TW201118173A - Production of polio virus at high titers for vaccine production - Google Patents

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201118173 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於細胞培養及小兒麻痺病毒製造之領域。更 特定言之，本發明係關於一種經改良之培養細胞的方法及 自該細胞製造用於生產小兒麻痒症疫苗之小兒麻痺病毒的 方法。 【先前技術】 小兒麻痺病毒為小RNA病毒科（pic〇rnaviridae)，腸病毒 (Enterovirus)屬之成員。小兒麻痺病毒為小型、無外被膜 之病毒，其衣殼封閉單鏈正義RNA基因組。存在三種類型 之小兒麻痺病毒：1型、2型及3型。小兒麻痒病毒感染易 又感木之個體可導致小兒麻痺症（paralytic poliomyelitis)。 小兒麻痺症（P〇li〇myelitis)具高度傳染性。已發展出兩種 不同小兒麻痒症疫苗：沙克（Salk)2不活化小兒麻痒病毒 疫苗（IPV)、及沙賓（Sabin)之減毒口服小兒麻痒病毒疫苗 (OPV)兩種疫田皆安全且有效。各自具有其特定之優點 及缺點，且二者在控制小兒麻痺症上皆扮演重要角色。關 於小兒麻痺病毒及小兒麻痺症疫苗，可參見例如Kew等 人，2005 ° 口服小兒麻痺症疫苗（〇pV)廉價且方便，且已大量使 用。然而，偶有接受者由於疫苗中之回復突變種而罹患與 疫苗相關之小兒麻痺症（VAPP)。此外，已在免疫不全之人 群中観察到，減毒沙賓小兒麻痺病毒株發生突變變化，導 致發生麻痺症（paralytic disease)，其在臨床上及流行病學 149522*doc 201118173 上無法與天然存在之野生型小兒麻痺症區分；該等突變種 稱為流通性衍生自疫苗之小兒麻痒病毒或cVDPV(參見例 如 Kew 等人，2005 ; Wright及 Modlin, 2008 ; Yakovenko 等 人，2009)。 漸漸達成如下共識：當與現有之OPV方法組合使用時， 不活化小兒麻痒病毒疫苗（IPV)可有助於更快速根除野生 型小兒麻痒症及控制出現cVDPV(Wright及Modlin，2008 ; John, 2009)。 然而，生產IPV之成本較高（參見例如John, 2009)，且對 於較低度及最低度開發國家而言，可能甚至係天價，但該 等國家仍然強烈需要小兒麻痒症疫苗。用於批量製造可用 於疫苗之小兒麻痒病毒材料（特定言之未經減毒之小兒麻 痺病毒）的培養系統為成本相當高昂的主要原因。 因此，於技術中需要一種用於製造於疫苗中使用之小兒 麻痒病毒的有效培養糸統。 已闡述於HEK293細胞中繁殖小兒麻痒病毒作為用於研 究神經元特異性複製表現型小兒麻痒病毒之系統，且已闡 述，減毒形式之小兒麻痺病毒（諸如：存在於如沙賓病毒 株中之IRES元件中含有點突變之小兒麻痺病毒）已證實在 HEK293細胞中之繁殖減少（Campbell等人，2005)。 已闡述E1 -不死人類胚胎視網膜（HER)細胞（特定言之 PER.C0細胞）適用於繁殖多種病毒，尤其係流感病毒（Pau 等人，2001 ; WO 01/38362)。雖然 WO 01/38362 闡述於 PER.C6細胞中繁殖多種流感病毒株、及1型及2型單純范療 149522.doc 201118173 病毒（Herpes Simplex Virus)(HSV)、麻疹病毒⑼娜⑹ vmis)及輪狀殇毒（r〇tavirus)病毒株之工作實例，但是小兒 麻痺病毒之繁殖未列舉於W0 01/38362中。此外，仍未闡 述使小兒麻痒病毒於該等細胞中複製之條件，且無法基於 不相關之病毒於該等細胞中之複製而輕易作出推斷。因 此，至今仍未知是否能夠以工業規模經濟地於該等細胞中 製造用於疫苗生產之小兒麻痒病毒。 爲了大規模生產不活化小兒麻痺症疫苗，通常於源自猴 之非洲綠猴腎細胞（Vero cell)中繁殖小兒麻痺病毒。非洲 綠猴腎細胞廣泛用於疫苗生產，包括不活化、及活的減毒 小兒麻痺症疫苗，且迄今仍為管理當局最廣泛接受之用於 生產病毒疫苗之連續細胞株，且相關技術中之專家希望使 用該等細胞用於生產疫苗（Barrett等人，2009)。 已由M〇ntagnon等人，1982及1984闡述大規模微載體培 養非洲綠猴腎細胞’以用於生產不活化小兒麻痺病毒疫 苗。亦於美國專利案4,525,349中闡述利用非洲綠猴腎細胞 大規模生產小兒麻痺症疫苗之方法，及最終所得之疫苗。 已有Merten等人，1997闡述’於如下條件下可製造高效 價（約2xl〇9 TCID^/ml)小兒麻痒病毒（沙賓首先於含 有血清之培養基中培養於微載體上之細胞，隨後於病毒製 造時期’於不含血清之培養基中培養，但鑒於使用血清之 缺點，該等作者已經指出，需要一種完全不含血清之方 法’且於該種優化之完全不含血清之方法中，該等作者等 夠獲得6.3xl08TCID5〇/ml之效價。 149522.doc 201118173 涉及於工業規模上製造用於生產疫苗之小兒麻痺病毒的 Kreeftenberg等人’ 2006亦提及於生長於微載體上之非洲 綠猴腎細胞中產生多種野生型及沙賓小兒麻癉病毒株，其 中不同菌株之產率近似，（log效價）為8.1至8 6。該等作者 亦闡述，生產最終之IPV疫苗所需之病毒數量顯著高於生 產最終之OPV疫苗所需之病毒數量，其導致每一劑量之 IPV的生產成本顯著高於OPV。 亦有Card等人，2〇〇5闡述，利用培養於微載體上之非洲 綠猴腎細胞，以無血清方式製造小兒麻痺病毒，且雖然生 產量低於靜態培養時，但已闡述微載體培養更易於擴大規 模。 W然該等基於微載體之非洲綠猴腎細胞培養物有效且具 工業可應用性，但若製造大量小兒麻痺病毒仍成本高昂， 因此仍'然需要-種替代性之小兒麻癉病毒製造系統，以減 弱該缺點。 已闡述利用懸浮非洲綠猴腎細胞製造小兒麻痺病毒，其 所產生之病毒效價（i%g CCID5Q/m^ 6 5至7 9)比彼等於通 常之微載體非洲綠猴腎細胞中所觀察到之病毒效價低

Eikenhorst等人，2009)。 本發明之軚的為提供一種適宜方法，其可用於大規模 且經濟地製造作為疫苗使用之小絲痺病毒。其可能有助 於開發中@家獲得其可負擔之小兒麻痺症疫苗。 【發明内容】 本發明係基於如下已證實之結論：即可於PER.C6細胞中 I49522.doc 201118173 極高效地繁殖小兒料病毒，其中根據文中所述之方法， 可獲得前所未有之高效價之病毒。由於針對具有極不同性 質之多種不同類型之病毒之條件及可獲得之優點會有極大 變化’目此無法基於其他病I於豸等細月包中之複製情形來 預測所獲得如此高之效價是否會比於非洲綠歸細胞中製 造之小兒麻痒病毒更提供顯著之經濟優勢，亦不能預見其 工業上可行方法之條件。 因此，本發明提供一種製造小兒麻痺病毒之方法，包括 如下步驟：a)提供無血清懸浮細胞培養物，其為以Ecacc 第96〇2294〇號名義寄存之pER C6細胞，b)依細胞密度 2xl06個細胞/ml至ι5〇χ1〇6個細胞/ml，以小兒麻痺病毒感 染該等細胞，及c)於感染後之12至48小時收集小兒麻痺病 毒。 於某些實施例中，於細胞密度為約5xl〇6個細胞/ml至 2〇x 1 〇6個細胞/m卜例如約8 X 1 〇6個細胞/mi至15 X106個細胞/ ml ’例如於約ΙΟχΙΟ6個細胞/ml下進行該感染。 於某些實施例中’於感染之後之約丨8至3〇小時，例如於 感染之後約24小時’收集小兒麻痒病毒。 該等條件可在相當短之製程中獲得極高之小兒麻痺病毒 效價（約101G/ml，其為利用基於微載體之非洲綠猴腎細胞 通常可獲得之野生型小兒麻痒病毒株之效價之1 〇倍以 上），因此較之當前所採用之製造用於疫苗生產之小兒麻 痺病毒的方法，其具有顯著之經濟優勢。該結論已在所有 二種類型之小兒麻痒病毒（1型（Brunenders病毒株）、2型

S 149522.doc 201118173 (MEF病毒株）及3型（Saukett病毒株））中得到證實。 因此在某些#施射，該等小歸相毒料生型毒性 小兒麻痺病毒，例如】型小絲相毒、2型小絲痒病毒 或3型小兒麻相毒。於某些實施财，該小兒麻痒病毒 為1型小兒麻痒病毒株Mahoney或Brunenders、2型小兒麻 痺病毒株MEF(或應-1)、或3型小兒麻痒病毒株Saukett。L 於其他實施例中，該小兒麻痺病毒為減毒小兒麻痺病毒 (神經毒性較弱）’例如沙賓病毒株(其亦可為分為i、2或3 型）。 本么月另外長：供一種生產小兒麻痺症疫苗之方法，包括 根據本發明製造小兒麻癉病毒之方法，且包括純化，且視 需要不活化、及調配所收集之小兒麻痺病毒，以獲得小兒 麻痺症疫苗。對於IPV，藉由福馬林或其他方法進行不活 化。對於OPV，不需要不活化步驟。 文中亦揭示提供一種適用於製備小兒麻痺症疫苗之小兒 麻痒病毒原液，該小兒麻痒病毒原液可藉由根據本發明之 製造小兒麻痺病毒之方法獲得，且包括培養基，且小兒麻 痒病毒之效價為至少1〇9.4 CCID5〇/ml，例如約1〇95至1〇11 CClD50/m卜例如約1〇9.8至1〇10.8 cciD5〇/mi。於某些實施 例中，e玄原液之體積為1至1 〇〇〇升。於其他實施例中，該 原液含有根據本發明方法所使用之細胞及/或該細胞的細 胞碎片。於某些實施例中，該原液係置於生物反應器中。 於其他實施例中’已自生物反應器移出原液，並置於適宜 容器中。 149522.doc 201118173 本發明亦揭示-種根據本發日月之方法可獲得之小兒麻痒 病毒及小兒麻痺症疫苗。該等小兒麻痒病毒及/或該疫苗 不含猴蛋白質，較佳不含非人類蛋白質。其亦不含其它非 人頌伯主細胞殘留物。相反，根據通常方法製得之小兒麻 痒病毒會含有殘留之來源於所使用之宿主細胞及/或來源 於在細胞培養期間所使用之血清的非人類蛋白質及/或其 他非人類殘留物。因此，根據本發明製得之小兒麻痒病毒 又到由製造方法所導致之非人類雜質之污染程度低於採用 通常方法製得之小兒麻痒病毒。 本發明亦提供一種於細胞培養物中獲得小兒麻痺病毒製 劑之方法，且其效價為至少約i 09.4，較佳至少i 〇9.8，更佳 至少1〇10，例如1〇】05至10" ，該方法包括如下 步驟.a)提供無血清懸浮細胞培養物，其為pER C6細胞’ b)依細胞密度為2 x 1 〇6個細胞/ml至1 50 X 1 〇6個細胞/mi，以 小兒麻痺病毒感染該等細胞’及c)於感染之後12至48小時 收集小兒麻痺病毒，獲得具有該濃度之小兒麻痒病毒製 劑。較佳實施例係與上述用於根據本發明製造小兒麻瘁病 毒之方法相同。 【實施方式】 用於本發明方法之細胞為PER.C6細胞，其為不死細胞， 於相關技術中亦稱為連續細胞株’且因此其有可能永生 (參見例如Barrett等人，2009)。於本申請案中之pER.C6細 胞意指於1996年2月29日以第96022940號寄存於ECacc之 細胞°熟習此項技術者咸清楚，該定義將包括獲自該等寄 149522.doc 201118173 存細胞之上游或下游繼代、或上游或下游繼代之子代之細 胞。於美國專利案5,994，128及Fallaux等人，1998中已闡述 PER.C6細胞。如例如於pau等人，2001及WO 01/38362中 所述’由於該等細胞可高效率感染並繁殖病毒，因此其非 常適用於製造流感病毒，以生產基於細胞之流感疫苗。如 例如於Yallop等人，2005中所述，PER.C6細胞能夠於不存 在血清下懸浮生長。文中已證實，該等細胞亦非常適用於 於無血清懸浮培養物中製造高濃度小兒麻痒病毒。 此外，所採用之條件具經濟性且具管理優勢。 本發明不需要使用微載體，此係與廣泛使用之利用非洲 綠猴腎細胞之方法相反。微載體導致採用常用之基於非洲 綠狼腎細胞之方法製造小兒麻痒病毒成本高。 根據本發明，無血清意指用於細胞生長及感染之培養基 缺少全血清成份。其可能並非完全不含衍生自血清之產 物，諸，例如牛血清白蛋白(BSA)，然而，於較佳實施例 中δχ等且刀亦不存在，或已於不存在任何動物來源之組 分下重組製得。於較佳實施例中，於不存在直接獲自動物 之任何組分（諸如血清或血清組分等）下，進行全部製程。 於較佳實施财，於無㈣組分之條件下，進行生產疫苗 製程。其意指’用於細胞生長及感染之培養基不含任何源 自動物之組分。此外’在疫苗製造製程期間向培養基補充 添加物亦不含源自動物之組分。於製造該小兒麻痒 :免田之方法中不存在動物組分，使得該方法更可控及安 。因此’特徵已完錢定出4遵從GLp/GMp下發展出 149522.d〇c 201118173 之人類細胞-PER.C6細胞非常適用於生產疫苗。可使用不 同培養基，且選擇細胞之較佳培養基及所採用之環境為熟 習此領域之工作者之日常工作之一部份。用於本發明之適 宜培養基因此已為熟習此項技術者所熟知，且通常可大量 購得，或可根據標準方法定製。可於例如培養血、轉瓶或 生物反應器中，採用分批、批次進料、連續系統等進行培 養。爲了透過細胞培養大量（連續）製造病毒，於技術中較 佳需要一種能夠於懸浮液中生長之細胞，且較佳需要一種 能夠在不存在源自動物或人類之血清、或源自動物或人類 之血清組分下培養之細胞。已知適用於培養細胞之條件 (參見例如 Tissue Culture，Academic 出版社，Kruse 及 Paterson編輯（1973);及 R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique，第四版（Wiley-Liss公 司，2000，ISBN 0-471-34889-9).。可根據本發明方法使用 之無血清培養基包括但不限於可自media vendors目錄訂購 之標準培養基，包括 CDM4PERMAbTM(Thermo Scientific HyClone ，目錄 I虎第 SH30871 、 SH30872 号虎）。it匕夕卜，諸 士口 Permexcis (Lonza)之訂製培養基亦適宜。可能適用於本發 明方法之其他不含血清之培養基實例為AEM(Invitrogen， 目錄編號第125 82-01 1號）、£乂-〇£1^1^¥?11〇培養基（11〇·! Biosciences，目錄編號 14561 號）及 CDM4RetinoTM (HyClone，目錄編號第 SH30520、SH305 19號）° 於某些視需要選擇及非限制性實施例中，可能向本發明 方法中之無血清培養基補充脂質及/或水解物及/或其他補 149522.doc -11 - 201118173 充物，以進一步改善產率。 於本揭示案中，用於修飾數量數值之術語「約」（about 或around)意指數值土 1〇0/〇。 於根據本發明方法中，可例如適宜於溫度約33。(：至38。(： 下’以小兒麻痺病毒感染細胞及/或繁殖病毒。於較佳實 施例中’該感染及/或繁殖病毒係於溫度約34〇c至361下 進行’於某些實施例中，為約34 5它至35.51：，例如於約 35°C 下。 於根據本發明之方法中，可例如適宜於感染倍率（M〇I) 為0.001至10下，以小兒麻痺病毒感染細胞。於某些實施 例中’該感染係於MOI為約1至3下進行，例如於MOI為約2 下。於相當高之MOI(>〇.1，較佳約1或更高）下感染時，可 進一步改善該高效率、高產率方法。 根據本發明，較佳於高細胞密度下，以小兒麻痺病毒感 木細胞。於某些態樣中，當細胞密度為1 χ丨〇6個細胞^丨至 1 5〇x 1 〇6個細胞/ml ’較佳2χ丨〇6個細胞/m丨至i 5〇χ丨〇6個細胞/ ml下’感染小兒麻痺病毒。於某些較佳實施例中，於細胞 密度為約5χ106個細胞^丨至2〇xl〇6個細胞/ml，例如約 8xl06個細胞/ml至15xl〇6個細胞/nU，例如約1〇χ1〇6個細胞/ ml下進行該感染。據吾人瞭解，在生產非腺病毒型病毒之 疫苗時，本發明方法提供最高之細胞濃度。胃等根據本發 明之方法之優點為可獲得極高之小兒麻痺病毒效價，亦即 至少比利用先前技#中之常用#洲綠猴腎細胞方法高約數 倍。 149522.doc •12· 201118173 於根據本發明之方法中，於感染之後丨2至48小時收集小 兒麻痺病毒。於某些實施例中，於感染之後約18至30小 時’例如於感染之後約20至28小時 '約22至26小時，例如 於感染之後約24小時，收集小兒麻痺病毒。因此，根據本 發明之方法可用於非常快速地獲得高效價小兒麻痺病毒， 相較於相關技術中通常耗時更長之方法，其亦有助於使得 本發明方法極具經濟吸引力。 大多數大規模懸浮培養物係採用分批或批次進料製程操 作’因為其可最直接操作及擴大規模，且該等製程原則上 適用於本發明方法。然而，基於灌注原則之連續製程越來 越普遍。於本發明之某些實施例中，於灌注系統中培養生 產者細胞。 分批、批次進料、灌注、及灌注製造製程曾採用pER C6 細胞，例如用於生產重組抗體。於分批培養時，通常獲得 活細胞濃度高於12xl06個細胞/nU。已多次證實可利用分 批進料使活細胞濃度高達4〇X 1 〇6個細胞/ml。於灌注製程 中’通常獲得之細胞濃度峰值高於150x1 〇6個細胞/mi(Kral 等人，2009)。 灌注培養細胞具有技術上之意義，亦即其意指在培養期 間，可利用分離裝置截留細胞，其中流出之液體中細胞密 度比分離前減少，並且有細胞培養基流入。灌注培養之用 法係因應高密度之細胞（例如10-50X 1 〇6個活細胞/ml)生長 之挑戰。爲了增加後度，以新鮮培養基恒定、或間期性置 換培養基，以補充缺失之營養素’並去除毒性產物。灌注 149522.doc -13- 201118173 法亦更能控制培養環境（pH、d〇2、營養素含量等）^可利 用多種分離裴置（例如細篩網旋轉過濾器⑴如mesh spin filter)、中空纖維或平板式薄膜濾器、沉降管）截留細胞， 以使新鮮培養基灌注進入培養物。於某些實施例中，分離 裝置為含有中空纖維之過濾模組，亦即管狀薄膜。管之内 位通 < 為0.3至6·〇 mm，例如〇 5至2 〇 。於某些實施例 中，所選擇之膜筛目（孔徑）使得篩網中之孔徑接近細胞直 ^ X確保同度截留細胞，且同時使細胞碎片可通過濾 周於八他實她例中，篩目顯著小於細胞直徑。篩目較佳 為0·1至30 μΐη，例如0.1至3 μιη，例如約〇·2 μηι。含有中空 纖維之過濾模組可購自例如General Electric(先前稱

Amersham)。 採用灌注法以使某些代謝產物維持在所需濃度，並去 除’藉此減少培養基中之雜f。於通常之情形中，並非於 。養之正個過程中進行灌注，而通常係按需要於培養期間 間不定時進行。例如，通常直至某些培養基組分（諸如葡 萄糖）開始耗盡且需要置換時才開始灌注。 此技術+已知有幾種灌注系統，原則上適用於本發明之 方法°術語「灌注系統」意指生物反應器與分離裝置相連 "*刀離裝置可併入生物反應器中（例如細篩網旋轉 、二Γ )或可保留在生物反應器外部（例如中空纖維）。於 兩種情形中，如上述，分離裝置阻止細胞團洗出反應器， =可更新培養基。於某些實施例中，生物反應器係與（連 ’口 ；）父替切向流（alternating tangential ; atf)灌注系 149522.doc •14- 201118173 統（例如 ATF System, Refine Technology，Co” East Hanover， NJ) —起工作。切向流可根據熟習此項技術者所知之方法 及例如US 6,544,424中所述獲得。ATF灌注系統之操作已 闡述，且可調整（Furey，2002)。ATF系統使得細胞可培養 更長時間’且達到高細胞密度而不會阻塞濾器。事實上， 採用ATF灌注系統，例如使用per.C6細胞，可獲得極高 細胞密度，超過1〇〇χ106個活細胞/ml(參見例如心丨丨叩等 人，2005及WO 2005/095578)。然而，於先前之報導中， 灌注系統中之PER.C6細胞係用於重組產生抗體，亦即目的 完全不同’且不感染小兒麻痒病毒。 於某些實施例中，於預培養時期（亦即感染小兒麻痒病 毒之前）宜利用例如ATF系統灌注，因為其可獲得極高細胞 密度，且該等細胞係於良好狀態下用於隨後$染小兒麻痒 病毒。爲了達到該等高細胞密度，於某些實施例中，在細 胞生長一部份時間，至少部份灌注培養基。於某些實施例 中，一旦細胞密度達約2χ106個活細胞/如至^⑺6個活細胞/ ml之間’即開始灌注。 於本心月方法中，以小兒麻痒病毒感染細胞。通常在允 許攝入病毒之最佳條件了，使病毒暴露於適宜生產細胞。 熟習此項技術者知曉如何找出最佳之其他條件，亦即授掉 條件、PH、溶解氧（d〇2或D〇)。通常，最佳授掉為在約5〇 至300 rpm之間，通常約10〇_2〇〇,例如約15〇，通常⑽為 ，最佳PH為在6.7至7_7之間。通常小兒麻痺病毒自 發感染本發明細胞’且細胞與小兒麻痺病毒顆粒接觸足以 149522.doc •15- 201118173 使細胞感染。通常向培養物添加小兒麻痺病毒接種物以起 始感染，且隨後於料細胞巾繁殖小絲痒病毒。 宜於咼細胞密度下（亦即約1〇><1〇6個細胞/mi)，以小兒麻 痒病毒感染根據本發明之細胞培養物，且可獲得極高小兒 麻碑病毒效價（高於1 〇 I〇 CCID5()/ml)。 於某些實施例中’於感染之前，細胞培養物之存活率保 持75〇/〇以上，其意指在感染時，培養物中細胞總數之至少 75%存活。於某些實施例中，感染時之細胞培養物之存活 率為至/ 80/〇 ’於其他實施例中為至少85%。可利用熟 習此項技術者可使用之常用方法敎存活率，例如錐蟲藍 排除法（trypan blue exclusi〇n)、Ca_ 胞計數等。 ;某二貝施例中’感染時之細胞密度為約1 〇x 1 〇6至 50x10個活細胞/w’例如約1〇χΐ〇6至，1〇6個活細胞，m!， 例如約 1 Ο X 1 〇6 至 1 5 X 1 、工 2 π , 0個活細胞/ml。該等細胞密度可獲得 ，的病毒產量’且限制細胞碎片與宿主細胞題八之累積 量：有利於該等實施例中’於下游處理所收集之小兒麻痺 病毒。因A，本發明提供—種製造小兒麻痒病毒之優化方 法’其產生向效價的小兒麻痒病毒，且同時使得所收集之 材料仍然可於下游製程中接受處理。 :八他實化例中’感染時之細胞密度為約1 5 X 106至 1 50X 106個細胞/ml，例如約15><1〇6至8〇χΐ〇6個細胞化丨，例 如、力20x10至5〇χΐ〇6個細胞/nU。於該等細胞密度下進行感 染可產生更高濃度之病毒。 於本發明之某些實施例中’提供一種大量產生效價為至 149522.doc -16· 201118173 少l〇10 CCID5〇/ml之小兒麻痒病毒之方法。 效價係以CCID5G表示，其係50%細胞培養物之感染劑 量°有時亦稱其為TCID5G (50%組織培養物之感染劑量）， 但是由於文中係利用細胞培養物測定，故於文中使用術語 ccid50 〇 使病毒與細胞接觸’以使得病毒感染該等細胞，並進行 繁殖。例如，向細胞培養物添加病毒接種物，並於溫和攪 拌下（例如約30 rpm)使其被細胞吸收，例如約30分鐘，隨 後再添加一些培養基，且若需要調節，可調節攪拌速 度’並維持培養。於感染步驟之後，發生病毒顆粒數量之 擴增。當然，較佳亦於沒有血清下，於懸浮培養之PEr.C6 細胞中進行該步驟，且更佳為在完全不含直接源自動物之 組分的條件下。可於例如規模為1至2〇,〇〇〇升（例如丨〇至 2000升，例如5〇至1〇〇〇升）之生物反應器中進行該步驟， 其規模很容易地調整，以滿足疫苗之要求。於某些實施例 中’生物反應器為單次使用生物反應器（SIJB)。 在細胞中繁殖小兒麻痺病毒之後，自細胞培養物收集病 毋或八，’·且刀其可藉由諸如熟習此項技術者已知之常用方 法進打。可藉由諸如離心術或超濾術之常用方法，自細胞 生物質中分離出所製造及釋放到細胞培養基中之病毒，並 自上清液中收集。於該種情形或過瀘即為收集步 驟。可使用常用方法收集病毒，例如彼等於US 4,525,349 中所述之方法。簡言之，通常藉由例如超㈣抽吸含有病 毒之液態培養懸浮液，過濾，並濃縮。例如，於培養結束 149522.doc -17- 201118173 時進行收集’其方法為收集含有病毒懸浮液之培養基。可 例如利用0.22 μπι濾網過濾收集物，並視需要貯存於4t： 下。 經過濾之收集物可視需要進行超濾，以濃縮病毒懸浮 液，且隨後例如根據於118 4,525,349或¥311\^261等人， 1978中所述之製程，例如藉由凝膠過濾術及/或離子交換 層析術純化小兒麻痒病毒。可視需要稀釋最終所得濃縮之 病毒懸浮液，且爲了製備IPV，可使用常用方法使其中之 小兒麻痺病毒不活化。 收集及純化小兒麻痒病毒或病毒組分、及自其製造疫苗 之方法已於相關技術中.使用數十年，且因此已熟知且已 詳細闡述於例*Van Wezel等人，1978 ; M〇ntagn〇n等人， 刪；WO 2007/007344;训4 525 349中所有文獻均係 以引用的方式併入文中。 小兒麻痒症疫苗係基於活的病毒或不活化病毒。其含有 小兒麻痺病毒D-抗原，其為重要之保護性抗原。可藉由桿 準病毒滴定技術測定病毒產量，且亦藉由熟習此項^術= 已熟知之常用技術（例如D_抗原EusA分析術）測定D抗原 濃度。可例如藉由動物之活體内測試法決定免疫原性。可 利，原ELISA，及藉由對獲自過去曾接受免疫接種之 乳的血/月進行小兒麻痺病毒中和細胞培養分析，測定效 制=常係於分開製程中培養各小兒麻痒病毒株，且若例如 3有二種類型之小兒麻瘁病毒的三價疫苗時，則混合 149522.doc 201118173 (不活化，用於濟）病毒，並調配用於製備個別劑量。於 某些實施例中’例如每—劑量（例如05 ml)之最終所得疫 苗可例如包含40 D·抗原單位㈣之i型小兒麻癉病毒、8 DU之2型小兒麻痺病毒及32 DU之3型小兒麻痺病毒，其係 以參考製劑為對照所測定。 八 可根據相關技術中已知之方法’例如利用福馬林或利用 P-丙内自旨（BPL)(參見例如Jiang等人，1986)使小兒麻痒病 毒不活化。於某些實施例中，例如藉由以下方法，利用福 馬林進行不活化：使純化之病毒懸浮液經過㈣_薄膜 過濾，於穩定磁力下攪拌24小時，並加熱至3Γ(：，隨後添 加甲酸溶液，使濃度為4，_分之一。於頭四天，保持^ 毒懸浮液處於37Τ：下，且同時繼續進行磁力攪拌。於第六 天，使病毒懸浮液經過0.22微米薄膜過濾，懸浮液處於37 °C之下，繼續進行不活化，直至第十二天。均質化經不活 化之病毒懸浮液，並可貯存於例如4 t下。於該步驟之 後，可例如藉由混合所需之製備物，製得用於投與之經濃 縮及/或最終所得之批次。 於某些實施例中，將純化後之小兒麻痺病毒或病毒組分 調配成醫藥組合物。可根據熟習此項技術者所熟知之常用 方法，利用多種緩衝液，並採用多種方法進行調配。通 常，其要求使小兒麻痺病毒顆粒形成醫藥上可接受之組合 物’該組合物包括小兒麻痹病毒、及至少一種醫藥上可接 受之赋形劑。可於熟習此項技術者已知之條件下製備該組 合物，且於某些實施例中，其適於向人類投與。於某些實 149522.doc •19- Β 201118173 細例中’組合物可包括經緩衝之培養基，其可視需要為 Medium M-199培養基’其係用作某些已註冊之常用不活 化j兒麻痺病毒疫苗之調配緩衝液。此外，可使用磷酸鹽 緩衝生理鹽水’且最終所得之藥劑調配物可包含例如每劑 0.5% 2-笨氧乙醇及最多〇 〇2%曱醛作為抗微生物防腐劑。 醫藥上可接受之載劑或賦形劑及稀釋劑已於相關技術中 熟知，且廣泛應用於多種治療用產品中。較佳採用可於疫 苗中良好發揮作用之載劑。於某些實施例中，疫苗另外包 括佐劑，例如明礬。於相關技術中已知佐劑可進一步增加 針對所使用之抗原決定子的免疫反應。 爲了向人類投與，本發明可使用含有小兒麻痺病毒及醫 藥上可接受之載劑或賦形劑之醫藥組合物。於本發明全文 中，術s吾「醫藥上可接受」意指於所採用之劑量及濃度下 之載劑或賦形劑不會在接受投與之受檢者中導致不需要或 有害之反應。該等醫藥上可接受之載劑及賦形劑係相關技 術中已熟知（參見 Remington，s Pharmaceutical Sciences ’ 第 18 版，A. R. Gennar〇，Ed，Mack publishing c〇mpa叩 [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins，S. Frokjaer及 L. Hovgaard編輯，Taylor &

Francis [2000];及醫藥上可接受之賦形劑手冊（Handb〇〇k of Pharmaceutical Excipients)，第 3 版，A. Kibbe編輯，

Pharmaceutical出版社[2000])。經純化之不活化小兒麻痒 病毒或其具免疫原性之部份較佳係調配成無菌溶液投與。 藉由無菌過遽'術或藉由相關技術中已知之其他方法製備無 149522.doc •20· 201118173 菌溶液。隨後來乾溶液或填裝入醫藥藥劑容器中。溶液之 PH通常為阳3.0至9.5,例如pH5〇至75。小兒麻痒病毒 或其具免疫原性之部份通常處於含有適宜之醫藥上可接受 之緩衝液的溶液中’且小兒麻痺病毒溶液亦可含有鹽。視 需要存在諸如白蛋白之穩定劑。於某些實施例中，添加清 潔劑。於某些實施例中，可將疫苗調配成注射用製劑。該 等調配物含有有效數量之小兒麻痺病毒或其具免疫原性之 部份，且為無菌液態溶液、液態懸浮液或為凍乾形式，且 視需要含有穩定劑或賦形劑。 小兒麻痺症疫苗可為單價（含有一種類型之小兒麻痺病 毋（1、2或3型）、或雙價（含有兩種類型之小兒麻痺病毒， 例如1及2型、1及3型或2及3型）、或三價（含有三種類型之 小兒麻痒病毒，亦即1、2及3型）。 可自野生型小兒麻痺病毒生產IPV。或者，可自無毒性 之活小兒麻痺病毒’例如自沙賓病毒株製得IPV，該等病 毒可進一步降低自IPV製造再次引入野生型小兒麻痒病毒 之風險（參見例如WO 2007/007344及Doi等人，2001)。本 發明適於製造野生型小兒麻痺病毒（丨、2及3型，例如1型 病毒株Mahoney、2型病毒株MEF、或3型病毒株Saukett)、 - 及無毒性類型之小兒麻痒病毒（例如沙賓病毒株）。本發明 因此可用於製造用於IPV、及用於OPV之小兒麻痒病毒。 用於生產IPV之根據本發明之方法可使得成本降低至較低 度開發及最低度開發之國家可負擔IPV之程度。雖然，根 據通常之方法所製得之OPV通常比IPV廉價，但本發明之 149522.doc 21 $ 201118173 極高效方法仍可進一步降低用於〇PV之原料成本’且因此 亦降低OPV之成本。 可根據相關技術中已知之方法’例如經肌内、經皮内、 或經口投與小兒麻痒症疫苗。 根據本發明可獲得之小兒麻痺病毒疫苗可用作獨立疫苗 (stand-alone vaccine)，但於其他實施例中可與其他疫苗以 常用方式組合，例如呈抗白喉病、百日咳、破傷風與小兒 麻痺症之組合疫苗之形式，且可視需要包含其他疫苗組 分’例如抗B型肝炎及/或流行性感冒嗜血桿菌 (heam〇philus influenzae)等之組分。因此，小兒麻库病毒 適用於擴大免疫計畫（expanded program 〇n immunizati〇n ; EPI)且可與该計畫中之疫苗組合。類似於常用之小兒麻 痺病毒疫苗，根據本發明之疫苗可呈單劑提供，或較佳於 初免-加強療程中提供，其中間隔適宜時間投與多劑量之 疫苗，例如間隔1-2個月注射兩次，隨後於6_12個月之後加 強；或例如首先經口投藥，隨後於約8週之後進行第二次 技樂，且於第二次投藥之後8_】2個月第三次投藥；或者例 如對於嬰兒’於6_12週齡時第一次經口投藥，隨後於第一 -人，與之後約8週第二次投藥，且於約6_18月齡時第三次 杈藥，或者例如對於先前曾接受免疫接種且正處於增加之 風險中之個體僅單次投藥等。可根據標準醫學操作確定較 又’、式’且其通常係與現有之小兒麻痺病毒疫苗於 藥方式相同。 又 下列實例將進一步闡釋本發明。該等實例不以任何方式 149522.doc •22- 201118173 限制本發明。其僅供闡述本發明。 實例 實例1 :小兒麻痺病毒之於固著PER.C6細胞中之有效生產法 為測試小兒麻痒病毒於固著PER.C6細胞中之繁殖，並產 生病毒儲備物’自SBL(瑞典）獲得1型小兒麻痺病毒 (Bmnenders)、2型（MEF-1)及 3 型（Sauckett)。於非洲綠猴腎 細胞中製得之各該等儲備物之效價均為約1〇6 CCID5Q/ml。 PER.C6細胞（Fallaux等人，1998)係生長於培養基（含有1〇% FBS及10 mM MgCl2之DMEM)中。於三個丁175燒瓶中，依 每個燒瓶3〇xl〇6個PER.C6細胞，接種細胞至25 ml培養基 中，次曰，依感染倍率CCID5〇/個細。胞）， 於潮濕培養箱中，於37t及10% c〇2下分別接種各類型之 小兒麻痺病毒。三天之後，收集細胞及培養基’且藉由兩 次凍/融循環製得粗製溶胞產物。藉由離心去除細胞碎片 之後，取上清液分成等份，並貯存於_8〇。〇下。作為平行 處理，於含於T175燒瓶之25 ml非洲綠猴腎細胞培養基（補 充4 mM L-麩胺酸之〇ptipr〇 SFM培養基）中接種6 25χΐ〇6個 非洲綠崎細胞’並依相同画感染各小兒麻痺病毒株。 亦於三天之後收集非洲綠猴腎細胞培養物’凍/融兩次， 並等份貯存。 隨後利用非洲綠猴腎細胞，藉由CCID5〇分析法定量小兒 麻痒病毒產量。因此，於96孔分析板各孔之1〇〇 μΐ培養基 中接種1·25χ104個非洲綠猴腎細胞，並於3?β(：及5% c〇2下 培養。次日’於㈣、綠猴腎細胞培養基中製備小兒麻痒病 149522.doc •23- 201118173 毒樣本的15個五倍稀釋系列，並各取1〇〇卜丨第5至15號稀釋 液添加至96孔分析板中之第1至丨丨行，八個重複。第丨之行 用作未受感染之對照行。七天之後，分析各孔中出現之細 胞病變效應（CPE) ’並利用如下Spearman-Karber方法計管 效價： 終點效價（logiohXo-dU+d/i^EXj 其中X。為當所有接種物仍然呈陽性時之最高稀釋倍數的 logiG值，d為所採用之稀釋倍數之i〇giG值，n為各稀釋倍數 下之重複次數，且ΣΧι為呈陽性之孔（包括稀釋度X。）之總 數。 效4貝貫驗之結果出示於圖1中’且其顯示，於固著 PER.C6細胞上’ 1型小兒麻痺病毒之效價比非洲綠猴腎細 胞時之效價高5倍以上，且2型及3之效價比非洲綠猴腎細 胞時之效價高10倍以上。由於接種較多PER C6細胞，因此 認為每個細胞之病毒顆粒的產量差異較小。PER.C6及非洲 綠猴腎細胞之細胞單層之匯合度皆估計為〜8〇0/〇。 自該等實驗，吾人得出如下結論：於固著單層PER工6細 胞上之小兒麻痒病毒產量至少與非洲綠猴腎細胞一樣好。 實例2 :小兒麻癉病毒於懸浮pER C6細胞中之有效生產法 為研究小兒麻瘁病毒於懸浮PER.C6細胞中之繁殖，進行 小規模實驗以測試不同培養基、感染倍率（Μ〇Ι)&收集時 間（ΤΟΗ)。因此，於如下三種不同培養基中培養pERC^_ 胞：AEM(Invitrogen)、BMIVg(以商品名 PermexcisTM購自 Lonza)、及 CDM4PERMAb(Hyclone)。於感染當天，於震 149522.doc •24· 201118173 盪臺（shaking platform)上之含濕氣培育箱中，於37。(：下， 計算一種類型培養基中所培養之細胞數，且依不同細胞密 度（1.5、2.5、3.5或5百萬個細胞/ml)再接種於相同類型之 培養基中，並依不同ΜΟΙ(0·01、0.05或0.1 CCID50/個細胞） 感染病毒。震盪臺（IKA KS 260)之軌道直徑為1 〇 rnm，且 對於填裝15-20 ml培養基之125或250 ml震盪燒瓶，於1〇〇 rpm下使用。對於AEM培養基，依1,5或2.5百萬個細胞/ml 接種細胞，此係因為AEM不能承受更高之細胞密度。依此 方式，製得多種培養物，並於感染之後之2、3或4天收 集。所有樣本均束/融兩次，並貯存於_2〇。(3或更低之溫度 下’直至進一步分析。 圖2說明於第二天及第四天時，該等樣本之效價測定結 果（第二天之數據未顯示）。於三種培養基中生長並受感染 之PER.C6細胞均能夠製造高效價i型小兒麻痺病毒，雖然 BMIVg培養基之效價比pERMAb及AEM培養基相對較低。 此外’培養更長時間並不導致效價更高。相反，於大多數 情形t ’第二天之收集物之效價比第三天及第四天之收集 物高。於該實驗中不能觀察到M0I變化之一致效應。重要 的是’感染時採用較高細胞密度確實提高單位體積效價， 其說明採用高細胞密度之懸浮培養製程有利於產生具感染 性之小兒麻痒病毒。 於下一個貫驗中，在所有三種小兒麻痒病毒株中，比較 收集時間及感染期間之溫度。因此，於震盪燒瓶中，依 2.5xl〇6個細胞/ml接種pER C6細胞至15以體積之aem培養 149522.doc -25- 201118173 基中’並依MOI為0.1，於37°C及於3 5°C下感染各小兒麻痺 病毒株。於感染之後2、3及4天收集細胞及培養基，並如 上所述進行處理。如上所述藉由測定CCID5〇值來分析不同 條件下之病毒產量，且顯示，對於所有三種類型之小兒麻 痺病毒，於35 °C下之產量高於3 7。(：（圖3)。此外，已證實， 於大多數情形下，當於第二天採集收集物時，可測得最高 之效價，2型及3型小兒麻痺病毒亦如此。 實驗3 :於較高細胞密度下，於懸浮PER.C6細胞中之小兒 麻痺病毒之產量增加 為研究進一步增加細胞密度是否會增加病毒效價，故比 較2.5xl06個細胞/ml與i〇xi〇6個細胞/ml下之產量。因此， 於震盪燒瓶中，依指定細胞密度，接種PER.C6細胞至1 5 ml體積之PERMAb培養基中，並感染2 CCID50/個細胞之1 型小兒麻痒病毒，並進行三重複。於24及48小時之後，收 集細胞及培養基，並藉由如上所述之康/融及離心術術製 得澄清之溶胞產物。除了先前測試之溫度35及37°C之外， 亦於33°C下進行實驗。 藉由CCID50分析法（圖4)分析效價，且證實，當細胞於 密度為ΙΟχΙΟ6個細胞/ml下受感染時’產量高於當於 2.5x1 〇6個細胞/^1下受感染時。於不同細胞密度或收集日 期下，均於35°C下獲得最佳效價。此外’對於於PER.C6細 胞上之小兒麻痺病毒的有效繁殖量而言’該實驗顯示，亦 可於24小時之後採集收集物，因為24小時與48小時之樣本 中之產量非常相當。 H9522.doc •26- 201118173 於下一個實驗中，針對其他類型之小兒麻痒病毒測試該 等條件。依10X106個細胞/ml接種PERC6細胞至PERMAb培 養基中’並於震盪燒瓶中，於35〇C下，依2 CCID50/個細 胞感染不同小兒麻痒病毒儲備物，並進行三重複。於24及 48小時之後進行收集’並如上所述處理細胞及培養基，獲 得澄清之溶胞產物。藉由CCID5G分析法測定效價，結果顯 不採用高細胞密度亦導致2型及3病毒之高產量（圖5)。 該實驗清楚顯示’懸浮PEr.C6細胞之高密度培養物提供 製造野生型小兒麻痒病毒極佳平臺。由於可利用生物反應 器系統、波動袋（wave bags)或其他類型之可擴大規模之培 養系統增加PER.C6細胞之細胞密度及培養物之尺寸/體 積’因此相較於當前利用非洲綠猴腎細胞培養物之微載體 系統’可顯著改善小兒麻殫病毒之生產。 所製得之小兒麻痒病毒係根據此技術中已知且用於非洲 綠猴腎細胞上繁殖之小兒麻痒病毒之方法收集及純化，根 據已知方法由福馬林不活化，且隨後根據此技術中周知之 方法利用標準大鼠免疫原性分析法測試免疫原性（例如 BevilaCqUa等人，1996)。預期由此製得之小兒麻痺病毒的 免疫原性與利用非洲綠猴腎細胞之常用方法所製得之小兒 麻痒病毒相當。 實例4 :於生物反應器中於PEr.C6細胞中製造小兒麻踔病毒 細胞自PER.C6工作細胞庫解凍，並於含濕氣培養箱中於 37 C及10% c〇2下於無血清培養基中繁殖。每隔3至4天進 行繼代培養，直至達到充分細胞密度，以細胞密度〇 2_ S- 149522.doc -27- 201118173 0.4χ106個細胞/ml接種2 L生物反應器。細胞於2 L生物反 應器中’於37°C ’ DO 40%，及pH 7.3下繁殖。當細胞密度 達到約2x106個細胞/ml時（接種後第四天），開始ATF系統， 以使細胞可培養更長時間並達到高細胞密度。於約11至12 天之後，2 L生物反應器中之細胞密度達到50χΙΟ6個細胞/ ml以上。此時’將細胞懸浮液轉移至1〇 L生物反應器。2 L 生物反應器之細胞懸浮液以無血清培養基1:5稀釋。10 L生 物反應器中之細胞密度為在1 〇至15 X106個細胞/ml之間。 隨後，以小兒麻痒病毒種儲備物感染10 L生物反應器， MOI為 2 CCID5Q/個細胞。於 35°C，pH 7.3及 DO 40%下，製 造小兒麻痒病毒。於某些時間點對1 〇 L生物反應器採樣， 用於細胞計數及小兒麻痒病毒產量，並適宜於感染後12至

I 48小時之間收集小兒麻痺病毒。 參考文獻

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Claims (1)

1. 201118173 七、申請專利範圍： 1. 一種製造小兒麻痒病毒之方法，其包含如下步驟： a) 提供一種無血清懸浮PER.C6細胞培養物， b) 以小兒麻痺病毒感染該等細胞’細胞密度在2χ 106 個細胞/ml至15〇χ106個細胞/ml之間，及 e)於感染後12至48小時之間收集小兒麻痒病毒。 2·如請求項1之方法，其中於34t：至361間之溫度進行該 感染及/或病毒繁殖。 3.如請求項1或2之方法，其中於細胞密度在5xl〇6個細胞/ ml至2〇χΐ〇6個細胞/ml之間進行該感染。 4-如請求項1或2之方法，其中於細胞密度約1〇χ1〇6個細胞/ ml進行該感染。 5. 如請求項1或2之方法，其中於感染倍率（“⑴丨在工至]之 間’例如約2，進行該感染。 6. 如請求項1或2之方法，其中於感染後18至3〇小時之間， 例如於感染後約24小時，收集小兒麻痺病毒。 7. 如請求項…之方法，其中該小兒麻痒病毒為ι型小兒 麻痺病毒、2型小兒麻痺病毒或3型小兒麻痒病毒。 8. =項7之方法，其'該小兒麻痒病毒為1型小兒麻痒 病t株Mah〇ney、2型小兒麻痺病毒株ΜΕρ、或3 麻痒病毒株Saukett。 9’如凊求項7之方法，其中該小兒麻 痖在主吨，一 卿甘馬減毒小兒麻 厗病，，诸如沙賓（Sabin)病毒株。 10. —種生產小兒麻痒疫苗之方 匕3如凊求項1或2之方 S 149522.doc 201118173 11. 12. 13. 14. 15. 法’其進一步包含純化，視需要不活化，及調配 之小兒麻痺病毒，以獲得小兒麻痺疫苗。 如清求項3之方法’其中於感染後18至3〇小時之門 如於感染後約24小時，收集小兒麻痺病毒。 …列 ^項3之；Π ’其中該小兒麻痒病毒為1型小兒麻痒 ’毋2型小兒料病毒或3型小兒麻痺病毒。 「種生產小兒麻殫疫苗之方& ’包含如請求項3之方 法’其進一步包含純化，視需 仇兩要不活化，及調配所收 之小兒麻痒財，以€得]、兒麻痺疫肖。 ” 一種生產小兒麻痒疫苗之方》’包含如請求項6之方 法’其進-步包含純化’視需要不活化，及調配所收集 之小兒麻痺病毒，以獲得小兒麻痺疫苗。 -種生產小兒麻痒疫苗之方法，包含如請求項7之方 法’其進-步包含純化’視需要不活化，及調配所收集 之小兒麻痒病毒，以獲得小兒麻痺疫苗。 149522.doc