TW201221641A - Processes for purification of proteins - Google Patents
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201221641 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大體上係關於純化蛋白質之方法。 本申請案主張2010年10月11曰申請之美國臨時申請案第 61/391,762號之優先權利，該案以全文引用的方式併入本 文中。 【先前技術】 大規模蛋白質純化的經濟因素很重要，尤其對於治療抗 體而言’因為抗體構成市場上治療生物製劑的較大百分 比。除其治療價值之外，單株抗體例如在診斷領域中亦為 重要工具。眾多單株抗體已經開發且用於診斷許多疾病、 診斷妊婊及用於藥物測試。 典型的純化方法涉及多個層析步驟以便滿足純度.、產率 及生產量需要。該等步驟通常涉及捕捉、中間純化或精製 及最終精製。親和性層析法（蛋白質A或蛋白質G)或離子交 換層析法；ji用作捕捉步驟。傳統地，捕捉步驟接著繼之以 至/另外兩個中間純化或精製層析步驟以確保足夠的純度 病毒/月除中間純化或精製步驟通常經由親和性層析、 離子交換層析或疏水性相互作用連同其他方法一道來實 ^ °在傳統方法中’最終精製步驟可經由離子交換層析、 鼽水眭相互作用層析或凝膠過濾層析來實現。此等步驟移 除匕私相關及產物相關雜質，該等雜質包括來自產物流及 細胞培養物之宿主細胞蛋白質（Hcp)、DNA、浸析蛋白質 A、聚集體、片段、病毒及其他小分子雜質。 159342.doc 201221641 【發明内容】 簡言之，在一實施例中，本發明係關於一種純化蛋白質 之方法，其包含提供含有該蛋白質之樣品、經由捕捉層析 樹脂處理該樣品以提供包含蛋白質的第一溶離液、使該第 一溶離液中之病毒不活化以提供包含蛋白質的不活化溶離 液、經由至少一個深度過濾器處理該不活化溶離液以提供 包s蛋白質的經過滤溶離液，及經由至少一個離子交換膜 處理該經過濾溶離液以提供包含蛋白質的第二溶離液。 另外，在一貫施例中，本發明係關於一種純化蛋白質之 方法，其包含提供含有該蛋白質之樣品、澄清該樣品以提 供澄清樣品、經由捕捉層析樹脂處理該澄清樣品以提供包 含蛋白質的第一溶離液、使該第一溶離液中之病毒不活化 以提供包含蛋白質的不活化溶離液、經由至少一個深度過 遽器處理該不活化溶離液以提供包含蛋白f的經過渡溶離 液，’星由至义一個離子交換膜（其與深度過濾器串聯裝配 或用於另一步驟中）處理該經過濾溶離液以提供包含蛋白 =的第二溶離液、經由另—層析樹脂處理該第二溶離液以 ^匕3蛋白質的第二溶離液、使該第三溶離液進行奈米 慮以提供包含蛋自質的經奈米過渡之溶離液，及使該經 〃米過濾之溶離液進行超濾及奈米過濾或透濾。 【貫施方式】 :見：坪細參考本發明之實施例’在下文中闡述本發明之 一=多個實例。各實例以說明本發明而非限制本發明之方 式提供。事實上，㉟習此項技術者將顯而易知在未悖離本 159342.doc 201221641 發明之範疇或精神的情況下可對本發明作出各種修改及變 化。舉例而言’作為一實施例之部分進行說明或描述之特 徵可用於另一實施例以產生此外另一實施例。 因此，本發明意欲涵蓋歸入隨附申請專利範圍及其等效 内容之範疇内的該等修改及變化。本發明之其他目標、特 徵及態樣揭示於或顯而易見於以下詳細描述中。一般技術 者應瞭解本發明論述僅為例示性實施例之描述，且並非音 欲限制本發明之較廣泛態樣。 在一實施例中，本發明包含一種蛋白質純化系統及方 法。圖1至圖4 t提供本發明純化系統之實施例的示意圖。 在本發明之-實施例中’提供含有蛋白質之樣品。任何 3有蛋白質之樣品均可用於本發明。含有蛋白質之樣品可 包3例如細胞培養物或鼠類腹水液。作為一實例，蛋白質 ^在授拌槽生物反應器中表現於中國倉㈣巢（⑶⑽e 二ΤΟ，，細胞中。蛋白質可為任何在此項技 =知之蛋白質或其片段。在多種實施例中，; 支 融合蛋白，諸如Fc融合蛋白。 贫白質為 在一些實施例中，蛋白質為抗 蛋白質為單株抗體或以段。在竿^ m例中， 人類單株抗體情況下，蛋白質可為 几體在其他實施例中，蛋白皙 抗體。在-實施例中，蛋白質可為飾=疫球蛋白G 體、人類化免癌,… # 了為飾面免疫球蛋白G抗 在一特定+ 》 G犰體或重組免疫球蛋白G抗f。 f特…例中，蛋白f :G抗體。 貫施例中，蛋白質可特異性針對人：表疫球蛋白。饱 丁八頰表皮生長因子受體 159342.d〇c 201221641 (EGFR)之抗原決定基。在另一實施例中，蛋白質可為針斜 IL-13上獨特抗原決定基之重組人類化中和單株抗體。 在本發明之一實施例中，可首先使用任何在此項技術中 已知之方法來澄清含有蛋白質的樣品（參見圖1至圖4，步 驟1)。澄清步驟設法移除樣品中之細胞、細胞碎片及—些 宿主細胞雜質。在一實施例中，可經由一或多個離心步驟 來澄清樣品。樣品之離心可如在此項技術中已知之方式進 行。舉例而言’可使用約ixio-8 m/s之校正裝載量及約 5,000xg至約15,000xg之重力來進行樣品之離心。 在另一實施例中，可經由一或多個深度過濾步驟來澄清 樣品。深度過濾係指使用一系列依次配置具有遞減孔徑的 過渡器自溶液中移除顆粒之方法。深度過濾器三維矩陣形 成類迷宮之路彳坐，樣品經由該路徑穿過。深度過渡器之主 要滯留機制依賴於整個矩陣深度之隨機吸附及機械截留。 在多種實施例中，過濾膜或薄片可為纏繞棉花、聚丙烯、 人造絲纖維素、玻螭纖維、燒結金屬、瓷、矽藻土或其他 已知組分。在某些實施例中，構成深度過濾膜之組合物可 經化學處理來賦予正電性電荷（亦即陽離子電荷）以使過濾 器捕捉帶負電荷的顆粒，諸如DNA、宿主細胞蛋白質或聚 集體。 熟習此項技術者可用之任何深度過濾系統均可用於此實 施例。在一特定實施例中，深度過濾步驟可用可自 MilliP〇re Corporation獲得之MilHstak+⑧ p〇(J深度過濾系統 X0HC介質來實現。在另一實施例中，深度過濾步驟可用 159342.doc 201221641 可自3M Purification Inc.獲得之Zeta PlusTMS度過濾、器來 實現。 在一些實施例中，深度過濾器介質具有約〇. 1 μπι至約8 μηι之標稱孔徑《在其他實施例中，深度過濾器介質可具 有約2 μπι至約5 μπι之孔徑。在一特定實施例中，深度過濾 器介質可具有約0.01 μιη至約1 μπι之孔徑。在其他實施例 中’深度過滤器介質可具有大於約1 μηι之孔徑。在其他實 施例中，深度過濾器介質可具有小於約1 pm之孔徑。 在一些實施例中，澄清步驟可涉及使用兩個或兩個以上 串聯配置之深度過濾器。深度過濾器可彼此相同不同。在 此實施例中’舉例而言’ Millistak+®微型D0HC及X0HC過 濾器可串聯連接且用於本發明之澄清步驟。 在另一實施例中，澄清步驟可涉及使用三個或三個以上 深度過濾器。在一實施例中’澄清步驟可涉及使用多個 (例如10個）並聯配置的深度過濾器單元。在此實施例中， 多個深度過濾器單元可為Millip0re® x〇HC過渡器。 在一特定實施例中，澄清步驟可經由使用離心繼之以串 聯進行X0HC深度過濾來實現（圖2至圖4，步驟1) ^ 在另一實施例中，樣品可經由微濾或超濾膜以切向流過 渡（tangential flow filtration，TFF)模式進行澄清。任何在 此項技術中已知之TFF澄清方法均可用於此實施例。TFF 表示由壓力梯度驅動呈橫向流組態之膜分離方法，其中.膜 根據顆粒及/或溶質尺寸及結構使液體混合物之組分分 級。在澄清中，所選膜孔徑允許某些組分與水一起穿過孔 159342.doc 201221641 隙而使細胞及細胞碎片保留在膜表面之上。在_實施例 中，可使用例如0.1 μιη或75〇 kD分子量截斷、5磅/平方吋 至40磅/平方吋及約4〇c至約6〇β(：之溫度以及聚砜膜來進行 TFF澄清。 在本發明之一實施例中，澄清步驟可涉及以清潔劑處理 樣品。所用清潔劑可為任何已知適用於蛋白質純化方法的 清潔劑。在一實施例中’可將清潔劑以低含量施用於樣品 且隨後將樣品培育足夠一段時間以使包膜哺乳動物病毒不 活化。在一實施例中，待施用之清潔劑含量可為約 0/〇(ν/ν)至約ι%(ν/ν)。在另一實施例中，待施用之清潔劑 含量可為約〇.〇5%(Wv)至約〇.7%(v/v)。在另一實施例中， 待施用之清潔劑含量可為約0·5%(ν/ν)。在一特定實施例 中’清潔劑可為可自Sigma-Aldrich Inc.獲得之聚山梨醇酷 80(Tween® 80)或可自 Roche Diagn〇sties GmbH獲得之 Triton® X-ioo。 此項技術中已知之此等或其他澄清方法之任何組合均可 用作本發明之澄清步驟。 在一實施例中，繼本發明之澄清步驟之後，樣品可進行 層析捕捉步驟（參見圖1至圖4 ’步驟2)。捕捉步驟經設計用 以使目標蛋白質與存在於澄清樣品中之其他雜質分離。常 吊，捕捉步驟減少樣品中之宿主細胞蛋白質（Hep)、宿主 細胞DNA及内源性病毒或類病毒顆粒。在此實施例中所用 之層析技術可為任何在此項技術中已知用作捕捉步驟的技 術。在一實施例中’樣品可經受親和性層析、離子交換層 159342.doc 201221641 析、混合模式層析或疏水性相互作用層析作為捕捉步驟。 在本發明之一特定實施例中，親和性層析可用作捕捉步 驟。親和性層析利用分子之間的特異性結合相互作用。特 定配位體化學固定於或「偶合」於固體支撐物上。當樣品 在樹脂内傳遞時，樣品中對配位體具有特異性結合親和性 之蛋白質變成結合態。在沖洗掉其他樣品組分之後，接著 將結合態蛋白質自固定配位體上剝離且溶離，產生其自原 始樣品之純化。 在本發明之此實施例中，親和性層析捕捉步驟可包含抗 原與抗體之間、酶與受質之間或受體與配位體之間的相互 作用。在本發明之一特定實施例中，親和性層析捕捉步驟 可包含蛋白質A層析、蛋白質G層析、蛋白質α/G層析或蛋 白質L層析。 在某些實施例中’蛋白質A親和性層析可用於本發明之 捕捉步驟（參見圖2至圖4，步驟2)。蛋白質A親和性層析涉 及使用蛋白質A，一種顯示與許多類別免疫球蛋白之非抗 原結合部分特異性結合的細菌蛋白質。所用蛋白質A樹脂 可為任何蛋白質A樹脂。在一實施例中，蛋白質a樹脂可 選自可自 GE Healthcare Life Sciences獲得之MabSelectTN^i|· 脂家族。在另一實施例中，蛋白質A樹脂可為可自
Millipore Corporation獲得之ProSep® Ultra Plus樹脂。任 何在此項技術中可用之管柱均可用於此步驟。在一特定實 施例中’管柱可為用可自GE Healthcare Life Sciences獲得 之MabSelect™樹脂充填的管柱或用可自Millipore 159342.doc 201221641
Corporation獲得之ProSep® Ultra Plus樹脂充填的管柱（例 如 Quickscale管柱）。 若蛋白質A親和性用作層析步驟，則管柱可具有約35 cm 之内徑以及20 cm之管柱長度。在其他實施例中，管柱長 度可為約5 cm至約35 cm。在另一實施例中，管柱長度可 為約1 0 cm至約20 cm。在另一實施例中，管柱長度可為5 cm或5 cm以上。在一實施例中，管柱之内徑可為約〇 5 至約100 cm或200 cm。在另一實施例中，管柱之内徑可為 約10 cm至約50 cm。在另一實施例中，管柱之内徑可為15 cm或1 5 cm以上。 用於層析捕捉步驟之特定方法（包括樣品流經管柱、洗 滌及溶離）視所用特定管柱及樹脂而定，且通常由製造商 提供或在此項技術中已知。如本文中所使用之術語「處 理」可描述使樣品流經或穿過層析管柱、樹脂、膜、過濾 w或/、他機構之過程，且應包括連續流經各機構以及在各 機構之間暫停或停止之流動。 ，層析捕捉步驟之後，溶離液可進行組合處理步驟。在 實施例中，此組合步驟可包含病毒不活化繼之以經由一 或夕個冰度過濾器及離子交換膜處理(參見圖丄至圖4，步 )在：r施例中，；罙度過濾及離子交換膜可設計為 接過濾器系列。 化 實細例中，病毒不活化步驟可包含低pH值病毒不活 在心樣中，可採用在溶離中使用低pH值高濃度甘胺 酸緩衝液，在I 2 Μ .“、另外pH值調整的情況下，在最終溶離液池 159342.doc 201221641 t以目標範圍用於低pH值病毒不活化。或者，乙酸鹽或檸 檬酸鹽緩衝液可用於溶離，且隨後可將溶離液池滴定至適 當pH值範圍以用於低ΡΗ值病毒不活化。在一實施例中， pH值為約2.5至約4。在另一具體實例中，pH值為約3至約 4 〇 在一實施例十，一旦溶離液池之pH值降低，則將池培育 約15分鐘至約90分鐘之時間長度。在一特定實施例中，低 PH值病毒不活化步驟可經由以〇5 M磷酸滴定得到約3 :之 pH值且隨後可將樣品培育約6〇分鐘與9〇分鐘之間的時期來 完成。 在低pH值病毒不活化步驟之後，可將不活化溶離液池中 和至較高pH值。在一實施例中，經中和之較高pH值可為 約5至約1〇之pH值。在另一實施例中，經中和之較高？11值 可為約8至約1〇之pH值。在另一實施例中，經中和之較高 PH值可為約6至約1〇ipH值。在另一實施例中，經中和之 較高pH值可為約6至約8之pH值。在另一實施例中，經中 和之較高pH值可為約8.0之pH值。 在一實施例中，可使用3.0 M三乙醇胺或另一在此項技 術中已知的緩衝液來實現pH值中和。可隨後以純化水或去 離子水調整不活化溶離液池的導電率。在一實施例中，不 活化溶離液池的導電率可調整為約〇·5 mS/cm至約5〇 mS/cm。在另一實施例中，不活化溶離液池的導電率可調 整為約4 mS/cm至約6 mS/cm。在一特定實施例中，不活化 溶離液池的導電率可調整為約5.0 mS/em。 159342.doc • 11 - 201221641 在替代性實施例中，可使用其他在此項技術中已知之方 法來進行組合處理步驟之病毒不活化態樣。舉例而言，在 各種實施例中’病毒不活化步驟可包含以酸、清潔劑、溶 劑、化學物、核酸交聯劑、紫外線、γ輻射、加熱或任何 其他在此項技術中已知適用於此目的之方法處理。 繼病毒不活化及中和之後，不活化溶離液池可經由以過 濾器系列或串接形式提供的如上文充分描述之一或多個深 度過濾器以及一或多個離子交換膜、疏水性膜或混合模式 膜進行處理》 組合步驟之深度過濾態樣可包含一或多種類型之深度過 濾器。在一實施例中’組合步驟之深度過濾態樣可包含一 種以上深度過濾器單元。在一實施例中，此等深度過遽器 可為Millipore® X0HC過濾器。熟習此項技術者將認識 到’所用過濾器之類型及數目的選擇將取決於所處理樣品 之體積。 組合步驟之離子交換態樣可為任何在此項技術中已知之 離子交換方法。在一實施例中，此步驟包含膜層析囊 (membrane chromatography capsule) 〇 在一實施例中，可使 用ChromasorbTM膜吸附器。 在一特定實施例中，該步驟之層析態樣包含Q膜層析 囊。在一實施例中’ Q膜層析囊可包含Mustang® Q膜層析 囊（可自 Pall Corporation 獲得）或 Sartobind® Q(可自 Sartorius Stedim Biotech GmbH獲得）。在一實施例中，q 膜層析囊以流通模式操作。 159342.doc 12- 201221641 在一實施例中，各深度過濾器及離子交換膜步驟可繼之 以囊式過濾步驟。舉例而言，囊式過濾步驟可包含可自 Sanorius Stedim Biotech GmbH獲得之 Sart〇p〇re(g) 2囊式過 渡器β 繼組合處理步驟之後，樣品可進行中間/最終精製步驟 (圖1至圖4’步驟4)。在一實施例中，此步驟可包含另一層 析步驟。任何在此項技術中已知之層析形式均可令人接 受。舉例而言，在-實施例中，中間/最終精製步驟可包 含混合模式（亦稱為多模式）層析步驟（圖3，步驟4)。本發 明中所用之混合模式層析步驟可利用任何在此項技術中已 知的混合模式層析方法。混合模式層析涉及使用呈樹脂、 單石或膜形式之固相層析支樓物，其採用多種化學機制來 吸附蛋白質或其他溶質。適用於本發明之實例包括（但不 限於)利用兩個或兩個以上下列機制之組合的層析支撐 物：陰離子交換、陽離子交換、疏水性相互作用 ' 親水性 相互作用、嗜硫性相互作用、氫鍵結、η鍵結及金屬親 和性。在特定實施财，混合模式層析法合併：⑴陰離子 交換及疏水性相互作用技術；⑺陽離子交換及疏水性相互 作用技術；及/或（3)靜電及疏水性相互作用技術。 在實施例中’混合模式層析步驟可藉由使用管柱及樹 脂來實現，諸如可自GE —㈣獲得之 黏附管柱及樹脂e Capt。⑧㈣f柱為用於在捕捉後 I間純化及精製單株抗體的多模式介質。在-料實施例 中’混合模式層析步料㈣通模式進行。在其他實施例 159342.doc 201221641 中，混合模式層析步驟可以結合-溶離模式進行。 在其他實施例中，混合模式層析步驟可藉由使用一或多 個以下系統來實現：Capto® MMC(可獲自GE Healthcare Life Sciences)、HEA HyperCelTM(可獲自 Pall Corporation)、 PPA HyperCelTM(可獲自 Pall Corporation)、MBI HyperCel™ (可獲自 Pall Corporation)、MEP HyperCelTM(可獲自 Pall Corporation)、Blue Trisacryl M(可獲自 Pall Corporation)、 CFTTM Ceramic Fluoroapatite(可獲自 Bio-Rad Laboratories, Inc.)、- CHTTM Ceramic Hydroxyapatite(可獲自 Bio-Rad Laboratories，Inc.)及 / 或 ABx(可獲自 J. T. Baker)。用於混合 模式層析步驟之特定方法可視所用特定管柱及樹脂而定’ 且通常由製造商供應或在此項技術中已知。 在另一實施例中，中間/最終精製步驟可包含陽離子交 換層析（圖4，步驟4)。本發明中所用陽離子交換層析步驟 可使用任何在此項技術中已知之陽離子交換層析法。在一 實施例中，陽離子交換層析步驟可藉由使用以Poros XS樹 脂（Life Technologies)充填之管柱來實現。在一特定實施例 中，陽離子交換層析步驟可以結合-溶離模式操作。 在方法中所用之各管柱可大到足以提供最大生產能力及 規模經濟。舉例而言，在某些實施例中，各管柱可界定約 1 L至約1500 L、約1 L至約1000 L、約1 L至約500 L或約1 L至約250 L之内部體積。在一些實施例中，混合模式管柱 或陽離子交換管柱可具有約1 cm之内徑及約7 cm之管柱長 度。在其他實施例中，混合模式管柱或陽離子交換管柱之 159342.doc • 14 - 201221641 二徑可為約(U cm至約100 cm、〇 a cm至5〇⑽、〇」⑽至 ’勺W cm、約〇 5 cm至約5 cm、約〇 $ 至約丨$ 或可為 約1 cm ^在—實施例中，混合模式管柱或陽離子交換管杈 之官柱長度可為約1 cm至約5〇 cm、約1 cm至約20 cm、約 5〇111至約10(^或可為約7(^。 在一些實施例中，本發明系統能夠操作高滴定濃度，例 如約 5 g/L、約 6 g/L、約 7 g/L、約 8 g/L、約 9 g/L、約 g/L、約 12.5 g/L、約 15 g/L、約 20 g/L、約 25 g/L之濃度， 約1 g/L至約5 g/L之濃度，約5 g/L至約1〇 g/L之濃度，約5 g/L至約12.5 g/L之濃度，約5 g/L至約15 g/L之濃度，約5 g/L至約20 g/L之濃度，約5 g/L至約55 g/L之濃度或約5 g/L至約1〇〇 g/L之濃度。舉例而言，一些系統能夠操作高 抗體滚度且同時處理每小時約2〇〇 L至約2〇〇〇 L培養物、 每小時約400 L至約2000 L培養物、每小時約600 L至約 1500 L培養物、每小時約8〇〇 [至約12〇〇 l培養物或每小時 大於約1500 L培養物。 在一貫施例中’中間/最終精製步驟可經由一或多個膜 吸附器或單石來實現。膜吸附器為用與等效樹脂上之官能 基類似之g能基衍生的微孔或大孔合成薄膜。在其表面 上，膜吸附器帶有能夠與至少一種接觸物質在藉由重力穿 過膜移動之流體相内相互作用的官能基、配位體、交織纖 維或反應物。通常在相對較小濾筒的深處堆疊5層至15層 膜以產生較具有類似輸出量之管柱小得多的佔據面積。本 文中所用之膜吸附器可為膜離子交換器、混合模式配位體 159342.doc 15 201221641 膜及/或疏水性膜。 在一實施例中，所用膜吸附器可為可自Millipore Corporation獲得之 ChromaSorb™膜吸附器。ChromaSorb™ 膜吸附器為設計用於移除包括HCP、DNA、内毒素及病毒 在内之痕量雜質以進行MAb及蛋白質純化的基於膜的陰離 子交換器。其他可使用之膜吸附器包括Sartobind® Q(可獲 自 Sartorium BBI Systems GmbH)、Sartobind® S(可獲自 Sartorium BBI Systems GmbH)、Sartobind® C(可獲自 Sartorium BBI Systems GmbH)、Sartobind® D(可獲自 Sartorium BBI Systems GmbH)、Sartobind® Phenyl(可獲自 Sartorium BBI Systems GmbH)、Sartobind® IDA(可獲自 Sartorium BBI Systems GmbH)、Pall Mustang®(可獲自 pall Corporation)或任何其他在此項技術中已知之膜吸附器。 如以上所闡述，單石可用於本發明之中間/最終精製步 驟。單石為具有特定控制尺寸之不間斷且互連之通道的單 片多孔結構。經由對流使樣品傳輸穿過單石，引起移動相 與固定相之間的快速質量傳遞。因此，層析特徵為非流動 依賴性。單石亦展現較低背壓，甚至在較高流速下，亦顯 著減少純化時間。在一實施例中，單石可為離子交換或混 合模式之基於配位體的單石。在一態樣中，所用單石可包 括CIM®單石（可獲自BIA separations)、UNO®單石（可獲自 Bio-Rad Laboratories，Inc.)或 ProSwift® 或 IonSwiftTM 單石 (可獲自 Dionex Corporation)。 在另一實施例中，中間/最終精製步驟可經由另一深度 159342.doc -16- 201221641 過濾步驟而非藉由使用膜吸附器、單石或混合模式管柱來 實現。在此實施例中，用於中間/最終精製之深度過濾可 為CUNO Zeta Plus VR®深度過濾器。在此實施例中，深度 過滤器可k供中間/最終精製以及病毒清除之目的。 在一特定實施例中’中間/最終精製步驟可為疏水性相 互作用層析步驟（圖2，步驟4)。在一實施例中，此步驟可 使用Phenyl Sepharose®高效能疏水性相互作用樹脂及
Chromaflow®丙烯酸層析管柱，各者均可自ge Healthcare 獲得。Phenyl Sepharose® HP樹脂係基於具有34 μιη之平均 粒徑的高度交聯剛性珠粒化瓊脂糖。官能基經由不帶電 荷、化學穩定之醚鍵與基質連接，產生具有最小化離子特 性的疏水性介質。在此實施例中，樣品可在裝載於管柱上 之前經Sartopore®囊式過濾器過濾。 若疏水性相互作用層析用於中間/最終精製步驟，則管 柱之内徑可在約10 cm與100 cm之間。在一特定實施例 中’内徑可為約60 cm。在一實施例中，管柱之高度可在 約10 cm與20 cm之間。在一實施例中，管柱之高度為約15 cm ° 繼中間/最終精製層析步驟之後，溶離液池可進行奈米 過濾步驟（參見圖1至圖4，步驟5)。在一實施例中，奈米過 濾步驟係經由一或多個奈米過濾器或病毒過濾器來實現。 過滤器可為任何在此項技術中已知適用於此目的之過濟 器’且可包括例如Millipore Pellicon®4Millipak®過濟器 或Sartorius Vivaspin®或Sartopore®過渡器。在一特定實施 159342.doc • 17- 201221641 例中’奈米過濾步驟可經由預濾器及奈米過濾器或病毒過 濾器組成之過濾器系列來實現。作為一實例，過渡器系列 可由兩個可自 Pall Corporation獲得之Pall 0.15 m2 〇 1 μιη Fluorodyne® π PVDF囊式過濾器組成，作為並聯的兩個可 自 Sartorius Stedim Biotech GmbH 獲得之 20 时 Sartorius
Virosart® CPV過濾器的保護過濾器。在另—實例中，過渡 器系列可由一個（0.17 m2)0.1 μπι Maxicap®預濾器及兩個 20吋Virosart® CPV過濾器組成，兩者均來自Sartorius Stedim Biotech GmbH。熟習此項技術者應瞭解，過濾器之 類型及數目的選擇將取決於所處理樣品之體積。 如圖1至圖4步驟6中所示，奈米過濾步驟可視情況繼之 以超濾/透濾（UF/DF)，以在裝瓶之前達成目標藥物物質濃 度及緩衝條件。在一實施例中’此可藉由使用過濾器來實 現。過濾器可為任何在此項技術中已知適用於此目的之過 濾器’且可包括例如 Millipore Pellicon® ' Millipak® 或 Sartopore®過濾器。在一特定實施例中，UF/DF可經由三 個各具有30 kD分子量截斷及2·5 m2表面積之Millipore® Pellicon® 2 Biomax UF模組、視情況繼之以經由 Sartopore® 2,800無菌囊式過濾器過濾來實現。奈米過濾 及UF/DF步驟可組合或由任何在此項技術中已知用以提供 可接受用於裝瓶（圖1-4，步驟7)之純化蛋白質的方法替 換。在裝瓶之前’在一實施例中，樣品可經由Millipak® 200 0.22 μπι過濾器泵送至預滅菌且無熱原質之聚對苯二曱 酸乙二醇酯（PETG)容器中。 159342.doc •18· 201221641 以下實例描述本發明之各種實施例。熟習此項技術者鑒 於如本文中揭示之本發明之說明書或實務將顯而易知屬於 本文申請專利範圍之範疇内的其他實施例。說明書以及實 例僅意欲視為例示性，且本發明之範疇及精神係由繼實例 之後的申凊專利範圍進行指定。 實例1 一般而言’蛋白質樣品（MAb Α)係經由一系列回收、捕 捉及純化步驟自細胞培養上清液中純化。初始回收步驟涉 及離心及深度過濾》捕捉步驟涉及蛋白質A層析，繼之以 病毒不活化、深度過濾及Mustang® Q膜層析。精細純化步 驟涉及疏水性相互作用層析、奈米過濾及超濾/透濾。隨 後將最終產物過濾、裝瓶及冷凍。回收及捕捉操作在環境 溫度下進行。除非另外指定，否則精細純化步驟在17±2<)(： 之溫度下進行。三批MAb Α之3000 L生物反應器收集物經 由此方法進行純化。 初始回收 藉由離心及深度過渡進行之初始回收係用於自生產生物 反應器槽移除細胞及細胞碎片。Alfa-Laval BTUX 5 10離心 機用於此製程步驟。3000 L生產生物反應器充當連續流動 盤式堆疊離心機之饋料槽。離心機在約5200 rpm下以28公 升/分鐘之饋料速率操作。隨後使經離心之收集物穿過由 十個1.1 m2 Millipore® X0HC介質Pod單元組成的過濾器系 列。在生物反應器之内容物經深度過濾之後，隨後以200 kg25mMTris、100mM氯化鈉（pH7.2)沖洗過濾器系列， 159342.doc -19- 201221641 且隨後吹入空氣以移除剩餘濾液。以單個單元操作形式進 行收集物之離心及過濾。將濾液收集於3000 L收集槽中， 冷卻至4°C至12°C，且保持至多5天。 在一操作中’並不使用離心機而代之以使用一系列Pod 過濾器來處理物質《使用總共15個D0HC及10個X0HC過濾 器來澄清約3000 L收集物質。隨後再次以200 kg 25 mM Tris、100 mM氯化鈉（pH 7.2)沖洗過濾器系列，且隨後吹 入空氣以移除剩餘濾液。當僅使用深度過濾器時，澄清產 率與離心機及深度過濾器均使用之澄清產率類似。總體而 言’平均收集步驟產率為91%，其中平均收集物濃度為 1.85 g/L。收集物離心及過濾操作之結果概述於表1中。 表1.初始回收操作之概述 操作編號 1 2 3 平均值 標準差 反應器最終濃度(g/L) 2.07 2.07 2.02 2.05 0.03 反應器最終量(kg) 2903 2923 2937 2921 17 收集物最終濃度(g/L) 1.87 1.79 1.88 1.85 0.05 收集物最終量(kg) 2931 3013 2895 2946 60 收集步驟產率(％) 91 89 92 91 2 蛋白質A捕捉層析 蛋白質A層析用於自經澄清之收集物中捕捉蛋白質且減 少過程相關雜質的量。pr〇Sep® Ultra Plus樹脂（Millipore) 及Quickscale層析管柱（Millipore)用於此製程步驟。蛋白質 Α捕捉管柱直徑為35 cm且目標高度為20 cm(床體積19.2 L)。管柱中MAb A之裝載限度為每公升蛋白質a樹脂42公 159342.doc -20- 201221641 克樣品。各批次均完成七個循環。步驟在環境 行，且使用720公分/小時至多36 g/L、_公分^ # 39 g/L及240公分/小時至多42 g/L之3步驟線速度裝载量。 以25 mM Tris、100 mM氣化鋼（pH 72)平衡管柱且以經 澄清之收集物裝載。 裝載後，以平衡緩衝液將管柱洗滌至基線吸光度 (八28〇)。使用20 „^檸檬酸鈉/檸檬酸、〇5 m氣化鈉 6.0)進行第二次洗務’以便減少過程相關雜f的量。平衡 緩衝液之第三次洗滌使得光學密度（〇D)、pH值及導電率 回到基線。以(Μ Μ乙酸(pH 3.5)使產物自管柱中溶離。在 280 nm下以1 cm路徑長度在峰前i 〇D至峰尾】〇D間收集 溶離液。對於各細胞培養物批次，將f柱再循環六次以處 理預期約5500 g之粗蛋白質。在各循環之間，以〇2 m乙酸 使管柱再生。在進行低pH值病毒不活化步驟之前，將洗出 液冷卻至4°C至12°C，保持至多5天。 蛋白質A捕捉步驟之操作資料及產率展示於表2中。各批 次除第七次循環外，平均管柱裝載量為每循環每公升樹脂 約42 g蛋白質，其利用剩餘裝載體積進行部分裝載。蛋白 質A捕捉步驟平均產率為90%。捕捉管柱操作與溶離層析 概況一致。在圖5及圖6中說明疊加圖。 表2. ProSep® Ultra Plus蛋白質a捕捉層析之概述 操作編號 1 2 3 平均值 標準 總裝載量(kg) 2931 3013 2895 2946 60— 管柱裝載濃度(g/L) 1.87 1.79 1.88 1.85 — 一 0.05 159342.doc •21· 201221641 溶離液池之量(kg) 245 247 229 240 10 溶離液池濃度(g/L) 20.24 19.71 21.09 20.35 0.70 步驟產率(°/〇) 91 91 89 90 1 病毒不活化、深度過濾及Q膜層析 使蛋白質A溶離液池經受低pH值以使可能已存在之外來 病毒不活化》步驟在環境溫度下進行。藉由以〇 5 jv[磷酸 將溶離液池之pH值調整至3.5±0.1(在25°C下量測）來進行低 pH值不活化步驟。在6〇分鐘至9〇分鐘之保持期後，使用 3.0 Μ二乙醇胺將不活化物質中和至pH值8.〇±〇.1(在25。(：下 I測）’且以純化水稀釋至5·〇±〇·5 mS/cm之導電率。中和 後，使pH值不活化之物質穿過過濾器系列進入儲料槽中。 過濾器系列由兩個組件製成。第一個組件由六個丨a ^ Millipore® X0HC介質P〇d單元組成，且第二個組件為78〇 mL Pall Mustang® Q層析囊。在河⑽⑽砂Q囊上之平均裝 載量為每毫升Q囊6.3 g蛋白質。在深度過濾之後及此外在 Q膜處理之後，使樣品流經Sartopore® 2 20对（0.45 μιη+〇 2 μπι)囊式過濾器。在過濾饋料槽之内容物後，隨後以約ι〇〇 kg 25 mM三乙醇胺及40爪河氣化鈉沖洗過濾器系列。在 S22°C下流出物保持至多1天。在其他情況下，在進行 Phenyl Sepharose® HP層析步驟之前，使流出物冷卻至 S8°C且保持至多3天。 低pH值不活化及過濾操作之結果概述於表3中。 Mustang® Q囊之平均裝載量為每毫升卩囊63 g蛋白質㈠目 當於每毫升Q囊409 mL蛋白質卜三次操作具有嫩之平均 159342.doc •22- 201221641 步驟產率。 表3.病毒不活化、深度過渡及Q膜層析操作之概述 操作編號 1 2 3 平均值 標準差 起始量(kg) 245 247 229 240 10 pH值，初始(病毒不活化） 4.0 4.1 4.1 4.1 0.1 pH值，最終(病毒不活化） 3.5 3.6 3.6 3.6 0.1 所添加之0.5 Μ填酸(kg) 6.7 7.1 7.0 6.9 0.2 pH值，初始 3.6 3.6 3.6 3.6 0.0 pH值，最終 7.9 7.9 7.9 7.9 0.0 所添加之3.0 Μ三乙醇胺(kg) 16.8 16.3 14.8 16.0 1.0 導電率，初始(mS/cm) 6.4 6.5 6.7 6.5 0.1 導電率，最終(mS/cm) 5.4 5.4 5.4 5.4 0.0 所添加之USP-PW(kg) 54.7 59.7 54.0 56.1 3.1 Mustang® Q裝載量(公克樣品/ 毫升Q囊） 6.4 6.2 6.2 6.3 0.1 過濾器系列沖洗量(kg) 54.8 109.4 108.2 90.8 31.2 最終池(kg) 378.0 439.5 413 410 31 最終濃度(g/L) 11.93 10.87 10.85 11.22 0.62 步驟產率(％) 91 100.4 97.1 96 5 疏水性相互作用層析
Phenyl Sepharose® HP層析用於減少可能存在於Q膜流出 物中之過程相關雜質及聚集抗體的量。在此精製步驟之 前，以2.2 Μ硫酸銨及40 mM磷酸鈉（pH 7.0)將Q膜流出物 稀釋至含有1 _〇 Μ硫酸銨及1 8 mM磷酸鈉之目標濃度，且隨 後在裝載於管柱上之前經由Sartopore® 2 10叶（0.45 159342.doc -23- 201221641 μιη+0.2 μπι)囊式過濾器過濾。
Phenyl Sepharose® HP疏水性相互作用樹脂（GE
Healthcare)及 Chromaflow® 丙烯酸層析管柱（g£ Healthcare) 用於此製程步驟。Phenyl管柱直徑為60 cm且目標高度為 15 士 1 cm(床體積42.4 L)。管柱之裝載限度為每公升phenyl Sepharose® HP樹脂40公克樣品。步驟在17±yc下且以75 公分/小時之流動速率進行。當需要時，在第一次循環起 始之前將裝載物質溫至17±2它。以水預洗滌管柱，且以 1.0 Μ硫酸銨及18 mM磷酸鈉（pH 7.0)平衡。繼平衡之後， 以稀釋Phenyl裝載物裝載管柱。在裝载之後’以M硫酸 銨及20 mM磷酸鈉（PH 7.0)繼之以ο.% ^^硫酸銨及17爪河磷 酸鈉（pH 7.0)分別將管柱洗滌至基線吸光度（A28q)。以〇55 Μ硫酸銨及1〇 mM磷酸鈉（pH 7〇)將產物以3人5公分/小時 之折合流動速率自管柱溶離至攜帶型貯槽中。在28〇 nmT 以1 cm路徑長度在峰前5 0D至峰尾丨〇D間收集溶離液。 對於各細胞培養物批次，將管柱再循環兩次以處理預期約 4700 g之蛋白質樣品。在各循環之間，以注射用水（wfi) 使管柱再生。在下將溶離液保持丨天。視情況’在進 行奈米過濾步驟之前，可將溶離液冷卻至且保持至多 10天。Pheny丨管柱操作與溶離層析概況一致。在圖7及圖8 中說明疊加圖。
Phenyl Sepharose® HP層析之操作資料及產率詳述於表* 中。平均管柱裝載$為每循環每公升樹脂約36呂蛋白質。 Phenyl Sepharose®步驟之平均產率為89%。 159342.doc -24· 201221641 表 4. Phenyl Sepharose® HP層析之概述 操作編號 1 2 3 平均值 標準差 裝載量(g) 4509.5 4777.4 4481.1 4589.3 163.5 管柱裝載量（公克樣品/公 升樹脂） 35 38 35 36 1 溶離液池(L) 396.7 363.3 332.9 364.3 31.9 溶離液池濃度(g/L) 11.12 11.45 10.52 11.03 0.47 步驟產率(％) 98 89 81 89 9 奈米過濾 奈米過滤用於移除可潛在存在於經Phenyl Sepharose® HP純化之物質中直徑do nm之外來病毒。奈米過濾過濾 器系列由兩個Pall 0.15 m2 0.1 μπι Fluorodyne® II PVDF囊 式過濾器（總計0.3 m2標稱過濾面積）組成，作為並聯的兩 個20吋Sartorius Virosart® CPV過濾器（總計2.8 m2標稱過 濾面積）或兩個20吋Pall DV20過濾器的保護過濾器。該步 驟在1 〇°C至14。(：下進行。為監測過濾，將壓力計安裝於預 遽器之上游及各奈米過濾器外殼之上游。在過濾期間，使 壓力保持在£32磅/平方吋。在已將所有Phenyl溶離液過濾 之後，以25 kg 15 mM組胺酸（pH 6.0)沖洗過濾器系列以回 收任何可能已保留在過濾器外殼中之蛋白質樣品。對於各 細胞培養物批次，進行一次奈米過濾。在進行調配步驟之 前’將濾液在S22°C下保持至多1天或冷卻至“它且保持至 多10天。 奈米過濾操作之平均產率為99%。Sartorius過濾器之平 159342.doc •25· 201221641 均過濾裝載量為每操作130 L/m2(相當於每操作1413 g/m ) ° DV20裝載量為每操作61 L/m2(相當於每操作693 g/m2)。基於濾液體積、濾液濃度及產率，過濾操作一 致。操作及產率詳述於表5中。 表5.奈米過濾操作之概述 操作編號 1 2 3 平均值 標準差 病毒過濾器標稱面積(m2) 2.8 6.0 2.8 不適用 不適用 病毒過濾器裝載量(公克樣品/ 平方公尺過濾面積） 1575 693 1251 1413a 230a 裝載體積(L) 1 396.7 363.3 332.9 364.3 31.9 病毒過濾器裝載量(公升樣品/ 平方公尺過濾面積） 142 61 119 130a 16a 沖洗量(kg) 25 25 25 25 0 濾液體積(L) 407.2 381.6 354.3 381.0 26.5 濾液濃度(g/L) 10.28 10.73 10.31 10.4 0.3 步驟產率(％) 95 98 104 「99 5 僅在操作1及操作3中使用與sartorius過濾器相關之資料所 計算的值。 調配（超濾及透濾） 藉由超濾及透濾來濃縮及調配各批病毒濾液。三個各具 有30 kD分子量截斷及2 5 m2表面積之MilHp〇re peiHc⑽⑧ 2 Biomax UF模組（總計7·5 m2標稱過濾面積）用於調配操作 的第一部分。步驟在…七至“它下進行。藉由超濾將病毒 濾液首次濃縮至70 g/L的目標。接著，以最少8倍體積之19 mM組胺酸（pH 5.6)進行連續透濾。在透濾之後，將藥物物 159342.doc -26· 201221641 質進一步濃縮至195 g/L的目標。隨後超濾系統排出產物， 且以約8 kg 19 mM組胺酸（pH 5.6)沖洗以回收滯留在系統 中之產物。將濃縮物與洗滌液組合以產生具有13〇 g/L至 150 g/L之目標濃度的經透濾之樣品。隨後使經調配之濃縮 物經由一個Sartopore® 2,800無菌囊式過濾器過濾至儲料 槽中。在進行最終裝瓶步驟之前，濾液在$22。(：下保持至 多7天。 調配操作之平均產率為99% »基於最終保留物體積、濃 度及產率，調配操作一致（參見表6)。 表6.調配操作之概述 操作編號 1 2 3 平均值 標準差 初始量(g) 4186 4095 3653 3978 285 保留物體積(L) 30.9 26.1 24.0 27.0 3.5 保留物濃度(g/L) 140.1 149.9 149.7 146.6 5.6 保留物量(g) 4326 3911 3587 3941 370 步驟產率(％) 103 96 • 98 99 4 過濾、裝瓶及冷凍 在2 C至8 C下在氣流清淨罩（flow hood)中進行裝瓶操 作。樣品經由Millipak® 200 0.22 μιη過濾器泵送至預滅菌 且無熱原質之聚對苯二甲酸乙二醇酯容器中。每2 L瓶中 填充約1.6 L。在裝瓶操作結束三個小時内，將經填充經標 記之瓶冷凍於-80°C下。 最終裝瓶操作之平均產率為99%。基於蛋白質濃度、蛋 白質之量及最終產率，裝瓶操作一致（參見表7)。 159342.doc -27· 201221641 表7.無菌過濾、裝瓶及冷凍操作之概述 操作編號 1 2 3 平均值 標準差 起始量(g) 4287 3932 3564 3928 362 散裝產物濃度(g/L) 138 150 148 145 6 散裝藥物量(g) 4234 3866 3517 3872 359 步驟產率(％) 99 98 99 99 1 產率概述 各製程步驟之產率在表8中給出。反應器最終量及裝瓶 散裝藥物物質之量用於計算總產率。平均所計算總產率為 60%。當校正製程中取樣時，平均所計算總產率為68%。 表8. MAb A純化產率之概述 步驟 1 2 3 平均值 標準差 初始收集(％) 91 89 92 91 2 ProSep® Ultra Plus捕捉(％) 91 91 89 90 1 病毒不活化/Pod/Q膜(％) 91 100 97 96 5 Phenyl Sepharose® HP層析(％) 98 89 81 89 9 病毒過渡(％) 95 98 104 99 5 UF/DF(°/〇) 103 96 98 99 4 裝瓶(％) 99 98 99 99 1 總製程產率(取樣校正)(％) 72 67 65 68 3 產物品質 測試最終散裝藥物物質之全部品質特性。總體而言，三 批最終藥物物質一致且在所有所測試之特性的規格内（參 見表9)。 159342.doc -28- 201221641 表9.最終藥物物質中MAb A之產物純度 檢定 操作1 操作2 操作3 單體％ 99 99 99 宿主細胞蛋白質(ng/mg) <0.21 <0.21 0.34 蛋白質A(ng/mg) 0.05 0.05 0.06 DNA(pg/mg) <1 <1 — <1 實例2 在此實例中’進行極類似於實例1中所描述之蛋白質純 化方法來純化MAb B。兩種方法之間的差異描述於本文 中。右方法之一態樣並未洋細描述’則其如實例1所述。 初始回收 離心及深度過濾充當初始回收步驟。離心方法與實例ι 所描述相同。隨後使經離心之收集物穿過由1〇個M ^ MUUpore® X0HC介質Pod單元組成的過遽器系歹,^。隨後樣 品經三個㈣的30时Sartop〇re⑧2 〇 45/〇 2㈣過滤器過 遽。樣品經過滤後，以2001^25祕丁士、1〇〇福氣化納 (P Η 7.2)沖洗繼之以吹入空翁以銘!^午丨力人，各 二轧以移除剩餘濾液。收集物之 離心及過濾係以單個單元择作报★ _ 平兀锯作形式進行。將濾液收集於 3000 L收集槽中，冷卻至4。「$彳 I王主12C，且保持至多5天。 蛋白質A捕捉層析 實例2之蛋白質A捕捉步驟實質上與實m中所描述類 似。管柱之«限度為每公升蛋自fA樹脂43公克腿 B。各批次均元成八至九個循 四 4步驟在％境溫度下進 行且使用_公分/小時至多3Q g/L及伽公分/小時至Μ 159342.doc •29· 201221641 g/L之2步驟線速度裝載量。〇·15 μ磷酸（pH 1.5)用於各個 循環之再生。每五個循環及在製程結束時使用6 Μ尿素清 潔。50 mM乙酸鈉（ΡΗ 5)、2%苄醇用於消毒及儲存。 病毒不活化、深度過濾及Q膜層析 方法中下一步驟為包括病毒不活化、深度過濾及層析之 組合步驟》在此步驟中，低pH值不活化以實例1中所闡述 之方式實現。繼不活化之後，樣品流經8 8 m2 XOHC Pod 繼之以兩個並聯設定之780 mL Mustang® Q膜吸附器。經 由Q膜吸附器之流動速率為1 〇 CV/min。在深度過濾之後及 此外在Q膜處理之後，樣品流經Sart〇p〇re® 2 30吋（0.45 μηι+0.2 μιη)囊式過濾器。 疏水性相互作用層析
Phenyl Sepharose® HP疏水性相互作用樹脂（GE Healthcare)及 Chromaflow® 丙烯酸層析管柱（GE Healthcare) 用於此製程步驟。Phenyl管柱直徑為80 cm且目標高度為 15±1 cm。在此精製步驟之前，以2.2 Μ硫酸銨及40 mM磷 酸納（pH 7.0)稀釋Q膜流出物，得到Μ μ硫酸銨及11 mM 礙酸鈉之目標濃度，且隨後在裝載於管柱上之前經由 Sartop〇re® 2(0.45 μηι+0·2 μιη)囊式過濾器過濾。以水預洗 務管柱’且以含1.1 Μ硫酸銨之20 mM磷酸鈉溶液（pH 7.0) 平衡。繼平衡之後，以稀Phenyl裝載物在75公分/小時流動 速率下裝載管柱。裝載之後，以1.4 Μ硫酸銨及25 mM磷酸 納（pH 7‘0)將管柱洗滌至基線吸光度（a28())。以〇 625 μ硫 酸敍及11 mM磷酸鈉（pH 7.0)將產物以37.5公分/小時之折 159342.doc •30· 201221641 合流動速率自管柱申溶離。在280 nm下以1 cm路徑長度在 峰前1 OD至峰尾1 〇D間收集溶離液。經由管柱以兩個循 環處理樣品。管柱之裝載限度為每公升pheny丨Sepharose® HP樹脂64公克樣品。 奈米過濾 奈米過遽過滤器系列由Sartorius 0.1 μηι Maxicap®過遽 器組成’作為並聯的兩個2〇时sart〇rius vjrosart⑧cpy過 遽器（總計2.8 m2標稱過濾面積）的預過濾器。在過濾期 間’使壓力保持在$34碑/平方叫·。 調配（超濾及透濾） 藉由超濾及透濾來濃縮及調配各批病毒濾液。具有3〇 kD分子量截斷（總膜面積為10 m2)之Millipore Pellicon® 2 Bmmax UF模組用於調配操作之第一部分。藉由超濾將病 毒濾液初始濃縮至50 g/L的目標。接著，以最少8倍體積之 23 mM組胺酸（pH 5.6)進行連續透濾。在透濾之後，將藥 物物質另外濃縮至180 g/L的目標。隨後超濾系統排出產 物，且以約6 kg至8 kg之15 mM組胺酸（ΡΗ 5.6)沖洗以回收 滯留在系統中之產物。將濃縮物與洗滌液組合以產生具有 120 g/L至160 g/L之目標濃度的經透濾之樣品。 如實例1中所闡述實現過濾、裝瓶及冷凍。 MAb B之純化產率及最終產物品質概述於表ι〇及表u 中。四個批次以69%之平均總純化產率成功地操作。所有 批人敢、冬政裝藥物物質中之雜質含量類似且滿足產物品質 規格。 159342.doc •31- 201221641 表10. MAb B純化產率之概述 操作編號 1 2 3 4 平均值 標準差 澄清(％) 96 91 89 95 93 3 Pro Sep® Ultra Plus 捕捉(％) 96 95 93 91 94 2 病毒不活化/P〇d/Q膜(°/〇) 90 87 91 92 90 2 Phenyl Sepharose® HP層析(°/〇) 89 93 95 90 92 3 病毒過渡(°/〇) 99 102 97 101 100 2 UF/DF(%) 103 92 98 95 97 5 裝瓶(％) 99 100 98 100 99 1 總製程產率(取樣校正)(％) 75 65 67 69 69 4 表11.最終藥物物質中MAb B之產物純度。 檢定 操作1 操作2 操作3 操作4 單體(％) 99.7 99.8 99.6 99.4 宿主細胞蛋白質(ng/mg) <0.14 <0.14 <0.14 0.14 蛋白質A(ng/mg) <0.29 <0.29 <0.29 <0.29 DNA(pg/mg) <1 <1 <1 <1 實例3 在此實例中，以實驗室規模進行另一蛋白質純化方法來 純化MAb A。藉由添加1 M Tris溶液（pH 9.5)將來自如實例 1中所述之第三批次操作的X0HC濾液調整至pH 8.1，且藉 由添加1 M NaCl將導電率調整至9 mS/cm。隨後約270 mL 經調整之遽液流經三個並聯的0.18 ml Aero disc® Mustang® Q膜吸附器裝置。藉由添加1 M NaCl將Q膜流通 池之導電率進一步調整至9 mS/cm，且隨後經0.22 μπι過 159342.doc -32- 201221641 濾。此經調節之池隨後以3分鐘滯留時間流動速率流經5 mL預填Capto®黏附管柱。Capto®黏附管柱之裝載量為221 mg/ml且在饋料裝載之後進行2〇 CV之平衡緩衝液洗滌。基 於產物裝載期間200 mAU至緩衝液洗滌期間200 mAU之 UV280讀數來收集產物池。實驗在室溫下進行。量測 Capto®黏附產物池之濃度及體積以計算步驟產率，且使用 内部ELISA檢定使用SEC及HCP及蛋白質a含量來分析池之 聚集體/單體。 實驗室規模Q膜流通顯示步驟產率為93%至97%，且 Capto®黏附管柱精製步驟得到89%之步驟產率。因此，關 於最終精製使用Capto®黏附之總製程產率與如實例1中所 示使用Phenyl Sepharose® HP之總製程產率類似。另外， 如表12中所示’在Capto®黏附純化之後產物池之品質亦滿 足產物規格β 表12.經由蛋白質Α捕捉繼之以POD過濾/q膜流通及Capt〇@ 黏附流通精製之MAb A純化效能。 檢定 Capto®黏附FTW池中之雜質含量 單體％ 99.8 — 宿主細胞蛋白質(ng/mg) 3.5 蛋白質A(ng/mg) 0.01 實例4 在此實例中’以實驗室規模進行類似於實例3中所描述 的蛋白質純化方法來純化MAb B。藉由添加1 μ Tris(pH 9.5)將來自如實例2中所述之第二批次操作之q膜流通池調 I59342.doc -33· 201221641 整至pH 8.1，且藉由添加1 M NaCl將導電率調整至6 mS/cm，隨後經由0.22 μιη膜過濾。此經調節之池隨後以3 分鐘滯留時間流動速率流經5 mL預填Capto®黏附管柱。 Capto®黏附管柱之裝載量為256 mg/ml，且在饋料裝載之 後進行20 CV之平衡緩衝液洗滌。基於產物裝載期間200 mAU至緩衝液洗滌期間200 mAU之UV280讀數來收集產物 池。實驗在室溫下進行。量測Capto®黏附產物池之濃度及 體積以計算步驟產率，且使用内部ELISA檢定使用SEC及 HCP及蛋白質A含量來分析池之聚集體/單體。
Capto®黏附管柱精製步驟獲得91.6%之步驟產率，與實 例2中顯示之Phenyl Sepharose® HP結合-溶離步驟類似。 另夕卜，如表13中所概述，繼Capto®黏附純化之後的產物池 之品質滿足產物規格。 表13.經由蛋白質A捕捉繼之以POD過濾/Q膜流通及Capto 黏附流通精製之MAb B純化效能。 檢定 Capto黏附FTW池中之雜質含量 單體％ 99.0 宿主細胞蛋白質(ng/mg) . 3.4 蛋白質A(ng/mg) 0.0 實例5 在此實例中，以實驗室規模進行類似於實例4中所描述 的蛋白質純化方法來純化MAb B。藉由添加1 M Tris(pH 9.5)將來自如實例2中所述之第二批次操作之X0HC濾液調 整至pH 6.5，且藉由添加1 M NaCl或以Milli-Q®水稀釋將 159342.doc •34- 201221641 導電率調整至6 mS/cm，隨後經由0.22 μιη膜過渡。此經調 節之池隨後以3分鐘滯留時間流動速率流經5 mL預填ρρΑ HyperCel™管柱。進行兩次操作。PPA HyperCel™管柱之 裝載量分別為104 mg/ml及235 mg/ml，且在各饋料裝載之 後進行20 CV之平衡缓衝液洗滌。基於產物裝載期間2〇〇 mAU至緩衝液洗滌期間200 mAU之UV280讀數來收集產物 池。實驗在室溫下進行。量測PPA HyperCel™產物池之濃 度及體積以計算步驟產率，且使用内部ELISA檢定使用 SEC及HCP及蛋白質A含量來分析池之聚集體/單體。 用於此實驗之饋料含有約98.1%單體（1.7%聚集體）、7 ng/mg HCP且外加 23.6 ng/mg蛋白質 A。PPA HyperCelTM樹 脂之效能概述於表14中。在較高裝載量（235 mg/ml)下產率 為92。/〇，與實例2中所顯示之Phenyl Sepharose® HP精製步 驟的產率相當。此外，在PPA HyperCel™純化之後的產物 池品質滿足產物規格。因為此操作之裝載物不經過Q膜， 所以預期若在X0HC過濾及PPA hypercel精製步驟之間使用 Q膜，則產物品質將得到進一步改善。 表14.經由蛋白質A捕捉繼之以POD過濾及PPA HyperceFM 流通精製之MAb B純化效能。 測試 PPA hypercel FTW池中之雜質含量 100 mg/ml裝載量 235 mg/ml裝載量 單體％ 99.2 99.0 佰主細胞蛋白質(ng/mg) 2.31 3.62 蛋白質A(ng/mg) 0.02 0.03 159342.doc •35· 201221641 實例6 在此實例中，以室驗室規模進行另一蛋白質純化方法來 純化厘八0 3。藉由添加1]\4 7'1^溶液（？^19.5)將如實例2中 所述之蛋白質A溶離液調整至pH 5，且藉由添加1 M NaCl 將導電率調整至8 mS/cm’接著進行0.22 μιη過渡。此經調 節之物質隨後以4分鐘滯留時間流動速率流經8 mL Poros XS®(Life Technologies)陽離子交換管柱。在裝載之前，以 0·1 M NaOH清潔管柱，以50 mM乙酸鈉、35 mM NaCl緩 衝液（pH 5)平衡。在以72 mg/ml MAb B裝載之後，以平衡 緩衝液洗滌管柱，且隨後以50 mM乙酸鈉、220 mM NaCl 緩衝液（pH 5)溶離。基於200 mAU至200 mAU之UV280讀 數來收集溶離液。實驗在室溫下進行。量測Poros XS®產 物池之濃度及體積以計算步驟產率，且使用内部ELISA檢 定使用SEC及HCP及蛋白質A含量來分析池之聚集體/單體 含量。 表15概述此精製步驟之純化效能。得到近乎100°/。之步 驟產率且所有雜質含量均在產物規格之内。因為此操作之 裝載物不經歷X0HC POD及Q膜精製步驟，所以預期當併 入此等步驟時，產物品質將得到進一步改善。 表15. MAb B蛋白質A溶離液之Poros XS陽離子交換管柱精 製效能。 單體(％) HCP(ng/mg) 蛋白質A(ng/mg) 饋料 95 514 8.6 溶離液 99.5 4 0.4 159342.doc •36- 201221641 實例7 在此實例中，以室驗室規模進行另一蛋白質純化方法來 純化MAb C。藉由添加2 Μ乙酸至溶液中將如實例1中所描 述之經低pH值病毒不活化且經Millipore POD深度過濾之 物質調整至pH 5，且藉由以水稀釋將導電率調整至5 mS/cm，接著進行0.22 μιη過滤。此經調節之物質外加有額 外量之蛋白質Α及宿主細胞蛋白質，以檢查此層析樹脂移 除此等過程雜質之能力。經摻料之物質以2.9分鐘滯留時 間流動速率裝載於 4.9 mL Poros XS®(Life Technologies)陽 離子交換管柱上。在裝載之前，以0.1 M NaOH清潔管柱， 以100 mM乙酸鈉緩衝液（pH 5)平衡。在以68 mg/ml MAb C 裝載之後，以平衡緩衝液洗滌管柱，且隨後以380 mM乙 酸鈉缓衝液（pH 5)溶離。基於200 mAU至400 mAU之 UV280讀數來收集溶離液。實驗在室溫下進行。量測Poros XS®產物池之濃度及體積以計算步驟產率，且使用内部 ELISA檢定使用SEC及HCP及蛋白質A含量來分析池之聚集 體/單體含量。 表16概述純化效能。得到93%之步驟產率且所有雜質含 量均在產物規格之内。 表16. MAb C蛋白質A溶離液之Poros XS陽離子交換管柱精 製效能。 聚集體(％) 單體(％) HCP(ng/mg) 蛋白質A(ng/mg) 饋料 1.1 98.9 62.3 38.7 溶離液 0.4 99.5 0.8 3.5 159342.doc -37- 201221641 本說明書中所引用之所有參考文獻，包括（但不限於）所 有論文、公開案、專利、專利中請案、報告'文本、報 導、手稿、小冊子、#籍、網際網路告示、雜諸文章及/ 或期刊，藉此均以全文引用的方式併入本說明書中。本文 中參考文獻之討論僅意欲概述由其作者所作出之聲明且並 不承 < 任何參考文獻構成先前技術。本申請者保留質疑所 引用參考文獻之準確性及相關性的權利。 本發明之此等及其他修改及變化可由一般技術者在不悖 離本發明之精神及範疇（其更特定言之闡述於隨附申請專 利範圍中）的情況下實踐。另外，應瞭解各種實施例之態 樣可完全或部分互換。此外，一般技術者應瞭解，上述描 it僅以貫例之方式進行，且並不意欲限制進一步描述於隨 附申請專利範圍中之本發明。因此，隨附申請專利範圍之 精神及範疇不應限於其中所含之形式的描述。 【圖式簡單說明】 圖1說明該方法之一實施例的示意圖。 圖2說明該方法之另一實施例的示意圖。 圖3說明該方法之另一實施例的示意圖。 圖4說明該方法之另一實施例的示意圖。 圖5說明在280 nm下之ProSep® Ultra Plus蛋白質A捕捉 層析溶離概況。 圖6說明在302 nm下之ProSep® Ultra Plus蛋白質A捕捉 層析溶離概況。 圖7說明在280 nm下之Phenyl Sepharose® HP層析概況。 圖8說明在302 nm下之Phenyl Sepharose® HP層析概況。 159342.doc -38 -
Claims (1)
- 201221641 七、申請專利範圍： 1. 一種純化蛋白質之方法，其包含： a.提供含有該蛋白質的樣品； . b’經由捕捉層析樹脂處理該樣品以提供包含該蛋白質 的第一溶離液； c. 使及第-洛離液中之病毒不活化以提供包含該蛋白 質的不活化溶離液； d. 紅由至少一個深度過濾器處理該不活化溶離液以提 供包含該蛋白質的經過據溶離液；及 e•經由至少—個離子交換膜處理該㉟過遽溶離液以提 供包含該蛋白質的第二溶離液。 2. 如明求項1之方法，其中該深度過濾步驟及該離子交換 膜步驟係以過濾器系列提供。 3. 如明求項1之方法，其中該捕捉層析樹脂係選自由親和 f树知離子父換樹脂、混合模式樹脂及疏水性相互作 用樹脂組成之群。 4·如叫求項1之方法，其中該捕捉層析樹脂係選自由蛋白 • 質A樹脂、蛋白質G樹脂、蛋白質α/G樹脂及蛋白質l樹 脂組成之群。 5·如睛求項1之方法，其中該蛋白質係選自由蛋白質片 段 '抗體、單株抗體、免疫球蛋白及融合蛋白組成之 群。 6.如响求項1之方法，其中該樣品為細胞培養物。 7·如明求項1之方法，其中該樣品在經由該捕捉層析樹脂 159342.doc 201221641 處理之前經澄清。 8. 如請求項7之方法，其中該樣品係藉由選自由離心、微 慮、超攄、深度過遽、無菌過滤及用清潔劑處理組成之 群的澄清方法進行澄清。 9. 如請求項1之方法，其中該病毒不活化包含選自由以 酸、清潔劑、化學物、核酸交聯劑、紫外線、γ輻射及 加熱進行處理組成之群的方法^ 10. 如請求項9之方法，其中病毒不活化包含將該第一溶離 液之PH值降低至約3至約4之ρΗ值。 11 ·如請求項1〇之方法，其中在病毒不活化期間將該第〆溶 離液培育約3〇分鐘至約9〇分鐘。 1 2·如明求項】之方法，其中在深度過濾步驟之前將該不活 化溶離液調整至pH值為5至10。 13. 如請求項1之方法，其中該深度過濾步驟包含經由至少 一個深度過濾器進行過濾。 兩個串聯或並聯配置的深度過濾器 15 ·如μ求項1之方法，其中該深度過 菌過遽步驟。無菌過濾步驟。 19·如請求項1之方法 14. 如凊求項丨之方法，其中該深度過濾步驟包含經由至少 進行過遽。 其中該深度過濾步驟之後為囊式無 ’其中該離子交換膜包含(^膜。 ，其中s亥Q膜步驟以流通模式進行。 ，其中該離子交換膜步驟之後為囊 個深 其中該不活化溶離液係經由 159342.doc 201221641 20. 21. 22. 23. 24. 度過遽器處理且該經過遽溶離液係經 換膜處理。 的6亥 如請求項1之方法，其十該第二溶 層析步驟。 冑步進仃其 2求項2G之方法，其Μ其他層析步驟係選自由疏水 =互作用層析、混合模式層析及陽離子交換層析組成 離子交 他 如請求項1之方法， 過遽步驟。 如請求項1之方法 及透遽步驟。 其中該第二溶離液進-步進行奈米 該第二溶離液進一步進行超濾 一種純化蛋白質之方法，其包含： a. k供含有該蛋白質的樣品； b. 將該樣品澄清以提供經澄清之樣品； 〇·故由捕捉層析樹脂處理該經澄清之樣品以提供包含 該蛋白質的第一溶離液； d·使該第-溶離液中之病毒不活化以提供包含該蛋白 質的不活化溶離液； e•經由至少一個深度過濾器處理該不活化溶離液以提 供包含該蛋白質的經過濾溶離液； f .經由至少一個離子交換膜處理該經過濾溶離液以提 供包含該蛋白質的第二溶離液； g.經由其他層析樹脂處理該第二溶離液以提供包含該 蛋白質的第三溶離液； 159342.doc 201221641 h·使該第三溶離液進行太 $订'丁、未過濾以提供包含該蛋白質 的經奈米過濾之溶離液；及 使該經奈米過濾之溶離液進行超濾及透渡。 月求項24之方法’其中該其他層析樹脂包含混合模式 層析樹脂。 26.如請求項25之方法，盆φ兮结 ^ ’ 中3玄第二溶離液經由該其他混合 模式層析樹脂進行之處理包含 ^ 3 或多種選自由以下組成 之群的層析技術：陰離子$拖、 ^ =啡丁 乂換、陽離子交換、疏水性相 互作用 '親水性相互作用、左决a 卞用虱鍵結、π-π鍵結及金屬親和 性。 27. 如凊求項26之方法，其中該第二溶離液經由該其他混合 模式層析樹脂進行之處理包含陰離子交換與疏水性相互 作用層析機制之組合。 28. 如請求項26之方法，其中該混合模式層析管柱可以流通 或結合-溶離模式操作。 29. 如請求項24之方法，其中該其他層析樹脂包含陽離子交 換樹脂。 30. 如請求項29之方法，其中該第二溶離液經由該其他混合 模式層析樹脂進行之處理包含一或多種選自由以下組成 之群的層析技術：陰離子交換、陽離子交換、疏水性冲目 互作用、親水性相互作用、氫鍵結、π-π鍵結及金屬親和 性。 3 1 ·如請求項30之方法，其中該第二溶離液經由該其他混合 模式層析樹脂進行之處理包含陰離子交換與疏水性相互 159342.doc 201221641 作用層析機制之組合。 32.如請求項29之方法，其中該陽離子交換層析管柱係以結 合-溶離模式操作。 159342.doc
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