MX2013004091A - Proceso para purificacion de proteinas. - Google Patents

Proceso para purificacion de proteinas.

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Abstract

La invención se dirige a un método para purificar una proteína. El método involucra proporcionar una muestra conteniendo la proteína, procesar la muestra a través de una resma de cromatografía de captura, inactivar virus en la muestra y procesar a través de al menos un filtro de profundidad y membrana de intercambio iónico.

Description

PROCESOS PARA PURIFICACION DE PROTEINAS Solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de la solicitud estadounidense provisional ser. No. 61 /391 ,762, presentada el 1 1 de octubre de 201 0, la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.
Antecedentes de la invención La presente invención se refiere de manera general a métodos para purificar proteínas.
La econom ía de purificación de proteína a gran escala es importante, en particular para anticuerpos terapéuticos, ya que los anticuerpos forman un gran porcentaje de los biológicos terapéuticos en el mercado. Además de su valor terapéutico, los anticuerpos monoclonales, por ejemplo, también son herramientas importantes en el campo diagnóstico. Se han desarrollado y usado numerosos anticuerpos monoclonales en el diagnóstico de muchas enfermedades, para diagnosticar embarazo y en pruebas de medicamentos.
Los procesos de purificación típicos involucran múltiples pasos de cromatografía con el fin de cumplir los requerimientos de pureza, rendimiento y producción. Los pasos normalmente involucran captura, purificación intermedia o pulido, y pulido final. La cromatografía por afinidad (Proteína A o G) o cromatografía de intercambio iónico se usa con frecuencia como un paso de captura . Tradicionalmente, el paso de captura es seguido entonces por al menos otros dos pasos de cromatografía de purificación intermedia o pulido para asegurar la pureza y eliminación viral adecuadas. El paso de purificación intermedia o pulido es logrado normalmente vía cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio iónico, o interacción hidrofóbica, entre otros métodos. En un proceso tradicional, el peso de pulido final puede ser logrado vía cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía de filtración en gel. Estos pasos remueven impurezas relacionadas con proceso y producto, incluyendo proteínas de células huéspedes (HCP), DNA, proteína A lixiviada, agregados, fragmentos, virus y otras impurezas de molécula pequeña desde la corriente de producto y cultivo celular.
Breve descripción de la invención Brevemente, la presente invención se dirige , en una modalidad, a un método para purificar una proteína comprendiendo proporcionar una muestra conteniendo la proteína, procesar la muestra a través de una resina de cromatografía de captura para proporicnar un primer eluato comprendiendo la proteína, inactivar virus en el primer eluato para proporcionar un eluato inactivado comprendiendo la proteína, procesar el eluato inactivado a través de al menos un filtro de profundidad para proporcionar un eluato filtrado comprendiendo la proteína, y procesar el eluato filtrado a través de al menos una membrana de intercambio iónico para proporcionar un segundo eluato comprendiendo la proteína.
Además, la invención es dirigid, en una modalidad, a un método para purificar una proteína comprendiendo proporcionar una muestra conteniendo la proteína, clarificar la muestra para proporcionar una muestra clarificada, procesar la muestra clarificada a través de una resina de cromatografía de captura para proporcionar un primer eluato comprendiendo la proteína, inactivar virus en el primer eluato para proporcionar un eluato inactivado comprendiendo la proteína, procesar el eluato inactivado a través de al menos un filtro de profundidad para proporcionar un eluato filtrado comprendiendo la proteína, procesar el eluato filtrado a través de al menos una membrana de intercambio iónico, la cual es ya sea ensamblada en serie con el filtro de profundidad o usada en un paso separado, para proporcionar un segundo eluato comprendiendo la proteína, procesar el seg undo eluato a través de una resina de cromatografía adicional para proporcionar un tercer eluato comprendiendo la proteína, someter el tercer eluato a nanofiltración para proporcionar un eluato nanofiltrado com prendiendo la proteína, y someter el eluato nanofiltrado a ultrafiltración y nanofiltración o diafiltración.
Breve descripción de los dibujos La Figura 1 ilustra un esquema de una modalidad del proceso.
La Figura 2 ¡lustra un esquema de otra modalidad del proceso. La Figura 3 ilustra un esquema de todavía otra modalidad del proceso.
La Figura 4 ilustra un esquema de todavía otra modalidad del proceso.
La Figura 5 ilustra perfiles de elución de cromatografía de captura de proteína A ProSep® Ultra Plus a 280 nm .
La Figura 6 ilustra perfiles de elución de cromatografía de captura de proteína A ProSep® Ultra Plus a 302 nm.
La Figura 7 ilustra perfiles de cromatografía de Phenyl Sepharose® HP a 280 nm.
La Figura 8 ilustra perfiles de cromatografía de Phenyl Sepharose® HP a 302 nm.
Descripción detallada de las modalidades Se hacer referencia ahora en detalle a las modalidades de la invención, uno o más ejemplos de las cuales se exponen más adelante. Cada ejemplo es provisto a manera de explicación de la invención, no una limitación de la invención. De hecho, será evidente para aquéllos expertos en la técnica que varias modificaciones y variaciones pueden hacerse en la presente invención sin apartarse del alcance o espíritu de la invención. Por ejemplo, características ilustradas o descritas como parte de una modalidad, pueden ser usadas en otra modalidad para producir todavía una modalidad adicional .
De esta manera, se pretende que la presente invención cubra tales modificaciones y variaciones como que entran dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y sus equivalentes. Otros objetivos, características y aspectos de la presente invención son descritos en o son obvios de la siguiente descripción detallada. Se entenderá por alguien de habilidad en la técnica, que la presente discusión es una descripción de modalidades ejemplares solamente , y no pretende ser limitante de aspectos más amplios de la presente invención.
En una modalidad , la presente invención comprende un sistema y método de purificación de proteína. Diagramas esquemáticos para modalidades del presente sistema de purificación son provistos en las Figuras 1 -4.
En una modalidad de la invención, se proporciona una muestra que contiene una proteína. Cualquier muestra conteniendo una proteína puede ser utilizada en la invención . La muestra, la cual contiene una proteína, puede comprender, por ejemplo, cultivo celular o fluido ascítico de murino. Como un ejemplo, la proteína puede ser expresada en células de ovario de hámster chino (CHO) en bio-reactores de tanque agitado. La proteína puede ser cualquier proteína, o fragmento de la misma, conocido en la técnica. En varias modalidades, la proteína es una proteína de fusión, tal como una proteína de fusión Fe.
En algunas modalidades, la proteína es un anticuerpo. En una modalidad particular, la proteína es un anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo. En algunos casos, la proteína puede ser un anticuerpo monoclonal humano. En otras modalidades, la proteína es un anticuerpo de inmunoglobulina G. En una modalidad, la proteína puede ser anticuerpo de inmunoglobulina G chapada, un a nticuerpo de inmunoglobulina G humanizada, o un anticuerpo de inmunoglobulina G recombinante. En una modalidad particular, la proteína puede ser una inmunoglobulina lgG 1 . La proteína puede ser específica , en ciertas modalidades, para un epitope de receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) humano. La proteína puede ser, en otra modalidad, un anticuerpo monoclonal neutralizante humanizado, recombinante, contra un epitope único en I L-1 3.
En una modalidad de la invención, la muestra conteniendo la proteína puede ser clarificada primero usando cualquier método conocido en la técnica (ver las Figs. 1 -4, paso 1 ). El paso de clarificación busca remover las células, desechos e células, y algunas impurezas de células huésped de la muestra. En una modalidad, la muestra puede ser clarificada vía uno o más pasos de centrifugación. La centrifugación de la muestra puede ser realizada como es sabido en la técnica. Por ejemplo, la centrifugación de la muestra puede ser realizada usando una carga normalizada de aproximadamente 1 x10'8 m/s y una fuerza gravitacional de aproximadamente 5,000xg hasta aproximadamente 1 5, 000xg.
En otra modalidad, la muestra puede ser clarificada vía uno o más pasos de filtración de profundidad. La filtración de profundidad se refiere a un método para remover partículas de la solución usando una serie de filtros, arreglados en secuencia, los cuales tienen tamaño de poro decreciente. Una matriz tridimensional de filtro de profundidad crea una trayectoria como laberinto a través de la cual pasa la muestra. Los mecanismos de retención principales de filtros de profundidad se basan en la adsorción aleatoria y atrapado mecánico a través de la profundidad de la matriz. En varias modalidades, las membranas o láminas de filtro pueden ser de algodón enrollado, polipropileno, rayón celulosa, fibra de vidrio, metal sinterizado, porcelana , tierra de diatomeas, u otros componentes conocidos. En ciertas modalidades, las composiciones que comprenden las membranas de filtro de profundidad pueden ser tratadas químicamente para conferir una carga electropositiva, es decir, una carga catiónica, para permitir que el filtro capture partículas con carga negativa, tales como DNA, proteínas de células huésped o agregados.
Cualquier sistema de filtración de profundidad disponible para alguien de habilidad en la técnica puede ser usado en esta modalidad. En una modalidad particular, el paso de filtración de profundidad puede lograrse con un sistema de filtro de profundidad Millistak+® Pod, medios XOHC, disponible de Millipore Corporation. En otra modalidad, el paso de filtración de profundidad puede lograrse con un Filtro de profundidad Zeta PlusMR, disponible de 3M Purificaron I nc.
En algunas modalidades, los medios de filtro de profundidad tiene un tamaño de poro nominal desde aproximadamente 0. 1 pm hasta aproximadamente 8 pm . En otras modalidades, los medios de filtro de profundidad pueden tener tamaños de poro desde aproximadamente 2 pm hasta aproximadamente 5 pm. En una modalidad particular, los medios de filtro de profundidad pueden tener tamaños de poro desde aproximadamente 0.01 pm hasta aproximadamente 1 pm . Todavía en otras modalidades, los medios de filtro de profundidad pueden tener tamaños de poro que son mayores que aproximadamente 1 pm . En modalidades adicionales, los medios de filtro de profundidad pueden tener tamaños de poro que son menores que aproximadamente 1 pm .
En algunas modalidades, el paso de clarificación puede involucrar el uso de dos o más filtros de profundidad arreglados en serie. Los filtros de profundidad pueden ser iguales o diferentes unos de otros. En esta modalidad, por ejemplo, filtros Millistak+® mini DOHC y XOCH podrían conectarse en serie y usarse en el paso de clarificación de la invención.
En otra modalidad, el paso de clarificación puede involucrar el uso de tres o más filtros de profundidad. En una modalidad, el paso de clarificación puede involucrar el uso de múltiples unidades (por ejemplo, diez) de filtros de profundidad arreglados en paralelo. En esta modalidad, las unidades múltiples de filtros de profundidad pueden ser filtros Millipore® XOHC.
En una modalidad particular, el paso de clarificación puede ser logrado a través del uso de centrifugación seguido por filtración de profundidad XOHC, realizado en serie (Figs. 2-4, paso 1 ).
En otra modalidad, la muestra puede ser clarificada vía una membrana de microfiltración o ultrafiltración en modo de filtración de flujo tangencial (TFF). Cualquier proceso de clarificación de TFF conocido en la técnica puede ser utilizado en esta modalidad. La TFF designa un proceso de separación de membrana en configuración de flujo cruzado, impulsado por un gradiente de presión, en la cual la membrana fracciona componentes de una mezcla líquida como una función de partícula y/o tamaño de soluto y estructura. En la clarificación, el tamaño de poro de membrana seleccionado permite a algunos componentes pasar a través de los poros con el agua mientras que retiene las células y desechos de células por arriba de la superficie de membrana. En una modalidad, la clarificación de TFF puede ser conducida usando, por ejemplo, a 0.1 µ?? o 758 kD de corte de peso molecular, 5-40 psig (0.351 5-2.812 kg/cm2 manométricos), y temperaturas desde aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 60°C con membranas de polisulfona.
En una modalidad de la invención, el paso de clarificación puede involucrar el tratamiento de la muestra con un detergente. El detergente utilizado puede ser cualquier detergente conocido por ser útil en procesos de purificación de proteína. En una modalidad, el detergente puede ser aplicado a la muestra a un bajo nivel y la muestra entonces incubarse durante un periodo suficiente para inactivar virus de mamífero envueltos. El nivel de detergente a ser aplicado, en una modalidad, puede ser desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 1 % (p/p). En otra modalidad, el nivel de detergente a ser aplicado puede ser desde aproximadamente 0.05% hasta aproximadamente 0.7% (v/v). Todavía en otra modalidad, el nivel de detergente a ser aplicado puede ser aproximadamente 0.5% (v/v). En una modalidad particular, el detergente puede ser polisorbato 80 (Tween® 80), disponible de Sigma-Aldrich, Inc. , o Tritón® X-100, disponible de Roche Diagnostics GmbH.
Cualquier combinación de estos u otros procesos de clarificación, los cuales son conocidos en la técnica pueden ser utilizados como el paso de clarificación de la invención .
En una modalidad, después del paso de clarificación de la invención, la muestra puede ser sometida a un paso de captura por cromatografía (ver Figs. 1 -4, paso 2). El paso de captura es diseñado para separar la proteína objetivo de otras impurezas presentes en la muestra clarificada. Con frecuencia, el paso de captura reduce proteína de célula huésped (HCP), DNA de célula huésped y virus endógeno o partículas similares a virus en la muestra. La técnica de cromatografía utilizada en esta modalidad puede ser cualquier técnica conocida en la técnica a ser usada como un paso de captura. En una modalidad, la muestra puede ser sometida a cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de modo mixto, o cromatografía de interacción hidrofóbica como un paso de captura.
En una modalidad particular de la invención , la cromatografía por afinidad puede ser utilizada como el paso de captura. La cromatografía por afinidad hace uso de interacciones de unión específica entre moléculas. Un ligando particular es químicamente inmovilizado o "acoplado" a un soporte sólido. Cuando la muestra es pasada sobre la resina, la proteína en la muestra, la cual tiene una afinidad de unión específica al ligando, se vuelve ligada. Después de que otros componentes de muestra son lavados, la proteína ligada es entonces extraída del ligando inmovilizado y eluida, resultando en su purificación de la muestra original.
En esta modalidad de la invención, el paso de captura de cromatografía por afinidad puede comprender interacciones entre un antígeno y un anticuerpo, una enzima y un substrato, o un receptor y un ligando. En una modalidad particular de la invención, el paso de captura de cromatografía por afinidad pueden comprender cromatografía de proteína A, cromatografía de proteína G, cromatografía de proteína A/G o cromatografía de proteína L.
En una cierta modalidad, la cromatografía por afinidad de proteína A puede ser utilizada en el paso de captura de la invención (ver Figs. 2-4, paso 2). La cromatografía por afinidad de proteína A involucra el uso de proteína A, una proteína bacteriana que demuestra unión específica a la porción de unión no de antígeno de muchas clases de inmunoglobulinas. La resina de proteína A utilizada puede ser cualquier resina de proteína A. En una modalidad, la resina de proteína A puede ser seleccionada de la familia de resinas MabSelectMR, disponible de GE Healthcare Life Sciences. En otra modalidad, la resina de proteína A puede ser una resina ProSep® Ultra Plus, disponible de illipore Corporation. Cualquier columna disponible en la técnica puede ser utilizada en este paso. En una modalidad particular, la columna puede ser una columna empacada con resina abSelect R, disponible de GE Healthcare Life Sciences, o una columna (por ejemplo, columna Quickscale) empacada con resina ProSep® Ultra Plus, disponible de Millipore Corporation .
Si se utiliza una afinidad de proteina A como el paso de cromatografía, la columna puede tener un diámetro interno de aproximadamente 35 cm con una longitud de columna de 20 cm . En otras modalidades, la longitud de columna puede ser desde aproximadamente 5 cm hasta aproximadamente 35 cm . Todavía en otra modalidad, la longitud de columna puede ser desde aproximadamente 1 0 cm hasta aproximadamente 20 cm. Todavía en otra modalidad, la longitud de columna puede ser 5 cm o mayor. En una modalidad, el diámetro interno de la columna puede ser desde aproximadamente 0.5 cm hasta aproximadamente 1 00 o 200 cm . En otra modalidad, el diámetro interno de la columna puede ser desde aproximadamente 10 cm hasta aproximadamente 50 cm . Todavía en otra modalidad, el diámetro interno de la columna puede ser 1 5 cm o mayor.
Los métodos específicos usados para el paso de captura de cromatografía, incluyendo el flujo de la muestra a través de la columna, lavado y elución, dependen de la columna específica y resina usada y son provistas normalmente por los fabricantes o son conocidas en la técnica. Como se usa en la presente, el término "procesado" puede describir el proceso de fluir o pasar una muestra a través de una columna de cromatografía, resina, membrana, filtro u otro mecanismo, y deberá incluir un flujo continuo a través de cada mecanismo así como un flujo que es pausado o parado entre cada mecanismo.
Siguiendo el paso de captura de cromatografía, el eluato puede ser sometido a un paso de procesamiento de combinación. Este paso de combinación puede comprender, en una modalidad, inactivación viral seguido por procesamiento a través de uno más filtros de profundidad y membranas de intercambio iónico (ver Figs. 1 -4, paso 3). En una modalidad, la filtración de profundidad y membrana de intercambio iónico pueden ser diseñadas como un tren de filtración, en serie.
En una modalidad, el paso de inactivación viral puede comprender inactivación viral de bajo pH. En un aspecto, el uso de un amortiguador de glicina de alta concentración a bajo pH para elución puede ser empleado, sin ajuste de pH adicional, en un depósito de eluato final en el rango enfocado para inactivación viral de bajo pH. De manera alternativa, pueden usarse amortiguadores de acetato o citrato para elución y el depósito de eluato puede ser titulado entonces al rango de pH apropiado para inactivación viral de bajo pH . En una modalidad, el pH es desde aproximadamente 2.5 hasta aproximadamente 4. En una modalidad adicional, el pH es desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 4.
En una modalidad, una vez que el pH del depósito de eluato es bajado, el depósito es incubado durante un lapso desde aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 90 minutos. En una modalidad particular, el paso de inactivación viral de bajo pH puede lograrse vía titulación con ácido fosfórico 0.5 M para obtener un pH de aproximadamente 3.5 y la muestra puede ser incubada entonces durante un periodo entre aproximadamente 60 minutos y 90 minutos.
Después del paso de inactivación viral de bajo pH, el depósito de eluato inactivado puede ser neutralizado a un pH mayor. En una modalidad, el pH mayor, neutralizado, puede ser un pH de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10. En otra modalidad, el pH mayor, neutralizado, puede ser un pH desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10. Todavía en otra modalidad, el pH mayor, neutralizado, puede ser un pH desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 1 0. Todavía en otra modalidad, el pH mayor, neutralizado, puede ser un pH desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8. Todavía en otra modalidad, el pH mayor, neutralizado, puede ser un pH de aproximadamente 8.0.
En una modalidad, la neutralización de pH puede ser lograda usando 3.0 M trolamina u otro amortiguador conocido en la técnica. La conductividad del depósito de eluato inactivado puede ser ajustado entonces con agua purificada o deionizada. En una modalidad, la conductividad del depósito de eluato inactivado puede ser ajustada desde aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 50 mS/cm. En otra modalidad, la conductividad del depósito de eluato inactivado puede ser ajustada desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 mS/cm . En una modalidad particular, la conductividad del depósito de eluato inactivado puede ser ajustada desde aproximadamente 5.0 mS/cm.
En modalidades alternativas, el aspecto de inactivación viral del paso de procesamiento de combinación puede ser realizado usando otros métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el paso de inactivación viral puede comprender, en varias modalidades, el tratamiento con ácido, detergente, solvente, qu ímicos, agentes reticuladores de ácido nucleico, luz ultravioleta, radiación gamma, calor o cualquier otro proceso conocido en la técnica como útil para este propósito.
Siguiendo la inactivación viral y neutralización , el depósito de eluato inactivado puede ser procesado a través de uno o más filtros de profundidad, como se describe completamente antes, y una o más membranas de intercambio iónico, membranas hidrofóbicas, o membranas de modo mixto, provistas como un tren de filtración o en serie.
El aspecto de filtración de profundidad del paso de combinación puede comprender uno o más tipos de filtros de profundidad. En una modalidad, el aspecto de filtración de profundidad del paso de combinación puede comprender más de una unidad de filtros de profundidad. Estos filtros de profundidad pueden ser, en una modalidad, filtros Millipore® XOHC. Un experto en la técnica reconocerá que la selección del tipo y número de filtros usados dependerá del volumen de la muestra siendo procesada.
El aspecto de intercambio iónico del paso de combinación puede ser cualquier proceso de intercambio iónico conocido en la técnica. En una modalidad, este paso comprende una cápsula de cromatografía de membrana. En una modalidad, puede utilizarse el adsorbedor de membrana Chromasorb R.
En una modalidad, el aspecto de cromatografía del paso comprende una cápsula de cromatografía de membrana Q. En una modalidad, la cápsula de cromatografía de membrana Q puede comprender cápsula de cromatografía de membrana Mustang® Q (disponible de Pall Corporation) o Sartobind® Q (disponible de Sartorius Stedim Biotech GmbH). En una modalidad, la cápsula de cromatografía de membrana Q es operada en modo de flujo a través.
Cada uno de los pasos de filtro de profundidad y membrana de intercambio iónico puede ser, en una modalidad, seguido por un paso de filtración de cápsula. Por ejemplo, el paso de filtración de cápsula puede comprender un filtro de cápsula Sartopore® 2, disponible de Sartorius stedim Biotech GmbH.
Siguiendo el paso de procesamiento de combinación, la muestra puede ser sometida a un paso de pulido intermedio/final (Figs. 1 -4, paso 4). Este paso puede comprender, en una modalidad , un paso de cromatografía adicional, cualquier forma de cromatografía conocida en la técnica puede ser aceptable. Por ejemplo, en una modalidad, el paso de pulido intermedio/final puede comprender un paso de cromatografía de modo mixto (también conocido como multimodal) (Fig. 3, paso 4). El paso de cromatografía de modo mixto utilizado en esta invención puede utilizar cualquier proceso de cromatografía de modo mixto conocido en la técnica. La cromatografía de modo mixto involucra el uso de soportes cromatográficos de fase sólida en formato de resina, monolito, o membrana que emplean múltiples mecanismos qu ímicos para adsorber proteínas u otros solutos. Ejemplos útiles en la invención incluyen, pero no están limitados a, soportes cromatográficos que explotan combinaciones de dos o más de los siguientes mecanismos: intercambio aniónico, intercambio catiónico, interacción hidrofóbica, interacción hidrof ílica, interacción tiofílica, unión de hidrógeno, unión pi-pi y afinidad de metal. En modalidades particulares, el proceso de cromatografía de modo mixto combina: ( 1 ) tecnolog ías de interacción hidrofóbica e intercambio aniónico; (2) tecnolog ías de interacción hidrofóbica e intercambio catiónico; y/o (3) tecnologías de interacción hidrofóbica y electrostática.
En una modalidad, el paso de cromatografía de modo mixto puede lograrse al usar una columna y resina, tal como columna y resina Capto® adhere, disponible de GE Healthcare Life Sciences. La columna Capt® adhere es un medio multimodal para purificación intermedia y pulido de anticuerpos monoclonales después de la captura. En una modalidad, el paso de cromatografía de modo mixto puede ser conducido en modo de flujo a través. En otras modalidades, el paso de cromatografía de modo mixto puede ser conducido en modo de ligar-eluir.
En otras modalidades, el paso de cromatografía de modo mixto puede ser logrado al usar uno o más de los siguientes sistemas: Capto® MMC (disponible de GE Healthcare Life Sciences), HEA HyperCelMR (disponible de Pall Corporation) , PPA HyperCelMR (disponible de Pall Corporation), MBI HyperCel R (disponible de Pall Corporation), MEP HyperCel R (disponible de Pall Corporation), Blue Trisacryl M (disponible de Pall Corporation), fluoroapatita cerámica CFTMR (disponible de Bio-Rad Laboreatories, Nc), hidroxiapatita cerámica CHT R (disponible de Bio-Rad Laboratories, I Nc ), y/o ABx (disponible de J.T. Baker). Los métodos específicos usados para el paso de cromatografía de modo mixto pueden depender de la columna específica y resina utilizada, y son suministrados normalmente por el fabricante o son conocidos en la técnica.
En otra modalidad, el paso de pulido intermedio/final puede comprender una cromatografía de intercambio catiónico (Fig. 4, paso 4). El paso de cromatografía de intercam bio catiónico utilizado en esta invención puede usar cualquier proceso de cromatografía de intercambio catiónico conocido en la técnica. En una modalidad, el paso de cromatografía de intercambio catiónico puede ser logrado al usar una columna empacada con resina Poros XS (Life Technologies). En una modalidad particular, el paso de cromatografía de intercambio catiónico puede ser operado en modo de ligar-eluir.
Cada columna utilizada en el proceso puede ser suficientemente grande para proporcionar capacidad de producción máxima y econom ía de escala. Por ejemplo, en ciertas modalidades, cada columna puede definir un volumen interior desde aproximadamente 1 I hasta aproximadamente 1 500 I, desde aproximadamente 1 I hasta aproximadamente 1 000 I , desde aproximadamente 1 I hasta aproximadamente 500 I, o desde aproximadamente 1 I hasta aproximadamente 250 I. En algunas modalidades , la columna de modo mixto o intercambio catiónico pueden tener un diámetro interno de aproximadamente 1 cm y una longitud de columna de aproximadamente 7 cm. En otras modalidades, el diámetro interno de la columna de intercambio catiónico o modo mixto puede ser desde aproximadamente 0.1 cm hasta aproximadamente 100 cm , desde 0.1 hasta 50 cm, desde 0.1 cm hasta aproximadamente 1 0 cm , desde aproximadamente 0.5 cm hasta aproximadamente 5 cm , desde aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 1 .5 cm, o puede ser aproximadamente 1 cm . En una modalidad, la longitud de columna de la columna de modo mixto o intercambio catiónico puede ser desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 cm, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 cm, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10 cm , o puede ser aproximadamente 7 cm.
En algunas modalidades, los sistemas inventivos son capaces de manejar concentraciones de alto título, por ejemplo, concentraciones de aproximadamente 5 g/l, aproximadamente 6 g/l, aproximadamente 7 g/l, aproximadamente 8 g/l, aproximadamente 9 g/l, aproximadamente 10 g/l, aproximadamente 1 2.5 g/l, aproximadamente 15 g/l, aproximadamente 20 g/l, aproximadamente 25 g/l, concentraciones desde aproximadamente 1 g/l hasta aproximadamente 5 g/l, concentraciones desde aproximadamente 5 g/l hasta aproximadamente 1 0 g/l, concentraciones desde aproximadamente 5 g/l hasta aproximadamente 12.5 g/l, concentraciones desde aproximadamente 5 g/l hasta aproximadamente 15 tg/l, concentraciones desde aproximadamente 5 g/l hasta aproximadamente 20 g/l, concentraciones desde aproximadamente 5 g/l hasta aproximadamente 55 g/l, o concentraciones desde aproximadamente 5 g/l hasta aproximadamente 1 00 g/l. Por ejemplo, algunos de los sistemas son capaces de manejar altas concentraciones de anticuerpo y, al mismo tiempo, procesar desde aproximadamente 200 I hasta aproximadamente 2000 I de cultivo por hora, desde aproximadamente 400 I de cultivo hasta aproximadamente 2000 I por hora, desde aproximadamente 600 I hasta aproximadamente 1 500 I de cultivo por hora, desde aproximadamente 800 I hasta aproximadamente 1200 I de cultivo por hora, o más de aproximadamente 1 500 I de cultivo por hora.
En una modalidad, el paso de pulido intermedio/final puede ser logrado vía uno o más adsorbedores de membrana o monolitos. Los adsorbedores de membrana son membranas delgadas, sintéticas, microporosas o macroporosas que son derivadas con grupos funcionales parecidos a aquéllos en las resinas equivalentes. Sobre sus superficies, los adsorbedores de membrana transportan grupos funcionales, ligandos, fibras intertejidas, o reactivos capaces de interactuar con al menos una substancia en contacto dentro de una fase de fluido que se mueve a través de la membrana por gravedad. Las membranas son apiladas normalmente 5 a 1 5 capas de profundidad en un cartucho comparativamente pequeño para generar una huella mucho más pequeña que columnas con rendimientos similares. El adsorbedor de membrana utilizado en la presente puede ser un intercambiador iónico de membrana, membrana de ligando de modo mixto y/o membrana hidrofóbica.
En una modalidad, el adsorbedor de membrana utilizado puede ser Adsorbedor de membrana ChromaSorbMR, disponible de Millipore Corporation. El adsorbedor de membrana ChromaSorbMR es un intercambiador amónico basado en membrana diseñado para la remoción de impurezas en trazas incluyendo HCP, DNA, endotoxinas, y virus para purificación de proteína y MAb. Otros adsorbedores de membrana que podrían ser utilizados incluyen Sarbobind® Q (disponible de Sartorium BBI Systems GmbH), Sartobind® S (disponible de Sartorium BBI Systems GmbH) , Sartobind® C (disponible de Sartorium BBI Systems GmbH), Sartobind® D (disponible de Sartorium BBI Systems GmbH); Sartobind® Pheyl (disponible de Sartorium BBI Systems GmbH), Sartobind® I DA (disponible de Sartorium BBI Systems GmbH); Pall Mustang® (disponible de Pall Corporation), o cualquier otro adsorbedor de membrana conocido en la técnica.
Como se expone antes, los monolitos pueden ser utilizados en el paso de pulido intermedio/final de la invención. Los monolitos son estructuras porosas de una pieza de canales ininterrumpidos e interconectados de tamaño controlado específico. Las muestras son transportadas a través de monolitos vía convección, conduciendo a una transferencia de masa rápida entre la fase móvil y estacionaria. En consecuencia, las características cromatográficas no son dependientes de flujo. Los monolitos también exhiben baja retropresión, incluso a altas velocidades de flujo, disminuyendo significativamente el tiempo de purificación. En una modalidad, el monolito puede ser un monolito basado en ligando de modo mixto o intercambio iónico. En un aspecto, el monolito utilizado puede incluir monolitos CI M® (disponibles de BIA separations), monolitos UNO® (disponibles de Bio-Rad Laboratories, Inc.) o monolitos ProSwift® o lonSwiftMR (disponibles de Dionex Corporation).
Todavía en otra modalidad, el paso de pulido intermedio/final puede ser logrado vía un paso de filtración de profundidad adicional en lugar de usar adsorbedores de membrana, monolitos, o una columna de modo mixto. En esta modalidad, la filtración de profundidad utilizada para pulido intermedio/final puede ser un filtro de profundidad CUNO Zeta Plus VR®. En esta modalidad, el filtro de profundidad puede servir el propósito de pulido intermedio/final así como eliminación viral.
En una modalidad particular, el paso de pulido intermedio/final puede ser un paso de cromatografía de interacción hidrofóbica (Fig . 2, paso 4). En una modalidad, este paso puede usar resina de interacción hidrofóbica Pheyl Sepharose® Hig Performace y una columna de cromatografía Chromaflow® Acrylic, cada una disponible de GE Healthcare. Las resinas Phenyl Sepharose® HP se basan en agarosa en perlas, altamente reticulada, rígida, con un diámetro de partícula promedio de 34 µ?? . Los grupos funcionales son unidos a la matriz vía enlaces de éter químicamente estables, no cargados, que resultan en un medio hidrofóbico con propiedades iónicas minimizadas. En esta modalidad, la muestra puede ser filtrada a través de un filtro de cápsula Sartopore® antes de cargar sobre la columna.
Si la cromatografía de interacción hidrofóbica es usada en el paso de pulido intermedio/final, el diámetro interno de la columna puede estar entre aproximadamente 10 y 100 cm . En una modalidad particular, el diámetro interno puede ser aproximadamente 60 cm. La altura de la columna, en una modalidad, puede estar entre aproximadamente 10 y 20 cm. En una modalidad, la altura de la columna es aproximadamente 15 cm .
Siguiendo el paso de cromatografía de pulido intermedio/final, el depósito de eluato puede ser sometido a un paso de nanofiltración (ver Figs. 1 -4, paso 5). En una modalidad, el paso de nanofiltración es logrado vía uno o más nanofiltros o filtros virales. Los filtros pueden ser conocidos en la técnica para ser útiles para este propósito y pueden incluir, por ejemplo, filtros Millipore Pellicon® o Millipak® o filtros Sartorius Vivaspin® o Sartopore®. En una modalidad particular, el paso de nanofiltración puede ser logrado vía un tren de filtro comprendido por un prefiltro y un nanofiltro o filtros virales. Como un ejemplo, el tren de filtro puede estar comprendido por dos filtros de cápsula Pall 0.15 m2 0.1 µ?? Fluorodyne® II PVDF disponibles de Pall Corporation, como filtros protectores para dos filtros Sartorius Virosart® CPV de 20 in (50.8 cm), disponibles de Sartorius Stedim Biotech GmbH, en paralelo. En otro ejemplo, el tren de filtro puede estar comprendido por un prefiltro (0.17 m2) 0.1 pm Maxicap® y dos filtros Virosar(T) CPV de 20 in (50.8 cm), ambos de Sartorius Stedim Biotech GmbH: un experto en la técnica entenderá que la selección de tipos y números de filtros será dependiente del volumen de muestra siendo procesado.
Como se muestra en las Figuras 1-4, paso 6, el paso de nanofiltración puede ser seguido opcionalmente por ultrafiltración/diafiltración (UF/DF), para lograr la concentración de substancia de medicamento enfocada y condición amortiguadora antes del embotellado. En una modalidad, esto puede lograrse por el uso de filtros. Los filtros pueden cualquiera conocido en la técnica como útil para este propósito y pueden incluir, por ejemplo, filtros Millipore Pellicon®; Millipak® o Sartopore®. En una modalidad particular, la UF/DF puede lograrse vía tres módulos Millipore® Pellicon® 2 Biomax UF con un corte de peso molecular de 30 kD y 2.5 m2 de área de superficie cada uno, seguido opcionalmente por filtración a través de un filtro de cápsula estéril Sartopore® 2, 800. Los pasos de nanofiltración y UF/DF pueden combinarse o reemplazarse por cualquier proceso o procesos conocidos en la técnica conocidos por proporcionar una proteína purificada que sea aceptable para embotellarse (Figs. 1-4, paso 7). Antes de embotellarse, las muestras pueden, en una modalidad, ser bombeadas a través de un filtro de 0.22 pm Millipak® 200 en recipientes de polietileno tereftalato glicol (PETG) libre de pirógeno, pre-esterilizados.
Los siguientes ejemplos describen varias modalidades de la presente invención. Otras modalidades dentro del alcance de las reivindicaciones en la presente serán evidentes para alguien experto en la técnica a partir de la consideración de la especificación o práctica de la invención como se describe en la presente. Se pretende que la especificación, junto con los ejemplos, sean considerados ejemplares solamente, con el alcance y espíritu de la invención siendo indicados por las reivindicaciones que siguen a los ejemplos.
Ejemplo 1 Hablando de manera general, una muestra de proteína (MAb A) fue purificada a partir de un sobrenadante de cultivo celular a través de una serie de pasos de recuperación, captura y purificación. Los pasos de recuperación primaria involucraron centrifugación y filtración de profundidad. Los pasos de captura involucraron cromatografía de proteína A, seguido por inactivación viral, filtración de profundidad y cromatografía de membrana Mustang® Q. Los pasos de purificación fina involucraron cromatografía de interacción hidrofóbica, nanofiltración y ultrafiltración/diafiltración. El producto final fue filtrado entonces, embolletado y congelado. Las operaciones de recuperación y captura fueron realizadas a temperatura ambiente. Los pasos de purificación fina fueron realizados a una temperatura de 1 7 ± 2°C, a menos que se especifique de otra manera. Tres lotes de recolección de bio-reactor de 3000 I de MAb A fueron purificados a través de este proceso.
Recuperación primaria La recuperación primaria por centrifugación y filtración de profundidad se usó para remover células y desechos de células del tanque de bio-reactor de producción. Una centrífuga Alfa-Laval BTUX 51 0 fue utilizada para este paso de proceso. Un bio-reactor de producción de 3000 I sirvió como el tanque de alimentación a una centrífuga de pila de discos de flujo continuo. La centrífuga fue corrida a aproximadamente 5200 rpm a una velocidad de alimentación de 28 l/minuto. La recolección centrifugada fue pasada subsecuentemente a través de un tren de filtración que consistió de diez unidades Millipore® X0HC media Pod de 1 .1 m2. Después, los contenidos del bio-reactor fueron sometidos a filtración de profundidad, el tren de filtración fue enjuagado subsecuentemente con 200 kg de 25 mM Tris, 1 00 mM cloruro de sodio, pH 7.2, y entonces soplados con aire para remover el filtrado restante. La centrifugación y filtración de la recolección se realizaron como una sola operación unitaria. El filtrado fue recolectado en un tanque de recolección de 3000 I, enfriado a 4-1 2°C y mantenido hasta por 5 días.
En una corrida, la centrífuga no fue utilizada y una serie de filtros Pod fue usada en su lugar para procesar el material. Un total de quince filtros DOHC y diez HOCH fueron usados para clarificar aproximadamente 3000 I de materiales de recolección. Nuevamente, el tren de filtración fue enjuagado subsecuentemente con 200 kg de 25 mM Tris, 100 mM cloruro de sodio, pH 7.2, y entonces soplados con aire para remover el filtrado restante. El rendimiento de clarificación cuando se usa el filtro de profundidad fue solo similar a aquél usando tanto centrífuga como filtro de profundidad. En total, el rendimiento de paso de recolección promedio fue 91 % con una concentración de recolección promedio de 1 .85 g/l. Los resultados de las operaciones de centrifugación y filtración de recolección son resumidos en la Tabla 1 .
Tabla 1. Resumen de operaciones de recuperación primaria Cromatografía de captura de proteína A Se usó cromatografía de proteína A para capturar la proteína de la recolección clarificada y para reducir la cantidad de impurezas relacionadas con el proceso. La resina ProSep® Ultra Plus (Millipore) y una columna de cromatografía Quickscale (Millipore) se utilizaron para este paso de proceso. La columna de captura de proteína A fue de 35 cm de diámetro con una altura objetivo de 20 cm (volumen de lecho 1 9.2 I). El límite de carga para Ab A en la columna fue 42 gramos de muestra por litro de resina de proteína A. Siete ciclos fueron completados para cada lote. El paso fue realizado a temperatura ambiente y se usó una carga de velocidad lineal de 3 pasos de 720 cm/h hasta 36 g/l, 480 cm/h hasta 39 g/l y 240 cm/h hasta 42 g/l. La columna se equilibró con 25 mM Tris, 1 00 mM cloruro de sodio, pH 7.2 y se cargó con recolección clarificada.
Después de la carga, la columna fue lavada a absorbancia de línea base (?2ß? ) con amortiguador de equilibrio. Un segundo lavado de 20 mM citrato de sodio/ácido cítrico, 0.5 M cloruro de sodio, pH 6.0, se utilizó con el fin de reducir la cantidad de impurezas relacionadas con proceso. Un tercer lavado de amortiguador de equilibrio llevó la densidad óptica (OD) , pH y conductividad nuevamente a la línea de base. El producto fue elu ído de la columna con 0. 1 M ácido acético, pH 3.5. El eluato fue recolectado desde 1 OD en el frente hasta 1 OD en la cola a 280 nm con una longitud de trayectoria de 1 cm . Para cada lote de cultivo celular, la columna fue reciclada seis veces adicionales para procesar aproximadamente los 5500 g de proteina cruda que se esperaban. Entre cada ciclo, la columna fue regenerada con 0.2 M ácido acético. El depósito de eluato fue sostenido hasta 5 días, enfriado a 4-12°C, antes de proceder el paso de inactivación de virus de pH bajo.
Los datos de operación y rendimientos para el paso de captura de Proteína son mostrados en la Tabla 2. Cargas de columna promedio fueron aproximadamente 42 g de proteína por I de resina por ciclo con la excepción del séptimo ciclo para cada lote, el cual se cargó parcialmente usando el volumen de carga restante. El rendimiento promedio para el paso de captura de Proteína A fue 90%. Las operaciones de columna de captura fueron consistentes con respecto a los perfiles cromatog ráficos de elución. Las superposiciones son ilustradas en las Figuras 5 y 6.
Tabla 2. Resumen de cromatografía de captura de proteína A de ProSep® Ultra Plus Inactivación viral, filtración de profundidad y cromatografía de membrana Q El depósito de eluato de proteína A fue sometido a pH bajo para inactivar virus adventicios que puedan haber estado presentes. El paso fue realizado a temperatura ambiente. El paso de inactivación de pH bajo fue realizado al ajustar el pH del depósito de eluato de 3.5 ± 0.1 (medido a 25°C) con ácido fosfórico 0.5 M. Después de un periodo de sostenimiento de 60-90 minutos, el material inactivado fue neutralizado a pH 8.0 ± 0. 1 (medido a 25°C) usando 3.0 M trolamina y diluido con agua purificada a una conductividad de 5.0 ± 0.5 mS/cm. Después de la neutralización, el material de pH inactivado se pasó a través de un tren de filtración hacia un tanque de sostenimiento. El tren de filtración estaba hecho de dos componentes. El primero consistió de seis unidades Millipore® X0HC media Pod de 1 .1 m2 y el segundo fue una cápsula de cromatografía Pall Mustang® Q de 780 mi. La carga promedio sobre la cápsula Mustang® Q fue 6.3 g de proteína por mi de cápsula Q. Después de la filtración de profundidad, y nuevamente después de procesar con membrana Q, la muestra se hizo fluir a través de un filtro de cápsula Sartopore® 2 20-in (0.45 pm + 0.2 pm). Después los contenidos del tanque de alimentación fueron filtrados, el tren de filtración fue enjuagado subsecuentemente con aproximadamente 100 kg de 25 mM trolamina y 40 mM cloruro de sodio. El efluente fue sostenido a= 22°C hasta por 1 día. En otros casos, el efluente fue enfriado a = 8°C y sostenido hasta por 3 días antes de proceder al paso de cromatografía de Phenyl Sepharose® HP.
Los resultados de las operaciones de inactivación de pH bajo y filtración son resumidas en la Tabla 3. La carga promedio sobre la cápsula Mustang® Q fue 6.3 g de proteína por mi de cápsula Q (equivalente a 409 mi de proteína por mi de cápsula Q) . Las tres corridas tuvieron un rendimiento de paso promedio de 96%.
Tabla 3. Resumen de operaciones de inactivación viral, filtración de profundidad y cromatografía de membrana Q Cromatografía de interacción hidrofóbica Se usó cromatografía de Phenyl Sepharose® HP para reducir la cantidad de impurezas relacionadas con proceso y anticuerpo agregado que pudiera estar presente en el efluente de membrana Q. Antes de este paso de pulido, el efluente de membrana Q fue diluido con 2.2 M sulfato de amonio y 40 mM fosfato de sodio, pH 7.0, para contener una concentración objetivo de 1.0 M sulfato de amonio y 18 mM fosfato de sodio y entonces filtrarse a través de un filtro de cápsula Sartopore® 2 10-in (0.45 pm + 0.2 pm) antes de cargar sobre la columna.
La resina de interacción hidrofóbica Phenyl Sepharose® HP (GE Healthcare) y una columna de cromatografía Chromaflow® Acrylic (GE Healthcare) se utilizaron para este paso de proceso. La columna de fenilo fue de 60 cm de diámetro con una altura objetivo de 15 ± 1 cm (volumen de lecho de 42.4 I). El límite de carga para la columna fue 40 gramos por muestra por litro de resina Phenyl Sepharose® HP. El paso se realizó a 17 ± 2°C y a una velocidad de flujo de 75 cm/h. El material de carga se calentó, cuando se requirió, a 17 ± 2°C antes del inicio del primer ciclo. La columna fue pre-lavada con agua y equilibrada con 1.0 M sulfato de amonio y 18 mM fosfato de sodio, pH 7.0. Siguiendo el equilibrio, la columna fue cargada con la carga de fenilo diluida. Después de la carga, la columna fue lavada a absorbancia de línea de base (A28o) con 1.1 M sulfato de amonio y 20 mM fosfato de sodio, pH 7.0, seguido por 0.95 M sulfato de amonio y 17 mM fosfato de sodio, pH 7.0, respectivamente. El producto fue eluido de la columna a una velocidad de flujo reducida de 37.5 cm/h con 0.55 M sulfato de amonio y 10 mM fosfato de sodio, pH 7.0, en un tanque portátil. El eluato fue recolectado de 5 OD en el frente hasta 1 OD en la cola a 280 nm con una longitud de trayectoria de 1 cm. Para cada lote de cultivo celular, la columna fue ciclizada dos veces adicionales para procesar los aproximadamente 4700 g de muestra de proteína que se esperaban. Entre cada ciclo, la columna fue regenerada con agua para inyección (WFI). El eluato fue sostenido a = 8°C y sostenido hasta por 1 0 días antes de proceder al paso de nanofiltración. Las operaciones de columna de fenilo fueron consistentes con respecto a los perfiles cromatográficos de elución. Las superposiciones son ilustradas en las Figuras 7 y 8.
Los datos de operación y rendimientos para cromatografía de Phenyl Sepharose® HP son detallados en la Tabla 4. Las cargas de columna promedio fueron aproximadamente 36 g de proteína por I de resina por ciclo. El rendimiento promedio para el paso de Phenyl Sepharose® fue 89%.
Tabla 4. Resumen de cromatografía de Phenyl Sepharose® HP Nanofiltración Se usó la nanofiltración para remover virus adventicios= 20 nm de diámetro que pudieran estar potencialmente presentes en el material purificado de Phenyl Sepharose® HP. El tren de filtro de nanofiltración estaba comprendido por dos filtros de cápsula Pall 0.15 m2 0.1 µ?t? Fluorodyne® II PVDF (total de área de filtro nominal de 0.3 m2) como filtros protectores de dos filtros Sartorius Virosar® CPV de 20 in (50.8 cm) (total de área de filtro nominal de 2.8 m2) o dos filtros Pall DV20 de 20 in (50.8 cm) en paralelo. El paso fue realizado a 1 0-14°C. Para monitorear la filtración, se montaron medidores de presión corriente arriba del prefiltro y corriente arriba de cada alojamiento de nanofiltro. Durante la filtración , la presión fue mantenida a = 32 psig (2.2496 kg/cm2 manométricos) . Después de que todo el eluato de fenilo ha sido filtrado, el tren de filtro fue enjuagado con 25 kg de 1 5 mM histidina, pH 6.0, para recuperar cualquier muestra de proteína , la cual puede haber sido retenida en los alojamientos de filtro. Para cada lote de cultivo celular, se realizó una nanofiltración. El filtrado fue sostenido a= 22°C hasta 1 día o enfriado a = 8°C y sostenido por hasta 10 d ías antes de proceder al paso de formulación.
El rendimiento promedio para la operación de nanofiltración fue 99%. La carga de filtro promedio para los filtros Sartorius fue 1 30 l/m2 por corrida (equivalente a 1413 g/m2 por corrida) . La carga de DV20 fue 61 l/m2 por corrida (equivalente a 693 g/m2 por corrida). Las operaciones de filtración fueron consistentes con base en los volúmenes de filtrado, concentraciones de filtrado y rendimientos. La operación y rendimientos son detallados en la Tabla 5.
Tabla 5. Resumen de la operación de nanofiltración aValores calculados usando datos relevantes para filtros Sartorius en Corridas 1 y 3 solamente.
Formulación (ultrafiltración y dialfiltración) Cada lote de filtrado viral fue concentrado y formulado mediante ultrafiltración y diafiltración. Tres módulos illipore Pellicon® 2 Biomax UF con un corte de peso molecular de 30 kD y área de superficie de 2.5 m2 cada una (total de 7.5 m2 de área de filtro nominal) se usaron para la primera porción de la operación de formulación. El paso fue realizado a 1 0-14°C . El filtrado viral fue concentrado primero a un objetivo de 70 g/l por ultrafiltración. A continuación, se realizó diafiltración continua con un m ínimo de 8 volúmenes de 1 9 mM histidina, pH 5.6. Después de la diafiltración, la substancia de medicamento fue concentrada adicionalmente a un objetivo de 1 95 g/l. El sistema de ultrafiltración fue drenado entonces de producto y enjuagado con aproximadamente 8 kg de 1 9 mM histidina, pH 5.6 , para recuperar producto sostenido en el sistema. El concentrado y lavado se combinaron para producir una muestra diafiltrada con una concentración objetivo de 1 30-1 50 g/l. El concentrado formulado fue filtrado entonces a través de un filtro de cápsula estéril Sartopore® 2 , 800 en u n tanque de sostenimiento. El filtrado fue mantenido por hasta 7 días a = 22°C antes de proceder al paso de embotellado final.
El rendimiento promedio para la operación de formulación fue 99%. Las operaciones de formulación fueron consistentes con base en los volúmenes de retenido final, concentraciones y rendimientos (ver Tabla 6) .
Tabla 6. Resumen de operación de formulación Filtración, embotellado y congelación Las operaciones de embotellado fueron realizadas en una campana de flujo a 2-8°C. La muestra fue bombeada a través de un filtro Millipak® 200 de 0.22 µ?t? en recipientes de polietileno tereftalato glicol libre de pirógeno, pre-esterilizados. Aproximadamente 1.6 I se llenaron por botella de 2 I. Dentro de tres horas del final de la operación de embotellado, las botellas etiquetadas y llenadas se congelaron a -80°C.
El rendimiento promedio para la operación de embotellado final fue 99%. Las operaciones de embotellado fueron consistentes con base en la concentración de proteína, cantidades de proteína, y rendimientos finales (ver Tabla 7).
Tabla 7. Resumen de operaciones de filtración estéril, embotellado y congelación Resumen de rendimiento Los rendimientos para cada paso de proceso están dados Tabla 8. La cantidad final de reactor y la cantidad de substancia de medicamento a granel embotellada se usaron para calcular el rendimiento global. El rendimiento global calculado promedio fue 60%. Cuando se corrigió para muestreo en proceso, el rendimiento global calculado promedio fue 68%.
Tabla 8. Resumen de rendimientos para purificación de MAb A Calidad de producto Se probó la substancia de medicamento a granel final para un panel completo de atributos de calidad. En total, los tres lotes de substancia de medicamento final fueron consistentes y dentro de especificaciones para todos los atributos probados (ver Tabla 9) .
Pureza de producto en substancia de medicamento final para Ejemplo 2 En este ejemplo, un proceso de purificación de proteína muy similar a aquél descrito en el Ejemplo 1 fue realizado para purificar MAb B. Las diferencias entre los dos procesos se describen en la presente. Si un aspecto del proceso no se describe en detalle, es como se describe para el Ejemplo 1 .
Recuperación primaria La centrifugación y filtración de profundidad sirvieron como los pasos de recuperación primaria. El proceso de centrifugación fue el mismo como se describe para el Ejemplo 1 . La recolección centrifugada fue pasada entonces a través de un tren de filtro que consistió de diez unidades 1 .1 m2 Millipore® X0HC media Pod. La muestra fue filtrada entonces a través de tres filtros Sartopore® 2 0.45/0.2 µ?t? de 30 in (76.2 cm), en serie. Después de que la muestra se filtró, se enjuagó con 200 kg de 25 mM tris, 100 mM cloruro de sodio, pH 7.2, seguido por soplado con aire para remover el filtrado restante. La centrifugación y filtración de la recolección se realizaron como una sola operación unitaria. El filtrado se recolectó en un tanque de recolección de 3000 I, enfriado a 4-12°C y se sostuvo hasta por 5 días.
Cromatografía de captura de proteína A El paso de captura de proteína A del Ejemplo 2 fue substancialmente similar a aquél descrito en el Ejemplo 1. El límite de carga para la columna fue 43 gramos de MAb B por litro de resina de proteína A. Ocho de nueve ciclos fueron completados para cada lote. El paso fue realizado a temperatura ambiente y se usó una carga de velocidad lineal de 2 pasos de 600 cm/h hasta 30 g/l y 400 cm/h hasta 43 g/l. Se usó 0.15 M ácido fosfórico (pH 1.5) para regeneración de cada ciclo. Se usó 6 M urea para limpieza, cada cinco ciclos y al final de proceso. 50 mM acetato de sodio, pH 5, 2% alcohol bencílico se usaron para sanitización y almacenamiento.
Inactivación viral, filtración de profundidad y cromatografía de membrana Q El siguiente paso en el proceso es el paso de combinación, el cual incluye inactivación viral, filtración de profundidad y cromatografía. En este paso, la inactivación de pH bajo se logró en la manera expuesta en el Ejemplo 1. Siguiendo la inactivación, la muestra se hizo fluir a través de XOHC Pod de 8.8 m2 seguido por dos adsorbedores de membrana Mustang® Q de 780 mi, los cuales están dispuestos en paralelo. La velocidad de flujo a través del adsorbedor de membrana Q fue 10 CV/min. Después de la filtración de profundidad y nuevamente después de procesamiento con membrana Q, la muestra se hizo fluir a través de un filtro de cápsula Sartopore® 2 30-in (0.45 µ?t? + 0.2 pm).
Cromatografía de interacción hidrofóbica Una resina de interacción hidrofóbica de Phenyl Sepharose® HP (GE Healtcare) y una columna de cromatografía Chromaflow® Acrylic (GE Healthcare) fueron utilizadas para este paso de proceso. La columna de fenilo fue de 80 cm de diámetro con una altura objetivo de 15 ± 1 cm. Antes de este paso de pulido, el efluente de membrana Q fue diluido con 2.2 M sulfato de amonio y 40 mM fosfato de sodio, pH 7.0, para obtener una concentración objetivo de 1.1 M sulfato de amonio y 11 mM fosfato de sodio y entonces filtrarse a través de un filtro de cápsula Sartopore® 2 (0.45 pm + 0.2 pm) antes de cargar sobre la columna. La columna fue pre-lavada con agua y equilbirada con 1.1 M sulfato de amonio en 20 mM fosfato de sodio, pH 7.0 solución. Siguiendo el equilibrio, la columna fue cargada con la carga de fenilo diluida a 75 cm/h de velocidad de flujo. Después de la carga, la columna fue lavada a absorbancia de línea de base (A2eo) con 1.4 M sulfato de amonio y 25 mM fosfato de sodio, pH 7.0. El producto fue eluido a partir de la columna a una velocidad de flujo reducida de 37.5 cm/h con 0.625 M sulfato de amonio y 11 mM fosfato de sodio, pH 7.0.
El eluato fue recolectado de 1 OD en el frente a 1 OD en la cola a 280 nm con una longitud de trayectoria de 1 cm . La muestra fue procesada a través de la columna en dos ciclos. El límite de carga para la columna fue 64 gramos de muestra por litro de resina Phenyl Sepharose® HP.
Nanofiltración El tren de filtro de nanofiltración estuvo comprendido por un filtro Sartorius 0. 1 µ?? Maxicap® como un pre-filtro para dos filtros Sartorius Virosart® CPV de 20 in (50.8 cm) (total de 2.8 m2 de área de filtro nominal) en paralelo. Durante la filtración, la presión se sostuvo a= 34 psig (2.3902 kg/cm2 manométricos).
Formulación (ultrafiltración y diafiltración) Cada lote de filtrado viral fue concentrado y formulado por ultrafiltración y diafiltración. Los módulos Millipore Pellicon® 2 Biomax UF con un corte de peso molecular de 30 kD (área de membrana total de 10 m2) se usaron para la primera porción de la operación de formulación. El filtrado viral fue concentrado primero a un objetivo de 50 g/l por ultrafiltración. A continuación, la diafiltración continua con un mínimo de 8 volúmenes de 23 m histidina, pH 5.6, se realizó. Después de la dialfiltración, la substancia de medicamento fue concentrada adicionalmente a un objetivo de 180 g/l. El sistema de ultrafiltración fue drenado entonces de producto y enjuagado con aproximadamente 6-8 kg de 15 mM histidina, pH 5.6, para recuperar el producto sostenido en el sistema. El concentrado y lavado se combinaron para producir una muestra diafiltrada con una concentración objetivo de 1 20-1 60 g/l.
La filtración, embotellado y congelación se lograron como se expone en el Ejemplo 1 .
Los rendimientos de purificación y calidad de producto final para MAb B fueron resumidos en la Tabla 10 y 1 1 . Cuatro lotes fueron corridos exitosamente con rendimiento de purificación total promedio de 69%. Los niveles de impurezas en las substancias de medicamento a granel final de todos los lotes fueron comparables y cumplieron la especificación de calidad de producto.
Tabla 10. Resumen de rend imientos para purificación de MAb B .
Tabla 11. Pureza de producto en substancia de medicamento final para MAb B.
Ejemplo 3 En este ejemplo, se realizó otro proceso de purificación de proteína para purificar MAb A en escala de laboratorio. El filtrado XOHC para la tercer corrida de lote, como se describe en el Ejemplo 1 , se ajustó a pH 8. 1 al adicionar 1 M Tris, pH 90.5 solución y la conductividad se ajustó a 9 mS/cm al adicionar 1 M NaCI. Aproximadamente 270 mi de filtrado ajustado se hizo fluir entonces a través de tres dispositivos adsorbedores de membrana Acrodisc® Mustang® Q de 0.1 8 mi en paralelo. La conductividad del depósito de flujo a través de membrana Q fue ajustada adicionalmente a 9 mS/cm al adicionar 1 M NaCI y entonces se filtró a 0.22 µ?t? . Este depósito acondicionado se hizo fluir entonces a través de una columna de 5 mi pre-empacada Capto® adhere a velocidad de flujo de tiempo de residencia de 3 min . El nivel de carga sobre la columna Capto® adhere fue 221 mg/ml y un lavado de amortiguador de equilibrio de 20 CV se realizó siguiente la carga libre. El depósito de producto se recolectó con base en la lectura de UV280 de 200 mAU durante la carga de producto a 200 mAU durante el lavado de amortiguador. El experimento se condujo a temperatura ambiente. La concentración y volumen del depósito de producto Capto® adhere se midieron para calcular el rendim iento de paso y el depósito se analizó para agregados/monómero usando SEC, y niveles de HCP y proteína A usando ensayos ELISA en casa.
El flujo a través de membrana Q de escala de laboratorio mostró rendimiento de paso de 93-97% y el paso de pulido de columna Capto® adhere dio un rendimiento de paso de 89%. Así, el rendimiento de proceso total usando Capto® adhere para pulido final es similar a aquél usando Phenyl Sepharose® HP como se muestra en el Ejemplo 1 . Además, la calidad del depósito de producto siguiendo purificación de Capto® adhere también cumplió la especificación de producto, como se muestra en la Tabla 12.
Tabla 12. Desempeño de purificación para MAb A a través de captura de proteína A seguido por filtración de POD/flujo a través de membrana Q y pulido de flujo a través de Capto® adhere.
Ejemplo 4 En este ejemplo, un proceso de purificación de proteína similar a aquél descrito en el Ejemplo 3 fue realizado para purificar MAb B en escala de laboratorio. El depósito de flujo a través de membrana Q de la segunda corrida de lote, como se describe en el Ejemplo 2, se ajustó a pH 8.1 al adicionar 1 M Tris, pH 9.5, y la conductividad se ajustó a 6 mS/cm al adicionar 1 M NaCI antes de filtrar a través de una membrana 0.22 pm. Este depósito acondicionado se hizo fluir entonces a través de una columna de 5 mi pre-empacada Capto® adhere a velocidad de flujo de tiempo de residencia de 3 min. El nivel de carga sobre la columna Capto® adhere fue 256 mg/ml y un 20 CV de lavado de amortiguador de equilibrio se realizó siguiendo la carga de alimentación. El depósito de producto se recolectó a temperatura ambiente. La concentración y volumen del depósito de producto Capto® adhere se midieron para calcular el rendimiento de paso, y el depósito se analizó para agregados/monómero usando SEC, y niveles de HCP y proteína A usando ensayos ELISA en casa.
El paso de pulido de columna Capto® adhere dio un rendimiento de paso de 91 .6%, el cual es similar al paso de ligar-eluir de Phenyl Sepharose® HP mostrado en el Ejemplo 2. Además, la calidad del depósito de producto siguiendo la purificación de Capto® adhere cumplió la especificación de producto, como se resumen en la Tabla 1 3.
Tabla 1 3. Purificación de desempeño para MAb B a través de captura de proteína A seguido por filtración de POD/flujo a través de membrana Q y pulido de flujo a través de Capto adhere.
Ejem plo 5 En este ejemplo, un proceso de purificación de prote ína similar a aquél descrito en el Ejemplo 4 se realizó para pu rificar MAb B en escala de laboratorio. El filtrado XOHC de la segunda corrida de lote, como se describe en el Ejem plo 2, se aj ustó a pH 6.5 al adicionar 1 M Tris , pH 9.5, y la conductividad se ajustó a 6 mS/cm al adicionar 1 M NaCI o diluir con ag ua Mil li-Q® antes de filtrar a través de una membrana de 0.22 µ?t? . Este depósito acondicionado se hizo flu ir entonces a través de una columna de 5 mi pre-empacada PPA HyperCelMR a velocidad de flujo de tiempo de residencia de 3 m in . Dos corridas fueron cond ucidas. Los niveles de carga sobre la columna PPA HyperCelMR fueron 1 04 y 235 mg/l, respectivamente, y se rea lizó un 20 CV de lavado de a mortig uador de eq uilibrio siguiendo cada carga de alimentación . El depósito de producto fue recolectado con base en la lectura UV280 de 200 mAU durante la carga de producto a 200 mAU durante el lavado de amortiguador. El experimento fue conducido a temperatura ambiente. La concentración y volumen del depósito de producto PPA HyperCelMR fueron medidos para calcular el rendimiento de paso, y el depósito se analizó para agregados/monómero usando SEC, y niveles de HCP y proteína A usando ensayos ELISA en casa.
La alimentación para estos experimentos contiene aproximadamente 98.1 % de monómero ( 1 .7% de agregados), 7 ng/ml de HCP y se disparó con 23.6 ng/mg de proteína A. El desempeño de la resina PPA HyperCelM R se resumió en la Tabla 14. El rendimiento a mayor nivel de carga (235 mg/ml) fue 92%, comparable con aquél del paso de pulido de Phenyl Sepharose® HP mostrado en el Ejemplo 2. Además, la calidad de los depósitos de producto siguiendo purificación de PPA HyperCelM R cumplió la especificación de producto. Debido a que la carga para esa corrida no atravesó la membrana Q, se espera que la calidad de producto sea mejorada adiciona lmente si la membrana Q es usada entre la filtración de XOHC y paso de pulido de PPA hypercel.
Tabla 14. Desempeño de purificación para MAb B a través de captura de proteína A seguido por filtración de POD y pulido de flujo a través de PPA HypercelM R Ejemplo 6 En este ejemplo, se realizó otro proceso de purificación de proteína para purificar MAb B en escala de laboratorio. El eluato de proteína A como se describe en el Ejemplo 2, fue ajustado a pH 5 al adicionar 1 M Tris, pH 9.5 solución y la conductividad se ajustó a 8 mS/cm al adicionar 1 M NaCI seguido por filtración a 0.22 pm. Este material acondicionado se hizo fluir entonces a través de una columna de intercambio catiónico de 8 mi Poros XS® (Life Technologies) a velocidad de flujo de tiempo de residencia de 4 min. Antes de la carga, la columna se limpió con 0.1 M NaOH, equilibrado con 50 mM acetato e sodio, 35 mM NaCI, pH 5 amortiguador. Después de cargarse con 72 mg/ml de MAb B, la columna se lavó con amortiguador de equilibrio y entonces se eluyó con 50 mM acetato de sodio, 220 mM NaCI, pH 5 amortiguador. El eluato se recolectó con base en la lectura de UV280 desde 200 mAU hasta 200 mAU. El experimento se condujo a temperatura ambiente. La concentración y volumen del depósito de producto Poros XS® se midieron para calcular el rendimiento de paso, y el depósito se analizó para niveles de agregados/monómero usando SEC, y niveles de HCP y proteína A usando ensayos ELISA en casa.
La Tabla 15 resume el desempeño de purificación para este paso de pulido. Un rendimiento de paso de casi 100% fue obtenido y todos los niveles de impureza están dentro de las especificaciones de producto. Debido a que la carga para esta corrida no atravesó XOHC POD y paso de pulido de membrana Q, se espera que la calidad de producto mejore adicionalmente cuando se incorporen estos pasos.
Tabla 15. Desempeño de pulido de columna de intercambio catiónico Poros XS para eluato de proteína A de MAb B Ejemplo 7 En este ejemplo, otro proceso de purificación de proteina fue realizado para purificar MAb C en escala de laboratorio. El material inactivado viral de pH bajo, filtrado por profundidad con Millipore POD, como se describe en el Ejemplo 1 , se ajustó a pH 5 al adicionar 2 M ácido acético a la solución y la conductividad se ajustó a 5 mS/cm al diluir con agua seguido por filtración a 0.22 µ?t? . Este material acondicionado se disparó con cantidades adicionales de proteína A y proteínas de célula huésped para examinar la capacidad de esta resina de cromatografía para remover estas impurezas de proceso. El material disparado fue cargado sobre una columna de intercambio catiónico de 4.0 mi Poros XS® (Life Technologies) a velocidad de flujo de3 tiempo de residencia de 2.9 min. Antes de la carga, la columna fue limpiada con 0.1 M NaOH, equilibrada con 1 00 mM acetato de sodio, pH 5 amortiguador. Después de la carga con 68 mg/ml de MAb C, la columna fue lavada con amortiguador de equilibrio y entonces se eluyó con 380 mM acetato de sodio, pH 5 amortiguador. El eluato se recolectó con base en la lectura de UV280 desde 200 mAU hasta 400 mAu. El experimento se condujo a temperatura ambiente. La concentración y volumen del depósito de producto Poros XS® se midieron para calcular el rendimiento de paso, y el depósito se analizó para niveles de agregados/monómero usando SEC y niveles de HCP y proteína A usando ensayos ELISA en casa.
La Tabla 16 resume el desempeño de purificación. Un rendimiento de paso de 93% fue obtenido y todos los niveles de impureza están dentro de especificaciones de producto.
Tabla 16. Desempeño de pulido de columna de intercambio catiónico Poros XS para eluato de proteína A de MAb C Todas las referencias citadas en esta especificación, incluyendo sin limitación, todos los documentos, publicaciones, patentes, solicitudes de patentes, presentaciones, textos, reportes, manuscritos, folletos, libros, divulgaciones en internet, artículos de diarios y/o periódicos son incorporadas aquí por referencia en esta especificación en su totalidad . La discusión de las referencias en la presente pretende meramente resumir las afirmaciones hechas por sus autores y no se hace admisión alguna que cualquier referencia constituya técnica anterior. Los solicitantes se reservan el derecho a retar la precisión y pertinencia de las referencias citadas.
Estas y otras modificaciones y variaciones para la presente invención pueden ser practicadas para aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica, sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención, la cual se expone de manera más particular en las reivindicaciones anexas. Además, se debería entender que aspectos de las diversas modalidades pueden ser intercambiadas en todo o en parte. Adicionalmente, aquéllos de habi lidad ordinaria en la técnica apreciarán que la descripción anterior es a manera de ejemplo solamente, y no pretende limitar la invención descrita adicionalmente en tales reivindicaciones anexas. Por lo tanto, el espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas debería limitarse a la descripción de las versiones contenidas en la presente.

Claims (32)

REIVINDICACIONES
1. Un método para purificar una proteína comprendiendo: a. proporcionar una muestra conteniendo la proteína; b. procesar la muestra a través de una resina de cromatografía de captura para proporcionar un primer eluato comprendiendo la proteína; c. inactivar virus en el primer eluato para proporcionar un eluato inactivado comprendiendo la proteína; d. procesar el eluato inactivado a través de al menos un filtro de profundidad para proporcionar un eluato filtrado comprendiendo la proteína; y e. procesar el eluato filtrado a través de al menos una membrana de intercambio iónico para proporcionar un segundo eluato comprendiendo la proteína.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el paso de filtración de profundidad y el paso de membrana de intercambio iónico son provistos en un tren de filtración.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la resina de cromatografía de captura es seleccionada del grupo que consiste de una resina de afinidad, una resina de intercambio iónico, resina de modo mixto y una resina de interacción hidrofóbica.
4. El método de la reivindicación 1, en donde la resina de cromatografía de captura es seleccionada del grupo que consiste de una resina de proteína A, una resina de proteína G, una resina de proteína A/G y una resina de proteína L.
5. El método de la reivindicación 1 , en donde la proteína es seleccionada del grupo que consiste de un fragmento de proteína, un anticuerpo, un anticuerpo' monoclonal, una inmunoglobulina y una proteína de fusión.
6. El método de la reivindicación 1 , en donde la muestra es un cultivo celular.
7. El método de la reivindicación 1 , en donde la muestra es clarificada antes de procesar a través de la resina de cromatografía de captura.
8. El método de la reivindicación 7, en donde la muestra es clarificada por un método de cl a rificaci ón seleccionado del grupo que consiste de centrifugación, microfiltración, ultrafiltración, filtración de profundidad, filtración estéril, y tratamiento con un detergente.
9. El método de la reivindicación 1 , en donde la inactivación viral comprende un método seleccionado del grupo que consiste de tratamiento con ácido, detergente, químicos, agentes reticulantes de ácido nucleico, luz ultravioleta, radiación gamma , y calor.
10. El método de la reivindicación 9, en donde la inactivación viral comprende disminuir el pH del primer eluato a un pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 4.
1 1 . El método de la reivindicación 1 0, en donde el primer eluato es incubado durante aproximadamente 30 hasta aproximadamente 90 minutos durante la inactivación viral.
12. El método de la reivindicación 1 , en donde el eluato inactivado es ajustado a pH 5 hasta 1 0 antes del paso de filtración de profundidad.
13. El método de la reivindicación 1 , en donde el paso de filtración de profundidad comprende filtración a través de al menos un filtro de profundidad.
14. El método de la reivindicación 1 , en donde el paso de filtración de profundidad comprende filtración a través de al menos dos filtros de profundidad arreglados en serie o en paralelo.
15. El método de la reivindicación 1 , en donde el paso de filtración de profundidad es seguido por un paso de filtración estéril de cápsula.
16. El método de l a re ivi nd icació n 1 , en do nde la mem bra na de intercambio iónico comprende una membrana Q.
1 7. El método de la reivindicación 16, en donde el paso de membrana Q es conducido en el modo de flujo a través.
1 8. El método de la reivindicación 1 , en donde el paso de membrana de intercambio iónico es seguido por un paso de filtración estéril de cápsula.
19. El método de la reivindicación 1 , en donde el eluato inactivado es procesado a través de un filtro de profundidad y el eluato filtrado es procesado a través de la membrana de intercambio iónico en serie.
20. El método de l a reivindicación 1 , en donde el segundo eluato es sometido adicionalmente a un paso de cromatografía adicional.
21 . El método de la reivindicación 20, en donde el paso de cromatografía adicional es seleccionado del grupo que consiste de cromatografía de interacción hidrofóbica , cromatografía de modo mixto y cromatografía de intercambio catiónico.
22. El método de la reivindicación 1 , en donde el segundo eluato es sometido adicionalmente a un paso de nanofiltración.
23. El método de la reivindicación 1 , en donde el segundo eluato es sometido adicionalmente a un paso de ultraf iltración y diafiltración.
24. Un método para purificar una proteína que comprende: a. proporcionar una muestra conteniendo la proteína; b. clarificar la muestra para proporcionar un amuestra clarificada; c. procesar la m uestra clarificada a través de una resi n a de cromatografía de captura para proporcionar un primer eluato comprendiendo la proteína; d. inactivar virus en el primer eluato para proporcionar un eluato inactivado comprendiendo la proteína; e. procesar el eluato inactivado a través de al menos un filtro de profundidad para proporcionar un eluato filtrado comprendiendo la proteína; f. procesar el eluato filtrado a través de al menos una membrana de intercambio iónico para proporcionar un segundo eluato comprendiendo la proteína; g. procesar el segundo eluato a través de una resina de cromatografía adicional para proporcionar un tercer eluato comprendiendo la proteína; h. someter el tercer eluato a nanofiltración para proporcionar un eluato nanofiltrado comprendiendo la proteína; y i. someter el eluato nanofiltrado a ultrafiltración y diafiltración.
25. El método de la reivindicación 24, en donde la resina de cromatografía adicional comprende una resina de cromatografía de modo mixto.
26. El método de la reivindicación 25, en donde el procesamiento del segundo eluato a través de la resina de cromatografía de modo mixto adicional comprende una o más técnicas de cromatografía seleccionadas del grupo que consiste de intercambio aniónico, intercambio catiónico, interacción hidrofóbica, interacción hidrofí l ica , u n ión de h id rógeno , u n ión pi-pi y afin idad de meta l .
27. El método de la reivindicación 26, en donde el procesamiento del segundo eluato a través de la resina de cromatografía de modo mixto adicional comprende una combinación de mecanismos de cromatografía de intercambio aniónico e interacción hidrofóbica.
28. El método de la reivindicación 26, en donde la columna de cromatografía de modo mixto puede ser operada en modo de flujo a través o ligar-eluir.
29. El método de la reivindicación 24, en donde la resina de cromatografía adicional comprende una resina de intercambio catiónico.
30. El método de la reivindicación 29, en donde el procesamiento del segundo eluato a través de la resina de cromatografía de modo mixto adicional comprende una o más técnicas de cromatografía seleccionadas del grupo que consiste de intercambio aniónico, intercambio catiónico, interacción hidrofóbica , interacción hidrof ílica, unión de hidrógeno, unión pi-pi y afinidad de metal.
31 . El método de la reivindicación 30, en donde el procesamiento del segundo eluato a través de la resina de cromatografía de modo mixto adicional comprende una combinación de mecanismos de cromatografía de intercambio aniónico e interacción hidrofóbica.
32. El método de la reivindicación 29, en donde la columna de cromatografía de intercambio catiónico es operada en modo ligar-eluir.
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