KR20140080281A

KR20140080281A - 내열성 균주 유래의 효소를 이용한 알로스의 제조방법

Info

Publication number: KR20140080281A
Application number: KR1020120149907A
Authority: KR
Inventors: 한은진; 김혜정; 안신혜; 전세희; 박종진; 이강표
Original assignee: 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2014-06-30
Also published as: KR101764840B1

Abstract

본 발명은 내열성 균주 유래 효소를 포함하는 알로스 (allsoe) 제조용 조성물, 및 상기 효소를 이용한 알로스 제조방법에 관한 것이다.

Description

내열성 균주 유래의 효소를 이용한 알로스의 제조방법 {Method for preparing allose by using enzyme producing hyperthermophilic strain}

알로스 (D-allose)는 포도당 (D-glucose)과 3번 탄소의 -OH 기 방향만 다른 에피머 (epimer)로서, 사이코스 (psicose)의 이성질체로 알려진 희소당 단당류이다. 알로스는 혈전 형성, 장기이식수술 환자의 자가 면역 반응 및 암세포의 증식을 억제하는 기능을 가지고 있다. 또한 간과 뇌의 허혈 후 신경세포의 사멸을 연장시키는 효과도 있으며 백혈병 환자의 치료약으로도 연구가 진행되고 있다.

상기와 같은 특징으로 인해, 알로스는 의약 분야에서 차세대 핵심 소재로써의 높은 이용가치가 있으나, 자연계에 극히 드물게 존재하기 때문에 산업적으로 적용하기 위해서는 효율적인 생산 공정을 개발하는 것이 필요하다. 종래에 알로스는 주로 화학적 합성 방법에 의해서만 생산되었으나, 부가적인 당류의 생성 및 이로 인한 복잡한 정제 과정과 공정상에서 화학적 폐기물이 발생한다는 문제가 있다.

이에, 최근에는 미생물이 생산하는 효소를 이용하여 알로스를 대량 생산하는 방법이 제안되었다. 일본 카가와 대학의 이즈모리 그룹에서 처음으로 슈도모나스 슈체리 (Pseudomonas stutzeri) 유래의 람노스 이성화 효소 (L-rhamnose isomerase)를 사용하여 사이코스에서 알로스를 생산하여 보고하였으나 (Journal of Fermentation and Bioengineering , 85(5);539-541, 1998), 상기 효소는 알로스 생성시 부산물로 다량의 알트로스 (D-altrose)도 함께 생성시키는 단점이 있었다.

따라서 알트로스와 같은 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건을 나타내며 높은 열 안정성을 나타내며, 높은 수율로 알로스를 생산할 수 있는 효소의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명은 종래에 생화학적 특성 및 기능이 밝혀지지 않은 단백질로서, 사이코스로부터 알로스를 전환하는 활성을 가지며 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건을 나타내며 높은 열 안정성을 나타내는 신규한 효소 단백질, 이를 암호화하는 유전자 및 이를 이용하여 사이코스로부터 알로스를 생산하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지며 사이코스로부터 알로스를 전환하는 활성을 가지는 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 균주를 포함하는, 사이코스로부터 알로스의 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 사이코스와 반응시키는 단계를 포함하는, 사이코스로부터 알로스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 그 기능이 밝혀지지 않은 폴리뉴클레오티드 중에서, 사이코스로부터 알로스를 전환하는 활성을 가지는 단백질을 스크리닝하였다. 그 결과 카복시도써모스 하이드로게노포만스가 가지고 있는 유전자 중에서 사이코스를 알로스로 전환할 수 있는 효소를 발현하는 유전자를 확보하였으며, 이에 따라 단백질의 효과적인 과발현을 위하여 최적화 한 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하고 이를 재조합 벡터에 삽입하고 발현시켜 사이코스로부터 알로스로 전환하는 활성을 갖는 효소를 확보함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지며 사이코스로부터 알로스를 전환하는 활성을 가지는 단백질에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 균주를 포함하는, 사이코스로부터 알로스의 제조용 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 사이코스와 반응시키는 단계를 포함하는, 사이코스로부터 알로스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

바람직한 일 예로, 본 발명은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지며 사이코스를 알로스로 전환시키는 활성을 가지는 단백질을 제공한다. 바람직하게, 상기 단백질은 카복시도써머스 하이드로게노포만스 (Carboxydothermus hydrogenoformans) Z-2901 로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 효소는 생화학적 기능은 알려져 있지 않았었으나, 본 발명자들이 사이코스를 알로스로 전환하는 활성을 갖는 효소를 스크리닝 하는 과정에서 그 기능을 발견하게 되었다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 상기 효소는 사이코스를 기질로 하여 알로스를 생산하는 활성을 가진다. 상기에서 사이코스는 D-사이코스인 것이 바람직하고, 상기 알로스는 D-알로스인 것이 바람직하다.

본 발명에서 제공하는 효소 단백질은, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 사이코스를 알로스로 전환시켜줄 수 있는 활성이 유지되는 한, 이에 한정되지 않고 서열번호 1의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 또는 소실된 경우 등을 모두 포함한다. 바람직하게는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 것을 포함한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법 (SDS-PAGE)으로 측정된 단량체의 분자량이 15 내지 20 kDa , 바람직하게는 약17 kDa일 수 있고, 최적 온도는 바람직하게는 pH 7.0에서 70 내지 85℃ 일 수 있다. 또한 60℃에서 최적 pH가 6.5 내지 7.5일 수 있다.

따라서, 바람직하게 본 발명에서 제공하는 효소 단백질은 다음과 같은 특성을 보유할 수 있다:

(a) 분자량이 15 내지 20 kDa;

(b) 최적 활성 온도가 70 내지 85℃; 및

(c) 최적 활성 pH가 pH6.5 내지 7.5.

본 발명의 바람직한 다른 예는, 상기 효소 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주를 제공한다.

상기 효소 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는, 서열번호 2 또는 최적화된 서열인 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 것일 수 있으나, 상기한 염기 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 그 서열을 분석한 경우, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상 상동성이 있는 염기 서열을 포함한다.

당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등에 의해 본 발명에 따른 유전자의 하나 또는 그 이상의 염기 서열을 용이하게 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 상동성을 갖는 범위 내에서 동일한 활성을 갖는 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 용이하게 제조할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

상기 유전자는 그 자체로, 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 목적한 유전자의 염기 서열과, 상기 유전자 염기 서열을 발현하는데 필수적인 적정 염기 서열이 작동 가능하게 연결된 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 적정 염기 서열은 프로모터 및 전사 종결인자로 이루어지는 하나 이상의 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 예를 들면, 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및 온도 민감성 요소(temperature sensitive element)등과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 화학물질 유도성 요소(inducible element)는 lac 오페론 및 T7 프로모터, trc 프로모터 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 T7 프로모터는 바이러스인 T7 파지에서 유래된 것으로 프로모터와 함께 T7 터미네이터를 포함한다.

상기 재조합 벡터는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법을 통해 클로닝을 위 한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다(Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:411-421). 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니며, 발현 벡터는 유전자 재조합에 이용되어온 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하다. 바람직하게는 대장균 내 발현에 적합한 pET, pBR, pTrc, pLex, pUC 벡터 등을 사용할 수 있다.

상기 재조합 벡터를 형질전환 시킬 수 있는 균주는 활성형의 상기 효소 단백질을 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지되어 있는 어떠한 미생물도 이용할 수 있다. 바람직하게는 대장균을 사용할 수 있으며, 상기 대장균은 BL21, JM109, RR1, LE392, K-12, DH5α 또는 W3110 등을 예시할 수 있다. 바람직하게는, BL21(DE3) 균주를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 외에도, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아 속 그리고 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬사 속 균, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등을 사용할 수 있다.

상기 벡터를 사용하여 형질전환시키기 위한 방법은 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 구현예는, 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 균주를 포함하는, 사이코스로부터 알로스의 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 예는, 상기 조성물을 사이코스와 반응시키는 단계를 포함하는, 사이코스로부터 알로스를 제조하는 방법을 제공한다.

바람직한 일 구현예로, 상기 알로스의 제조 방법은, 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 준비 및 정제하는 단계; 및 상기 단백질을 사이코스와 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

바람직한 다른 일 구현예로, 상기 알로스의 제조 방법은, 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 발현하는 재조합 균주를 배양하는 단계; 및 상기 재조합 균주 또는 상기 재조합 균주로부터 분리된 효소 단백질을 사이코스와 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 재조합 균주의 배양 단계는 사용되는 균주의 특성에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택되는 배지 및 배양 조건 하에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 배지로서는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 바람직하게는 2YT 배지, LB 배지, SOB 배지 또는 TB 배지 등이 될 수 있다. 상기 배양은 연속, 반연속, 또는 회분식 배양일 수 있다.

재조합 균주의 배양물은 일반적으로 균주, 예컨대 대장균을 배양하는데 적합한 조건을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 35℃ 내지 37℃에서 상기 재조합 미생물을 150 내지 250rpm에서 진 배양하여 배양물을 얻을 수 있다. 또한 바람직하게는 효소 단백질의 발현을 유도하기 위하여 당업계에서 통상적으로 사용하는 유도 물질을 첨가할 수 있다. 상기 유도 물질의 첨가는 선택되는 유도 요소에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 상기 유도 요소가 lac 오페론 또는 trc 포로모터인 경우, IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토티오피라노시드)일 수 있다. 상기 유도는 당업자에 의하여 배양의 적절한 시기에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 유도는 세포 성장이 충분히 이루어진 후 이루어지는 것일 수 있으며, 바람직하게는 지연기 (lag phase), 지수기 (exponential phase), 정체기 (stantionary phase) 및 사멸기 (death phase)로 이루어지는 세포 성장기 중 지수기 초반 내지 중반에 이루어지는 것일 수 있다.

상기 균주는 균주 배양물에 대해 원심분리, 여과 등을 수행하여 얻을 수 있으며, 또한 상기 얻어진 균주를 균질화시키고 원심 분리하여 수득된 상층액 또는 상기 상층액을 분획화하거나, 크로마토그래피 등을 통해 분리 정제하여 효소 단백질을 얻을 수 있다. 예컨대, 회수된 균주를 50mM 인산 완충용액으로 현탁한 후 파쇄하여 원심분리 한 후, 상등액만 니켈-NTA 컬럼(Qiagen) 에서 흡착시킨 후 20mM, 250mM 이미다졸의 농도로 효소 단백질을 회수할 수 있다.

효소 단백질을 발현하는 재조합 균주 자체를 알로스 전환 반응에 사용하는 경우, 재조합 균주는 원하는 농도 예를 들면, 고농도로 농축된 상태로 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 균주는 고농도로 사이코스를 포함하는 배지 중에 접종되어 배양될 수 있으며, 상기 배지에서 OD₆₀₀ 이 0.05 내지 50, 예를 들면 5 내지 50, 10 내지 50, 20 내지 50, 또는 20 내지 40이 되도록 하는 농도로 접종될 수 있다. 이렇게 고농도의 상기 효소를 포함하는 대장균을 사용함으로써 배지 중에서 고농도로 사이코스가 포함된 배지에서 효율적으로 사이코스를 알로스로 전환할 수 있다.

또한, 상기 사이코스와 반응시키는 단계는 바람직하게는 본 발명의 효소 단백질의 최적 활성화 조건 하에 이루어질 수 있다. 즉, 바람직하게는 pH 6.0 내지 9.0, 보다 바람직하게는 pH6.5 내지 7.5 에서 이루어질 수 있으며, 또한 바람직하게는 70 내지 85℃ 의 온도 조건 하에 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 배지로서는 LB 배지, SOB 배지 또는 TB 배지 등을 사용할 수 있고, 상기 배양은 연속, 반연속, 또는 뱃치 (batch) 형식 배양일 수 있다. 바람직하게는 상기 사이코스는 5 내지 60%(w/v), 보다 바람직하게는 10 내지 40%(w/v)의 농도로 사용될 수 있다. 상기 범위로 사이코스를 사용함으로써 보다 경제적이며 효율적으로 알로스를 생산할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 사이코스로부터 수득된 알로스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 의해 제조된 알로스는 암세포의 증식에 대한 저해제 또는 허혈 작용에 의한 장기 손상에 대한 억제제로서, 기능성 식품 및 의약품 등의 제조 시 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 내열성 균주 유래의 효소는 산업적으로 유용한 범위의 pH, 높은 온도에서의 안정성을 가지며, 사이코스 기질로부터 높은 수율로 알로스를 생산하는 활성을 가지므로, 기능성 당 관련 건강식품 및 의약 산업에서 폭넓게 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 효소 단백질을 발현하기 위한 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 2에서 정제된 효소의 단백질 발현을 나타내는 SDS-PAGE 도면이다.
도 3은 실시예 2에서 정제된 효소의 최적 온도를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 2에서 정제된 효소의 최적 pH를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 2에서 정제된 효소의 열 안정성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 2에서 정제된 효소를 사용하여 사이코스에서 알로스를 생산한 것을 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

실시예 1. 사이코스로부터 알로스를 전환하는 활성을 가지는 효소를 생산하는 재조합 균주 제조

발현 균주로 사용될 대장균에 최적화되도록 카복시도써머스 하이드로게노포만스 Z-2901로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 바이오니아 (Bioneer.Co.Korea)에 의뢰하여 합성하였으며, 상기 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 서열번호 3으로 나타내었다.

합성된 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 제한효소 NdeI과 XhoI (NEB)을 사용하여 발현 벡터인 pET21a (Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pET21a/효소 (pET-RpiB)를 제조하였다 (도 1). 상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터는 heat shock 방법 (Sambrook and Russell: Molecular cloning)에 의하여 대장균 BL21 (DE3) 균주에 형질전환 하였다. 또한, 상기 형질전환 된 미생물은 50% glycerol에 냉동 보관하여 사용하였다.

상기 효소를 대량 생산하기 위하여, 형질전환된 재조합 균주를 5ml LB-ampicilline 배지 (Difco)에 접종하고 600nm에서 흡광도가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200rpm에서 진탕배양 한 후, 이 배양액을 500ml LB-ampicillin 배지에 접종하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 600nm에서 흡광도가 0.6이 될 때, 0.1mM의 IPTG를 첨가하여 목적 효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중 과발현 유도시점부터 배양조건은 16℃, 150rpm으로 조정하여 16시간 동안 배양하였다.

이후 8000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체만을 회수하고, 0.85% (w/v) NaCl로 2회 세척한 다음 알로스 생산 및 효소 정제에 사용하였다.

실시예 2. 사이코스로부터 알로스를 전환하는 활성을 가지는 효소 정제 및 특성 확인

2-1. 효소의 정제

상기 실시예 1에서 회수된 균체를 lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.0 300mM NaCl)에 혼탁시킨 후 음파진동기 (Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 13,000rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하여 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni-NTA컬럼 (Ni-NTA Superflow, Qiagen)에 적용시킨 다음 50mM Tris-HCl 300mM NaCl, pH 7.0에 20mM imidazol과 250mM imidazol이 함유된 완충용액을 순차적으로 흘려주었다. 용출된 목적 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액 (50mM Tris-HCl, pH7.0)으로 전환하여 다음 실험에 사용하였다.

상기 방법으로 부분 정제된 효소를 얻을 수 있었고, SDS-PAGE를 통하여 단량체의 크기가 약 17 kDa임을 확인하였다 (도 2).

2-2. 효소의 온도, pH 변화에 따른 활성 분석

상기에서 정제된 효소의 pH 및 온도 변화에 따른 활성을 조사하기 위하여, 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 효소와 기질을 반응시키고 효소 활성을 비교하였다. 이때 활성측정은 50mM 사이코스, 1.5 unit/ml으로 실시하였으며, 100℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 정지시켰다.

먼저 pH 7.0에서 50-90℃까지 효소 반응을 측정해본 결과 도 3에 나타난 바와 같이 70에서 85℃의 범위에서 높은 활성을 보였으며, 특히 85℃에서 최대 활성을 나타내었다.

또한 효소 활성에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 60℃에서 50mM sodium citrate pH 5.0-6.0, 50mM PIPES pH 6.0-7.0, 50mM Tris-HCl pH 7.0-9.0의 완충용약을 각각 사용하여 효소반응을 실시한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 pH 6.5-7.5 범위에서 높은 활성을 나타내었고, 그 중 특히 50mM PIPES, pH 7.0에서 가장 높은 활성을 나타내었다.

2-3. 효소의 온도 안정성 분석

상기 정제된 효소의 온도 안정성을 확인하기 위해 다양한 온도에서 반응 시간 별 활성을 측정하였다. 활성측정은 50mM 사이코스, 1.5 unit/ml으로 실시하였으며 70-85℃에서 6시간 동안 효소 반응을 측정하였다.

상기 반응 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 half life는 70, 80, 85℃에서 각각 5시간, 3시간, 12분으로 나타났다.

2-4. 효소의 반응속도 ( kinetic parameter ) 분석

상기 정제된 효소의 반응속도를 확인하기 위해 kinetic parameter 분석을 실시하였다. 5-200mM 농도의 사이코스를 기질로 하여 60℃, 50mM Tris-HCl buffer (pH 7.0)에서 1.5 mg/ml의 효소를 사용하여 활성을 측정하였고, 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지시켰다.

상기 반응 결과, 효소 반응 속도를 단량체로 계산 했을 경우 사이코스의 Km 값은 57mM이고 Kcat값은 5.77 min^- ¹ 이었다.

<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> Method for preparing allose by using enzyme producing hyperthermophilic strain <130> DPP20128678KR <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901 <400> 1 Met Lys Ile Ala Ile Gly Ala Asp His Ala Gly Phe Asn Leu Lys Glu 1 5 10 15 Glu Ile Lys Lys His Leu Glu Lys Lys Gly Ile Ala Val Ile Asp Lys 20 25 30 Gly Thr Tyr Ser Ala Glu Ser Val Asp Tyr Pro Asp Phe Gly Glu Ala 35 40 45 Val Ala Glu Ala Val Val Gln Lys Glu Val Asp Phe Gly Ile Val Ile 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ala Asn Lys Val Pro Gly 65 70 75 80 Ile Arg Ala Ala Leu Cys Ser Asp Thr Phe Ser Ala His Ser Ala Arg 85 90 95 Glu His Asn Asp Ala Asn Val Leu Ala Leu Gly Ala Arg Val Val Gly 100 105 110 Val Gly Leu Ala Leu Asp Ile Val Asp Thr Phe Leu Gly Ala Ser Phe 115 120 125 Glu Gly Gly Arg His Ala Arg Arg Val Glu Lys Ile Ala Gly Ile Glu 130 135 140 Glu Lys Tyr Cys Lys Pro Gln Thr Ser Asn Lys Arg Glu Arg Glu 145 150 155 <210> 2 <211> 480 <212> DNA <213> Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901 <400> 2 atgaagatag ccatcggggc tgaccacgcg ggatttaact taaaggaaga aataaaaaag 60 cacctggaaa aaaaggggat tgctgtgatt gacaaaggga cttactccgc ggaatcggtg 120 gactaccccg attttgggga agccgtggcc gaggcggtgg tgcaaaagga agtagatttt 180 ggcattgtaa tttgcggtac cgggatagga atttccatcg ccgccaataa ggttcctggg 240 atccgggcag ccctttgttc ggacactttt tccgcccatt cagcccggga gcacaatgat 300 gccaacgttt tagctctggg ggcccgggtg gtgggagtgg gtcttgccct ggatatcgtg 360 gacacctttc ttggagcatc ctttgaaggt ggccgccacg cccgccgggt agaaaagata 420 gcgggtattg aagagaaata ttgtaaaccc caaacatcca ataaaaggga gcgtgaataa 480 480 <210> 3 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimized gene sequence <400> 3 atgaaaatcg cgatcggtgc ggaccacgcg ggtttcaacc tgaaagaaga aatcaaaaaa 60 cacctggaaa aaaaaggtat cgcggttatc gacaaaggta cctactctgc ggaatctgtt 120 gactacccgg acttcggtga agcggttgcg gaagcggttg ttcagaaaga agttgacttc 180 ggtatcgtta tctgcggtac cggtatcggt atctctatcg cggcgaacaa agttccgggt 240 atccgtgcgg cgctgtgctc tgacaccttc tctgcgcact ctgcgcgtga acacaacgac 300 gcgaacgttc tggcgctggg tgcgcgtgtt gttggtgttg gtctggcgct ggacatcgtt 360 gacaccttcc tgggtgcgtc tttcgaaggt ggtcgtcacg cgcgtcgtgt tgaaaaaatc 420 gcgggtatcg aagaaaaata ctgcaaaccg cagacctcta acaaacgtga acgtgaataa 480 480

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 균주를 포함하는, 사이코스로부터 알로스의 제조용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 카복시도써머스 하이드로게노포만스 (Carboxydothermus hydrogenoformans)로부터 유래된 효소 단백질인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 코딩되는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열 지도를 가지는 재조합 벡터인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 다음의 특징을 가지는 것인 조성물 :
(a) 분자량이 15 내지 20 kDa;
(b) 최적 활성 온도가 70 내지 85℃; 및
(c) 최적 활성 pH가 pH6.5 내지 7.5.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 사이코스와 반응시키는 단계를 포함하는, 사이코스로부터 알로스를 제조하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 반응은 70 내지 85℃ 에서 이루어지는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 반응은 pH6.5 내지 7.5 에서 이루어지는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 사이코스는 5 내지 60%(w/v)의 농도인 방법.