CN101362679B - 用于抑制b型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种用于抑制B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合物,尤其是关于一种由牛樟芝萃取物中所分离出的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5[3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl]-cyclohex-2-enone),并可有效抑制B型肝炎病毒。本发明中,牛樟芝环己烯酮化合物对于能分泌B型肝炎病毒的人类肝癌细胞株HepG2 2.2.15具细胞毒性,并可降低B型肝炎病毒颗粒的生成量,且可有效抑制B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg),藉以达到抑制B型肝炎病毒的目的。
Description
技术领域
本发明是关于一种用于抑制病毒的化合物,尤其是关于一种自牛樟芝(Antrodia camphorata)萃取物中分离纯化而得且可用于抑制B型肝炎病毒的环己烯酮化合物。
背景技术
B型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)属于肝病毒科(Hepadnviridae),其是可以造成持续非细胞病变性(noncytopathic)肝脏感染的小型脱氧核糖核酸类病毒体,并具有蛋白外套膜(envelope),也是目前人类肝炎病毒中唯一的DNA病毒;B型肝炎病毒的外膜约含25%脂质以及75%糖蛋白,糖蛋白的主要成分为B型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen;HbsAg),而B型肝炎病毒核心颗粒中含有B型肝炎外套膜抗原(hepatitis B envelop antigen;HbeAg),其中,B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)是一种分泌性蛋白(secretoryprotein),早期即可通过胎盘进入胎儿体内,此时胎儿免疫系统尚未成熟,因此毒杀性T淋巴细胞会对B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)产生耐受性,导致人体免疫系统无法清除B型肝炎病毒,使病毒可大量复制,故B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)也被视为是一种耐受原(tolerogen),因此,B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)含量的侦测结果,可作为评估B型肝炎病毒复制与分泌情况的指标。世界卫生组织的调查中显示,全世界约有超过二十亿的人口曾被B型肝炎病毒感染,是个流行率相当高的病毒,主要通过亲代垂直感染,感染后会引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、甚至是肝癌。在台湾地区,三十岁以上的男子约有百分之九十的人曾受B型肝炎病毒感染,其中15%~20%的人会变成终身带原者,并有可能转变成肝硬化、肝癌而死亡,故台湾是B型肝炎感染严重的地方,同时也是肝癌好发的地区。
由前述可知,B型肝炎病毒的感染与肝脏疾病以及肝癌的形成关系密切,因此,如何干扰并抑制病毒复制,彻底根除慢性感染,是抗病毒治疗的主要研 究目标;此外,近年来不论是使用干扰素、抗病毒药物或疫苗来防治B型肝炎病毒感染已有不错的成效,但在慢性B型肝炎带原者的治疗上,仍无法彻底根除病毒,此为造成B型肝炎病毒引发肝脏相关疾病并造成高致死率的主因,因此,开发出可有效抑制B型肝炎病毒的抗病毒药物刻不容缓。
牛樟芝(Antrodia camphorata),又称樟芝、牛樟菇或红樟芝等,属于非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)的多年生蕈菌类,为台湾特有种真菌,仅生长于台湾保育类树种-牛樟树(Cinnamoum kanehirai Hay)的中空腐朽心材内壁上。由于牛樟树分布数量极为稀少,加上人为的盗伐,使得寄生于其中方能生长的野生牛樟芝数量更形稀少,且由于其子实体生长相当缓慢,生长期也仅在六月至十月之间,因此价格非常昂贵。
牛樟芝的子实体为多年生,无柄,呈木栓质至木质,其具强烈的樟树香气,且形态多变化,有板状、钟状、马蹄状或塔状。初生时为扁平型并呈鲜红色,之后其周边会呈现放射反卷状,并向四周扩展生长,颜色也转变为淡红褐色或淡黄褐色,并有许多细孔,且其是牛樟芝药用价值最丰富的部位。
在台湾民俗医学上,牛樟芝具有解毒、减轻腹泻症状、消炎、治疗肝脏相关疾病及抗癌等功用。牛樟芝如同一般食药用的蕈菇类,具有许多复杂的成分,已知的生理活性成分中,包括:三萜类化合物(triterpenoids)、多糖体(polysaccharides,如β-D-葡聚糖)、腺苷(adenosine)、维生素(如维生素B、烟碱酸)、蛋白质(含免疫球蛋白)、超氧歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、微量元素(如:钙、磷、锗)、核酸、固醇类以及血压稳定物质(如antodia acid)等,此些生理活性成分被认为具有抗肿瘤、增加免疫能力、抗过敏、抗病菌、抗高血压、降血糖及降胆固醇等多种功效。
牛樟芝众多成分中以三萜类化合物被研究的最多,三萜类化合物是由三十个碳元素结合成六角形或五角形天然化合物的总称,牛樟芝所具的苦味即主要来自三萜类此成分。1995年时,Cherng等人发现牛樟芝子实体萃取物中含有三种新的以麦角甾烷(ergostane)为骨架的三萜类化合物:antcin A、antcin B与antcin C(Cherng,I.H.,and Chiang,H.C.1995.Three new triterpenoids fromAntrodia cinnamomea.J.Nat.Prod.58:365-371)。Chen等人以乙醇萃取樟芝子实体后发现zhankuic acid A、zhankuic acid B及zhankuic acid C等三种三萜类化 合物(Chen,C.H.,and Yang,S.W.1995.New steroid acids from Antrodiacinnamomea,-a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum.J.Nat.Prod.58:1655-1661)。此外,Chiang等人于1995年也由子实体萃取物中发现另外三种分别为倍半萜内酯(sesquiterpene lactone)与两种双酚类衍生物的新三萜类化合物,此即antrocin,4,7-二甲氧基-5-甲基-1,3-苯并二氧环(4,7-dimethoxy-5-methy-1,3-benzodioxole)与2,2′,5,5′-四甲氧基-3,4,3′,4′-双-亚甲二氧基-6,6′-二甲基联苯(2,2′,5,5′-teramethoxy-3,4,3′,4′-bi-methylenedioxy-6,6′-dimethylbiphenyl)(Chiang,H.C.,Wu,D.P.,Cherng,I.W.,and Ueng,C.H.1995.A sesquiterpene lactone,phenyl and biphenyl compounds from Antrodiacinnamomea.Phytochemistry.39:613-616)。到了1996年,Cherng等人以同样分析方法再度发现四种新的三萜类化合物:antcin E、antcin F、methyl antcinateG、methyl antcinate H(Cherng,I.H.,Wu,D.P.,and Chiang,H.C.1996.Triteroenoids from Antrodia cinnamomea.Phytochemistry.41:263-267);而Yang等人则发现了二种以麦角甾烷为骨架的新化合物zhankuic acid D、zhankuicacid E和三种以羊毛甾烷(lanostane)为骨架的新化合物:15α-乙酰-去氢硫色多孔菌酸(15α-acetyl-dehydrosulphurenic acid)、去氢齿孔酸(dehydroeburicoic acid)与去水硫色多孔菌酸(dehydrasulphurenic acid)(Yang,S.W.,Shen,Y.C.,and Chen,C.H.1996.Steroids and triterpenoids of Antrodiacinnamomea-a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum.Phytochemistry.41:1389-1392)。
虽然由目前诸多的实验可得知牛樟芝萃取物具有前述功效,且其所含成分也陆续被分析出,但究竟牛樟芝萃取物中何种有效成分可抑制B型肝炎病毒感染并治疗与B型肝炎病毒相关的肝脏疾病,仍有待进一步实验研究来厘清,故若能找出牛樟芝萃取物中所含真正有效抑制B型肝炎病毒的成分,对于急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化以及肝癌等与B型肝炎病毒相关肝脏疾病的治疗将产生莫大的帮助。
发明内容
为明了牛樟芝萃取物中究竟是何成分可有效抑制B型肝炎病毒感染,本发明由牛樟芝萃取物中分离纯化出具式(1)结构式的化合物;
其中,X是氧(O)或硫(S),Y是氧或硫;R1是氢基(H)、甲基(CH3)或(CH2)m-CH3,R2是氢基、甲基或(CH2)m-CH3,R3是氢基、甲基或(CH2)m-CH3,m=1~12;n=1~12。
如式(1)结构式的化合物中,较佳者为如下所示式(2)的化合物:
式(2)的化合物,其化学名为4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone),分子式为C24H38O4,外观为淡黄色粉末状,分子量为390。
本发明中式(1)、式(2)的化合物是分离纯化自牛樟芝水萃取物或有机溶剂萃取物,有机溶剂可包括醇类(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯类(例如乙酸乙酯)、烷类(例如己烷)或卤代烷(例如氯甲烷、氯乙烷),但并不以此为限,其中较佳者为醇类,更佳者为乙醇。
通过前述化合物,本发明将其应用于抑制B型肝炎病毒感染上,使能进一步用于治疗B型肝炎病毒所致相关肝脏疾病的医药组合物中,增益急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化以及肝癌等与B型肝炎病毒相关的肝脏疾病的治疗效果。结果显示,当以本发明式(1)和/或式(2)的化合物处理可分泌具感染能力的B型肝炎病毒的肝癌细胞株HepG2 2.2.15时,其可有效抑制该肝癌细胞株的细胞相对存活率,并降低由B型肝炎病毒所生成的B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成量,达到抑制B型肝炎 病毒复制及分泌的目的,进而可将由天然成分所萃取出的该化合物利用于与B型肝炎病毒相关的肝脏疾病的治疗上。
另一方面,本发明中也可将式(1)和/或式(2)的化合物利用于治疗B型肝炎病毒所致相关肝脏疾病的医药组合物的成分中,藉以抑制B型肝炎病毒的复制及分泌,进而减缓急性或慢性肝炎感染,并降低肝炎带原者转变为肝硬化或肝癌而死亡的发生率。前述医药组合物除包括有效剂量的式(1)和/或式(2)的化合物外,还可以包括药学上可接受的载体。载体可为赋形剂(如水)、填充剂(如蔗糖或淀粉)、黏合剂(如纤维素衍生物)、稀释剂、崩解剂、吸收促进剂或甜味剂,但并不仅限于此。本发明医药组合物可依一般悉知药学的制备方法生产制造,将式(1)和/或式(2)有效成分剂量与一种以上的载体相混合,制备出所需的剂型,此剂型可包括锭剂、粉剂、粒剂、胶囊或其它液体制剂,但未以此为限。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式,下述所列举的实施例用以阐明本发明,并非用以限定本发明的范围,任何熟悉此技艺者,在不脱离本发明的精神和范围内,当可做些许更动与润饰,因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。
附图说明
图1是本发明实施例所分离出的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对人类肝癌细胞HepG2 2.2.15存活率的影响结果。(A)图是4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮;(B)图是牛樟芝粗萃取物。垂直线代表三次独立试验的标准偏差值;
图2是本发明实施例所分离出的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量的影响结果。(A)图是4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮;(B)图是牛樟芝粗萃取物。垂直线代表三次独立试验的标准偏差值;
图3是本发明实施例所分离出的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生 成量的影响结果。(A)图是4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮;(B)图是牛樟芝粗萃取物。垂直线代表三次独立试验的标准偏差值。
具体实施方式
首先取牛樟芝(Antrodia camphorata)菌丝体、子实体或二者的混合物,利用悉知萃取方式,以水或有机溶剂进行萃取,藉以取得牛樟芝水萃取物或有机溶剂萃取物。其中,有机溶剂可包括醇类(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯类(例如乙酸乙酯)、烷类(例如己烷)或卤代烷(例如氯甲烷、氯乙烷),但并不以此为限。其中较佳者为醇类,更佳者为乙醇。
经萃取过后的牛樟芝水萃取物或有机溶剂萃取物,可进一步通过高效液相层析加以分离纯化,之后再对每一分液(fraction)进行抑制B型肝炎病毒复制的相关生化测试。最后,则针对具抑制B型肝炎病毒复制效果的分液进行成分分析,再进一步分别做相关的生化测试,例如:各分液中所含有效成份对于肝癌细胞株HepG2 2.2.15的细胞毒性的影响以及检测B型肝炎表面抗原(HbsAg)与B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)含量等测试。最终即发现本发明中如式(1)/式(2)的化合物具有抑制B型肝炎病毒复制的效果。
为方便说明本发明,以下将以式(2)的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮化合物进行说明。此外,为证实4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮化合物对肝癌细胞HepG2 2.2.15生长的细胞毒性影响,并研究该牛樟芝环己烯酮化合物是否可有效抑制B型肝炎病毒的复制,本发明中以MTT分析法,根据美国国家癌症研究所(National CancerInstitute,NCI)抗肿瘤药物筛检模式,对肝癌细胞HepG2 2.2.15进行细胞存活率的测试,并利用半定量酶联免疫分析法侦测由B型肝炎病毒所分泌的B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的含量。由这些测试证实,牛樟芝环己烯酮化合物可降低肝癌肿瘤细胞HepG2 2.2.15的存活率,并有效抑制B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B 型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的形成,进而达到抑制B型肝炎病毒复制与分泌的目的。兹对前述实施方式详尽说明如下:
实施例1:
4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮的分离
将100克左右的牛樟芝菌丝体、子实体或二者的混合物,置入三角锥形瓶中,加入适当比例的水与醇类(例如70%以上的醇类水溶液),于20~25℃下搅拌萃取至少1小时以上,之后以滤纸及0.45μm滤膜过滤,收集萃取液。
将前述收集的牛樟芝萃取液,利用高效液相色谱仪(HighPerformance Liquid chromatography),以RP18的色谱柱(column)进行分析,并以甲醇(A)及0.1%~0.5%醋酸水溶液(B)做为移动相(mobilephase)(其溶液比例是:0~10分钟,B比例为95%~20%;10~20分钟,B比例为20%~10%;20~35分钟,B比例为10%~10%;35~40分钟,B比例为10%~95%),在每分钟1ml的速度下冲提,同时以紫外-可见光全波长侦测器分析。
将25分钟至30分钟的冲提液收集浓缩即可得淡黄色粉末状的固体产物,此即4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮。经分析,其分子式为C24H38O4,分子量390,熔点(m.p.)为48℃~52℃。核磁共振(NMR)分析值则如下所示: 1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.51、1.67、1.71、1.75、1.94、2.03、2.07、2.22、2.25、3.68、4.05、5.07与5.14。13C-NMR(CDCl3)δ(ppm):12.31、16.1、16.12、17.67、25.67、26.44、26.74、27.00、39.71、39.81、4.027、43.34、59.22、60.59、120.97、123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、138.05、160.45与197.12。
实施例2:
牛樟芝环己烯酮化合物体外对肝癌肿瘤细胞的毒性测试
为进一步测试实施例1中的牛樟芝环己烯酮化合物对肝癌肿瘤细胞的抑制效果,本实施例是根据美国国家癌症研究所(National CancerInstitute,NCI)抗肿瘤药物筛检模式进行的,首先取实施例1中所分离的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮,加入HepG2 2.2.15人类肝肿瘤细胞培养液中,进行肿瘤细胞存活性的测试。细胞存活性的测试可采用悉知的MTT分析法进行分析,而HepG2 2.2.15是人类的肝癌肿瘤细胞系,且该细胞系可分泌具感染能力的B型肝炎病毒。
MTT分析法是一种常见用于分析细胞增殖(cell proliferation)、存活率(percent of viable cells)以及细胞毒性(cytotoxicity)的分析方法。其中,MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide)为黄色染剂,它可被活细胞吸收并被线粒体中的琥珀酸四唑还原酶(succinate tetrazolium reductase)还原成不溶水性且呈蓝紫色的formazan,因此通过甲 (formazan)形成与否,即可判断并计算细胞的存活率。
首先将人类肝癌细胞HepG2 2.2.15置于含有10%胎牛血清以及200μg/ml抗生素G418的仅含12种必需氨基酸、谷氨酸胺和8种维生素的低限量基础培养基(minimum essential medium,MEM)(Gibco Co.,USA)中培养24小时。将增殖后的细胞以PBS清洗一次,并以1倍的胰蛋白酶-EDTA处理细胞,随后于1,200rpm下离心5分钟,将细胞沉淀并丢弃上清液。之后加入10ml的新培养液,轻微摇晃使细胞再次悬浮,再将5000个细胞分置于96孔微量培养板内。测试时,分别于每一孔内加入以二甲基硫酸(dimethyl sulfoxide,DMSO)所配制的0.1、1、10μg/ml牛樟芝粗萃取物(对照组,未经纯化分离的牛樟芝乙醇总萃取物)以及4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮(实验组),并以完全不添加任何物质者为对照组,于37℃、5%CO2下培养22小时。其后,于避光的环境下于每一孔内加入2.5mg/ml的MTT,反应2小时后,移除培养基,并加入50μl二甲基硫酸(DMSO)溶解结晶。最后以酶免疫分析仪在570nm吸光波长下测定其吸光值,并将此测 得数值与未经处理的对照组的细胞数值相比较,藉以计算得细胞相对的存活率(%),其结果如图1所示。
请参阅图1,该图是本发明实施例所分离出的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对人类肝癌细胞HepG22.2.15存活率的影响结果。由图1中可知,相对于对照组牛樟芝粗萃取物的细胞相对存活率结果,4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮可有效降低人类肝癌细胞HepG22.2.15的存活率,且经浓度为10μg/ml牛樟芝环己烯酮化合物处理后的癌细胞存活率可低至约81%以下,因此可证实分离自牛樟芝萃取物的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮确实能够利用于肝癌肿瘤细胞HepG2 2.2.15生长的抑制。
实施例3:
牛樟芝环己烯酮化合物体外对B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的影响
为测试实施例1分离纯化出的牛樟芝环己烯酮化合物对B型肝炎病毒所产生的B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的影响,本实施例先培养人类肝癌细胞HepG2 2.2.15,并于此细胞的培养基中加入牛樟芝环己烯酮化合物,再以半定量的酶联免疫分析法(enzyme-linked immunoabsorbent assy,ELISA)检测培养基中B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成量,通过此两病毒指针来评估牛樟芝环己烯酮化合物可否有效抑制B型肝炎病毒。其中,HepG2 2.2.15细胞系利用包含B型肝炎病毒基因组(HBVgenome)的质体(plasmid)转染人类肝肿瘤细胞株HepG2,并经过抗生素G418筛选所得可分泌B型肝炎表面抗原(HbsAg)、B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)、核蛋白衣壳(nucleocapsid)以及病毒颗粒(virion)的细胞株(Sells,M.A.,Chen,M.L.and Acs,G.1987.Production of hepatitisB virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virusDNA.Proc.Natl.Acad.Sci. USA.84:1005-1009)。
首先将人类肝癌细胞HepG2 2.2.15置于含有10%胎牛血清以及200μg/ml抗生素G418的MEM培养基(Gibco Co.,USA)中培养24小时。将增殖后的细胞以PBS清洗一次,并以1倍的胰蛋白酶-EDTA处理细胞,随后于1,200rpm下离心5分钟,将细胞沉淀并丢弃上清液。之后加入10ml的新培养液,轻微摇晃使细胞再次悬浮,再将5000个细胞分置于96孔微量培养板内。测试时,分别于每一孔内加入以二甲基硫酸(dimethylsulfoxide,DMSO)配置且浓度分别为0.1、1、10μg/ml的牛樟芝粗萃取物(对照组,未经纯化分离的牛樟芝乙醇总萃取物)以及4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮,并以完全不添加任何物质者为对照组,于37℃、5%CO2下培养22小时。再取适量的各培养液,通过抗人类B型肝炎病毒表面抗原的单株抗体(monoclonal antibody)及抗人类B型肝炎病毒外套膜抗原的多源抗体(multiclonal antibody)的酶联免疫检验试剂分析试剂盒(generalbiologicals corp.,Taiwan,ROC.),利用抗体-抗原-抗体酶接合体的三明治复合体,以含过氧化氢的邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)溶液使之显色,再以酶联免疫分析仪于450nm的波长下,测得培养液中B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的含量,其阴性判定是依照以下公式:cutoff value=O.D.negative control+0.025,其中若OD450的吸光值超过此值则为阳性,其结果如图2与图3中所示。
请参阅图2,该图是本发明实施例所分离出的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量的影响结果,由图中结果显示,相对于对照组牛樟芝粗萃取物的B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量结果,4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮可有效抑制B型肝炎表面抗原(HbsAg)的生成,且随着牛樟芝环己烯酮化合物施予浓度的增加,B型肝炎表面抗原(HbsAg)的生成量便随之下降,经前述各浓度牛樟芝环己烯酮化合物处理后的B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量可降低至60%以下,其中又以浓度为10μg/ml牛樟芝环己烯酮化合物对B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量的抑制效果为最佳,其B型肝炎表面抗原(HbsAg)生成量可低至28%以下,因此可证实由牛樟芝萃取物中分离出的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮确实能够有效降低B型肝炎表面抗原(HbsAg)的生成量,这也显示牛樟芝环己烯酮化合物具有抑制B型肝炎病毒繁殖的功效。
请参阅图3,该图是本发明实施例所分离出的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的影响结果。由图中结果可知,相对于对照组牛樟芝粗萃取物的B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量结果,4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮可有效抑制B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成,经牛樟芝环己烯酮化合物处理后的B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量可低至84%以下,其中又以浓度为1μg/ml的牛樟芝环己烯酮化合物对B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的抑制效果为最佳,其B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量可低至57%以下,因此可证实由牛樟芝萃取物中分离出的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮确实能够有效降低B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的生成量。
另一方面,相对于前述4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对HepG2 2.2.15细胞毒性测试的结果(请参阅图1)可观察到,该牛樟芝环己烯酮化合物抑制B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的数值相对高于该牛樟芝环己烯酮化合物抑制人类肝癌细胞HepG2 2.2.15存活率的数值,这表示4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮对B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)生成量的抑制效果并非因其对细胞具毒性所致。
综上所述,本发明自牛樟芝萃取物中所分离出的新4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮可有效抑制人类肝癌肿瘤细胞HepG2 2.2.15的存活率,且可抑制B型肝炎表面抗原(HbsAg)以及B型肝炎外套膜抗原(HbeAg)的形成,因此这些化合 物可用于抑制B型肝炎病毒的复制与分泌,同时可利用于与B型肝炎病毒相关的肝脏疾病的治疗上。另外,也可将其制备成医药组合物,此医药组合物除包含有效剂量的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮外,还可以包括药学上可接受的载体。载体可为赋形剂(如水)、填充剂(如蔗糖或淀粉)、黏合剂(如纤维素衍生物)、稀释剂、崩解剂、吸收促进剂或甜味剂,但并不仅限于此。本发明医药组合物可依一般悉知药学的制备方法生产制造,将有效成分剂量的这些牛樟芝化合物与一种以上的载体相混合,制备出所需的剂型,此剂型可包括锭剂、粉剂、粒剂、胶囊或其它液体制剂,但未以此为限。
Claims (7)
1.化合物4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮在制备用于治疗B型肝炎病毒所引起疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其中,所述化合物降低B型肝炎表面抗原生成量的使用浓度为10μg/ml。
3.根据权利要求1所述的应用,其中,所述化合物降低B型肝炎外套膜抗原生成量的使用浓度为1μg/ml。
4.根据权利要求1所述的应用,其中,所述B型肝炎病毒所引起疾病包含急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化以及肝癌。
5.化合物4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮在制备用于抑制B型肝炎病毒的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其中,所述化合物降低B型肝炎表面抗原生成量的使用浓度为10μg/ml。
7.根据权利要求5所述的应用,其中,所述化合物降低B型肝炎外套膜抗原生成量的使用浓度为1μg/ml。
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