TW200829234A - Antrodia camphorata isophorone extract - Google Patents

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200829234 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種新穎化合物，尤其係關於一種由牛 樟芝萃取物中所分離純化之化合 物及其於抑制腫瘤細胞生長之應用。 【先前技術】 牛樟芝（ca/wp/zoraiflr)，又稱樟芝、牛樟兹、 紅樟、紅樟芝、樟菰或樟窟内菰等，為臺灣特有種真菌， 只生長於臺灣山區海拔45〇〜2〇〇〇公尺間之牛樟樹 (Cz/wamowm tme/zim/ Hay )的中空腐朽心材内壁上，因 此是由樹幹内面生長出子實體。牛樟樹目前主要分佈於桃 園:南投等山區，由於牛樟樹是台灣數量極為稀少的保育 類樹種，加上人為的盜伐，使得寄生於其中方能生長之野 生牛樟芝數量更形稀少，且由於其生長相當緩慢，^長期 亦僅在六月至十月之間，因此價格非常昂貴。 丁评之1于灵體為多年生，無柄，呈木栓質至 狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。初0_ 、生於木龍面，之後其前齡略為捲她起，而 =2纹板狀）或如鐘乳石狀。牛樟芝頂部表面呈 胳色，具不明顯的皺紋，有光澤，邊緣平而鈍， 腹面則為橘紅色或局部黃色，並有許多域。 200829234 +立Γ:，具有強烈的黃樟香氣’其曬乾後褪色成 -$古’民間將其用作解毒、保肝、抗癌之草 牛敎如同-般食_的蕈_，具有許多複雜的成 刀已去的生理/舌性成分中，包括：多醣體 (P〇lysaccharides’如：沒_萄聚醣）、三箱類化合物 ㈣e—)、超氧歧化酶(sup_ide dismutase ，SOD)、
腺苷(adenosine)、蛋白質(含免疫球蛋白）、維生素（如：維 生素B、終鹼酸）、微量元素（如：#5、構及鍺等）、核 酸、凝集素、胺基酸、固醇類、木質素以及金壓穩定物質 (如·ιηί〇(1^ acid)等，這些生理活性成分被認為具有抗 腫瘤、增加免疫能力、抗過敏、抑制血小板凝集、抗病毒、 抗細菌、抗尚血壓、降血糖、降膽固醇以及保護肝臟等功 牛樟芝眾多成分中以三萜類化合物被研究的最多， 三萜類化合物是由三十個碳元素結合成六角形或五角形 天然化合物之總稱’牛樟芝所具之苦味即主要來自三萜類 此成分。1995年時，Cherng等人發現牛樟芝子實體萃取 物中含有三種新的以麥角留烧（ergostane)為骨架的三萜 類化合物：antcin A、antcin B 與 antcin C( Cherng，I. H·，and Chiang, H. C. 1995. Three new triterpenoids from Antrodia J· Nat· Prod· 58:365-371 )。Chen 等人以乙醇 萃取樟芝子實體後發現zhankuic acid A、zhankuic acid B 及zhankuic acid C等三種三萜類化合物（Chen，C· H·，and Yang, S. W. 1995. New steroid acids from Antrodia 6 200829234 cinnamomea， - a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. L Nat. Prod. 58:1655-1661)。此外，Chiang 等人於1995年也由子實體萃取物中發現另外三種分別 為倍半萜内醋（sesquiterpene lactone)與兩種雙酴類衍生 物的新三萜類化合物，此即antrocin，4,7-二曱氧基-5-曱 基-1，3-苯並二氧環（4,7-dimethoxy-5-methy_l，3-benzodioxole)與 2,2’，5,5’_四甲氧基_3,4,3，，4丨_雙·亞甲二氧 基-6,6’_ 二甲基聯苯（2,2’，5,5?七以11^1;11€^-3,4,3丨，4’·!^· ( methylenedioxy-6,6f_ dimethylbiphenyl) (Chiang，H· C·，Wu， D· P·，Cherng, I· W·，and Ueng，C· Η· 1995· A sesquiterpene lactone，phenyl and biphenyl compounds from Antrodia czVwflmoweo· Phytochemistry· 39:613_616)。到了 1996 年， Cherng等人以同樣分析方法再度發現四種新的三箱類化 合物：antcin E、antcin F、methyl antcinate G、methyl antcinate H ( Cherng，Ι· H·，Wu，D· P·，and Chiang，Η· C· 1996. Triteroenoids from Antrodia cinnamomea· i Phytochemistry· 41:263-267);而 Yang 等人則發現了二種 以麥角甾烧為骨架的新化合物zhankuic acid D、zhankuic acid E，和三種以羊毛甾烧（lanostane)為骨架的新化合 物·· 15 α -乙醯-去氫硫色多孔菌酸（15 α -acetyl-dehydrosulphurenic acid )、去氫齒孔酸 (dehydroeburicoic acid )與去水硫色多孔菌酸 (dehydrasulphurenic acid) ( Yang，S· W·，Shen，Y· C·，and Chen, C, H. 1996. Steroids and triterpenoids of Antrodia 200829234 cinnamomea - a fungus parasitic on Cinnamomum
Phytochemistry· 41:1389_ 1392)。雖然由目前 諸多之實驗可得知牛樟芝萃取物具有抑癌之功效（如前述
Chen ( 1995))，但究為何種有效成分可達到抑制腫瘤 細胞效果之研究，目前則仍處於試驗階段，並未有具體之 有效成分發表，故若能將該萃取物進一步純化分析，找出 其真正有效抑癌成分，對於人類癌症之治療實將產生莫大 的助益。 ^ 【發明内容】 為明瞭牛樟芝萃取物中究竟是何成分具有抑癌之效 果，本發明由牛樟芝萃取物中分離純化出具式(1)結構式 之新穎化合物； ^
氫基 3 ’ R3係氫基、曱基或(CH2)m_CH3，m= 基或…n2)m-CH3，R3係氫基、 12 ; n= 1 〜12 0 較佳者為如下所示式(2) 如式(1)結構式之化合物中， 之化合物： 200829234
(2) 式(2)之化合物，其化學名為4-羥基-2,3-二甲氧基_6_ 甲基-5 (3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯）_2_環己烯酉同 (4_hydroxy_2,3_dimethoxy-6-methy-5(357，ll-trimethyl_ci0 deca-2?6510-trienyl)-cyclohex-2-enone )，分子式為 C24H38〇4，夕卜觀為淡黃色粉末狀，分子量為390。 " 本發明中式(1)、式(2)之化合物係分離純化自牛棒芝 水萃取物或有機溶劑萃取物，有機溶劑可包括醇類（例如 曱醇、乙醇或丙醇）、酯類（例如乙酸乙酯）、烧類（例 如己烧）或鹵烷（例如氯甲烷、氯乙烷），但並不以此為 限，其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。 藉由前述化合物，本發明係將其應用於抑制腫瘤細 胞生長上，使能進一步應用於治療癌症之醫藥組成份中， 增益癌症之治療效果。本發明化合物得應用之範圍包括對 於乳癌腫瘤細胞、職_細胞與攝獅癌_細胞等細 胞之生長產生抑制效果，使該等腫瘤細胞無法迅速生長， 進而抑制腫瘤之增生，延緩腫瘤之惡化，因此，可進一步 利用於乳癌、肝癌與攝護腺癌等癌症之治療。 另一方面，本發财亦可將式⑴或/與式(2)之化合物 利用於治療乳癌、肝颇攝護腺料㈣域物之成分 200829234 制該等腫瘤細胞的生長。前述醫藥組成物除包 上可垃里之式⑴或/與式(2)之化合物外，尚可包括藥學 "、文的载體。載體可為賦形劑（如水）、填充劑（如 S或&粉）、黏合劑（如纖維素衍生物）、稀釋劑、崩 从，、、吸收促進劑或甜味劑，但並未僅限於此。本發明醫 樂組成物可依—般習知藥學之製備方法生產製造，將式(1) 或/與^(2)有效成分劑量與一種以上之載體相混合，製儐 出所舄之知彳型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊威 其他液體製劑，但未以此為限。 此外，由於本發明中之化合物同時具有抗氧化滲 性，因此亦可將之添加於保健食品、飲食品、醫藥品、化 妝品當中，藉由其抗氧化能力達到預防心血管疾病或避免，細 胞突變等效用，使助益於施用人體之健康。 以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述 所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明 之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範 圍内，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當 視後附之申請專利範圍所界定者為準。 【實施方式】 首先取牛樟芝（如的出acamp/zorofia)菌絲體、子實 體或二者之混合物，利用習知萃取方式，以水或有機溶劑 200829234 進仃萃取’藉以取得牛樟芝水萃取物或有機㈣丨萃取物。 其中，有機溶劑可包括醇類（例如甲醇、乙醇或丙醇）、 ，類（例，乙酸乙醋）、鋪（例如己燒）或鹵烧（例如 亂曱炫、氯乙烧），但並不以此為限。其中較佳者為醇類， 更佳者為乙醇。 經萃取過後之牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物， 可進一步藉由高效液相層析加以分離純化，之後再對每一 分液（fraction)進行抑癌效果的測試。最後，則針對具 ^癌效果之分液進行成分分析，將可能產生抑癌效果的成 刀再刀別進一步做不同癌症腫瘤細胞之抑制效果測試。最 終即發現本發财如式⑴/式⑺之化合物係具有抑制不 同癌症腫瘤細胞生長之效果，且該化合物經與習知文獻比 對，並未曾發現於牛樟芝中，因此係一新穎之化合物。 為方便說明本發明，以下將以式(2)之扣經基_2,3_二甲 氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三婦）·2-環 己烯酮化合物進行說明。此外，為證實4_羥基_2,3_二甲 氧基_6_甲基-5 (3,7，11-三甲基-2,6，10，十二碳三烯）-2-環 己烯酮化合物對腫瘤細胞生之抑制效果，本發明中係以 ΜΤΤ分析法，根據美國國家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，對包括乳癌、肝癌 與攝護腺癌等腫瘤細胞進行細胞存活率之測試。由該些測 試證實，4·羥基·2,3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三甲基 _2,6，10_十二碳三婦）_2_環己烯酮對於乳癌腫瘤細胞（包 π 200829234 括=與MDA_MB_231)、肝癌彻細胞（包括~ ηπ Γμ /2)與攝護腺癌膜瘤細皰（包括LNCaP與 生長半抑可降低其存活率’相對之下並可同時降低 生長+抑制率所需濃度（即❿值），因此得藉由㈣ 基-2,3·二甲氧基冬甲基_5 ( 3Λ1 k甲基以鼻十二碳 二炸）_2·環己相，應麟包括乳癌、肝癌與攝護腺癌 等腫瘤細胞之生長抑制上，而進-步可彻於乳癌、肝癌 與攝護腺癌等癌症之治療。_前述實財式詳盡說明如 -| — · 實施例1 : 4-經基-2,3_一甲氧基_6_甲基_5( 3,7，11_三甲基_2,6，1〇_十二 碳三烯）-2•環己稀酮的分離 將100克左右之牛樟芝菌絲體、子實體或二者之混 合物’置入三角錐形瓶中，加入適當比例的水與醇類 (70%〜100%醇類水溶液），於20〜25°C下櫈拌萃取至少 1小時以上，之後以濾紙及〇·45 μιη濾膜過濾，收集萃取 液0 將前述收集之牛樟芝萃取液，利用高效能液相層析 儀(High Performance Liquid chromatography)，以 RP18 的 層析管(column)進行分析，並以甲醇(A)及〇·ι%〜〇·5%醋 酸水溶液(Β)做為移動相(mobile phase)(其溶液比例係·· 0〜10分鐘，B比例為95%〜20% ; 1〇〜20分鐘，B比例為 20%〜10%; 20〜35分鐘’ B比例為1〇%〜1〇%; 35〜40分鐘， 12 200829234 B比例為10〇/。〜95〇/〇)，在每分鐘！ ml之速度下 _ 時以紫外-可見光全波長偵測器分析。 同 將25分鐘至30分鐘之沖提液收集濃縮即可彳卩*主 色粉末狀之固體產* ’特4-經基_2,3_二甲氧基:犬頁 -5 (3,7，11_三曱基_2A1G_十：碳三婦）_2_環己_ = 分析，其分子式為C24H38〇4，分子量39〇，熔點（功‘ 為48°C〜52°C。核磁共振（NMR)分析值則如下二二)· f 々-NMR^CDClJWppm) : 1.5卜 1.67、1.7卜 1.75、i 94 2.03、2.07、2.22、2-25、3.68、4.05、5.07 與 5.14、 13C-NMR(CDC13) 5 (ppm) : 12.31、16.1、16.12、17 67 25.67、26.44、26.74、27.00、39.71、39.81、4.027、43 34 59.22、60.59、120.97、123.84、124.30、131.32、135 35 135·92、138·05、160.45 與 197·12。 經將4_羥基_2,3·二甲氧基-6-曱基_5 (3,7，11-三甲烏 -2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯酮與化學式資料庫比對 後’並未發現與前述相同之化合物結構，因此，此化合物 係一新穎且前所未見之化合物。 實施例2 : 體外抗乳癌腫瘤細胞之活性測試 為進一步測試實施例1中所發現化合物對腫瘤細跑 之抑制效果，本實施例將根據美國國家癌症研究所 (National Cancer Institute，NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式， 13 200829234 首先取實施例1中所分離之4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基 5 (3,7，11·三曱基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯_化合 物，加入MCF-7與MDA-MB-231人類腫瘤細胞培養液 中，進行腫瘤細胞存活性之測試。細胞存活性之測試可採 習知之MTT分析法進行分析，而MCF_7與MDA-MB-231 皆係人類之乳癌腫瘤細胞系。 MTT分析法是一種常見用於分析細胞增生（cell proliferation)、存活率（percent of viable cells)以及細 胞毒性（cytotoxicity)的分析方法。其中，]\4丁丁（3-[4,5-dimethylthiazol_2_yl]2,5_diphenyltetrazolium bromide )為一 黃色染劑，它可被活細胞吸收並被粒腺體中的琥珀酸四唾 還原酶（succinate tetrazolium reductase )還原成不溶水性 且呈藍紫色的formazan，因此藉由formazan形成與否， 即可判斷並計算細胞之存活率。 首先將人類乳癌細胞MCF-7與MDA-MB-231分別 於含有胎牛血清之培養液中培養24小時。將增生後之細 胞以PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶_EDTA處理細 胞，隨後於l，200rpm下離心5分鐘，將細胞沈澱並丟棄 上清液。之後加入10 ml的新培養液，輕微搖晃使細胞再 次懸浮，再將細胞分置於96孔微量盤内。測試時，分別 於每一孔内加入 30、10、3、1、0·3、〇·ι 與 0 03 μ§/ιη1 牛樟芝乙醇萃取物（對照組，未經純化分離之總萃取物） 以及4_經基_2,3_二甲氧基-6-曱基-5( 3,7，11-三甲基_2,6，10_ 200829234 十二碳三烯）-2-環己烯酮（試驗組），於37°c、5% C〇2 下培養48小時。其後，於避光的環境下於每一孔内加入 2·5 mg/ml的MTT，反應4小時後再於每一孔内加入1〇〇 μ1 的lysis buffer終止反應。最後以酵素免疫分析儀在57〇nm 吸光波長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率，並推 异出其生長半抑制率所需濃度（即IC5()值），其結果如 表一所示。 表一：體外對乳癌腫瘤細胞存活率之測試結果 挫樣品_ ic5〇Ug/mn 對照組(加入牛樟芝萃取物） 11.132 25.812 MCF_7 MDA-MB-231 試驗組(加入式2) ~ —__，w ^ 夏— 由表一中可知，藉由4-羥基-2,3-二曱氧基_6_曱基_5 (3,7，11-三甲基_2,6，10_十二碳三烯）_2_環己缔綱的作 用’其對於MCF-7人類乳癌腫瘤細胞之ICs()值為〇852
Pg/ml’對於mda-MB-231人類乳癌腫瘤細胞之IC5g值則 為1.031 pg/m卜相較於牛樟芝萃取混合物所測得之忙 值係低的多，因此可證實牛樟芝萃取物中之4__美 一甲氧基-6-曱基-5( 3,7，11_三曱基-2,6，10-十二碳三烯 環己烯_確實能夠利用於乳癌腫瘤細胞生長之抑制。β 15 200829234 實施例3 : 體外對乳癌腫瘤細胞辅助治療之活性測試 本測試同樣係根據美國國家癌症研究所的體外篩檢 模式進行測試。首先，取人類乳癌細胞MCF-7與 MDA-MB-231 ’分別於含有胎牛血清之培養液中培養24 小時後，將增生後之細胞以PBS清洗一次，並以1倍之 胰蛋白酶-EDTA處理細胞，隨後於i，2〇〇 rpm下離心5分 鐘’將細胞沈殿並丟棄上清液。之後加入1〇 ml的新培養 液，輕微搖晃使細胞再次懸浮。測試前，先加入〇 〇〇17 pg/ml紫杉醇（Taxol)處理細胞72小時，再將細胞分置 於96孔微量盤内，之後分別於每孔内加入〇μ§/πι1 (對照 組），30、10、3、1、0·3、0.1 與 〇·〇3 pg/ml 實施例 1 中 所分離之4_羥基-2,3_二甲氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三甲基 -2,6，10-十二碳三烯）-2·環己烯酮（試驗組），於37°C、 5% C〇2下培養48小時。其後，於避光的環境下於每一 孔内加入2.5mg/ml的MTT，反應4小時後於每一孔内加 入100 μΐ的lysis buffer終止反應。最後以酵素免疫分析 儀在570nm吸光波長下測定其吸光值，藉以計算細胞的 存活率，並推算出其生長半抑制所需濃度（即IC5()值）， 其結果如表二所示。 表二··體外對乳癌腫瘤細胞經紫杉醇辅助治療後抑制之測 試結果 16 200829234 測試樣品 結果 對照組 細胞存活率（％) MCF-7 (0.0017 μδ/ηι1 Taxol) 65 土 1 MDA-MB-231 (0.0017 pg/ml Taxol) 76土 3 試驗組 IC50 (pg/ml) MCF-7 (0.0017 pg/ml Taxol+式 2) 0.009 MDA-MB_231 (0.0017 pg/ml Taxol+式 2) 0.011 由表二中可知，透過紫杉醇之協同作用，4-經基-2,3-二甲氧基-6-曱基_5 ( 3,7，11-三甲基-2,6，l〇-十二碳三烯）_2一 環己細酮對於MCF-7人類乳癌腫瘤細胞之ic5G值降為 0.009吨嵐，對於MDA-MB_231人類乳癌腫瘤細胞之冗5〇 值亦降為約0.011 pg/m卜因此可證實牛樟芝萃取物中之 4-髮基_2,3_二曱氧基_6_曱基-5 (3,7，11-三甲基_2,6，10·十二 石反二烯）_2_環己烯酮確實能夠利用於乳癌腫瘤細胞生長之 抑制’衫料彡醇之協同制下，有更佳之抑制效果。 實施例4 : 體外抗肝癌腫瘤細胞之活性測試 “本測試亦係根據美_家癌症研究所抗腫瘤藥物筛 檢模式進行’將實關1巾所分離之4_減_2,3_二甲氧基 -5 (3,7，11_三曱基_2,6抓十二碳三婦> 環己自 =二加入Hep 3B與Hep G2人類肝癌腫瘤細胞培養 、之進仃培養，藉以進行腫瘤細胞存活性之測試。 17 200829234 首先將人類肝癌細胞Hep 3B與Hep G2分別於含有 胎牛血清之培養液中培養24小時。將增生後之細胞以 PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶-EDTA處理細胞， 隨後於l，200rpm下離心5分鐘，將細胞沈澱並丟棄上清 液。之後加入10 ml的新培養液，輕微搖晃使細胞再次懸 浮’再將細胞分置於96孔微量盤内。測試時，分別於每 孔内加入 30、10、3、1、0·3、0.1 與 〇·〇3 pg/ml 之牛樟 芝乙醇萃取物（對照組，未經純化分離之總萃取物）以及 3〇、10、3、1、〇·3、〇·1 與 0.03 pg/ml 之 4·羥基-2,3-二甲 氧基_6_甲基_5 (3,7，11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯）_2•環己 烯酮（試驗組），於37°C、5% C02下培養48小時。其 後’於避光的環境下於每一孔内加入2.5 mg/ml的MTT， 反應4小時後再於每一孔内加入1〇〇 μΐ的lysis buffer終 止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測 定其吸光值，藉以計算細胞的存活率，並推算出其ic50 值’其結果如表三所示。 表二·體外對肝癌腫瘤細胞抑制之測試結果 一 測試樣品 IC50 (gg/ml) 對照組(加入牛樟芝萃取物） Hep 3B 5.121 Hep G2 18.631 喊驗組(加入式2) Hep 3B 0.005 _ Hep G2 1.679 200829234 由表二中可知，藉由4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三甲基-2,6，1〇·十二碳三烯）-2環己烯酮的作用， 其對於Hep 3Β人類肝癌腫瘤細胞之IC5G值降為〇 〇〇5 pg/ml ’對於Hep G2人類肝癌腫瘤細胞之1(：5()值則降為 1479 μΕ/ιη1，相較於牛樟芝萃取混合物所測得之^別值 係低的多，因此可證實牛樟芝萃取物中之私經基_2,3•二甲 氧基_6_曱基-5 ( 3,7，11-三甲基_2,6，1〇-十二碳三烯）_2·環己 烯酉同確實能夠利用於肝癌腫瘤細胞生長之抑制。 實施例5 ·· 體外對肝癌腫瘤細胞辅助治療之活性測試 本測試同樣係根據美國國家癌症研究所的體外篩檢 模式進行測試。首先，取人類肝癌細胞Hep 3Β與Hep G2 ’分別於含有胎牛血清之培養液中培養24小時後，將 增生後之細胞以PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶 -EDTA處理細胞，隨後於1，200 i^pm下離心5分鐘，將細 胞沈澱並丟棄上清液。之後加入10 ml的新培養液，輕微 搖晃使細胞再次懸浮。測試前，先於Hep 3B細胞株試驗 加入0.0043 pg/ml Lovastatin，而於Hep G2細胞株試驗加 入0.0017 gg/ml紫杉醇（Taxol)，處理細胞72小時，再 將細胞分置於96孔微量盤内，之後分別於每孔内加入〇 pg/ml (對照組），30、10、3、；[、0.3、0.1 與 〇·〇3 pg/ml 實施例1中所分離之4-羥基_2,3_二甲氧基-6-曱基-5 19 200829234 (3,7，11-三甲基-2,6，l〇-十二碳三烯）-2-環己烯酮（試驗 組），於37°C、5% C〇2下培養48小時。其後，於避 光的環境下於每一孔内加入2·5 mg/ml的MTT，反應4 小時後於每一孔内加入100 μΐ的lySis buffer終止反應。 最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測定其吸 光值，猎以计异細胞的存活率，並推算出其值，其 結果如表四所示。 表四：體外對肝癌腫瘤細胞經紫杉醇輔助治療後抑制之測 試結果 測試樣品 結果 對照組 細胞存活率（％) Hep 3B (0.0043 μβ/πι1 Lovastatin) 61±3 Hep G2 (0.0017 pg/ml Taxol) 81±2 試驗組 1。5〇 (gg/ml) Hep 3B (0.0043 pg/ml Lovastatin+式 2) 0.002 __(0.0017 pg/ml Taxol + 式 2) 0.008 由表四中可知，透過Lovastatin及紫杉醇之協同作 用’ 4-經基_2,3-二甲氧基_6_甲基_5 (3,7，11_三甲基_2,6，1〇-十二碳三烯）-2-環己烯酮對於Hep 3B人類肝癌腫瘤細胞 之1值降為〇·〇〇2 gg/ml，對於Hep G2人類肝癌腫瘤細 胞之1Cso值亦降為約0.008 gg/m卜因此可證實牛樟芝萃 取物中之4_經基_2,3_二曱氧基_6_曱基-5 ( 3,7，11_三曱基 -2,6，1〇_十二碳三烯）-2_環己烯嗣確實能夠利用於肝癌腫瘤 20 200829234 細胞生長之抑制’且在紫杉醇之協同作訂，有更佳之抑 制效果。 實施例6 : 體外抗攝護腺癌腫瘤細胞之活性測試 本測試亦係根據美國國家癌症研究所抗腫瘤藥物篩 檢模式進行’將實施例1中所分離之4-經基-2,3-二甲氧基 曱基_5 (3,7，11_三曱基-2,6，ι〇-十二碳三烯）_2_環己烯酮 化合物，加入LNCaP與DU-145人類攝護腺癌腫瘤細胞 培養液中進行培養，藉以進行腫瘤細胞存活性之測試。 首先將人類攝護腺癌細胞LNCaP與DU-145分別於 含有胎牛企清之培養液中培養24小時。將增生後之細胞 以PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶-EDTA處理細胞， 隨後於1，200 rpm下離心5分鐘，將細胞沈澱並丟棄上清 液。之後加入10 ml的新培養液，輕微搖晃使細胞再次懸 浮’再將細胞分置於96孔微量盤内。測試時，分別於每 一孔内加入30、10、3、1與0·3 pg/ml牛樟芝乙醇萃取物 (對照組，未經純化分離之總萃取物）以及30、10、3、1 與0.3 pg/ml由實施例1所分離之4-經基-2,3·二曱氧基_6_ 曱基-5( 3,7，11_三甲基-2,6，10-十二碳三烯）_2_環己烯_(試 驗組），於37°C、5% C02下培養48小時。其後，於 避光的環境下於每一孔内加入2.5mg/ml的MTT，反應4 小時後再於每一孔内加入1〇〇 μΐ的lysis buffer終止反 21 200829234 應。最後以酵素免疫分析儀在57〇nm吸光波長下蜊定其 吸光值，藉以計算細胞的存活率，並推算出其][Cso值， 其結果如表五所示。 表五·體外對攝護腺癌腫瘤細胞抑制之測試結果 _測試樣品 IC50 (pg/ml) 對照組(加入牛樟芝萃取物） 11.491 41.392 2.378
LNCaP ( DU-145 試驗組(加入式2)
LNCaP DU-145___ 1.812 由表五中可知，藉由4-經基-2,3-二曱氧基_6-甲基_5 (3,7，11_三曱基_2,6，1〇_十二碳三烯）-2-環己烯_的作用， 其對於LNCaP人類攝護腺癌腫瘤細胞之IC%值降為2.378 pg/m卜對於DU-145人類攝護腺癌腫瘤細胞之1C%值則 1 降為UUpg/ml，相較於牛樟芝萃取混合物所測得之Ic% 值係低的多，因此可證實牛樟芝萃取物中之4-輕基_2,3_ 二甲氧基_6_曱基-5 ( 3,7，11_三甲基-2,6，10_十二碳三烯） 環己烯酮確實能夠利用於攝護腺癌腫瘤細胞生長之抑制。 實施例7 ·· 體外對攝護腺癌腫瘤細胞輔助治療之活性測試 22 200829234 本測5式同樣係根據美國國家癌症研究所的體外篩檢 模式進行測試。首先，取人類攝護腺癌細胞LNCaP與 DU-145，分別於含有胎牛血清之培養液中培養24小時 後，將增生後之細胞以PBS清洗一次，並以丨倍之胰蛋 白i#-EDTA處理細胞，隨後於ι，2〇〇印㈤下離心$分鐘， 將細胞沈澱並丟棄上清液。之後加入1〇 ml的新培養液， 輕微搖晃使細胞再次懸浮。測試前，先於LNCaP細胞株 試驗加入0.0017 pg/ml紫杉醇，而於du-145胞株試驗加 入0.0043 pg/ml紫杉醇分別處理細胞72小時，再將細胞 分置於96孔微量盤内，之後分別於每孔内加入〇 μδ/ιη1 (對,¾ 組）’ 30、10、3、1、0·3、〇·1 與 〇·〇3 pg/ml 於實施 例1中所分離之4-經基-2,3-二曱氧基各甲基-5 (3,7，11-三曱基-2,6，10_十二碳三烯）-2•環己烯酮（試驗組），於 37°C、5% C〇2下培養48小時。其後，於避光的環境下 於每一孔内加入2.5 mg/ml的MTT，反應4小時後於每一 孔内加入100 μΐ的lysis buffer終止反應。最後以酵素免 疫分析儀在570 nm吸光波長下測定其吸光值，藉以計算 細胞的存活率，並推算出其IC5G值，其結果如表六所示。 表六：體外對攝護腺癌腫瘤細胞經紫杉醇辅助治療後抑 制之測試結果 測試樣品 結果 對照組 細胞存活率（％) LNCaP (0.0017 pg/ml Taxol) 56±3 DU-145 (0.0043 pg/ml Taxol) 7〇±2 23 200829234 IC50 (pg/ml) 0-961 0.515 試驗組 LNCaP (〇.〇〇i7pg/mi Taxol+式 2) DU-145」〇.〇〇43gg/mi Taxol+式 2) 由表六中可知，透過紫杉醇之協同作用，‘經基_2,3_ ^曱氧基_6_曱基_5 ( w i•三曱基_2,6，1〇_十二碳三烯 玉衣己細酌對於LNCaP人類攝護腺癌腫瘤細胞之值降 為0.961 pg/ml，對於DU-145人類攝護腺癌腫瘤細胞之
ICso值亦降為約〇·515 μ§/ιη1，相較於牛樟芝萃取混合物 所測得之IC5〇值係低的多，因此可證實牛樟芝萃取物中 之一4_Γ^_2,3-二甲氧基各曱基m U三甲基-2,6算 十二碳三烯）_2_環己烯_實能夠於攝護腺癌腫瘤細 胞生長之抑制，且在紫杉醇之協同作用下，有更佳之 效果。 實施例8 : 體外抗氧化活性之試驗 一般抗氧化活性n _用人類低密度脂蛋白 (human 10W density lip〇pr〇tdn，肌），加入銅離子（以+ ) 與待測樣柄行氧化反應，檢測既上二狀反應結果後， =維生素E之水雜類她TfGlGx料·、(τ_χ濃度為 2 μΜ時，其效力值訂域雜1())，計算⑽ 氧化活性。 24 200829234 首先準備二次純水(控制組），並配製5 mM磷酸鈉緩衝 溶液（sodium phosphate buffer，SPB )、1 μΜ 與 2 μΜ 的 Trolox (對照組)及40 pg/ml由實施例1中所分離之4-羥基-2,3-二甲 氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三甲基_2,6，10_十二碳三烯）-2-環己烯 酋同（試驗組）。利用酵素法測得低密度膽固醇濃度(LDL-C) 後’利用5 mM SPB將LDL稀釋至0.10〜0.25 mg/ml間。取 96孔的石英微量盤，於其中先加入1〇〇 μ1之LDL，再分別加 入前述預定濃度的Trolox及由實施例1中所分離之化合物， 之後再分別加入CuS04溶液以啟動氧化反應(每一 250 μΐ孔 中的銅（II)濃度為5·0μΜ)，最後將該微量盤置於酵素免疫 微量盤分析儀（ELISAreader)中進行檢測。酵素免疫微量盤 分析儀檢測波長設為232 nm，溫度設為37°C，偵測時間為 12小時，採樣間隔時間為15分鐘，其結果如表七所示。 表七：體外抗氧化活性之測試钴罢 測試樣品 Tlag(分） △Tlag(分) 效力值 氏0 (控制紙Tlago) 185 1 μΜ Trolox (對照組） 266 81 0.48 2 μΜ Trolox 344 159 LOO 40 pg/mL 式 2 439 208 1.30 註1 · Tlag(分)係指在吸收光波長為234nm下，延滯期叱) 與連鎖期(propagation phase)的交差點；ΔΉ3β(分)係指各測試 樣品Tlag時間與Tiag()時間的差值。 註2 :效力值>〇·5時，表示其具抗氧化作用。 25 200829234 由表七中可知，4_羥基_2,3·二甲氣基甲基4 (3,7，n_ 三甲基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯_具有13〇之效力值， 其比具抗氧化能力之標準值〇·5高出甚多，亦即，其具有相 當之抗氧化能力，因此可用作保健食品、飲食品、醫藥品、 化妝品當中之成分，藉由其抗氧化能力翻驗^血管疾病 或避免細胞突變等效用’使對於施用之人體健康產生莫大的 助益。 【圖式簡單說明】 無 【主要元件符號說明】 無 26

Claims (1)

  1. 200829234 十、申請專利範圍： 1、一種化合物，包括下列結構式：
    其中，X係氧⑼或硫（s)，Y係氧或硫；R!係氫基（H)、 甲基（CH3)或(CH2)m-CH3，& 係氫基、曱基或(CH2)nrCH3， R3係氫基、曱基或或(CH2)m-CH3，m=l〜12 ; η=ι〜12。 2、 如申請專利範圍第1項所述之該化合物，其係分離自牛樟 芝。 3、 如申凊專利範圍第2項所述之該化合物，其係由牛樟芝之 有機溶劑萃取物中所分離。 4如申印專利範圍第3項所述之該化合物，其中該有機溶劑 係選自g曰類、醇類、烧類或齒烧所組成的族群。 5、 如申凊專利範圍第4項所述之該化合物，其中該醇類係乙 醇。 6、 如申請專利範圍第2項所述之該化合物，其係由牛樟芝之 水萃取物中所分離。 7、 如申請專利範圍第1項所述之該化合物，該化合物係4_羥 基-2,3-二甲氧基甲基_5 ( 3,7，11_三曱基_2,6，10_十二碳三 烯）-2-環己烯酮（4-]^(11%€吩-2,3-(^11^1:11〇乂>^6-11^1:1^-5(3,7，11- trimethyl_dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2_enone )。 27 200829234 8、 一種將具有如申請專利範圍第1 S7項所述化合物利用於 抑制乳癌腫瘤細胞生長之應用。 9、 如申請專利範圍第8項所述將該化合物利用於抑制乳癌腫 瘤細胞生長之應用，其中該化合物係分離自牛樟芝。 10、 如中請專利範圍第9項所述將該化合物利用於抑制乳癌 腫瘤細胞生長之應用，其中該化合物係由牛樟芝之有機溶 劑萃取物中所分離。 ，11、如申請專利範圍第10項所述將該化合物利用於抑制乳癌 腫瘤細胞生長之應用，其中該有機溶劑係選自酯類、醇類、 烷類或i烷所組成的族群。 、 12、 如申請專利範圍第n項所述將該化合物利用於抑制乳癌 腫瘤細胞生長之應用，其中該有機溶劑係乙醇。 13、 如申請專利範圍第9項所述將該化合物利用於抑制乳癌 腫瘤細胞生長之應用，其中該化合物係由牛樟芝之水萃取 物中所分離。 14、 如申請專利範圍第8項所述將該化合物利用於抑制乳癌 腫瘤細胞生長之應用，其中該乳癌腫瘤細胞係¥(：17_7或 MDA-MB_231 細胞系。 15、 一種將具有如申請專利範圍第1或7項所述化合物利用 於抑制肝癌腫瘤細胞生長之應用。 16、 如申請專利範圍第15項所述將該化合物利用於抑制肝癌 腫瘤細胞生長之應用，其中該化合物係分離自牛樟芝。 28 200829234 17、 如申請專利範圍第16項所述將該化合物利用於抑制肝癌 腫瘤細胞生長之應用，其中該化合物係由牛樟芝之有機溶 劑萃取物中所分離。 〆 18、 如申請專利範圍第17項所述將該化合物_於抑制肝癌 腫瘤細胞生長之應用，其中該有機溶劑係選自軸、醇類、 炫類或鹵烧所組成的族群。 、 19、 如申請專利範圍第18項所述將該化合物利用於抑制肝 , 細細胞生長之應用，其中該有機溶劑係乙醇。 ° f 20、如申請專利範圍帛16項所述將該化合物利餘抑制 腫瘤細胞生長之應用，其中該化合物係由牛樟芝之水萃取 物中所分離。 Μ 2卜如申请專利範圍第15項所述將該化合物利用於抑制肝 腫瘤細胞生長之應用’其中該肝癌腫瘤細胞係3 ^ Hep G2細胞系。 或 22、 —種將具有如中請專利範圍第i或7項所述化合物利用 ( 於抑制攝護腺癌腫瘤細胞生長之應用。 23、 如申請專利範圍第22項所述將該化合物利用於抑 腺癌腫瘤細胞生長之應用，其中該化合物係分離自牛樟芝 24、 如中請專利範圍第23項所述將該化合物利用於抑 腺癌腫瘤細胞生長之應用，其中該化合物係由牛掉芝之^ 機溶劑萃取物中所分離。 29 200829234 25、 如申請專利範圍第24項所述將該化合物利用於抑制攝護 腺癌腫瘤細胞生長之應用，其中該有機溶劑係選自_類、 醇類、烷類或鹵烷所組成的族群。 曰、、 26、 如申請專利範圍第25項所述將該化合物利用於抑制攝護 腺癌腫瘤細胞生長之應用，其中該有機溶劑係乙醇。ΰ 27、 如申請專利範圍第23項所述將該化合物利用於抑制攝護 腺癌腫瘤細胞生長之應用，其中該化合物係由牛樟芝之水 萃取物中所分離。 28、 如申請專利範圍第22項所述將該化合物利用於抑制攝護 腺癌腫瘤細胞生長之應用，其中該攝護腺癌腫瘤細胞係 LNCaP或DU145細胞系。 29、 如申凊專利範圍第1或7項所述之化合物，其係具抗氧 化活性。 3〇 彻於抑制腫瘤細胞生長之醫藥組成物，包括一有 效j里如申請專利範圍第1項所述之化合物以及一藥學上 可接又之栽體，其中該腫瘤細胞係選自乳癌、肝癌或攝護 腺癌之腫瘤細胞。 31 i 利用於抑制腫瘤細胞生長之醫藥組成物，包括一有 、文背j里如申請專利範圍第7項所述之化合物以及一藥學上 可接又之栽體，其中該腫瘤細胞係選自乳癌、肝癌或攝護 腺癌之腫瘤細胞。
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