AAV Rep小鼠單株抗體(mAb)；2.抗桿狀病毒包膜糖蛋白gp64小鼠mAb；抗OTOF小鼠mAb。培育後，移除一級抗體溶液，且用WB洗滌膜(3 x 5 min)。將非結合mAb與二級抗體溶液(山羊抗小鼠辣根過氧化物酶(HRP)結合物)培育1 hr，隨後如上用WB洗滌。藉由增強之化學發光(ECL)偵測HRP活性。脂質奈米粒子
藉由前述雙乳液溶劑蒸發法(O'Donnell及McGinity 1997Adv Drug Delivery Rev 28(1):25-42)，將耳畸蛋白cDNA或mRNA封裝在聚(乳酸-共-乙醇酸)奈米粒子中，及封裝在脂質奈米粒子中(Pezzoli等人，2013Methods Mol Biol 1025:269-279)。簡言之，可使用Precirol ATO-5及硬脂胺作為陽離子脂質，自微乳液產生固體脂質奈米粒子。將500 mg Precirol ATO-5加熱至高於其熔點10℃，且添加10 mL不同比例之泊洛沙姆及硬脂胺(1/1.25；1/1.87；1/3.12；1/4.37及1/5)之熱水溶液。將樣品在14,000 rpm下攪拌30分鐘。藉由將熱微乳液以1:5之乳液:水比率分散在冷水(2-5℃)中產生奈米粒子。為回收奈米粒子，將所得懸浮液在20℃之溫度下在3,000 rpm下離心20分鐘三次，在離心後將沈澱物重構。藉由以1:2 (SLN:甘露糖醇)比率添加冷凍保護劑(5%甘露糖醇)之水溶液來凍乾陽離子固體脂質奈米粒子。將冷凍乾燥機中之冷凍溫度設定為-40℃，且將樣品在此溫度下保持2小時。隨後在0.2-0.4 mBa之壓力下將凍乾溫度設定為25℃ 48小時。製備OTOF cDNA質體之溶液，使濃度為2 μg/μL。隨後將25 µL質體DNA溶液之等分試樣添加至不同體積之陽離子SLN懸浮液中，藉由攪拌獲得15:1至1:1 (SLN:OTOF)之比率。經修飾 RNA
根據本揭示案使用之多核苷酸，一級構築體mRNA(或經修飾mRNA或「mmRNA」)可根據任何可用技術製備，包括(但不限於)化學合成、酶法合成(其通常稱為活體外轉錄(IVT))或較長前驅物之酶法或化學裂解等。合成RNA之方法為此項技術中所已知(參見例如，Gait, M. J. (編) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, D.C.: IRL Press, 1984；及Herdewijn, P. (編) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, 第288卷 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005；兩者均以引用之方式併入本文中)。
本揭示案一級構築體之設計及合成製程通常包括基因構築、mRNA產生(具有或不具有修飾)及純化之步驟。在酶法合成方法中，首先選擇編碼目的多肽之標靶多核苷酸序列以併入載體中，將其擴增產生cDNA模板。視情況，可對標靶多核苷酸序列及/或任何側接序列進行密碼子最佳化。隨後使用cDNA模板以經由活體外轉錄(IVT)產生mRNA。產生後，mRNA可進行純化及淨化製程。下文更詳細地提供其步驟。基因構築
基因構築之步驟可包括(但不限於)基因合成、載體擴增、質體純化、質體線性化及淨化以及cDNA模板合成及淨化。基因合成
選擇目的多肽或標靶用於產生後，設計一級構築體。在初級構築體中，可使用所選核酸(DNA或RNA)轉錄本之開放閱讀框(ORF)構築編碼目的多肽之連接核苷的第一區域。ORF可包含野生型ORF、其同功型、變體或片段。如本文所用，「開放閱讀框」或「ORF」指編碼目的多肽之核酸序列(DNA或RNA)。ORF通常以起始密碼子ATG開始，且以無義或終止密碼子或訊號結束。此外，可對第一區域之核苷酸序列進行密碼子最佳化。密碼子最佳化方法為此項技術中所已知，且可用於努力達成數個目標中之一或多者。此等目標包括匹配標靶生物及宿主生物中之密碼子頻率以確保正確折疊，偏好GC含量以增加mRNA穩定性或減少二級結構，最小化可損害基因構築或表現之串聯重複密碼子或鹼基運行，定製轉錄及轉譯控制區，插入或移除蛋白質運輸序列，移除/添加編碼蛋白中之轉譯後修飾位點(例如，糖基化位點)，添加、移除或改組蛋白質域，插入或刪除限制位點，修飾核糖體結合位點及mRNA降解位點，調節轉譯率以使蛋白質之各種域正確折疊，或減少或消除mRNA中有問題之二級結構。密碼子最佳化工具、算法及服務為此項技術中所已知。非限制性實例包括來自GeneArt (Life Technologies)及DNA2.0 (Menlo Park Calif.)之服務及/或專有方法。在一個實施例中，使用最佳化算法來最佳化ORF序列。每種胺基酸之密碼子選擇為此項技術中所已知。終止密碼子
在一個實施例中，本揭示案之一級構築體可在3'非轉譯區(UTR)之前包括至少兩個終止密碼子。終止密碼子可選自TGA、TAA及TAG。在一個實施例中，本揭示案之一級構築體包括終止密碼子TGA及另一終止密碼子。在另一實施例中，另一終止密碼子可為TAA。在另一實施例中，本揭示案之一級構築體包括三個終止密碼子。載體擴增
隨後使用此項技術中已知之方法，諸如但不限於，使用PURELINK.TM.HiPure Maxiprep套組(Carlsbad, Calif.)之maxi prep，擴增含有初級構築體之載體，且分離且純化質體。質體線性化
隨後可使用此項技術中已知之方法，諸如但不限於使用限制酶及緩衝液來線性化質體。線性化反應可使用以下來純化：包括例如Invitrogen之PURELINK® PCR Micro套組(Carlsbad, Calif.)的方法，及基於HPLC之純化方法，諸如但不限於強陰離子交換HPLC、弱陰離子交換HPLC、逆相HPLC (RP-HPLC)及疏水性相互作用HPLC (HIC-HPLC)以及Invitrogen之標準PURELINK.TM. PCR套組(Carlsbad, Calif.)。可視進行之線性化反應的大小來修改純化方法。隨後使用線性化質體來產生用於活體外轉錄(IVT)反應之cDNA。cDNA 模板合成
可藉由使線性化質體進行聚合酶鏈反應(PCR)來合成cDNA模板。用於任何擴增之引子-探針設計在熟習此項技術者之技能範圍內。探針還可含有經化學修飾鹼基以增加對標靶分子之鹼基配對保真度及鹼基配對強度。此類修飾可包括5-甲基-胞苷、2,6-二胺基-嘌呤、2'-氟、硫代磷酸酯或鎖定核酸。mRNA 產生
mRNA或mmRNA產生之製程可包括(但不限於)活體外轉錄、cDNA模板移除及RNA淨化以及mRNA加帽及/或加尾反應。活體外轉錄
可使用活體外轉錄(IVT)系統轉錄如上產生之cDNA。該系統典型地包含轉錄緩衝液、三磷酸核苷酸(NTP)、RNase抑制子及聚合酶。NTP可內部製備，可自供應商選擇，或可如本文所述合成。NTP可選自但不限於本文所述之NTP，包括天然及非天然(經修飾)NTP。聚合酶可選自但不限於T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶及突變型聚合酶，諸如但不限於能夠併有經修飾核酸之聚合酶。5' 加帽
mRNA之5'帽結構參與核輸出，從而提高mRNA穩定性。其結合mRNA帽結合蛋白(CBP)，該CBP經由CBP與poly(A)結合蛋白結合形成成熟環狀mRNA物質而負責細胞中之mRNA穩定性及轉譯能力。帽進一步輔助在mRNA剪接期間移除5'近端內含子。內源mRNA分子可經5'末端加帽，從而在末端鳥苷帽殘基與mRNA分子之5'末端轉錄之有義核苷酸之間產生5'-ppp-5'-三磷酸鍵。隨後可將此5'-鳥苷酸帽甲基化以產生N7-甲基-鳥苷酸殘基。mRNA 5'末端之末端及/或末端前轉錄核苷酸的核糖可視情況亦經2'-O-甲基化。經由鳥苷酸帽結構之水解及裂解進行的5'-去帽可靶向核酸分子，諸如mRNA分子，以進行降解。對本揭示案之多核苷酸、初級構築體及mmRNA的修飾可產生不可水解之帽結構，從而防止去帽，因此延長mRNA半衰期。因為帽結構水解需要5'-ppp-5'磷酸二酯鍵聯裂解，故在加帽反應期間可使用經修飾核苷酸。例如，可根據製造商之說明，將New England Biolabs (Ipswich, Mass.)之牛痘加帽酶與α-硫代鳥苷核苷酸一起使用，以在5'-ppp-5'帽中產生硫代磷酸酯鍵聯。可使用其他經修飾鳥苷核苷酸，諸如α-甲基-膦酸酯及硒代磷酸核苷酸。其他修飾包括(但不限於)mRNA (上述)5'末端及/或5'末端前核苷酸之核糖在糖環2'-羥基上的2'-O-甲基化。多個不同5'-帽結構可用於產生核酸分子，諸如mRNA分子之5'-帽。側接區非轉譯區 (UTR)
基因之非轉譯區(UTR)經轉錄但不轉譯。5'UTR在轉錄起始位點處起始，且持續至起始密碼子，但不包括起始密碼子，而3'UTR在緊鄰終止密碼子之後處起始且持續直至轉錄終止訊號為止。可以將UTR併入本揭示案之多核苷酸、初級構築體及/或mRNA中以提高分子之穩定性。亦可併有UTR，以確保在將轉錄本誤引導至不合需要之器官位點的情形下，受控地下調轉錄本。5' UTR 及轉譯起始
藉由工程改造典型地在特定標靶器官之大量表現基因中發現之特徵，可提高本揭示案之多核苷酸、一級構築體或mmRNA之穩定性及蛋白質產生。例如，可將內含子或內含子序列之部分併入本揭示案之多核苷酸、初級構築體或mmRNA的側接區域中。富 AU 元件
富AU元件(ARE)可分為三類(Chen等人，Mol. Cell. Biol. 15:5777-5788, 1995；Chen等人，Mol. Cell Biol. 15:2010-2018, 1995)：I類ARE在富U區域內含有數個AUUUA模體之分散複本。C-Myc及MyoD含有I類ARE。II類ARE具有兩個或更多個重疊UUAUUUA(U/A)(U/A) (SEQ ID NO: 38 )九聚物。含有此類ARE之分子包括GM-CSF及TNF-a。III類ARE之定義不太明確。此等富U區域不含AUUUA模體。c-Jun及生肌蛋白為此類別之兩個經充分研究之實例。已知大多數與ARE結合之蛋白質會使信使不穩定，而ELAV家族之成員(最尤其HuR)已證明可增加mRNA之穩定性。HuR結合於所有三種類別之ARE。將HuR特異性結合位點工程改造至核酸分子之3' UTR中將引起HuR結合，從而 活體內穩定訊息。可使用3' UTR富AU元件(ARE)之引入、移除或修飾來調節本揭示案之多核苷酸、一級構築體或mmRNA之穩定性。當工程改造特定多核苷酸、初級構築體或mmRNA時，可引入ARE之一或多個複本以使本揭示案之多核苷酸、初級構築體或mmRNA較不穩定，從而減少轉譯且降低所得蛋白之產生。同樣，可鑑別且移除或突變ARE以增加細胞內穩定性，因此增加所得蛋白之轉譯及產生。可使用本揭示案之多核苷酸、初級構築體或mmRNA，在相關細胞株中進行轉染實驗，且可在轉染後之各個時間點檢定蛋白之產生。例如，可使用不同ARE工程改造分子轉染細胞，且使用針對相關蛋白之ELISA套組偵測，且檢定在轉染後6小時、12小時、24小時、48小時及7天產生之蛋白。可使用天然及/或合成聚合物調配本揭示案之多核苷酸、初級構築體及mRNA。可用於遞送之聚合物的非限制性實例包括(但不限於)DYNAMIC POLYCONJUGATE® (Arrowhead Research Corp., Pasadena, Calif.)、來自MIRUS® Bio (Madison, Wis.)及Roche Madison (Madison, Wis.)之調配物、PHASERXTM 聚合物調配物諸如但不限於SMARTT POLYMER TECHNOLOGYTM (PHASERX.RTM., Seattle, Wash.)、DMRI/DOPE、泊洛沙姆、來自Vical (San Diego, Calif.)之VAXFECTIN®佐劑、殼聚糖、來自Calando Pharmaceuticals (Pasadena, Calif.)之環糊精、樹狀聚合物及聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合物、RONDELTM (RNAi/寡核苷酸奈米粒子遞送)聚合物(Arrowhead Research Corporation, Pasadena, Calif.)及pH反應性共嵌段聚合物諸如但不限於PHASERX® (Seattle, Wash.)。此等聚合物方法中有許多已展現將寡核苷酸活體內遞送至細胞質中之功效(評述於deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132中；以全文引用之方式併入本文中)。動態聚結合物及基於環糊精之奈米粒子為活體內穩定遞送核酸(在此情形下使用小干擾RNA (siRNA))之兩種聚合物方法。此等遞送方法中之第一者使用動態聚結合物，且已在小鼠中活體內顯示在肝細胞中有效遞送siRNA及沈默內源標靶mRNA (Rozema等人，Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887；以全文引用之方式併入本文中)。此特殊方法為一種多組分聚合物系統，其主要特徵包括膜活性聚合物，核酸(在此情形下為siRNA)經由二硫鍵與該聚合物共價偶合，且其中PEG (用於電荷遮蔽)及N-乙醯半乳糖胺(用於肝細胞靶向)基團兩者經由pH敏感鍵連接(Rozema等人，Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887；以全文引用之方式併入本文中)。與肝細胞結合且進入內體後，聚合物複合物在低pH環境中分解，其中聚合物暴露其正電荷，引起內體逃逸及siRNA自聚合物釋放細胞質。經由用甘露糖基置換N-乙醯半乳糖胺基，展現可將靶向表現脫唾液酸糖蛋白受體之肝細胞改變為竇內皮及庫普弗細胞。另一種聚合物方法涉及使用含靶向轉鐵蛋白之環糊精的聚陽離子奈米粒子。此等奈米粒子已展現在表現轉鐵蛋白受體之尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)腫瘤細胞中靶向沈默EWS-FLI1基因產物(Hu-Lieskovan等人，Cancer Res. 2005 65: 8984-8982；以全文引用之方式併入本文中)，且在此等奈米粒子中調配之siRNA在非人類靈長類動物中具有良好耐受性(Heidel等人，Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21；以全文引用之方式併入本文中)。此兩種遞送策略均併有使用靶向遞送及內體逃逸機制兩者之合理方法。實例 16 ：藉由反式剪接方法恢復 Otof-/- 小鼠之聽力
進行實驗以判定是否可使用本文所述方法使用兩種不同載體之組合恢復Otof-/- 小鼠中之聽力。材料及方法 選殖
使用標準選殖策略，包括限制性消化及連接，將自耳蝸cDNA次選殖之小鼠耳畸蛋白cDNA轉錄本變體4 (KX060996；與參考序列NM_001313767一致之編碼DNA序列(CDS))(Strenzke 等人，(2016) EMBO J. 35 2519-2535)次選殖於AAV生產之主鏈中。兩種載體均含有血清型2之ITR。將CMV增強子及人類J-肌動蛋白啟動子次選殖至5'載體中，該載體含有eGFP cDNA及P2A訊號(圖1)。耳畸蛋白CDS在外顯子21-外顯子22接合處分裂成具有大致類似大小之兩半。5'載體編碼耳畸蛋白中胺基酸1至844之N末端部分，3'載體含有胺基酸845至1977之編碼序列及土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)及聚腺苷酸化訊號。
對於反式剪接方法，剪接供體位點 (Trapani等人， (2014)EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014)在5'載體中之編碼序列後。在3'載體中，將剪接受體位點次選殖於緊鄰耳畸蛋白編碼序列之前。在編碼序列內，引入沈默突變，產生用於限制性消化之另一位點。
對於雜交方法，在5'載體之剪接供體位點之後且在3'載體之剪接受體位點之前，次選殖用於同源重組之F1噬菌體致重組區(圖2)。藉由Sanger測序驗證質體一致性。病毒產生及純化
藉由在多水準細胞工廠中生長之HEK293細胞的瞬時轉染產生雙重AAV載體。將細胞與輔助質體共轉導以產生編碼血清型6衣殼蛋白之病毒。藉由碘克沙醇密度-梯度超離心，繼而藉由FPLC親和層析進行第二純化及濃縮步驟來進行細胞裂解物之純化(Asai 等人，(2015) Nat. Neurosci. 18 1584-1593；Tereshchenko 等人，(2014) Neurobiol. Dis. 65 35-42)。對於反式剪接方法，5'載體達成之濃度為約2.8 x 108 個轉導單位/µL。3'載體達成約1.4 x 108 個轉導單位/µL。對於雜交方法，在相同溶液中同時純化兩種病毒，從而達成略微較高之病毒力價。小鼠品系
如所述(Reisinger等人，(2011) J. Neurosci. 31 4886-4895)產生耳畸蛋白敲除(Otof-/- )小鼠，且與C57/Bl6N或CD1品系回交至少5代。對於病毒注射，使用Otof--/- CD1雌性與Otof-/- C57/Bl6N雄性之F1後代。對於野生型對照，使來自Otof+/- C57/Bl6N育種之Otof+/+ 小鼠與CD1野生型小鼠(Charles River)交配。病毒注射
使用2.5%-5%異氟烷麻醉出生後第6天至第7天(P6-7)之小鼠。打開左鼓泡後之皮膚，且暴露圓窗口。使用PLI-100A BASIC PICOLITER微型注射器(Harvard Apparatus GmbH, Germany)作為壓力源，將玻璃毛細管中之病毒溶液注射穿過圓窗膜，從而每隻內耳注射約0.2-0.5 µL溶液(Jung等人 . (2015) EMBO J. 34 2686-2702)。閉合皮膚，且幼崽由其母親撫養。免疫組織化學
如前述進行免疫染色 (Strenzke等人，(2016) EMBO J. 35 2519-2535)。 斷頭後，將顳骨分離，打開耳蝸骨架之一部分，且將圓窗穿孔。將顳骨在4℃下在4%甲醛之PBS溶液中固定45 min。將大於P20之小鼠的耳蝸在莫爾斯溶液(Morse's solution )中脫鈣5 min或在0.12 M EDTA溶液中脫鈣2天。用17%正常山羊血清、0.3%Triton X-100、0.45 mM NaCl及20 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)進行阻斷。用阻斷溶液稀釋抗體，且將其施用於位於顳骨中之柯蒂氏器，隨後切下頂端及基端。使用了以下抗體：山羊IgG1抗Ctbp2小鼠抗耳畸蛋白(RRID:AB_881807, Abcam, Cambridge, UK，1:300)、兔抗耳畸蛋白(Synaptic Systems, Göttingen, Germany，1:100)、山羊抗鈣結合蛋白D28k及二級Alexa Fluor®405、Alexa Fluor®488、Alexa Fluor®568、Alexa Fluor®594及Alexa Fluor647標記之抗體(Invitrogen，1:200)。使用具有63x甘油浸沒物鏡(NA = 1.456)之雷射掃描共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5, Leica Microsystems CMS GmbH, Mannheim, Germany)以2D影像之堆疊的形式以0.6 µm之步長獲取共聚焦顯微鏡影像。使用ImageJ軟體中之細胞計數器插件，將14-16天齡內毛細胞(IHC)中之突觸數計數作為Ctbp2點之數量。確定膜結合耳畸蛋白之分率水準的影像分析描述於Strenzke等人，(2016a) EMBO J. 35 2519-2535)中。電生理學
如(Moser及Beutner (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97 883-888)所述，藉由在室溫(20-25℃)下在穿孔膜片構造中對新鮮解剖之柯蒂氏器頂部線圈中的IHC進行膜片箝操作來量測自IHC之Ca2+ 電流及質膜電容。移液管溶液含有130 mM葡糖酸銫、10 mM氯化四乙銨(TEA-Cl)、10 mM 4-胺基吡啶(Merck, Darmstadt, Germany)、1 mM MgCl2 、10 mM Cs-HEPES(pH 7.17，滲透壓約290 mOsm)、300 μg/mL兩性黴素B(Calbiochem, La Jolla, CA)。細胞外溶液含有110 mM NaCl、35 mM TEA-Cl、2.8 mM KCl、2 mM CaCl2 、1 mM MgCl2 、10 mM Na-HEPES、1 mM CsCl、11.1 mM D-葡萄糖(pH 7.2，滲透壓約300 mOsm)。除非另有說明，否則所有化學品均獲自Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany)。使用由Pulse 軟體控制之EPC-9放大器(HEKA Electronics, Lambrecht, Germany)來取樣且分別過濾20 kHz及5 kHz之電流。對液體接界電位進行電位校正(-14 mV)。如先前所述(Beutner及Moser (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97 883-888)，使用不同持續時間之去極化達到峰值Ca2+ 電流電位來量測ΔCm，其中刺激間隔為30-60 sec。所有電流均使用P/6方案進行洩漏校正。囊泡補充速率之計算方式為：100 ms去極化期間之ΔCm減20 ms去極化時之ΔCm，除以45 aF/個囊泡(Neef等人，(2007) The Journal of Neuroscience 27 12933-12944) ，以獲得囊泡數。用免疫組織化學確定每個細胞之活性區數目(經轉導Otof-/- IHC為10個突觸，Otof+/+ IHC為14個突觸)。ABR 記錄
如所述(Jing等人， (2013) J Neurosci 33 4456-4467)記錄聽覺腦幹反應。RNA 分離、逆轉錄、 PCR 及測序
根據製造商之說明，用Invitrogen™ TRIzol™ Plus RNA純化套組(Thermo Fisher Scientific, 12183555)自急性解剖之柯蒂氏器分離總RNA，且用作使用SuperScript® IV第一股合成系統(ThermoFisher Scientific，18091050)用Oligo(dT)20 及隨機六聚物引子進行cDNA合成之模板。使用DreamTaq® Polymerase (Thermo Fisher Scientific，EP0702)，使用以下引子將cDNA進一步用於PCR擴增反應： N末端片段3'-CCCACAAGGCCAACGAGACGGATGAGGAC-5' (SEQ ID NO: 24)及3'-AAGAGGCTTCGGGCCTGATACATGTGTGCT-5' (SEQ ID NO: 25)； 組裝片段3'-ACGGCAATGAAGTCGATGGTATGTCCCGGC-5' (SEQ ID NO: 26)； C末端片段3'-CTGACCTGCCACCCATCAATGGCCCAGTGG-5' (SEQ ID NO: 27)及3'-CTATGCGCTCCTCCTCTGTGGAGCCATCCT-5'(SEQ ID NO: 28)。
切下所有條帶，使用TOPO® TA®選殖套組(Thermo Fisher Scientific，450641)選殖至pCR2.1™-TOPO®載體中，且注入One Shot™ TOP10 Electrocomp™大腸桿菌 細胞(Thermo Fisher Scientific，C404050)中。篩選所有純系之正確插入片段，且藉由Sanger測序驗證。結果
為測試反式剪接方法，產生雙重AAV載體，各自包含耳畸蛋白CDS之一半。在第一載體中，使用人類β-肌動蛋白啟動子及CMV增強子驅動eGFP及5'耳畸蛋白片段(兩者由P2A序列分隔)之表現(圖1)。第二載體含有3'耳畸蛋白CDS及mRNA穩定元件。AAV載體藉由反向末端重複序列(ITR)之非同源末端連接，在標靶細胞之核中進行頭至尾多聚，從而促進兩種載體基因體之組裝。包括5'載體中之剪接供體位點及3'載體中之剪接受體位點，以促使加工正確全長耳畸蛋白mRNA (圖1)。
在出生後第6-7天(P6-7)，經由左耳圓窗膜向耳畸蛋白敲除Otof-/- 動物共同注射兩種AAV (約1.4-2.8 x 108 個轉導單位/µL)(圖3)。將未注射之Otof-/- 同窩幼仔及野生型動物(其中一些注射有編碼eGFP之AAV)用作對照。在P23-28，使用聽覺腦幹記錄(ABR)測試聽力，且使用免疫組織化學測試內毛細胞(IHC)轉導率及耳畸蛋白表現水準。如圖3所示，在未轉導Otof-/- 小鼠中，由於IHC之去極化，ABR記錄引起顯著總和電位(SP)，但此等訊號並未傳遞至腦幹，從而產生平線。雙重AAV轉導後，小鼠呈現典型ABR波，指示聽覺資訊處理至腦幹。
為響應於短音刺激，經成功轉導耳之臨限值為54 ± 3 dB(範圍：30-70 dB)。在對照實驗中，即使在100 dB之聲音刺激下，未轉導Otof-/- 同窩幼仔動物亦未展示ABR波，除總和電位以外。純音刺激在大多數經轉導耳中引起ABR反應，但在未轉導Otof-/- 同窩幼仔對照中則無(圖3-6)。低(6 kHz)、中(12 kHz)及高頻率(24 kHz)下可偵測純音ABR。Otof+/- 對照顯示正常ABR波形，臨限值為39±1 dB (範圍：30-40 dB)(圖4及5)。如圖4所示，在經轉導Otof-/- 小鼠中ABR波之振幅小於用具有增加之綠色螢光蛋白(eGFP)之雙重AAV轉導的野生型Otofwt/wt 小鼠。
為測試正確定向之全長耳畸蛋白mRNA的正確多聯化及再組裝，自轉導及未轉導P14Otof-/- 柯蒂氏器提取mRNA。在逆轉錄成cDNA後，將來自耳畸蛋白mRNA之三個片段擴增：一者由5'病毒編碼，一者由3'病毒編碼，且一個片段覆蓋組裝兩種載體之位點。PCR擴增子之Sanger測序揭示正確耳畸蛋白轉錄本，其含有病毒轉導耳畸蛋白之沈默突變，指示經雙重AAV轉導之耳畸蛋白mRNA的正確組裝。
為研究內毛細胞(IHC)轉導率及耳畸蛋白表現水準，在P18-28解剖柯蒂氏器，且藉由使用兩種抗耳畸蛋白抗體進行免疫組織化學來分析，一者結合N末端部分，且另一者恰結合耳畸蛋白之C末端部分(圖6及圖7)。如圖7所示，將鈣結合蛋白用作內及外毛細胞之標記物。表現eGFP之細胞指示至少5'病毒之病毒轉導。耳畸蛋白N末端半部分之抗耳畸蛋白抗體染色(Abcam)指示耳畸蛋白N末端部分之表現。C末端抗耳畸蛋白抗體染色(Synaptic Systems)指示耳畸蛋白C末端部分之表現。綜上，圖7中之所有三張圖均展現全長耳畸蛋白在IHC中表現。IHC中之12%至51% (平均32 ± 4%，s.e.m.)展示全長耳畸蛋白表現，其中耳蝸頂區(低頻區，35 ± 5%轉導率；範圍：19-52%)之IHC轉導率高於基端(24 ± 6%，範圍：0-51%)。所有IHC中約10%展示N末端耳畸蛋白訊號，但無C末端耳畸蛋白表現，從而推測僅指示5'載體之轉導。在Otof-/- 對照同窩幼仔中未觀察到訊號。值得注意地，僅在IHC中發現N末端及C末端之耳畸蛋白訊號，而在外毛細胞(OHC)以及不同時表現耳畸蛋白之其他細胞類型中亦發現eGFP螢光。因此，儘管在柯蒂氏器中之數種細胞類型中均轉導AAV，但耳畸蛋白之表現僅限於IHC。為定量耳畸蛋白表現水準，使用N末端抗耳畸蛋白抗體在免疫染色IHC之共聚焦堆疊中量測免疫螢光(如Strenzke等人，(2016) EMBO J. 35 2519-2535)。在經雙重AAV轉導之Otof-/- IHC中，發現耳畸蛋白水準為野生型對照之約30%。
由於在 出生後之第二週期間，Otof-/- 小鼠中之突觸部分損失，因此進行實驗以判定在此等IHC中耳畸蛋白之表現是否影響突觸數量。將突觸帶免疫標記；在26天齡未轉導Otof-/- IHC中發現9 ± 0.3個突觸(n = 42個細胞，N = 3隻動物)。在經雙重AAV轉導之Otof-/- 中，藉由eGFP螢光鑑別10 ± 0.2個突觸(n = 59個細胞；N = 3隻動物)。相反，野生型IHC每個IHC呈現13-16個突觸(Strenzke等人，(2016) EMBO J. 35 2519-2535)。因此，在P6雙重AAV注射後，耳畸蛋白之表現部分阻止P26Otof-/- IHC之突觸損失。
圖15及圖16中之資料亦展示，雜交方法(投與圖2中所示之載體)亦恢復Otof-/- 小鼠之IHC中的耳畸蛋白活性。
此等資料指示，本發明主張之方法可恢復耳畸蛋白基因中具有滅活突變之哺乳動物的聽力。實例 17 ：藉由反式剪接雙重 AAV 介導之耳畸蛋白在 Otof-/- 小鼠之 IHC 中之表現恢復的響應於短去極化刺激之胞吐作用的恢復
進行實驗以判定本發明主張之方法是否可恢復Otof-/- 小鼠中突觸囊泡與內聽毛細胞之融合。
由於突觸囊泡之融合增加細胞之質膜表面，故可將此融合量測為質膜電容之增加(ΔCm)。為定量囊泡之易釋放池之胞吐作用及持續胞吐作用，在穿孔膜片箝構造(圖8-10)中量測質膜電容之變化(ΔCm )。將胞吐作用記錄為在指定持續時間內將IHC去極化至-14 mV後之膜電容變化。
在出生後第14至18天(P14-P18)，將來自小鼠急性外植之柯蒂氏器的IHC去極化至引起最大Ca2+ 電流之電壓，典型地為-14 mV。記錄來自進行及未進行病毒轉導之Otof-/- IHC的Ca2+ 電流及ΔCm ，其中經病毒轉導IHC藉由實驗期間其eGFP螢光鑑別。發現與未處理及經轉導Otof-/- IHC中之突觸數量一致，Ca2+ 電流之大小與Otof+/+ 年齡及背景匹配之對照相當(圖8及圖10)。如圖8所示，在未轉導Otof-/- IHC、經雙重AAV轉導之IHC或來自背景匹配之對照動物的野生型IHC之間，Ca2+ 電流之振幅或門控特性無差異。響應於5或10 ms之去極化脈衝，發現經轉導Otof-/- IHC中的胞吐作用與Otof+/+ IHC中具有類似大小，而在未轉導Otof-/- IHC中，Cm 幾乎不可偵測到變化(圖9)。實際上，對於長達20 ms之短去極化刺激，在Otof-/- 小鼠之經雙重AAV轉導之IHC中，胞吐作用與野生型類似，指示囊泡之完整易釋放池。在持續去極化期間，需要補充易釋放池中之囊泡；已知此過程需要耳畸蛋白(Pangrsic等人，(2010) Nat. Neurosci. 13 869-876；Strenzke等人，(2016) EMBO J. 35 2519-2535)。對於較長之去極化刺激，胞吐作用在輕度聽覺障礙之OtofI515T/I515T 小鼠的範圍內(Strenzke等人，(2016) EMBO J. 35 2519-2535)。如圖9所示，對於50-100 ms去極化，發現經轉導Otof-/- IHC中之胞吐作用為Otof+/+ IHC之約60%，而未轉導Otof-/- IHC幾乎不展示任何囊泡融合，如前述(Roux等人，(2006) Cell 127 277-289)。計算個別轉導細胞中之囊泡補充率。發現約380個囊泡/秒/活動區發生胞吐作用，相比之下，在Otof+/+ IHC中為750個囊泡/秒/活動區(Strenzke等人，(2016) EMBO J. 35 2519-2535)。因此，在經轉導Otof-/- IHC中，RRP之囊泡補充率可部分恢復，且在野生型對照之囊泡補充率與輕度聽力障礙之Otof I515T /I515T 小鼠的囊泡補充率之間(Strenzke等人，(2016) EMBO J. 35 2519-2535)。如圖10所示，去極化步驟期間之Ca2+ 積分指示，在轉導及未轉導Otof-/- IHC中以及在野生型對照細胞中，類似Ca2+ 電荷量進入IHC。
選擇AAV血清型6，從而引起高達51%之IHC轉導率。如最近已展示(Landegger等人，(2017) Nat. Biotechnol. 35 280-284)，人工血清型Anc80L65可進一步增加IHC轉導率，尤其在施用於成熟耳時(Suzuki等人，(2017) Scientific Reports 7 45524)。
總之，此等資料展示，使用本文所述之方法，在九隻經注射Otof-/- 動物中聽力恢復。此等資料亦指示，IHC表現之耳畸蛋白愈多，聽力臨限值愈佳。實例 18 ：腺相關病毒 (AAV) 反式剪接策略
分子間多聯化及反式剪接後，至少兩種不同核酸載體(例如，AAV載體)可用於在細胞內重構活性耳畸蛋白基因(例如，全長耳畸蛋白基因)。參見例如，Yan等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:12; 6716-6721, 2000，以全文引用之方式併入本文中。
在一些實例中，使用兩種不同核酸載體。第一核酸載體可包括啟動子(例如，本文所述啟動子中之任一者)、位於啟動子3'端之編碼耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的第一編碼序列(例如，任何大小之本文所述耳畸蛋白之蛋白的一部分及/或本文所述耳畸蛋白之蛋白之N末端部分中之任一者)及位於第一編碼序列3'末端之剪接供體訊號序列。第二核酸載體可包括剪接受體訊號序列、位於剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之C末端部分(亦即，耳畸蛋白之蛋白中不包括在N末端部分中之整個部分)的第二編碼序列(例如，任何大小之本文所述耳畸蛋白之蛋白的一部分及/或本文所述耳畸蛋白之蛋白之C末端部分中之任一者)及在第二編碼序列3'末端之聚腺苷酸化序列(例如，本文所述聚腺苷酸化序列中之任一者)。在一些實施例中，編碼部分中之每一者之長度為至少30個胺基酸殘基(例如，長度為至少50個胺基酸、至少75個胺基酸或至少100個胺基酸)，編碼部分中之每一者之胺基酸序列不與另一個編碼部分之序列重疊，且兩種不同載體中單一載體均不編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)。當兩種載體之兩個編碼序列在哺乳動物細胞(例如，本文所述哺乳動物細胞中之任一者)中表現時，在剪接供體訊號序列與剪接受體訊號序列之間發生剪接，從而形成編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)的重組mRNA。
在另一實例中，可使用三種不同核酸載體。第一核酸載體可包括啟動子序列之一部分(例如，本文所述啟動子序列中之任一者)、位於啟動子3'端之編碼耳畸蛋白之蛋白之第一部分的耳畸蛋白基因之第一編碼序列(例如，本文所述耳畸蛋白編碼序列中之任一者)及位於第一編碼序列3'端之第一剪接供體訊號序列。第二核酸載體可包括第一剪接受體訊號序列、位於第一剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之第二部分的耳畸蛋白基因之第二編碼序列及位於第二編碼序列3'末端之第二剪接供體訊號序列(例如，本文所述剪接供體訊號中之任一者)。第二核酸載體之特徵為不會發生自剪接(亦即，第二核酸載體之第二剪接供體訊號序列與第一剪接受體訊號序列之間不發生剪接)。在一些實施例中，第一核酸載體之剪接供體訊號序列與第二核酸載體之第二剪接供體訊號相同(例如，本文所述或此項技術中已知剪接供體訊號中之任一者)。在一些實施例中，第一核酸載體之第一剪接供體訊號序列與第二核酸載體之第二剪接供體訊號不同(例如，本文所述或此項技術中已知剪接供體訊號序列中之任一者)。第三核酸載體包括第二剪接受體訊號序列、位於第二剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之第三部分的耳畸蛋白基因之第三編碼序列及位於第三編碼序列3'末端之聚腺苷酸化序列(例如，本文所述聚腺苷酸化序列中之任一者)。在使用三種核酸載體之此類方法中，第一剪接供體序列與第一剪接受體序列可組裝在一起，且第二剪接供體序列與第二剪接受體序列可組裝在一起(重組)，且耳畸蛋白之蛋白中分別由第一、第二及第三編碼序列編碼之部分不重疊，且當引入哺乳動物細胞(例如，本文所述哺乳動物細胞中之任一者)時，在第一剪接供體序列與第一剪接受體序列之間，且在第二剪接供體序列與第二剪接受體序列之間發生剪接，以形成編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)的剪接核酸。基於以上提供之策略，熟習此項技術者應瞭解如何使用四種、五種或六種不同核酸載體開發策略。
在此等方法之任何實例中，編碼部分中每一者之胺基酸序列均不與任何其他編碼部分之序列重疊，且單一載體均不編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)。
至少兩種不同載體中之每一者均包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，編碼部分中之每一者可為至少30個胺基酸(例如，約30個胺基酸至約1600個胺基酸，或本文所述此範圍中之任何其他亞範圍)。
在一些實施例中，編碼序列中之每一者可包括SEQ ID NO: 12之至少一個外顯子及至少一個內含子(例如，至少兩個外顯子及至少一個內含子，至少兩個外顯子及至少兩個內含子，至少三個外顯子及至少一個內含子，至少三個外顯子及至少兩個內含子或至少三個外顯子及至少三個內含子)。在一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，該等編碼部分中之每一者可編碼SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的高達80% (例如，SEQ ID NO: 5之高達10%、高達20%、高達30%、高達40%、高達50%、高達60%或高達70%)，使得編碼部分中之每一者不重疊。在一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，該等編碼部分中之每一者編碼SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的高達80% (例如，SEQ ID NO: 5之高達10%、高達20%、高達30%、高達40%、高達50%、高達60%或高達70%)，使得編碼部分中之每一者不重疊。
至少兩種核酸載體中之每一者還可包括反向末端重複序列(ITR)以允許頭至尾重組。隨後經由剪接移除ITR。例如，ITR可為迴文雙D ITR，如Yan等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97(12):6716-6721, 2000中所述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。例如，ITR可為AAV血清型2 ITR，如Gosh等人，Mol. Ther. 16:124-130, 2008，及Gosh等人，Human Gene Ther. 22: 77-83, 2011所述。剪接受體及/或供體訊號序列之非限制性實例為此項技術中所已知。參見例如，Reich等人，Human Gene Ther. 14(1):37-44, 2003，及Lai等人，(2005)Nat. Biotechnol. 23(11):1435-1439, 2005, 2005。剪接供體和受體訊號序列可為基因(例如，耳畸蛋白基因)之任何內源內含子剪接訊號。
例如，剪接供體訊號序列可為： 5'-GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGA AACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT-3' (SEQ ID NO: 64)且剪接受體訊號可為： 5'-ATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTC CACAG-3' (SEQ ID NO: 110) (參見例如，Trapani等人，EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014)。
評價剪接及剪接效率之方法為此項技術中所已知(參見例如，Lai等人，Nat. Biotechnol. 23(11): 1435-1439, 2005)。實例 19 ：使用鹼性磷酸酶 (AP) 高度致重組外源基因區之雜交載體反式剪接策略
分子間多聯化、標記基因介導之重組及反式剪接後，至少兩種(例如，兩種、三種、四種、五種或六種)不同核酸載體(例如，AAV載體)亦可在本文所述方法中之任一者中用於在細胞內重構活性耳畸蛋白基因(例如，全長耳畸蛋白基因)。此策略為雜交策略，因為其包括同源重組及/或反式剪接。參見例如，Gosh等人，Mol. Ther. 16: 124-130, 2008；Gosh等人，Human Gene Ther. 22: 77-83, 2011；及Duan等人，Mol. Ther. 4: 383-391, 2001，每一者以全文引用之方式併入本文中。如本文所用，可偵測標記基因可為高度致重組DNA序列，其允許編碼序列獨立性重組。可偵測標記基因之非限制性實例為鹼性磷酸酶(AP)基因。例如，可偵測標記基因可為人類胎盤AP互補DNA中之中間三分之一，其長度為872 bp(參見例如，Gosh等人，2008)。至少兩種不同核酸載體含有可偵測標記基因(例如，本文所述可偵測標記基因中之任一者)。由於雜交載體如實例18中所述基於反式剪接載體構築，故可使用ITR介導之重組及反式剪接或可偵測標記基因介導(例如，AP基因介導)之重組及反式剪接重構活性耳畸蛋白基因(例如，全長耳畸蛋白基因)。反式剪接後，將在哺乳動物細胞(例如，本文所述哺乳動物細胞中之任一者)之基因體DNA中重構活性耳畸蛋白基因(例如，全長耳畸蛋白基因)。
在一些實例中，使用兩種不同核酸載體。第一核酸載體可包括啟動子(例如，本文所述啟動子中之任一者)、位於啟動子3'端之編碼耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的第一編碼序列(例如，任何大小之本文所述耳畸蛋白之蛋白的一部分及/或本文所述耳畸蛋白之蛋白之N末端部分中之任一者)、位於第一編碼序列3'末端之剪接供體訊號序列及位於剪接供體訊號序列3'端之第一可偵測標記基因。第二核酸載體可包括第二可偵測標記基因、位於第二可偵測標記基因3'端之剪接受體訊號序列、位於剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之C末端部分的第二編碼序列(例如，任何大小之本文所述耳畸蛋白之蛋白的一部分及/或本文所述耳畸蛋白之蛋白之C末端部分中之任一者)及在第二編碼序列3'末端之聚腺苷酸化序列(例如，本文所述聚腺苷酸化序列中之任一者)。在一些實施例中，編碼部分中之每一者之長度為至少30個胺基酸殘基(例如，長度為至少50個胺基酸、至少75個胺基酸或至少100個胺基酸)，編碼部分中之每一者之胺基酸序列不重疊，且兩種不同載體中單一載體均不編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)。當引入哺乳動物細胞(例如，本文所述哺乳動物細胞中之任一者)中時，在剪接供體訊號序列與剪接受體訊號序列之間發生剪接，從而形成編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)的RNA。
在另一實例中，可使用三種不同核酸載體。第一核酸載體可包括啟動子序列之一部分(例如，本文所述啟動子序列中之任一者)、位於啟動子3'端之編碼耳畸蛋白之蛋白之第一部分的耳畸蛋白基因之第一編碼序列(例如，本文所述耳畸蛋白編碼序列中之任一者)、位於第一編碼序列3'端之第一剪接供體訊號序列及第一可偵測標記基因。第二核酸載體可包括第二可偵測標記基因、位於第二可偵測標記基因3'端之第一剪接受體訊號序列、位於第一剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之第二部分的耳畸蛋白基因之第二編碼序列、位於第二編碼序列3'末端之第二剪接供體訊號序列(例如，本文所述剪接供體訊號中之任一者)及第三可偵測標記基因。第二核酸載體之特徵為不會發生自剪接(亦即，第二核酸載體之第二剪接供體訊號序列與第一剪接受體訊號序列之間不發生剪接)。在一些實施例中，第一核酸載體之剪接供體訊號序列與第二核酸載體之第二剪接供體訊號相同(例如，本文所述或此項技術中已知剪接供體訊號中之任一者)。在一些實施例中，第一核酸載體之第一剪接供體訊號序列與第二核酸載體之第二剪接供體訊號不同(例如，本文所述或此項技術中已知剪接供體訊號序列中之任一者)。第三核酸載體可包括第四可偵測標記基因、位於第四可偵測標記基因3'端之第二剪接受體訊號序列、位於第二剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之第三部分的耳畸蛋白基因之第三編碼序列及位於第三編碼序列3'末端之聚腺苷酸化序列(例如，本文所述聚腺苷酸化序列中之任一者)。在使用三種核酸載體之此類方法中，第一剪接供體序列與第一剪接受體序列可組裝在一起(重組)，且第二剪接供體序列與第二剪接受體序列可組裝在一起(重組)，且耳畸蛋白之蛋白中由第一、第二及第三編碼序列編碼之部分不重疊，且當引入哺乳動物細胞(例如，本文所述哺乳動物細胞中之任一者)時，在第一剪接供體序列與第一剪接受體序列之間，且在第二剪接供體序列與第二剪接受體序列之間發生剪接，以形成編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)的重組核酸。如此項技術中可瞭解，當使用三種核酸載體時，至少兩種不同核酸載體中之兩者可包括可偵測標記基因(例如，AP標記基因)，且至少兩種不同核酸中之一者可包括剪接受體訊號序列，該剪接受體訊號序列與包括可偵測標記基因之核酸載體中的剪接供體訊號序列互補。例如，在一些實施例中，第一及第二核酸載體可包括可偵測標記基因(例如，AP標記基因)，且第三核酸載體包括與第二核酸載體中之剪接供體訊號序列互補的剪接受體訊號序列，且第三核酸載體不包括可偵測標記基因(例如，AP標記基因)。在其他實例中，第二及第三核酸載體可包括可偵測標記基因(例如，AP標記基因)，且第一核酸載體包括與第二核酸載體中之剪接受體訊號序列互補的剪接供體訊號序列，且第一核酸載體不包括可偵測標記基因(例如，AP標記基因)。
基於以上提供之策略，熟習此項技術者應瞭解如何使用四種、五種或六種載體開發策略。
至少兩種核酸載體(例如，兩種、三種、四種、五種或六種)中提供的編碼序列將不重疊。至少兩種不同載體中之每一者均可包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，編碼部分中之每一者為例如至少30個胺基酸(例如，約30個胺基酸至約1600個胺基酸，或本文所述此範圍中之任何其他亞範圍)。
在一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者均包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，編碼部分中之每一者編碼SEQ ID NO: 12中之至少一個外顯子及至少一個內含子(例如，至少兩個外顯子及至少一個內含子，至少兩個外顯子及至少兩個內含子，至少三個外顯子至少一個內含子，至少三個外顯子及至少兩個內含子或至少三個外顯子及至少三個內含子)。在一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，該等編碼部分中之每一者編碼SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的高達80% (例如，SEQ ID NO: 5之高達10%、高達20%、高達30%、高達40%、高達50%、高達60%或高達70%)，使得編碼部分中之每一者不重疊。在一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，該等編碼部分中之每一者編碼SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的高達80% (例如，SEQ ID NO: 5之高達10%、高達20%、高達30%、高達40%、高達50%、高達60%或高達70%)，使得編碼部分中之每一者不重疊。
如實例18中所述，至少兩種核酸載體中之每一者還可包括反向末端重複序列(ITR)以允許頭至尾重組。隨後經由剪接移除ITR。ITR及剪接受體及/或供體訊號序列之實例為此項技術中所已知，且已在實例18中描述。實例 20 ：使用 F1 噬菌體高度致重組外源基因區 (AK) 之雜交載體反式剪接策略
分子間多聯化、標記基因介導之重組及反式剪接後，至少兩種(例如，兩種、三種、四種、五種或六種)不同核酸載體(例如，AAV載體)亦可在本文所述方法中之任一者中用於在細胞內重構活性耳畸蛋白基因(例如，全長耳畸蛋白基因)。參見例如，圖2中所示之載體。此策略為雜交策略，因為其包括同源重組及/或反式剪接。參見例如，Trapani等人，EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014，以全文引用之方式併入本文中。如本文所用，將使用F1噬菌體致重組區(AK)來允許編碼序列非依賴性重組。F1噬菌體致重組區可為來自F1噬菌體基因體之77 bp致重組區，如Trapani等人，(2014) EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014中所述。至少兩種不同核酸載體將含有F1噬菌體致重組區。由於雜交載體將如實例18中所述基於反式剪接載體構築，故可使用ITR介導之重組及反式剪接或F1噬菌體致重組區誘導之重組及反式剪接產生編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長靜纖毛蛋白)的核酸。反式剪接後，在哺乳動物細胞(例如，本文所述哺乳動物細胞中之任一者)中產生編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)的核酸。
在一實例中，將使用兩種不同核酸載體。第一核酸載體可包括啟動子(例如，本文所述啟動子中之任一者)、位於啟動子3'端之編碼耳畸蛋白之蛋白之N末端部分的第一編碼序列(例如，任何大小之本文所述耳畸蛋白之蛋白的一部分及/或本文所述耳畸蛋白之蛋白之N末端部分中之任一者)、位於第一編碼序列3'末端之剪接供體訊號序列及位於剪接供體訊號序列3'端之F1噬菌體致重組區。第二核酸載體可包括F1噬菌體致重組區、位於F1噬菌體致重組區3'端之剪接受體訊號序列、位於剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之C末端部分的第二編碼序列(例如，任何大小之本文所述耳畸蛋白之蛋白的一部分及/或本文所述耳畸蛋白之蛋白之C末端部分中之任一者)及在第二編碼序列3'末端之聚腺苷酸化序列(例如，本文所述聚腺苷酸化序列中之任一者)。在一些實施例中，編碼部分中之每一者之長度為至少30個胺基酸殘基(例如，長度為至少50個胺基酸、至少75個胺基酸或至少100個胺基酸)，編碼部分中之每一者之胺基酸序列不重疊，且兩種不同載體中單一載體均不編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)。當將載體引入哺乳動物細胞(例如，本文所述哺乳動物細胞中之任一者)中時，在剪接供體訊號序列與剪接受體訊號序列之間發生剪接，從而形成編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)的重組核酸。
在另一實例中，使用三種不同核酸載體。第一核酸載體可包括啟動子序列之一部分(例如，本文所述啟動子序列中之任一者)、位於啟動子5'端之編碼耳畸蛋白之蛋白之第一部分的耳畸蛋白基因之第一編碼序列(例如，本文所述耳畸蛋白編碼序列中之任一者)、位於第一編碼序列3'端之第一剪接供體訊號序列及F1噬菌體致重組區。第二核酸載體可包括F1噬菌體致重組區、位於F1噬菌體致重組區3'端之第一剪接受體訊號序列、位於第一剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之第二部分的耳畸蛋白基因之第二編碼序列、位於第二編碼序列3'末端之第二剪接供體訊號序列(例如，本文所述剪接供體訊號中之任一者)及F1噬菌體致重組區第二核酸載體之特徵為不會發生自剪接(亦即，第二核酸載體之第二剪接供體訊號序列與第一剪接受體訊號序列之間不發生剪接)。在一些實施例中，第一核酸載體之剪接供體訊號序列與第二核酸載體之第二剪接供體訊號相同(例如，本文所述或此項技術中已知剪接供體訊號中之任一者)。在一些實施例中，第一核酸載體之第一剪接供體訊號序列與第二核酸載體之第二剪接供體訊號不同(例如，本文所述或此項技術中已知剪接供體訊號序列中之任一者)。第三核酸載體可包括F1噬菌體致重組區、位於F1噬菌體致重組區3'端之第二剪接受體訊號序列、位於第二剪接受體訊號序列3'末端之編碼耳畸蛋白之蛋白之第三部分的耳畸蛋白基因之第三編碼序列及位於第三編碼序列3'末端之聚腺苷酸化序列(例如，本文所述聚腺苷酸化序列中之任一者)。在使用三種核酸載體之此類方法中，第一剪接供體序列與第一剪接受體序列可組裝在一起(重組)，且第二剪接供體序列與第二剪接受體序列可組裝在一起(重組)，且耳畸蛋白之蛋白中由第一、第二及第三編碼序列編碼之部分不重疊，且當引入哺乳動物細胞(例如，本文所述哺乳動物細胞中之任一者)時，在第一剪接供體序列與第一剪接受體序列之間，且在第二剪接供體序列與第二剪接受體序列之間發生剪接，以形成編碼活性耳畸蛋白之蛋白(例如，全長耳畸蛋白之蛋白)的重組核酸。如此項技術中可瞭解，當使用三種核酸載體時，兩種不同核酸載體可包括F1噬菌體致重組區，且不同核酸中之一者可包括剪接受體訊號，該剪接受體訊號序列與包括F1噬菌體致重組區之核酸載體中的剪接供體訊號序列互補。例如，在一些實施例中，第一及第二核酸載體可包括F1噬菌體致重組區，且第三核酸載體包括與第二核酸載體中之剪接供體訊號序列互補的剪接受體訊號，且第三核酸載體不包括F1噬菌體致重組區(例如，AP標記基因)。在其他實例中，第二及第三核酸載體可包括F1噬菌體致重組區，且第一核酸載體包括與第二核酸載體中之剪接受體訊號序列互補的剪接供體訊號序列，且第一核酸載體不包括F1噬菌體致重組區。基於以上提供之策略，熟習此項技術者應瞭解如何使用四種、五種或六種載體開發策略。
至少兩種核酸載體(例如，兩種、三種、四種、五種或六種)中之每一者中提供的編碼序列將不重疊。至少兩種不同載體中之每一者均包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，編碼部分中之每一者為至少30個胺基酸(例如。約30個胺基酸至約1600個胺基酸，或本文所述此範圍中之任何亞範圍)。
在一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，該等編碼部分中之每一者編碼SEQ ID NO: 12中之至少一個外顯子及至少一個內含子(例如，至少兩個外顯子及至少一個內含子，至少兩個外顯子及至少兩個內含子，至少三個外顯子至少一個內含子，至少三個外顯子及至少兩個內含子或至少三個外顯子及至少三個內含子)。在一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，該等編碼部分中之每一者編碼SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的高達80% (例如，SEQ ID NO: 5之高達10%、高達20%、高達30%、高達40%、高達50%、高達60%或高達70%)，使得編碼部分中之每一者不重疊。在一些實施例中，至少兩種不同載體中之每一者包括編碼耳畸蛋白之蛋白之不同部分的編碼序列，該等編碼部分中之每一者編碼SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的高達80% (例如，SEQ ID NO: 5之高達10%、高達20%、高達30%、高達40%、高達50%、高達60%或高達70%)，使得編碼部分中之每一者不重疊。
如實例18中所述，至少兩種核酸載體中之每一者還可包括反向末端重複序列(ITR)以允許頭至尾重組。隨後經由剪接移除ITR。ITR及剪接受體及/或供體訊號之實例為此項技術中所已知，且已在實例18中描述。
此等方法已用於改良五隻動物之聽力。圖15及圖16中之資料展示，投與圖2中所示之載體的Otof-/- 小鼠恢復Otof-/- 小鼠之IHC中的耳畸蛋白活性。實例 21 ：使用兩種載體活體外表現全長人類耳畸蛋白
產生各種不同載體，其各自包括如下編碼耳畸蛋白之一部分的核酸序列：p109 (SEQ ID NO: 84)，其如圖38中所示；p105 (SEQ ID NO: 85)，其如圖39中所示；WPRE，其如圖40中所示；p108，其如圖41中所示；1OTOF18.CL1，其如圖42中所示；19OTOF48，其如圖43中所示；1OTOF20.CL1，其如圖44中所示；21OTOF48.WPRE，其如圖45中所示；1OTOF21.CL1，其如圖46中所示；及 22OTOF48.WPRE，其如圖47中所示；105.pA.NTF3.CMVd，其如圖48中所示。
使用此等載體對轉染HEK293FT細胞。在此等實驗中，將1.2 x 105 個細胞/孔在37℃及5% CO2 下接種於24孔板中隔夜。第二天，使用JetPrime試劑(Polyplus)將含ITR線性化質體對(圖49中所示之對)轉染至HEK293FT細胞中。轉染後72小時，收穫細胞且使用RIPA緩衝液裂解，且在4-12% Bolt蛋白凝膠中分析。將凝膠轉移至硝酸纖維素膜上，且用抗OTOF多株抗體(Thermo PA5-52935)進行印跡分析。將抗人類β-肌動蛋白單株抗體用作一級抗體以用於泳道之間的內部裝載控制。進行三個獨立活體外實驗，以使用各種重組策略相對於單一質體CMV.fl-OTOF轉染(泳道10)分析且比較全長蛋白之表現。
與陰性對照相比，除第6號泳道外之每個泳道中均觀察到全長耳畸蛋白之蛋白的表現(約226 kD)(圖50及圖51)。實例 22 ：使用兩種載體活體內恢復 OTOF-/- 小鼠之聽力功能
進行一組實驗，以判定耳蝸中引入兩種載體(分別p109及p105；SEQ ID NO: 84及85)之Otof-/- 小鼠的聽力功能是否可恢復。簡言之，在出生後約第6-7天(P6-7)，經由覆蓋圓窗膜(RWM)之聽覺鼓泡將病毒製劑(例如，1-2 x 1010 vg/μL)注射至左耳蝸之鼓階中。參見例如，Jung等人，(2015)EMBO J 34: 2686-2702，及Al-Moyed等人，(2019)EMBO Molecular Medicine 11(1). pii: e9396。在注射前，將所有小鼠經由異氟烷麻醉，且在耳後切口之前，例如藉由賽羅卡因(xylocaine)泵噴霧術進行局部麻醉。
記錄經受4、6、8、12、16、24或32 kHz短純音(例如，10 ms平穩，1 ms cos2 上升/下降或以20 Hz呈現之0.03 ms寬頻短音刺激)之約3至4週齡經麻醉小鼠的聽覺腦幹反應(ABR)。參見例如，Jing等人，(2013)J Neurosci 33: 4456-4467。將經注射耳用電極凝膠堵塞，而記錄對側未注射耳之ABR。
測定ABR短音臨限值作為引起可再現ABR波反應所必需之最低音壓級，且以10分貝音壓級(dB SPL)步長自30 dB SPL至100 dB SPL進行量測。以10 dB SPL步長自最低可再現ABR以下10 dB SPL至最高90 dB SPL記錄短純音臨限值。ABR波I定義為總和感受器電位(SP)與顯著ABR波II峰之間的第一個可區分峰。各ABR波之振幅的計算方式為波最高點與後續局部最小值之間的差。藉由將ABR波I-V之個別振幅值相加來計算總ABR波I-V振幅。
在未處理野生型小鼠、未處理Otof-/- 及用兩種載體(p109及p105)處理之Otof-/- 小鼠中確定短音ABR臨限值及短純音ABR臨限值。在投與後第26-28天及第91天，在經處理Otof-/- 中測試聽力功能。資料展示，與未處理Otof-/- 小鼠相比，用兩種載體處理後，Otof-/- 小鼠展現聽力功能顯著改良(圖51及圖52)。實例 23 ：使用兩種載體活體內恢復人類個體之聽力功能
進行一組實驗，以判定耳蝸中引入兩種載體(分別p109及p105；SEQ ID NO: 84及85)之人類個體的聽力功能是否可恢復。在投與後15、30、45、60及90天在人類個體中測試聽力功能，且將其與未接受治療之人類個體的功能聽力比較。實例 24 ：使用兩種載體活體外表現全長人類耳畸蛋白
與其他雙重載體方法一樣，將各自包含全長轉錄本之一部分的兩個轉殖基因包裝在單獨之載體中，且一起提供以接觸標靶，例如，例如有需要之個體中的標靶細胞群體。本實例提供一組載體，其經產生以各自包括包含人類耳畸蛋白(OTOF )基因或OTOF cDNA之編碼序列的一部分的核酸序列。「上游」 AKhOTOF5載體之整體結構及組分如圖79中所示。完整5'ITR至3'ITR序列由SEQ ID NO: 96表示。下表1中以在5'ITR至3'ITR中發現之順序提供個別組分之序列。「下游」 AKhOTOF3載體之整體結構及組分如圖80中所示。完整5'ITR至3'ITR序列由SEQ ID NO: 105表示。下表2中以在5'ITR至3'ITR中發現之順序提供個別組分之序列。雙重AAV載體系統之示意圖如圖78中所示。Anc80衣殼(SEQ ID NO: 109；參見下表3)獨立地殼體化上游載體(Anc80.AKhOTOF5)及下游載體(Anc80.AKhOTOF3)。在一些實施例中，當向有需要之個體投與上游及下游載體中之每一者時，構築體在既定細胞內多聯化。在一些此類實施例中，表現多聯化全長OTOF且產生功能耳畸蛋白之蛋白。
此等載體之對用於治療罹患或易患聽力損失之人類個體。將包含雙重AAV載體系統之兩種載體Anc80.AKhOTOF5及Anc80.AKhOTOF3之組成物引入人類個體之至少一個耳蝸中。在投與後15、30、45、60及90天在人類個體中測試聽力功能，且將其與接受治療前之人類個體或與未接受治療之人類個體的功能聽力比較。 AKhOTOF5
AKhOTOF5構築體包含兩個ITR (SEQ ID NO: 97及104)、CAG啟動子(由SEQ ID NO: 98、99及100鑑別，其分別包含CMV早期增強子元件、雞β肌動蛋白基因序列及包含來自兔β球蛋白基因之3'剪接序列的嵌合內含子)、5'OTOF編碼區(SEQ ID NO: 101)、SD內含子序列(SEQ ID NO: 102)及AK致重組序列(SEQ ID NO: 103)。全長AKhOTOF5由SEQ ID NO: 96表示。表 1. AKhOTOF5
名稱 序列 SEQ ID NO
AKhOTOF5 TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTTGTCGACGCGGCCGCACGCGTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGACCGGTGCCACCATGGCCTTGCTCATCCACCTCAAGACAGTCTCGGAGCTGCGGGGCAGGGGCGACCGGATCGCCAAAGTGACTTTCCGAGGGCAATCCTTCTACTCTCGGGTCCTGGAGAACTGTGAGGATGTGGCTGACTTTGATGAGACATTTCGGTGGCCGGTGGCCAGCAGCATCGACAGAAATGAGATGCTGGAGATTCAGGTTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTCATCGGGACCTTCCGCATGGTGCTGCAGAAGGTGGTAGAGGAGAGCCATGTGGAGGTGACTGACACGCTGATTGATGACAACAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGTGCGTGGAGGTCCGGTATCAGGCCACTGACGGCACAGTGGGCTCCTGGGACGATGGGGACTTCCTGGGAGATGAGTCTCTTCAAGAGGAAGAGAAGGACAGCCAAGAGACGGATGGACTGCTCCCAGGCTCCCGGCCCAGCTCCCGGCCCCCAGGAGAGAAGAGCTTCCGGAGAGCCGGGAGGAGCGTGTTCTCCGCCATGAAGCTCGGCAAAAACAGGTCTCACAAGGAGGAGCCCCAAAGACCAGATGAACCGGCGGTGCTGGAGATGGAAGACCTTGACCATCTGGCCATTCGGCTAGGAGATGGACTGGATCCCGACTCGGTGTCTCTAGCCTCAGTCACAGCTCTCACCACTAATGTCTCCAACAAGCGATCTAAGCCAGACATTAAGATGGAGCCAAGTGCTGGGCGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACGGTGATCGAGGCCCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGCGTGGAGGTGGGTGACGACAAGAAGTACACATCCATGAAGGAGTCCACTAACTGCCCCTATTACAACGAGTACTTCGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCGGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATTTCGGTGATTCACTCCAAGAACCTGCTGCGCAGTGGCACCCTGGTGGGCTCCTTCAAAATGGACGTGGGAACCGTGTACTCGCAGCCAGAGCACCAGTTCCATCACAAGTGGGCCATCCTGTCTGACCCCGATGACATCTCCTCGGGGCTGAAGGGCTACGTGAAGTGTGACGTTGCCGTGGTGGGCAAAGGGGACAACATCAAGACGCCCCACAAGGCCAATGAGACCGACGAAGATGACATTGAGGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGGGTGCCCCCCGAACGCCAGTGGGCCCGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGGCTGCCCCGTATGAACACAAGCCTCATGGCCAATGTAAAGAAGGCTTTCATCGGTGAAAACAAGGACCTCGTGGACCCCTACGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGCCAGAAGGGCAAGACTTCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCCCTGTGGAATGAGCAGGTCGTCTTTACAGACCTCTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGAGACTCGGACAAGGTCAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTCATTGACCTGCGCAAGATTTCTAATGACGGAGACAAAGGCTTCCTGCCCACACTGGGCCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACACGTAACTACACGCTGCTGGATGAGCATCAGGACCTGAACGAGGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGGCTCCTGCTGGGCCTGGCTGTGGAGATCGTAGACACCTCCAACCCTGAGCTCACCAGCTCCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCCATCTCGGAGAGCTGTGCAGGTAAAATGGAAGAATTCTTTCTCTTTGGAGCCTTCCTGGAGGCCTCAATGATCGACCGGAGAAACGGAGACAAGCCCATCACCTTTGAGGTCACCATAGGCAACTATGGGAACGAAGTTGATGGCCTGTCCCGGCCCCAGCGGCCTCGGCCCCGGAAGGAGCCGGGGGATGAGGAAGAAGTAGACCTGATTCAGAACGCAAGTGATGACGAGGCCGGTGATGCCGGGGACCTGGCCTCAGTCTCCTCCACTCCACCAATGCGGCCCCAGGTCACCGACAGGAACTACTTCCATCTGCCCTACCTGGAGCGAAAGCCCTGCATCTACATCAAGAGCTGGTGGCCGGACCAGCGCCGCCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGACCACATTGCCGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAACGACATACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCTGAGCGTCGCCTGCGGGGCGTCCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGCCGCTTCCTCTCCCTCGCTGACAAGGACCAGGGCCACTCATCCCGCACCAGGCTTGACCGGGAGCGCCTCAAGTCCTGCATGAGGGAGCTGGAAAACATGGGGCAGCAGGCCAGGATGCTGCGGGCCCAGGTGAAGCGGCACACGGTGCGGGACAAGCTGAGGCTGTGCCAGAACTTCCTGCAGAAGCTGCGCTTCCTGGCGGACGAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCCTAGGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA    96
5'ITR TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 97
CMV增強子 GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG 98
CBA基因序列 GTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG 99
嵌合內含子 GGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG 100
5'OTOF ATGGCCTTGCTCATCCACCTCAAGACAGTCTCGGAGCTGCGGGGCAGGGGCGACCGGATCGCCAAAGTGACTTTCCGAGGGCAATCCTTCTACTCTCGGGTCCTGGAGAACTGTGAGGATGTGGCTGACTTTGATGAGACATTTCGGTGGCCGGTGGCCAGCAGCATCGACAGAAATGAGATGCTGGAGATTCAGGTTTTCAACTACAGCAAAGTCTTCAGCAACAAGCTCATCGGGACCTTCCGCATGGTGCTGCAGAAGGTGGTAGAGGAGAGCCATGTGGAGGTGACTGACACGCTGATTGATGACAACAATGCTATCATCAAGACCAGCCTGTGCGTGGAGGTCCGGTATCAGGCCACTGACGGCACAGTGGGCTCCTGGGACGATGGGGACTTCCTGGGAGATGAGTCTCTTCAAGAGGAAGAGAAGGACAGCCAAGAGACGGATGGACTGCTCCCAGGCTCCCGGCCCAGCTCCCGGCCCCCAGGAGAGAAGAGCTTCCGGAGAGCCGGGAGGAGCGTGTTCTCCGCCATGAAGCTCGGCAAAAACAGGTCTCACAAGGAGGAGCCCCAAAGACCAGATGAACCGGCGGTGCTGGAGATGGAAGACCTTGACCATCTGGCCATTCGGCTAGGAGATGGACTGGATCCCGACTCGGTGTCTCTAGCCTCAGTCACAGCTCTCACCACTAATGTCTCCAACAAGCGATCTAAGCCAGACATTAAGATGGAGCCAAGTGCTGGGCGGCCCATGGATTACCAGGTCAGCATCACGGTGATCGAGGCCCGGCAGCTGGTGGGCTTGAACATGGACCCTGTGGTGTGCGTGGAGGTGGGTGACGACAAGAAGTACACATCCATGAAGGAGTCCACTAACTGCCCCTATTACAACGAGTACTTCGTCTTCGACTTCCATGTCTCTCCGGATGTCATGTTTGACAAGATCATCAAGATTTCGGTGATTCACTCCAAGAACCTGCTGCGCAGTGGCACCCTGGTGGGCTCCTTCAAAATGGACGTGGGAACCGTGTACTCGCAGCCAGAGCACCAGTTCCATCACAAGTGGGCCATCCTGTCTGACCCCGATGACATCTCCTCGGGGCTGAAGGGCTACGTGAAGTGTGACGTTGCCGTGGTGGGCAAAGGGGACAACATCAAGACGCCCCACAAGGCCAATGAGACCGACGAAGATGACATTGAGGGGAACTTGCTGCTCCCCGAGGGGGTGCCCCCCGAACGCCAGTGGGCCCGGTTCTATGTGAAAATTTACCGAGCAGAGGGGCTGCCCCGTATGAACACAAGCCTCATGGCCAATGTAAAGAAGGCTTTCATCGGTGAAAACAAGGACCTCGTGGACCCCTACGTGCAAGTCTTCTTTGCTGGCCAGAAGGGCAAGACTTCAGTGCAGAAGAGCAGCTATGAGCCCCTGTGGAATGAGCAGGTCGTCTTTACAGACCTCTTCCCCCCACTCTGCAAACGCATGAAGGTGCAGATCCGAGACTCGGACAAGGTCAACGACGTGGCCATCGGCACCCACTTCATTGACCTGCGCAAGATTTCTAATGACGGAGACAAAGGCTTCCTGCCCACACTGGGCCCAGCCTGGGTGAACATGTACGGCTCCACACGTAACTACACGCTGCTGGATGAGCATCAGGACCTGAACGAGGGCCTGGGGGAGGGTGTGTCCTTCCGGGCCCGGCTCCTGCTGGGCCTGGCTGTGGAGATCGTAGACACCTCCAACCCTGAGCTCACCAGCTCCACAGAGGTGCAGGTGGAGCAGGCCACGCCCATCTCGGAGAGCTGTGCAGGTAAAATGGAAGAATTCTTTCTCTTTGGAGCCTTCCTGGAGGCCTCAATGATCGACCGGAGAAACGGAGACAAGCCCATCACCTTTGAGGTCACCATAGGCAACTATGGGAACGAAGTTGATGGCCTGTCCCGGCCCCAGCGGCCTCGGCCCCGGAAGGAGCCGGGGGATGAGGAAGAAGTAGACCTGATTCAGAACGCAAGTGATGACGAGGCCGGTGATGCCGGGGACCTGGCCTCAGTCTCCTCCACTCCACCAATGCGGCCCCAGGTCACCGACAGGAACTACTTCCATCTGCCCTACCTGGAGCGAAAGCCCTGCATCTACATCAAGAGCTGGTGGCCGGACCAGCGCCGCCGCCTCTACAATGCCAACATCATGGACCACATTGCCGACAAGCTGGAAGAAGGCCTGAACGACATACAGGAGATGATCAAAACGGAGAAGTCCTACCCTGAGCGTCGCCTGCGGGGCGTCCTGGAGGAGCTGAGCTGTGGCTGCTGCCGCTTCCTCTCCCTCGCTGACAAGGACCAGGGCCACTCATCCCGCACCAGGCTTGACCGGGAGCGCCTCAAGTCCTGCATGAGGGAGCTGGAAAACATGGGGCAGCAGGCCAGGATGCTGCGGGCCCAGGTGAAGCGGCACACGGTGCGGGACAAGCTGAGGCTGTGCCAGAACTTCCTGCAGAAGCTGCGCTTCCTGGCGGACGAG 101
SD內含子 GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT 102
AK GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT 103
3'ITR AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA 104
AKhOTOF3
AKhOTOF3構築體包含兩個ITR (SEQ ID NO: 97及104)、AK致重組序列(SEQ ID NO: 103)、SA內含子序列(SEQ ID NO: 106)、3'OTOF編碼區(SEQ ID NO: 107)及bgH polyA序列(SEQ ID NO: 108)。全長AKhOTOF3由SEQ ID NO: 105表示。表 2. AKhOTOF3
名稱 序列 SEQ ID NO
AKhOTOF3 TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTTGTCGACGCGGCCGCACGCGTGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGCCCCAGCACAGCATTCCCGACATCTTCATCTGGATGATGAGCAACAACAAGCGTGTCGCCTATGCCCGTGTGCCCTCCAAGGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAGACTGGCAAGGACTGCGCCAAGGTCAAGACGCTCTTCCTTAAGCTGCCAGGGAAGCGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTGCAGGCCAAGGTGGAGCTGTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAACAGCGCAAGGAGTTCCTGTGCGGCCTGCCCTGTGGCTTCCAGGAGGTCAAGGCAGCCCAGGGCCTGGGCCTGCATGCCTTCCCACCCGTCAGCCTGGTCTACACCAAGAAGCAGGCGTTCCAGCTCCGAGCGCACATGTACCAGGCCCGCAGCCTCTTTGCCGCCGACAGCAGCGGACTCTCAGACCCCTTTGCCCGCGTCTTCTTCATCAATCAGAGTCAGTGCACAGAGGTGCTGAATGAGACCCTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTGTTCGACAACCTGGAGCTCTATGGTGAAGCTCATGAGCTGAGGGACGATCCGCCCATCATTGTCATTGAAATCTATGACCAGGATTCCATGGGCAAAGCTGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAACCCCTGGTGAAGATGGCAGACGAGGCGTACTGCCCACCCCGCTTCCCACCTCAGCTCGAGTACTACCAGATCTACCGTGGCAACGCCACAGCTGGAGACCTGCTGGCGGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGACCAGCAGGGAAGGCTGACCTGCCCCCCATCAATGGCCCGGTGGACGTGGACCGAGGTCCCATCATGCCCGTGCCCATGGGCATCCGGCCCGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTACGGGACCTAAAGCGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGGCCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGGAAGGGGGTGCAGTCGTCCCTGATCCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACCCTCGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCAGAGAACGAGCTGCTGCACCCGCCCTTGAACATCCGTGTGGTGGACTGCCGGGCCTTCGGTCGCTACACACTGGTGGGCTCCCATGCCGTCAGCTCCCTGCGACGCTTCATCTACCGGCCCCCAGACCGCTCGGCCCCCAGCTGGAACACCACGGTCAGGCTTCTCCGGCGCTGCCGTGTGCTGTGCAATGGGGGCTCCTCCTCTCACTCCACAGGGGAGGTTGTGGTGACTATGGAGCCAGAGGTACCCATCAAGAAACTGGAGACCATGGTGAAGCTGGACGCGACTTCTGAAGCTGTTGTCAAGGTGGATGTGGCTGAGGAGGAGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGCACTGCGGAGGAGCCAGAGGAGGAGGAGCCAGACGAGAGCATGCTGGACTGGTGGTCCAAGTACTTTGCCTCCATTGACACCATGAAGGAGCAACTTCGACAACAAGAGCCCTCTGGAATTGACTTGGAGGAGAAGGAGGAAGTGGACAATACCGAGGGCCTGAAGGGGTCAATGAAGGGCAAGGAGAAGGCAAGGGCTGCCAAAGAGGAGAAGAAGAAGAAAACTCAGAGCTCTGGCTCTGGCCAGGGGTCCGAGGCCCCCGAGAAGAAGAAACCCAAGATTGATGAGCTTAAGGTATACCCCAAAGAGCTGGAGTCCGAGTTTGATAACTTTGAGGACTGGCTGCACACTTTCAACTTGCTTCGGGGCAAGACCGGGGATGATGAGGATGGCTCCACCGAGGAGGAGCGCATTGTGGGACGCTTCAAGGGCTCCCTCTGCGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAGGACGTGTCCCGGGAAGCCGGCTACGACTCCACCTACGGCATGTTCCAGGGCATCCCGAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAGTCTATGTGGTCCGGGCCACGGACCTGCACCCTGCTGACATCAACGGCAAAGCTGACCCCTACATCGCCATCCGGCTAGGCAAGACTGACATCCGCGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTCTTTGGGAAGTCCTTTGACATCGAGGCCTCCTTCCCCATGGAATCCATGCTGACGGTGGCTGTGTATGACTGGGACCTGGTGGGCACTGATGACCTCATTGGGGAAACCAAGATCGACCTGGAGAACCGCTTCTACAGCAAGCACCGCGCCACCTGCGGCATCGCCCAGACCTACTCCACACATGGCTACAATATCTGGCGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACCCGCCTCTGCAAAGACGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGGCCCCCTGGGAGAGTGAAGGTGGCCAACCGCGTCTTCACTGGGCCCTCTGAGATTGAGGACGAGAACGGTCAGAGGAAGCCCACAGACGAGCATGTGGCGCTGTTGGCCCTGAGGCACTGGGAGGACATCCCCCGCGCAGGCTGCCGCCTGGTGCCAGAGCATGTGGAGACGAGGCCGCTGCTCAACCCCGACAAGCCGGGCATCGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACGCCTCTGGACATCTCACCTCGGAAGCCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCATCTGGAACACAGATGAGGTGGTCTTGGAGGACGACGACTTCTTCACAGGGGAGAAGTCCAGTGACATCTTCGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAGCAGGACACAGACGTCCACTACCACTCCCTCACTGGCGAGGGCAACTTCAACTGGCGCTACCTGTTCCCCTTCGACTACCTGGCGGCGGAGGAGAAGATCGTCATCTCCAAGAAGGAGTCCATGTTCTCCTGGGACGAGACCGAGTACAAGATCCCCGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGATGCGGACCACTTCTCCGCTGACGACTTCCTGGGGGCCATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGCGGGGCGCAAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTGCCCCTCGTGTCCATCTTCAAGCAAAAGCGCGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAACGATGAGTTTGAGCTCACGGGCAAGGTGGAGGCTGAGCTGCATTTACTGACAGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCAGTGGGCCTGGCCCGCAATGAACCTGACCCCCTAGAGAAACCCAACCGGCCCGACACGGCCTTCGTCTGGTTCCTCAACCCTCTCAAGTCCATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTCATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGTTGGGGCTGCTCATGTTGGGGCTCTTCCTCTACAGCCTCCCTGGCTACATGGTCAAAAAGCTCCTTGGGGCATGAACTAGTGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAAGCTTGAATTCAGCTGACGTGCCTCGGACCGCCTAGGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA 105
5'ITR TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 97
AK GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAAT 103
SA內含子 GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG 106
3'OTOF CCCCAGCACAGCATTCCCGACATCTTCATCTGGATGATGAGCAACAACAAGCGTGTCGCCTATGCCCGTGTGCCCTCCAAGGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAGACTGGCAAGGACTGCGCCAAGGTCAAGACGCTCTTCCTTAAGCTGCCAGGGAAGCGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTGCAGGCCAAGGTGGAGCTGTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAACAGCGCAAGGAGTTCCTGTGCGGCCTGCCCTGTGGCTTCCAGGAGGTCAAGGCAGCCCAGGGCCTGGGCCTGCATGCCTTCCCACCCGTCAGCCTGGTCTACACCAAGAAGCAGGCGTTCCAGCTCCGAGCGCACATGTACCAGGCCCGCAGCCTCTTTGCCGCCGACAGCAGCGGACTCTCAGACCCCTTTGCCCGCGTCTTCTTCATCAATCAGAGTCAGTGCACAGAGGTGCTGAATGAGACCCTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTGTTCGACAACCTGGAGCTCTATGGTGAAGCTCATGAGCTGAGGGACGATCCGCCCATCATTGTCATTGAAATCTATGACCAGGATTCCATGGGCAAAGCTGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAACCCCTGGTGAAGATGGCAGACGAGGCGTACTGCCCACCCCGCTTCCCACCTCAGCTCGAGTACTACCAGATCTACCGTGGCAACGCCACAGCTGGAGACCTGCTGGCGGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGACCAGCAGGGAAGGCTGACCTGCCCCCCATCAATGGCCCGGTGGACGTGGACCGAGGTCCCATCATGCCCGTGCCCATGGGCATCCGGCCCGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTACGGGACCTAAAGCGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGGCCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGGAAGGGGGTGCAGTCGTCCCTGATCCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACCCTCGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCAGAGAACGAGCTGCTGCACCCGCCCTTGAACATCCGTGTGGTGGACTGCCGGGCCTTCGGTCGCTACACACTGGTGGGCTCCCATGCCGTCAGCTCCCTGCGACGCTTCATCTACCGGCCCCCAGACCGCTCGGCCCCCAGCTGGAACACCACGGTCAGGCTTCTCCGGCGCTGCCGTGTGCTGTGCAATGGGGGCTCCTCCTCTCACTCCACAGGGGAGGTTGTGGTGACTATGGAGCCAGAGGTACCCATCAAGAAACTGGAGACCATGGTGAAGCTGGACGCGACTTCTGAAGCTGTTGTCAAGGTGGATGTGGCTGAGGAGGAGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGCACTGCGGAGGAGCCAGAGGAGGAGGAGCCAGACGAGAGCATGCTGGACTGGTGGTCCAAGTACTTTGCCTCCATTGACACCATGAAGGAGCAACTTCGACAACAAGAGCCCTCTGGAATTGACTTGGAGGAGAAGGAGGAAGTGGACAATACCGAGGGCCTGAAGGGGTCAATGAAGGGCAAGGAGAAGGCAAGGGCTGCCAAAGAGGAGAAGAAGAAGAAAACTCAGAGCTCTGGCTCTGGCCAGGGGTCCGAGGCCCCCGAGAAGAAGAAACCCAAGATTGATGAGCTTAAGGTATACCCCAAAGAGCTGGAGTCCGAGTTTGATAACTTTGAGGACTGGCTGCACACTTTCAACTTGCTTCGGGGCAAGACCGGGGATGATGAGGATGGCTCCACCGAGGAGGAGCGCATTGTGGGACGCTTCAAGGGCTCCCTCTGCGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAGGACGTGTCCCGGGAAGCCGGCTACGACTCCACCTACGGCATGTTCCAGGGCATCCCGAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAGTCTATGTGGTCCGGGCCACGGACCTGCACCCTGCTGACATCAACGGCAAAGCTGACCCCTACATCGCCATCCGGCTAGGCAAGACTGACATCCGCGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTCTTTGGGAAGTCCTTTGACATCGAGGCCTCCTTCCCCATGGAATCCATGCTGACGGTGGCTGTGTATGACTGGGACCTGGTGGGCACTGATGACCTCATTGGGGAAACCAAGATCGACCTGGAGAACCGCTTCTACAGCAAGCACCGCGCCACCTGCGGCATCGCCCAGACCTACTCCACACATGGCTACAATATCTGGCGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACCCGCCTCTGCAAAGACGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGGCCCCCTGGGAGAGTGAAGGTGGCCAACCGCGTCTTCACTGGGCCCTCTGAGATTGAGGACGAGAACGGTCAGAGGAAGCCCACAGACGAGCATGTGGCGCTGTTGGCCCTGAGGCACTGGGAGGACATCCCCCGCGCAGGCTGCCGCCTGGTGCCAGAGCATGTGGAGACGAGGCCGCTGCTCAACCCCGACAAGCCGGGCATCGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACGCCTCTGGACATCTCACCTCGGAAGCCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCATCTGGAACACAGATGAGGTGGTCTTGGAGGACGACGACTTCTTCACAGGGGAGAAGTCCAGTGACATCTTCGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAGCAGGACACAGACGTCCACTACCACTCCCTCACTGGCGAGGGCAACTTCAACTGGCGCTACCTGTTCCCCTTCGACTACCTGGCGGCGGAGGAGAAGATCGTCATCTCCAAGAAGGAGTCCATGTTCTCCTGGGACGAGACCGAGTACAAGATCCCCGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGATGCGGACCACTTCTCCGCTGACGACTTCCTGGGGGCCATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGCGGGGCGCAAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTGCCCCTCGTGTCCATCTTCAAGCAAAAGCGCGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAACGATGAGTTTGAGCTCACGGGCAAGGTGGAGGCTGAGCTGCATTTACTGACAGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCAGTGGGCCTGGCCCGCAATGAACCTGACCCCCTAGAGAAACCCAACCGGCCCGACACGGCCTTCGTCTGGTTCCTCAACCCTCTCAAGTCCATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTCATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGTTGGGGCTGCTCATGTTGGGGCTCTTCCTCTACAGCCTCCCTGGCTACATGGTCAAAAAGCTCCTTGGGGCA 107
bGHpA CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG 108
3'ITR AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA 104
表 3. Anc80L65
名稱 序列 SEQ ID NO
Anc80L65 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGSNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLNFKLFNIQVKEVTTNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTSGTAGNRTLQFSQAGPSSMANQAKNWLPGPCYRQQRVSKTTNQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMATHKDDEDKFFPMSGVLIFGKQGAGNSNVDLDNVMITNEEEIKTTNPVATEEYGTVATNLQSANTAPATGTVNSQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSTNVDFAVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*    109
其他實施例
應瞭解，已使用之詞語為描述性而非限制性詞語，且在較寬泛態樣中不背離本揭示案之真實範圍及精神的情況下可在隨附申請專利範圍之範圍內進行改變。
儘管已以一定長度且以關於數個所述實施例之一定特定性描述本揭示案，但預期不應將本揭示案限於任何此類特例或實施例或任何特定實施例，而是應當參考隨附申請專利範圍來解釋，以便鑒於先前技術提供此類申請專利範圍之最寬泛可能解釋，從而有效涵蓋本揭示案之預期範圍。
應瞭解，儘管已結合本揭示案之詳細描述描述本揭示案，但前述描述意欲說明而非限制本揭示案之範圍，本揭示案之範圍由隨附申請專利範圍之範圍界定。其他態樣、優點及修改在以下申請專利範圍之範圍內。
本文提及之所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻皆以全文引用之方式併入。在衝突之情況下，以本說明書(包括定義)為準。另外，章節標題、材料、方法及實例僅為說明性的，且不欲為限制性的。
10:裝置 11:尺寸 12:滾花手柄 13:尺寸 14:遠端手柄黏合劑 15:尺寸 16:近端手柄黏合劑 17:尺寸 18:近端 20:遠端 22:應變消除特徵 23:錐形部分 24:伸縮式海波管針支架 26:針子總成/彎針子總成/尖端總成 28:塞子 32:彎曲部分 34:成角度尖端/成角度頂部 36:管 38:彎針/針 42A:嵌套海波管 42B:嵌套海波管 42C:嵌套海波管 46:角 48:高度 52:長度
圖1為用於使用反式剪切方法在內毛細胞(IHC)中進行雙重AAV轉導之5'及3'載體的遺傳圖的例示性示意圖。在5'載體中，CMV增強子(CMVe)及人類β-肌動蛋白啟動子(hbA)驅動編碼eGFP及P2A肽之mRNA的轉錄，該mRNA在轉譯期間裂解。5'載體亦含有編碼耳畸蛋白之N末端部分的cDNA及剪接供體位點(SD)。SD DNA序列由Trapani等人，(2014)EMBO Mol Med 6 194-211提供。在3'載體中，在第一反向末端重複序列(ITR)後且在耳畸蛋白編碼序列之3'部分前次選殖了剪接受體位點(SA)。其後為mRNA穩定序列，即土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)及聚腺苷酸化訊號(pA)。 圖2為用於使用雜交方法在IHC中進行雙重AAV轉導之5'及3'載體的遺傳圖的例示性示意圖。除圖1中所述之元件外，在'5載體之3'末端及3'載體之5'末端包括來自F1噬菌體之高度致重組序列(AK)序列，以促使正確地組裝載體(Trapani等人. (2014) EMBO Mol Med 6 194-211)。 圖3為展示以下中之聽覺腦幹反應(ABR)振幅隨時間變化的圖：未轉導Otof-/- 小鼠(n = 25；細黑色線)及雙重AAV介導之耳畸蛋白表現後之Otof-/- 小鼠(n = 14；灰色線代表個別動物，黑色粗線為所有動物之平均反應)。 圖4為展示以下中之ABR振幅隨時間變化的圖：未轉導Otof-/- 小鼠(n = 25；長虛線)、雙重AAV介導之耳畸蛋白表現後之Otof-/- 小鼠(n = 14；短虛線)及用具有增強之綠色螢光蛋白(eGFP)之雙重AAV轉導後的野生型Otofwt/wt 小鼠(n = 5；黑色細線代表個別動物，黑色粗線為所有動物之平均振幅)。 圖5為展示ABR臨限值(dB SPL)響應於純音或短音刺激隨頻率(kHz)變化之例示性圖。呈現以下之響應於純音或短音刺激的可偵測到波時之最小音壓級(SPL)：具有雙重AAV介導之耳畸蛋白表現的個別Otof-/- 動物(白色圓圈代表個別動物，填充對角線之圓圈為所有動物之平均臨限值)、未轉導Otof-/- 動物(黑色圓圈)及用具有eGFP之雙重AAV轉導之Otofwt/wt 動物(填充方格之圓圈)。 圖6為展示藉由使用兩種不同抗體進行免疫組織化學測定之沿耳蝸(例如，整個柯蒂氏器(Corti)、頂端及中基端/基端)的IHC之轉導率的圖，該兩種不同抗體一者結合N末端耳畸蛋白片段，且另一者恰結合耳畸蛋白之C末端部分。 圖7為雙重AAV介導之耳畸蛋白表現後，Otof-/- 小鼠之一個柯蒂氏器(organ of Corti)的一組免疫組織化學影像。將鈣結合蛋白用作內及外毛細胞之標記物。表現eGFP之細胞指示至少5'病毒之病毒轉導。左圖及中圖展示耳畸蛋白N末端半部分中之抗耳畸蛋白抗體染色(Abcam)。右圖展示C末端抗耳畸蛋白抗體染色(Synaptic Systems)。綜上，所有三張圖均展現全長耳畸蛋白在IHC中表現。重要地，儘管AAV在柯蒂氏器中轉導多種細胞類型(由eGFP螢光指示)，但耳畸蛋白表現僅限於內毛細胞。比例尺：100 µm。 圖8為展示以下之Ca2+ 電流隨去極化刺激變化之圖：Otof-/- IHC (白色；n=10)、雙重AAV介導之耳畸蛋白表現後的Otof-/- IHC (對角線；n = 8)及來自背景匹配之對照動物的野生型IHC (黑色；n = 6)。 圖9為展示以下中之質膜電容(ΔCm )隨去極化持續時間變化的圖：Otof-/- 小鼠之經雙重AAV轉導之IHC (黑色線，個別IHC；填充對角線之菱形：平均值± s.e.m；n = 8)；來自經注射Otof-/- 小鼠之經兩種個別雙重AAV轉導之IHC(虛線)，其僅呈現少量胞吐作用；及背景匹配之野生型對照(黑色菱形；n = 6)。來自Strenzke等人，(2016) EMBO J. 35 2519-2535之野生型數據以黑色圓圈展示以供比較。 圖10為展示以下中之Qreal隨去極化持續時間(ms)變化的代表性圖：Otof-/- IHC (白色菱形)、Otof-/- 小鼠之經雙重AAV轉導之IHC (黑色圓圈)及背景匹配之野生型對照(黑色菱形)。 圖11為pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB之代表性質體圖。 圖12為pAAV-SA-3'mOTOF-EWB之代表性質體圖。 圖13為pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD之代表性質體圖。 圖14為pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK之代表性質體圖。 圖15為展示以下中之質膜電容(ΔCm)隨去極化持續時間變化的圖：用圖2所示之兩種載體轉導之Otof-/- 小鼠的IHC (中等陰影；粗線)、野生型小鼠中之IHC (深色陰影；中等粗線)及Otof-/- 小鼠中之IHC。 圖16為展示以下中之Qreal隨去極化持續時間(ms)變化的代表性圖：Otof-/- IHC (白色菱形)、用圖2所示之兩種載體轉導之Otof-/- 小鼠的IHC (灰色菱形)及背景匹配之野生型對照的IHC (黑色菱形)。 圖17為pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB之代表性質體圖。 圖18為pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD之代表性質體圖。 圖19為pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK之代表性質體圖。 圖20為pAAV-SA-3'mOTOF-EWB之代表性質體圖。 圖21為pAKOS102 (SEQ ID NO: 43)之一部分的代表性示意圖。 圖22為pAKOS103 (SEQ ID NO: 44)之一部分的代表性示意圖。 圖23為pAKOS103之一部分的代表性示意圖。 圖24為pAKOS104 (SEQ ID NO: 45)之代表性質體圖。 圖25為pAKOS104-DHFR (SEQ ID NO: 46)之一部分的代表性示意圖。 圖26為pAKOS104-DHFR之一部分的代表性示意圖。 圖27为pAKOS105 (SEQ ID NO: 47)之一部分的代表性示意圖。 圖28為pAKOS105之一部分的代表性示意圖。 圖29為pAKOS105_GFP (SEQ ID NO: 48)之一部分的代表性示意圖。 圖30為pAKOS106 (SEQ ID NO: 49)之一部分的代表性示意圖。 圖31為pAKOS106之一部分的代表性示意圖。 圖32為pAKOS107 (SEQ ID NO: 50)之一部分的代表性示意圖。 圖33為pAKOS107之一部分的代表性示意圖。 圖34為pAKOS108 (SEQ ID NO: 51)之一部分的代表性示意圖。 圖35為pAKOS108之一部分的代表性示意圖。 圖36為pAKOS109 (SEQ ID NO: 52)之一部分的代表性示意圖。 圖37為因子VIII填充序列(SEQ ID NO. 54-57)之代表性示意圖。 圖38為p109 (SEQ ID NO: 84)之代表性示意圖。 圖39為p105 (SEQ ID NO: 85)之一部分的代表性示意圖。 圖40為105.WPRE之代表性示意圖。 圖41為p108之代表性示意圖。 圖42為1OTOF18.CL1之代表性示意圖。 圖43為19OTOF48之代表性示意圖。 圖44為1OTOF20.CL1之代表性示意圖。 圖45為21OTOF48.WPRE之代表性示意圖。 圖46為1OTOF21.CL1之代表性示意圖。 圖47為22OTOF48.WPRE之代表性示意圖。 圖48為105.pA.NTF3.CMVd之代表性示意圖。 圖49為展示用所示不同質體對轉染之HEK293FT細胞中全長人類耳畸蛋白之表現的免疫墨點。 圖50為展示來自圖49中所述之三個重複實驗的全長人類耳畸蛋白之表現的定量的表格。 圖51為以下中短音ABR臨限值之圖：未用載體處理之野生型，或未用載體處理或用雙重AAV Anc80.hOtof載體(p105及p109載體)處理之Otof-/- 小鼠。在處理後26-28天及91天量測投與雙重AAV Anc80.hOtof載體(p105及p109載體)之Otof-/- 小鼠的聽力。 圖52為以下中短純音ABR臨限值之圖：未用載體處理之野生型，或未用載體處理或用雙重AAV Anc80.hOtof載體(p105及p109載體)處理之Otof-/- 小鼠。在處理後26-28天及91天量測投與雙重AAV Anc80.hOtof載體(p105及p109載體)之Otof-/- 小鼠的聽力。 圖53為pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD (SEQ ID NO: 87)之一部分的代表性示意圖。 圖54為pAAV-SA-3'mOTOF.WPRE (SEQ ID NO: 88)之一部分的代表性示意圖。 圖55為pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF.SD-AK之一部分的代表性示意圖。 圖56為pAAV-AK-SA-3'mOTOF.WPRE之一部分的代表性示意圖。 圖57為pAAV-CMV-5'hOTOF-SD-AK之一部分的代表性示意圖。 圖58為pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AP之一部分的代表性示意圖。 圖59為pAAV-HBA-5'hOTOF-SD-AK之一部分的代表性示意圖。 圖60為pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD-AK之一部分的代表性示意圖。 圖61為pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD之一部分的代表性示意圖。 圖62為pAAV-CMV-5'hOTOFcodop-SD之一部分的代表性示意圖。 圖63為pAAV-CMV-5'hOTOFcodop-SD-AK之一部分的代表性示意圖。 圖64為pAAV-CBA-5'hOTOFcodop-SD-AK之一部分的代表性示意圖。 圖65為pAAV-CBA-5'hOTOF-SD之一部分的代表性示意圖。 圖66為pAAV-SA-3'OTOF之一部分的代表性示意圖。 圖67為pAAV-AP-SA-3'OTOF之一部分的代表性示意圖。 圖68為pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop之一部分的代表性示意圖。 圖69為展示使用DNA轉染試劑jetPRIME® (polyplus)以及600 ng所示不同質體對轉染之HEK293FT細胞中全長人類耳畸蛋白之表現的代表性免疫墨點。泳道1含有預染色之蛋白ladder。泳道2含有用載體pAKOS104 (如圖24及圖59所示)及載體pAKOS105 (如圖27、圖28及圖39所示)轉染之HEK293FT細胞的蛋白樣品。泳道3含有用載體pAKOS108 (如圖34、圖35、圖41及圖57所示)及載體pAKOS105 (如圖27、圖28及圖39所示)轉染之HEK293FT細胞的蛋白樣品。泳道4含有用載體pAKOS109 (如圖36及圖38所示)及載體pAKOS105 (如圖27、圖28及圖39所示)轉染之HEK293FT細胞的蛋白樣品。泳道5含有用載體pAAV-HBA-5'hOTOFcodop-SD-AK (如圖60所示)及載體pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop (如圖68所示)轉染之HEK293FT細胞的蛋白樣品。泳道6含有用載體pAAV-CMV-5'hOTOFcodop-SD-AK (如圖63所示)及載體pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop (如圖68所示)轉染之HEK293FT細胞的蛋白樣品。泳道7含有用載體pAAV_CBA-5'hOTOFcodop-SD-AK (如圖64所示)及載體pAAV-AK-SA-3'OTOFcodop (如圖68所示)轉染之HEK293FT細胞的蛋白樣品。泳道8含有用載體pAKOS102 (如圖21所示)及載體pAKOS103 (如圖22、圖23及圖66所示)轉染之HEK293FT細胞的蛋白樣品。泳道9含有用CBA.TS載體及載體pAKOS103 (如圖22、圖23及圖66所示)轉染之HEK293FT細胞的蛋白樣品。泳道10含有用載體pAKOS106 (如圖30、圖31及圖58所示)及載體pAKOS107 (如圖32、圖33及圖67所示)轉染之HEK293FT細胞的蛋白樣品。轉染後96小時，收穫細胞且使用RIPA緩衝液溶解，且在4-12% Bolt蛋白凝膠中分析，隨後將其轉移至硝酸纖維素膜上。使用抗OTOF多株抗體(Thermo PA5-52935)偵測人類耳畸蛋白。將人類β-肌動蛋白用作一級抗體以用於泳道之間的內部裝載控制。一式三份地重複該實驗。在免疫墨點下提供各實驗之相對定量量測值，以及平均量測值及標準偏差(STDEV)。 圖70為展示以不同感染複數(MOI)用所示不同質體對轉染之HEK293FT細胞中全長人類耳畸蛋白之表現的免疫墨點。將HEK293FT細胞以4×104 個細胞/孔接種於96孔板上隔夜。接種後六小時，將雙重載體添加至各孔。轉染後96小時，收穫細胞且使用RIPA緩衝液溶解，且在4-12% Bolt蛋白凝膠中分析，隨後將其轉移至硝酸纖維素膜上。使用抗OTOF多株抗體(Thermo PA5-52935)偵測人類耳畸蛋白。將人類β-肌動蛋白用作一級抗體以用於泳道之間的內部裝載控制。泳道1：CBA.OTOF(AK)，MOI 503,000；泳道2：CBA.OTOF(AK)，MOI 1,510,000；泳道3：CBA.OTOF(AK)，MOI 100,000；泳道4：CBA.OTOF(AK)，MOI 303,000；泳道5：CMV.OTOF(AK)，MOI 638,000；泳道6：CMV.OTOF(AK)，MOI 1,910,000；泳道7：CMV.OTOF(AK)，MOI 127,000；泳道8：CMV.OTOF(AK)，MOI 382,000；泳道9：陰性對照。 圖71為來自單側耳蝸內投與表現CBA.hOTOF(AK)之雙重AAV載體(p105及109載體)後P17齡Otof-/-小鼠之一個柯蒂氏器的一組免疫組織化學影像。解剖同側耳蝸，且使用免疫組織化學法在三個不同頻率區(基區-頂區)分析蛋白表現。 圖72為展示注射雙重AAV-TS (n = 10隻小鼠)及雙重AAV-Hyb (n = 9隻小鼠)之CD1B6F1-Otof -/- 小鼠(P18-P30齡)中N末端及C末端耳畸蛋白標記之內毛細胞(IHC)百分比的圖。個別動物用空心符號描繪。數據呈現為平均值±平均值標準誤差(s.e.m.)，ns P＞ 0.05；*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001，威氏配對符號秩檢驗(Wilcoxon matched-pair signed rank test)及採用韋爾奇校正之無配對t檢驗(unpaired t-test with Welch's correction)。 圖73為展示來自小鼠(P23-30齡)之經雙重AAV轉導Otof-/- 及野生型內毛細胞(IHC)中平均N末端及C末端耳畸蛋白免疫螢光水準的圖。對於每種抗體，根據未轉導B6野生型IHC中之免疫螢光水準將耳畸蛋白水準分別標準化。定量IHC之數量如條形圖內所指示。數據呈現為平均值±平均值標準誤差(s.e.m.)，ns P＞ 0.05；*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001，克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(Kruskal-Wallis test)，繼而鄧恩多重比較檢驗(Dunn's multiple comparison test)。 圖74為展示自以下之耳蝸頂端中之內毛細胞(IHC) 定量的突觸帶數量的圖：野生型(B6：n= 48 IHC，CD1B6F1：n= 108 IHC)、經轉導Otof--/- (雙重AAV-TS：n= 59 IHC，雙重AAV-Hyb：n= 37 IHC)以及來自經注射(-AAV未注射耳，n = 65 IHC)及對側未注射(-AAV未注射耳，n = 46 IHC)耳(來自P25-P29齡之小鼠)之未轉導Otof-/- IHC。個別動物用空心符號描繪。數據呈現為平均值±平均值標準誤差(s.e.m.)，ns P＞ 0.05，**P≤0.001 (克魯斯卡爾-沃利斯檢驗，繼而鄧恩多重比較檢驗)。 圖75為展示自以下之頂端(c)中之內毛細胞(IHC) 定量的突觸數量的圖：兩個不同發育階段(P6及P14)之B6野生型(P6：n= 53 IHC；P14：n= 73 IHC)及B6Otof-/- (P6：n= 62 IHC；P14：n= 65 IHC)小鼠。個別動物用空心符號描繪。數據呈現為平均值±平均值標準誤差(s.e.m.)，ns P＞ 0.05，**P≤0.001 (克魯斯卡爾-沃利斯檢驗，繼而鄧恩多重比較檢驗)。 圖76為展示在不同短音強度下以下中之總聽覺腦幹反應(ABR)波I-V振幅的圖：P23-30齡之注射耳畸蛋白雙重AAV、未注射Otof-/- 及野生型對照小鼠。分析之小鼠的數量：CD1B6F1野生型動物(+AAV.eGFP：n=12隻小鼠，雙重AAV-TS：n = 6隻小鼠)及CD1B6F1Otof-/- 動物(雙重AAV-TS：n = 16 隻小鼠，雙重AAV-Hyb：n = 8隻小鼠，=AAV：n = 38隻小鼠)。數據表示為平均值±平均值標準誤差(s.e.m.)。個別動物用空心符號描繪。 圖77為展示個別雙重AAV-TS處理之CD1B6F1Otof-/- 動物(n = 8隻動物，來自圖76)的總聽覺腦幹反應(ABR)波I-V振幅相對於其全長耳畸蛋白內毛細胞(IHC)轉導率(來自圖5，C末端耳畸蛋白)繪製的圖。r ：相關係數。＝ 8隻小鼠，＝ AAV：n ＝ 38隻小鼠)。個別動物用空心符號表示。r≥0.5正相關(70分貝音壓級(dB SPL)及90 dB SPL：皮爾遜相關檢驗(Pearson correlation test)；50 dB SPL：斯皮爾曼相關檢驗(Spearman correlation test))。 圖78為本揭示案之例示性雙重AAV載體系統的示意圖，該例示性雙重AAV載體系統包括「上游」及「下游」載體(分別為AKhOTOF5及AKhOTOF3)。 圖79為「上游」載體AKhOTOF5之示意圖。 圖80為「下游」載體AKhOTOF3之示意圖。 圖81圖解說明根據本揭示案之態樣將流體遞送至內耳之裝置之透視圖。 圖82圖解說明根據本揭示案之態樣之彎針子總成之側視圖。 圖83圖解說明根據本揭示案之態樣將流體遞送至內耳之裝置之透視圖。 圖84圖解說明根據本揭示案之態樣結合至裝置遠端之彎針子總成之透視圖。
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Claims (43)

  1. 一種重組AAV載體，其具有SEQ ID NO: 96。
  2. 一種重組AAV載體，其具有SEQ ID NO: 105。
  3. 一種重組AAV載體，其按5'至3'之順序包含： SEQ ID NO: 97之5' ITR序列； CAG啟動子，其包含SEQ ID NO: 98之CMV早期增強子元件、SEQ ID NO: 99之雞β肌動蛋白基因序列及SEQ ID NO: 100之嵌合內含子； 包含OTOF cDNA之外顯子1至(及貫穿至(and through)) 21的5'OTOF編碼區； SEQ ID NO: 102之SD內含子序列； SEQ ID NO: 103之AK致重組序列；及 SEQ ID NO: 104之3' ITR序列。
  4. 如請求項3之重組AAV載體，其中該5'OTOF編碼區為SEQ ID NO: 101。
  5. 如請求項3或4之重組AAV載體，其中該5'OTOF編碼區與SEQ ID NO: 101至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%一致，且編碼與SEQ ID NO: 101所編碼相同之胺基酸序列。
  6. 一種重組AAV載體，其按5'至3'之順序包含： SEQ ID NO: 97之5' ITR序列； SEQ ID NO: 103之AK致重組序列； SEQ ID NO: 106之SA內含子序列； 包含OTOF cDNA之外顯子22至(及貫穿至)外顯子48的3'OTOF編碼區； SEQ ID NO: 108之bgH polyA序列；及 SEQ ID NO: 104之3' ITR序列。
  7. 如請求項6之重組AAV載體，其中該3'OTOF編碼區為SEQ ID NO: 107。
  8. 如請求項6或7之重組AAV載體，其中該3'OTOF編碼區與SEQ ID NO: 107至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%一致，且編碼與SEQ ID NO: 107所編碼相同之胺基酸序列。
  9. 一種重組AAV粒子(rAAV粒子)，其包含如請求項1至8中任一項 之重組AAV載體，該重組AAV載體由Anc80衣殼殼體化。
  10. 如請求項9之rAAV粒子，其中該Anc80衣殼包含SEQ ID NO: 109之多肽。
  11. 一種組成物，其包含：包含如請求項1之重組AAV載體的第一rAAV粒子及包含如請求項2之重組AAV載體的第二rAAV粒子。
  12. 一種組成物，其包含：包含如請求項3至5中任一項之重組AAV載體的第一rAAV粒子及包含如請求項6至8中任一項 之重組AAV載體的第二rAAV粒子。
  13. 如請求項11或12之組成物，其中該等第一及第二rAAV粒子各自獨立地用Anc80衣殼殼體化。
  14. 如請求項13之組成物，其中該Anc80衣殼包含SEQ ID NO: 109之多肽。
  15. 如請求項11之組成物，其中當將該組成物引入人類細胞中時，如請求項1及2之重組AAV載體彼此發生多聯化或同源重組，從而在該細胞內形成編碼全長耳畸蛋白之蛋白的重組核酸。
  16. 如請求項12之組成物，其中當將該組成物引入人類細胞中時，如請求項3至5中任一項 之重組AAV載體及如請求項6至8中任一項 之重組AAV載體彼此發生多聯化或同源重組，從而在該細胞內形成編碼全長耳畸蛋白之蛋白的重組核酸。
  17. 如請求項15或16之組成物，其進一步包含至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
  18. 一種方法，其包含將治療有效量之如請求項11至17中任一項 之組成物引入哺乳動物之耳蝸中。
  19. 如請求項18之方法，其中該哺乳動物為人類。
  20. 如請求項18或19之方法，其中先前已鑑別出該哺乳動物具有缺陷耳畸蛋白基因。
  21. 一種增加哺乳動物細胞中之全長耳畸蛋白之蛋白的表現的方法，該方法包含將如請求項11至17中任一項 之組成物引入該哺乳動物細胞中。
  22. 如請求項21之方法，其中該哺乳動物細胞為內毛細胞。
  23. 如請求項21或22之方法，其中該哺乳動物細胞為人類細胞。
  24. 如請求項21至23中任一項 之方法，其中先前已確定該哺乳動物細胞具有缺陷耳畸蛋白基因。
  25. 一種增加哺乳動物耳蝸中內毛細胞中全長耳畸蛋白之蛋白之表現的方法，該方法包含將治療有效量之如請求項11至17中任一項 之組成物引入該哺乳動物耳蝸中。
  26. 如請求項25之方法，其中先前已鑑別出該哺乳動物具有缺陷耳畸蛋白基因。
  27. 如請求項25或26之方法，其中該哺乳動物為人類。
  28. 一種治療鑑別為具有缺陷耳畸蛋白基因之個體的非症候群性感覺神經性聽力損失的方法，該方法包含向該個體之耳蝸中投與治療有效量之如請求項11至17中任一項 之組成物。
  29. 如請求項28之方法，其中該個體為人類。
  30. 如請求項28或29之方法，其還包含在該投與步驟之前，確定該個體具有缺陷耳畸蛋白基因。
  31. 如請求項28至30中任一項 之方法，其中使用微導管向該耳蝸投與該組成物。
  32. 如請求項31之方法，其中該微導管經成形以使得其可經由外耳道進入中耳腔且使該微導管之末端與RWM接觸。
  33. 如請求項31或32之方法，其中該微導管之遠端包含至少一個直徑為10微米至1,000微米之微針。
  34. 如請求項28至30中任一項之方法，其中該組成物係使用包括針之裝置投與該耳蝸。
  35. 如請求項34之方法，其中該針包括彎曲部分及成角度尖端。
  36. 一種套組，其包含如請求項11至17中任一項 之組成物。
  37. 如請求項36之套組，其中該組成物預裝載在裝置中。
  38. 如請求項37之套組，其中該裝置為微導管。
  39. 如請求項38之套組，其中該微導管經成形以使得其可經由外耳道進入中耳腔且使該微導管之末端與RWM接觸。
  40. 如請求項38或39之套組，其中該微導管之遠端包含至少一個直徑為10微米至1,000微米之微針。
  41. 如請求項36之套組，其進一步包括裝置。
  42. 如請求項41之套組，其中該裝置係圖81-圖84中之任一者中所述之裝置。
  43. 如請求項42之套組，其中該裝置包括針，該針包括彎曲部分及成角度尖端。
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