TW201920231A - 肽醯胺類化合物、其製備方法及醫藥用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了通式(I)所示的肽醯胺類化合物及其製備方法和在醫藥上的用途，該化合物結構新穎，生物活性更好、鎮痛效果更佳。

Description

肽醯胺類化合物、其製備方法及醫藥用途
本發明涉及一種具有鎮痛作用的肽醯胺類化合物及其製備方法和在醫藥上的用途。
鴉片類藥物用於疼痛的治療已有數千年的歷史，其主要通過與已知的三種經典鴉片受體μ,δ和κ相互結合而發揮生理作用。這三種受體都是G蛋白偶聯受體家族的一員，主要分佈在中樞神經系統，同時也存在於很多外周組織中。其中最為經典的藥物屬嗎啡，其主要通過μ鴉片受體的作用發揮鎮痛效果。
此外常用的臨床鎮痛藥物還包含其他μ鴉片受體藥物，如以二氫嗎啡酮、芬太尼為代表的傳統類鴉片藥物。
然而μ鴉片受體類藥物在長期使用後會產生多種副作用，例如耐受、依賴和呼吸抑制以及對胃腸運動的影響等，這不僅增加了治療費用，更影響了患者康復週期。而一些非鴉片類注射劑，如對乙醯氨基酚、NSAIDs(非甾體抗炎藥)，由於其鎮痛效果差，限制了其使用範圍和劑量；此外也有一定的副作用，如對乙醯氨基酚增加肝臟毒性，NSAIDs(非甾體抗炎藥)導致各種胃腸道疾病。
隨著現代社會生活工作壓力的不斷增大和老年社會的到來，以及鴉片受體對於治療不同類型的疼痛有著至關重要的作用，尋找具有高鎮痛活性且低毒副作用的新型鴉片藥物具有重要的科學及社會意義。
研究發現通過使用κ鴉片受體激動劑，可以將κ鴉片受體作為干預的標靶以治療疼痛和預防種類繁多的疾病和病況。如1993年Woold等在Anesthesia and Analgesia(1993，77,362-379)描述了將κ鴉片受體激動劑用於治療痛覺增敏在內的疼痛；1999年Wu等在Circulation Res(1999,84,1388-1395)提出將κ鴉片受體激動劑作為預防和治療心血管疾病的標靶；2003年Kaushik等在J.Postgraduate Medicine(2003，49(1),90-95)闡述了κ鴉片受體激動劑的神經保護作用；2004年Potter等在.Pharmacol.Exp.Ther(2004，209,548-553)描述了κ鴉片受體激動劑在眼部紊亂和眼部疼痛中的用途；2005年Wikstrom等在J.Am.Soc.Nephrol(2005,16，3742-3747.)描述了κ激動劑在治療尿毒癥和鴉片引起的瘙癢的用途；2006年Bileviciute-Ljungar等在Rheumatology(2006,45，295-302)評估了κ鴉片受體激動劑用於骨關節炎，類風濕性關節炎等炎性疾病的性質；2006年Lembo在Diges.Dis.(2006,24,91-98)中評估了κ鴉片受體激動劑胃腸道疾病中的用途；2006年Jolivalt等在Diabetologia(2006,49(11)，2775-2785)描述了κ鴉片受體激動劑阿西馬朵林在齧齒動物糖尿病神經病變中的作用；2008年卡拉治療學股份有限公司的Schteingart,Claudio,D等在WO2008057608A2中評估了κ鴉片受體激動劑在內臟疼痛、pH敏感型傷害感受器活化的相關疼痛以及辣椒素引起的眼部疼痛中的作用。
本發明的目的是提供一種結構新穎，生物活性更好、鎮痛效果更佳的κ鴉片受體激動劑，及其製備方法和在醫藥上的用途。
本發明提供一種通式(I)所示的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶：
其中，R1選自； m1、m2各自獨立選自1、2、3或4；m3、m4各自獨立選自0、1、2、3或4；條件是，m3和m4不能同時為0；n1、n2各自獨立選自0、1、2、3或4；Z選自CRz1Rz2或NRz3；Rz1、Rz2各自獨立選自H、F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、-C(=O)-C1-6烷基、-(CH2)q-C(=O)O-C1-6烷基、-(CH2)q-NR1eR1f、-(CH2)q-COOH、-(CH2)q-CONH2、C3-8碳環基或3至8元雜環基，所述烷基、烷氧基、烯基、炔基、碳環基或雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、=O、羧基、硝基、氰基、氨基、C1-6 烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子，所述雜原子選自S時，任選進一步為S、S=O或S(=O)2；R1e、R1f各自獨立地選自H、C1-6烷基、-C(=O)O-C1-6烷基、-C(=O)O-(CH2)q-C3-8碳環基或-C(=O)O-(CH2)q-3至8元雜環基，所述的烷基、碳環基或者雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、氰基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；或者，Rz1和Rz2與其連接的碳原子形成3至10元含氮雜環，所述的環任選進一步被選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、氰基、硝基、=O、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代；R1a、R1b各自獨立選自F、CF3、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或3至8元雜環基，所述烷基、烯基、炔基或雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子；Rz3獨立選自H、-C(=O)-C1-6烷基、-C(=O)O-C1-6烷基、-C(=O)-C3-8碳環基、-C(=O)O-C3-8碳環基、-C(=O)O-(3至8元雜環基)、-S(=O)p-C1-6烷基、-S(=O)p-C3-8碳環基、-S(=O)p-(3至8元雜環基)、-C(=O)NR1gR1h、-S(=O)p-NR1iR1j或3至8元雜環基，所述烷基、碳環基或雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6 烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子；R1g、R1h、R1i、R1j各自獨立選自H或C1-6烷基；或者，R1g、R1h與其連接的氮原子形成3至10元雜環，所述的環任選進一步被選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、氰基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基或-S(=O)p-C1-6烷基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；q選自0、1、2、3或4；p選自0、1或2；a選自0、1、2或3；R4獨立選自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或-(CH2)q-C3-8碳環基，所述的烷基、烯基、炔基或碳環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CN、CF3、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；R2、R3、R7、R8各自獨立地選自H、C1-6烷基、-C(=O)O-C1-4烷 基、-C(=O)O-(CH2)q-C3-8碳環基、-C(=O)O-(CH2)q-3至8元雜環基或，所述的烷基、碳環基或雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子；b選自0、1、2、3、4或5； c選自0、1、2、3、4或5；R5、R6每個各自獨立選自F、Cl、Br、I、CF3、氰基、硝基、C1-4烷基、-OR5a、-C(O)OR5b、-SR5c、-S(O)R5d、-S(O)2R5e或-NR5fR5g；R5a、R5b、R5c、R5d、R5e、R5f和R5g各自獨立選自H或C1-4烷基；或者，R5f、R5g與其連接的氮原子形成5至6元雜環，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子。
本發明的較佳方案，提供一種通式(I)所示的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶： 其中，R1選自； m1、m2、m3、m4各自獨立選自1或2；n1、n2各自獨立選自0、1或2；Z選自CRz1Rz2或NRz3；Rz1、Rz2各自獨立選自H、F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基、-C(=O)-C1-4烷基、-(CH2)q-C(=O)O-C1-4烷基、-(CH2)q-NR1eR1f、-(CH2)q-COOH、-(CH2)q-CONH2、C3-6碳環基或3至6元雜環基，較佳為H、C1-4烷基、-(CH2)q-C(=O)O-C1-4烷基、-(CH2)q-NR1eR1f、-(CH2)q-COOH、-(CH2)q-CONH2、C3-6碳環基或3至6元雜環基，所述烷基、烷氧基、烯基、炔基、碳環基或雜環基任選進一步被0-3個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、=O、羧基、氰基、氨基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6碳環基或3至6元雜環基的取代基所取代，所述 的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子，所述雜原子選自S時，任選進一步為S、S=O或S(=O)2；R1e、R1f各自獨立地選自H、C1-4烷基、-C(=O)O-C1-4烷基、-C(=O)O-(CH2)q-C3-6碳環基或-C(=O)O-(CH2)q-3至6元雜環基，較佳為H、C1-4烷基、-C(=O)O-C1-4烷基或-C(=O)O-(CH2)q-C3-6碳環基，所述的烷基、碳環基或者雜環基任選進一步被0-3個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、氰基、硝基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6碳環基或3至6元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；或者，Rz1和Rz2與其連接的碳原子形成3至10元含氮雜環，較佳為形成4至6元含氮雜環，所述的環任選進一步被選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、氰基、硝基、=O、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6碳環基或3至6元雜環基的取代基所取代；R1a、R1b各自獨立選自F、CF3、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或3至6元雜環基，較佳為F、CF3、C2-4烯基或C2-4炔基，所述烷基、烯基、炔基或雜環基任選進一步被0-3個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6碳環基或3至6元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子；Rz3獨立選自H、-C(=O)-C1-4烷基、-C(=O)-C3-6碳環基、-C(=O)O-C1-4烷基、-C(=O)-C3-4碳環基、-C(=O)O-C3-6碳環基或-C(=O)O-(3至6元雜環基)、-S(=O)p-C1-4烷基、-S(=O)p-C3-6碳環基、-S(=O)p-(3至6元雜環基)、-C(=O)NR1gR1h、-S(=O)p-NR1iR1j或3至6元雜環基，較佳為H、-C(=O)- C1-4烷基、-C(=O)O-C1-4烷基、-S(=O)p-C1-4烷基、-S(=O)p-C3-6碳環基、-C(=O)NR1gR1h或3至6元雜環基，所述烷基、烯基、炔基、碳環基或雜環基任選進一步被0-3個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、氨基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6碳環基或3至6元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子；R1g、R1h、R1i、R1j各自獨立選自H或C1-6烷基，較佳為H或C1-4烷基；或者，R1g、R1h與其連接的氮原子形成3至10元雜環，較佳為形成4至6元雜環，所述的環任選進一步被選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、氰基、硝基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基或-S(=O)p-C1-4烷基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；q選自0、1、2、3或4；較佳為0或1；p選自0、1或2；較佳為2；a選自0、1、2或3；較佳為3；R4獨立選自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基或-(CH2)q-C3-6碳環基，較佳為C1-4烷基，所述的烷基、烯基、炔基或碳環基任選進一步被0-3個選自F、Cl、Br、I、OH、CN、CF3、NO2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6碳環基或3至6元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子； R2、R3、R7、R8各自獨立地選自H、C1-4烷基、-C(=O)O-C1-4烷基、-C(=O)O-(CH2)q-C3-6碳環基、-C(=O)O-(CH2)q-3至6元雜環基或，較 佳為H、C1-4烷基、-C(=O)O-C1-4烷基、-C(=O)O-(CH2)q-C3-6碳環基，所述的烷基、碳環基或雜環基任選進一步被0-3個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6碳環基或3至6元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子；b選自0、1、2、3、4或5，較佳為0或1；c選自0、1、2、3、4或5，較佳為0或1；R5、R6每個各自獨立選自F、Cl、Br、I、CF3、氰基、硝基、C1-4烷基、或-NR5fR5g，較佳為F、CF3或C1-4烷基；R5f和R5g各自獨立選自H或C1-4烷基。
本發明的較佳方案，提供一種通式(I)所示的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶：其中，m1、m2、m3、m4各自獨立選自1或2；n1、n2各自獨立選自0、1或2；Z選自CRz1Rz2或NRz3；Rz1、Rz2各自獨立選自H、C1-4烷基、-(CH2)q-C(=O)O-C1-4烷基、-(CH2)q-NR1eR1f、-(CH2)q-COOH、-(CH2)q-CONH2、C3-6碳環基或3至6元雜環基，所述烷基、碳環基或雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、=O、羧基、硝基、氰基、氨基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6碳環基或3至6元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子，所述雜原子選自S時，任選進一步為S、S=O或S(=O)2； R1e、R1f各自獨立地選自H、C1-4烷基、-C(=O)O-C1-4烷基或-C(=O)O-(CH2)q-C3-6碳環基，所述的烷基或碳環基任選進一步被0-3個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、苯基的取代基所取代；或者，Rz1和Rz2能夠與其連接的碳原子形成4至6元含氮雜環，所述的環任選進一步被=O的取代基所取代；R1a、R1b獨立選自F、CF3、甲基、乙基、丙基或異丙基；Rz3各自獨立選自H、-C(=O)-C1-4烷基、-C(=O)-C3-6碳環基、-C(=O)O-C1-4烷基、-S(=O)p-C1-4烷基、-S(=O)p-C3-6碳環基、-C(=O)NR1gR1h、-S(=O)p-NR1iR1j或3至6元雜環基，所述烷基、碳環基或雜環基任選進一步被0-3個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、氨基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、環丙基或苯基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；R1g、R1h、R1i、R1j各自獨立選自H或C1-4烷基；或者，R1g、R1h與其連接的氮原子形成4至6元雜環，所述的環任選進一步被選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、氰基、硝基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或-S(=O)p-C1-4烷基(較佳為-S(=O)p-甲基、較佳為-S(=O)p-乙基)的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；p選自2；q選自0或1；a選自3；R4選自丙基或異丙基； R2、R3、R7、R8各自獨立地選自H、C1-4烷基、-C(=O)O-C1-4烷基或-C(=O)O-苄基；b選自0；c選自0。
本發明較佳方案，提供一種通式(I)所示化合物，其中該化合物選自通式(II)所示的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶：
其中，R1選自；m1、m2、m3、m4各自獨立選自1或2；n1、n2各自獨立選自0或2；R1a、R1b獨立選自F；Z選自CRz1Rz2或NRz3； Rz1、Rz2各自獨立選自H、羧基、、、 、、、、、、氨基、-CH2NH2或 或者，Rz1和Rz2能夠與其連接的碳原子形成一個內醯胺 Rz3各自獨立選自H、-C(=O)-C1-4烷基、-C(=O)-C3-6碳環基、-C(=O)O-C1-4烷基、-S(=O)p-C1-4烷基、-S(=O)p-C3-6碳環基、-C(=O)NR1gR1h、-S(=O)p-NR1iR1j或3至6元雜環基，所述烷基、碳環基或雜環基任選進一步被0-3個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、氨基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、環丙基或苯基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；R1g、R1h、R1i、R1j各自獨立選自H或C1-4烷基；或者，R1g、R1h與其連接的氮原子形成4至6元雜環，所述的環任選進一步被選自F、CF3、甲基、甲氧基或-S(=O)p-C1-4烷基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；p選自2；R2、R3、R7、R8各自獨立地選自H、甲基或-C(=O)O-第三丁基。
本發明較佳方案，提供一種通式(II)所示化合物，其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶： 其中，R1選自； m1、m2、m3、m4各自獨立選自1或2；n1、n2各自獨立選自0或2；R1a、R1b選自F；Z選自CRz1Rz2或NRz3； Rz1、Rz2各自獨立選自H、羧基、、、 、、、、、、氨基、-CH2NH2或 或者，Rz1和Rz2能夠與其連接的碳原子形成一個內醯胺 Rz3各自獨立選自H、、、、、 R2、R3、R7、R8各自獨立地選自H、甲基或-C(=O)O-第三丁基。
本發明較佳方案，提供一種通式(II)所示化合物，其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶： 其中，R1選自、、、 Z選自CRz1Rz2或NRz3； Rz1、Rz2各自獨立選自H、羧基、、、 、、、、、、氨基、-CH2NH2或 或者，Rz1和Rz2能夠與其連接的碳原子形成一個內醯胺 Rz3各自獨立選自H、、、、、 R2、R3、R7、R8各自獨立地選自H、甲基或-C(=O)O-第三丁基。
本發明較佳方案，提供一種通式(I)或(II)所示的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，其中該化合物包括但不限於如下結構式所示化合物之一：
本發明的一種較佳方案，提供一種通式(I)或(II)所示的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，所述的藥學上可接受的鹽選自三氟乙酸鹽。
本發明提供一種藥物組合物，所述的藥物組合物包含通式(I)或(II)所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，和一種或多種以上的藥學上可接受的載體及/或賦形劑。
本發明通式(I)或(II)所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶或包含通式(I)或(II)所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶的藥物組合物用於製造治療或預防哺乳動物的κ鴉片樣物質受體相關的疾病或病況的藥物的用途。
本發明的較佳方案，其中所述κ鴉片樣物質受體相關的疾病或病況選自下列群組，其構成為：疼痛、炎症、瘙癢、水腫、低鈉血症、低鉀血症、腸梗阻、咳嗽和青光眼。
本發明的較佳方案，其中所述疼痛選自下列群組，其構成為：神經性疼痛、軀體痛、內臟痛和皮膚痛。
本發明的較佳方案，其中所述疼痛選自下列群組，其構成為：關節炎疼痛、腎結石疼痛、子宮痙攣、痛經、子宮內膜異位症、消化不良、外 科手術後疼痛、醫療處理後疼痛、眼部疼痛、耳炎疼痛、爆發性癌症疼痛和GI紊亂相關的疼痛。
本發明提供一種治療或預防哺乳動物的κ鴉片樣物質受體相關的疾病或病況的方法，所述方法包括給予通式(I)或(II)所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，或通式(I)或(II)所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶的藥物組合物，所述的所述κ鴉片樣物質受體相關的疾病或病況較佳為下列群組，其構成為：疼痛、炎症、瘙癢、水腫、低鈉血症、低鉀血症、腸梗阻、咳嗽和青光眼，所述疼痛較佳為下列群組，其構成為：神經性疼痛、軀體痛、內臟痛和皮膚痛；或者所述疼痛較佳為下列群組，其構成為：關節炎疼痛、腎結石疼痛、子宮痙攣、痛經、子宮內膜異位症、消化不良、外科手術後疼痛、醫療處理後疼痛、眼部疼痛、耳炎疼痛、爆發性癌症疼痛和GI紊亂(胃腸道紊亂)相關的疼痛。
除非有相反的陳述，在說明書和申請專利範圍中使用的術語具有下述含意。
本發明所述基團和化合物中所涉及的碳、氫、氧、硫、氮或鹵素均包括它們的同位素，及本發明所述基團和化合物中所涉及的碳、氫、氧、硫、氮或鹵素任選進一步被一個或多個它們對應的同位素所替代，其中碳的同位素包括12C、13C和14C，氫的同位素包括氕(H)、氘(D，又稱為重氫)、氚(T，又稱為超重氫)，氧的同位素包括16O、17O和18O，硫的同位素包括32S、33S、34S和36S，氮的同位素包括14N和15N，氟的同位素19F，氯的同位素包括35Cl和37Cl，溴的同位素包括79Br和81Br。
「烷基」是指直鏈和支鏈的一價飽和烴基，主鏈包括1至10個碳原子，較佳為1至8個碳原子，進一步較佳為1至6個碳原子，更佳為1至4個碳原子的直鏈與支鏈基團，最佳為1至2個碳原子，烷基的實例包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基等；所述的烷基可以任選進一步被0、1、2、3、4或5個選自F、Cl、Br、I、=O、羥基、-SR19、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基、3至8元雜環基、-(CH2)a-C(=O)-R19、-(CH2)k-C(=O)-O-R19、-(CH2)k-C(=O)-NR19R19a、-(CH2)k-S(=O)j-R19、-O-C(=O)-O-R19或者-NR19R19a的取代基所取代，其中R19和R19a各自獨立選自H、羥基、氨基、羧基、C1-8烷基、C1-8烷氧基、C2-8烯基、C2-8炔基、3至10元碳環基、4至10元雜環基、3至10元碳環基氧基或者4至10元雜環基氧基，k選自0、1、2、3、4或者5，j選自0、1或者2。本文中出現的烷基、k、j、R19和R19a，其定義如上所述。
「亞烷基」是指直鏈和支鏈的二價飽和烴基，包括-(CH2)v-(v為1至10的整數)，亞烷基實施例包括但不限於亞甲基、亞乙基、亞丙基和亞丁基等；所述的亞烷基可以任選進一步被0、1、2、3、4或5個選自F、Cl、Br、I、=O、羥基、-SR19、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基、3至8元雜環基、-(CH2)a-C(=O)-R19、-(CH2)k-C(=O)-O-R19、-(CH2)k-C(=O)-NR19R19a、-(CH2)k-S(=O)j-R19、-O-C(=O)-O-R19或者-NR19R19a的取代基所取代，當亞烷基中的取代基數量大於等於2個時，取代基可以稠合在一起形成環狀結構。本文中出現的亞烷基，其定義如上所述。
「烷氧基」是指O-烷基的一價基團，其中，烷基如本文所定義，烷氧基實施例包括但不限於甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、1-丁氧基、2-甲基-1-丙氧基、2-丁氧基、2-甲基-2-丙氧基、1-戊氧基、2-戊氧基、3-戊氧基、2-甲基-2-丁氧基、3-甲基-2-丁氧基、3-甲基-1-丁氧基和2-甲基-1-丁氧基等。
「烯基」是指直鏈和支鏈的一價不飽和烴基，其具有至少1個，通常有1、2或3個碳碳雙鍵，主鏈包括2至10個碳原子，進一步較佳為2至6個碳原子，更佳為在主鏈上有2至4個碳原子，烯基實施例包括但不限於乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-1-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-1-戊烯基、2-甲基-1-戊烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、1-辛烯基、3-辛烯基、1-壬烯基、3-壬烯基、1-癸烯基、4-癸烯基、1,3-丁二烯、1,3-戊二烯、1,4-戊二烯和1,4-己二烯等；所述的烯基可以任選進一步被0、1、2、3、4或5個選自F、Cl、Br、I、=O、羥基、-SR19、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基、3至8元雜環基、-(CH2)a-C(=O)-R19、-(CH2)k-C(=O)-O-R19、-(CH2)k-C(=O)-NR19R19a、-(CH2)k-S(=O)j-R19、-O-C(=O)-O-R19或者-NR19R19a的取代基所取代。本文中出現的烯基，其定義如上所述。
「炔基」是指直鏈和支鏈的一價不飽和烴基，其具有至少1個，通常有1、2或3個碳碳三鍵，主鏈包括2至10個碳原子，進一步較佳為2至6個碳原子，更佳為在主鏈上有2至4個碳原子，炔基實施例包括但不限 於乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-甲基-2-丙炔基、4-戊炔基、3-戊炔基、1-甲基-2-丁炔基、2-己炔基、3-己炔基、2-庚炔基、3-庚炔基、4-庚炔基、3-辛炔基、3-壬炔基和4-癸炔基等；所述的炔基可以任選進一步被0、1、2、3、4或5個選自F、Cl、Br、I、=O、羥基、-SR19、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基、3至8元雜環基、-(CH2)a-C(=O)-R19、-(CH2)k-C(=O)-O-R19、-(CH2)k-C(=O)-NR19R19a、-(CH2)k-S(=O)j-R19、-O-C(=O)-O-R19或者-NR19R19a的取代基所取代。本文中出現的炔基，其定義如上所述。
「環烷基」是指一價飽和的碳環烴基，通常有3至10個碳原子，非限制性實施例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基或環庚基等。所述的環烷基可以任選進一步被0、1、2、3、4或5個選自F、Cl、Br、I、=O、羥基、-SR19、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基、3至8元雜環基、-(CH2)a-C(=O)-R19、-(CH2)k-C(=O)-O-R19、-(CH2)k-C(=O)-NR19R19a、-(CH2)k-S(=O)j-R19、-O-C(=O)-O-R19或者-NR19R19a的取代基所取代。本文中出現的環烷基，其定義如上所述。
「碳環」是指飽和或者不飽和的芳香環或者非芳香環，芳香環或者非芳香環可以是3至10元的單環、4至12元雙環或者10至15元三環體系，碳環基可以連接有橋環或者螺環，非限制性實施例包括環丙基、環丁基、環戊基、1-環戊基-1-烯基、1-環戊基-2-烯基、1-環戊基-3-烯基、環己基、1-環己基-2-烯基、1-環己基-3-烯基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環辛基、環壬基、環癸基、環十一烷基、環十二烷基、苯基或萘基。所述的碳環基可以任選進一步被0、1、2、3、4或5個選自F、Cl、Br、I、=O、羥基、-SR19、硝 基、氰基、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基、3至8元雜環基、-(CH2)a-C(=O)-R19、-(CH2)k-C(=O)-O-R19、-(CH2)k-C(=O)-NR19R19a、-(CH2)k-S(=O)j-R19、-O-C(=O)-O-R19或者-NR19R19a的取代基所取代。本文中出現的碳環，其定義如上所述。
「雜環」是指飽和或不飽和的芳香環或者非芳香環，芳香環或者非芳香環可以是3至10元的單環、4至12元雙環或者10至15元三環體系，且包含1至4個選自N、O或S的雜原子，較佳為3至8元雜環基，雜環基的環中選擇性取代的N、S可被氧化成各種氧化態。雜環基可以連接在雜原子或者碳原子上，雜環基可以連接有橋環或者螺環，非限制性實施例包括環氧乙基、環氧丙基、氮雜環丙基、氧雜環丁基、氮雜環丁基、硫雜環丁基、1,3-二氧戊環基、1,4-二氧戊環基、1,3-二氧六環基、氮雜環庚基、氧雜環庚基、硫雜環庚基、氧氮雜卓基、二氮雜卓基、硫氮雜卓基、吡啶基、哌啶基、高哌啶基、呋喃基、噻吩基、吡喃基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、哌嗪基、高哌嗪基、咪唑基、哌啶基、嗎啉基、硫代嗎啉基、噻噁烷基、二氫呋喃基、二氫吡喃基、二噻戊環基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、四氫吡咯基、四氫咪唑基、四氫噻唑基、四氫吡喃基、苯並咪唑基、苯並吡啶基、吡咯並吡啶基、苯並二氫呋喃基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氫吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧雜環己基、1,3-二氧環戊基、吡唑啉基、二噻烷基、二噻茂烷基、二氫噻吩基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、1,2,3,4-四氫異喹啉基、3-氮雜雙環[3.1.0]己基、3-氮雜雙環[4.1.0]庚基、氮雜雙環[2.2.2]己基、3H-吲哚基喹嗪基、N-吡啶基尿素、1,1-二氧硫代嗎啉基、氮雜二環[3.2.1]辛烷基、氮雜二環[5.2.0]壬烷基、氧雜三環[5.3.1.1]十二烷 基、氮雜金剛烷基和氧雜螺[3.3]庚烷基。所述的雜環基可以任選進一步被0、1、2、3、4或5個選自F、Cl、Br、I、=O、羥基、-SR19、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基、3至8元雜環基、-(CH2)a-C(=O)-R19、-(CH2)k-C(=O)-O-R19、-(CH2)k-C(=O)-NR19R19a、-(CH2)k-S(=O)j-R19、-O-C(=O)-O-R19或者-NR19R19a的取代基所取代。本文中出現的雜環，其定義如上所述。
「任選」或「任選地」是指隨後所描述的事件或環境可以但不必須發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。如：「任選被F取代的烷基」指烷基可以但不必須被F取代，說明包括烷基被F取代的情形和烷基不被F取代的情形。
「藥物組合物」表示一種或多種文中所述化合物或其生理學/藥學上可接受的鹽、其立體異構物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶與其他組成成分的混合物，其中其它組分包含生理學/藥學上可接受的載體和賦形劑。
「立體異構物」是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產生的異構物，包括順反異構物、對映異構物和構象異構物。
「有效劑量」指引起組織、系統或受試者生理或醫學反應的化合物的量，此量是所尋求的，包括在受治療者身上施用時足以預防受治療的疾患或病症的一種或幾種症狀發生或使其減輕至某種程度的化合物的量。
「溶劑化物」指本發明化合物或其鹽，它們還包括以分子間非共價力結合的化學計量或非化學計量的溶劑。當溶劑為水時，則為水合物。
以下結合附圖及實施例詳細說明本發明的技術手段，但本發明的保護範圍包括但是不限於此。
化合物的結構是通過核磁共振(NMR)或(和)質譜(MS)來確定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的單位給出。NMR的測定是用(Bruker Avance III 400和Bruker Avance 300)核磁共振光譜儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)。
MS的測定用(Agilent 6120B(ESI)和Agilent 6120B(APCI))。
HPLC的測定使用安捷倫1260DAD高壓液相色譜儀(Zorbax SB-C18 100×4.6mm)。
薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.20mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm~0.5mm。
管柱層析一般使用煙臺黃海矽膠200~300目矽膠為載體。
本發明的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買於泰坦科技、安耐吉化學、上海德默、成都科龍化工、韶遠化學科技、百靈威科技等公司。
氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氮氣氣球。
氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。
氫化反應通常抽真空，充入氫氣，反復操作3次。
如實施例中無特殊說明，反應在氮氣氛下進行。
如實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。
如實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫。
室溫為最適宜的反應溫度，為20℃~30℃。
如實施例中無特殊說明，M為mol/L。
Boc：是指第三丁基氧基羰基。
Cbz：是指苄氧羰基。
THP：四氫吡喃基。
中間體1的製備：
(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基-丙基]氨基]-3-苯基-丙基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己酸(中間體1)
(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoic acid
第一步：甲基(2R)-2-[[(2R)-2-(苄氧羰基氨基)-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1b)
methyl(2R)-2-[[(2R)-2-(benzyloxycarbonylamino)-4-methyl-pentanoyl]amino]-6-(tert-butoxycarbonylamino)hexanoate
室溫下，將甲基(2R)-2-氨基-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1a)(2.6g,10mmol)溶於乙酸乙酯(50mL)中，降溫至0℃。磁力攪拌下，將(2R)-2- (苄氧羰基氨基)-4-甲基-戊酸(2.8g,11mmol)，1-羥基苯並三唑(1.62g,12mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(2.3g,12mmol)依次加至反應液中，升溫至25℃，並於該溫度下反應15h。向反應液中加入1M鹽酸水溶液(25mL)洗滌、分液。有機相中加入飽和碳酸氫鈉水溶液(25mL)攪拌30分鐘、分液。有機相依次用1M鹽酸水溶液(25mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(25mL)、飽和氯化鈉水溶液(25mL)洗滌，無水硫酸鈉(2g)乾燥。過濾，濾液減壓濃縮得到甲基(2R)-2-[[(2R)-2-(苄氧羰基氨基)-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1b)，白色泡狀固體(5.0g，產率99%)。
第二步：甲基(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1c)
methyl(2R)-2-[[(2R)-2-amino-4-methyl-pentanoyl]amino]-6-(tert-butoxycarbonylamino)hexanoate
室溫下，將甲基(2R)-2-[[(2R)-2-(苄氧羰基氨基)-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1b)(5.0g,10mmol)溶於乙酸乙酯(50mL)中，將10%鈀碳(1g,20% w/w)加至反應液中，置換氫氣3次，氫氣氛圍室溫反應5h。將反應液用矽藻土(3g)過濾，濾液減壓濃縮，得到甲基(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1c)粗產物，白色泡狀固體(3.7g，產率99%)，並直接用於下一步反應。
第三步：甲基(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(苄氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1d)
methyl(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(benzyloxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]-6-(tert-butoxycarbonylamino)hexanoate
室溫下，將甲基(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1c)粗產物(3.7g,9.9mmol)溶於乙酸乙酯(50mL)中，降溫至0℃。將(2R)-2-(苄氧羰基氨基)-3-苯基-丙酸(3.3g,11mmol)、1-羥基苯並三唑(1.62g,12mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(2.3g,12mmol)依次加至反應液中，升溫至25℃，於該溫度下反應5h。加入1M鹽酸水溶液(25mL)洗滌、分液。有機相中加入飽和碳酸氫鈉水溶液(25mL)攪拌30分鐘、分液。有機相依次用1M鹽酸水溶液(25mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(25mL)、飽和氯化鈉水溶液(25mL)洗滌，無水硫酸鈉(2g)乾燥。過濾，濾液減壓濃縮得到甲基(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(苄氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1d)粗產物，白色泡狀固體(3.0g，產率46%)，並直接用於下一步反應。
第四步：甲基(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1e)
methyl(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]-6-(tert-butoxycarbonylamino)hexanoate
室溫下，將甲基(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(苄氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1d)粗產物(3.0g,4.58mmol)溶於乙酸乙酯(50mL)中，將10%鈀碳(1g,33% w/w)加至反應液中，置換氫氣3次，氫氣氛圍下(氣球)室溫反應5h。將反應液用矽藻土(3g)過濾，濾液減壓濃縮至乾。加入乙酸乙酯(6mL)加熱溶解，加入石油醚(6mL)後緩慢降至室溫析出固體，過濾，濾餅於50℃減壓烘乾，得到甲基(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1e)，白色泡狀固體(2.1g，產率88%)。
第五步：甲基(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己酸酯(1f)
methyl(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoate
室溫下，將甲基(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]-6-(第三丁氧羰基氨基)己酸酯(1e)(2.1g,4.0mmol)溶於乙酸乙酯(30mL)中，降溫至0℃。將(2R)-2-(第三丁氧羰基)-3-苯基-丙酸(1.3g,4.9mmol)，1-羥基苯並三唑(0.65g,4.8mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1.1g,5.7mmol)依次加至反應液中，升溫至25℃，於該溫度下反應5h。加入1M鹽酸水溶液(15mL)洗滌、分液。有機相中加入飽和碳酸氫鈉水溶液(15mL)攪拌30分鐘、分液。有機相用依次用1M鹽酸水溶液(15mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(15mL)、飽和氯化鈉水溶液(15mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮，矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=100：1~5：1)，得到甲基(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己酸酯(1f)，白色泡狀固體(2.3g，產率74%)。
第六步：(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基-丙基]氨基]-3-苯基-丙基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己酸(中間體1)
(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoic acid
室溫下，將甲基(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己酸酯(1f)(2.3g,3.0mmol)溶於甲醇(20mL)中，將氫氧化鈉(200mg,5.0mmol)的水溶液(20mL)加至反應液中，於該溫度下反應5h。用1M鹽酸水溶液調節反應液pH<4，用乙酸乙酯(40mL)萃取、分液。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮後得到(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基-丙基]氨基]-3-苯基-丙基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己酸(中間體1)，白色泡狀固體(2.1g，產率93%)。
Ms m/z(ESI)：752.5[M-H]-；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.38-7.27(m,3H),7.25-7.07(m,7H),4.82-4.62(m,1H),4.61-4.41(m,2H),4.37-4.18(m,1H),3.37-2.67(m,6H),2.00-1.65(m,3H),1.59-1.37(m,15H),1.35-1.26(m,9H),0.90-0.80(m,6H)。
實施例1：
2-氨基-7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸；三三氟乙酸鹽
2-amino-7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-7-azaspiro[3.5]nonane-2-carboxylic acid；tri-trifluoroacetate
第一步：2-[(1S)-1-苯基乙基]亞氨基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(2B)
tert-butyl 2-[(1S)-1-phenylethyl]imino-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
室溫下，將2-氧代-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸第三丁酯(2A)(7.2g,30mmol)、(1S)-1-苯乙胺(3.7g,31mmol)溶於甲苯(100mL)中，加入對甲苯磺酸(300mg,1.74mmol)，Dean-Stark迴流分水。6h後，將反應液減壓濃縮至乾，得到2-[(1S)-1-苯基乙基]亞氨基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(2B)粗產物，黃色泡狀固體(10g，產率97%)。
第二步：2-氰基-2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(2C)
tert-butyl 2-cyano-2-[[(1S)-1-phenylethyl]amino]-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
室溫下，將2-[(1S)-1-苯基乙基]亞氨基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(2B)粗產物(10g,29.2mmol)溶於甲醇(90mL)中，冰浴冷卻至0℃。攪拌下加入氯化鋅(210mg,1.54mmol)，緩慢滴入氰基三甲基矽烷(3g,30.2mmol)，保持0℃反應3h。將反應液過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v/v)=4：1)，得到2-氰基-2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(2C)，黃色泡狀固體(4.7g，產率44%)。
第三步：2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸(2D)
2-[[(1S)-1-phenylethyl]amino]-7-azaspiro[3.5]nonane-2-carboxylic acid
室溫下，將2-氰基-2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(2C)(2g,5.4mmol)溶於濃鹽酸(20mL)中，然後迴流反應40h。降至室溫，並將反應液減壓濃縮，得到2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸(2D)粗產物，黃色油狀液體(1.5g，產率96%)，直接用於下一步反應。
第四步：7-第三丁氧基羰基-2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸(2E)
7-tert-butoxycarbonyl-2-[[(1S)-1-phenylethyl]amino]-7-azaspiro[3.5]nonane-2-carboxylic acid
室溫下，將2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸(2D)粗產物(1g,3.47mmol)溶於四氫呋喃(10mL)中，加入氫氧化鈉(0.5g,12.5mmol)的水(10mL)溶液，然後加入二碳酸二第三丁酯(908mg,4.16mmol)，並於室溫下反應6h。將反應液過濾，得到7-第三丁氧基羰基-2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸(2E)粗產物，白色固體(0.8g，產率60%)。
第五步：O7-第三丁基O2-甲基2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯(2F)
O7-tert-butyl O2-methyl 2-[[(1S)-1-phenylethyl]amino]-7-azaspiro[3.5]nonane-2,7-dicarboxylate
室溫下，將7-第三丁氧基羰基-2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸(2E)(775mg,2.0mmol)溶於二氯甲烷(10mL)中，加入甲醇(10mL)。室溫下，攪拌下依次加入1-羥基苯並三唑(270mg,2.0mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.6g,3.13mmol)，反應15h。將反應液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：1)，得到O7-第三丁基O2-甲基2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯(2F)，淡黃色泡狀固體(560mg，產率70%)。
第六步：甲基2-[[(1S)-1-苯乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸甲酯(2G)
methyl 2-[[(1S)-1-phenylethyl]amino]-7-azaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
室溫下，將O7-第三丁基O2-甲基2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯(2F)(500mg,1.24mmol)溶於二氯甲烷(4.5mL)中，降溫至0℃。加入三氟乙酸(1.5mL)，室溫下反應3h，將反應液減壓濃縮，得到甲基2-[[(1S)-1-苯乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸甲酯(2G)，黃色油狀液體(320mg，產率85%)。
第七步：7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R))-2-[[(2R)苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜-螺[3.5]壬烷-2-羧酸甲酯
methyl 7-[(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-2-[[(1S)-1-phenylethyl]amino]-7-azaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
室溫下，將甲基2-[[(1S)-1-苯乙基]氨基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸甲酯(2G)(300mg,1.0mmol)溶於二氯甲烷(10mL)中，加入中間體1(753mg,1.0mmol)。室溫下，攪拌下依次加入1-羥基苯並三唑(135mg,1.0mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.23g,1.2mmol)，反應15h。將反應液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，收集沖提劑減壓濃縮，得到白色泡狀固體的7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R))-2-[[(2R)苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜-螺[3.5]壬烷-2-羧酸甲酯(2H)(710mg，產率69%)。
第八步：2-氨基-7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸甲酯(2I)
methyl 2-amino-7-[(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-7-azaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
室溫下，將7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R))-2-[[(2R)苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-2-[[(1S)-1-苯基乙基]氨基]-7-氮雜-螺[3.5]壬烷-2-羧酸甲酯(2H)(700mg,0.7mmol)溶於乙酸乙酯(10mL)中。加入鈀碳(0.1g，20wt%)，置換氫氣3次，氫氣氛圍下(氣球)室溫反應5h。將反應液用矽藻土過濾，濾液濃縮至乾，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到2-氨基-7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基基)-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸甲酯(2I)，白色泡狀固體(370mg，產率60%)。
第九步：2-氨基-7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸酯三三氟乙酸鹽(2J)
methyl 2-amino-7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-7-azaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate；2,2,2-trifluoroacetic acid
室溫下，將2-氨基-7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基基)-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸甲酯(2I)(370mg,0.4mmol)溶於二氯甲烷(3mL)中，降溫至0℃。加入三氟乙酸(1mL)，升至室溫，反應3h。將反應液減壓濃縮至乾，得到2-氨基-7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸酯三三氟乙酸鹽(2J)粗產物，黃色油狀液體(305mg，產率72%)。
第十步：2-氨基-7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸；三三氟乙酸鹽(化合物2)
2-amino-7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-7-azaspiro[3.5]nonane-2-carboxylic acid；tri-trifluoroacetic acid
室溫下，將氫氧化鈉(50mg，1.25mmol)溶於水(2mL)中，加入2-氨基-7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸酯三三氟乙酸鹽(2J)粗產物(305mg,0.288mmol)，室溫下反應5h。將反應液減壓濃縮至乾，製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150mmol)[[(2R)-2-met；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到2-氨基-7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸；三三氟乙酸鹽(化合物2)(92mg，產率31%)。
MS m/z(ESI)：360.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ7.44-7.18(m,10H),4.65(t,1H),4.33-4.18(m,2H),3.58(br,2H),3.52-3.41(m,1H),3.41-3.29(m,1H),3.17(d,2H),3.10-2.90(m,4H),2.70-2.46(m,2H),2.32-2.18(m,2H),2.05-1.28(m,14H),0.98-0.84(m,6H)。
化合物2-1(游離形式的化合物2)：
將化合物2(7.3g,6.88mmo)通過離子交換樹脂(300mL)(水~3.3%氨水沖提)，減壓濃縮所接收到的沖提溶液(水溫60℃下減壓濃縮至100mL)，進一步凍乾得到化合物2-1，白色固體(4,5g，產率90.8%)。
MS m/z=720.5[M+2H]+；1HNMR(400MHz,D2O)δ 7.34-7.22(m,6H),7.18-7.06(m,4H),4.78-4.72(m,1H),4.55(t,1H),4.25(t,1H),3.65-3.46(m,3H),3.45-3.25(m,2H),3.09-2.97(m,1H),2.95-2.84(m,3H),2.85-2.73(m,2H),2.51-2.33(m,2H),2.00-1.83(m,2H),1.82-1.25(m,13H),0.96-0.78(m,6H)。
實施例2：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-氧代-3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-10-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物3)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(2-oxo-3,10-diazadispiro[4.1.5^{7}.1^{5}]tridecane-10-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：2-(2-乙氧基-2-氧代-亞乙基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3B)
tert-butyl 2-(2-ethoxy-2-oxo-ethylidene)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
將四氫呋喃(50mL)加入反應瓶中，氮氣保護下加入氫化鈉(1.3g，54.2mmol)，冰水浴冷卻至0℃，緩慢滴入膦醯基乙酸三乙酯(6.9g，31mmol)，加完後0℃反應20min。冷卻至-5至0℃，緩慢滴入2-氧代-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3A)(5g，20.9mmol)的四氫呋喃(20mL)溶液，加完後升至室溫反應1h。加入飽和氯化鈉水溶液(50mL)，乙酸乙酯(50mL×2) 萃取，合併有機層，有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到2-(2-乙氧基-2-氧代-亞乙基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3B)粗產物，淡黃色油狀液體(6.0g，產率92.8%)，直接用於下一步。
第二步：2-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-2-(硝基甲基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3C)
tert-butyl 2-(2-ethoxy-2-oxo-ethyl)-2-(nitromethyl)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
將2-(2-乙氧基-2-氧代-亞乙基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3B)加入反應瓶中，加入四氫呋喃(60mL)，室溫攪拌溶解完全，然後加入硝基甲烷(6.0g，98.3mmol)和四丁基氟化銨(7.85g，30mmol)。加完後，升溫迴流反應5h。將反應液冷卻至室溫，加入乙酸乙酯(150mL)，飽和氯化鈉水溶液(100mL×1)洗滌、分液。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓減壓濃縮至乾，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=10：1)，得到2-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-2-(硝基甲基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3C)，無色透明油狀液體(6.5g，產率90%)。
第三步：2-(氨基甲基)-2-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3D)
tert-butyl 2-(aminomethyl)-2-(2-ethoxy-2-oxo-ethyl)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
將2-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-2-(硝基甲基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3C)(6.5g，18mmol)加入到反應瓶中，加入乙醇(75mL)和水(25mL)，鐵粉(4.9g，88mmol)和氯化銨(4.7g，88.00mmol)，然後迴流反應5h。降溫至室溫，並將反應體系濃縮至20mL，加入水(30mL)，用氨水調節pH至大於10，用二氯甲烷(50mL×2)萃取，合併有機相，有機相減壓濃縮至乾，得到2-(氨基甲基)-2-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3D)，淡黃色油狀液體(5.1g，產率85%)。
第四步：第三丁基2-氧代-3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-10-羧酸第三丁酯(3E)
tert-butyl 2-oxo-3,10-diazadispiro[4.1.5^{7}.1^{5}]tridecane-10-carboxylate
將2-(氨基甲基)-2-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3D)(3g，8.8mmol)加入到反應瓶中，加入氫氧化鈉(400mg，10mmol)的水(30mL)溶液，室溫反應5h。將反應液過濾，得到第三丁基2-氧 代-3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-10-羧酸第三丁酯(3E)，白色固體(2.10g，產率81%)。
第五步：3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-2-酮(3F)
3,10-diazadispiro[4.1.5^{7}.1^{5}]tridecan-2-one
將第三丁基2-氧代-3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-10-羧酸第三丁酯(3E)(1g，3.4mmol)，溶於二氯甲烷(9mL)中，加入三氟乙酸(3mL)，室溫反應5h反應完全。將反應液減壓濃縮至乾，加入水(20mL)，用2M氫氧化鈉水溶液調節體系PH>10，用二氯甲烷(20mL×2)萃取、分液，合併有機相，有機相減壓濃縮，得到3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-2-酮(3F)粗產物，黃色油狀液體(0.6g，產率85%)。
第六步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)1-(2-氧代-3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-10-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(3G)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(2-oxo-3,10-diazadispiro[4.1.5^{7}.1^{5}]tridecane-10-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
氮氣保護下將二氯甲烷(30mL)加入到反應瓶中，加入中間體1(2.25g，2.98mmol)、3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-2-酮(3F)粗產物(0.6g，2.88mmol)，1-羥基苯並三唑(0.39g，2.89mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.83g，4.33mmol)，室溫反應15h。然後加入水(20mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取、分液，合併有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=20：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)1-(2-氧代-3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-10-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(3G)，白色泡狀固體(1.77g，產率73.2%)。
第七步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-氧代-3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-10-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物3)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(2-oxo-3,10-diazadispiro[4.1.5^{7}.1^{5}]tridecane-10-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
氮氣保護下，將N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)1-(2-氧代-3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-10-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(3G)(0.90g,1mmol)和二氯甲烷(21mL)加入到反應瓶中，攪拌下加入三氟乙酸(7mL)，室溫反應3h。將反應液減壓濃縮至乾，殘留物製備分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A for ACN and B for H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-氧代-3,10-二氮雜螺[4.1.5^{7}.1^{5}]十三烷-10-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物3)，白色固體(0.98g，率54%)。
MS m/z(ESI)：365.9[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 8.86-8.67(m,1H),8.40-8.23(m,1H),8.14-8.01(m,3H),7.84-7.72(m,2H),7.52-7.42(m,1H),7.37-7.15(m,10H),4.76-3.94(m,4H),3.59-2.65(m,12H),2.29-2.15(m,2H),1.93-1.19(m,17H),0.88(dd,6H)。
實施例3：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(9-氧代-2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-2-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物4)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(9-oxo-2,8-diazadispiro[3.1.4^{6}.1^{4}]undecane-2-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：第三丁基6-(2-乙氧基-2-氧代-亞乙基)-2-氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸第三丁酯(4B)
tert-butyl 6-(2-ethoxy-2-oxo-ethylidene)-2-azaspiro[3.3]heptane-2-carboxylate
將四氫呋喃(50mL)加入反應瓶中，加入氫化鈉(2.5g，59.2mmol)，冰水浴冷卻至0℃，緩慢滴入膦醯基乙酸三乙酯(7.96g，35.5mmol)，加完後0℃反應20min。接著冷卻至-5至0℃，緩慢滴加6-氧代-2-氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸第三丁酯(4A)(5g，23.7mmol)的四氫呋喃(20mL)溶液，加完後室溫反應1h。然後向反應液中加入飽和氯化鈉水溶液(50mL)，乙酸乙酯(50mL×2)萃取、分液，合併有機相。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到第三丁基6-(2-乙氧基-2-氧代-亞乙基)-2-氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸第三丁酯(4B)粗產物，黃色油狀液體(5.5g，產率83%)，直接用於下一步。
第二步：6-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-6-(硝基甲基)-2-氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸第三丁酯(4C)
tert-butyl 6-(2-ethoxy-2-oxo-ethyl)-6-(nitromethyl)-2-azaspiro[3.3]heptane-2-carboxylate
將第三丁基6-(2-乙氧基-2-氧代-亞乙基)-2-氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸第三丁酯(4B)粗產物加入到反應瓶中，加入四氫呋喃(60mL)，室溫攪拌溶解完全，然後加入硝基甲烷(6.0g，98.3mmol)和四丁基氟化銨(7.85g，30mmol)。加完後，升溫迴流反應5h。將反應液冷卻至室溫，加入乙酸乙酯(150 mL)，飽和氯化鈉水溶液(100mL)洗滌、分液。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=4：1)，得到6-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-6-(硝基甲基)-2-氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸第三丁酯(4C)，無色透明油狀液體(5.1g，產率76%)。
第三步：6-(氨基甲基)-6-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-2-氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸第三丁酯(4D)
tert-butyl 6-(aminomethyl)-6-(2-ethoxy-2-oxo-ethyl)-2-azaspiro[3.3]heptane-2-carboxylate
將6-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-6-(硝基甲基)-2-氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸第三丁酯(4C)(5.1g，15mmol)加入到反應瓶中，加入乙醇(75mL)和水(25mL)，鐵粉(4.2g，74mmol)和氯化銨(4.0g，74mmol)，升溫迴流反應5h。降至室溫，將反應體系濃縮至約20mL，加入水(30mL)，接著用氨水調節pH至大於10，用二氯甲烷(50mL x 2)萃取、分液，合併有機相，將有機相減壓濃縮，得到6-(氨基甲基)-6-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-2-氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸第三丁酯(4D)粗產物，(4.6g，產率99%)，並直接用於下一步。
第四步：第三丁基9-氧代-2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-2-羧酸第三丁酯(4E)
tert-butyl 9-oxo-2,8-diazadispiro[3.1.4^{6}.1^{4}]undecane-2-carboxylate
將6-(氨基甲基)-6-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)-2-氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸第三丁酯(4D)粗產物(4.6g，15mmol)加入到反應瓶中，加入氫氧化鈉(600mg，15mmol)的水(45mL)溶液，室溫反應5h。將反應液過濾，得到第三丁基9-氧代-2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-2-羧酸第三丁酯(4E)，白色固體(2.90g，產率74%)。
第五步：2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-9-酮鹽酸鹽(4F)
2,8-diazadispiro[3.1.4^{6}.1^{4}]undecan-9-one；hydrochloride
將第三丁基9-氧代-2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-2-羧酸第三丁酯(4E)(2g，7.5mmol)，溶於4N HCl-異丙醇溶液(9mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮至乾，得到2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-9-酮鹽酸鹽(4F)粗產物，白色固體(0.95g，產率62%)，並直接用於下一步。
第六步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)1-(9-氧代-2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(4G)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(9-oxo-2,8-diazadispiro[3.1.4^{6}.1^{4}]undecane-2-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate；
氮氣保護下將二氯甲烷(30mL)加入到反應瓶中，加入中間體1(2.25g，2.98mmol)，2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-9-酮鹽酸鹽(4F)(0.6g，3.0mmol)，1-羥基苯並三唑(0.39g，2.89mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.83g，4.33mmol)，室溫反應15h。然後加入水(20mL)，乙酸乙酯(30mL×3)萃取、分液，合併有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=10：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)1-(9-氧代-2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(4G)，白色泡狀固體(1.9g，產率70%)。
第七步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(9-氧代-2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-2-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基〕氨基〕-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物4)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(9-oxo-2,8-diazadispiro[3.1.4^{6}.1^{4}]undecane-2-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2- amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
氮氣保護下，將N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)1-(9-氧代-2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(4G)(1.7g,1.9mmol)和二氯甲烷(21mL)加入到反應瓶中，攪拌下加入三氟乙酸(7mL)，室溫反應3h。將反應液減壓濃縮乾，殘留物用製備色譜分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(9-氧代-2,8-二氮雜螺[3.1.4^{6}.1^{4}]十一烷-2-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物4)，白色固體(0.7g，產率40%)。
MS m/z(ESI)：351.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )δ 8.76(d,1H),8.32(d,1H),8.11-7.97(m,4H),7.85-7.69(m,3H),7.50(s,1H),7.33-7.18(m,10H),4.74-3.74(m,8H),3.24-2.63(m,8H),2.27-2.05(m,6H),1.71-1.17(m,9H),0.89(dd,6H)。
實施例4：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-環丙基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺(化合物6)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(2-cyclopropylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide
第一步：7-苄基2-第三丁基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯(6B)
7-benzyl 2-tert-butyl 2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2,7-dicarboxylate
0℃下，50mL單口瓶中，將三乙胺(0.15mL,1.1mmol)滴入到2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(6A)(0.23g,1mmol)的四氫呋喃(5mL)溶液中，滴畢，加入氯甲酸苄酯(340mg,2mmol)，攪拌10min。升至室溫繼續攪拌1h，反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮後得到7-苄基2-第三丁基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯(6B)，無色油狀產物(362mg，產率99%)。
MS m/z=383.2[M+Na]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.34-7.32(m,5H),5.12(s,2H),3.64(s,4H),3.43(dd,4H),1.77-1.61(m,4H),1.44(s,9H)。
第二步：2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)
benzyl 2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入7-苄基2-第三丁基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯(6B)(0.36g，1mmol)和二氯甲烷(7mL)，室溫下滴加三氟乙酸(1mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)粗產物，黃色油狀液體(260mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
MS m/z=261.2[M+H]+；
第三步：2-環丙基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6D)
benzyl 2-cyclopropylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)粗產物(260mg，1mmol)、三乙胺(200mg，2mmol)和二氯甲烷(7mL)。冰浴冷卻至0℃，滴加環丙基磺醯氯(170mg，1.2mmol)，加完後升至室溫反應4h。然後反應體系用飽和碳酸氫鈉(10mL)淬滅，乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合併有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=4：1)，得到2-環丙基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯化合物(6D)，白色固體(360mg，產率99%)。
MS m/z=365.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.43-7.28(m,5H),5.12(s,2H),3.70(s,4H),3.53-3.36(m,4H),2.41-2.22(m,1H),1.85-1.69(m,4H),1.19-1.09(m,2H),1.04-0.93(m,2H)。
第四步：2-環丙基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(6E)
2-cyclopropylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane
在50mL反應瓶中，加入2-環丙基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6D)(360mg,0.99mmol)、鈀碳(72mg,20wt%)和乙酸乙酯(10mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應2h。反應液用矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到2-環丙基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(6E)，淡黃色固體(210mg，產率92%)，並直接投入下一步反應。
第五步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2-環丙基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(6F)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(2-cyclopropylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入2-環丙基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(6E)(161mg，0.7mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(124mg，0.8mmol)、1-羥基苯並三唑(108mg，0.8mmol)、中間體1(500mg，0.7mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2-環丙基磺醯基-2,7- 二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(6F)，白色固體(610mg，產率95%)。
第六步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-環丙基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺(化合物6)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(2-cyclopropylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)1-(2-環丙基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(6F)(300mg，0.31mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A for ACN and B for H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾得到白色粉末狀化合物。再通過離子交換樹脂(水~3.3%氨水沖提)，減壓濃縮所接收到 的沖提溶液(水溫60℃下減壓濃縮至25mL)，進一步凍乾得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-環丙基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺(化合物6)，白色固體(153mg，產率63%)。
MS m/z=383.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.40-7.24(m,6H),7.16(dd,4H),4.72-4.73(m,1H),4.58-4.52(m,1H),4.25(t,1H),3.84(dd,,4H),3.67-3.55(m,3H),3.46-3.45(m,1H),3.35-3.34(m,1H),3.03(dd,1H),2.91(dd,3H),2.82(d,2H),2.69(ddd,1H),1.85-1.86(m,3H),1.670-1.66(m,5H),1.51-1.49(m,3H),1.38-1.36(m,2H),1.23-1.06(m,4H),0.88(dd,6H)。
實施例5：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物7)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(2-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetate
第一步：2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(7A)
benzyl 2-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(330mg，1.3mmol)、三乙胺(263mg，2.6mmol)和二氯甲烷(20mL)，攪拌溶解。冷卻至-10℃，滴加甲磺醯氯(164mg，1.43mmol)，反應4h。然後升至室溫，反應液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(60mL)、3N鹽酸水溶液(60mL)洗滌、分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：1)，得到2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(7A)，淡黃色油狀物(236mg，產率54.6%)。
MS m/z=339.0[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.41-7.28(m,5H),5.12(s,2H),3.68(s,4H),3.50-3.38(m,4H),2.86(s,3H),1.83-1.70(m,4H)。
第二步：2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(7B)
2-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane
在50mL反應瓶中，加入2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(7A)(236mg，0.7mmol)、鈀碳(40mg，20wt%)和甲醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應8h。然後反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(7B)粗產物，淡黃色固體(133mg，產率100%)，直接投入下一步反應。
MS m/z=205.1[M+1]+；
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(7C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(2-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(7B)粗產物(133mg，0.65mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(374mg,1.95mmol)、1-羥基苯並三唑(96.6mg，0.72mmol)、中間體1(490 mg，0.65mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(7C)，淡黃色固體(317mg，產率52%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺(化合物7)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(2-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)1-(2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(7C)(317mg，0.34mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN 及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，收集製備液，減壓濃縮除去大部分有機溶劑，並凍乾得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺(化合物7)，白色粉末(217mg，產率66.5%)。
MS m/z=370.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.43-7.27(m,6H),7.25-7.20(m,4H),4.67-4.62(m,2H),4.33-4.20(m,2H),3.87-3.71(m,4H),3.69-3.56(m,2H),3.53-3.41(m,1H),3.40-3.29(m,1H),3.23-3.12(m,2H),3.11-3.07(m,3H),3.07-2.91(m,4H),1.94-1.78(m,3H),1.78-1.60(m,5H),1.58-1.48(m,3H),1.46-1.28(m,2H),0.98-0.82(m,6H)。
實施例6：
(2R)-N-[(1R)-1-(2-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物8)
(2R)-N-[(1R)-1-(2-acetyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)-5-amino-pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：2-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(8A)
benzyl 2-acetyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
氮氣保護下，在50mL反應瓶中，將2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(520mg,2.0mmol)溶於二氯甲烷(5mL)中，攪拌下加入三乙胺(607mg,6.0mmol)。然後降溫至-20℃，滴加乙醯氯(314mg,4.0mmol)，加完後自然升溫至室溫並攪拌2h。接著向反應中加入0.5M稀鹽酸水溶液(20mL)，並攪拌分層、分液，用二氯甲烷萃取水層(20mL x 2)，合併有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(純乙酸乙酯)，得到2-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯化合物(8A)，淡黃色油狀液體(440mg，產率72.8%)。
第二步：1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)乙酮(8B)
1-(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-2-yl)ethanone
在50mL反應瓶中，將2-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(8A)(440mg,1.46mmol)加入到乙酸乙酯(5mL)和甲醇(2mL)的混合溶液中。然後加入鈀碳(80mg,20wt%)，氫氣(氣球)氛圍下室溫攪拌2h。接著將反應液過濾，濾液減壓濃縮，得到1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)乙酮(8B)粗產物，淡黃色油狀液體(250mg，收率99%)，直接用於下一步反應。
第三步：第三丁基N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(2-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷--7-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸酯(8C)
tert-butyl N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(2-acetyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]carbamate
氮氣保護下，在50mL反應瓶中，將1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)乙酮(8B)粗產物(200mg，1.19mmol)加入到乙酸乙酯(10mL)中。冰浴冷卻 至0℃，加入中間體1(867mg,1.15mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(331mg,1.73mmol)、1-羥基苯並三唑(186mg,1.38mmol)，加完後室溫反應1.5h。隨後向反應液中加入1N鹽酸水溶液(15mL)，攪拌後分液。有機相中加入飽和碳酸鈉水溶液(15mL)，攪拌30分鐘後分液。有機相用飽和氯化鈉水溶液(15mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到第三丁基N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(2-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷--7-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸酯(8C)粗產物，淡黃色泡狀固體(1.04g，產率99%)，直接用於下一步反應。
第四步：(2R)-N-[(1R)-1-(2-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物8)
(2R)-N-[(1R)-1-(2-acetyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)-5-amino-pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
將第三丁基N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(2-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷--7-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸酯(8C)粗產物 (1.04g,1.15mmol)的粗產物溶於二氯甲烷(7.5mL)中，加入三氟乙酸(3.5mL)，室溫下攪拌1h。接著將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化後(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A for ACN and B for H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，收集製備液，減壓濃縮除去大部分有機溶劑，並凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-1-(2-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物8)，白色固體(460mg,兩步產率42.9%)。
MS m/z(ESI)：352.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.49-7.00(m,10H),4.66-4.49(m,2H),4.30-3.93(m,4H),3.79-3.54(m,4H),3.52-3.25(m,2H),3.22-2.90(m,6H),1.92-1.27(m,16H),1.02-0.75(m,6H).
化合物8-1：
將化合物8(1.0g,1.07mmo)通過離子交換樹脂(60mL)(水~3.3%氨水沖提)，減壓濃縮所接收到的沖提溶液(水溫60℃下減壓濃縮至100mL)，進一步凍乾得到化合物8的游離形式即化合物8-1，白色固體(451mg，產率60.0%)。
MS m/z(ESI)：352.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.45-7.32(m,6H),7.23(dd,4H),4.85-4.75(m,1H),4.64(t,1H),4.35(t,1H),4.07(d,2H),3.83(d,2H),3.74-3.63(m,3H), 3.62-3.50(m,1H),3.50-3.39(m,1H),3.17-2.65(m,6H),2.01-1.66(m,9H),1.65-1.30(m,7H),0.96(dd,6H).
實施例7：
7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸異丙酯；二三氟乙酸鹽(化合物9)
isopropyl 7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate；di-trifluoroacetic acid
第一步：O7-苄基O-異丙基2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯(9A)
O7-benzyl O2-isopropyl 2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2,7-dicarboxylate
在50mL單口瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(310mg，1.2mmol)、三乙胺(364mg，3.6mmol)和二氯甲烷(20mL)，並在室溫下攪拌溶解。然後冷卻至-10℃，滴加氯甲酸異丙酯(146mg，1.2mmol)，加完後升至室溫，並反應4h。反應體系依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(60mL)、3M鹽酸水溶液(60mL)洗滌、分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：1)，得到O7-苄基O-異丙基2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯化合物(9A)，淡黃色油狀液體(279mg，產率68%)。
MS m/z=347.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.38-7.30(m,5H),5.12(s,2H),4.95-4.80(m,1H),3.68(s,4H),3.47-3.39(m,4H),1.75-1.68(m,4H),1.23(d,6H)。
第二步：2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸異丙酯(9B)
isopropyl 2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入O7-苄基O-異丙基2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯(9A)(260mg，0.75mmol)、鈀碳(52mg，20wt%l)和甲醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應8h。然後將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸異丙酯(9B)粗產物，淡黃色固體(159mg，產率100%)，直接投入下一步反應。
MS m/z=213.2[M+1]。
第三步：7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基1]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基戊醯基]氨基]己醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸異丙酯(9C)
isopropyl 7-[(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸異丙酯(9B)粗產物(159mg，0.75mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(374mg，1.95mmol)、1-羥基苯並三唑(110mg，0.81mmol)、中間體1(565mg，0.75mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基1]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基戊醯基]氨基]己醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸異丙酯(9C)，淡黃色固體(556mg，產率78%)。
第四步：7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸異丙酯；二三氟乙酸鹽(化合物9)
isopropyl 7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate；di-trifluoroacetic acid
在50mL單口瓶中，加入7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基1]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基戊醯基]氨基]己醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸異丙酯(9C)(317mg，0.334mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸異丙酯；二三氟乙酸鹽(化合物9)，白色粉末狀產物(326mg，產率98%)。
MS m/z=374.9[M+2H]+/2； 1HNMR(400MHz,D2O)δ 7.50-7.14(m,10H),4.89-4.78(m,1H),4.66(t,1H),4.30(t,1H),4.22(t,1H),3.89-3.74(m,4H),3.69-3.54(m,2H),3.54-3.41(m,1H),3.41-3.28(m,1H),3.21-3.11(m,2H),3.11-2.90(m,4H),1.93-1.30(m,14H),1.27(d,6H),0.93(q,6H)。
實施例8：
((2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物10)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
第一步：7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(10A)
tert-butyl7-[(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(6A)(0.11g,0.5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(115mg，0.6mmol)、1-羥基苯並三唑(81mg，0.6mmol)、中間體1(378mg，0.5mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(10A)白色固體(450mg，產率93%)。
第二步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物10)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
在50mL單口瓶中，加入7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(10A)(450mg，0.468mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物10)白色粉末狀產物(358mg，產率76%)。
MS m/z=331.8[M-2CF3COOH+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.48-7.10(m,10H),4.65-4.61(m,2H),4.28-4.20(m,2H),3.93(d,4H),3.70-3.57(m,2H),3.52-3.39(m,1H),3.39-3.27(m,1H),3.15(d,2H),3.02-2.94(m,4H),1.98-1.87(m,3H),1.82-1.60(m,5H),1.51-1.50(m,3H),1.44-1.36(m,2H),0.89(dd,6H)。
實施例9：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物11)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
第一步：2-[(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R))-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基戊醯基]氨基]己醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(11A)
Benzyl 2-[(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL單口瓶中，2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(0.26g，1mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(230mg，1.2mmol)、1-羥基苯並三唑(162mg，1.2mmol)、中間體1(0.75g，1mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到2-[(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R))-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(11A)，白色固體(850mg，產率85%)。
第二步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(11B)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入2-[(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R))-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(11A)(850mg，0.85mmol)、鈀碳(170mg，20wt%)和甲醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應8h。然後將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(11B)粗產物，白色固體(580mg，產率79%)，直接投入下一步反應。
第三步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物11)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
在50mL單口瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁 酯(11B)(0.5g，0.58mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物11)，白色粉末狀產物(380mg，產率66%)。
MS m/z=331.8[M-2CF3COOH+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.43-7.13(m,10H),4.61(t,1H),4.28-4.06(m,5H),3.84-3.74(m,2H),3.19-3.14(m,6H),2.99-2.95(m,4H),2.09-1.94(m,4H),1.79-1.61(m,4H),1.55-1.31(m,5H),0.89(dd,6H)。
實施例10：
2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(7-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物12)
2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(7-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：7-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(12A)
tert-butyl 7-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(6A)(0.23g,1mmol)、三乙胺(210mg，2.0mmol)和二氯甲烷(7mL)，攪拌溶解。冷卻至-10℃，滴加甲磺醯氯(140mg，1.2mmol)，反應4h。然後升至室溫，然後反應體系用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)淬滅，乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合併有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=4：1)，得到7-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(12A)，淡黃色油狀物(250mg，產率81%)。
MS m/z=327.2[M+Na]+。
第二步：7-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(12B)
7-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane
在50mL反應瓶中，加入7-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(12A)(0.25g，0.81mmol)和二氯甲烷(7mL)，室溫下滴加三氟乙酸(1mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到7-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(12B)粗產物，淡黃色油狀液體(165mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(7-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(12C)
tert-butylN-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(7-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入7-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(12B)粗產物(165mg，0.75mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(192mg，1mmol)、1-羥基苯並三唑(135mg，1mmol)、中間體1(610mg，0.81mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(7-甲磺醯基-2,7-二氮 雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(12C)，白色固體(630mg，產率82.7%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(7-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物12)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(7-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(7-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(12C)(630mg，0.34mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(7-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2- [[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物12)，白色粉末(410mg，產率63.2%)。
MS m/z=370.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.43-7.15(m,10H),4.61(t,1H),4.33-3.96(m,5H),3.79-3.69(m,2H),3.25-3.13(m,7H),3.02-2.93(m,6H),1.91-1.86(m,3H),1.70-1.64(m,3H),1.56-1.31(m,5H),1.25(t,2H),0.89(dd,6H)。
實施例11：
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(吡咯烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物13)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(pyrrolidine-1-carbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：吡咯烷-1-碳醯氯(13B)
pyrrolidine-1-carbonyl chloride
在50mL單口瓶中，加入NaHCO3(5.04g，60mmol)、三光氣(5.94g，20mmol)和二氯甲烷(10mL)，反應液冷卻至-10℃，然後緩慢滴加吡咯烷(2.16g，30.4mmol)，加完後恢復室溫反應過夜。將反應液過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=3：1)，得到吡咯烷-1-碳醯氯(13B)，無色油狀物(2.07g,產率51.65%)。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ 3.62-3.56(m,2H),3.54-3.44(m,2H),2.02-1.90(m,4H)。
第二步：2-(吡咯烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(13C)
benzyl 2-(pyrrolidine-1-carbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(350mg，1.3mmol)、三乙胺(408mg，4.03mmol)和二氯甲烷(20mL)，並在室溫下攪拌溶解。然後將反應液冷卻至0℃，滴加吡咯烷-1-碳醯氯(13B)(123mg，0.92mmol)，加完後升至室溫，並反應4h。反應液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(60mL)、3mol/L鹽酸水溶液(60mL)洗滌、分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到2-(吡咯烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(13C)粗產物，淡黃色油狀液體(460mg，產率100%)。
MS m/z=358.2[M+H]+。
第三步：2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基(吡咯烷-1-基)甲酮(13D)
2,7-diazaspiro[3.5]nonan-2-yl(pyrrolidin-1-yl)methanone
在50mL單口瓶中，加入2-(吡咯烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(13C)粗產物(460mg，1.3mmol)、氫氧化鈀/碳(100mg，20wt%)和異丙醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，油浴加熱至100℃反應8h。然後將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基(吡咯烷-1-基)甲酮(13D)粗產物，淡黃色固體(290mg，產率100%)，直接投入下一步反應。
MS m/z=224.3[M+H]+。
第四步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(吡咯烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(13E)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-[2-(pyrrolidine-1-carbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，依次加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基(吡咯烷-1-基)甲酮(13D)粗產物(167mg，0.75mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(374mg，1.95mmol)、1-羥基苯並三唑(108mg，0.81mmol)、中間體1(556mg，0.75mmol)和二氯甲烷(30mL)，加完後在室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(吡咯烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(13E)，白色固體(360mg，產率29%)。
第五步：(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(吡咯烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物13)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(pyrrolidine-1-carbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(吡咯烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙 基]氨基甲酸第三丁酯(13E)(360mg，0.38mmol)和二氯甲烷(10mL)，在室溫下滴加三氟乙酸(3mL)，加完後反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(吡咯烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物13)，白色固體(169mg，產率45.6%)。
MS m/z=380.4[M+2H]+/2。
1HNMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 8.75(d,1H),8.35(d,1H),8.09(d,1H),8.01(br,3H),7.73(br,3H),7.34-7.17(m,10H),4.71-4.60(m,2H),4.40-4.32(m,1H),4.08-3.96(m,2H),3.73-3.23(m,8H),3.16-3.01(m,3H),2.98-2.86(m,1H),2.85-2.69(m,3H),1.82-1.69(m,4H),1.69-1.42(m,11H),1.36-1.22(m,2H),0.89(dd,6H)。
實施例12：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物14)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(3-methylsulfonylazetidine-1-carbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl- propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-碳醯氯(14B)
3-methylsulfonylazetidine-1-carbonyl chloride
在50mL單口瓶中，加入NaHCO3(756mg，9.0mmol)、三光氣(0.89g，4.5mmol)和二氯甲烷(8mL)，反應液冷切至-10℃，然後緩慢滴加3-甲基磺醯基氮雜環丁烷鹽酸鹽(772mg，4.5mmol)，加完後恢復室溫反應過夜。將反應液過濾，減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：1)，得到無色油狀物3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-碳醯氯(14B)(494mg，產率50%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 4.62-4.32(m,4H),4.07-3.92(m,1H),2.93(s,3H)。
第二步：2-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(14C)
benzyl 2-(3-methylsulfonylazetidine-1-carbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(350mg，1.3mmol)、三乙胺(406mg，4.01mmol)和二氯甲烷(20mL)，並在室溫下攪拌溶解。然後將反應液冷卻至0℃，滴加3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-碳醯氯(14B)(293mg，1.48mmol)，加完後升至室溫，並反應4h。反應液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(60mL)、3mol/L鹽酸水溶液(60mL)洗滌、分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，得到2-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(14C)，白色固體(300mg，產率55%)。
MS m/z=422.2[M+H]+；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ 7.41-7.28(m,5H),5.12(s,2H),4.30-4.19(m,4H),4.00-3.89(m,1H),3.69(s,4H),3.49-3.36(m,4H),2.90(s,3H),1.79-1.67(m,4H)。
第三步：2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-基)甲酮(14D)
2,7-diazaspiro[3.5]nonan-2-yl-(3-methylsulfonylazetidin-1-yl)methanone
在50mL單口瓶中，依次加入2-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(14C)(300mg，0.7mmol)、氫氧化鈀/碳(60mg，20wt%)和異丙醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，油浴加熱至100℃反應8h。然後將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-基)甲酮(14D)粗產物，淡黃色固體(202mg，產率100%)，直接投入下一步反應。
MS m/z=288.1[M+H]+。
第四步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(14E)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxy carbonylamino)-1-[2-(3-methylsulfonylazetidine-1-carbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，依次加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-基)甲酮(14D)粗產物(202mg，0.7mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(402mg，2.10mmol)、1-羥基苯並三唑(115mg，0.85mmol)、中間體1(536mg，0.71mmol)和二氯甲烷(30mL)，加完後在室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=40：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(14E)，淡黃色固體(686mg，產率96%)。
第五步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物14)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(3-methylsulfonylazetidine-1-carbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；2,2,2-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙 基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(14E)(680mg，0.66mmol)和二氯甲烷(10mL)，在室溫下滴加三氟乙酸(3mL)，加完後室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(3-甲基磺醯基氮雜環丁烷-1-羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物14)，白色固體(330mg，產率41.3%)。
MS m/z=412.3[M+2H]+/2；1HNMR(400MHz,D2O)δ 7.44-7.18(m,10H),4.66(t,1H),4.47-4.16(m,7H),3.90-3.72(m,4H),3.69-3.55(m,2H),3.53-3.41(m,1H),3.39-3.27(m,1H),3.24-3.14(m,2H),3.10(s,3H),3.09-2.90(m,4H),1.94-1.26(m,14H),0.92(d,6H)。
實施例13：
7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-甲醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物15)
7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl- pentanoyl]amino]hexanoyl]-N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxamide；2,2,2-trifluoroacetic acid
第一步：2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(15B)
benzyl 2-(methylcarbamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(310mg，1.2mmol)、三乙胺(364mg，3.6mmol)和二氯甲烷(20mL)，並在室溫下攪拌溶解。然後將反應液冷卻至0℃，滴加甲胺基甲醯氯(15A)(123mg，1.32mmol)，加完後升至室溫，並反應4h。反應液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(60mL)、3mol/L鹽酸水溶液(60mL)洗滌、分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(15B)粗產物，黃色油狀(440mg，產率100%)。
MS m/z=318.2[M+H]+； 1HNMR(400MHz,CDCl3)δ 7.39-7.28(m,5H),5.12(s,2H),3.66(s,4H),3.50-3.36(m,4H),2.79(s,3H),1.82-1.63(m,4H)。
第二步：N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-甲醯胺(15C)
N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxamide
在50mL單口瓶中，依次加入2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(15B)粗產物(260mg，0.82mmol)、氫氧化鈀/碳(50mg，20wt%)和異丙醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，油浴加熱至100℃反應8h。然後將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-甲醯胺(15C)粗產物，淡黃色固體(150mg，產率100%)，直接投入下一步反應。
MS m/z=184.3[M+H]+。
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(15D)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-[2-(methylcarbamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，依次加入N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-甲醯胺(15C)粗產物(150mg，0.82mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(374mg，1.95mmol)、1-羥基苯並三唑(110mg，0.81mmol)、中間體1(565mg，0.75mmol)和二氯甲烷(30mL)，加完後在室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=40：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(15D)，淡黃色固體(480mg，產率63%)。
第四步：7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-甲醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物15)
7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(15D)(480mg，0.52mmol)和二氯甲烷(10mL)，在室溫下滴加三氟乙酸(3mL)，加完後反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-甲醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物15)，白色固體(260mg，產率53%)。
MS m/z=360.3[M+2H]+/2；1HNMR(400MHz,D2O)δ 7.43-7.28(m,6H),7.27-7.21(m,4H),4.66(t,1H),4.30(t,1H),4.21(t,1H),3.74(s,2H),3.70(s,2H),3.69-3.59(m,2H),3.55-3.43(m,1H),3.41-3.31(m,1H),3.24-3.12(m,2H),3.11-2.92(m,4H),2.69(s,3H),1.94-1.27(m,14H),0.93(dd,6H)。
實施例14：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(5,5-二氟-2-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物16)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(5,5-difluoro-2-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；2,2,2-trifluoroacetic acid
第一步：O7-苄基O2-第三丁基5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯(16B)
O7-benzyl O2-tert-butyl 5,5-difluoro-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2,7-dicarboxyl ate
在50mL單口瓶中，依次加入三乙胺(0.85mL,8.4mmol)、5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(16A)(2.1g,8.0mmol)和四氫呋喃(15mL)，將反應液冷卻至0℃，然後緩慢滴加氯甲酸苄酯(1.5g,8.8mmol)，加完後保持0℃下反應10分鐘，再升至室溫繼續攪拌5h。反應液過濾，濾液 減壓濃縮得到O7-苄基O2-第三丁基5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯(16B)，淡黃色油狀產物(3.5g，產率100%)。
MS m/z=419.3[M+Na]+；
第二步：5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(16C)
benzyl 5,5-difluoro-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入O7-苄基O2-第三丁基5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2,7-二羧酸酯(16B)(3.17g，8.0mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫下滴加三氟乙酸(6.0mL)，加完後室溫反應3h。將反應液用氨水調節pH約為13後分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(16C)，黃色油狀液體(2.43g，產率100%)，並直接用於下一步反應。
MS m/z=297.1[M+H]+；
第三步：5,5-二氟-2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(16D)
benzyl 5,5-difluoro-2-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(16C)(310mg，1.05mmol)、三乙胺(318mg，3.14mmol)和二氯甲烷(20 mL)，攪拌溶解。冷卻至-10℃，滴加甲磺醯氯(156mg，1.36mmol)，反應4小時。然後升至室溫，反應液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(60mL)、3M鹽酸水溶液(60mL)洗滌、分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=60：1)，得到5,5-二氟-2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(16D)，白色固體(233mg，產率59%)。
MS m/z=397.2[M+Na]+；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ 7.42-7.29(m,5H),5.15(s,2H),4.09(d,2H),3.78-3.59(m,4H),3.51(t,2H),2.89(s,3H),2.08(s,2H)。
第四步：5,5-二氟-2-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(16E)
5,5-difluoro-2-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane
在50mL反應瓶中，加入5,5-二氟-2-甲基磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(16D)(230mg，0.5mmol)、鈀/碳(40mg，20wt%)和異丙醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，油浴加熱至100℃反應8h。然後反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到5,5-二氟-2-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(16E)，淡黃色固體(155mg，產率100%)，直接投入下一步反應。
MS m/z=241.1[M+H]+；
第五步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(5,5-二氟-2-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基] 氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(16F)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(5,5-difluoro-2-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入5,5-二氟-2-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(16E)(155mg，0.5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(300mg,2.0mmol)、1-羥基苯並三唑(115mg，0.85mmol)、中間體1(377mg，0.5mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5小時。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=40：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(5,5-二氟-2-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(16F)，白色固體(380mg，產率78%)。
第六步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(5,5-二氟-2-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物16)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-(5,5-difluoro-2-methylsulfonyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；2,2,2-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(5,5-二氟-2-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(16F)(380mg，0.34mmol)和二氯甲烷(10mL)，在室溫下滴加三氟乙酸(3mL)，加完後反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(5,5-二氟-2-甲磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物16)，白色粉末(270mg，產率71%)。
MS m/z=388.8[M+2H]+/2； 1HNMR(400MHz,D2O)δ 7.44-7.17(m,10H),4.66(t,1H),4.42-4.13(m,4H),4.13-3.49(m,7H),3.25-2.92(m,9H),2.30-2.00(m,2H),1.91-1.26(m,9H),0.93(q,6H).。
實施例15：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-[(2R)-2-氨基丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物17)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[2-[(2R)-2-aminopropanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
第一步：(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙酸(17B)
(2R-2-(tert-butoxycarbonylamino)propanoic acid
在250mL反應瓶中，加入D-丙氨酸(17A)(10g，112.24mmol)和水(56mL)，將反應液冷卻至0℃，然後加入氫氧化鈉(6.73g，168.36 mmol)，加完後保持0℃反應10分鐘，再滴加二碳酸二第三丁酯(31.85g,145.91mmol)的四氫呋喃(50mL)溶液，加完後升溫至室溫攪拌過夜。反應液用石油醚(100mL×2)萃取並棄去有機相，水相用4M的鹽酸溶液酸化至pH約為1，然後用乙酸乙酯(100mL×4)萃取，合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙酸(17B)，無色油狀(21.2g，收率：100%)。
MS m/z=212.1[M+Na]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d 6)δ 12.34(br,1H),7.05(d,1H),3.98-3.87(m,1H),1.38(s,9H),1.22(d,3H)。
第二步：2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(17C)
benzyl 2-[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)propanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(335mg，1.3mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(748mg,3.9mmol)、1-羥基苯並三唑(211mg，1.56mmol)、(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙酸(17B)(246mg，1.3mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯 (v：v)=3：1)，得到2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(17C)，白色固體(510mg，產率91%)。
MS m/Z=454.3[M+Na]+；
第三步：N-[(1R)-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(17D)
tert-butyl N-[(1R)-2-(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-2-yl)-1-methyl-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(17C)(460mg，1.1mmol)、氫氧化鈀/碳(92mg，20wt%)和異丙醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，油浴加熱至100℃反應8h。然後降至室溫，反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到N-[(1R)-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(17D)粗產物，淡黃色固體(252mg，產率77%)，直接投入下一步反應。
MS m/z=298.3[M+H]+；
第四步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(17E)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-[2-[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)propanoyl]-2,7- diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，依次加入N-[(1R)-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(17D)粗產物(223mg，0.75mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(374mg,1.95mmol)、1-羥基苯並三唑(110mg，0.81mmol)、中間體1(565mg，0.75mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=40：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(17E)，淡黃色固體(560mg，產率69%)。
第五步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-[(2R)-2-氨基丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物17)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[2-[(2R)-2-aminopropanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(17E)(560mg，0.52mmol)和二氯甲烷(10mL)，在室溫下滴加三氟乙酸(3mL)，加完後室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-[(2R)-2-氨基丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物17)，白色粉末(310mg，產率45%)。
MS m/z=367.3[M+2H]+/2；1HNMR(400MHz,D2O)δ 7.44-7.28(m,6H),7.26-7.20(m,4H),4.65(t,2H),4.33-4.21(m,2H),4.19-4.01(m,3H),3.96-3.78(m,2H),3.75-3.59(m,2H),3.56-3.42(m,1H),3.42-3.30(m,1H),3.24-3.12(m,2H),3.10-2.92(m,4H),1.99-1.79(m,3H),1.80-1.63(m,5H),1.53(d,3H),1.50-1.30(m,5H),0.92(dd,6H)。
實施例16：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基〕氨基〕-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物18)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-[(2R)-2-aminopropanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide tri-trifluoroacetic acid
第一步：N-[(1R)-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸苄酯(18B)
benzyl N-[(1R)-2-(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-7-yl)-1-methyl-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(6A)(0.45g,2mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(780mg,4.1mmol)、1-羥基苯並三唑(340mg，2.5mmol)、(2R)-2-(苄氧基羰基氨基)丙酸(446mg，2.0mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到N-[(1R)-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸苄酯(18B)，白色固體(860mg，產率99%)。
MS m/Z=454.2[M+Na]+。
第二步：N-[(1R)-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸苄酯(18C)
benzyl N-[(1R)-2-(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-7-yl)-1-methyl-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸苄酯(18B)(0.86g，2mmol)和二氯甲烷(20mL)，室溫下滴加三氟乙酸(2mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到N-[(1R)-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸苄酯(18C)粗產物，黃色油狀液體(660mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
MS m/z=332.2[M+H]+；
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R基)-2-(苄氧羰基氨基)丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(18D)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-(benzyloxycarbonylamino)propanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在100mL反應瓶中，加入N-[(1R)-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸苄酯(18C)(243mg，0.7mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(300mg，2.0mmol)、1-羥基苯並三唑(200mg，1.0mmol)、中間體1(500mg，0.7mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=30：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R基)-2-(苄氧羰基氨基)丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(18D)，淡黃色固體(740mg，產率99%)。
第四步：N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-氨基丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(18E)
tert-butyl N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-aminopropanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R基)-2-(苄氧羰基氨基)丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(18D)(700mg，0.7mmol)、鈀碳(140mg，20wt%)和甲醇(15mL)。氫氣置換3次，在氫氣氛圍下，室溫反應8h。然後反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-氨基丙醯基]-1,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(18E)粗產物，淡黃色油狀物(650mg，產率99%)，直接投入下一步反應。
第五步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸(化合物18)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-[(2R)-2-aminopropanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-氨基丙醯基]-1,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(18E)粗產物(650mg，0.7mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸(化合物18)，白色粉末(170mg，產率19%)。
MS m/z=733.5[M+H]+；1HNMR(400MHz,D2O)δ 7.44-7.28(m,6H),7.27-7.20(m,4H),4.64(t,1H),4.55-4.46(m,1H),4.32-4.23(m,2H),4.21-4.05(m,3H),3.86-3.71(m,2H),3.63-3.40(m,4H),3.25-3.10(m,2H),3.10-2.90(m,4H),2.00-1.60(m,8H),1.60-1.29(m,8H),0.92(dd,6H)。
實施例17：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基丙醯基]-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物19)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-[(2R)-2-aminopropanoyl]-5,5-difluoro-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
第一步：2-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(19A)
benzyl 2-[(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-5,5-difluoro-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在100mL反應瓶中，加入5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸乙酯苄酯(16C)(797mg，2.69mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1.04g，5.4mmol)、1-羥基苯並三唑(400mg，3mmol)、中間體1(2.03g，2.69mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=30：1)，得到2-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(19A)，淡黃色固體(2.49g，產率89.6%)。
第二步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(19B)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(5,5-difluoro-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入2-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(19A)(2.49g，2.41mmol)、鈀碳(500mg，20wt%)和甲醇(25mL)。氫氣置換3次，在氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應4h。然後反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(19B)粗產物，淡黃色油狀物(2.16g，產率99%)，直接投入下一步反應。
MS m/z=899.5[M+H]+；
第三步：N-(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙醯基]-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(19C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-[7-[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)propanoyl]-5,5- difluoro-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(19B)粗產物(400mg，0.4mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.23g，1.2mmol)、1-羥基苯並三唑(70mg，0.5mmol)、Boc-D-丙氨酸(78mg，0.41mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=30：1)，得到N-(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙醯基]-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基基〕氨基〕-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(19C)，淡黃色固體(340mg，產率79%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基丙醯基]-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基〕氨基〕-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物19)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-[(2R)-2-aminopropanoyl]-5,5-difluoro-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl- propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙醯基]-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基基〕氨基〕-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(19C)(340mg，0.32mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基丙醯基]-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基〕氨基〕-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物19)，白色粉末(170mg，產率48%)。
MS m/z(ESI)：385.3[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.43-7.29(m,6H),7.27-7.21(m,4H),4.67-4.47(m,3H),4.31-4.09(m,5H),4.09-3.76(m,3H),3.74-3.46(m,2H), 3.18(d,2H),3.10-2.91(m,4H),2.33-1.97(m,2H),1.84-1.61(m,4H),1.61-1.26(m,8H),0.92(dd,6H)。
實施例18：
(2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物20)
(2R)-N-[(1R)-1-(7-acetyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)-5-amino-pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(20B)
tert-butyl 7-acetyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
氮氣保護下，在50mL反應瓶中，將2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(6A)(450mg,2.0mmol)溶於二氯甲烷(5mL)中，攪拌下加入三乙胺(606mg,6.0mmol)。然後降溫至-20℃，滴加乙醯氯(310mg,4.0mmol)， 加完後自然升溫至室溫並攪拌2h。接著向反應中加入0.5M稀鹽酸水溶液(20mL)，並攪拌分層、分液，用二氯甲烷萃取水層(20mL x 2)，合併有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(純乙酸乙酯)，得到7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(20B)，淡黃色油狀液體(520mg，產率97.0%)。
第二步：1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)乙酮(20C)
1-(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-7-yl)ethanone
在50mL反應瓶中，加入7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(20B)(520mg，1.9mmol)和二氯甲烷(6mL)，室溫下滴加三氟乙酸(3mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，往殘留物中加入濃氨水4mL，再加入無水硫酸鈉乾燥，用甲醇(20mL)洗滌，洗滌液濃縮得到1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)乙酮(20C)粗產物，黃色油狀液體(250mg，產率77%)，並直接用於下一步反應。
第三步：N-(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸酯(20D)
tert-butylN-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-acetyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]amino]-1-benzyl-2-oxo- ethyl]carbamate
氮氣保護下，在50mL反應瓶中，將1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)乙酮(20C)(250mg，1.49mmol)加入到乙酸乙酯(10mL)中。冰浴冷卻至0℃，加入中間體1(800mg,1.06mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(305mg,1.6mmol)、1-羥基苯並三唑(172mg,1.27mmol)，加完後室溫反應1.5h。隨後向反應液中加入1M鹽酸水溶液(15mL)，攪拌後分液。有機相中加入飽和碳酸鈉水溶液(15mL)，攪拌30分鐘後分液。有機相用飽和氯化鈉水溶液(15mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到N-(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸酯(20D)粗產物，淡黃色泡狀固體(0.85g，產率88%)，直接用於下一步反應。
第四步：((2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物20)
(2R)-N-[(1R)-1-(7-acetyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)-5-amino-pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
將N-(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸酯(20D)粗產物(0.85g,0.94mmol)的粗產物溶於二氯甲烷(7.5mL)中，加入三氟乙酸(3.5mL)，室溫下攪拌1h。接著將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化後(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到((2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物20)，白色固體(310mg，產率40.0%)。
MS m/z(ESI)：352.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.46-7.17(m,10H),4.64(t,1H),4.29-4.05(m,5H),3.83-3.74(m,2H),3.57-3.35(m,4H),3.24-3.11(m,2H),3.09-2.93(m,4H),2.17-1.29(m,16H),0.92(dd,6H)。
實施例19：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)-7-氮雜-螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物21)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(1,1-dioxo-1,4-thiazinan-4-yl)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide tri-trifluoroacetic acid
第一步：(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(21A)
tert-butyl 2-(1,1-dioxo-1,4-thiazinan-4-yl)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL反應瓶中，依次加入2-氧代-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3A)(129mg，0.54mmol)、乙酸(65mg，1.08mmol)、1,4-噻嗪烷1,1-二氧化物(72mg，0.54mmol)、三乙醯氧基硼氫化鈉(229mg，1.08mmol)和二氯 甲烷(20mL)，加完後在室溫反應16h。將反應液抽濾，濾液用飽和碳酸氫鈉溶液(50mL)洗滌，分液後有機層用無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濾液減壓濃縮，得到(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(21A)，白色粉末(147mg，產率76%)。
第二步：4-(7-氮雜螺[3.5]壬-2-基)-1,4-噻嗪烷-1,1-二氧化物(21B)
4-(7-azaspiro[3.5]nonan-2-yl)-1,4-thiazinane 1,1-dioxide
在50mL反應瓶中，加入(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(21A)(147mg，0.41mmol)和二氯甲烷(10mL)，室溫下滴加三氟乙酸(2mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到4-(7-氮雜螺[3.5]壬-2-基)-1,4-噻嗪烷-1,1-二氧化物(21B)粗產物，黃色油狀液體(106mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步：(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)-7-氮雜-螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(21C)
tert-butylN-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-[2-(1,1-dioxo-1,4-thiazinan-4-yl)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入4-(7-氮雜螺[3.5]壬-2-基)-1,4-噻嗪烷-1,1-二氧化物(21B)粗產物(106mg，0.41mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(94mg，0.49mmol)、1-羥基苯並三唑(66mg，0.49mmol)、中間體1(309mg，0.41mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)-7-氮雜-螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(21C)，白色固體(367mg，產率90%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)-7-氮雜-螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物21)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(1,1-dioxo-1,4-thiazinan-4-yl)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide tri-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)-7-氮雜-螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(21C)(367mg，0.37mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)-7-氮雜-螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物21)，白色粉末(295mg，產率70%)。
MS m/z=397.9[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.36-7.19(m,10H),4.63-4.60(m,1H),4.32-4.16(m,3H),3.92-3.78(m,1H),3.63(d,9H),3.53-3.22(m,3H),3.15(d,2H),3.01-2.91(m,4H),2.48-2.32(m,2H),1.98-2.06(m,2H),1.75-1.23(m,13H),0.89(dd,6H)。
實施例20：
7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-N-甲基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-甲醯胺；二三氟乙酸(化合物22)
7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-N-methyl-2,7-diazaspiro[4.4]nonane-2-carboxamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羧酸第三丁酯(22B)
tert-butyl 7-(methylcarbamoyl)-2,7-diazaspiro[4.4]nonane-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入2-Boc-2,7-二氮雜-螺[4.4]壬烷(22A)(452mg，2.0mmol)、三乙胺(400mg，4.0mmol)和二氯甲烷(15mL)，攪拌溶解。冷卻至-10℃，滴加甲胺基甲醯氯(188mg，2.01mmol)，加完後在室溫反應3小時。反應液中加入3M稀鹽酸(50mL)，然後用二氯甲烷(60mL×2)萃取， 有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羧酸第三丁酯(22B)，白色固體(570mg，產率65.5%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 3.51-3.16(m,8H),2.82(s,3H),1.98-1.74(m,4H),1.46(s,9H)。
第二步：N-甲基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-甲醯胺(22C)
N-methyl-2,7-diazaspiro[4.4]nonane-2-carboxamide
在50mL反應瓶中，加入7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羧酸第三丁酯(22B)(161mg，0.568mmol)、二氯甲烷(10mL)和三氟乙酸(1.2mL)，在室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮得到N-甲基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-甲醯胺(22C)粗產物，淡黃色油狀物，直接投入下一步反應。
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(22D)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-[2-(methylcarbamoyl)-2,7-diazaspiro[4.4]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，依次加入N-甲基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-甲醯胺(22C)粗產物(81mg，0.44mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.288g，1.5mmol)、1-羥基苯並三唑(81mg，0.6mmol)、中間體1(330mg，0.44mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=30：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(22D)，淡黃色固體(420mg，產率98%)。
第四步：7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-N-甲基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-甲醯胺；二三氟乙酸(化合物22)
7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-N-methyl-2,7-diazaspiro[4.4]nonane-2-carboxamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(22D)(400mg，0.44mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-N-甲基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-甲醯胺；二三氟乙酸(化合物22)，白色粉末(130mg，產率31.5%)。
MS m/z(ESI)：360.3[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.43-7.19(m,10H),4.68-4.60(m,1H),4.50-4.19(m,3H),3.93-3.62(m,2H),3.55-3.27(m,5H),3.24(s,1H),3.18(d,2H),3.09-2.94(m,4H),2.74-2.66(m,3H),2.10-1.85(m,4H),1.84-1.62(m,4H),1.59-1.43(m,4H),1.43-1.29(m,1H),0.92(dd,6H)。
實施例21：
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-4-甲基戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物23)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(1-piperidyl)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
第一步：第三丁基2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺環[3.5]壬烷-7-羧酸酯(23A)
tert-butyl 2-(1-piperidyl)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
將2-氧代-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸第三丁酯(0.48g，2mmol)、哌啶(0.25g，3mmol)和二氯甲烷(10mL)加入反應瓶中，攪拌30min後，冷卻至0-5℃，加入氰基硼氫化鈉(0.13g，4mmol)；加完室溫反應4h，TLC監控反應完全。加入二氯甲烷(10mL)和水(10mL)攪拌5min，靜置分層，有機層無水 硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮，得第三丁基2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺環[3.5]壬烷-7-羧酸酯(23A)粗產物，淡黃色固體(0.53g，產率86%)，直接用於下一步。
第二步：2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺環[3.5]壬烷三氟乙酸鹽(23B)
2-(1-piperidyl)-7-azaspiro[3.5]nonane；2,2,2-trifluoroacetic acid
氮氣保護下，在50mL反應瓶中，將第三丁基2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺環[3.5]壬烷-7-羧酸酯(23A，0.53g，1.7mmol)加入到二氯甲烷(5mL)中，攪拌下加入三氟乙酸(2mL)，加完後室溫反應2h。TLC監控反應完全，減壓濃縮乾，得2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺環[3.5]壬烷三氟乙酸鹽(23B)，淡黃色油狀物(0.50g，產率90%)，直接用於下一步。
第三步：第三丁基N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-[2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸酯(23C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-[2-(1-piperidyl)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
氮氣保護下，在50mL反應瓶中，將2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺環[3.5]壬烷三氟乙酸鹽(23B，0.50g，1.60mmol)加入到二氯甲烷(10mL)中。冰浴冷卻至0℃，加入中間體1(0.50g，0.66mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(190mg，0.99mmol)、1-羥基苯並三唑(110mg，0.81mmol)，加完後室溫反應3h。隨後向反應液中加入1M鹽酸水溶液(15mL)，攪拌後分液。有機相中加入飽和碳酸鈉水溶液(15mL)，攪拌30分鐘後分液。有機相用飽和氯化鈉水溶液(15mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到第三丁基N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-[2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸酯(23C)粗產物，淡黃色泡狀固體(0.45g，產率72%)，直接用於下一步反應。
第四步：(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-4-甲基戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物23)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(1-piperidyl)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
將第三丁基N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-[2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸酯(23C)粗產物(0.45g,0.48mmol)的粗產物溶於二氯甲烷(7.5mL)中，加入三氟乙酸(3.5mL)，室溫下攪拌1h。接著將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化後(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(1-哌啶基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-4-甲基戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物23)，白色固體(260mg，產率56%)。
MS m/z(ESI)：372.9[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ7.48-7.09(m,10H),4.68-4.60(m,1H),4.34-4.17(m,2H),3.73-3.52(m,3H),3.52-2.92(m,10H),2.80-2.64(m,2H),2.47-2.24(m,2H),2.05-1.88(m,4H),1.88-1.20(m,18H),1.00-0.81(m,6H)。
實施例22：
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-(7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷2-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物24)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-(7-tetrahydropyran-4-yl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)pentyl]-4-methyl-pentanamide tri-trifluoroacetic acid
第一步：第三丁基7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸酯(24A)
tert-butyl7-tetrahydropyran-4-yl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.4]壬烷-2-羧酸第三丁酯(6A)(0.452g,2mmol)、四氫吡喃酮(200mg，2mmol)、乙酸(120mg，2.0mmol)和二氯乙烷(7mL)，攪拌0.5h，加入三乙醯氧基硼氫化鈉(0.636g，3mmol)，反應5h，然後反應液用水(10mL)淬滅，乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合併有機相，並用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=4：1)，得到第三丁基7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸酯(24A)，淡黃色油狀物(500mg，產率80.64%)。
MS m/z=311.2[M+H]+。
第二步：7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(24B)
7-tetrahydropyran-4-yl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane
在50mL反應瓶中，加入第三丁基7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸酯(24A)(0.5g，1.61mmol)和二氯甲烷(7mL)，室溫下滴加三氟乙酸(1mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(24B)粗產物，淡黃色油狀液體(338mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步：第三丁基N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-(7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2氧代乙基]氨基甲酸酯(24C)
tert-butylN-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(7-tetrahydropyran-4-yl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(24B)粗產物(338mg，1.61mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸 鹽(384mg，2mmol)、1-羥基苯並三唑(270mg，2mmol)、中間體1(400mg，0.53mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到第三丁基N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-(7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2氧代乙基]氨基甲酸酯(24C)，白色固體(200mg，產率39.93%)
第四步：2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-(7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷2-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物24)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-(2-piperazin-1-yl-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-4-methyl-pentanamide tri-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入第三丁基N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-(7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2氧代乙基]氨基甲酸酯(24C)(200mg，0.21mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN 及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-(7-四氫吡喃-4-基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷2-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物24)，白色粉末(135mg，產率86.1%)。
MS m/z=373.9[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.46-7.29(m,10H),4.71(t,1H),4.27-4.16(m,7H),3.93-3.86(m,2H),3.66-3.53(m,5H),3.25-3.05(m,8H),2.34-2.13(m,6H),1.79-1.43(m，11H),1.02-0.95(m,6H)。
實施例23：
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基)氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物25)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-(2-pyrrolidin-1-yl-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-4-methyl-pentanamide tri-trifluoroacetic acid
第一步：2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸第三丁酯(25A)
tert-butyl 2-pyrrolidin-1-yl-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL反應瓶中，依次加入2-氧代-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3A)(131mg，0.55mmol)、乙酸(66mg，1.1mmol)、吡咯烷(39mg，0.55mmol)、三乙醯氧基硼氫化鈉(233mg，1.1mmol)和二氯甲烷(20mL)，加完後在室溫反應6h。將反應液抽濾，濾液用飽和碳酸氫鈉溶液(30mL)洗滌，分液後有機層用無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濾液減壓濃縮，得到2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸第三丁酯(25A))，白色粉末(120mg，產率75%)。
第二步：2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷(25B)
2-pyrrolidin-1-yl-7-azaspiro[3.5]nonane
在50mL反應瓶中，加入(2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸第三丁酯(25A)(120mg，0.41mmol)和二氯甲烷(10mL)，室溫下滴加三氟乙 酸(2mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷(25B)粗產物，黃色油狀液體(80mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步：(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(25C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(2-pyrrolidin-1-yl-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷(25B)粗產物(80mg，0.41mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(96mg，0.5mmol)、1-羥基苯並三唑(67.5mg，0.5mmol)、中間體1(309mg，0.41mmol)和二氯甲烷(20mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(25C)，淡黃色固體(344mg，產率90%)。
第四步：(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基)氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物25)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-(2-pyrrolidin-1-yl-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-4-methyl-pentanamide tri-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(25C)(344mg，0.37mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到((2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基)氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物25)，白色粉末(249mg，產率70%)。
MS m/z=365.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.43-7.13(m,10H),4.71-4.70(m,1H),4.62(t,1H),4.30-4.17(m,2H),3.82-3.74(m,1H),3.68-3.39(m,5H),3.38-3.21(m,1H),3.15(d,2H),3.06-2.90(m,6H),2.43-2.25(m,2H),2.16-1.89(m,6H),1.78-1.27(m,13H),0.89(dd,6H)。
實施例24：
(2R)-1-[7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜螺[3.5]壬-2-基]吡咯烷-2-羧酸；三三氟乙酸鹽(化合物26)
(2R)-1-[7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-7-azaspiro[3.5]nonan-2-yl]pyrrolidine-2-carboxylic acid tri-trifluoroacetic acid
第一步：2-[(2R)-2-甲氧基羰基吡咯烷-1-基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸第三丁酯(26A)
tert-butyl2-[(2R)-2-methoxycarbonylpyrrolidin-1-yl]-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL反應瓶中，依次加入2-氧代-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸第三丁酯(3A)(287mg，1.2mmol)、乙酸(144mg，2.4mmol)、D-脯氨酸甲酯(154mg，1.2mmol)、三乙醯氧基硼氫化鈉(233mg，2.4mmol)和二氯甲烷(30mL)，加完後在室溫反應6h。將反應液抽濾，濾液用飽和碳酸氫鈉溶液(50mL)洗滌，分液後有機層用無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濾液減壓濃縮，得到2-吡咯烷-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸第三丁酯(26A)，白色粉末(275mg，產率65%)。
第二步：(2R)-1-(7-氮雜螺[3.5]壬-2-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(26B)
methyl(2R)-1-(7-azaspiro[3.5]nonan-2-yl)pyrrolidine-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入2-[(2R)-2-甲氧基羰基吡咯烷-1-基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸第三丁酯(26A)(275mg，0.78mmol)和二氯甲烷(10mL)，室溫下滴加三氟乙酸(2mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃 縮，得到(2R)-1-(7-氮雜螺[3.5]壬-2-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(26B)，黃色油狀液體(196mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步：(2R)-1-[7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙醯基)氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜-螺[3.5]壬-2-基]吡咯烷-2-羧酸甲酯(26C)
Methyl(2R)-1-[7-[(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-7-azaspiro[3.5]nonan-2-yl]pyrrolidine-2-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入(2R)-1-(7-氮雜螺[3.5]壬-2-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(26B)(196mg,0.78mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(180mg，0.94mmol)、1-羥基苯並三唑(127mg，0.94mmol)、中間體1(587mg，0.78mmol)和二氯甲烷(20mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到(2R)-1-[7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙醯基)氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜-螺[3.5]壬-2-基]吡咯烷-2-羧酸甲酯(26C)，白色固體(385mg，產率50%)。
第四步：(2R)-1-[7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基)氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜-螺[3.5]壬-2-基]吡咯烷-2-羧酸(26D)
(2R)-1-[7-[(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-7-azaspiro[3.5]nonan-2-yl]pyrrolidine-2-carboxylic acid
室溫下，(2R)-1-[7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙醯基)氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜-螺[3.5]壬-2-基]吡咯烷-2-羧酸甲酯26C(385mg,0.39mmol)溶於甲醇(5mL)中，將氫氧化鈉(16mg,0.4mmol)的水溶液(10mL)加至反應液中，室溫反應5h。用1M鹽酸水溶液調節反應液pH<4，用乙酸乙酯(20mL)萃取、分液。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮後得到(2R)-1-[7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基)氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜-螺[3.5]壬-2-基]吡咯烷-2-羧酸(26D)，白色固體(345mg，產率93%)。
第五步：(2R)-1-[7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜螺[3.5]壬-2-基]吡咯烷-2-甲酸；三三氟乙酸鹽(化合物26)
(2R)-1-[7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-7-azaspiro[3.5]nonan-2-yl]pyrrolidine-2-carboxylic acid tri-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入(2R)-1-[7-[(2R)-6-(第三丁氧基羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基)氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜-螺[3.5]壬-2-基]吡咯烷-2-羧酸(26D)(345mg，0.36mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-1-[7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜螺[3.5]壬-2-基]吡咯烷-2-甲酸；三三氟乙酸鹽(化合物26)，白色粉末(240mg，產率60%)。
MS m/z=387.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.44-7.09(m,10H),4.27-4.19(m,3H),3.96-3.84(m,2H),3.67-3.50(m,3H),3.48-3.21(m,3H),3.19-2.89(m,7H),2.50-2.22(m,3H),2.18-1.91(m,5H),1.78-1.24(m,13H),0.88(dd,6H)。
實施例25：
2-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基戊醯基]氨基]己醯基]-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物27)
2-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：第三丁基7-(甲氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺-[3.5]壬烷-2-羧酸酯(27A)
tert-butyl 7-(methylcarbamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
氮氣保護下，將2-第三丁氧羰基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(0.45g，2mmol)、二氯甲烷(10mL)和三乙胺(0.30g，3mmol)加入反應瓶中；冷卻至0-5℃，滴入甲胺基甲醯氯(0.20g，2.2mmol)，加完移去冷卻，升至室溫反應1h。TLC監控反應完全，加入二氯甲烷(10mL)和水(10mL)，攪拌5min後，靜置分層；有機層無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇=(v/v)20/1)，得第三丁基7-(甲氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺-[3.5]壬烷-2-羧酸酯(27A)，淡黃色油狀物(0.48g，產率85%)。
第二步：N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺三氟乙酸鹽(27B)
N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxamide；2,2,2-trifluoroacetic acid
氮氣保護下，在50mL反應瓶中，將第三丁基7-(甲氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺-[3.5]壬烷-2-羧酸酯(27A，0.48g，1.7mmol)加入到二氯甲烷(5mL)中，攪拌下加入三氟乙酸(2mL)，加完後室溫反應2h。TLC監控反應完全，減壓濃縮乾，得N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺三氟乙酸鹽(27B)，淡黃色油狀物(0.49g，產率97%)，直接用於下一步。
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-[7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨 基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(27C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-[7-(methylcarbamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
氮氣保護下，在50mL反應瓶中，將N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺三氟乙酸鹽(27B)粗產物(0.48g，2.60mmol)加入到二氯甲烷(10mL)中。冰浴冷卻至0℃，加入中間體1(0.50g，0.66mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(200mg，1.73mmol)、1-羥基苯並三唑(125mg，0.93mmol)，加完後室溫反應3h。隨後向反應液中加入1M鹽酸水溶液(15mL)，攪拌後分液。有機相中加入飽和碳酸鈉水溶液(15mL)，攪拌30分鐘後分液。有機相用飽和氯化鈉水溶液(15mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-[7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(27C)粗產物，淡黃色泡狀固體(0.5g，產率80%)，直接用於下一步反應。
第四步：2-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基戊醯基]氨基]己醯基]-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物27)
2-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxamide；di-trifluoroacetic acid
將N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-[7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(27C)粗產物(0.5g,0.5mmol)的粗產物溶於二氯甲烷(7.5mL)中，加入三氟乙酸(3.5mL)，室溫下攪拌1h。接著將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化後(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，凍乾，得到2-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基戊醯基]氨基]己醯基]-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物27)，白色固體(220mg，產率40%)。
MS m/z(ESI)：360.3[M+1H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.45-7.16(m,10H),4.66-4.57(m,1H),4.32-4.19(m,2H),4.19-3.99(m,3H),3.83-3.66(m,2H),3.40-3.22(m,4H),3.22-3.12(m,2H),3.06-2.99(m,4H),2.69(s,3H),1.80-1.62(m,8H),1.58-1.27(m,5H),1.03-0.79(m,6H)。
實施例26：
7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-甲醯胺；二三氟乙酸(化合物28)
7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-5,5-difluoro-N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：5,5-二氟-2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸苄酯(28A)
benzyl 5,5-difluoro-2-(methylcarbamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸乙酯苄酯(16C)(330mg，1.11mmol)、三乙胺(364mg，3.6mmol)和二氯甲烷(20mL)，攪拌溶解。冷卻至-10℃，滴加甲胺基甲醯氯(104mg，1.11mmol)，加完後在室溫反應3小時。反應液中加入3M稀鹽酸(50mL)，用二氯甲烷(60mL×2)萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到5,5-二氟-2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸苄酯(28A)，白色固體(268mg，產率68.6%)。
MS m/z(ESI)：354.1[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.41-7.28(m,5H),5.14(s,2H),4.09(d,2H),3.65(dd,4H),3.51-3.44(m,2H),2.79(s,3H),2.01(s,2H)。
第二步：5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-甲醯胺(28B)
5,5-difluoro-N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxamide
在50mL反應瓶中，加入5,5-二氟-2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸苄酯(28A)(269mg，0.76mmol)、鈀碳(54mg，20wt%)和甲醇(5mL)。氫氣置換3次，在氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應3h。然後反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷- 2-甲醯胺(28B)粗產物，淡黃色油狀物(164mg，產率98.55%)，直接投入下一步反應。
MS m/z(ESI)：220.2[M+H]+；
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[5,5-二氟-2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(28C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxy carbonylamino)-1-[5,5-difluoro-2-(methylcarbamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，依次加入5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-甲醯胺(28B)粗產物(164mg，0.75mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.374g，1.95mmol)、1-羥基苯並三唑(110mg，0.81mmol)、中間體1(565mg，0.75mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[5,5-二氟-2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊 基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(28C)，淡黃色固體(600mg，產率84%)。
第四步：7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-甲醯胺；二三氟乙酸(化合物28)
7-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-5,5-difluoro-N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxamide；ditrifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[5,5-二氟-2-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(28C)(600mg，0.6mmol)和三氟乙酸(3mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到7-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨 基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯基]-5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-甲醯胺；二三氟乙酸(化合物28)，白色粉末(100mg，產率13%)。
MS m/z(ESI)：755.5[M+H]+；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.43-7.18(m,10H),4.86-4.75(m,1H),4.65(t,1H),4.39-4.17(m,2H),4.15-4.05(m,2H),4.04-3.45(m,6H),3.24-3.10(m,2H),3.10-2.90(m,4H),2.77-2.60(m,3H),2.06(d,2H),1.85-1.61(m,4H),1.60-1.46(m,3H),1.45-1.27(m,2H),0.92(dt,6H)。
實施例27：
2-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物29)
2-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-5,5-difluoro-N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxamide ditrifluoroacetic acid
第一步：5,5-二氟-7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(29B)
tert-butyl5,5-difluoro-7-(methylcarbamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸乙酯苄酯(16C)(113mg，0.43mmol)、三乙胺(43mg，0.43mmol)和二氯甲烷(10mL)，攪拌溶解。冷卻至-10℃，滴加甲胺基甲醯氯(42mg，0.45mmol)，加完後在室溫反應3小時。反應液中加入0.3M稀鹽酸(10mL)，然後用二氯甲烷(5mL×2)萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到5,5-二氟-7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(29B)，白色固體(96mg，產率70%)。
第二步5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺(29C)
5,5-difluoro-N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxamide
在50mL反應瓶中，加入5,5-二氟-7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(29B)(96mg，0.3mmol)和二氯甲烷(8mL)，室溫下滴加三氟乙酸(2mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到 5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺(29C)，黃色油狀液體(66mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步：(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[5,5-二氟-7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(29D)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxy carbonylamino)-1-[5,5-difluoro-7-(methylcarbamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺(29C)(66mg，0.3mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(239mg，0.36mmol)、1-羥基苯並三唑(49mg，0.36mmol)、中間體1(226mg，0.3mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[5,5-二氟-7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(29D)，白色固體(286mg，產率90%)。
第四步：2-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物29)
2-[(2R)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-5,5-difluoro-N-methyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxamide ditrifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[5,5-二氟-7-(甲基氨基甲醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(29D)(286mg，0.3mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到2-[(2R)-6-氨基-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯基]氨基]己醯]-5,5-二氟-N-甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物29)，白色粉末(192mg，產率65%)。
MS m/z=378.3[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.46-7.12(m,10H),4.64-4.58(m,1H),4.53-4.43(m,1H),4.26-4.19(m,2H),4.17-4.02(m,3H),3.80-3.76(m,1H),3.72-3.57(m,2H),3.36(s,2H),3.19-3.11(m,2H),3.03-2.95(m,4H),2.68(s,3H),2.03-1.99(m 2H),1.75-1.63(m,4H),1.54-1.26(m,5H),0.89(dd,6H)。
實施例28：
(2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物30)
(2R)-N-[(1R)-1-(7-acetyl-2,7-diazaspiro[3.4]octane-2-carbonyl)-5-amino-pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：第三丁基7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羧酸酯(30A)
tert-butyl 7-acetyl-2,7-diazaspiro[3.4]octane-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入第三丁基2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羧酸酯(A)(0.414g,2mmol)、三乙胺(420mg，4.0mmol)和二氯甲烷(7mL)，攪拌溶解。冷卻至-10℃，滴加乙醯氯(188mg，2.4mmol)，反應10min。然後升至室溫攪拌3h，然後反應體系用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)淬滅，乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合併有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=4：1)，得到第三丁基7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羧酸酯(30A)，淡黃色油狀物(411mg，產率81%)。
MS m/z=255.2[M+H]+。
第二步：7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷(30B)
7-acetyl-2,7-diazaspiro[3.4]octane
在50mL反應瓶中，加入第三丁基7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羧酸酯(30A)(0.41g，1.62mmol)和二氯甲烷(7mL)，室溫下滴加三氟乙酸(1mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷(30B)粗產物，淡黃色油狀液體(249mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步：第三丁基N-[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基)-5(第三丁氧羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代乙基]氨基]-1-苄基-2氧代乙基]氨基甲酸酯(30C)
tert-butyl N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-acetyl-2,7-diazaspiro[3.4]octane-2-carbonyl)-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷(30B)粗產物(249mg，1.62mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(384mg，2mmol)、1-羥基苯並三唑(270mg，2mmol)、中間體1(400mg，0.53mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到第三丁基N-[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基)-5(第三丁氧羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代乙基]氨基]-1-苄基-2氧代乙基]氨基甲酸酯(30C)，白色固體(200mg，產率42.3%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物30)
(2R)-N-[(1R)-1-(7-acetyl-2,7-diazaspiro[3.4]octane-2-carbonyl)-5-amino-pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入第三丁基N-[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基)-5(第三丁氧羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代乙基]氨基]-1-苄基-2氧代乙基]氨基甲酸酯(30C)(200mg，0.22mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30 mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物30)，白色粉末(120mg，產率79.1%)。
MS m/z=345.9[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.45-7.29(m,10H),4.71(t,1H),4.37-4.2(m,5H),4.05-4.00(m,2H),3.82-3.52(m,4H),3.26-3.05(m,6H),2.32-2.11(m,5H),1.8-1.76(m,4H),1.61-1.45(m,5H),1.02-0.96(dd,6H)。
實施例29：
(2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物31)
(2R)-N-[(1R)-1-(7-acetyl-2,7-diazaspiro[4.4]nonane-2-carbonyl)-5-amino-pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羧酸第三丁酯(31A)
tert-butyl 7-acetyl-2,7-diazaspiro[4.4]nonane-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入2-Boc-2,7-二氮雜-螺[4.4]壬烷(22A)(452mg，2.0mmol)、三乙胺(400mg，4.0mmol)和二氯甲烷(15mL)，攪拌溶解。冷卻至-10℃，滴加乙醯氯(160mg，2.0mmol)，加完後在室溫反應4小時。反應液中加入1M稀鹽酸(50mL)，用二氯甲烷(60mL×2)萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羧酸第三丁酯(31A)，淡黃色油狀物(392mg，產率73%)。
MS m/z=291.2[M+Na]+。
第二步：1-(2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-基)乙酮(31B)
1-(2,7-diazaspiro[4.4]nonan-2-yl)ethanone
在50mL反應瓶中，加入7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羧酸第三丁酯(31A)(161mg，0.6mmol)、二氯甲烷(10mL)和三氟乙酸(2mL)，在室溫反應2h。將反應液減壓濃縮得到1-(2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-基)乙酮(31B)粗產物，淡黃色油狀物(100mg，產率99%)。
第三步：N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(31C)
tert-butyl N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-acetyl-2,7-diazaspiro[4.4]nonane-2-carbonyl)-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，依次加入1-(2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-基)乙酮(31B)粗產物(100mg，0.6mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.288g，1.5mmol)、1-羥基苯並三唑(81mg，0.6mmol)、中間體1(400 mg，0.5mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=30：1)，得到N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(31C)，淡黃色固體(120mg，產率22%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物31)
(2R)-N-[(1R)-1-(7-acetyl-2,7-diazaspiro[4.4]nonane-2-carbonyl)-5-amino-pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(31C)(120mg，0.22mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃； 波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物31)，白色粉末(77mg，產率85%)。
MS m/z(ESI)：352.7[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.43-7.18(m,10H),4.68-4.60(m,1H),4.47-4.19(m,3H),3.91-3.27(m,8H),3.18(d,2H),3.08-2.92(m,4H),2.13-1.86(m,7H),1.85-1.63(m,4H),1.62-1.27(m,5H),0.92(dd,6H)。
實施例30：
(2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物32)
(2R)-N-[(1R)-1-(7-acetyl-5,5-difluoro-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)-5-amino-pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(32A)
tert-butyl N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-acetyl-5,5-difluoro-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，依次加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(19B)(430mg，0.48mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.18g，0.94mmol)、1-羥基苯並三唑(71mg，0.53mmol)、乙酸(28.8mg，0.48mmol)和二氯甲烷(20mL)，室溫反應3h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(32A)，白色固體(430mg，產率95%)。
第二步：(2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物32)
(2R)-N-[(1R)-1-(7-acetyl-5,5-difluoro-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl)-5-amino-pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(32A)(430mg，0.46mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-1-(7-乙醯基-5,5-二氟-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基)-5-氨基-戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物32)，白色粉末(273mg，產率61%)。
MS m/z(ESI)：370.8[M+2H]+/2； 1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.43-7.19(m,10H),4.67-4.60(m,1H),4.58-4.47(m,1H),4.31-4.08(m,5H),3.98-3.70(m,3H),3.70-3.43(m,2H),3.18(d,2H),3.06-2.94(m,4H),2.23-1.94(m,5H),1.80-1.63(m,4H),1.56-1.29(m,5H),0.91(dd,6H)。
實施例31：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸(化合物33)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-(oxetan-3-yl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
第一步：7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(33A)
tert-butyl 7-(oxetan-3-yl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，依次加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三 丁酯(6A)(0.452g，2.0mmol)、乙酸(0.24g，4.0mmol)、3-氧雜環丁酮(0.288g，4.0mmol)、三乙醯氧基硼氫化鈉(1.48g，6.98mmol)和二氯甲烷(20mL)，加完後在室溫反應16h。將反應液過濾，濾液用飽和碳酸氫鈉溶液(50mL)洗滌，分液後有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(33A)，白色粉末(432mg，產率76%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 4.67-4.55(m,4H),3.61(s,4H),3.41(p,1H),2.19(s,4H),1.78(t,4H),1.44(s,9H)。
第二步：7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(33B)
7-(oxetan-3-yl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane
在50mL反應瓶中，加入7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(33A)(0.14g，0.5mmol)和二氯甲烷(5mL)，室溫下滴加三氟乙酸(57mg，0.5mmol)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(33B)粗產物，黃色油狀液體(70.5mg，產率88%)，並直接用於下一步反應。
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(33C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-[7-(oxetan-3-yl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在100mL反應瓶中，加入7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷(33B)粗產物(70.5mg，0.44mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(288mg，1.5mmol)、1-羥基苯並三唑(81mg，0.60mmol)、中間體1(330mg，0.44mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(33C)，淡黃色固體(400mg，產率99%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸(化合物33)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-(oxetan-3-yl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(33C)(400mg，0.40mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。然後將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-(氧雜環丁烷-3-基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸(化合物33)，白色粉末(160mg，產率56%)。
MS m/z(ESI)：359.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.42-7.20(m,10H),4.96(t,2H),4.85(dd,2H),4.66-4.56(m,2H),4.48-4.35(m,2H),4.30-4.10(m,5H),3.84(s,2H),3.43(br,1H),3.17(d,2H),3.14(s,1H),3.07-2.93(m,4H),2.12(br,4H),1.80-1.60(m,4H),1.58-1.29(m,5H),0.91(dd,6H)。
實施例32：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-(二甲基氨磺醯)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物34)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-(dimethylsulfamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：7-(二甲基氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(34A)
tert-butyl 7-(dimethylsulfamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(6A)(0.452g，2mmol)、三乙胺(400mg，4.0mmol)和二氯甲烷(15mL)，攪拌溶解。冷卻至-10℃，滴加二甲氨基磺醯氯(287mg，2.0mmol)，加完後在 室溫反應3小時。反應液中加入3M稀鹽酸(50mL)，然後用二氯甲烷(60mL×2)萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到7-(二甲基氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(34A)粗產物，淡黃色固體(440mg，產率66%)。
第二步：N，N-二甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-磺醯胺(34B)
N,N-dimethyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-sulfonamide
在50mL反應瓶中，加入7-(二甲基氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(34A)粗產物(0.22g，0.66mmol)和二氯甲烷(5mL)，室溫下滴加三氟乙酸(2mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到N，N-二甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-磺醯胺(34B)粗產物，黃色油狀液體(103mg，產率76%)，並直接用於下一步反應。
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-(二甲基氨磺醯)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(34C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxy carbonylamino)-1-[7-(dimethylsulfamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在100mL反應瓶中，加入N，N-二甲基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-磺醯胺(34B)粗產物(103mg，0.44mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(288mg，1.5mmol)、1-羥基苯並三唑(81mg，0.60mmol)、中間體1(330mg，0.44mrnol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-(二甲基氨磺醯)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(34C)，淡黃色固體(240mg，產率56%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-(二甲基氨磺醯)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物34)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-(dimethylsulfamoyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-(二甲基氨磺醯)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(34C)(400mg，0.4mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-(二甲基氨磺醯)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物34)，白色粉末(130mg，產率29%)。
MS m/z(ESI)：385.3[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.46-7.29(m,6H),7.29-7.18(m,4H),4.65(t,1H),4.32-3.99(m,5H),3.85-3.68(m,2H),3.35-3.11(m,6H),3.11-2.92(m,4H),2.81(d,6H),1.96-1.79(m,4H),1.71(dd,4H),1.60-1.32(m,5H),0.93(dd,6H)。
實施例33：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(7-(二甲氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物35)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-(dimethylsulfamoyl)-2,7-diazaspiro[3.4]octane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：第三丁基7-(二甲氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羧酸酯(35A)
tert-butyl 7-(dimethylsulfamoyl)-2,7-diazaspiro[3.4]octane-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入第三丁基2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羧酸酯(A)(0.414g,2mmol)、三乙胺(420mg，4.0mmol)和二氯甲烷(7mL)，攪拌溶解。冷卻至-10℃，滴加二甲氨磺醯氯(343mg，2.4mmol)，反應10分鐘。然後升至室溫攪拌3h，反應液用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)淬滅，乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合併有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減 壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=4：1)，得到第三丁基7-(二甲氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羧酸酯(35A)，淡黃色油狀物(414mg，產率0.65%)。
MS m/z=320.2[M+H]+；
第二步：7-(二甲氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷(35B)
7-(dimethylsulfamoyl)-2,7-diazaspiro[3.4]octane
在50mL反應瓶中，加入第三丁基7-(二甲氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羧酸酯(35A)(0.41g，1.3mmol)和二氯甲烷(7mL)，室溫下滴加三氟乙酸(1mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到7-(二甲氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷(35B)粗產物，淡黃色油狀液體(284mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步：第三丁基N-[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-二甲氨磺醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基)-5(第三丁氧羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代乙基]氨基]-1-苄基-2氧代乙基]氨基甲酸酯(35C)
tert-butyl N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-dimethylsulfamoyl-2,7-diazaspiro[3.4]octane-2-carbonyl)-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入7-(二甲氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷(35B)粗產物(284mg，1.3mnol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(384mg，2mmol)、1-羥基苯並三唑(270mg，2mmol)、中間體1(400mg，0.53mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到第三丁基N-[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基)-5(第三丁氧羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代乙基]氨基]-1-苄基-2氧代乙基]氨基甲酸酯(35C)，白色固體(201mg，產率39.7%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(7-(二甲氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物35)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-(dimethylsulfamoyl)-2,7-diazaspiro[3.4]octane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入第三丁基N-[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-(7-乙醯基-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基)-5(第三丁氧羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代乙基]氨基]-1-苄基-2氧代乙基]氨基甲酸酯(35C)(201mg，0.17mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-(7-(二甲氨磺醯基)-2,7-二氮雜螺[3.4]辛烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸鹽(化合物35)，白色粉末(115mg，產率89.7%)。
MS m/z=378.3[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.46-7.29(m,10H),4.71(t,1H),4.38-4.21(m,5H),4.07-4.05(m,2H),3.60-3.46(m,4H),3.23-3.05(m,6H),2.9-2.89(d,6H),2.32-2.26(m，2H)1.8-1.59(m,9H),1.02-0.96(dd,6H)。
實施例34：
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-哌嗪-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；四三氟乙酸鹽(化合物36)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-(2-piperazin-1-yl-7- azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-4-methyl-pentanamide tetra -trifluoroacetic acid
第一步：第三丁基2-(4-苄氧羰基哌嗪-1-基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸酯(36A)
tert-butyl2-(4-benzyloxycarbonylpiperazin-1-yl)-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入第三丁基2-氧代-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸酯(C)(0.478g,2mmol)、苄基-1-哌嗪碳酸酯(440mg，2mmol)、乙酸(120mg，2.0mnol)和二氯乙烷(7mL)，攪拌半小時，加入三乙醯氧基硼氫化鈉(0.636g，3mmol)，反應5h，反應體系用水(10mL)淬滅，乙酸乙酯(5mL×3)萃取，合併有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=4：1)，得到第三丁基2-(4-苄氧羰基哌嗪-1-基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸酯(36A)，淡黃色油狀物(450mg，產率50.79%)。
MS m/z=444.2[M+H]+；
第二步：苄基4-(7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-基)哌嗪-1-羧酸酯(36B)
benzyl 4-(7-azaspiro[3.5]nonan-2-yl)piperazine-1-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入第三丁基2-(4-苄氧羰基哌嗪-1-基)-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸酯(36A)(0.45g，1.20mmol)和二氯甲烷(7mL)，室溫下滴加三氟乙酸(1mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到苄基4-(7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-基)哌嗪-1-羧酸酯(36B)粗產物，淡黃色油狀液體(411mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步：苄基4-[7-[(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-基]哌嗪-1-羧酸酯(36C)
benzyl4-[7-[(2R)-6-(tert-butoxycarbonylamino)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanoyl]amino]hexanoyl]-7-azaspiro[3.5]nonan-2-yl]piperazine-1-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入苄基4-(7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-基)哌嗪-1-羧酸酯(36B)粗產物(411mg，1.2mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(384mg，2mmol)、1-羥基苯並三唑(270mg，2mmol)、中間體1(400 mg，0.53mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到苄基4-[7-[(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-基]哌嗪-1-羧酸酯(36C)，白色固體(300mg，產率52.4%)
第四步：第三丁基N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-(2-哌嗪-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸酯(36D)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-1-(2-piperazin-1-yl-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入苄基4-[7-[(2R)-6-(第三丁氧羰基氨基)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-(第三丁氧羰基氨基)-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基戊醯基]氨基]己醯基]-7-氮雜螺[3.5]壬烷-2-基]哌嗪-1-羧酸酯(36C)(300mg，0.27mmol)和甲醇(5mL)，和Pd/C(30mg)，氫氣氛室溫反應4h。將反應液矽藻土過濾，減壓濃縮，得第三丁基N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-(2-哌嗪-1-yl-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7- 羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸酯(36D)(255mg，100%)直接用於下一步。
第五步：(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-哌嗪-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；四三氟乙酸鹽(化合物36)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-(2-piperazin-1-yl-7-azaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-4-methyl-pentanamide；tetra-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入第三丁基N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧羰基氨基)-1-(2-哌嗪-1-yl-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸酯(36D)粗產物(255mg，0.27mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基- 1-(2-哌嗪-1-基-7-氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；四三氟乙酸鹽(化合物36)，白色粉末(160mg，產率77.6%)。
MS m/z=373.4[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.47-7.30(m,10H),4.71(t,1H),4.36-4.29(m,2H),3.90-3.86(m,1H),3.85-3.24(m,12H),3.23-3.04(m,6H),2.52-2.44(m,2H),2.14-2.12(m,2H),1.77-1.47(m，14H),1.03-0.96(dd,6H)。
實施例35：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物37)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
第一步：7-[(2R)-2-(苄氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(37A)
tert-butyl 7-[(2R)-2-(benzyloxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(6A)(83mg,0.35mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(80mg,0.42mmol)、1-羥基苯並三唑(57mg，0.42mmol)、(2R)-2-(苄氧基羰基氨基)-3-苯基-丙酸(105mg，0.35mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。將反應液 減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到7-[(2R)-2-(苄氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(37A)，白色固體(177mg，產率80%)。
第二步：N-[(1R)-1-苄基-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸苄酯(37B)
Benzyl N-[(1R)-1-benzyl-2-(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-7-yl)-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入7-[(2R)-2-(苄氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(37A)(177mg，0.35mmol)和二氯甲烷(20mL)，室溫下滴加三氟乙酸(2mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到：N-[(1R)-1-苄基-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸苄酯(37B)，黃色油狀液體(143mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步：N-(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R基)-2-(苄氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(37C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-(benzyloxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸苄酯(37B)(143mg，0.35mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(80mg，0.42mmol)、1-羥基苯並三唑(57mg，0.42mmol)、中間體1(264mg，0.35mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R基)-2-(苄氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(37C)，白色固體(400mg，產率99%)。
第四步：N-(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(37D)
tert-butyl N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R基)-2-(苄氧羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯37C(400mg，0.35mmol)、鈀碳(80mg，20wt%l)和甲醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應3h。將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(37D)粗產物，淡黃色固體(353mg，產率100%)，直接投入下一步反應。
第五步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物37)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-[(2R)-2-amino-3phenyl-propanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(37D)(353mg，0.35mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物37)，白色粉末(282mg，產率70%)。
MS m/z=405.3[M+2H]+/2； 1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.52-7.09(m,15H),4.78-4.74(m,1H),4.64-4.58(m,1H),4.26-4.19(m,2H),4.15-3.96(m,3H),3.83(d,1H),3.71-3.63(m,1H),3.59-3.50(m,1H)3.43-2.90(m,11H),1.90-1.18(m,13H),0.98-0.80(m,6H)。
實施例36：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物38)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-[(2R)-2-amino-4-methyl-pentanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
第一步7-[(2R)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(38A)
tert-butyl 7-[(2R)-2-(benzyloxycarbonylamino)-4-methyl-pentanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
在50mL反應瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(6A)(93mg,0.41mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(94mg,0.49mmol)、1-羥基苯並三唑(66mg，0.49mmol)、(2R)-2-(苄氧基羰基氨基)丙酸(446mg，2.0mmol)和二氯甲烷(10mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到7-[(2R)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(38A)，白色固體(175mg，產率90%)。
第二步N-[(1R)-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)-3-甲基-丁基]氨基甲酸苄酯(38B)
Benzyl N-[(1R)-1-(2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)-3-methyl-butyl]carbamate
在50mL反應瓶中，加入7-[(2R)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(38A)(175mg，0.37mmol)和二氯甲烷(20mL)，室溫下滴加三氟乙酸(2mL)，加完後室溫反應3h。將反應液 直接減壓濃縮，得到N-[(1R)-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)-3-甲基-丁基]氨基甲酸苄酯(38B)，黃色油狀液體(138mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步N-(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R基)-2-(苄氧羰基氨基)-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(38C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-(benzyloxycarbonylamino)-4-methyl-pentanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入N-[(1R)-1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)-3-甲基-丁基]氨基甲酸苄酯(38B)(138mg，0.37mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(84mg，0.44mmol)、1-羥基苯並三唑(59mg，0.44mmol)、中間體1(279mg，0.37mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R基)-2-(苄氧羰基氨基)-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基 羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(38C)，白色固體(366mg，產率90%)。
第四步：N-(1R)-2-[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-氨基-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(38D)
tert-butyl N-[(1R)-2-[[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-amino-4-methyl-pentanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]-5-(tert-butoxycarbonylamino)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]amino]-1-benzyl-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R基)-2-(苄氧羰基)-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基氨基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(38C)(366mg，0.33mmol)、鈀碳(73mg，20wt%l)和甲醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應3h。將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到(1R)-2-[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-氨基-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1- 苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(38D)粗產物，淡黃色固體(322mg，產率100%)，直接投入下一步反應。
第五步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物38)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-[(2R)-2-amino-4-methyl-pentanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入(1R)-2-[(1R)-2-[[(1R)-1-[[(1R)-1-[7-[(2R)-2-氨基-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]-5-(第三丁氧基羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基]-1-苄基-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(38D)(322mg，0.33mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-[(2R)-2-氨基-4-甲基-戊醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2- 羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸鹽(化合物38)，白色粉末(240mg，產率65%)。
MS m/z=388.3[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.44-7.14(m,10H),4.61(t,1H),4.50-4.42(m,1H),4.28-4.02(m,5H),3.83-3.70(m,2H),3.66-3.36(m,4H),3.14(t,2H),2.97(t,4H),1.94-1.64(m,10H),1.54-1.30(m,6H),1.01-0.81(m,12H)。
實施例37：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物39)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(cyclopropanecarbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：2-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(39A)
benzyl 2-(cyclopropanecarbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(390mg，1.5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(760mg，4.9mmol)、1-羥基苯並三唑(300mg，2.0mmol)、環丙基甲酸(172mg，2.0mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到2-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(39A)，淡黃色油狀物(320mg，產率65%)。
第二步：環丙基(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)甲酮(39B)
cyclopropyl(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-2-yl)methanone
在50mL單口瓶中，加入2-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(39A)(320mg，0.97mmol)、鈀碳(64mg，20wt%l)和甲醇(10mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應3h。將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到環丙基(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)甲酮(39B)粗產物，淡黃色固體(189mg，產率100%)，直接投入下一步反應。
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基 甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(39C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxy carbonylamino)-1-[2-(cyclopropanecarbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入環丙基(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)甲酮(39B)粗產物(189mg，0.75mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(216mg，1.13mmol)、1-羥基苯並三唑(122mg，0.9mmol)、中間體1(565mg，0.75mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(39C)，淡黃色固體(410mg，產率45%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物39)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(cyclopropanecarbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl- propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(39C)(410mg，0.44mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物39)，白色粉末(330mg，產率78%)。
MS m/z=365.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.45-7.18(m,10H),4.66(t,1H),4.26(dt,2H),4.13(d,2H),3.78(d,2H),3.71-3.61(m,2H),3.56-3.45(m,1H),3.42-3.31(m,1H),3.18(d,2H),3.10-2.93(m,4H),1.99-1.30(m,15H),1.01-0.77(m,10H)。
實施例38：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物40)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-(cyclopropanecarbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：7-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(40A)
tert-butyl 7-(cyclopropanecarbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(6A)(0.453g，2.0mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(767mg，4.0mmol)、1-羥基苯並三唑(324mg，2.4mmol)、環丙基甲酸(176mg， 2.2mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到7-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(40A)，淡黃色油狀物(590mg，產率96%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 3.68(s,4H),3.62-3.52(m,4H),1.81-1.69(m,5H),1.45(s,9H),1.00-0.93(m,2H),0.78-0.71(m,2H)。
第二步：環丙基(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)甲酮(40B)
cyclopropyl(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-7-yl)methanone
在50mL反應瓶中，加入7-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羧酸第三丁酯(40A)(0.25g，0.83mmol)和二氯甲烷(7mL)，室溫下滴加三氟乙酸(1mL)，加完後室溫反應3h。將反應液直接減壓濃縮，得到環丙基(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)甲酮(40B)粗產物，黃色油狀液體(161mg，產率100%)，並直接用於下一步反應。
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(40C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxy carbonylamino)-1-[7-(cyclopropanecarbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-7-基)甲酮(40B)粗產物(0.16g，0.83mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(239mg，1.25mmol)、1-羥基苯並三唑(135mg，1.0mmol)、中間體1(625mg，0.83mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(40C)，淡黃色固體(700mg，產率90%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物40)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[7-(cyclopropanecarbonyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-2-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[7-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(40C)(700mg，0.75mmol)和三氟乙酸(3mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[7-(環丙烷羰基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-2-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物40)，白色粉末(200mg，產率28%)。
MS m/z=365.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.40-7.17(m,10H),4.62(t,1H),4.32-4.00(m,5H),3.82-3.60(m,4H),3.48(br,2H),3.23-3.08(m,2H),3.07-2.91(m,4H),2.01-1.61(m,9H),1.58-1.27(m,5H),0.97-0.67(m,10H)。
實施例39：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸(化合物41)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[2-[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl- propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
第一步：2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸苄酯(41A)
benzyl 2-[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(390mg，1.5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(760mg，4.9mmol)、1-羥基苯並三唑(300mg，2.0mmol)、Boc-D-苯丙氨酸(530mg，2.0mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸苄酯(41A)，白色固體(514mg，產率67%)。
第二步：N-[(1R)-1-苄基-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(41B)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-2-yl)-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸苄酯(41A)(514mg，1.01mmol)、鈀碳(100mg，20wt%)和甲醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應3h。將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到N-[(1R)-1-苄基-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(41B)粗產物，淡黃色固體(377mg，產率100%)，直接投入下一步反應。
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(41C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxy carbonylamino)-1-[2-[(2R)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-phenyl-propanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(41B)粗產物(377mg，1.01mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(290mg，1.52mmol)、1-羥基苯並三唑(164mg，1.21mmol)、中間體1(761mg，1.01mmol)和二氯甲烷(30mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v：v)=1：2)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(41C)，淡黃色固體(410mg，產率36.6%)。
第四步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸(化合物41)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[2-[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；tri-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-[(2R)-2-(第三丁氧基羰基氨基)-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代乙基]氨基甲酸第三丁酯(41C)(410mg，0.37mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；三三氟乙酸(化合物41)，白色粉末(298mg，產率70%)。
MS m/z=405.4[M+2H]+/2；1HNMR(400MHz,D2O)δ 7.52-7.28(m,11H),7.28-7.20(m,4H),4.67-4.62(m,1H),4.32-4.15(m,3H),3.85-3.38(m,6H),3.37-3.22(m,2H),3.22-3.13(m,2H),3.12-2.90(m,6H),2.65(dd,1H),1.83-1.48(m,9H),1.47-1.28(m,3H),1.25-1.11(m,1H),0.92(dd,6H)。
實施例40：
(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(2-羥基乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物42)
(2R)-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(2-hydroxyacetyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：2-四氫吡喃-2-基氧基乙酸(42B)
2-tetrahydropyran-2-yloxyacetic acid
在250mL單口瓶中，依次加入3,4-二氫-2H-吡喃(840mg，10mmol)、羥基乙酸甲酯(42A)(900mg，10mmol)、對甲基苯磺酸一水合物(100mg，0.5mmol)和二氯甲烷(100mL)，加完後在室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物中加入氫氧化鋰溶液(75mL甲醇+25mL水的混合溶液)，加完後在室溫反應過夜。向反應液中滴加0.1M稀鹽酸(12mL)，測試反應液pH為2-3，反應 液用二氯甲烷(100mL×2)萃取，有機層用無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濾液減壓濃縮得到2-四氫吡喃-2-基氧基乙酸(42B)，淡黃色油狀物，(510mg，產率30%)。
MS m/z=183.1[M+Na]+；
第二步：2-(2-四氫吡喃-2-基氧基乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸乙酯(42C)
benzyl 2-(2-tetrahydropyran-2-yloxyacetyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入2-四氫吡喃-2-基氧基乙酸(42B)(510mg，3.2mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1.2g，6.3mmol)、1-羥基苯並三唑(516mg，3.82mmol)、2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(830mg，3.2mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到2-(2-四氫吡喃-2-基氧基乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸乙酯(42C)，淡黃色固體(580mg，產率45%)。
第三步：1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-2-四氫吡喃-2-基氧基-乙酮(42D)
1-(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-2-yl)-2-tetrahydropyran-2-yloxy-ethanone
在50mL單口瓶中，加入2-(2-四氫吡喃-2-基氧基乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-甲酸乙酯(42C)(580mg，1.4mmol)、鈀碳(120mg，20wt%l)和甲醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應3h。將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-2-四氫吡喃-2-基氧基-乙酮(42D)粗產物，淡黃色固體(387mg，產率100%)，直接投入下一步反應。
第四步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(2-四氫吡喃-2-基氧基乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(42E)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxy carbonylamino)-1-[2-(2-tetrahydropyran-2-yloxyacetyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-2-四氫吡喃-2-基氧基-乙酮(42D)粗產物(387mg，1.4mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(553mg，2.88mmol)、1-羥基苯並三唑(233mg，1.72mmol)、中間體1(1.09g，1.45mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到 N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(2-四氫吡喃-2-基氧基乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(42E)，淡黃色固體(590mg，產率41%)。
第五步：(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(2-羥基乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物42)
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(2-四氫吡喃-2-基氧基乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(42E)(590mg，0.59mmol)和三氟乙酸(4mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(2-羥基乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰 基]戊基]-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基-丙醯基]氨基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物42)，白色粉末(286mg，產率67%)。
MS m/z=720.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.44-7.29(m,6H),7.24(d,4H),4.66(t,1H),4.34-4.20(m,2H),4.14(d,2H),4.02(d,2H),3.83(d,2H),3.72-3.60(m,2H),3.56-3.42(m,1H),3.42-3.30(m,1H),3.18(d,2H),3.10-2.94(m,4H),1.96-1.29(m,14H),0.92(dd,6H)。
實施例41：
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-丙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物43)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-(2-propanoyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：2-丙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(43A)
benzyl 2-propanoyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(390mg，1.5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(575mg，3.0mmol)、1-羥基苯並三唑(243mg，1.80mmol)、丙酸(122mg，1.65mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到2-丙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(43A)，淡黃色固體(245mg，產率52%)。
第二步：1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)丙-1-酮(43B)
1-(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-2-yl)propan-1-one
在50mL單口瓶中，加入2-丙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(43A)(245mg，0.775mmol)、鈀碳(49mg，20wt%l)和甲醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣氛圍下，室溫反應3h。將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)丙-1-酮(43B)粗產物，淡黃色固體(141mg，產率99.8%)，直接投入下一步反應。
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2-丙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(43C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxy carbonylamino)-1-(2-propanoyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)丙-1-酮(43B)粗產物(141mg，0.774mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(383mg，2.0mmol)、1-羥基苯並三唑(135mg，1.0mmol)、中間體1(0.565g，0.75mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2-丙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(43C)，淡黃色固體(500mg，產率72.7%)。
第四步：(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-丙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物43)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-(2-propanoyl-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl)pentyl]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-(2-丙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(43C)(260mg，0.28mmol)和三氟乙酸(1.3mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-(2-丙醯基-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基)戊基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物43)，白色粉末(125mg，產率51%)。
MS m/z=359.8[M+2H]+/2；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.45-7.28(m，6H),7.24(d,4H),4.80-4.75(m,1H)4.66(t,1H),4.29(t,1H),4.27(t,1H),4.01(d,2H),3.77(d,2H),3.71-3.60(m,2H),3.55-3.42(m,1H),3.41-3.27(m,1H),3.18(dd,2H),3.11-2.93(m,4H),2.19(qd,2H),1.95-1.63(m,8H),1.61-1.49(m,3H),1.48-1.30(m,2H),1.07(td,3H),0.92(dd,6H)。
實施例42：
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物44)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(2,2,2-trifluoroacetyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
第一步：2-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(44A)
benzyl 2-(2,2,2-trifluoroacetyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carboxylate
在50mL單口瓶中，加入2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(6C)(390mg，1.5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(575mg， 3.0mmol)、1-羥基苯並三唑(243mg，1.80mmol)、三氟乙酸(171mg，1.5mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到2-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(44A)，淡黃色固體(224mg，產率63%)。
第二步：1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-2,2,2-三氟-乙酮(44B)
1-(2,7-diazaspiro[3.5]nonan-2-yl)-2,2,2-trifluoro-ethanone
在50mL單口瓶中，加入2-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羧酸苄酯(44A)(223mg，0.63mmol)、鈀碳(46mg，20wt%l)和甲醇(20mL)。氫氣置換3次，氫氣(氣球)氛圍下，室溫反應3h。將反應液通過矽藻土過濾，濾液減壓濃縮，得到1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-2,2,2-三氟-乙酮(44B)粗產物，淡黃色固體(116mg，產率83%)，直接投入下一步反應。
第三步：N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(44C)
tert-butyl N-[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-benzyl-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(tert-butoxy carbonylamino)-1-[2-(2,2,2-trifluoroacetyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]carbamoyl]-3-methyl-butyl]amino]-2-oxo-ethyl]amino]-2-oxo-ethyl]carbamate
在50mL單口瓶中，加入1-(2,7-二氮雜螺[3.5]壬-2-基)-2,2,2-三氟-乙酮(44B)粗產物(116mg，0.52mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(575mg，3.7mmol)、1-羥基苯並三唑(240mg，1.3mmol)、中間體1(0.47g，0.626mmol)和二氯甲烷(50mL)，室溫反應5h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷：甲醇(v：v)=50：1)，得到N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(44C)，淡黃色固體(216mg，產率42%)。
第四步：(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物44)
(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-amino-3-phenyl-propanoyl]amino]-3-phenyl-propanoyl]amino]-N-[(1R)-5-amino-1-[2-(2,2,2-trifluoroacetyl)-2,7-diazaspiro[3.5]nonane-7-carbonyl]pentyl]-4-methyl-pentanamide；di-trifluoroacetic acid
在50mL反應瓶中，加入N-[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-苄基-2-[[(1R)-1-[[(1R)-5-(第三丁氧基羰基氨基)-1-[2-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]氨基甲醯基]-3-甲基-丁基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基]-2-氧代-乙基]氨基甲酸第三丁酯(44C)(210mg，0.22mmol)和三氟乙酸(2mL)，室溫反應2h。將反應液減壓濃縮，殘留物通過製備液相分離純化(製備條件：儀器：Gilson GX-281；管柱：Xbridge C18,150×30mm I.D.,5μm；流動相：A為ACN及B為H2O；等位沖提：A 65%；流量：30mL/min；背壓：1000PSI；柱溫：30℃；波長：210nm；週期：18min；樣品製備：化合物溶解於12mL甲醇中；注射：0.9mL/針)，將製備液減壓濃縮除去大部分溶劑，凍乾，得到(2R)-2-[[(2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙醯基]氨基]-3-苯基丙醯基]氨基]-N-[(1R)-5-氨基-1-[2-(2,2,2-三氟乙醯基)-2,7-二氮雜螺[3.5]壬烷-7-羰基]戊基]-4-甲基-戊醯胺；二三氟乙酸(化合物44)，白色粉末(111mg，產率51%)。
MS m/z=758.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,D2O)δ 7.44-7.28(m,6H),7.24(d,4H),4.64(t,1H),4.38-4.21(m,4H),3.97(d,2H),3.73-3.58(m,2H),3.56-3.43(m,1H),3.40-3.32(m,1H),3.25-3.11(m,2H),3.11-2.93(m,4H),1.99-1.63(m,9H),1.53(d,3H),1.49-1.33(m,2H),0.93(dd,6H)。
生物測試例
測試1：對人κ-鴉片受體的激動活性
Forskolin(毛喉素)能夠刺激人κ-鴉片受體高表達細胞株-OPRK1細胞(DiscoveRx)cAMP的釋放，而κ-鴉片受體激動劑能夠抑制forskolin刺激的cAMP釋放。通過檢測受試化合物對forskolin刺激的cAMP釋放的抑制作用，能夠測定化合物對人κ-鴉片受體的激動活性。首先用一定濃度的forskolin和不同濃度的受試化合物與人κ-鴉片受體高表達細胞株一起孵育。使用基於時間分辨螢光共振能量轉移(TR-FRET)的cAMP免疫測試法(LANCE®,PerkinElmer)來確定所激發的OPRK1細胞中的cAMP水平。具體方法如下：高表現人(highly expressing human)κ-鴉片受體的OPRK1細胞(DiscoveRx)培養於含10% FBS(Gibco 10099-141)的McCoy's 5A(Gibco 16600-082)培養基中。實驗當天，將在指數生長期的細胞，用PBS/5mM EDTA沖洗分離，離心收集，並用Stimulation Buffer重新懸浮細胞並計數，調整細胞濃度至3*105cells/ml。用DMSO分別溶解Forskolin和受試化合物，使其母液濃度均為10mM，再用Stimulation Buffer稀釋Forskolin至4μM，加入不同濃度受試化合物(濃度依次為80、16、3.2、0.64、0.128、0.0256、0.00512、0.001024、0μM)，以每孔5μl加入384孔板。再向每孔中加入5μl細胞懸浮液，室溫孵育30min。隨後，每孔分別加入5μl 4 x Eu-cAMP tracer工作溶液(用cAMP Detection Buffer稀釋Eu-cAMP stock solution 50倍)和5μl 4 x Ulight-anti-cAMP工作溶液(用cAMP Detection Buffer稀釋ULight-anti-cAMP stock solution 150倍)，室溫下孵育1小時。384孔板用酶標儀(Perkin Elmer，Envision)TR-FRET方法檢測cAMP水平。所得數據用origin7.5軟體處理和擬 合EC50。本發明化合物對人κ-鴉片受體的激動活性通過以上的實驗進行測定，測得的EC50值見表1。
Stimulation Buffer配製方法：將14mL 1*HBSS(invitrogen,cat.# 14025-092)、75μL 1M HEPES(Invitrogen,cat.# 15630-080)、30μL 250mM IBMX溶於DMSO(Sigma,cat.# 17018)和200μL 7.5% BSA Stabilizer混合，用0.1N NaOH調節溶液pH到7.4，並用1*HBSS定容到15mL。
結論：本發明化合物對人κ-鴉片受體具有明顯激動作用。
測試2：小鼠熱板實驗
雌性C57小鼠18-22g購自成都達碩實驗動物有限公司。將熱板儀溫度設定為56℃，升溫後穩定30min開始實驗。將動物依次放入熱板儀測試，觀察動物舔後足反應，以此作為痛反應指標；記錄下動物從進入熱板至受熱刺激引起舔後足反應的時間，符合入組標準(舔後足反應時間低於25s)的動物入組編號。按基線臨界值分組，每組10隻。以10ml/kg皮下給與不同濃度化合物，給藥15min後檢測，以30秒作為截止時間，記錄反應時間。對結果進行統計分析，按公式計算出%MPE值：%MPE=(Tn-T0)/(30-T0)，(Tn為給藥後動物舔後足時間，T0為給藥前動物舔足時間)。實驗結果見表2。
結論：本發明化合物的鎮痛作用是通過外周κ鴉片受體起作用的。
測試3：小鼠扭體實驗
小鼠腹腔注射乙酸後，能夠引起小鼠扭體行為。扭體反應指小鼠表現出典型的腹部肌肉收縮或伸張特徵性的行為反應。通過檢測化合物對乙 酸引起的小鼠扭體行為的抑制作用，可以反應化合物的鎮痛活性。具體方法如下：8周齡ICR小鼠(購自成都達碩生物科技公司，許可證號：SCXK(川)2008-24(NO：51203500002150))。隨機分組，每組10隻動物，雌雄各半；實驗前12h禁食不禁水。實驗當天，分別靜脈給予1.0mg/kg受試化合物，對照組給予空白試劑。給藥後15min，以0.4mL/隻的劑量腹腔內注射0.6%(v/v)醋酸溶液。分別記錄注射醋酸後15min和6h內的小鼠扭體次數，並分別計算受試化合物對乙酸引起的小鼠扭體行為的抑制百分率，分析結果如表3所示。
抑制百分率%=(對照組扭體次數-給藥組扭體次數)/對照組扭體次數。
NQ表示沒有測試。
對照為，CN101627049A中公開化 合物25為其游離鹼。
結論：本發明化合物具有明顯鎮痛作用。
部分受試化合物進一步測試了對乙酸引起的小鼠扭體行為的長效試驗，按照上述相同的試驗方法，給藥方式為靜脈注射，給藥劑量為3mg/kg或10mg/kg，記錄注射醋酸後18h內的小鼠扭體次數，並分別計算受試化合物對乙酸引起的小鼠扭體行為的抑制百分率，結果如表4所示。
表4 受試化合物對乙酸引起的小鼠扭體行為的18h-post抑制百分率
CR845結構為
結論：本發明部分化合物具有明顯鎮痛作用，且具有長效的優點。
4.大鼠PK試驗
5.小鼠PK試驗

Claims (16)

  1. 一種通式(I)所示的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶： 其中， R1選自；m1、m2各自獨立選自1、2、3或4；m3、m4各自獨立選自0、1、2、3或4；條件是，m3和m4不能同時為0；n1、n2各自獨立選自0、1、2、3或4；Z選自CRz1Rz2或NRz3；Rz1、Rz2各自獨立選自H、F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、-C(=O)-C1-6烷基、-(CH2)q-C(=O)O-C1-6烷基、-(CH2)q-NR1eR1f、-(CH2)q-COOH、-(CH2)q-CONH2、C3-8碳環基或3至8元雜環基，所述烷基、烷氧基、烯基、炔基、碳環基或雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、=O、羧基、硝基、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代， 所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子，所述雜原子選自S時，任選進一步為S、S=O或S(=O)2；R1e、R1f各自獨立地選自H、C1-6烷基、-C(=O)O-C1-6烷基、-C(=O)O-(CH2)q-C3-8碳環基或-C(=O)O-(CH2)q-3至8元雜環基，所述的烷基、碳環基或者雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、氰基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；或者，Rz1和Rz2與其連接的碳原子形成3至10元含氮雜環，所述的環任選進一步被選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、氰基、硝基、=O、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代；R1a、R1b各自獨立選自F、CF3、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或3至8元雜環基，所述烷基、烯基、炔基或雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子；Rz3獨立選自H、-C(=O)-C1-6烷基、-C(=O)O-C1-6烷基、-C(=O)-C3-8碳環基、-C(=O)O-C3-8碳環基、-C(=O)O-(3至8元雜環基)、-S(=O)p-C1-6烷基、-S(=O)p-C3-8碳環基、-S(=O)p-(3至8元雜環基)、-C(=O)NR1gR1h、-S(=O)p-NR1iR1j或3至8元雜環基，所述烷基、碳環基或雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子； R1g、R1h、R1i、R1j各自獨立選自H或C1-6烷基；或者，R1g、R1h與其連接的氮原子形成3至10元雜環，所述的環任選進一步被選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、氰基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基或-S(=O)p-C1-6烷基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；q選自0、1、2、3或4；p選自0、1或2；a選自0、1、2或3；R4獨立選自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或-(CH2)q-C3-8碳環基，所述的烷基、烯基、炔基或碳環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CN、CF3、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；R2、R3、R7、R8各自獨立地選自H、C1-6烷基、-C(=O)O-C1-4烷基、- C(=O)O-(CH2)q-C3-8碳環基、-C(=O)O-(CH2)q-3至8元雜環基或，所述的烷基、碳環基或雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-8碳環基或3至8元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子；b選自0、1、2、3、4或5。c選自0、1、2、3、4或5。R5、R6每個各自獨立選自F、Cl、Br、I、CF3、氰基、硝基、C1-4烷基、-OR5a、-C(O)OR5b、-SR5c、-S(O)R5d、-S(O)2R5e或-NR5fR5g； R5a、R5b、R5c、R5d、R5e、R5f和R5g各自獨立選自H或C1-4烷基；或者，R5f、R5g與其連接的氮原子形成5至6元雜環，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，其中，m1、m2、m3、m4各自獨立選自1或2；n1、n2各自獨立選自0、1或2；Z選自CRz1Rz2或NRz3；Rz1、Rz2各自獨立選自H、C1-4烷基、-(CH2)q-C(=O)O-C1-4烷基、-(CH2)q-NR1eR1f、-(CH2)q-COOH、-(CH2)q-CONH2、C3-6碳環基或3至6元雜環基，所述烷基、碳環基或雜環基任選進一步被0-5個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、=O、羧基、硝基、氰基、氨基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C2-4烯基、C2-4炔基、C3-6碳環基或3至6元雜環基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個任選自N、O或S的雜原子，所述雜原子選自S時，任選進一步為S、S=O或S(=O)2；R1e、R1f各自獨立地選自H、C1-4烷基、-C(=O)O-C1-4烷基或-C(=O)O-(CH2)q-C3-6碳環基，所述的烷基或碳環基任選進一步被0-3個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、苯基的取代基所取代；或者，Rz1和Rz2能夠與其連接的碳原子形成4至6元含氮雜環，所述的環任選進一步被=O的取代基所取代；R1a、R1b獨立選自F、CF3、甲基、乙基、丙基或異丙基； Rz3各自獨立選自H、-C(=O)-C1-4烷基、-C(=O)-C3-6碳環基、-C(=O)O-C1-4烷基、-S(=O)p-C1-4烷基、-S(=O)p-C3-6碳環基、-C(=O)NR1gR1h、-S(=O)p-NR1iR1j或3至6元雜環基，所述烷基、碳環基或雜環基任選進一步被0-3個選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、氨基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、環丙基或苯基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；R1g、R1h、R1i、R1j各自獨立選自H或C1-4烷基；或者，R1g、R1h與其連接的氮原子形成4至6元雜環，所述的環任選進一步被選自F、Cl、Br、I、OH、CF3、氰基、硝基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或-S(=O)p-C1-4烷基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；p選自2；q選自0或1；a選自3；R4選自丙基或異丙基；R2、R3、R7、R8各自獨立地選自H、C1-4烷基、-C(=O)O-C1-4烷基或-C(=O)O-苄基；b選自0；以及c選自0。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，其中，該化合物選自通式(II)所示的化合物： R1選自；m1、m2、m3、m4各自獨立選自1或2；n1、n2各自獨立選自0或2；R1a、R1b獨立選自F；Z選自CRz1Rz2或NRz3； Rz1、Rz2各自獨立選自H、羧基、、、、 、、、、、氨基、-CH2NH2或 或者，Rz1和Rz2能夠與其連接的碳原子形成一個內醯胺；Rz3各自獨立選自H、-C(=O)-C1-4烷基、-C(=O)-C3-6碳環基、-C(=O)O-C1-4烷基、-S(=O)p-C1-4烷基、-S(=O)p-C3-6碳環基、-C(=O)NR1gR1h、-S(=O)p-NR1iR1j或3至6元雜環基，所述烷基、碳環基或雜環基任選進一步被0-3個選自F、 Cl、Br、I、OH、CF3、硝基、氰基、氨基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、環丙基或苯基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；R1g、R1h、R1i、R1j各自獨立選自H或C1-4烷基；或者，R1g、R1h與其連接的氮原子形成4至6元雜環，所述的環任選進一步被選自F、CF3、甲基、甲氧基或-S(=O)p-C1-4烷基的取代基所取代，所述的雜環基含有1至3個選自N、O或S的雜原子；p選自2；R2、R3、R7、R8各自獨立地選自H、甲基或-C(=O)O-第三丁基。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，其中，該化合物選自通式(II)所示的化合物： Rz3各自獨立選自H、、、、、、
  5. 如申請專利範圍第4項所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶， R1選自、、、、、
  6. 如申請專利範圍第5項所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，所述化合物選自如下結構之一：
  7. 如申請專利範圍第1-6項中任一項所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，所述的藥學上可接受的鹽選自三氟乙酸鹽。
  8. 一種藥物組合物，所述的藥物組合物包含如申請專利範圍1-7項中任一項所述的化合物、其立體異構物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，和一種或多種以上的藥學上可接受的載體及/或賦形劑。
  9. 如申請專利範圍第1-7項中任一項所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，或者如申請專利範圍第8項所述的藥物組合物在製造用於治療或預防哺乳動物的κ鴉片樣物質受體相關的疾病或病況的藥物之用途。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的用途，其中所述κ鴉片樣物質受體 相關的疾病或病況選自下列群組：疼痛、炎症、瘙癢、水腫、低鈉血症、低鉀血症、腸梗阻、咳嗽和青光眼。
  11. 如申請專利範圍第9項所述的用途，其中所述疼痛選自下列群組：神經性疼痛、軀體痛、內臟痛和皮膚痛。
  12. 如申請專利範圍第9項所述的用途，其中所述疼痛選自下列群組：關節炎疼痛、腎結石疼痛、子宮痙攣、痛經、子宮內膜異位症、消化不良、外科手術後疼痛、醫療處理後疼痛、眼部疼痛、耳炎疼痛、爆發性癌症疼痛和GI紊亂相關的疼痛。
  13. 一種治療或預防哺乳動物的κ鴉片樣物質受體相關的疾病或病況的方法，所述的方法包括給予如申請專利範圍第1-7項中任一項所述的化合物、其立體異構物、水合物、代謝產物、溶劑化物、藥學上可接受的鹽或共晶，或者如申請專利範圍第8項所述的藥物組合物。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的方法，所述κ鴉片樣物質受體相關的疾病或病況選自下列群組：疼痛、炎症、瘙癢、水腫、低鈉血症、低鉀血症、腸梗阻、咳嗽和青光眼。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的方法，所述疼痛選自下列群組：神經性疼痛、軀體痛、內臟痛和皮膚痛。
  16. 如申請專利範圍第14項所述的方法，所述疼痛選自下列群組：關節炎疼痛、腎結石疼痛、子宮痙攣、痛經、子宮內膜異位症、消化不良、外科手術後疼痛、醫療處理後疼痛、眼部疼痛、耳炎疼痛、爆發性癌症疼痛和GI紊亂相關的疼痛。
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