WO2009018726A1 - Composé de cyclohexénone d'antrodia camphorata utilisé pour inhiber le virus de l'hépatite b - Google Patents

Composé de cyclohexénone d'antrodia camphorata utilisé pour inhiber le virus de l'hépatite b Download PDF

Info

Publication number
WO2009018726A1
WO2009018726A1 PCT/CN2008/070386 CN2008070386W WO2009018726A1 WO 2009018726 A1 WO2009018726 A1 WO 2009018726A1 CN 2008070386 W CN2008070386 W CN 2008070386W WO 2009018726 A1 WO2009018726 A1 WO 2009018726A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hepatitis
virus
compound
cyclohexenone
inhibiting
Prior art date
Application number
PCT/CN2008/070386
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Sheng-Yun Liu
Wu-Che Wen
Mao-Tien Kuo
Original Assignee
Golden Biotechnology Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Golden Biotechnology Corporation filed Critical Golden Biotechnology Corporation
Publication of WO2009018726A1 publication Critical patent/WO2009018726A1/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/07—Basidiomycota, e.g. Cryptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C403/00—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone
    • C07C403/02—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone having side-chains containing only carbon and hydrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/16—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring the ring being unsaturated

Definitions

  • the present invention relates to a compound for inhibiting viruses, and more particularly to a cyclohexenone compound which is isolated and purified from an extract of Antrodia camphorata and which can be used for inhibiting hepatitis B virus. Background technique
  • Hepatitis B virus belongs to the Hepatoviridae family, which is a small deoxyribonucleic acid virion that can cause persistent noncytopathic liver infection and has a protein envelope. It is also the only DNA virus in human hepatitis virus; the outer membrane of hepatitis B virus contains about 25% lipid and 75% glycoprotein, and the main component of glycoprotein is hepatitis B surface antigen (HbsAg).
  • the hepatitis B virus core particle contains hepatitis B coatment antigen (HbeAg), wherein the hepatitis B coat membrane antigen (HbeAg) is a secretory protein, which can be early.
  • hepatitis B mantle antigen HbeAg
  • HbeAg hepatitis B coat membrane antigen
  • HbsAg hepatitis B surface antigen
  • HbeAg hepatitis B coat membrane antigen
  • Taiwan Taiwan is a place where hepatitis B infection is serious, and it is also a region where liver cancer is prone to occur.
  • Antrodia camphorata also known as Antrodia camphorata, burdock or red locust, etc.
  • Antrodia camphorata is a perennial fungus belonging to the genus Aphyllophorales and Polyporaceae. It is a unique species of fungi in Taiwan and only grows in Taiwan.
  • the fruiting body of Antrodia camphorata is perennial, sessile, with cork to wood. It has a strong aroma of eucalyptus, and its morphology varies, and it has a plate shape, a bell shape, a horseshoe shape or a tower shape. It is flat and bright red at the time of birth, and then it radiates and rewinds around it, and grows to the periphery. The color also changes to reddish brown or yellowish brown, and there are many fine pores, and it is medicinal The most valuable part.
  • Niobium has the functions of detoxification, alleviating diarrhea, anti-inflammatory, treating liver-related diseases and anti-cancer.
  • Antrodia camphorata has many complex ingredients, such as triterpenoids, polysaccharides (such as ⁇ -D-glucan), and many other physiologically active ingredients.
  • Adenosine, vitamins (such as vitamin B, nicotinic acid), proteins (including immunoglobulins), superoxide dismutase (SOD), trace elements (such as calcium, phosphorus, strontium), nucleic acids, Sterols and blood pressure stabilizing substances (such as antodia acid), etc., are considered to have anti-tumor, immune-enhancing, anti-allergic, anti-pathogenic, anti-hypertensive, hypoglycemic and cholesterol-lowering effects.
  • Triterpenoids are a general term for the combination of thirty carbon elements into hexagonal or pentagonal natural compounds.
  • the bitterness of Antrodia camphorata is mainly derived from triterpenoids.
  • Chemg et al. found that three extracts of triterpenoids based on ergostane were found in the extract of Antrodia camphorata fruit bodies: antcin A, antcin B and antcin C (Chemg, IH, and Chiang, HC 1995. Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea. J. Nat. Prod. 58:365-371). Chen et al. and E.
  • X oxygen (0) or sulfur (S)
  • Y oxygen or sulfur
  • R 2 is hydrogen, fluorenyl Or (CH 2 ) m -CH 3
  • the compound of the formula (1) and the formula (2) in the present invention is isolated and purified from an aqueous extract of Antrodia camphorata or an organic solvent extract, and the organic solvent may include an alcohol (for example, decyl alcohol, ethanol or propanol), an ester (for example, acetic acid B). Ester), alkane (e.g., hexane) or alkane (e.g., chlorodecane, ethyl chloride), but not limited thereto, preferably an alcohol, more preferably ethanol.
  • an alcohol for example, decyl alcohol, ethanol or propanol
  • an ester for example, acetic acid B
  • Ester alkane
  • alkane e.g., hexane
  • alkane e.g., chlorodecane, ethyl chloride
  • the present invention is applied to a pharmaceutical composition for inhibiting hepatitis B virus infection and further for treating liver diseases caused by hepatitis B virus, and is capable of augmenting acute hepatitis, chronic hepatitis, liver cirrhosis, and liver cancer.
  • the therapeutic effect of liver diseases associated with hepatitis B virus show that when the hepatoma cell line HepG2 2.2.15 which can secrete the infectious hepatitis B virus is treated with the compound of the formula (1) and/or the formula (2) of the present invention, it can effectively inhibit the liver cancer cell line.
  • Relative cell survival rate and reduction of hepatitis B surface antigen produced by hepatitis B virus (HbsAg) and the production of hepatitis B mantle antigen (HbeAg) to inhibit the replication and secretion of hepatitis B virus, and the compound extracted from natural components can be used in the liver associated with hepatitis B virus. Treatment of the disease.
  • the compound of the formula (1) and/or the formula (2) can also be used in the composition of a pharmaceutical composition for treating a liver disease associated with hepatitis B virus, thereby suppressing the hepatitis B virus. Replication and secretion, thereby slowing down acute or chronic hepatitis infections, and reducing the incidence of death from hepatitis patients who have converted to cirrhosis or liver cancer.
  • the aforementioned pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier in addition to an effective amount of a compound of the formula (1) and/or formula (2).
  • Carrier can be an excipient
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced according to a generally known pharmaceutical preparation method, and the active ingredient dose of the formula (1) and/or the formula (2) is mixed with one or more carriers to prepare a desired dosage form, and the dosage form is prepared.
  • these may include lozenges, powders, granules, capsules or other liquid preparations, but are not limited thereto.
  • Figure 1 is a 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl-2,6,10-dode carbon) isolated in accordance with an embodiment of the present invention.
  • (A) is 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl-2,6,10-dodecatriene)-2- Cyclohexenone;
  • B The figure is a crude extract of Antrodia camphorata. The vertical line represents the standard deviation value of three independent tests;
  • FIG. 2 is a 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl-2,6,10-dode carbon) isolated in accordance with an embodiment of the present invention.
  • (A) is 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl-2,6,10-dodecatriene)-2- Cyclohexenone;
  • B The figure is a crude extract of Antrodia camphorata.
  • the vertical line represents the standard deviation value of three independent tests;
  • Figure 3 is a 4-hydroxy-2,3-didecyloxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl-2,6,10-dode carbon) isolated in accordance with an embodiment of the present invention.
  • HbeAg hepatitis B mantle antigen
  • A is 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl-2,6,10-dodecatriene)-2- Cyclohexenone
  • B is a crude extract of Antrodia camphorata.
  • the vertical line represents the standard deviation value of three independent test risks. detailed description
  • the organic solvent may include an alcohol (such as decyl alcohol, ethanol or propanol), an ester (such as ethyl acetate), an alkane (such as hexane) or an alkyl halide (such as chlorodecane, ethyl chloride), but Not limited to this.
  • alcohols such as decyl alcohol, ethanol or propanol
  • ester such as ethyl acetate
  • an alkane such as hexane
  • an alkyl halide such as chlorodecane, ethyl chloride
  • the extracted aqueous extract of Antrodia camphorata or the organic solvent extract can be further separated and purified by high-performance liquid chromatography, and then each fraction is subjected to a biochemical test for inhibiting replication of hepatitis B virus.
  • component analysis is performed on the fractions that inhibit the replication of hepatitis B virus, and further relevant biochemical tests are performed, for example: The cytotoxicity of the active ingredients contained in each fraction for the hepatoma cell line HepG2 2.2.15 To test and test the content of hepatitis B surface antigen (HbsAg) and hepatitis B mantle membrane antigen (HbeAg).
  • HbsAg hepatitis B surface antigen
  • HbeAg hepatitis B mantle membrane antigen
  • 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl-2,6, 10-) of the formula (2) will be exemplified below.
  • the 12-carbon trio)-2-cyclohexenone compound is described.
  • 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl-2,6, 10-dodecatriene)-2-ring The cytotoxic effect of the hexenone compound on the growth of HepG2 2.2.15 cells, and whether the anthraquinone cyclohexenone compound can effectively inhibit the replication of hepatitis B virus.
  • the MTT assay is used according to the National Cancer Research Institute. National Cancer Institute (NCI) anti-tumor drug screening model, cell viability assay for HepG2 2.2.15 cells, and detection of hepatitis B virus by semi-quantitative enzyme-linked immunosorbent assay The content of secreted hepatitis B surface antigen (HbsAg) and hepatitis B mantle membrane antigen (HbeAg).
  • NCI National Cancer Institute
  • HbsAg hepatitis B surface antigen
  • HbeAg hepatitis B mantle membrane antigen
  • the collected Antrodia camphorata extract was analyzed by high performance liquid chromatography with a column of RP18, and was treated with decyl alcohol (A) and 0.1% to 0.5% acetic acid aqueous solution (BM). Therefore, it is the mobile phase (the ratio of the solution is: 0 ⁇ 10 minutes, B ratio is 95% ⁇ 20%; 10 ⁇ 20 minutes, B ratio is 20% ⁇ 10%; 20-35 minutes, B ratio is 10% ⁇ 10%; 35-40 minutes, B ratio is 10% ⁇ 95%), rushed at a rate of 1 ml per minute, and analyzed by UV-visible full-wavelength detector.
  • the extract is collected and concentrated in 25 minutes to 30 minutes to obtain a pale yellow powdery solid product, which is 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-indenyl-5 (3,7,11 - Tridecyl-2,6,10-dodecatriene)-2-cyclohexenone.
  • the molecular formula is C 24 H 38 0 4
  • the molecular weight is 390
  • the melting point (mp) is 48 ° C ⁇ 52 ° C.
  • the nuclear magnetic resonance (NMR) analysis values are as follows: 1 H-NMR (CDCl 3 ) 5 (ppm): 1.51, 1.67, 1.71, 1.75, 1.94, 2.03, 2.07, 2.22, 2.25, 3.68, 4.05, 5.07 and 5.14 .
  • Example 1 In order to further test the inhibitory effect of the Antrodia camphorone compound in Example 1 on liver cancer tumor cells, this example was carried out according to the National Cancer Institute (NCI) anti-tumor drug screening mode, first taken 4-Hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,1 1-tridecyl-2,6, 10-dodecatriene) isolated in Example 1. -2-cyclohexenone was added to HepG2 2.2.15 human liver tumor cell culture medium for tumor cell viability assay. Cell viability assays can be performed using well-known MTT assays, while HepG2 2.2.15 is a human hepatoma tumor cell line that secretes infectious hepatitis B virus.
  • NCI National Cancer Institute
  • MTT assay is a commonly used analytical method for analyzing cell proliferation, percent of viable cells, and cytotoxicity. Among them, MTT( 3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide )
  • succinate tetrazolium reductase succinate tetrazolium reductase is reduced to insoluble water-soluble and blue-violet formazan, so the survival rate of cells can be judged and calculated by the formation of formazan.
  • human hepatoma cell line HepG2 2.2.1 was placed in a low-limit basal medium containing only 12 essential amino acids, glutamate and 8 vitamins containing 10% fetal bovine serum and 200 g/ml antibiotic G418. , MEM ) ( Gibco Co., USA ) for 24 hours.
  • the proliferated cells were washed once with PBS, and the cells were treated with 1 time trypsin-EDTA, followed by centrifugation at 1,200 rpm for 5 minutes, the cells were pelleted and the supernatant was discarded. Then add 10 ml of new medium, shake it gently to resuspend the cells, and then place 5000 cells in a 96-well plate.
  • FIG. 1 is a 4-hydroxy-2,3-didecyloxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl-2,6, isolated according to an embodiment of the present invention.
  • 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl) was obtained as a result of cell relative survival of the crude extract of Antrodia camphorata.
  • -2,6,10-dodecatriene)-2-cyclohexenone can effectively reduce the survival rate of human hepatoma cells HepG22.2.1, and is treated with a concentration of 10 g/ml of anthraquinone cyclohexenone compound.
  • the survival rate of cancer cells can be as low as about 81% or less, so that 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl) isolated from Antrodia camphorata extract can be confirmed.
  • -2,6,10-dodecatriene) -2-cyclohexenone can indeed be utilized for the inhibition of growth of hepatoma tumor cells HepG22.2.1.
  • Example 3 Example 3:
  • HbsAg Hepatitis B surface antigen
  • HbeAg Hepatitis B coat membrane antigen
  • HbsAg hepatitis B surface antigen produced by the B. cerevisiae virus and the hepatitis B coat antigen of the B. cerevisiae cyclohexanone compound.
  • HbeAg The influence of the amount of production, in this example, the human hepatoma cell HepG22.2.1 was first cultured, and the bovine ⁇ ⁇ cyclohexenone compound was added to the culture medium of the cell, and then the enzyme-linked immunoassay (enzyme-linked immunoassay) was carried out.
  • the HepG22.2.1 cell line utilizes the hepatitis B virus genome.
  • HBV genome plastid plasmid
  • plasmid transfected into human liver tumor cell line HepG2 and screened by antibiotic G418 to secrete hepatitis B surface antigen (HbsAg), hepatitis B mantle membrane antigen (HbeAg), nuclear protein capsid (nucleocapsid) and virus particles
  • Human hepatoma cells HepG2 2.2.1 were first cultured in MEM medium (Gibco Co., USA) containing 10% fetal calf serum and 200 g/ml antibiotic G418 for 24 hours. The proliferated cells were washed once with PBS, and the cells were treated with 1 time trypsin-EDTA, followed by centrifugation at 1,200 rpm for 5 minutes, the cells were pelleted and the supernatant was discarded. Then, 10 ml of the new culture solution was added, and the cells were resuspended by gentle shaking, and then 5000 cells were placed in a 96-well microplate.
  • MEM medium Gibco Co., USA
  • each culture solution is passed through an enzyme-linked immunoassay of a monoclonal antibody against human hepatitis B virus surface antigen and a multiclonal antibody against human hepatitis B virus coat membrane antigen.
  • a reagent complex (General biologicals corp., Taiwan, ROC.), using a sandwich-complex of antibody-antigen-antibody enzyme conjugate, with a solution of hydrogen peroxide-containing O-phenylenediamine (OPD) Color development, and the content of hepatitis B surface antigen (HbsAg) and hepatitis B mantle membrane antigen (HbeAg) in the culture solution was measured by an enzyme-linked immunosorbent analyzer at a wavelength of 450 nm.
  • OPD hydrogen peroxide-containing O-phenylenediamine
  • FIG. 2 is a 4-hydroxy-2,3-didecyloxy-6-mercapto-5(3,7,1 1 -tridecyl-2,6) isolated according to an embodiment of the present invention.
  • 10-dodecatriene)-2-cyclohexenone on the amount of hepatitis B surface antigen (HbsAg) production the results shown in the figure, compared to the control group of Antrodia camphorata crude extract of hepatitis B surface
  • the amount of antigen (HbsAg) produced, 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,1 1-tridecyl-2,6, 10-dodecatriene) -2-cyclohexenone can effectively inhibit the formation of hepatitis B surface antigen (HbsAg), and with the increase of the concentration of the anthraquinone cyclohexenone compound, the amount of hepatitis B surface antigen (HbsAg) is produced.
  • hepatitis B surface antigen treated with the above concentrations of anthraquinone cyclohexenone compound The amount of (HbsAg) produced can be reduced to less than 60%, and the effect of inhibiting the production of hepatitis B surface antigen (HbsAg) is best at a concentration of 10 g/ml of anthraquinone cyclohexenone.
  • the amount of antigen (HbsAg) produced can be as low as 28% or less, so that 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11- isolated from the extract of Antrodia camphorata can be confirmed.
  • Triterpene-2,6,10-dodecatriene)-2-cyclohexenone is indeed effective in reducing the amount of hepatitis B surface antigen (HbsAg), which also shows inhibition of the anthraquinone cyclohexenone compound.
  • HbsAg hepatitis B surface antigen
  • FIG. 3 is a 4-hydroxy-2,3-didecyloxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl-2,6, isolated according to an embodiment of the present invention.
  • 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,3) was produced as a result of the amount of Hepatitis B coat antigen (HbeAg) produced by the crude extract of Antrodia camphorata.
  • Hepatitis B mantle membrane antigen HbeAg
  • the amount of Hepatitis B coat antigen (HbeAg) can be as low as 84% or less, and the inhibition of the production of Hepatitis B coat antigen (HbeAg) by the concentration of 1 g/ml of Antrodia camphora cyclohexanone compound The best effect, its hepatitis B coat membrane antigen
  • the amount of (HbeAg) produced can be as low as 57% or less, so that 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11-three) isolated from the extract of Antrodia camphorata can be confirmed.
  • Mercapto-2,6,10-dodecatriene)-2-cyclohexenone is indeed effective in reducing the production of Hepatitis B coat antigen (HbeAg).
  • the novel 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-mercapto-5 (3,7,11-tridecyl-2,6) isolated from the extract of Antrodia camphorata. , 10-dodecatriene)-2-cyclohexenone can effectively inhibit
  • the survival rate of HepG2 2.2.15 in human hepatocellular carcinoma cells can inhibit the formation of hepatitis B surface antigen (HbsAg) and hepatitis B coat membrane antigen (HbeAg), so these compounds can be used to inhibit the replication of hepatitis B virus. Secretion, and can be used in the treatment of liver diseases associated with hepatitis B virus.
  • a pharmaceutical composition which comprises an effective amount of 4-hydroxy-2,3-dimethoxyoxy-6-mercapto-5 (3,7,1 1-trian) in addition to an effective amount.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may also be included.
  • the carrier may be, but is not limited to, an excipient such as water, a filler such as sucrose or starch, a binder such as a cellulose derivative, a diluent, a disintegrant, an absorption enhancer or a sweetener.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced according to a generally known pharmaceutical preparation method, and an active ingredient dose of these anathopin compound is mixed with one or more carriers to prepare a desired dosage form, and the dosage form may include a tablet, a powder, Granules, capsules or other liquid preparations, but not limited to this.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

用于抑制 B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合物
技术领域
本发明是关于一种用于抑制病毒的化合物， 尤其是关于一种自牛樟芝 ( Antrodia camphorata )萃取物中分离纯化而得且可用于抑制 B型肝炎病毒 的环己烯酮化合物。 背景技术
B型肝炎病毒 ( hepatitis B virus, HBV )属于肝病毒科 ( Hepadnviridae ), 其是可以造成持续非细胞病变性（ noncytopathic )肝脏感染的小型脱氧核糖核 酸类病毒体， 并具有蛋白外套膜（envelope ), 也是目前人类肝炎病毒中唯一 的 DNA病毒； B型肝炎病毒的外膜约含 25 %脂质以及 75 %糖蛋白， 糖蛋白 的主要成分为 B型肝炎表面抗原 （ hepatitis B surface antigen; HbsAg )， 而 B 型肝炎病毒核心颗粒中含有 B型肝炎外套膜抗原（ hepatitis B envelop antigen; HbeAg ), 其中， B型肝炎外套膜抗原（HbeAg )是一种分泌性蛋白（secretory protein ), 早期即可通过胎盘进入胎儿体内， 此时胎儿免疫系统尚未成熟， 因 此毒杀性 T淋巴细胞会对 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg )产生耐受性， 导致 人体免疫系统无法清除 B型肝炎病毒， 使病毒可大量复制， 故 B型肝炎外套 膜抗原 （HbeAg )也被视为是一种耐受原 （tolerogen ), 因此， B型肝炎表面 抗原 （HbsAg ) 以及 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg )含量的侦测结果， 可作 为评估 B型肝炎病毒复制与分泌情况的指标。 世界卫生组织的调查中显示， 全世界约有超过二十亿的人口曾被 B型肝炎病毒感染， 是个流行率相当高的 病毒， 主要通过亲代垂直感染， 感染后会引起急性肝炎、 慢性肝炎、 肝硬化、 甚至是肝癌。 在台湾地区， 三十岁以上的男子约有百分之九十的人曾受 B型 肝炎病毒感染， 其中 15 % ~20 %的人会变成终身带原者， 并有可能转变成肝 硬化、 肝癌而死亡， 故台湾是 B型肝炎感染严重的地方， 同时也是肝癌好发 的地区。
由前述可知， B型肝炎病毒的感染与肝脏疾病以及肝癌的形成关系密切， 因此， 如何干扰并抑制病毒复制， 彻底根除慢性感染， 是抗病毒治疗的主要 研究目标； 此外， 近年来不论是使用干扰素、 抗病毒药物或疫苗来防治 B型 肝炎病毒感染已有不错的成效， 但在慢性 B型肝炎带原者的治疗上， 仍无法 彻底根除病毒， 此为造成 B型肝炎病毒引发肝脏相关疾病并造成高致死率的 主因， 因此， 开发出可有效抑制 B型肝炎病毒的抗病毒药物刻不容緩。
午棒芝 ( Antrodia camphorata , 又称樟芝、 牛樟 或红樟芝等, 属于非 菌目 （ Aphyllophorales )、 多孔菌科（ Polyporaceae )的多年生蕈菌类， 为台 湾特有种真菌，仅生长于台湾保育类树种-牛樟树 ( Cinnamoum kanehirai Hay ) 的中空腐朽心材内壁上。 由于牛樟树分布数量极为稀少， 加上人为的盗伐， 使得寄生于其中方能生长的野生牛樟芝数量更形稀少， 且由于其子实体生长 相当緩慢， 生长期也仅在六月至十月之间， 因此价格非常昂贵。
牛樟芝的子实体为多年生， 无柄， 呈木栓质至木质， 其具强烈的樟树香 气， 且形态多变化， 有板状、 钟状、 马蹄状或塔状。 初生时为扁平型并呈鲜 红色， 之后其周边会呈现放射反卷状， 并向四周扩展生长， 颜色也转变为淡 红褐色或淡黄褐色， 并有许多细孔， 且其是牛樟芝药用价值最丰富的部位。
在台湾民俗医学上， 牛樟芝具有解毒、 减轻腹泻症状、 消炎、 治疗肝脏 相关疾病及抗癌等功用。 牛樟芝如同一般食药用的蕈菇类， 具有许多复杂的 成分， 已知的生理活性成分中， 包括： 三萜类化合物（triterpenoids ), 多糖体 ( polysaccharides , 如 β-D-葡聚糖 )、腺苷 ( adenosine )、 维生素（如维生素 B、 烟碱酸）、蛋白质（含免疫球蛋白）、超氧歧化酶（ superoxide dismutase, SOD )、 微量元素（如：钙、磷、锗）、核酸、 固醇类以及血压稳定物质（如 antodia acid ) 等， 此些生理活性成分被认为具有抗肿瘤、 增加免疫能力、 抗过敏、 抗病菌、 抗高血压、 降血糖及降胆固醇等多种功效。
牛樟芝众多成分中以三萜类化合物被研究的最多， 三萜类化合物是由三 十个碳元素结合成六角形或五角形天然化合物的总称， 牛樟芝所具的苦味即 主要来自三萜类此成分。 1995年时， Chemg等人发现牛樟芝子实体萃取物中 含有三种新的以麦角甾烷（ergostane )为骨架的三萜类化合物： antcin A、 antcin B与 antcin C ( Chemg, I. H., and Chiang, H. C. 1995. Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea. J. Nat. Prod. 58:365-371 )。 Chen等人 、乙酉竽萃取樟 芝子实体后发现 zhankuic acid A、 zhankuic acid B 及 zhankuic acid C等三种三 萜类化合物 ( Chen, C. Η·, and Yang, S. W. 1995. New steroid acids from Antrodia cinnamomea, ― a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. J. Nat. Prod. 58: 1655-1661 )。 此外， Chiang等人于 1995 年也由子实体萃取物中发现另外 三种分别为倍半萜内酯（ sesquiterpene lactone )与两种双酚类衍生物的新三萜 类化合物， 此即 antrocin, 4,7-二曱氧基 -5-曱基 -1,3-苯并二氧环
( 4,7-dimethoxy-5-methy-l ,3- benzodioxole )与 2,2',5,5'-四曱氧基 -3,4,3',4'-双- 亚曱二氧基—6,6'-二曱基联苯 ( 2,2,,5,5'-teramethoxy-3,4,3',4,-bi- methylenedioxy- 6,6'- dimethylbiphenyl ) ( Chiang, H. C, Wu, D. P., Cherng, I. W., and Ueng, C. H. 1995. A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 39:613-616 )。 到了 1996年， Cherng等人以同样 分析方法再度发现四种新的三萜类化合物： antcin E、 antcin F , methyl antcinate G、 methyl antcinate H ( Cherng, I. H., Wu, D. P., and Chiang, H. C. 1996. Triteroenoids from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 41 :263-267 ) ；而 Yang 等人则发现了二种以麦角甾烷为骨架的新化合物 zhankuic acid D、 zhankuic acid E和三种以羊毛甾烷（ lanostane )为骨架的新化合物： 15 α -乙酰-去氢硫 色多孑 L菌酸 ( 15 a -acetyl-dehydrosulphurenic acid )、 去氛齿孑 L酸
( dehydroeburicoic acid )与去水石 色多孑 L菌酸 ( dehydrasulphurenic acid X Yang, S. W., Shen, Y. C, and Chen, C. H. 1996. Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea - a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. Phytochemistry. 41 : 1389-1392 )。
虽然由目前诸多的实验可得知牛樟芝萃取物具有前述功效， 且其所含成 分也陆续被分析出， 但究竟牛樟芝萃取物中何种有效成分可抑制 B型肝炎病 毒感染并治疗与 B型肝炎病毒相关的肝脏疾病， 仍有待进一步实验研究来厘 清， 故若能找出牛樟芝萃取物中所含真正有效抑制 B型肝炎病毒的成分， 对 于急性肝炎、 慢性肝炎、 肝硬化以及肝癌等与 B型肝炎病毒相关肝脏疾病的 治疗将产生莫大的帮助。 发明内容
为明了牛樟芝萃取物中究竟是何成分可有效抑制 B型肝炎病毒感染， 本 发明由牛樟芝萃取物中分离纯化出具式（1 ) 结构式的化合物;
Figure imgf000006_0001
其中， X是氧（0 )或硫（S ), Y是氧或硫； 是氢基（H )、 曱基（C¾ ) 或 (CH2)m-CH3, R2是氢基、 曱基或 (CH2)m-CH3, R3是氢基、 曱基或 (CH2)m-CH3, m = 1 ~ 12; n = 1 ~ 12。
如式（1 ) 结构式的化合物中， 较佳者为如下所示式（2 ) 的化合物：
Figure imgf000006_0002
式（2 ) 的化合物， 其化学名为 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三 曱基 -2,6, 10-十二碳三烯） -2-环己烯酮 （ 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy- 5(3,7, 1 l-trimethyl-dodeca-2,6, 10-trienyl)-cyclohex-2-enone ) , 分 子 式 为
C24H3804, 外观为淡黄色粉末状， 分子量为 390。
本发明中式（ 1 )、 式（2 )的化合物是分离纯化自牛樟芝水萃取物或有机 溶剂萃取物， 有机溶剂可包括醇类（例如曱醇、 乙醇或丙醇）、 酯类（例如乙 酸乙酯）、 烷类 （例如己烷）或 代烷（例如氯曱烷、 氯乙烷）， 但并不以此 为限， 其中较佳者为醇类， 更佳者为乙醇。
通过前述化合物， 本发明将其应用于抑制 B型肝炎病毒感染上， 使能进 一步用于治疗 B型肝炎病毒所致相关肝脏疾病的医药组合物中， 增益急性肝 炎、 慢性肝炎、 肝硬化以及肝癌等与 B型肝炎病毒相关的肝脏疾病的治疗效 果。 结果显示， 当以本发明式（1 )和 /或式（2 ) 的化合物处理可分泌具感染 能力的 B型肝炎病毒的肝癌细胞株 HepG2 2.2.15时， 其可有效抑制该肝癌细 胞株的细胞相对存活率， 并降低由 B型肝炎病毒所生成的 B型肝炎表面抗原 ( HbsAg ) 以及 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg ) 的生成量， 达到抑制 B型肝 炎病毒复制及分泌的目的， 进而可将由天然成分所萃取出的该化合物利用于 与 B型肝炎病毒相关的肝脏疾病的治疗上。
另一方面， 本发明中也可将式（1 )和 /或式（2 ) 的化合物利用于治疗 B 型肝炎病毒所致相关肝脏疾病的医药组合物的成分中， 藉以抑制 B型肝炎病 毒的复制及分泌， 进而减緩急性或慢性肝炎感染， 并降低肝炎带原者转变为 肝硬化或肝癌而死亡的发生率。 前述医药组合物除包括有效剂量的式（ 1 )和 /或式（2 ) 的化合物外， 还可以包括药学上可接受的载体。 载体可为赋形剂
(如水）、 填充剂 （如蔗糖或淀粉）、 黏合剂 （如纤维素衍生物）、 稀释剂、 崩 解剂、 吸收促进剂或甜味剂， 但并不仅限于此。 本发明医药组合物可依一般 悉知药学的制备方法生产制造， 将式（1 )和 /或式（2 )有效成分剂量与一种 以上的载体相混合， 制备出所需的剂型， 此剂型可包括锭剂、 粉剂、 粒剂、 胶嚢或其它液体制剂， 但未以此为限。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式， 下述所列举的实施例用 以阐明本发明， 并非用以限定本发明的范围， 任何熟悉此技艺者， 在不脱离 本发明的精神和范围内， 当可做些许更动与润饰， 因此本发明的保护范围当 视后附的权利要求所界定者为准。 附图说明
图 1是本发明实施例所分离出的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11- 三曱基 -2,6,10-十二碳三烯） -2-环己烯酮对人类肝癌细胞 HepG2 2.2.1存活率 的影响结果。 ( A ) 图是 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10- 十二碳三烯） -2-环己烯酮； （B ) 图是牛樟芝粗萃取物。 垂直线代表三次独立 试验的标准偏差值；
图 2是本发明实施例所分离出的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11- 三曱基 -2,6,10-十二碳三烯） -2-环己烯酮对 B型肝炎表面抗原 （HbsAg )生成 量的影响结果。（A )图是 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10- 十二碳三烯） -2-环己烯酮； （B ) 图是牛樟芝粗萃取物。 垂直线代表三次独立 试验的标准偏差值； 图 3是本发明实施例所分离出的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11- 三曱基 -2,6,10-十二碳三烯） -2-环己烯酮对 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg )生 成量的影响结果。 （A ) 图是 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10-十二碳三烯） -2-环己烯酮； （B )图是牛樟芝粗萃取物。 垂直线代表三 次独立试险的标准偏差值。 具体实施方式
首先取牛樟芝 Antrodia camphorata ) 菌丝体、 子实体或二者的混 合物， 利用悉知萃取方式， 以水或有机溶剂进行萃取， 藉以取得牛樟芝 水萃取物或有机溶剂萃取物。 其中， 有机溶剂可包括醇类 （例如曱醇、 乙醇或丙醇）、 酯类 （例如乙酸乙酯）、 烷类 （例如己烷） 或卤代烷 （例 如氯曱烷、 氯乙烷）， 但并不以此为限。 其中较佳者为醇类， 更佳者为 乙醇。
经萃取过后的牛樟芝水萃取物或有机溶剂萃取物， 可进一步通过高 效液相层析加以分离纯化， 之后再对每一分液 ( fraction )进行抑制 B型 肝炎病毒复制的相关生化测试。 最后， 则针对具抑制 B型肝炎病毒复制 效果的分液进行成分分析， 再进一步分别做相关的生化测试， 例如： 各 分液中所含有效成份对于肝癌细胞株 HepG2 2.2.15的细胞毒性的影响以 及检测 B型肝炎表面抗原 （HbsAg ) 与 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg ) 含量等测试。 最终即发现本发明中如式（ 1 ) /式（2 ) 的化合物具有抑制 B型肝炎病毒复制的效果。
为方便说明本发明， 以下将以式 （2 ) 的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱 基 -5 ( 3,7, 11-三曱基 -2,6, 10-十二碳三婦） -2-环己烯酮化合物进行说明。 此外， 为证实 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6, 10-十二 碳三烯）-2-环己烯酮化合物对肝癌细胞 HepG2 2.2.15生长的细胞毒性影 响， 并研究该牛樟芝环己烯酮化合物是否可有效抑制 B型肝炎病毒的复 制，本发明中以 MTT分析法，根据美国国家癌症研究所（ National Cancer Institute, NCI ) 抗肿瘤药物筛检模式， 对肝癌细胞 HepG2 2.2.15进行细 胞存活率的测试， 并利用半定量酶联免疫分析法侦测由 B型肝炎病毒所 分泌的 B型肝炎表面抗原（HbsAg)以及 B型肝炎外套膜抗原（HbeAg) 的含量。 由这些测试证实， 牛樟芝环己烯酮化合物可降低肝癌肿瘤细胞 HepG22.2.15的存活率， 并有效抑制 B型肝炎表面抗原 （HbsAg) 以及 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg) 的形成， 进而达到抑制 B型肝炎病毒复 制与分泌的目的。 兹对前述实施方式详尽说明如下： 实施例 1:
4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10-十二碳三烯） -2-环 己烯酮的分离
将 100克左右的牛樟芝菌丝体、 子实体或二者的混合物， 置入三角 锥形瓶中， 加入适当比例的水与醇类 （例如 70%以上的醇类水溶液） ， 于 20~25°C下搅拌萃取至少 1小时以上， 之后以滤纸及 0.45 μηι滤膜过 滤， 收集萃取液。
将前述收集的牛樟芝萃取液， 利用 高效液相色谱仪 （ High Performance Liquid chromatography ) , 以 RP18的色普柱 ( column ) 进 行分析，并以曱醇（ A )及 0.1%~0.5%醋酸水溶液（ B M故为移动相（ mobile phase ) (其溶液比例是： 0~10分钟， B比例为 95%~20%； 10~20分钟， B比例为 20%~10%； 20-35分钟， B比例为 10%~10%； 35-40分钟， B 比例为 10%~95%) , 在每分钟 1 ml的速度下沖提， 同时以紫外-可见光 全波长侦测器分析。
将 25分钟至 30分钟的沖提液收集浓缩即可得淡黄色粉末状的固体 产物， 此即 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 (3,7,11-三曱基 -2,6,10-十二碳 三烯） -2-环己烯酮。 经分析， 其分子式为 C24H3804, 分子量 390, 熔点 ( m.p. ) 为 48 °C ~ 52 °C。 核磁共振 （ NMR ) 分析值则如下所示： 1H-NMR(CDCl3)5(ppm): 1.51, 1.67, 1.71, 1.75, 1.94, 2.03, 2.07, 2.22, 2.25、 3.68, 4.05, 5.07与 5.14。 13C-NMR(CDCl3)5(ppm)： 12.31、 16.1, 16.12、 17.67、 25.67、 26.44、 26.74、 27.00、 39.71、 39.81、 4.027、 43.34、 59.22、 60.59、 120.97、 123.84、 124.30、 131.32、 135.35、 135.92、 138.05、 160.45与 197.12。 实施例 2:
牛樟芝环己烯酮化合物体外对肝癌肿瘤细胞的毒性测试
为进一步测试实施例 1 中的牛樟芝环己烯酮化合物对肝癌肿瘤细胞 的抑制效果， 本实施例是根据美国国家癌症研究所 （ National Cancer Institute, NCI ) 抗肿瘤药物筛检模式进行的， 首先取实施例 1 中所分离 的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7, 1 1-三曱基 -2,6, 10-十二碳三烯 ) -2- 环己烯酮， 加入 HepG2 2.2.15人类肝肿瘤细胞培养液中， 进行肿瘤细胞 存活性的测试。 细胞存活性的测试可采用悉知的 MTT分析法进行分析， 而 HepG2 2.2.15是人类的肝癌肿瘤细胞系， 且该细胞系可分泌具感染能 力的 B型肝炎病毒。
MTT 分析法是一种常见用于分析细胞增殖 （cell proliferation ) 、 存 活率（ percent of viable cells ) 以及细胞毒性（cytotoxicity ) 的分析方法。 其中 , MTT( 3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide )
( succinate tetrazolium reductase ) 还原成不溶水性且呈蓝紫色的 formazan , 因此通过曱贈（ formazan ) 形成与否， 即可判断并计算细胞的 存活率。
首先将人类肝癌细胞 HepG2 2.2.1 置于含有 10%胎牛血清以及 200 g/ml 抗生素 G418的仅含 12种必需氨基酸、 谷氨酸胺和 8种维生素的 低限量基础培养基（ minimum essential medium, MEM ) ( Gibco Co., USA ) 中培养 24小时。 将增殖后的细胞以 PBS清洗一次， 并以 1倍的胰蛋白酶 -EDTA处理细胞， 随后于 1 ,200 rpm下离心 5分钟， 将细胞沉淀并丟弃上 清液。之后加入 10 ml的新培养液，轻微摇晃使细胞再次悬浮，再将 5000 个细胞分置于 96 孔 量培养板内。 测试时， 分别于每一孔内加入以二 曱基硫酸 ( dimethyl sulfoxide, DMSO ) 所配制的 0.1、 1、 10 g/ml牛樟 芝粗萃取物 （对照组， 未经纯化分离的牛樟芝乙醇总萃取物） 以及 4-羟 基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7, 1 1 -三曱基 -2,6, 10-十二碳三烯） -2-环己烯 酮（实验组）， 并以完全不添加任何物质者为对照组， 于 37 °C、 5 % C02 下培养 22 小时。 其后， 于避光的环境下于每一孔内加入 2.5 mg/ml的 MTT, 反应 2小时后， 移除培养基， 并加入 50 μΐ 二曱基硫酸（ DMSO ) 溶解结晶。 最后以酶免疫分析仪在 570nm吸光波长下测定其吸光值， 并 将此测得数值与未经处理的对照组的细胞数值相比较， 藉以计算得细胞 相对的存活率 （％ ) , 其结果如图 1所示。
请参阅图 1, 该图是本发明实施例所分离出的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10-十二碳三烯 ) -2-环己烯酮对人类肝癌细 胞 HepG2 2.2.1存活率的影响结果。 由图 1 中可知， 相对于对照组牛樟 芝粗萃取物的细胞相对存活率结果， 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10-十二碳三烯） -2-环己烯酮可有效降低人类肝癌细 胞 HepG22.2.1的存活率， 且经浓度为 10 g/ml牛樟芝环己烯酮化合物 处理后的癌细胞存活率可低至约 81%以下， 因此可证实分离自牛樟芝萃 取物的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10-十二碳三 烯） -2 -环己烯酮确实能够利用于肝癌肿瘤细胞 HepG22.2.1生长的抑制。 实施例 3:
牛樟芝环己烯酮化合物体外对 B型肝炎表面抗原 （HbsAg) 以及 B型肝 炎外套膜抗原 （HbeAg) 生成量的影响
为测试实施例 1分离纯化出的牛樟芝环己烯酮化合物对 B型肝炎病 毒所产生的 B 型肝炎表面抗原 （HbsAg ) 以及 B 型肝炎外套膜抗原
( HbeAg) 生成量的影响， 本实施例先培养人类肝癌细胞 HepG22.2.1, 并于此细胞的培养基中加入牛樟芝环己烯酮化合物， 再以半定量的酶联 免疫分析法 ( enzyme-linked immuno absorbent assy, ELISA )检测培养基 中 B型肝炎表面抗原 （HbsAg) 以及 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg) 的 生成量， 通过此两病毒指针来评估牛樟芝环己烯酮化合物可否有效抑制 B型肝炎病毒。 其中， HepG22.2.1细胞系利用包含 B型肝炎病毒基因组
( HBV genome ) 的质体 （ plasmid ) 转染人类肝肿瘤细胞株 HepG2, 并 经过抗生素 G418 筛选所得可分泌 B型肝炎表面抗原 （HbsAg) 、 B型 肝炎外套膜抗原 （HbeAg) 、 核蛋白衣壳 （nucleocapsid) 以及病毒颗粒
( virion )的细胞株（ Sells, M. A., Chen, M. L. and Acs, G. 1987. Production of hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 1005-1009 ) 。
首先将人类肝癌细胞 HepG2 2.2.1 置于含有 10%胎牛血清以及 200 g/ml 抗生素 G418的 MEM培养基 ( Gibco Co., USA ) 中培养 24小时。 将增殖后的细胞以 PBS清洗一次， 并以 1倍的胰蛋白酶 -EDTA处理细胞， 随后于 1 ,200 rpm下离心 5分钟， 将细胞沉淀并丟弃上清液。 之后加入 10 ml的新培养液， 轻微摇晃使细胞再次悬浮， 再将 5000个细胞分置于 96 孔微量培养板内。 测试时， 分别于每一孔内加入以二曱基硫酸 ( dimethyl sulfoxide, DMSO ) 配置且浓度分别为 0.1、 1、 10 g/ml的牛 樟芝粗萃取物 （对照组， 未经纯化分离的牛樟芝乙醇总萃取物） 以及 4- 羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7, 1 1-三曱基 -2,6, 10-十二碳三烯 ) -2-环己 烯酮， 并以完全不添加任何物质者为对照组， 于 37 °C、 5 % C02 下培 养 22小时。 再取适量的各培养液， 通过抗人类 B型肝炎病毒表面抗原的 单株抗体（monoclonal antibody )及抗人类 B型肝炎病毒外套膜抗原的多 源抗体 ( multiclonal antibody )的酶联免疫检马全试剂分析试剂盒 ( general biologicals corp., Taiwan, ROC. ) , 利用抗体一抗原一抗体酶接合体的三 明治复合体， 以含过氧化氢的邻苯二胺 （ O-phenylenediamine, OPD ) 溶 液使之显色， 再以酶联免疫分析仪于 450 nm的波长下， 测得培养液中 B 型肝炎表面抗原 （HbsAg ) 以及 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg ) 的含量， 其阴性判定是依照以下公式： cutoff value = O.D.negative c。ntTOl + 0.025 , 其 中若 OD45。的吸光值超过此值则为阳性， 其结果如图 2与图 3中所示。
请参阅图 2 , 该图是本发明实施例所分离出的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7, 1 1 -三曱基 -2,6, 10-十二碳三烯 ) -2-环己烯酮对 B型肝炎表 面抗原 （HbsAg ) 生成量的影响结果， 由图中结果显示， 相对于对照组 牛樟芝粗萃取物的 B型肝炎表面抗原（HbsAg )生成量结果， 4-羟基 -2,3- 二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7, 1 1-三曱基 -2,6, 10-十二碳三烯） -2-环己烯酮可有 效抑制 B型肝炎表面抗原 （HbsAg ) 的生成， 且随着牛樟芝环己烯酮化 合物施予浓度的增加， B 型肝炎表面抗原 （HbsAg ) 的生成量便随之下 降， 经前述各浓度牛樟芝环己烯酮化合物处理后的 B 型肝炎表面抗原 ( HbsAg ) 生成量可降低至 60%以下， 其中又以浓度为 10 g/ml牛樟芝 环己烯酮化合物对 B型肝炎表面抗原 （HbsAg) 生成量的抑制效果为最 佳， 其 B型肝炎表面抗原 （HbsAg) 生成量可低至 28%以下， 因此可证 实由牛樟芝萃取物中分离出的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三 曱基 -2,6,10-十二碳三烯） -2-环己烯酮确实能够有效降低 B 型肝炎表面 抗原 （HbsAg) 的生成量， 这也显示牛樟芝环己烯酮化合物具有抑制 B 型肝炎病毒繁殖的功效。
请参阅图 3, 该图是本发明实施例所分离出的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10-十二碳三烯 ) -2-环己烯酮对 B型肝炎外 套膜抗原 （HbeAg) 生成量的影响结果。 由图中结果可知， 相对于对照 组牛樟芝粗萃取物的 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg) 生成量结果， 4-羟 基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10-十二碳三烯） -2-环己烯 酮可有效抑制 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg) 的生成， 经牛樟芝环己烯 酮化合物处理后的 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg) 生成量可低至 84%以 下， 其中又以浓度为 1 g/ml的牛樟芝环己烯酮化合物对 B型肝炎外套 膜抗原 （HbeAg) 生成量的抑制效果为最佳， 其 B 型肝炎外套膜抗原
(HbeAg) 生成量可低至 57%以下， 因此可证实由牛樟芝萃取物中分离 出的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10-十二碳三烯 ) -2-环己烯酮确实能够有效降低 B型肝炎外套膜抗原（ HbeAg )的生成量。
另一方面， 相对于前述 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 (3,7,11-三曱 基 -2, 6,10-十二碳三烯） -2-环己烯酮对 HepG2 2.2.15 细胞毒性测试的结 果 （请参阅图 1 ) 可观察到， 该牛樟芝环己烯酮化合物抑制 B型肝炎表 面抗原 （HbsAg) 以及 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg) 生成量的数值相 对高于该牛樟芝环己烯酮化合物抑制人类肝癌细胞 HepG22.2.15存活率 的数值， 这表示 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10- 十二碳三烯） -2-环己烯酮对 B型肝炎表面抗原 （ HbsAg)以及 B型肝炎 外套膜抗原 （HbeAg) 生成量的抑制效果并非因其对细胞具毒性所致。
综上所述， 本发明自牛樟芝萃取物中所分离出的新 4-羟基 -2,3-二曱 氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,11-三曱基 -2,6,10-十二碳三烯） -2-环己烯酮可有效抑 制人类肝癌肿瘤细胞 HepG2 2.2.15的存活率，且可抑制 B型肝炎表面抗 原 （HbsAg ) 以及 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg ) 的形成， 因此这些化 合物可用于抑制 B型肝炎病毒的复制与分泌， 同时可利用于与 B型肝炎 病毒相关的肝脏疾病的治疗上。 另外， 也可将其制备成医药组合物， 此 医药组合物除包含有效剂量的 4-羟基 -2,3-二曱氧基 -6-曱基 -5 ( 3,7,1 1-三 曱基 -2,6,10-十二碳三烯 ) -2-环己烯酮外， 还可以包括药学上可接受的载 体。 载体可为赋形剂 （如水） 、 填充剂 （如蔗糖或淀粉） 、 黏合剂 （如 纤维素衍生物） 、 稀释剂、 崩解剂、 吸收促进剂或甜味剂， 但并不仅限 于此。 本发明医药组合物可依一般悉知药学的制备方法生产制造， 将有 效成分剂量的这些牛樟芝化合物与一种以上的载体相混合， 制备出所需 的剂型， 此剂型可包括锭剂、 粉剂、 粒剂、 胶嚢或其它液体制剂， 但未 以此为限。

Claims

权利 要求 书 种用于抑制 B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合物， 具有下列结构
Figure imgf000015_0001
其中， X是氧（0 )或硫（S ), Y是氧或硫； 是氢基（H )、 甲基（CH3 ) 或 (CH2)m-CH3, R2是氢基、 甲基或 (CH2)m-CH3, R3是氢基、 甲基或 (CH2)m-CH3, m = 1 ~ 12; n = 1 ~ 12。
2.根据权利要求 1所述的用于抑制 B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物， 其中， 所述化合物由牛樟芝的有机溶剂萃取物中分离制得。
3.根据权利要求 2所述的用于抑制 B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物， 其中， 所述有机溶剂选自酯类、 醇类、 烷类或 代烷所组成的组中。
4.根据权利要求 3所述的用于抑制 B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物， 其中， 所述醇类是乙醇。
5.根据权利要求 1所述的用于抑制 B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物， 其中， 所述化合物由牛樟芝的水萃取物中分离制得。
6.根据权利要求 1所述的用于抑制 B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物，其中，所述化合物是 4-羟基 -2,3-二甲氧基 -6-甲基 -5 ( 3,7,11-三甲基 -2,6,10- 十二碳三烯）-2-环己烯酮（ 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,ll-trimethyl- dodeca-2,6, 10-trienyl)- cy clohex- 2-enone )。
7.根据权利要求 1或 6所述的用于抑制 B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮 化合物， 其中， 所述化合物通过降低 B型肝炎表面抗原 （HbsAg ) 以及 B型 肝炎外套膜抗原 （HbeAg ) 的生成量而抑制 B型肝炎病毒。
8.根据权利要求 7所述的用于抑制 B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物， 其中， 所述化合物降低 B型肝炎表面抗原 （HbsAg )生成量的较佳使用 浓度为 10 g/ml。
9.根据权利要求 7所述的用于抑制 B型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合 物， 其中， 所述化合物降低 B型肝炎外套膜抗原 （HbeAg )生成量的较佳使 用浓度为 1 g/ml。
10. 一种用于治疗 B型肝炎病毒所引起疾病的医药组合物， 其至少包括 有效剂量的权利要求 1所述的化合物以及医学上可接受的载体。
11. 一种用于治疗 B型肝炎病毒所引起疾病的医药组合物， 其至少包括 有效剂量的权利要求 6所述的化合物以及医学上可接受的载体。
12. 根据权利要求 10或 11所述的用于治疗 B型肝炎病毒所引起疾病的 医药组合物， 其中， 所述 B型肝炎病毒所引起疾病包含急性肝炎、慢性肝炎、 肝硬化以及肝癌。
PCT/CN2008/070386 2007-08-08 2008-02-29 Composé de cyclohexénone d'antrodia camphorata utilisé pour inhiber le virus de l'hépatite b WO2009018726A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200710140281.0 2007-08-08
CN2007101402810A CN101362679B (zh) 2007-08-08 2007-08-08 用于抑制b型肝炎病毒的牛樟芝环己烯酮化合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009018726A1 true WO2009018726A1 (fr) 2009-02-12

Family

ID=40340946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2008/070386 WO2009018726A1 (fr) 2007-08-08 2008-02-29 Composé de cyclohexénone d'antrodia camphorata utilisé pour inhiber le virus de l'hépatite b

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN101362679B (zh)
WO (1) WO2009018726A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4146180A4 (en) * 2020-05-08 2024-06-26 Golden Biotechnology Corporation METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING RNA VIRUS-INDUCED DISEASE

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102755356B (zh) * 2011-04-28 2014-11-05 丽丰实业股份有限公司 抗病毒药物组合物
TWI481403B (zh) * 2011-10-17 2015-04-21 Simpson Biotech Co Ltd 從牛樟芝萃取之化合物與其用途
CN113795258B (zh) * 2019-02-25 2024-04-16 吉亚生技控股股份有限公司 抑制病毒感染的方法及组合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1666982A (zh) * 2004-03-10 2005-09-14 善笙生物科技股份有限公司 来自牛樟芝菌丝体的新混合物和化合物及其用途
US7342137B1 (en) * 2007-01-08 2008-03-11 Golden Biotechnology Corporation Cyclohexenone compounds from Antrodia camphorata and application thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1666982A (zh) * 2004-03-10 2005-09-14 善笙生物科技股份有限公司 来自牛樟芝菌丝体的新混合物和化合物及其用途
US7342137B1 (en) * 2007-01-08 2008-03-11 Golden Biotechnology Corporation Cyclohexenone compounds from Antrodia camphorata and application thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN C-H ET AL.: "New Steroid Acids from Antrodia Cinnamomea a Fungal Parasite of Cinnamomum micranthum", JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS, vol. 58, no. 11, 1995, pages 1655 - 1661, XP008138392, DOI: doi:10.1021/np50125a002 *
CHENG J-H. ET AL.: "Triterpenoids from Antrodia cinnamomea", PHYTOCHEMISTRY, vol. 41, no. 1, 1996, pages 263 - 267 *
CHERNG J-H. ET AL.: "Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea", JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS, vol. 58, no. 3, 1995, pages 365 - 371, XP008138391 *
CHIANG H-C. ET AL.: "A sesquiterpene lactone, phenyl compounds from Antrodia Cinnamomea", PHYTOCHEMISTRY, vol. 39, no. 3, 1995, pages 613 - 616, XP008138393, DOI: doi:10.1016/0031-9422(95)00025-3 *
YANG S-W. ET AL.: "Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea-a fungus parasitic on Cinnamomum mecranthus", PHYTOCHEMISTRY, vol. 41, no. 5, 1996, pages 1389 - 1392, XP008138394 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4146180A4 (en) * 2020-05-08 2024-06-26 Golden Biotechnology Corporation METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING RNA VIRUS-INDUCED DISEASE

Also Published As

Publication number Publication date
CN101362679A (zh) 2009-02-11
CN101362679B (zh) 2012-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI394575B (zh) Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for the Suppression of Hepatitis B Virus
TWI330528B (zh)
KR100897988B1 (ko) 안트로디아 캄포라타로부터 얻은 신규 화합물
WO2009052711A1 (fr) Nouveaux composés isolés d'un extrait d'antrodia camphorata
KR101150046B1 (ko) 자가면역 질병을 치료하기 위한 안트로디아 캄포라타로부터얻은 시클로헥세논 화합물
RU2422431C2 (ru) Новые циклогексеноновые соединения из антродии камфорной (antrodia camphorata) и их применение
EP2221291B1 (en) Cyclohexenone compounds from antrodia camphorata and pharmaceutical compositions thereof useful for treating autoimmune diseases
TWI394566B (zh) Used to inhibit the growth of ovarian cancer tumor cells of the cattle camphor cyclohexene ketone compounds
WO2009018726A1 (fr) Composé de cyclohexénone d'antrodia camphorata utilisé pour inhiber le virus de l'hépatite b
TW201102075A (en) Cyclohexenone compound of Antrodia cinnomomea that suppresses growth of tumor cell of pancreatic cancer
TWI302834B (zh)
US20110060055A1 (en) Inhibition of the Survival of Lymphoma by Cyclohexenone Compounds from Antrodia Camphorata
JP5203644B2 (ja) 自己免疫疾病の治療に用いるベニクスノキタケ由来の化合物
TWI361687B (zh)
TW201109014A (en) Cyclohexenone compound of Antrodia cinnomomea that suppresses growth of tumor cell of skin cancer
WO2009026794A1 (fr) Composés de cyclohexénone issus de antrodia camphorata destinés à la protection du foie

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08715122

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 08715122

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1