TW201527537A - ２－去氧－鯊肌糖還原酵素 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的為藉由單純的步驟，有效率地生產(-)-維博-櫟醇((-)-vibo-quercitol)。尤其意圖利用可將2-去氧-鯊肌糖直接變換成(-)-維博-櫟醇之酵素。 本發明之解決手段為提供2-去氧-鯊肌糖還原酵素，其來自具有同化(-)-維博-櫟醇之能力的微生物，並具有以下(a)至(c)之特性：(a)具有將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇的觸媒活性；(b)於pH 7.0至9.0顯示最大活性；及(c)以SDS-聚丙烯醯胺電泳所測得之該酵素之多肽部分之分子質量為約36kDa。

Description

2-去氧-鯊肌糖還原酵素
本發明係關於新穎的2-去氧-鯊肌糖還原酵素及編碼該酵素之基因。又，本發明係關於利用可將2-去氧-鯊肌糖(2-deoxy-scylloinosose)直接變換成(-)-維博-櫟醇的酵素，製造(-)-維博-櫟醇之方法。
(-)-維博-櫟醇((-)-vibo-quercitol)((1R,2R,4S,5R)-環己-1,2,3,4,5-五醇)係從蘿藦科(Asclepiadaceae)植物所發現之具有以下化學構造的化合物。
至目前為止，(-)-維博-櫟醇顯示具有強力的血糖效果作用。又，可藉由(-)-維博-櫟醇之胺基化而得到之去氧肌醇胺(deoxyinosamine)及去氧肌醇脒(deoxyinosamidine)，亦係可作為各種醫農藥之合成用中間體的化合物(專利文獻1及2)。
更進一步而言，近年，亦明瞭(-)-維博-櫟醇之工業有用性。例如，在專利文獻3中，記載(-)-維博-櫟醇在作為防止燃料電池之冷卻液凍結用之添加劑上為有用。在用於該目的之情況，(-)-維博-櫟醇，即使於長期使用後也不會被氧化，可維持適當的特性。
又，在專利文獻4中，著眼於(-)-維博-櫟醇在溶解及凝固的過程中可吸熱及放熱大量的潛熱，而揭示可將該化合物應用於太陽熱的蓄熱、或有效利用低廉夜間電力用的蓄熱材料。
因此，藉由單純的步驟有效率地生產(-)-維博-櫟醇顯然有需求。在利用(-)-維博-櫟醇作為醫藥之有效成分的情況，由於該化合物本身應儘可能純且不含不明的雜質，所以其製造步驟亦應儘可能簡單，且可容易追蹤其製造歷程。又，將(-)-維博-櫟醇使用於如上述之工業目的之情況，其生產成本可左右該技術之實現性。
典型地，(-)-維博-櫟醇係從蘿藦科之植物萃取。但是，近年，就更有效率的方法而言，提出於基質中使用肌醇(myo-inositol)，培養農桿菌屬(agrobacterium)或沙門氏桿菌屬之微生物，使該培養液生產(-)-維博-櫟醇，同時生產(+)-原櫟醇((+)-proto-quercitol)及(+)-表櫟醇((+)-epi-quercitol)，然後從該培養液單離出(-)-維博-櫟醇的方法。或者，使該農桿菌屬或沙門氏菌屬之微生物之菌體與肌醇接觸，仍然使該培養液生產(-)-維博-櫟醇，同時生產(+)-原櫟醇及(+)-表櫟醇，然後從該培養液單離出(-)-維 博-櫟醇的方法(專利文獻1及2)。
然而，在該方法中，未單離出可將肌醇變換成(-)-維博-櫟醇之所有酵素，甚至不清楚該反應係藉由一種酵素，還是有2種以上之酵素參與。因此，在該方法中，由於必須以肌醇作為基質來培養微生物，或至少必須利用從該微生物之培養物所得到之菌體，所以步驟仍然繁雜，並且伴隨被未知雜質污染的危險性。而且，該方法顯然沒有效率。
專利文獻5亦提出於基質中使用肌醇來培養腸桿菌屬之微生物，即腸桿菌屬(Enterobacter sp.)AB10114株(FERM P-19319)，使該培養液生產(-)-維博-櫟醇，然後從該培養液中單離(-)-維博-櫟醇的方法。在該方法中，從肌醇以約25%之產率得到(-)-維博-櫟醇(參照實施例1)。但是，在該方法中，也仍然未單離出將肌醇變換成(-)-維博-櫟醇的酵素。因此，在該方法中，由於亦必須以肌醇作為基質來培養微生物，所以其步驟仍然繁雜，並且伴隨被未知雜質污染的危險性。而且，在該方法中，得到目的(-)-維博-櫟醇之時，無法避免需要勞力及時間之微生物發酵步驟。
又，在專利文獻6中揭示：藉由與前揭之專利文獻5之方法中所使用之腸桿菌屬AB10114株(FERM P-19319)接觸，將(-)-維博-櫟醇變換成2-去氧-鯊肌糖的方法。換言之，腸桿菌屬AB10114株(FERM P-19319)可將(-)-維博-櫟醇以80%之產率變換成2-去氧-鯊肌糖(參照實施例 1)。由於在專利文獻6中亦未單離出所有酵素，所以雖然其詳情不明，但縱使假設該反應係以1種酵素作為觸媒，至少該酵素活性在將(-)-維博-櫟醇變換成2-去氧-鯊肌糖之方向上為優勢，將實質的逆反應看做難以進行應是合理的。
然而，本發明人等至目前為止不知，如下述反應圖式所示，可將2-去氧-鯊肌糖直接變換成(-)-維博-櫟醇的酵素有任何人報告過。
(先前技術文獻) (專利文獻)
[專利文獻1]日本特開平11-12210號公報
[專利文獻2]日本特開2000-4890號公報
[專利文獻3]國際公開第WO2005/091413號小冊子
[專利文獻4]日本特開2010-215876號公報
[專利文獻5]日本特開2005-70號公報
[專利文獻6]日本特開2005-72號公報
因此，本發明係以藉由單純的步驟且有效率地生產(-)-維博-櫟醇作為目的。藉由單純的步驟生產可將混入雜質之風險最小化。又，藉由有效率的生產，能預測在(-)-維博-櫟醇之工業領域亦可利用。
更特定而言，意圖利用將2-去氧-鯊肌糖直接變換成(-)-維博-櫟醇的酵素。換言之，已知2-去氧-鯊肌糖(以下，簡稱為「DOI」)，僅經由2階段之酵素反應即可從葡萄糖容易地發酵生產(WO2010/109916號小冊子、WO10/053052號小冊子及WO06/109479號小冊子等)，因而可期待其能成為非常便宜的原料。
本發明人等篩選具有(-)-維博-櫟醇生產能力的微生物，而發現可將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇的微生物。更進一步而言，本發明人等，從該微生物成功地單離出具有可將2-去氧-鯊肌糖直接變換成(-)-維博-櫟醇之觸媒活性的酵素，本發明人等解明該酵素之胺基酸序列及編碼該胺基酸序列的鹼基序列。因此，本發明之第1方面包含以下者。
(1)一種2-去氧-鯊肌糖還原酵素，其來自具有同化(-)-維博-櫟醇之能力的微生物，並具有以下(a)至(c)之特性：(a)具有將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇的觸媒活性；(b)於pH7.0至9.0顯示最大活性；及(c)以SDS-聚丙烯醯胺電泳所測得之該酵素之多肽部 分之分子質量為約36kDa。
(2)如上述(1)之2-去氧-鯊肌糖還原酵素，其中該微生物係屬於假單胞菌(Pseudomonas)屬或伯克氏菌(Burkholderia)屬之微生物。
(3)一種蛋白質，其為下述(a)至(e)之任一種：(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含對比於序列編號2所示之胺基酸序列具有58%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(c)包含對比於序列編號4所示之胺基酸序列具有56%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(d)包含對比於序列編號6所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；或(e)包含對比於序列編號8所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質。
(4)如上述(3)之蛋白質，該蛋白質為(b)至(e)之任一種，但是排除包含序列編號2、4、6及8所示之胺基酸序列之蛋白質。
(5)一種基因，其編碼上述(3)或(4)中所記載之蛋白質。
(6)一種基因，其包含以下之(a)或(b)之核苷酸序列：(a)序列編號1所示之核苷酸序列；或 (b)可與DNA於嚴苛條件下雜交，且編碼具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質的核苷酸序列，其中該DNA係包含與序列編號1所示之核苷酸序列中之至少連續18個鹼基之核苷酸序列互補的序列。
(7)如上述(6)之基因，其中該(b)中由包含至少連續18個鹼基之核苷酸序列係從序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21及序列編號23所成群組中選出之序列之全部或一部分。
又，藉由本發明，亦提供生產酵素的方法，該酵素具有可將2-去氧-鯊肌糖直接變換成(-)-維博-櫟醇的觸媒活性。因此，本發明之第2方面係意圖下述者。
(8)一種(-)-維博-櫟醇變換用重組載體，其包含上述(5)至(7)之任一種基因。
(9)一種(-)-維博-櫟醇變換用轉形體，其導入有上述(5)至(7)之任一種基因或上述(8)之重組載體。
(10)一種2-去氧-鯊肌糖還原酵素之生產方法，其特徵為將上述(9)之轉形體在適於具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質之生產的條件下培養一段時間，然後從培養物精製及回收該蛋白質。
又，在本發明中，提供使用上述酵素生產(-)-維博-櫟醇之方法。關於該生產方法，本發明人等檢索與本發明人等首先發現的本發明2-去氧-鯊肌糖還原酵素具同源性(homology)之胺基酸序列，其結果發現至目前為止被推定具有肌醇2-去氫酵素活性之數種蛋白質顯示與本發明 之新穎2-去氧-鯊肌糖還原酵素具高度胺基酸相同性(identity)，而且具有將2-去氧-鯊肌糖直接變換成(-)-維博-櫟醇的觸媒活性。就本發明人等所知，未曾有人報告此等蛋白質具有將2-去氧-鯊肌糖直接變換成(-)-維博-櫟醇的觸媒活性。
因此，本發明之第3方面係如下述。
(11)一種(-)-維博-櫟醇之製造方法，其特徵為使上述(1)或(2)之2-去氧-鯊肌糖還原酵素與2-去氧-鯊肌糖接觸，在pH5.0至10.0之條件下使其反應，然後從反應液將生成之(-)-維博-櫟醇回收。
(12)一種(-)-維博-櫟醇之製造方法，其特徵為使下述(a)至(e)之任一種蛋白質：(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含對比於序列編號2所示之胺基酸序列具有58%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(c)包含對比於序列編號4所示之胺基酸序列具有56%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(d)包含對比於序列編號6所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；或(e)包含對比於序列編號8所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵 素活性的蛋白質與2-去氧-鯊肌糖接觸，於pH5.0至10.0之條件下使其反應，然後從反應液回收生成的(-)-維博-櫟醇。
再者，藉由本發明提供一種使用上述酵素，將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇之方法。因此，本發明之第4方面係如下述。
(13)一種將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇之方法，其特徵為使在上述(1)或(2)中記載之2-去氧-鯊肌糖還原酵素與2-去氧-鯊肌糖接觸，在pH 5.0至10.0之條件下使其反應。
(14)一種將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇之方法，其特徵為使下述(a)至(e)之任一種蛋白質：(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含對比於序列編號2所示之胺基酸序列具有58%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(c)包含對比於序列編號4所示之胺基酸序列具有56%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(d)包含對比於序列編號6所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；或(e)包含對比於序列編號8所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵 素活性的蛋白質與2-去氧-鯊肌糖接觸，並於pH 5.0至10.0之條件下使其反應。
藉由本發明提供催化新穎反應的酵素。藉著使用本發明之酵素，可簡易且有效率地生產(-)-維博-櫟醇。
第1圖展現被確認具有將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇之能力之微生物的16SrRNA基因序列。
第2圖係展現來自本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素(以下，簡稱為「DOI還原酵素」或「DOIR」)之各精製段階的試料進行SDS-PAGE之結果的照片。從右端之行依序為：第M行：預染色之XL-階梯(廣範圍)(XL-Ladder(Broad))；第1行：粗酵素液；第2行：硫酸銨部分(fraction)；第3行：Butyl-Toyopearl部分；第4行：ResoureQ部分；及第5行：凝膠過濾部分(丙酮濃縮)。
第3圖係展現本發明之DOI還原酵素之最適pH。橫軸表示pH，縱軸表示用吸光度(340nm)之減少速度作為指標的相對活性。曲線圖中，黑色方塊表示檸檬酸緩衝液、白色方塊表示磷酸鉀緩衝液(以下，簡稱「KPB」)、黒色圓圈 表示Tris-鹽酸緩衝液、及白色圓圈表示甘胺酸-氫氧化鈉緩衝液。縱棒表示標準偏差。
第4圖展現已知之肌醇去氫酵素序列(在各序列之左側展現基因銀行登錄編號)、本發明之DOI還原酵素之N末端側胺基酸序列(DOI還原酵素，N端)及本發明之DOI還原酵素之內部序列(DOI還原酵素，內部)的對比。又，展現用於取得本發明之DOI還原酵素基因之各種引子的位置。對比中，將序列相同性高的部分用方框圍起來。向右的箭頭(→)表示正義鏈方向之引子的位置，向左方向之箭頭(←)表示反義鏈方向之引子的位置。又，圖中用圓圈起的數字對應於本文中括弧內的數字。
第5圖展現用於本發明之DOI還原酵素基因之擴增的PCR之溫度循環條件。上段為梯度PCR之條件，下段為TAIL-PCR之條件。
第6圖係展現本發明之DOI還原酵素基因之選殖之概要。
第7圖展現本發明之DOI還原酵素基因之表現用載體的構造。
第8圖係AKC-020株所生產之2-去氧-鯊肌糖還原酵素之胺基酸序列，與已知之肌醇脫氫酵素，即基因銀行登錄編號EKS70356.1、基因銀行登錄編號ADU72508.1、及基因銀行登錄編號EIK69154.1之胺基酸序列的對比。至目前為止，未曾報告此等已知之肌醇脫氫酵素具有將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇的觸媒活性。
第9圖展現肌醇脫氫酵素基因(基因銀行登錄編號AAG44816.1)之編碼區域之核苷酸序列及胺基酸序列；已明瞭該肌醇脫氫酵素基因所編碼之胺基酸序列，與來自本發明之AKC-020株之DOI還原酵素之胺基酸序列的序列相同性低，且將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇的能力低。
第10圖展現肌醇脫氫酵素基因(基因銀行登錄編號CAB12924.1)之編碼區域之核苷酸序列及胺基酸序列；已明瞭該肌醇脫氫酵素基因所編碼之胺基酸序列，與來自本發明之AKC-020株之DOI還原酵素之胺基酸序列的序列相同性低，且將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇的能力低。
第11圖展現肌醇脫氫酵素基因(基因銀行登錄編號CAB15358)之編碼區域之核苷酸序列及胺基酸序列；已明瞭該肌醇脫氫酵素基因所編碼之胺基酸序列，與來自本發明之AKC-020株之DOI還原酵素之胺基酸序列的序列相同性低，且將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇的能力低。
第12圖係展現使重組生產的酵素進行SDS-PAGE之結果的照片。
1. 2-去氧-鯊肌糖還原酵素
本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素係從具有將(-)-維博-櫟醇同化之能力的微生物單離。因此，除了在本說明書中所具體記載者之外，可從具有將(-)-維博-櫟醇同化之能力的其他微生物得到本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素。就選擇此等微生物的方法而言，例如，用(+)-原(proto)-櫟醇、 (-)-原-櫟醇、(+)-維博(vibo)-櫟醇、(-)-維博-櫟醇、(+)-表(epi)-櫟醇、(-)-表-櫟醇、(+)-乳(gala)-櫟醇、(-)-乳-櫟醇、(+)-塔羅(talo)-櫟醇、(-)-塔羅-櫟醇、(+)-別(allo)-櫟醇、(-)-別-櫟醇、鯊(scyllo)-櫟醇、新(neo)-櫟醇、順(cis)-櫟醇、黏(muco)-櫟醇中之一種以上作為唯一碳原進行培養之時，可分離出顯示良好繁殖力之微生物。就此等之中較佳的碳源而言，雖然以係直接目的物的(-)-維博-櫟醇為更佳，但亦可使用含有(-)-維博-櫟醇及其他櫟醇異構物的混合物。例如，可利用：實施在日本特開2000-4890號公報中記載之方法所得到之(+)-原櫟醇、(+)-表-櫟醇與(-)-維博-櫟醇的混合物，或藉著使用化學觸媒將2-去氧-鯊肌糖(DOI)氫化而得到之(-)-維博-櫟醇與鯊-櫟醇的混合物。
就更具體之例而言，將土壤樣本之稀釋液接種於含約0.6%(W/V)之(-)-維博-櫟醇與鯊-櫟醇之混合物的瓊脂平板上。該培養基中，較佳可添加無機氮原(例如，約0.6%(W/V)之硫酸銨)及一般微生物之繁殖所必需之無機鹽(例如，MgSO4、KH2PO4及NaCl等)。然後，將瓊脂平板於約20至30℃之溫度培養約1日至1星期，再將出現之菌落單離即可。
又，從以此種方式單離之微生物中，挑選顯示更高2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之菌株，較為有利。為了該目的，將單離之菌株的細胞，藉由超音波處理，破碎，得到細胞萃取液。將該萃取液與基質：含有2-去氧-鯊肌糖(DOI)之緩衝液混合，於其中添加輔酵素：NADH， 開始酵素反應。接著，測定該反應液中NADH變換為NADH+之速度，亦即2-去氧-鯊肌糖還原之速度，其為反應液於設定時間內顯示之吸光度的變化，可挑選顯示更高2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之菌株。
再者，本發明之酵素，應能以高非對映異構物過剩率來生成(-)-維博-櫟醇。藉此可省略「從生成物分離一方之非對映異構物」的無效率步驟。因此，以將挑選之菌株在有關非對映異構物之生產性上予以特性化為較佳。為了此目的，例如，將細胞萃取液與DOI及NADH混合。又，實施此反應時，藉由使甲酸脫氫酵素及甲酸鈉共存作為輔酵素再生系統，以使酵素反應充分地進行。反應後，以例如使用Shodex KS-801(商品名，昭和電工股份有限公司製)之HPLC分析反應液，並藉由計算下式： ，可鑑定出以高非對映異構物過剩率生成(-)-維博-櫟醇之菌株。以能以80%以上之非對映異構物過剩率將2-去氧-鯊肌糖變換為(-)-維博-櫟醇的菌株為較佳，以能以85%以上之非對映異構物過剩率將2-去氧-鯊肌糖變換為(-)-維博-櫟醇的菌株為更佳，以能以95%以上之非對映異構物過剩率將2-去氧-鯊肌糖變換為(-)-維博-櫟醇的菌株為最佳。
本發明人等依照上述之方法，進行菌株之單離、挑選及特性化的結果，發現6株假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、1株沉積伯克氏菌(Burkholderia sediminicola)、2株土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)、及1株伯克氏菌屬(Burkholderia sp.)，具有從DOI以80%以上之高非對映異構物過剩率生產(-)-維博-櫟醇的能力。
因此，本發明之具有將(-)-維博-櫟醇同化之能力的微生物，從假單胞菌(Pseudomonas)屬或伯克氏菌(Burkholderia)屬之微生物篩選，可較為有利。就特佳之微生物而言，可列舉本發明人等單離並命名之土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)AKC-020株及假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)AKC-019株。
土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)AKC-020株係於2013年11月1日，以NITE P-01745，受託於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄託中心(NPMD)(日本千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8 122號室)。假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)AKC-019株，係於2013年10月24日，以NITE P-01740，受託於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄託中心(NPMD)(千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8 122號室)。
再者，本發明人等成功地從土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)AKC-020株精製本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素。簡單而言，將AKC-020株之培養細胞以超音波碎裂，在其上清液中添加硫酸銨及KPB，形成30%飽和硫酸銨溶液。將該30%飽和硫酸銨溶液之上清液通過疏水層析，藉由硫酸銨之濃度梯度溶出活性部分。繼而將活性部分以MOPS緩衝液透析後，付諸於陰離子交換層析，並 藉由NaCl之濃度梯度溶出活性部分。最後，藉由凝膠過濾層析精製。在凝膠過濾層析中，活性部分雖係在對應於約130KDa之分子質量的保持時間溶出，然而隨後藉由SDS-PAGE進一步確認純度時，於約36KDa可見到單一區帶。因此，推測AKC-020株所生產之本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素於溶液中形成均4聚體。
再者，本發明人等調查AKC-020株所生產之本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素的各種性質。該酵素於pH 7.0至9.0顯示最大活性。又，該酵素在氧化活性評價，亦即將2-去氧-鯊肌糖還原生成(-)-維博-櫟醇之逆反應之評價中，顯示對(-)-維博-櫟醇之基質特異性比對肌醇(myo inositol)者高。
因此，本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素為來自具有將(-)-維博-櫟醇同化之能力的微生物，可被定義為具有以下之特性者：(a)具有將2-去氧-鯊肌糖變換為(-)-維博-櫟醇之觸媒活性；(b)於pH7.0至9.0顯示最大活性；及(c)以SDS-聚丙烯醯胺電泳所測得之該酵素之多肽部分的分子質量為36kDa。
除上述之外，本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素，亦可被定義為具有以下之特性者：(d)以80%以上之非對映異構物過剩率將2-去氧-鯊肌糖變換為(-)-維博-櫟醇；及 (e)在氧化活性評價中，顯示對(-)-維博-櫟醇之基質特異性比對肌醇者高。
2.具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質
本發明人等在考量AKC-020株生產之2-去氧-鯊肌糖還原酵素的N末端序列及內部序列，以及被推定與其有關連性之已知肌醇去氫酵素(以下，簡稱為「IDH」)基因的編碼序列下，進一步製作大約20個退化性引子(degenerate primer)，而成功取得AKC-020株所生產之2-去氧-鯊肌糖還原酵素基因。於是，如以下方式，從該基因之編碼區域鑑定AKC-020株所生產之2-去氧-鯊肌糖還原酵素的胺基酸序列： (序列編號2)
因此，具有上述胺基酸序列之蛋白質顯然呈現本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性，本技術領域人士當可理解其之均等物亦可使用於本發明之目的。為了此目的，本發明人等進一步檢索與上述序列編號2顯示同源性之已知胺基酸序列。於是，本發明人等將具有所檢索之序列的蛋白質於大腸菌內重組表現，測定具有此等胺基酸序列之蛋白質的酵素活性。其結果判明某些肌醇脫氫酵素呈現本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性。
更具體而言，具有與序列編號2顯示58% 以上之胺基酸序列相同性之以下3個序列(參照第8圖)的蛋白質，顯示與AKC-020株所生產之2-去氧-鯊肌糖還原酵素相同程度之將2-去氧-鯊肌糖變換為(-)-維博-櫟醇的觸媒活性。
基因銀行登錄編號EKS70356.1 (序列編號4)；基因銀行登錄編號ADU72508.1 (序列編號6)；及基因銀行登錄編號EIK69154.1 (序列編號8)
然而，關於上述3個肌醇脫氫酵素之任一種，迄今均未被報導具有將2-去氧-鯊肌糖變換為(-)-維博-櫟醇之觸媒活性。再者，判明呈現比序列編號2低同源性(50%以下)之肌醇脫氫酵素，只有少許將2-去氧-鯊肌糖變換為(-)-維博-櫟醇之觸媒活性，或完全沒有。
因此，本發明之具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質，可包含對比於序列編號2所表示之胺基酸序列，具有58%以上相同性之胺基酸序列。其中以包含 對比於序列編號2所表示之胺基酸序列，具有68%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為較佳，以包含具有79%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為更佳，以包含具有85%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為進一步更佳，以包含具有90%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質再進一步更佳，以包含具有95%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為特佳。
又，本發明之具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質，可包含對比於序列編號4所示之胺基酸序列，具有56%以上相同性之胺基酸序列。對比於序列編號4所示之胺基酸序列，以包含具有64%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為較佳，以包含具有79%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為更佳，以包含具有85%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為進一步更佳，以包含具有90%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為再進一步更佳，以包含具有95%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為特佳。
再者，本發明之具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質，可包含對比於序列編號6所示之胺基酸序列，具有54%以上相同性之胺基酸序列。對比於序列編號6所示之胺基酸序列，以包含具有65%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為較佳，以包含具有80%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為更佳，以包含具有85%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為進一步更佳，以包含具有90%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為再進一步更佳，以包含 具有95%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為特佳。
再者，本發明之具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質，可包含對比於序列編號8所示之胺基酸序列，具有54%以上相同性之胺基酸序列所構成。對比於序列編號8所示之胺基酸序列，以包含具有64%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為較佳，以包含具有68%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為較佳，以包含具有80%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為更佳，以包含具有85%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為進一步更佳，以包含具有90%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為再進一步更佳，以包含具有95%以上相同性之胺基酸序列的蛋白質為特佳。
在上述中，序列編號4及序列編號6顯示56%之相同性，序列編號4及序列編號8顯示64%之相同性，序列編號6及序列編號8顯示54%之相同性。
再者，在本說明書中，胺基酸序列之相同性，係表示在將二個序列以最適態樣比對時，二個序列間所共有的一致胺基酸之個數的百分率(一致位置之胺基酸之個數/被比對之胺基酸之個數×100)。可藉由網址http：//www.ncbi.n/m.nih.gov/egi-gin/BLAST之可實裝之BLAST演算法而算出。
此外，在與本發明之AKC-020株所生產之2-去氧-鯊肌糖還原酵素顯示58%以上胺基酸序列相同性的上述3個肌醇脫氫酵素之間，高度保存以下8個部分序列 (參照第8圖)。因此，本發明之具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質，以具有此等8個部分序列中之1個以上為較佳。
部分序列1：RIAVLGAGRIG(序列編號10)
部分序列2：DAVVIGTPTDTHI(序列編號12)
部分序列3：GKAVLCEKPIDLD(序列編號14)
部分序列4：VMLAFNRRFDP(序列編號16)
部分序列5：HSGGIFRDM(序列編號18)
部分序列6：ARWLLGEEPV(序列編號20)
部分序列7：DFDTVMVQLRTASGKQCHINCCR(序列編號22)
部分序列8：AVYGYDQR(序列編號24)
再者，已知在2個蛋白質分子之胺基酸序列不完全相同，但兩者之分子實質上具有類似構造的情況，此等顯示相同之生物活性。例如，即使將白胺酸變換為纈胺酸、將離胺酸變換為精胺酸、將麩醯胺酸變換為天冬醯胺酸，仍可不改變蛋白質之功能。因此，包含在序列編號2所示之胺基酸序列中刪除、置換、及/或附加1或數個胺基酸而成之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質，亦可適用於本發明之目的。
3.基因
如後述，當生產本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素及具有該酵素活性之蛋白質時，以使用編碼該酵素或蛋白質之 基因較為有利。
例如，本發明人等用從AKC-020株分離並決定序列的2-去氧-鯊肌糖還原酵素基因轉形適當之宿主細胞，可使該酵素有效率地生產。該基因之編碼區域的核苷酸序列如以下所示。
(序列編號1)
又，可利用於本發明之目的之2-去氧-鯊肌糖還原酵素基因可具有自然界可能發生的變異、或由人工方式導入之變異及修飾。例如，已知在編碼特定胺基酸之各種密碼子中，存在多餘之密碼子(redundancy)。因此在本發明中，亦可利用最終轉譯成相同胺基酸之代替密碼子。亦即，基因編碼由於縮聚，在編碼某種特定胺基酸上可使用複數個密碼子，因此胺基酸序列可由任何1組類似之DNA寡聚核苷酸編碼而得到。此組中雖然只有一成員與天然型酵素之基因序列相同，但即使用錯配之DNA寡聚核苷酸於嚴苛條件下與天然型序列雜交，也可鑑定、單離出編碼天然型序列之DNA，再者，此種基因亦可被利用於本發 明中。又，在本說明書中，嚴苛條件意指Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrook等人，1989)所記載之，「於含6×SSC(1×SSC之組成：0.15M氯化鈉、0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)、0.5% SDS、5×Denhardt溶液及100mg/mL鯡魚精子DNA之溶液中，於65℃保持恆溫8至16小時下，與探針進行雜交，然後，於例如2xSSC、0.1%SDS及68℃下進行洗淨」的條件。
如前述，與本發明人等所發現之2-去氧-鯊肌糖還原酵素呈現58%以上之胺基酸序列相同性的已知3種肌醇脫氫酵素(IDH)存在。於是，本發明人等首先闡明此3種IDH亦顯示迄今未經報導之2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性。再者，本發明人等藉由本發明人等所發現之2-去氧-鯊肌糖還原酵素之胺基酸序列與該3種IDH之胺基酸序列的對比，發現在前述8個區域，胺基酸序列高度地被保存。因此，本技術領域人士當能理解藉由使用與編碼該8個區域之任一者之胺基酸序列的核苷酸之全長或其一部分互補的DNA作為探針，可容易地將編碼本發明之顯示2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質的基因分離。亦即，典型而言，以利用與下述8個核苷酸序列之任一者互補之序列之全長或其一部分，例如包含連續15鹼基、18鹼基、20鹼基的DNA，作為檢索本發明之基因的探針為較佳。
部分序列1：cgaatcgccgtactcggtgccggccgcattggt(序列編號9)
部分序列2：gatgcggtcgtcatcggcacgccgacggacacgcacatc(序列編號11)
部分序列3：ggcaaggctgttctgtgtgagaagcccatcgacctcgac(序列編號13)
部分序列4：gtcatgctcgctttcaatcgacgtttcgacccg(序列編號15)
部分序列5：cactcgggcggcatcttccgcgacatg(序列編號17)
部分序列6：gcgcgctggttgctcggcgaagagcccgtc(序列編號19)
部分序列7：gacttcgatacggtgatggtgcagttacggaccgcgtcgggcaagcaatg ccatatcaactgctgtcgc(序列編號21)
部分序列8：gccgtgtacggctacgaccagcgc(序列編號23)
再者，由於已知幾乎所有生物優先使用特定密碼子(最適密碼子)之亞組(Gene,Vol.105,pp.61-72,1991等)，依據宿主微生物進行「密碼子最適化」，亦可在本發明中有用。因此，本發明之基因為可具有在序列編號1所示之核苷酸序列中刪除、置換、及/或附加1或數個核苷酸而成之核苷酸序列，且可編碼具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質的核苷酸序列。
4. 2-去氧-鯊肌糖還原酵素之生產方法
本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素及具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質，可利用基因重組技術容易地製造。典型而言，以編碼此等酵素蛋白質之基因作為表現匣(expression cassette)，導入宿主細胞。於是，可在此種轉形宿主細胞內(以下亦稱為「轉形體」)使蛋白質安定地表現。
在本說明書中，表現匣意指一核苷酸，其 包含功能性結合於表現對象之核酸或表現對象之基因而可調節轉錄及轉譯的鹼基序列。典型而言，本發明之表現匣包含從編碼序列算起在5’上游之啟動子序列、在3’下游之終結子序列、視情況係呈進一步與通常之調節元件功能性結合的狀態，在此種情況，表現對象之核酸或表現對象之基因以「可表現之方式導入」宿主細胞。
啟動子不論是構造性啟動子或調節啟動子皆可，被定義為使RNA聚合酶與DNA結合，使RNA合成開始的DNA序列。強啟動子意指使mRNA合成以高頻率開始之啟動子，在本發明中亦適合使用。針對lac系、trp系、TAC或TRC系、λ噬菌體之主要操縱子及啟動子區域、fd外殼蛋白質之控制區域、解糖系酵素(例如，3-磷酸甘油酸酯激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酵素)、麩胺酸脫羧酶A、絲胺酸羥甲基轉移酶之啟動子等，可依照其宿主細胞之性質等而加以利用。除啟動子及終結子序列之外，就其他調節元件之例而言可列舉者，如選擇標記、擴增信號、複製起點等。關於較佳之調節序列，例如，“Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185”，Academic Press(1990)所記載。
上述所說明之表現匣，係組成如質體、噬菌體、轉座子、IS元件、噬粒、黏粒、或線狀或環狀DNA等所構成的載體(亦即，重組載體)，插入宿主細胞中。其中以質體及噬菌體為較佳。此等載體可為在宿主細胞中自律複製者，亦可藉由染色體複製。較佳之質體為例如大腸 菌之pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λ gt11或pBdCI；桿菌之pUB110、pC194或pBD214；棒狀桿菌(Corynebacterium)屬之pSA77或pAJ667等。此等之外亦可使用之質體等記載於“Cloning Vectors”，Elsevier，1985。表現匣對載體之導入，可依照包含藉由適當限制酵素切出、選殖、及接合(ligation)之慣用方法。
依照上述方式構築具有本發明之表現匣的重組載體後，就可適用於將該載體導入宿主細胞，進行轉形之手法而言，可使用例如，共沉澱、原生質體融合、電穿孔、逆轉錄病毒轉染等慣用之選殖法及轉染法。此等之例，記載於「分子生物學之最新草案(Current Protocols in Molecular Biology)」、F.Ausubel等人，Publ.Wiley Interscience,New York,1997，或Sambrook等人，「分子選殖：實驗室操作手冊」，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,NY,1989。
就本發明之宿主細胞而言，可列舉原核細菌、酵母真菌(Saccharomyces)屬或畢赤酵母(Pichia)屬等之酵母、SF9等昆蟲細胞、CHO、COS7等動物細胞。較佳之宿主，如大腸桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、土芽孢桿菌屬、甲烷單胞菌屬、甲基小桿菌屬、嗜甲基菌屬、精蛋白桿菌屬、甲基球菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、發酵 單胞菌及李斯特菌屬之細菌。尤其以工業上發酵生產中利用已確立之大腸菌、芽孢桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、短桿菌屬細菌為更佳。大腸菌由於其迅速之繁殖能力及發酵管理之容易度，為本發明之宿主微生物的特佳例。
如上述方式所得到之轉形微生物，為了用於生產本發明之酵素蛋白質，於適合前述轉形微生物之繁殖條件下培養。來自各種宿主微生物細胞之轉形體用的較佳培養基組成、培養條件、培養時間為本技術領域人士所周知。培養基可為包含1個以上碳源、氮源、無機鹽、維生素、及視需要之微量元素或維生素等微量成分的天然、半合成、合成培養基。然而，不用說所使用之培養基必須適當滿足要培養之轉形微生物的營養要求。再者，培養基，在轉形微生物表現有用之附加形質的情況，例如在對抗生物質具有耐性標記之情況，可包含對應之抗生物質。藉此，可使發酵中之雜菌造成的污染風險減低。再者，相關附加形質，為使後續精製變得容易，亦可將本發明之酵素及蛋白質，形成與其他蛋白質或標籤，例如穀胱甘肽S轉移酶、蛋白質A、六組胺酸標籤、FLAG標籤等之融合蛋白質，使轉形體生產。所生產之融合型，可用適當之蛋白酶例如凝血酶等切出。
培養可為批次式，亦可為連續式。又，在任一種情況，亦可為在培養之適當時點補充追加前述碳源等的形式。再者，培養應可在維持較佳溫度、氧濃度、pH等而同時繼續。一般來自微生物宿主細胞之轉形體的較佳 培養溫度通常為15℃至45℃，較佳在25℃至37℃之範圍。在宿主微生物為好氧性之情況，為確保發酵中之適當氧濃度，必須進行振盪(燒瓶培養等)、攪拌/通氣(發酵罐培養等)。此等培養條件，對本技術領域人士而言，可容易地設定。
繼而，從適合本發明之酵素蛋白質之生產的條件下經適當時間培養之培養物，精製本發明之具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質。亦即，在該蛋白質累積於轉形微生物之細胞內的情況，從培養細胞精製蛋白質即可，在其被釋出於轉形微生物之細胞外的情況，從培養上清液精製蛋白質即可。可利用幾種精製方法。例如，可藉由鹽分割、離子交換層析、尺寸排除層析、羥基磷灰石吸附層析、疏水性相互作用層析之各種組合、或個別的適當使用，從細胞溶解液或萃取液或培養上清液精製本發明之酵素蛋白。
就關於本發明之酵素蛋白質之精製的具體例而言，將培養細胞以超音波破碎，在其上清液中添加硫酸銨，形成30%飽和硫酸銨溶液。將該30%飽和硫酸銨溶液之上清液通過疏水層析，以硫酸銨之濃度梯度將活性部分溶出。繼而將活性部分透析後，付諸於陰離子交換層析，以NaCl之濃度梯度將活性部分溶出。最後，可藉由凝膠過濾層析精製。
5.(-)-維博-櫟醇之製造方法
利用本發明之具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋 白質，可極簡便且有效率地從2-去氧-鯊肌糖製造(-)-維博-櫟醇。亦即，本發明人等所發現之可利用具有序列編號2之胺基酸序列的2-去氧-鯊肌糖還原酵素，迄今只知呈現肌醇脫氫酵素活性，然而本發明人等首先闡明具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性且分別以序列編號4、6及8所示的蛋白質亦可被利用於(-)-維博-櫟醇之製造方法中。再者，此等基因之編碼區域分別如以下所示。
(序列編號3)； (序列編號5)；以及 (序列編號7)
本發明之該酵素反應，只要在本發明之2-去氧-鯊肌糖還原酵素顯示最大活性之pH即pH約5.0至約 10.0之範圍的緩衝液內進行即可。前述pH較佳為5.5至9.5，最佳為7.0至9.0。例如，可使用已調整至此pH範圍之KPB或Tris-鹽酸緩衝液。反應中所使用之本發明之酵素的量，雖可依照基質濃度或期望之反應時間等而適宜選擇，然而通常只要5至500U/L即可。
為該酵素反應之基質的2-去氧-鯊肌糖，可藉由例如，WO2010/109916號小冊子、WO10/053052號小冊子及WO06/109479號小冊子等所記載之方法而容易得到。只要將該基質以期望之濃度溶解於前述緩衝液中即可，可為例如10至500mM，然而不以此為限。另一方面，為了進行本發明之還原酵素反應，必須於反應系中添加NADH，作為輔酵素。雖然添加之NADH之量比基質之量過剩即可，然而通常以基質之約1.2至2倍較充分。反應時間雖係經時地觀測反應液中(-)-維博-櫟醇之濃度，取其生成量最大之時點，然而更簡便而言，亦可觀察因NADH變換為NADH+而變化之緩衝液的吸光度(例如，波長340nm)，並選取其不再變化之時點。就較佳之反應時間之例而言，可列舉20分鐘至120小時，從酵素之安定性的觀點而言，以30分鐘至60小時為較佳，以30分鐘至10小時為更佳，以30分鐘至3小時為最佳。反應溫度只要按照本發明之具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質的最大活性而決定即可，典型地可為約15至40℃，較佳為25至30℃。
從上述之酵素反應物可極簡單且高純度地 將(-)-維博-櫟醇單離。亦即，本發明之具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質，由於係以極高收率及非對映異構物過剩率將2-去氧-鯊肌糖變換為(-)-維博-櫟醇，可避免使用如層析之煩雜步驟。例如，只藉由將反應終了之反應液適宜濃縮，添加低級醇進行再結晶，即可將(-)-維博-櫟醇單離。就具體之例而言，可列舉將酵素反應液濃縮至(-)-維博-櫟醇之含量成為約20至50%(W/V)，於其中添加0.5至2倍量之乙醇的方法。
被賦予以上說明之本技術領域人士可充分地實施本發明。以下，提供實施例僅係為了進一步說明，因此，本發明並不受該等實施例限定。再者，本說明書中若未預先限定，「%」係表示質量/體積之百分率(%(W/V))。又，核苷酸序列係以從5’至3’之方向記載。
[實施例]
1.(-)-維博-櫟醇同化菌之篩選
在0.85%食鹽滅菌水中添加約0.1g之土壤，充分攪拌。然後，靜置3小時，使砂及植物的根等沉澱，將0.1ml之上清液塗布於櫟醇瓊脂培養基(組成示於表1)上。於30℃培養1-2日，藉由LB瓊脂培養基(組成示於表1)進行繁殖之菌的單離作業。將形成單一菌落之菌株移植於斜面培養基(櫟醇瓊脂培養基)中，於30℃培養後，於4℃保存。藉由實施本實驗63次，取得109株之土壤菌。
2.具有將2-去氧-鯊肌糖(DOI)變換為(-)-維博-櫟醇之能力之微生物的取得
將上述取得之109株的土壤菌分別移植於2mL之櫟醇培養基(組成係從上述瓊脂培養基除去瓊脂之組成)，於30℃培養1至2日。此等之中有45株可見到良好之繁殖，因此將培養液離心(15,000rpm，10分鐘，4℃)，並集菌。將收集之菌體懸浮於2mL之20mM磷酸鉀緩衝液(pH7.0)，並以超音波碎裂裝置(TOMY精工股份有限公司，UD-200，輸出：60W，頻率：20kHz)進行30秒之處理，重複5次，將菌體碎裂，離心(15,000rpm，10分鐘，4℃)，回收上清液。以回收液作為粗酵素液，並依以下之順序進行酵素反應評 價。
(1)酵素反應之評價
反應液之組成如以下所示。再者，所使用之粗酵素液為10μl。
酵素反應係藉由將輔酵素NADH變換為NAD+之量用分光光度計定量而測定。亦即，將DOI以外之反應組成液(990μl)取至比色管，於25℃預備加溫約5分鐘。添加DOI溶液(10μl)後，迅速地混合，使用以水為對照且控制於25℃之分光光度計(島津製作所，UV-2550)，測定2分鐘之吸光度(波長340nm)之減少速度，算出每1分鐘之吸光度減少量。繼而，將波長340nm之NADH的分子吸光係數調成6.22mM-1cm-1，將1分鐘內1μmol之NADH減少之量定義為1單位(U)，算出每1mL之粗酵素液的U，進行各菌株之評價。此等結果顯示成功取得顯示超過0.2U/mL(粗酵素液)之活性的10株微生物。
(2)非對映異構物過剩率之評價
繼而從此等10株，以與上述同樣之方式取得粗酵素液，評價從DOI轉變成(-)-維博-櫟醇之反應中的非對映異構物過剩率。具體而言，使用藉由甲酸脫氫酵素(以下FDH，Roche Diagnostics股份有限公司，製品編號244678)之輔酵素再生系統，進行DOI變換。表3中表示變換反應液之組成。反應液係於30℃振盪，同時培育3小時。反應終了後，離心(15,000rpm，15分鐘)，藉由上清液之HPLC分析(條件示於表4)，進行(-)-維博-櫟醇及鯊-櫟醇之定量。
非對映異構物過剩率之計算係用以下之式算出。在所有10株中，達成80%以上之高非對映異構物過剩率。
3.微生物之鑑定
為了微生物之鑑定，進行基因組之萃取。以4ml之LB培養基培養‧集菌後，懸浮於0.72ml之0.05M Tris-HCl(pH 8.0)，並添加溶菌酶。於37℃培育30分鐘後，進一步添加0.08ml之2M NaCl及蛋白酶K、0.08ml之10%SDS，並於37℃處理10分鐘。等量添加Tris-飽和酚/氯仿/異戊醇(比率50：48：2)溶液，激烈攪拌後，離心(15,000rpm，10分鐘，4℃)。將上層液移至新試管，添加2倍量之乙醇，離 心(15,000rpm，10分鐘，4℃)，捨棄上清液。用70%乙醇進行2次清洗，於0.1ml之0.05M Tris-HCl(pH8.0)中再懸浮，添加RNase，並於37℃處理1小時。添加0.4ml之0.05M Tris-HCl(pH8.0)及0.1ml之2M NaCl，重複酚/氯仿萃取，以乙醇沉澱後，用70%乙醇進行清洗2次。將所得到之基因組懸浮於0.5ml之0.05M Tris-HCl(pH8.0)。以所得到之基因組作為模板，將16SrRNA基因之一部分序列以PCR擴增，使用ABI PRISM(登錄商標)310 Genetic Analyzer決定其一部分鹼基序列。將16SrRNA基因之擴增條件示於表5。
藉由使用BLAST search(就為檢索對象之數據庫而言，使用16S ribosomal RNA sequences)之16SrRNA基因之鑑定結果，先前取得之10株微生物，6株係歸屬為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，1株為沉積伯克氏菌(Burkholderia sediminicola)，2株為土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)，最後1株為伯克氏菌屬(Burkholderia sp.)。將此等菌株之16SrRNA基因示於第1圖中，分別為序列編號74至83。又，將此等菌株中，屬於土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)之菌株的一株命名為AKC-020株，屬於假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)之菌株的一株命名為AKC-019株。
4. DOI還原酵素之精製
將土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)AKC-020株，使用LB液體培養基於30℃振動一晚培養，以此作為前培養液。將1ml之前培養液加入100ml之酵母萃取液/胰蛋白腖(Tryptone)/DOI培養基(組成示於表6)，進行本培養。本培養係在500ml容積之坂口燒瓶中加入100ml之培養基，以回轉數120rpm，30℃、24小時之條件進行。
由100ml之培養液集菌，再懸浮於25ml之0.02M磷酸鉀緩衝液(KPB)(pH7.0)後，於冰上以30秒之間隔進行5分鐘超音波破碎(TOMY精工股份有限公司，超音波破碎裝置UD-200，輸出：200W，頻率：20kHz)。將破碎液離心(15,000rpm，10分鐘，4℃)，於上清液中添加5.4g之硫酸銨及KPB，形成35ml之30%飽和硫酸銨濃度溶液。於冰上冷卻40分鐘後離心(15,000rpm，10分鐘，4℃)，將上清液當做硫酸銨沉澱部分。
繼而進行疏水層析。使用管柱劑為Toyopearl Butyl-650M(東曹股份有限公司)，所使用之開口管柱(open column)的尺寸為 2.5cm×6.5cm，管柱體積為約30ml，流速為約0.8ml/分，餾分大小為約5ml/支，以流量400ml從30%至0%之硫酸銨濃度梯度溶出。
將疏水層析之部分用MOPS緩衝液透析後，繼而進行陰離子交換層析。使用管柱為RESOURCE Q 1ml(GE Healthcare)、流速為1ml/分，餾分大小為1ml/支，使用20mM之MOPS緩衝液(pH7.0)，以流量20ml，從0M至0.5M之NaCl濃度梯度溶出。使用機器AKTA purifier(GE Healthcare)。
最後進行凝膠過濾層析。使用管柱為TSK-GelG3000SW(管柱尺寸21.5mm I.D.×30cm，東曹公司製)，流速為1ml/分，餾分大小為1ml/支，以含0.3M之NaCl的0.02M KPB(pH7.0)溶出。就分子量標記而言，使用Oriental酵母股份有限公司製之MW-Marker(商品名)。就使用機器而言，係使用島津製作所製HPLC。
酵素液中之蛋白質濃度，係依照Bradford法測定。在蛋白質定量試藥方面，使用蛋白質含量測定試劑(Protein Assay Reagent)(Bio-Rad公司)，在標準方面，使用牛血清白蛋白(BSA)溶液。為了使土生伯克氏菌AKC-020株表現DOI還原酵素，係在含DOI之培養基中培養。培養之結果，於100ml之培養基中得到濕重量0.3g之菌體。對DOI之總活性為78.7U。將硫酸銨分劃，用Butyl-Toyopearl 650M、ResoureQ、TSK-GelG3000SW進行DOI還原酵素之精製時的精製結果及SDS-PAGE結果分別示於表7及第2圖。
依照使用TSK-Gel G3000 SW管柱之凝膠過濾層析的結果，精製酵素之保持時間為76.66分鐘。又以相同HPLC條件之分子量標記(MW-Marker)(馬心肌細胞色素c(分子量12,400)，酵母肌激酶(分子量32,000)，酵母烯醇化酶(分子量67,000)，豬心肌乳酸脫氫酵素(分子量142,000)，酵母麩胺酸脫氫酵素(分子量290,000))之各個保持時間分別為105.44、94.89、86.40、76.70、65.01分鐘。於是水溶液中之精製酵素，經鑑定分子質量為約130kDa。另一方面，由於依照SDS-PAGE之結果(圖2)，單體之分子質量為約36kDa，本酵素經推測為均4聚體。
5.精製DOI還原酵素之各種性質
(1)最適pH
DOI之還原係藉由以分光光度計定量輔酵素NADH變 換為NAD+之量而測定。在含0.3μmol之NADH且具各種pH之980μL之0.1M緩衝液中，添加10μL酵素液，並於25℃進行5分鐘之預備加溫。添加10μL之0.1M之DOI後，迅速混合，以分光光度計測定2分鐘之吸光度(波長340nm)之減少速度，比較於各pH之活性。將結果示於第3圖。
(2)基質特異性
藉由以分光光度計定量輔酵素NAD+變換為NADH之量，可測定與還原反應逆向進行時之DOI的基質特異性。在含1.0μmol之NAD+的0.1M之緩衝液980μL中，添加10μL酵素液，於25℃進行5分鐘預備加溫。添加10μL之0.1M的各基質後，迅速混合，以分光光度計測定2分鐘之吸光度(波長340nm)的増加速度，比較各基質所產生之活性。將於波長340nm之NADH之分子吸光係數設為6.22mM-1cm-1，將於1分鐘1期間1μmol之NADH變換之量定義為1單位(U)。將結果示於表8。表中，N.D.表示未見到反應。
(3)Km值及Vmax
酵素活性係藉由以分光光度計定量輔酵素NADH或NAD+變化之量而測定。將於波長340nm之NADH的分子吸光係數設為6.22mM-1cm-1，將於1分鐘期間1μmol之NADH變換的量定義為1單位(U)。又依照Bradford法測定酵素液中之蛋白質濃度。測定基質濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、1.0、2.0mM時的活性，算出對DOI之Km 值及Vmax。又，測定輔酵素濃度為0.04、0.06、0.08、0.1、0.2mM時的活性，算出對NADH之Km值。再者，測定櫟醇濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mM時的活性，算出對櫟醇之Km值及Vmax。同樣地，測定NAD+濃度為0.02mM至0.04、0.06、0.1、0.2、0.3mM時的活性，算出對NAD+之Km值。將結果示於表9。
6. DOI還原酵素基因(DOIR基因)之選殖
將論文等報導具有肌醇脫氫酶(inositol dehydrogenase，IDH)活性之已知酵素的胺基酸序列從數據庫取得。依據與此等胺基酸序列同源性高之區域及DOIR的N末端胺基酸序列及內部胺基酸序列，挑選合計8處簡併引子設計區域。將製成之比對及簡併引子序列示於表10及第4圖。將PCR條件示於表11及第5圖。
若詳細地說明，係以從土生伯克氏菌(B.terrae)AKC-020株萃取之基因組DNA作為模板，使用如上 述方式設計之簡併引子，進行第1次PCR(緩冷配對(annealing)之溫度條件在45至60℃之範圍內的梯度PCR)。藉由各種引子之組合進行PCR，結果，用DOIRdgF1/DOIRdgR8之引子組(在表10及第4圖之(1)及(17)，在緩冷配對溫度為約60℃下，可確認約900bp之帶的擴增；藉由使用此擴增片段作為模板，以使用內部區域之引子之第2次PCR(巢式PCR)進行擴增片段之納入，結果，用DOIRdgF1/DOIRdgR7Q之引子組(表10及第4圖之(1)及(15))時，約700bp片段擴增，該鹼基序列所編碼之胺基酸序列顯示與已知之IDH胺基酸序列有約34至53%之同源性。
因此，依據所取得之DOIR基因之部分片段的序列資料，製作引子((18)至(23))，實施TAIL-PCR(熱不對稱交錯PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR))(此等引子亦示於表10)。再者，藉由使用(18)至(20)作為下游區域之選殖用正向引子且使用(25)作為反向引子的TAIL-PCR，以及使用(31)作為正向引子且使用(21)至(23)作為反向引子的TAIL-PCR，分別得到包含下游區域及上游區域之序列的PCR產物。從此等鹼基序列資料可推定包含DOIR之ORF的約3.0kb鹼基序列。使用DOIR基因之ORF之上游之約150bp及下游之約70bp位置的序列製作引子(表10及第4圖之(32)及(33))，再度使用土生伯克氏菌(B.terrae)基因組DNA作為模板，進行PCR，將包含DOIR基因之ORF全長之約1.2kb區域擴增。將此擴增片段精製，藉由直接定序，確定DOIR基因序列。
7. DOIR基因與已知基因之同源性
DOIR基因全長990bp，具有由330胺基酸殘基構成之ORF(序列編號1及2)。從胺基酸序列推測之分子量為36195.12，又其胺基酸序列中，包含從精製酵素之序列解析所得到之N末端“MIRIAVLGAGRI”(序列編號66)及內部胺基酸序列”AELEAFVDALNTN”(序列編號67)。將DOIR之胺基酸序列進行BLAST同源性檢索(就為檢索對象之數據庫而言，使用UniProtKB/SwissProt)之結果，可知與 來自某種微生物之肌醇2-脫氫酶(IDH)具有約80%同源性的例子。然而，此等已知序列，從胺基酸序列之同源性而言，大半被歸類為IDH，實際上被報導有IDH活性者為表12所示之程度。
8.表現用載體pETduet-DOIR之構築
為了進行藉由大腸菌之DOIR的異種宿主表現，構築DOIR表現用載體pETduet-DOIR(第7圖)。使用引子(34)及(35)，將AKC0-020株之DOIR基因擴增，使用限制酵素BamHI及HindIII(參照上述之表10)，對pETDuet-1(Merck公司)之各個限制酵素識別部位進行選殖。pETduet-DOIR轉形為大腸菌(E.coli)BL21(DE3)株。
又，如前述方式進行BLAST檢索之結果， 判明存在與AKC0-020株之DOIR顯示同源性之複數種肌醇2-脫氫酶(inositol 2-dehydrogenase)，為了調查此等肌醇2-脫氫酶是否催化DOI還原，合成該等肌醇2-脫氫酶基因，使其以與上述DOIR基因同樣之方法表現。亦即，藉由DOIR之胺基酸序列及BLASTP檢索(就成為檢索對象之數據庫而言，使用基因銀行、PDB、SwissProt)，挑選顯示約80%、70%、60%、50%、40%、30%之同源性的6個肌醇脫氫酵素(參照表13)。
表13所示之基因之合成時，Bs-iolX之開始密碼子由於為GTG，變更為ATG。再者，報導來自費氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii)USDA191之肌醇脫氫酵素基因(Sf-Idh)編碼氧化肌醇之酵素，來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)168之iolX(Bs-IolX)及iolW(Bs-IolW)編碼對鯊-肌醇顯示活性的酵素。又，iolW(Bs-IolW)為針對NADPH依存型肌醇脫氫酵素者。將此等6基因導入表現載體pET21b(+)(MERCK公司)中，使其藉由大腸菌BL21(DE3)株表現。分別將每個培養液之活性示於表14。
將DOIR及Bh-IolG、Pa-Idh、Ps-Idh、Sf-Idh之重組蛋白的表現以SDS-PAGE確認。將此凝膠中之帶，使用ImageJ 1.46，比較表現量時，相對於DOIR，Bh-IolG、Pa-Idh、Ps-Idh、Sf-Idh表現量分別為0.61倍、0.99倍、1.25 倍、0.97倍(第12圖)。此等顯示對DOI具有活性(表14)。將DOI變換率及生成物之非對映異構物過剩率示於表15。
DOIR及BH-IolG、Pa-Idh、Ps-Idh可將DOI以89%d.e.以上之非對映異構物過剩率變換為(-)-維博-櫟醇。
BS-IolX將DOI以99%d.e.之非對映異構物變換率變換為鯊-櫟醇。Sf-Idh顯示在每個培養液中之DOI還原力弱，雖然過剩地添加菌體破碎液，然而仍無法檢測出為生產物之櫟醇。
[產業上之可利用性]
本發明可用於(-)-維博-櫟醇之極簡便、有效率、且高純度之工業性發酵生產。
【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
<110> 旭化成化學股份有限公司 富山縣
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<223> 引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> y為t或c
<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<223> y為t或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> m為a或c
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<223> r為g或a
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<221> misc_feature
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> r為g或a
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> d為a,g或t
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<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> r為g或a
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> r為g或a
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<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> d為a,g或t
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<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> d為a,g或t
<400> 38
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
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<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
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<223> r為g或a
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<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> k為g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> r為g或a
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> r為g或a
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<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> r為g或a
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<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> r為g或a
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> r為g或a
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> y為t或c
<400> 41
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 42
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 43
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 44
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 45
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 46
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 47
<210> 48
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> s為g或c
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<220>
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<223> w為a或t
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> w為a或t
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n為a,c,g，或t
<400> 50
<210> 51
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> w為a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> w為a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n為a,c,g，或t
<400> 51
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> w為a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> w為a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n為a,c,g，或t
<400> 52
<210> 53
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> s為g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> w為a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> w為a或t
<400> 53
<210> 54
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> w為a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> w為a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> w為a或t
<400> 54
<210> 55
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> s為g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> w為a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n為a,c,g，或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> w為a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n為a,c,g，或t
<400> 55
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 56
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 57
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 58
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 59
<210> 60
<211> 346
<212> PRT
<213> 乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)
<400> 60
<210> 61
<211> 350
<212> PRT
<213> 乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)
<400> 61
<210> 62
<211> 330
<212> PRT
<213> 苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)
<400> 62
<210> 63
<211> 344
<212> PRT
<213> 枯草桿菌(Bacillus subtilis)
<400> 63
<210> 64
<211> 365
<212> PRT
<213> 嗜酸性紅藻菌(Galdieria sulphuraria)
<400> 64
<210> 65
<211> 329
<212> PRT
<213> 費氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii)
<400> 65
<210> 66
<211> 12
<212> PRT
<213> 土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)AKC-020
<400> 66
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> 土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)AKC-020
<400> 67
<210> 68
<211> 990
<212> DNA
<213> 費氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(990)
<400> 68
<210> 69
<211> 329
<212> PRT
<213> 費氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii)
<400> 69
<210> 70
<211> 1029
<212> DNA
<213> 桿草桿菌(Bacillus subtilis)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1029)
<400> 70
<210> 71
<211> 342
<212> PRT
<213> 枯草桿菌(Bacillus subtilis)
<400> 71
<210> 72
<211> 1080
<212> DNA
<213> 枯草桿菌(Bacillus subtilis)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1080)
<400> 72
<210> 73
<211> 359
<212> PRT
<213> 枯草桿菌(Bacillus subtilis)
<400> 73
<210> 74
<211> 656
<212> DNA
<213> 松香假單胞菌(Pseudomonas abietaniphila)AKC-019
<400> 74
<210> 75
<211> 577
<212> DNA
<213> 土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)AKC-020
<400> 75
<210> 76
<211> 552
<212> DNA
<213> 假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)
<400> 76
<210> 77
<211> 551
<212> DNA
<213> 假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)
<400> 77
<210> 78
<211> 558
<212> DNA
<213> 假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)
<400> 78
<210> 79
<211> 563
<212> DNA
<213> 假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)
<400> 79
<210> 80
<211> 649
<212> DNA
<213> 假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)
<400> 80
<210> 81
<211> 555
<212> DNA
<213> 沈積伯克氏菌(Burkholderia sediminicola)
<400> 81
<210> 82
<211> 615
<212> DNA
<213> 土生伯克氏菌(Burkholderia terrae)
<400> 82
<210> 83
<211> 668
<212> DNA
<213> 伯克氏菌屬(Burkholderia sp.)
<400> 83
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 84
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 85
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 86
由於本案的圖為實驗數據圖，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (14)

  1. 一種2-去氧-鯊肌糖還原酵素，其來自具有同化(-)-維博-櫟醇之能力的微生物，並具有以下(a)至(c)之特性：(a)具有將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇的觸媒活性；(b)於pH 7.0至9.0顯示最大活性；及(c)以SDS-聚丙烯醯胺電泳所測得之該酵素之多肽部分之分子質量為約36kDa。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之2-去氧-鯊肌糖還原酵素，其中該微生物係屬於假單胞菌(Pseudomonas)屬或伯克氏菌(Burkholderia)屬的微生物。
  3. 一種蛋白質，其係下述(a)至(e)之任一種：(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含對比於序列編號2所示之胺基酸序列具有58%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(c)包含對比於序列編號4所示之胺基酸序列具有56%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(d)包含對比於序列編號6所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；或(e)包含對比於序列編號8所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌 糖還原酵素活性的蛋白質。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之蛋白質，其中該蛋白質係(b)至(e)之任一種，但是排除包含序列編號2、4、6及8所示之胺基酸序列之蛋白質。
  5. 一種基因，其編碼如申請專利範圍第3或4項所述之蛋白質。
  6. 一種基因，其係包含以下之(a)或(b)之核苷酸序列：(a)序列編號1所示之核苷酸序列；或(b)可與特定DNA於嚴苛條件下雜交，且編碼具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質的核苷酸序列，其中該特定DNA係包含與序列編號1所示之核苷酸序列中之至少連續18個鹼基之核苷酸序列互補的序列。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之基因，其中該(b)中包含至少連續18個鹼基之核苷酸序列係從序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編號21及序列編號23所構成之群組中選出之序列之全部或一部分。
  8. 一種(-)-維博-櫟醇變換用重組載體，其包含如申請專利範圍第5至7項中任一項所述之基因。
  9. 一種(-)-維博-櫟醇變換用轉形體，其經導入有如申請專利範圍第5至7項中任一項所述之基因。
  10. 一種2-去氧-鯊肌糖還原酵素之生產方法，其特徵為將如申請專利範圍第9項所述之轉形體，在適於生產具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性之蛋白質之條件下培 養一段時間，從培養物精製及回收該蛋白質。
  11. 一種(-)-維博-櫟醇之製造方法，其特徵為使如申請專利範圍第1或2項所述之2-去氧-鯊肌糖還原酵素與2-去氧-鯊肌糖接觸，於pH 5.0至10.0之條件下使其反應，然後從反應液回收生成的(-)-維博-櫟醇。
  12. 一種(-)-維博-櫟醇之製造方法，其特徵為使下述(a)至(e)之任一種蛋白質：(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列之蛋白質；(b)包含對比於序列編號2所示之胺基酸序列具有58%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(c)包含對比於序列編號4所示之胺基酸序列具有56%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(d)包含對比於序列編號6所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；或(e)包含對比於序列編號8所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質與2-去氧-鯊肌糖接觸，於pH5.0至10.0之條件下使其反應，然後從反應液回收生成的(-)-維博-櫟醇。
  13. 一種將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇之方法，其特徵為使如申請專利範圍第1或2項之2-去氧-鯊肌糖 還原酵素與2-去氧-鯊肌糖接觸，並於pH 5.0至10.0之條件下反應。
  14. 一種將2-去氧-鯊肌糖變換成(-)-維博-櫟醇之方法，其特徵為使下述(a)至(e)之任一種蛋白質：(a)包含序列編號2所示之胺基酸序列構成之蛋白質；(b)由對比於序列編號2所示之胺基酸序列具有58%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(c)包含對比於序列編號4所示之胺基酸序列具有56%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；(d)包含對比於序列編號6所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質；或(e)包含對比於序列編號8所示之胺基酸序列具有54%以上之相同性之胺基酸序列，且具有2-去氧-鯊肌糖還原酵素活性的蛋白質與2-去氧-鯊肌糖接觸，並於pH5.0至10.0之條件下反應。
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