200926960 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種用於真姬離褶傘（LyophyUum Shime⑴ 之菌床栽培的真姬離褶傘之菌床培養物。 【先前技術】 • 真姬離褶傘係10月中旬生長在抱櫟林或者抱櫟、赤松混 ' 生林之地面上的蘑菇’正如日本俗語「香莫如松茸，味莫 如離褶傘」所述，在日本，真姬離褶傘與松茸在食用蘑菇 © 中並稱為最高級蘑益。近年來，針對金針益、飽魚兹、滑 兹、鴻喜益、舞益等食用㈣，確立了主要使用將鑛^ 米糠、麥趄等營養源混合而成之培養基進行人工栽培的菌 床栽培s法，現可在整年中不論季節地穩定收獲磨菇。真 :㈣褶伞亦係極其美味之㈣，故而業界謀求確立人工栽 培方法，但上述金針益等為木腐菌，而真姬離褶傘為菌根 菌，因此難以實施人工菌床栽培。 ❹ 滋賀縣森林中心之太田先生首次成功進行了該真姬離褶 伞之人工菌床栽培。專利文獻1中揭示有使用麥類之真姬 離稽傘之菌床栽培方法，非專利文獻i中揭示有於使用麥 -類之培養基上生長真雜褶傘子實體的實驗。 - :’專利文獻2中揭示有利用以泥炭沼作為基材且添加 有炎粉等之培養基的菌根菌之菌絲培養方法，同發明者等 =專利文獻2中報告有於以泥炭沼作為基材且添加有殿 曰，培養基上生長真姬離褶傘之子實體的實驗。 於專利文獻1之發明者等的方法中，由於用於培 135789.doc 200926960 養基之麥類價格較高，故而培養基之成本會提高。又於 專利文獻2之發明者等的方法中，所生長出之子實體的產 量較低，尚未達到商業生產水平。 近年來’已揭示有多種以真姬離褶傘之商業栽培為目的 t真姬離槽傘之栽培方法。專利文獻3中，揭示有以含有 泰亞科植物為特徵之真姬離褶伞的菌床栽培用培養基、及 使用該培養基的真姬離褶傘之栽培方法。又專利文獻4 中揭不有如下真姬離褶伞之菌床栽培方法，其特徵在於： 製備至少含有玉米粉與闊葉樹之鋸屑的混合培養基，於水 濕潤狀態之該混合培養基上接種真姬離褶傘之菌絲，於3〇 它以下之溫度下進行培養，藉此生長出子實體。 專利文獻5中揭示有如下真姬離褶傘之菌床栽培方法， 其特徵在於：於真姬離褶傘之栽培方法中，對於可藉由在 水濕潤狀態下接種真姬離褶傘之菌絲，進行培養而生長出 子實體的培養基，添加混合經粉碎之牡蠣殼，且將培養基 • 之pH值調節至不超過7的範圍内。 專利文獻6中揭示有如下真姬離褶傘之菌床栽培方法， 其特徵在於：使用於含有玉米及鋸屑之培養基中添加混合 少量麥類及/或米類而製備成的混合培養基作為培養基， 於水濕潤狀態之該混合培養基上接種真姬離褶傘，並進行 培養後，生長出子實體。 專利文獻1中，於該實施例中，係於23〇c下將真姬離褶 傘菌株培養70天後，將溫度降低i15°c，觀察是否形成子 實體原基。又，藉由利用泥炭覆蓋培養基表面來提高子實 135789.doc 200926960 體形成率。又’非專利文獻1中，於22 °C之培養步驟中菌 絲蔓延時’以厚度達到1 cm之方式在培養基上添加泥炭， 其後進而培養2週，培養結束後轉移至151之生長室中， 使子實體生長。 非專利文獻2中，於培養基上接種真姬離褶傘菌株後， 於23 C下對培養基進行培養、熟化。繼而，於i6°c之生長 室中進行生長操作，經過13〜15天後，可見形成子實體原 基。 專利文獻3中，作為瓶栽培方法而揭示有培養基製備、 裝瓶、殺菌、接種、培養、出芽、生長、收穫等各步驟， 於培養後之出芽步驟中形成子實體原基。又，於該實施例 中’出芽步驟係於被覆赤玉土之狀態下進行。 專利文獻4中，於該實施例中，係於23。〇下將真姬離褶 傘菌株培養60天後，利用鹿沼土被覆培養基上表面。進而 培養7天後，轉移至15 t之生長室内’促進子實體之生 長。 專利文獻5中，於該實施例中，係於23它 伞菌株栽培7。天後，轉移至15。。之生長室中。繼真而，= 長出小子實體時取下蓋+，於I其生長至子實體之傘打開 之階段進行收穫。 專利文獻6中，於該實施例中，係於23。〇下將真姬離褶 傘菌株培養55天後，利用鹿沼土被覆培養基上表面，進而 培養10天後，轉移至15°C之生長室内，促進子實體之生 長。 135789.doc 200926960 [專利文獻1]曰本專利特開平07-115844號公報 [專利文獻2]曰本專利特開平〇6-153695號公報 [專利文獻3]曰本專利特開2000-106752號公報 [專利文獻4]日本專利特開2002-247917號公報 [專利文獻5]曰本專利特開2005-27585號公報 [專利文獻6]日本專利特開2007-54044號公報 [非專利文獻1]日本菌學會報，第39卷，第13〜20頁， 1998 年 [非專利文獻2]曰本菌學會報，第35卷，第192〜I%頁， 1994 年 【發明内容】 [發明所欲解決之問題] 本發明者等依據上述專利文獻3中所揭示之技術開始真 姬離褶傘之商業栽培’但進行大規模商業栽培時需要生產 之穩定化，從而期望進一步之技術開發。 即’鑒於上述現狀，本發明之目的在於提供一種於大規 模商業栽培中可穩定生產真姬離褶傘之菌床培養物及使用 該人工培養物之真姬離褶傘之菌床栽培方法。 [解決問題之技術手段] 本發明者等針對會影響真姬離褶傘菌床栽培之各種因素 進行栽培研究，而就對大規模商業栽培之影響進行潛心研 究。於使用液體種菌之蘑菇栽培中’於栽培用培養基上部 接種液體種菌時，就使該培養基之整個上部形成芽（幼子 實锻）之觀點而言，通常於該培養基上部之整個面上接種 135789.doc 200926960 液體種®。s而，本發明者等對適合於商業栽培之接種方 法進行潛心研究，結果驚奇地發現：藉由於栽培用培養基 上部接種液體種菌時，製作非接種部位，與先前相比，可 提向芽（幼子實體）之形成率，從而完成本發明。 若概述本發明，則本發明之第丨發明係關於一種真姬離 褶傘之菌床培養物，其特徵在於：其係接種液體種菌之真 姬離褶傘之菌床培養物者，且於栽培用培養基上部之菌座 上具有液體種菌接種部位及液體種菌非接種部位。 作為本發明之第丨發明的態樣，例示有瓶栽培用菌床培 養物。又，較好的態樣為液體種菌接種部位實質上為圓 形、橢圓形、圓環形或橢圓環形。更好的態樣係關於一種 於液體種菌接種部位接種〇.〇5〜5 mL/cm2之液體種菌的真 姬離褶傘之菌床培養物。又，作為栽培用培養基上部之菌 座上之液體種菌接種部位與液體種菌非接種部位的面積 比，並無特別限制，較好的是i:丨5〜5: J。 又，本發明之第2發明係關於一種真姬離褶傘之人工栽 培方法，其特徵在於：利用本發明之第丨發明之真姬離褶 傘之菌床培養物來使子實體生長。 根據本發明，亦可提供一種真姬離褶傘之液體種菌之接 種方法’其肖徵在於：在用於冑姬離稽傘之菌床栽培的栽 培用培養基上部之菌座上，形成液體種菌接種部位及液體 種菌非接種部位。該接種方法並無特別限制，較好的是對 填裝於栽培瓶中之栽培用培養基進行接種。又，對於液體 種菌接種部位並無特別限制，較好的是實質上為圓形、橢 I35789.doc -10 - 200926960 圓形、圓環形或橢圓環形。又，液體種菌之接種量並無特 別限制，對於液體種菌接種部位而言較好的是0.05〜5 mL/cm2。又，作為菌座上之液體種菌接種部位與液體種菌 非接種部位之面積比並無特別限制，較好的是1:15〜5:1。 [發明之效果] 根據本發明，可提供一種於大規模商業栽培中可穩定生 產真姬離褶傘之真姬離褶傘之菌床培養物、及使用該培養 物之真姬離褶傘之菌床栽培方法。 【實施方式】 以下，對本發明進行具體說明。 於本說明書中，真姬離褶傘係指在分類學上被分類為 Lyophyllum shimeji者。 本發明所使用之真姬離褶傘的菌株可選擇人工栽培者， 並無特別限制，可例示公知之真姬離褶傘菌株，例如： Lyophyllum shimeji La 01-27(FERM BP-10960) ' Lyophyllum shimeji La 01-20(FERM BP-10959) > Lyophyllum shimeji La 01-37(FERM P-17456) ' Lyophyllum shimeji La 01-45(FERM P-17457) > Lyophyllum shimeji La 〇l-46(FERM P-17458)及適合栽培的該等之變異株。 於本發明中，「菌座」係指栽培用培養基上部之表面部 位，由接種液體種菌之液體種菌接種部位、及不接種液體 種菌之液體種菌非接種部位所形成。 本發明之所謂真姬離褶傘之栽培方法，若為以使用真姬 離褶傘之菌床培養物進行栽培為特徵者，則並無特別限 135789.doc 200926960 制，可應用瓶栽培、袋栽培、箱栽培等菌床栽培方法，該 真姬離褶傘之菌床培養物之特徵在於，其係接種液體種菌 之真姬離褶傘之菌床培養物，且於栽培用培養基上部之菌 座上具有液體種菌接種部位及液體種菌非接種部位。藉由 使用該培養物之菌床栽培，可使真姬離褶傘之芽（幼子實 體）形成率提高到預料之外的水準，於大規模商業栽培時 • 真姬離褶傘之生產極為穩定》 以下，作為一例對瓶栽培之本發明之真姬離褶傘之菌床 栽培方法進行說明，此方法包括：培養基製備、裝瓶、殺 菌、接種、培養、原基形成、出芽（幼子實體之形成及生 長）、視需要挑選芽（幼子實體）、由幼子實體生長為成熟子 實體收穫成熟子實體等各步驟。其次，對該等進行具體 說明’但本發明並不限定於該說明内容^ 所明「培養基製備」，係指稱量用於菌床栽培之各種基 材，加以攪拌，加入水，再進行水分調整，以達到適合真 ❹ 姬離褶傘之菌床栽培的水濕潤狀態的步驟《本發明所使用 之真姬離褶傘之菌床栽培用培養基並無限制，為可用於栽 培者即可’較好的是玉米類與鋸屑之組合。作為鋸屑可 使用源自闊葉樹或源自針葉樹中之任一個的鋸屑，較好地 可例不源自針葉樹之鋸屑，例如源自杉樹之鋸屑（杉木 屑）。再者’於本案說明書中，作為玉米類，若為含有玉 米粒者則無特別限制’例如可例示：新鮮玉米粒、乾燥玉 米粒、粉碎物、壓片物、加熱壓片物。 以加熱壓片玉米與源自杉之鋸屑（杉木屑）之情形作為例 135789.doc 12 200926960 子，對玉米類與源自針葉樹之鑛屬的混合比率進行說明。 玉：類與源自針葉樹之雜廣的混合比率，為可進=離 ::::::比率即可™—言加熱 卷某φ 下限以其乾燥重量比計’於菌床栽培用培 中占桃以上，較好的是50%以上，更好的是6〇%以 。若未滿侧，則所獲得之真姬離縣之產量會顯著降 低，故而不佳。又，+ u 由於加熱壓片玉米之吸水性較低，故 ❹ 而：其於菌床栽培用培養基中之含量過高，則菌床栽培用 培養基之水分保持力會下降’水分會滯留在培養瓶下部， 故結果導致菌蔓延不良。即，加熱壓片玉米含量之上限以 其乾燥重量比計’於菌床栽培用培養基中占8〇%以下較 好的是75%以下，更好的是7〇%以下。 又’關於菌床栽培用培養基之水分含量，亦以加熱壓片 玉米與杉木屑之情形進行說明。根據從業者之常識，菌床 栽培用培養基之水分含量較好的是調整為水分不會滯留在 培養瓶下部之程度。水分含量並無特別限制，例如為68重 量％以下，較好的是66重量％以下。其中，於水分含量超 過64重量％時，存在培養基中之空隙減少而引起菌蔓延不 良之情形’故而會導致所獲得之子實體之產量及品質下 降。因此’更好的是將水分含量調整為64重量％以下。再 者’於水分含量過低時’由於培養基之乾燥等之影響亦會 引起菌蔓延不良或子實體之畸形、生長不良。_，較好的 是將水分含量調整為50重量％以上’更好的是調整為^重 量％以上。關於該等水分含量，可視經過水分調整之培養 135789.doc -13- 200926960 基性狀而適當設定。 所謂「裝瓶」，係指將菌床栽培用培養基裝入瓶中的步 驟。具體而言，通常係指如下步驟：將所製備之菌床栽培 用培養基裝入容量為400〜2300 mL之瓶栽培用耐熱性廣口 培養瓶中’例如於容量為丨100 mL之瓶時，係填裝入 550〜900 g，較好的是6〇〇〜85〇g，更好的是65〇〜75〇g，並 且於所填裝之菌床栽培用培養基上打丨個或多個口徑為丨〜3 cm左右之孔，並塞上塞子。藉由在菌座中心部打口徑為 1·5 2.0 cm之孔，並於其周圍打口徑為1 〇111之4個孔，可更 好地培養真姬離褶傘。 所謂「殺菌」，為可殺滅培養基中之全部微生物的步驟 即可。通常，利用蒸汽之常壓殺菌係於98〜1〇(rc下進行 4〜12小時，而高壓殺菌係於1〇1〜125〇c、較好的是118它下 進行30〜90分鐘。於本發明中，有時將如此而製造之培養 基稱為栽培用培養基。 所謂「接種」’係指將種菌移植至殺菌後放置冷卻之培 養基上的步驟。於本發明中，係使用利用液體培養基培養 真姬離褶傘菌絲而成之液體種菌作為種菌。通常，作為用 於製造液體種菌之培養基，並無特別限制，可例示：以葡 萄糖、蛋白脒、酵母萃取物為主成分，且添加有 KH2P〇4、MgS04/7H2〇等之PGY液體培養基或1/2 PGY液體 培養基；或以葡萄糖、酵母萃取物為主成分之GY培養 基、1/2GY培養基等。亦可將於該培養基上接種真姬離褶 伞菌絲’並於例如25°C下培養1〇〜15天而獲得者用作液體 135789.doc -14- 200926960 種菌。液體種菌之培養可使用燒瓶或缸式撥酵槽等來實 施。於培養用以進行大規模栽培之液體種菌時，就容量更 大且可縮短培養天數之觀點而言，較好的是缸式醱酵槽。 作為於栽培用培養基上接種種菌時所使用之液體種菌的菌 體濃度，並無特別限定，以乾燥菌體濃度計，可例示 〇·1〜10 g/L，較好的是1〜7 g/L，特別好的是2〜5 g/L。 液體種菌係以形成液體種菌接種部位及液體種菌非接種 部位之方式，例如向每1瓶為11〇〇 mL之廣口培養瓶中，於 無菌環境下移植例如約5~30 mL。再者，於本案說明書 中’液體種菌接種部位係指接種上述液體種菌之區域，即 直接接種液體種菌的菌座上之區域。於本案說明書中，液 趙種菌非接種部位係指接種上述液體種菌之部位以外的區 域’即未接種液體種菌的菌座上之區域。作為液體種菌接 種部位之形狀’若為可於栽培用培養基上部之菌座上形成 液體種菌接種部位及液體種菌非接種部位者，則並無特別 限定。液體種菌接種部位之形狀，較好地可例示小於栽培 用培養基上部之菌座面積實質上為圓形、橢圓形或多邊形 的形狀。液體種菌接種部位之形狀較好的是園形、橢圓 形，更好的是將圓形或橢圓形之中央部作為液體種菌非接 種部位之圓環形。又，該等液體種菌接種部位亦可為其中 心與瓶口徑之中心軸一致者、或與瓶口徑之中心轴偏移者 中之任一者。又，液體種菌接種部位亦可與瓶邊緣部接 觸。又，作為菌座之液體種菌接種部位與液體種菌非接種 部位之面積比，為芽形成率高於通常之種菌接種即可。液 I35789.doc -15· 200926960 體種菌接種部位與液體種菌非接種部位之面積比並 限定，較好的是1:15〜5:1，更好的是1:5〜4:1，更好、的是 1:3 〜3:1。 作為接種於栽培用培養基上之液體種菌量並無特別限 定，對於液體種菌接種部位，較好的是〇 〇5〜5 〇 / 更好的是G,1〜l.G mL/em2，更好的是75⑷一。 • X，作為接種於栽培用培養基上之菌體量並無特別限 定，對於液體種菌接種部位，以乾燥重量換算，趟杯沾β β o.—w，更好的是一gw，更好的= nig/cin2 〇 又，作為液體種菌之接種方法，若可較好地形成液體種 菌接種部位及液體種菌非接種部位，則並無特別限定可 使用公知之液體種菌接種機來實施接種。再者，於本案說 明書中，將該接種步驟以後之培養物稱作本發明之培養 物。 φ 所謂「培養」，係指對接種有種菌之培養基進行培養的 步驟，係使菌絲伸長及蔓延、成熟。通常，於溫度2〇〜25 °C、濕度50〜80%下，於接種有種菌之菌床栽培用培養基 上使菌絲蔓延，進而使其成熟。培養步驟可根據培養基之 容量進行適當設定，於採用1100 mL之瓶栽培時，通常進 行80〜12〇天、較好的是進行1〇〇天左右。培養步驟可分為 培養前期步驟及培養後期步驟而進行步驟管理，亦可於菌 絲伸長旺盛之培養後期稍稍降低溫度而進行管理。前期培 養步驟在75~85天結束，後期培養步驟在25〜35天結束。 135789.doc • 16 - 200926960 所謂原基形成」，係指使真姬離褶傘之子實體原基形 成的步驟。於培養步驟結束後，將培養物轉移至1 9〜22 C、較好的是20。(：左右、濕度6〇〜80%、照明度1000勒克 司以下的照明環境下，取下瓶的蓋子而使子實體原基形成 即可。原基形成步驟需要1〇〜2〇天。又，於上述培養後期 步驟中’例如亦可藉由進行累計照明度為2〇勒克司小時 (Lux hour)以上之光照射等’而於菌座上形成子實體原 基。 所謂「出芽」’係指由子實體原基形成芽（幼子實體：由 子實體原基所分化之原基的前端部形成灰白色菌傘之狀 態）、及/或促進芽（幼子實體）之生長的步驟。出芽步驟， 通常於10〜20°C、較好的是15。〇左右，濕度8〇%以上，照 明度1000勒克司以下的照明下進行5〜1 5天。 於出芽步驟中’容易因加濕而產生露水，因此為了防止 漂濕’可用有孔聚乙烯片材或瓦楞板等覆蓋菌床面，或將 培養槪反轉而進行培養。又，為了促進幼子實體之生長， 亦可視需要以適當之覆土材料覆蓋菌床面。 所謂「由幼子實體生長為成熟子實體」，係指通常在除 照明度為2000勒克司以下之外與出芽步驟大致相同的條件 下進行5〜15天的步驟。由幼子實體生長為成熟子實體之步 驟中’由於不易受到由露水所引起之濡濕的影響，故較好 的是不覆蓋有孔聚乙烯片材或瓦楞板等。 於本案說明書中’濕度超過100%之高加濕條件係指加 濕至飽和水蒸 >飞量以上且水以霧之形式漂浮的狀態。於本 135789.doc 17 200926960 案說明書中，為了將如此高加濕狀態數值化，而使用（股） 鷺呂製作所製造之裝置（商品名：Humid Eye 100)進行測 定°該裝置係使用下述方法：藉由加熱使空氣中之水分減 ^ 利用濕度感測器進行檢測後，再對因加熱而降低之部 分進行修正。因此’本裝置所顯示之數值若為1 〇〇%以下 則與相對濕度相同’若超過1 〇〇0/。則成為將空氣中所包含 之水分量換算為水蒸汽而以與飽和水蒸汽量之比值表示的 數值。再者，加濕亦可使用超音波加濕器、蒸汽式加濕 器、喷霧式加濕器等加濕器。 由幼子實體生長為成熟子實體之生長步驟中，在上述出 芽步驟後，將菌座中心部之芽（幼子實體）以外的芽、即菌 座之外邊緣（瓶邊緣部）的芽摘除，進行生長步驟，藉此可 穩定地於瓶的中心部獲得株化（生長多個）成熟子實體。再 者將菌座中〜之芽以外的芽摘除時可沿瓶邊緣部進 行機械摘除。藉由於該等處理後進行生長，可高效地生長 出株化成熟子實體。 又，所謂芽之挑選步驟，係指例如在上述出芽步驟、或 由幼子實體生長為成熟子實體之步驟的初期（至第5天），在 生長於菌座上之芽中選出欲使其生長為子實體的數個芽， 並將其他芽摘除的步驟。藉由進而進行芽之挑選步驟，可 獲得獨立之商品價值較高的真姬離褐伞大型子實體。再 者，於芽之挑選步驟中，亦可沿版邊緣部機械地摘除菌座 之外邊緣（瓶邊緣部）的芽，此時亦可視需要對形成於菌座 中央部之芽進行機械芽摘除。於該等處理後，進而對適合 135789.doc 200926960 於生長之子實體（幼子實體）以外的幼子實體進行芽摘除， 而對所剩餘之幼子實體進行挑選培養，藉此可高效地生長 出形狀良好之大型真姬離褶傘子實體。 進而’所謂插芽之分離及移植步驟，係指將例如由上述 :芽步驟中所獲得之幼子實體單獨分離出I，將其作為插 而移植至欲使子實體生長之培養基之任意位置上的步 藉由進而進行插芽之分離及移植步驟，可獲得單個獨
立之商品價值較高的真姬離褶傘大型子實體。作為移植插 芽之培養基，可為分離插芽時所使用之培養基（分離插芽 後之培養基)，亦可為與該培養基不同之另外製造的蘑菇 菌絲蔓延之培養基，例如培養步驟中之培養基、出芽步驟 中之培養基。 藉由以上步驟可獲得成熟子實體，進行收穫後，栽培之 全部步驟結束。以上，湘瓶栽培方法對本發明進行了說 明，但本發明係可應用於磨菇之菌床栽培者，並不限定於 上述瓶栽培。 根據本發明，可提供一種芽（幼子實體）形成率獲得提高 之真姬離褶傘之菌床培養物，及使用該養 伞之菌床栽培方法。即，藉由於菌座上形成二= 邛位及液體種菌非接種部位，而意外地亦可自液體種菌非 接種部位形成芽（幼子實體）。與在菌座整個面上形成芽且 在菌座個整面上接種種菌時相比，芽形成率更高。藉由本 發明可顯著地使幼子實體形成率變得穩定，且提高幼子實 體形成率，故而於真姬離褶傘之商業栽培時可進行穩定生 135789.doc 19· 200926960 產。又，可利用菌座中心部之芽數增多，來生產株化（多 個生長）真姬離褶傘。進而，於加入芽摘除步驟來生產大 型真姬離褶傘時，藉由本發明可於培養基菌座表面、尤其 是菌座中心部生長多個芽’藉此可在適合於形成子實體之 部位即菌座中央部附近穩定殘留芽。因此，極容易進行適 合於大型真姬離褶伞之生長的培養基菌座位置上之優良芽 之生長、挑選。又’藉由加入插芽步驟來生產大型真姬離 褶傘’可穩定地獲得大量優異之插芽。利用該等可提高產 率，且可進行穩定之真姬離褶傘子實體的栽培。 [實施例] 以下，藉由實施例更具體地說明本發明，但本發明並不 僅限於以下實施例之範圍。 實施例1 於100 mL之PGY液體培養基（組成：葡萄糖為2 〇0/〇 (w/v)、蛋白脒為〇.20/0 (w/v)、酵母萃取物為0.2% (w/v)、 KH2P〇4為 0.05% (w/v)、MgS04.7H20為 0.05% (w/v))上， 接種 Lyophyllum shimeji La 01-27 株（FERM P-17455)之菌 絲，於25C下振盪培養（loo吓爪广天。將培養物2 移植 至200 mL之相同培養基上，繼續振盪培養（1〇〇卬爪口天。 進而’將培養物之全部接種至加入有丨6〇 L之相同培養基 的容量為200 L之缸式酸酵槽（小松川製作所製造）中，進行 6天攪拌培養（攪拌速度：1〇〇 rpm，通氣量為25 L/分鐘）， 而製備液體種菌（乾燥菌體重量約4 g/L)。另一方面，以乾 物重量比為2:1 (壓片玉米：針葉樹鋸屑），將壓片玉米（飯 135789.doc -20· 200926960 阪精麥公司製造)與針葉樹鋸屑之杉木屑(巴物產有限公司) 混合，以培養基之水分最終達到62重量％之方式加入水， 充分進打攪拌、混合。將混合物分別填裝入每批次約5〇⑽ 個之聚丙稀製之廣π培養瓶⑴⑽mL)中（包含瓶及蓋子之 4量合計為8GG g)。於填裝物表面之中央開-個口徑為2.0 em之孔，且於以填裝物表面之中央為中心之直徑為4 cm的 . 81周上’均等地開4個口徑為！ cm之孔，料4個孔的深度 為1〇 左右，之後將培養瓶封蓋。對於封蓋之培養瓶， 於118°C下進行30分鐘高壓蒸汽殺菌，放置冷卻至2〇<t， 將所獲得者製備為菌床栽培用培養基（固體培養基）。於該 固體培養基上接種約12.5 mL之上述液體種菌如圖丨所 不，以接種部位與瓶口徑之中心軸偏移且成圓環形之方式 進行接種。於接種了液體種菌之固體培養基上，於溫度以 C、濕度為70〜75%之條件下將菌絲培養8〇天，使菌絲於 整個培養基上蔓延。將溫度降低〇rc，進而於累計照明 ❹ 度為20勒克司小時以上，繼續將菌絲培養30天。藉由合計 培養11〇天，而形成子實體原基。再者，圖丨係自上方觀察 於菌座上接種液體種菌之栽培瓶的圖。圖巾，A表示液體 -種菌接種部位，B&C表示液體種菌非接種部位。繼而， 除去蓋子，將栽培瓶反轉後，將培養瓶轉移至溫度為Μ 它、且以1^1„^(1丑”100(鷺宮製作所股份有限公司製造）之 表示值將加濕控制在115〜120%的出芽室中。於5〜3〇勒克 司之照明下，用10天進行使子實體原基生長為幼子實體之 出芽。其後，對每批次80個培養瓶進行隨機抽樣。測定由 135789.doc 200926960 培養基表面之子實體原基所生長出之芽（幼子實體）的數 量，計算其平均值。對1 〇個批次進行相同之測定，將其結 果示於表1。 [表1] 批次No. 每個培養瓶之平均芽(幼子實體)數量 070815 85 070816 74 070817 113 070820 95 070821 58 070822 78 070823 60 070824 125 070827 89 070828 71 平均埴 85 標準偏差 21.7 由表1可確認於培菌座上生長出較多芽。又，亦可知芽
之生長部位為菌座之整個面。 比較例1 除了於菌座整面上接種液體種菌（乾燥菌體重量約4 g/L)25 mL以外，以與實施例1相同之方式進行培養，並進 行出芽。其後，對每1批次80個培養瓶進行隨機抽樣，測 定由培養基表面之子實體原基所生長出之芽（幼子實體）的 數量，計算其平均值。對1 〇批次進行相同之測定，將其結 果示於表2。 [表2] 批次No· 每個培養瓶之平均芽(幼子實體)數量 070727 28 070730 22 070731 19 070801 35 135789.doc •22- 200926960
*---- U.JU_____ 由表2可知，比較例與實施例丨相比，於菌座上所生長出 之穿的數量較少。 實施例2 在藉由與實施例1記載之方法相同的方法所製備之固體 培養基的菌座中心部（瓶口徑之中心部）上，以圓狀且液體 種菌接種部位與液體種菌非接種部位之比率為1:15、 4:12、8:8、4:1、4:0之方式，將藉由與實施例i記載之方 法相同的方法所製備之液體種菌（乾燥菌體重量4 4 g/L)25 mL針對每個試驗區接種12瓶。其後，在與實施例丨相同之 條件下進行培養、出芽。使其出芽後，將菌座中心部的芽 以外之芽摘除，將瓶正轉。將培養物轉移至溫度為15<>c、 且以Humid Eye 100(鷺宮製作所股份有限公司製造）之表示 值將加濕控制在105〜120%的生長室中，於5〇〜1〇〇勒克司 之照明下使其生長10天，藉此使芽生長為成熟子實體。各 試驗區中，將由菌座中心部之芽生長而形成株化成熟子實 體之培養瓶的個數示於表3。 [表3] 試驗^ 形成有株化成熟子實體之培養瓶的個數 (每12個培養瓶） 1:15 10 ~ 4:12 12 8:8 12 4:1 ' A · Λ -------- 11 4 · u 5 135789.doc -23- 200926960 由表3可知，在液體種菌接種部位與非接種部位的比率 為1:1 5~4:1之所有試驗區中，在菌座中心部可形成充足之 芽，可獲得良好之株化成熟子實體。尤其是在4:12〜8:8之 試驗區中可顯著形成良好之株化成熟子實體。另一方面， 不具有液體種菌非接種部位（於菌座整體上接種液體種g) 之試驗區（4:0)，尤其是菌座中心部之芽形成顯著遜於其他 試驗區，其結果無法獲得充足量之株狀子實體。 實施例3 以PGY液體培養基，將藉由與實施例1記載之方法相同 的方法所製備之液體種菌（乾燥菌體重量4.4 g/L)稀釋為2倍 (乾燥菌體重量2.2 g/L)或4倍（乾燥菌體重量1.1 g/L)，而製 備液體種菌稀釋液。在藉由與實施例1記載之方法相同的 方法所製備之固體培養基的菌座中心部上，以圓狀且液體 種菌接種部位與液體種菌非接種部位之面積比為8: 8之方 式’分別對12個接種上述液體種菌原液50 mL、25 mL、 12.5 mL，2倍種菌稀釋液12.5 mL或4倍種菌稀釋液12.5 mL。其後，在與實施例1相同之條件下進行培養、出芽。 使其出芽後’將菌座中心部的芽以外之芽摘除，將瓶正 轉。將培養物轉移至溫度為15°C、且以Humid Eye 100(鷺 宮製作所股份有限公司製造）之表示值將加濕控制在 105〜120%的生長室中，於50~100勒克司之照明下使其生 長10天，藉此使芽生長為成熟子實體。各試驗區中，將由 菌座中心部之芽生長而形成株化成熟子實體之培養瓶的個 數不於表4。 135789.doc •24· 200926960 [表4] 試驗區 菌艘量(mg/cm2) 形成有株化成熟子貢體之培養瓶的 個數(每12個培養瓶） 原液50 ml 8.8 8 原液25 ml 4.4 11 原液12.5 ml 2.2 12 2倍稀釋液12.5 mL 1.1 12 4倍稀釋液12.5 ml 0.55 10 由表4可知’原液12.5 mL區（2.2 mg/cm2)、2倍稀釋液 12.5 mL區（1.1 mg/cm2)中，菌座中央部之芽的形成最為良 好，可穩定形成良好之株狀子實體。又，若多於上述菌體 量、或少於上述菌體量，則難以在菌座中央部穩定形成 芽，所獲得之株狀子實體減少。 實施例4 藉由與實施例1記載之方法相同的方法進行出芽。使其 出芽後’將瓶正轉。針對該培養基之中央部的孔及以中央 為中心之直徑為4 cm之圓周上均等地打開的4個孔，利用 刮勺摘除自側面向開口部所生長出之2、3個芽以外的芽。 ❹ 將培養物轉移至溫度為15 °C、且以Humid Eye 1 〇〇(鷺宮製 作所股份有限公司製造）之表示值將加濕控制在105〜120〇/〇 的生長室中。於50〜100勒克司之照明下使培養物培養1〇 天，藉此使芽生長為成熟子實體。其間，以自孔之開口部 可生長一個子實體的方式，一面摘除不需要之芽一面進行 生長。其結果，自中央部之孔可獲得每個重量約為2〇〜3〇 g之大型真姬離褶傘子實體。 實施例5 135789.doc •25- 200926960
藉由與實施例1記載之方法相同的方法進行出芽。使其 出芽後’摘除所獲得之芽（幼子實體），自所摘除之幼子實 體挑選長度為5〜2G mm的插芽。在摘除了子實體原基及幼 子實體之原固體培養基上，⑨自固體培養基之中央在直徑 為4 cm的圓周上均等打開之4個孔中各移植一個插芽。其 後，將培養物轉移至溫度為15<t、且以Humid咖⑽（驚 宮製作所股份有限公司製造）之表示值將加濕控制在 105 120/〇的生長室中。於5〇〜1〇〇勒克司之照明下使培養 物培養1G天’藉此使芽生長為成熟子實體。其結果絲 可獲得約70〜90 g之產量的大型真姬離褶傘子實體。 以上，由表1、表2可知，藉由本發明可獲得在菌座上形 成有芽（幼子實體）數約為先前之芽（幼子實體）數之4倍的真 姬離稽傘培養物。進而，如表3所示，考慮液體種菌接種 部位與液體種菌非接種部位之面積比，且如表4所示考慮 其菌鱧$，藉此可進一步穩定獲得株化真姬離稽傘子實
SA 锻0 [產業上之可利用性] 根據本發明，可提供一種於大規模商業栽培中可穩定生 產真姬離褶傘之真姬離褶傘之菌床培養物、及使用該培養 物之真姬離褶傘之菌床栽培方法。藉由將該培養物用於真 姬離褶傘之栽培中，芽（幼子實體）形成率較高，可實現穩 定之真姬離褶傘栽培。 【圖式簡單說明】 圖1係表示自上方觀察栽培用培養基（培養基）時，菌座 135789.doc -26· 200926960 上之液體種菌接種部位與非接種部位之關係例的圖，圖中 A係圓環形之液體種菌接種部位，B及C係液體種菌非接種 部位。 【主要元件符號說明】 A 液體種菌接種部位 ' B、C 液體種菌非接種部位
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