TWI361687B - - Google Patents

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丄观687 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種新穎化合物，尤其係關於一種由牛 樟芝（camp/zor⑽）萃取物中所分離純化之化合 物及其於抑制腫瘤細胞生長之應用。 【先前技術】 牛才早芝（caw/j/zoroM )，又稱樟芝、牛樟蒜、 紅樟、紅樟芝、樟菰或樟窟内菰等，為臺灣特有種真菌， 只生長於臺灣山區海拔450〜2000公尺間之牛樟樹 (知^办卜⑴· Hay )的中空腐朽心材内壁上，因 此是由樹幹内面生長出子實體。牛樟樹目前主要分佈於桃 園、南投等山區，由於牛樟樹是台灣數量極為稀少的保育 類樹種，加上人為的盜伐，使得寄生於其中方能生長之野 生牛樟芝數量更形稀少’且由於其生長相當緩慢，生長期 亦僅在六月至十月之間，因此價格非常昂貴。 牛樟芝之子實體為多年生，無柄，呈木栓質至木質， 其外形多變，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。初時為扁平 型，貼生於木材表面，之後其前緣會略為捲曲翹起，而呈 板塊狀（層紋板狀）或如鐘乳石狀。牛樟芝頂部表面呈褐 色至黑褐色，具不明顯的皺紋，有光澤，邊緣平而鈍，其 腹面則為橘紅色或局部黃色，並有許多細孔。 3 1361687 廿此外，牛樟芝具有強烈的黃樟香氣，其曬乾後褪色成 土只白色，味極苦，民間將其用作解毒、保肝、抗癌之草 藥。牛樟芝如同一般食藥用的簟菇類，具有許多複雜的成 ^ ’已知的生理活性成分中，包括：多醣體 ,(polysaccharides，如：卜萄聚醣）、三萜類化合物 (triterpenoids)、起氧歧化酶（SUper〇xide dismutase，SOD)、 腺發(adenosine)、蛋白質（含免疫球蛋白）、維生素（如：維 生素B、菸鹼酸）、微量元素（如：鈣、磷及鍺等）、核 ® 酸、凝集素、胺基酸、固醇類、木質素以及血壓穩定物質 (如：antodia acid)等，這些生理活性成分被認為具有抗腫 • 瘤、增加免疫能力、抗過敏、抑制血小板凝集、抗病毒、 抗細菌、抗高血壓、降血糖、降膽固醇以及保護肝臟等功 * 能。 牛樟芝眾多成分中以三萜類化合物被研究的最多，三 锅類化合物是由三十個碳元素結合成六角形或五角形天然 φ 化合物之總稱，牛樟芝所具之苦味即主要來自三萜類此成 分。1995年時，Cherng等人發現牛樟芝子實體萃取物中含 有三種新的以麥角甾烷（ergostane )為骨架的三萜類化合 物：antcin A、antcin B 與 antcin C( Cherng, I. H., and Chiang, H. C. 1995. Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea. J. Nat. Prod. 58:365-371 ) 。Chen 等人以乙醇 萃取樟芝子實體後發現zhankuic acid A、zhankuic acid B 及zhankuic acid C等三種三祐類化合物（Chen, C. H., an.d Yang, S. W. 1995. New steroid acids from Antrodia 4 1361687 cinnamomea, — a fungus parasitic on Cinnamomum J. Nat. Prod. 58:1655-1661 )。此外，Chiang 等人於1995年也由子實體萃取物中發現另外三種分別為 倍半萜内醋（sesquiterpene lactone)與兩種雙紛類衍生物 的新三萜類化合物，此即antrocin，4,7-二曱氧基-5-曱基 -1,3-苯並二氧環（4,7-dimethoxy-5-methy-l,3-benzodioxole)與 2,2'，5,5’-四曱氧基·3,4,3'，4'_雙-亞曱二氧基 -6,6’-二甲基聯苯（2,2',5,5’-teramethoxy-3,4,3’，4’-bi-methylenedioxy-6,6'- dimethylbiphenyl) (Chiang, H. C., Wu, • D. P., Cherng, I. W., and Ueng, C. H. 1995. A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia Phytochemistry. 39:613-616) 〇 到了 1996 年， * Cherng等人以同樣分析方法再度發現四種新的三萜類化合 物：antcin E、antcin F、methyl antcinate G、methyl antcinate H ( Cherng, I. H., Wu, D. P., and Chiang, H. C. 1996. Triteroenoids from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. • 41:263-267);而Yang等人則發現了二種以麥角甾烷為骨架 的新化合物zhankuic acid D、zhankuic acid E，和三種以羊 毛甾炫（lanostane)為骨架的新化合物：15 α -乙醯-去氫 硫色多孔菌酸（15 a -acetyl-dehydrosulphurenic acid)、去 氫窗孔酸（dehydroeburicoic acid )與去水硫色多孔菌酸 (dehydrasulphurenic acid) ( Yang, S. W., Shen, Y. C., and Chen, C. H. 1996. Steroids and triterpenoids of Antrodia ciimamomeci — a fungus parasitic on Cinnamomum 1361687

ch3 (2) 。、 式（2)之化合物，其化學名為4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯酮 (4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,l 1-trimethyl-dod eca-2,6，10-trienyl)-cyclohex-2-enone)，分子式為 C24H38〇4， • 外觀為淡黃色粉末狀，分子量為390。 本發明中式（1)、式（2)之化合物係分離純化自牛樟芝水 萃取物或有機溶劑萃取物，有機溶劑可包括醇類（例如甲 、醇、乙醇或丙醇）、酯類（例如乙酸乙酯）、烷類（例如 己烧）或鹵烧（例如氯甲烧、氣乙烧），但並不以此為限， 其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。 藉由前述化合物，本發明係將其應用於抑制腫瘤細胞 • 生長上，使能進一步應用於治療癌症之醫藥組成份中，增 益癌症之治療效果。本發明化合物得應用之範圍包括對於 乳癌腫瘤細胞、肝癌腫瘤細胞與攝護腺癌腫瘤細胞等細胞 之生長產生抑制效果，使該等腫瘤細胞無法迅速生長，進 而抑制腫瘤之增生，延緩腫瘤之惡化，因此，可進一步利 用於乳癌、肝癌與攝護腺癌等癌症之治療。 另一方面，本發明中亦可將式（1)或/與式（2)之化合物 利用於治療乳癌、肝癌與攝護腺'癌等醫藥組成物之成分 7 令’藉以抑制該等腫瘤細胞的生長。前述醫藥組成物除包 括有效劑量之式（1)或/與式（2)之化合物外，尚町包括藥學 上可接受的載體。載體可為賦形劑（如水）、填充劑（如 蔗糖或殿粉）、黏合劑（如纖維素衍生物）、豨釋劑、崩 解劑、吸收促進劑或甜味劑’但並未僅限於此β本發明醫 藥組成物可依一般習知藥學之製備方法生產製造，將式G) 或/與式(2)有效成分劑量與一種以上之載體相混合，製備出 所需之劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊或其 他液體製劑，但未以此為限。 此外，由於本發明中之化合物同時具有抗氧化活性，因此亦 可將之添加於保健食品、飲食品、醫藥品、化妝品當中，藉由 其抗氧化能力達到預防心血管疾病或避免細胞突變等效用，使 助益於施用人體之健康。 以下將配合圖式進—步說明本發明的實施方式，下述所列舉 的實施㈣__本剌，並_以限定本剌之範圍，任何 熟習此技藝者，在不麟本發明之精神和範圍内，#可做 ，與潤飾’因此本發明之賴範圍當視後附之帽專利範圍所界 者為準。 【實施方式】 首先取牛樟芝（松祕〇論）菌絲體 之ί合物，利用f知萃取方式，以水或有機溶劑 2卒 叫得牛樟芝水萃取物或有驗料取物 〃、中’有機溶劑可包括醇類（例如甲醇、乙醇或丙醇）、 1361687 酯類（例如乙酸乙酯）、烷類（例如己烷）或_燒（例士 氯曱烷、氯乙烷），但並不以此為限。其中較佳者為醇*貝° 更佳者為乙醇。 ' 經萃取過後之牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物， 進一步藉由高效液相層析加以分離純化，之後再對每 、 液（fraction)進行抑癌效果的測試。最後，則針對具抑二 效果之分液進行成分分析，將可能產生抑癌效果的成分^ 分別進一步做不同癌症腫瘤細胞之抑制效果測試。最終即 發現本發明中如式（1)/式（2)之化合物係具有抑制不同癌^ 腫瘤細胞生長之效果，且該化合物經與習知文獻比對，並 未曾發現於牛樟芝中，因此係一新穎之化合物。 為方便說明本發明，以下將以式（2)之4-經基·2,3_二甲 氧基-6_甲基-5 (3,7，11-三曱基_2,6，10_十二碳三烯）_2_環己 烯酮化合物進行說明。此外，為證實4_羥基_2,3_二曱氧基 -6-曱基·5 (3,7，11_三甲基_2,6，1〇_十二碳三稀）_2_環己稀網 φ化合物對腫瘤細胞生之抑制效果，本發明中係以ΜΤΤ分析 法’根據美國國家癌症研究所（Nati〇nal Cancer Institme， NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式’對包括乳癌、肝癌與攝護腺 癌等腫瘤細胞進行細胞存活率之測試。由該些測試證實， 4-經基-2,3-二f氧基甲基_5 (^以-三曱基^^十二 碳三烯）-2-環己烯酮對於乳癌腫瘤細胞（包括MCF_7與 MDA_MB·231)、肝癌腫瘤細胞（包括Hep3B與HepG2) 與攝護腺癌腫瘤細胞（包括LNCaP與DU-145)等皆可降 9 1361687 低其存活率，相對之下並可同時降低生長半抑制率所需濃 度（即IC50值），因此得藉由4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基 -5(3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯酮，應用 於包括乳癌、肝癌與攝護腺癌等腫瘤細胞之生長抑制上， 而進一步可利用於乳癌、肝癌與攝護腺癌等癌症之治療。 _ 茲對前述實施方式詳盡說明如下： 實施例1 : φ 4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三曱基-2,6，10-十二 . 碳三烯）-2-環己烯酮的分離 將100克左右之牛樟芝菌絲體、子實體或二者之混合 物，置入三角錐形瓶中，加入適當比例的水與醇類 ' (70%〜100%醇類水溶液），於20〜25°C下攪拌萃取至少1 -小時以上，之後以濾紙及0.45 μηι濾膜過濾，收集萃取液。 將前述收集之牛樟芝萃取液，利用高效能液相層析儀 籲 （High Performance Liquid chromatography)，以 RP18 的層析 管（column)進行分析，並以曱醇(A)及0.1%〜0.5%醋酸水溶 液(B)做為移動相（mobile phase)(其溶液比例係：0〜10分 鐘，B比例為95% -20% ; 10〜20分鐘，B比例為20%〜10% ; 20〜35分鐘，B比例為10%〜10%; 35〜40分鐘，B比例為 10%〜95%)，在每分鐘1 ml之速度下沖提，同時以紫外-可見光全波長偵測器分析。 I36l687 • 將25分鐘至30分鐘之沖提液收集濃縮即可得淡黃色 私末狀之固體產物’此即4-»基-2,3-二甲氧基_6_甲基 (3,7，11-二甲基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯鯛。經分 ' 析’其分子式為C24H38〇4，分子量390，炼點（m p )為 • 48 C〜52 C。核磁共振（NMR )分析值則如下所示： 1H-NMR(CDCl3)5(ppm) ： 1.51 ' 1.67 ' 1.71 > 1.75 > 1.94 ' 2.03 ' 2.07、2.22、2.25、3.68、4.05、5.07 與 5.14。 13C-NMR(CDCl3)5(ppm) : 12.3 卜 16.1、16.12、17.67、25.67、 鲁 26.44、26.74、27.0。、39.71、39.8卜 4.027、43.34、59.22 ' 60.59、120.97、123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、 138.05、160.45 與 197.12。 -經將4-羥基-2,3-二甲氧基-6_曱基(3,7，u•三甲基 -2,6，10-十二碳三稀）_2_環己稀酮與化學式資料庫比對後， 並未發現與前述相同之化合物結構，因此，此化合物係一 新穎且前所未見之化合物。 魯實施例2 : 體外抗乳癌腫瘤細胞之活性測試 為進一步測試實施例丨中所發現化合物對腫瘤細胞之 抑制效果’本實施例將根據美國國家癌症研究所（Nati〇nai Cancer Institute，NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，首先取實施 例1中所分離之4-羥基-2,3-二曱氧基_6_曱基-5 (3,7,11-三 甲基·2,6，10-十二碳三烯）_2_環己烯酮化合物，加入MCF_7 與MDA-MB-231人類腫瘤細胞培養液中，進行腫瘤細胞存 1361687 活性之測試。細胞存活性之測試可採習知之MTT分析法進 行分析，而MCF-7與MDA-MB-231皆係人類之乳癌腫瘤 細胞系。 ΜΤΤ分析法是一種常見用於分析細胞增生（cell proliferation )、存活率（percent of viable cells )以及細胞 毒性（cytotoxicity )的分析方法。其中，]^丁1'(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide )為一 黃色染劑，它可被活細胞吸收並被粒腺體中的琥珀酸四吐 •還原酶（succinate tetrazolium reductase)還原成不溶水性 且呈藍紫色的formazan，因此藉由formazan形成與否，即 可判斷並計算細胞之存活率。 首先將人類乳癌細胞MCF-7與MDA-MB-231分別於 含有胎牛血清之培養液中培養24小時。將增生後之細胞以 PBS清洗一次’並以1倍之胰蛋白酶-EDTA處理細胞，隨 後於1，200 rpm下離心5分鐘’將細胞沈澱並丟棄上清液。 Φ 之後加入10 ml的新培養液’輕微搖晃使細胞再次懸浮， 再將細胞分置於96孔微量盤内。測試時，分別於每一孔内 加入30、10、3、1、0.3、0.1與0.03 pg/mi牛樟芝乙醇萃 取物（對照組’未經純化分離之總萃取物）以及4-經基_2,3_ 二曱氧基-6-曱基-5 ( 3,7，11-三曱基-2,6，l〇-十二碳三烯）_2_ 環己烯酮（試驗組）’於37°C、5% C〇2下培養48小時。 其後’於避光的環境下於每一孔内加入2.5 mg/ml的MTT， 反應4小時後再於每一孔内加入100 μΐ的iySis buffer終止 12 1361687 反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測定 其吸光值，藉以計算細胞的存活率，並推算出其生長半抑 制率所需濃度（即IC5Q值），其結果如表一所示。 表一：體外對乳癌腫瘤細胞存活率之測試結果 測试樣品 IC5〇 ( Mg/ml) 對照組（加入牛樟芝萃取物） MCF-7 11.132 MDA-MB-231 25.812 試驗組（加入式2) MCF-7 0.852 MDA-MB-231 1.031 由表一中可知，藉由4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯酮的作用， 其對於MCF-7人類乳癌腫瘤細胞之IC5〇值為0.852 pg/ml， 對於MDA-MB-231人類乳癌腫瘤細胞之IC5〇值則為1.031 pg/ml，相較於牛樟芝萃取混合物所測得之IC5Q值係低的 多，因此可證實牛樟芝萃取物中之4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 ( 3,7，11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯酮確實 能夠利用於乳癌腫瘤細胞生長之抑制。 實施例3 : 體外對乳癌腫瘤細胞輔助治療之活性測試 本測試同樣係根據美國國家癌症研究所的體外篩檢模 式進行測試。首先，取人類乳癌細胞MCF-7與 MDA-MB-231，分別於含有胎牛血清之培養液中培養24小 1361687 時後’將增生後之細胞以PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋 白酶-EDTA處理細胞，隨後於1,200 rpm下離心5分鐘， 將細胞沈殿並丟棄上清液。之後加入10 ml的新培養液， 輕微搖晃使細胞再次懸浮。測試前，先加入0.0017 pg/ml 紫杉醇（Taxol)處理細胞72小時，再將細胞分置於96孔 •微量盤内’之後分別於每孔内加入〇 pg/ml (對照組），30、 10、3、1、0·3、0·1與〇.03 Mg/mi實施例i中所分離之4_ 羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基_5 ( 3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳 • 三烯）·2_環己烯酮（試驗組），於37°C、5% C02下培 養48小時。其後’於避光的環境下於每一孔内加入25 mg/ml的MTT’反應4小時後於每一孔内力口入1 〇〇 μΐ的以sis buffer終止反應。最後以酵素免疫分析儀在wo nm吸光波 " 長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率，並推算出其 - 生長半抑制所需濃度（即IC5G值），其結果如表二所示。 表一 ·體外對乳癌腔瘤細胞經紫杉醇輔助治療後抑制 之測試結果 測試樣品 結果 對照組 細胞存活率（％) MCF-7 (0.0017 μδ/ηι1 Taxol) 65 ±1 MDA-MB-231 (0.0017 pg/ml Taxol) 76±3 試驗組 IC5〇 (Mg/ml) MCF-7 (0.0017 pg/ml Taxol+式 2) 0.009 MDA-MB-231 (0.0017 pg/ml Taxol+式 2) 0.011 14 1361687 由表二中可知，透過紫杉醇之協同作用，4__其23 二甲氧基-6_曱基-5 ( 3,7，i i-三Ψ基_2,6暴十二碳三^ )，_2_ 環己烯酮對於MCF-7人類乳癌腫瘤細胞之冗

Mg/ml，對於MDA_MB_231人類乳癌腫瘤細胞之冗別值亦 降為約0.011 pg/ml，因此可證實牛樟芝萃取物中之4羥基 j，3-二甲氧基_6_曱基-5 ( 3,7，11-三甲基_2,6，1〇_十二碳三 烯）· 2 -環己烯酮確實能夠利用於乳癌腫瘤細胞生長之抑制， 且在紫杉醇之協同作用下’有更佳之抑制效果。 貫施例4 : 體外抗肝癌腫瘤細胞之活性測試 本測試亦係根據美國國家癌症研究所抗腫瘤藥物篩檢 模式進行，將實施例1中所分離之4_羥基_2,3_二甲氧基·6_ 曱基-5 ( 3,7，11-三曱基_2,6,10-十二碳三烯）_2_環己烯酮化合 物，加入Hep 3Β與Hep G2人類肝癌腫瘤細胞培養液中進 行培養’藉以進行腫瘤細胞存活性之測試。 首先將人類肝癌細胞Hep 3B與Hep G2分別於含有胎 牛血清之培養液中培養24小時。將增生後之細胞以pbs 清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶_EDTA處理細胞，隨後於 1，200 rpm下離心5分鐘，將細胞沈澱並丟棄上清液。之後 加入10 ml的新培養液，輕微搖晃使細胞再次懸浮，再將 細胞分置於96孔微量盤内。測試時，分別於每一孔内加入 30、10、3、1、〇.3、〇.1與〇 〇3 pg/ml之牛樟芝乙醇萃取 物（對照組’未經純化分離之總萃取物）以及3〇、10、3、 1361687 1、Ο.3、Ο.1 與 0.03jug/ml 之 4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7，11·三曱基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯酮（試驗 組），於37t、5% C02下培養48小時。其後，於避光 的環境下於每一孔内加入2.5 mg/ml的MTT，反應4小時 後再於母一孔内加入1〇〇 μΐ的lysis buffer終止反應。最後 以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測定其吸光值’ 藉以計算細胞的存活率，並推算出其^⑼值’其結果如表 三戶斤示。 表二：體外對肝癌腫瘤細胞抑制之測試結果 測試樣品 IC50 ( pg/ml) 對只?、組（加入牛掉芝萃取物上 Hep 3B 5.121 Hep G2 18.631 試驗組（加入式2) Hep 3B 0.005 Hep G2 1.679 由表三中可知，藉由4_羥基_2,3-二甲氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三曱基·2,6，1〇-十二碳三烯）-2-環己稀酮的作用， 其對於Hep 3Β人類肝癌腫瘤細胞之IC5G值降為0.005 pg/m卜對於Hep G2人類肝癌腫瘤細胞之IC5G值則降為 1.679 gg/ml，相較於牛樟芝萃取混合物所測得之IC%值係 低的多，因此可證實牛樟芝萃取物中之4-羥基-2,3-二曱氧 基-6-甲基-5 (3,7,11-三甲基_2,6，1〇-十二碳三烯）-2-環己烯 酮確實能夠利用於肝癌腫瘤細胞生長之抑制。 1361687 實施例5 : 體外對肝癌腫瘤細胞輔助治療之活性測試 本測試同樣係根據美國國家癌症研究所的體外篩檢模 式進行測試。首先，取人類肝癌細胞Hep 3B與Hep G2， 分別於含有胎牛血清之培養液中培養24小時後，將增生後 之細胞以PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶-EDTA處理 細胞，隨後於1，200 rpm下離心5分鐘，將細胞沈澱並丟棄 上清液。之後加入10 ml的新培養液，輕微搖晃使細胞再 ® 次懸浮。測試前，先於Hep 3B細胞株試驗加入0.0043 pg/ml Lovastatin ’而於Hep G2細胞株試驗加入0.0017 pg/ml紫 杉醇（Taxol)，處理細胞72小時，再將細胞分置於96孔 微量盤内，之後分別於每孔内加入〇 pg/mi (對照組），30、 10、3、1、0.3、0.1與〇.〇3 pg/ml實施例1中所分離之4-羥基-2,3-二曱氧基曱基·5 ( 3,7，11-三曱基-2,6，10-十二碳 三烯）-2-環己烯酮（試驗組），於37。〇、5% c〇2下培養 φ 48小時。其後，於避光的環境下於每一孔内加入2·5 mg/ml 的MTT ’反應4小時後於每一孔内加入1 〇〇 μΐ的iySis buffer 終止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下 測定其吸光值’藉以計算細胞的存活率，並推算出其IC5〇 值，其結果如表四所示。 表四：體外對肝癌腫瘤細胞經紫杉醇輔助治療後抑制 之測試結果 __測試樣品 結果 1361687 對照組 細胞存活率（％)

Hep 3B (0.0043 Mg/ml Lovastatin) 61 土3

Hep G2 (0.0017 gg/ml Taxol) 81+2 試驗組 IC5〇(pg/ml)

Hep 3B (0.0043 pg/ml Lovastatin+式 2) 0.002

Hep G2 (0.0017 Kg/ml Taxol + 式 2) 〇.〇〇8 由表四中可知，透過Lovastatin及紫杉醇之協同作用， 4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5 ( 3,7,11-三甲基_2,6,10-十二 • 碳三烯）-2-環己烯酮對於Hep 3B人類肝癌腫瘤細胞之ICso 值降為0.002 pg/ml，對於Hep G2人類肝癌腫瘤細胞之ICso 值亦降為約0.008 pg/m卜因此可證實牛樟芝萃取物中之4-羥基-2,3·二甲氧基-6-曱基-5 ( 3,7，11-三曱基_2,6,10_十二碳 二稀）-2-環己稀酮確實能夠利用於肝癌腫瘤細胞生長之抑 -制’且在紫杉醇之協同作用下，有更佳之抑制效果。 實施例6 : φ 體外抗攝護腺癌腫瘤細胞之活性測試 本測試亦係根據美國國家癌症研究所抗腫瘤藥物筛檢 模式進行，將實施例1中所分離之4-羥基-2,3-二甲氧基_心 甲基-5 ( 3,7,11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯_化合 物’加入LNCaP與DU-145人類攝護腺癌腫瘤細胞培養二 中進行培養，藉以進行腫瘤細胞存活性之測試。 首先將人類攝護腺癌細胞LNCaP與DU-145分別& $ 有胎牛血清之培養液中培養24小時。將增生後之細胞以 18 1361687 PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶-EDTA處理細胞，隨 後於1，200 rpm下離心5分鐘，將細胞沈澱並丟棄上清液。 之後加入10 ml的新培養液’輕微搖晃使細胞再次懸浮， 再將細胞分置於96孔微量盤内。測試時，分別於每一孔内 加入30、10、3、1與0.3 pg/ml牛樟芝乙醇萃取物（對职組， 未經純化分離之總萃取物）以及30、10、3、1與〇.3 Mg/ml由 實施例1所分離之4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基(3,7 n_ 三曱基-2,6，10-十二碳三稀）-2-環己烯嗣（試驗組），於pc、 费 5% C〇2下培養48小時。其後’於避光的環境下於每一 孔内加入2.5 mg/ml的MTT，反應4小時後再於每—孔内 加入100 μΐ的lysis buffer終止反應。最後以酵素免疫分析 儀在570 nm吸光波長下測定其吸光值，藉以計算細胞的 * 存活率，並推算出其IC5Q值，其結果如表五所示。 表五： 體外對攝護腺癌腫瘤細胞抑制之測試結果

由表五中可知，藉由4-羥基-2,3-二曱氧基_6_曱基_5 (3,7，11-二曱基-2,6，1〇-十二碳三烯）_2-環己稀_的作用 1361687 其對於LNCaP人類攝護腺癌腫瘤細胞之π%值降為2 378 pg/ml ’對於DU-145人類攝護腺癌腫瘤細胞之值則降 為1.812 pg/ml ’相較於牛樟芝萃取混合物所測得之值 係低的多，因此可證貫牛樟芝萃取物中之4-經基_2,3-二曱 氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三曱基_261〇_十二碳三烯）_2·環己 烯酮確實能夠利用於攝護腺癌腫瘤細胞生長之抑制。 實施例7 : 體外對攝護腺癌腫瘤細胞辅助治療之活性測試 本測試同樣係根據美國國家癌症研究所的體外篩檢模 式進行測試。首先，取人類攝護腺癌細胞LNCaP與 DU-145 ’分別於含有胎牛血清之培養液中培養24小時後， 將增生後之細胞以PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶 -EDTA處理細胞’隨後於i，2〇〇 rpm下離心5分鐘，將細 胞沈澱並丟棄上清液。之後加入10 ml的新培養液，輕微 搖晃使細胞再次懸浮。測試前，先於LNCaP細胞株試驗加 入0.0017 pg/ml紫杉醇’而於DU-145胞株試驗加入0.0043 pg/ml紫杉醇分別處理細胞72小時，再將細胞分置於96 孔微量盤内，之後分別於每孔内加入〇 pg/ml (對照組）， 30、10、3、1、0.3、0.1 與 〇.〇3 Mg/ml 於實施例 1 中所分 離之4-經基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯）-2·環己烯酮（試驗組），於37。〇、5% C02下 培養48小時。其後，於避光的環境下於每一孔内加入2.5 mg/ml的MTT，反應4小時後於每一孔内加入1 〇〇 μΐ的iysis buffer終止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波 20 1361687 長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率，並推算出其 IC5〇值’其結果如表六所示。 表六：體外對攝護腺癌腫瘤細胞經紫杉醇輔助治療後 抑制之測試結果 ——— 測試樣品 結果 對照組 細胞存活率（％) LNCaP (0.0017 pg/ml Taxol) 56±3 DU-145 (0.0043 pg/ml Taxol) 70±2 試驗組 IC5〇 (Mg/ml) LNCaP (0.0017pg/ml Taxol+式 2) 0.961 DU_145 (0.0043pg/ml Taxol+式 2) 0.515 由表六中可知，透過紫杉醇之協同作用，4-經基-2,3-- 一曱氧基-6-曱基-5 ( 3,7，11-三曱基-2,6，l〇-十二石炭三稀）-2-環己烯酮對於LNCaP人類攝護腺癌腫瘤細胞之IC5G值降為 0.961 pg/m卜對於DU-145人類攝護腺癌腫瘤細胞之IC5〇 # 值亦降為約〇·515 pg/m卜相較於牛樟芝萃取混合物所測得 之ICm值係低的多，因此可證實牛樟芝萃取物中之4_羥基 -2,3-二曱氧基-6-曱基-5 ( 3,7，11-三甲基_2,6,10-十二碳三 烯）-2-環己烯酮確實能夠利用於攝護腺癌腫瘤細胞生長之抑 制’且在紫杉醇之協同作用下，有更佳之抑制效果。 貫施例8 : 體外抗氧化活性之試驗 21 1361687 一般抗氧化活性之測試，係利用人類低密度脂蛋白 (human low density lipoprotein > LDL)，加入銅離子（Cu2+) 與待測樣本進行氧化反應’檢測LDL上二烯之反應結果後， • 以維生素E之水溶性類似物Trolox作為對照（Trolox濃度為 . 2 μΜ時，其效力值訂為標準值ΐ·〇)，計算出待測樣本之抗氧 化活性。 首先準備二次純水(控制組）’並配製5 mM磷酸鈉緩衝溶 液（sodium phosphate buffer，SPB )、1 μΜ 與 2 μΜ 的 Trolox _ (對照組)及40μβ/ιη1由實施例1中所分離之4_羥基_2,3-二甲氧 基-6-曱基-5 (3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯酮 (試驗組）。利用酵素法測得低密度膽固醇濃度(LDL-C)後’ 矛J用5 mM SPB.將LDL稀釋至0_ 10〜0.25 mg/ml.間。取96孔 的石英微量盤’於其中先加入100 μΐ之LDL，再分別加入前 述預定濃度的Trolox及由實施例1中所分離之化合物，之後 再分別加入CuS〇4溶液以啟動氧化反應(每一 250 μΐ孔中的銅 (11)濃度為5.0 μΜ) ’最後將該微量盤置於酵素免疫微量盤 寒分析儀（ELISA reader)中進行檢測。酵素免疫微量盤分析儀 檢測波長設為232 nm’溫度設為37°C，偵測時間為12小時’ 採樣間隔時間為15分鐘，其結果如表七所示。 参七：體外抗氧化活性之測試結果 測試樣品 Tlag(分）^Tlag(分） 效力值 玛0(控制組，Tlago) 185 1 μΜ Trolox (對照組） 266 81 0.48 2 μΜ Trolox 344 159 1.00 22 1361687 40 pg/mL 式 2_439 208 1.30 註1 : Tlag(分）係指在吸收光波長為234 nm下，延滯期（lag phase)與連鎖期（propagation phase)的交差點；ATlag(分） 係指各測試樣品Tlag時間與Tlag〇時間的差值。 註2 :效力值>0.5時，表示其具抗氧化作用。 由表七中可知，4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三 曱基-2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯酮具有1.30之效力值，其 比具抗氧化能力之標準值0.5高出甚多，亦即，其具有相當之 抗氧化能力，因此可用作保健食品、飲食品、醫藥品、化妝品 當中之成分，藉由其抗氧化能力達到預防心血管疾病或避免細 胞突變等效用，使對於施用之人體健康產生莫大的助益。 23 1361687 【圖式簡單說明】 益 *»»' 【主要元件符號說明】

Claims (1)

1361687 七、申請專利範圍： 1、 一種化合物，該化合物係4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基 -5(3,7，11-三曱基_2,6，10-十二碳三烯）-2-環己稀酮 ‘ （ 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,l 1- . trimethyl -dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone)° 2、 如申請專利範圍第1項所述之該化合物，其係分離自 牛棒芝。 • 3、一種將如申請專利範圍第1項所述化合物利用於製 備抑制乳癌腫瘤細胞生長之藥物的應用。 4、如申請專利範圍第3項所述之應用，其中該乳癌腫瘤 細胞係MCF-7或MDA-MB-231細胞系。 矗 . 5、一種將如申請專利範圍第1項所述化合物利用於製 備抑制肝癌腫瘤細胞生長之藥物的應用。 6、 如申請專利範圍第5項所述之應用，其中該肝癌腫瘤 % 細胞係Hep 3B或Hep G2細胞系。 7、 一種將如申請專利範圍第丨項所述化合物利用於製 備抑制攝護腺癌腫瘤細胞生長之藥物的應用。 8、 如申請專利範圍第7項所述之應用，其中該攝護腺癌 腫瘤細胞係LNCaP或DU145細胞系。 9、 一種將如申請專利範圍第1項所述之化合物利用於製備具 抗氧化活性之藥物的應用。 25 1361687 ίο、一種利用於抑制腫瘤細胞生長之醫藥組成物，包括一有效 劑量如ΐ請專利範圍第1項所述之化合物以及一藥學上可 接受之載體，其中該腫瘤細胞係選自乳癌、肝癌或攝護腺 癌之腫瘤細胞。 26