TW200525033A - PQQ dependent glucose dehydrogenase excellent in substrate specificity - Google Patents

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TW200525033A TW093127096A TW93127096A TW200525033A TW 200525033 A TW200525033 A TW 200525033A TW 093127096 A TW093127096 A TW 093127096A TW 93127096 A TW93127096 A TW 93127096A TW 200525033 A TW200525033 A TW 200525033A
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Seiji Takeshima
Tadanobu Matsumura
Takahide Kishimoto
Masanori Oka
Noriaki Hirayama
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Toyo Boseki
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Description

200525033 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 % 本發明為關於受質專一性經改良的重組葡萄糖去氫酵素 (本申請案中’將葡祠糖去氫酵素亦標記為 GDH)’且詳言 之，為關於以吡咯喹啉醌（本申請案中，將吡咯喹啉醌亦標 記為P Q Q )做為輔酶之重組P Q Q依存性葡萄糖去氫酵素（本 申請案中，將 PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素亦簡述為 P Q Q G D Η )、其製造方法及葡萄糖感測器。 又，本發明為關於在以鐵氰化物離子做為媒介之測定系 中之令野生型σ比嘻喧。林S昆依存性葡萄糖去氫酵素之比活性 、 提高的方法。 更且，本發明為關於在以鐵氰化物做為媒介之測定系 中，比活性為經提高之重組吡咯喹琳醌依存性葡萄糖去氫 酵素、其製造方法、及使用其之葡萄糖分析套件和葡萄糖 感測器。 本發明之重組 PQQGDH為於臨床檢查和食品分析等中可 用於葡萄糖的定量。 【先前技術】 P Q Q G D Η為以口比口各口f °林8昆做為輔酶之葡萄糖去氫酵素。由 於催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸内酯的反應，故可使用於 血糖的測定。血液中葡萄糖濃度為以糖尿病之重要標識， 於臨床診斷上為極重要的指標。現在，血液中葡萄糖濃度 的測定為以使用葡萄糖氧化酶之生物感測器的方法為主 流，但由於反應被溶氧濃度所影響，故於測定值具有發生 5 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033
誤差的可能性。取代此葡萄糖氧化酶之新酵素PQQ
In 葡萄糖去氫酵素被受到注目。 吾等團體發現鮑氏不動桿菌（A c i n e t c baumannii)NCIMB11517菌株為產生PQQ依存性葡萄 酵素，並且將基因選殖及建立高表現系（參照專 1 )。P Q Q依存性葡萄糖去氫酵素為比葡萄糖氧化酶 專一性上具有問題點。 〈專利文獻1 > 曰本專利特開平1 1 - 2 4 3 9 4 9號公報 又，將吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫酵素使用於 測器時，於一般的血糖監測器中，使用鐵氰化物離 媒介，但於此試片上，酵素為經由檢體的血液而被 但血液與水和其他一般試藥中所用之溶劑相比較， 高且溶解性低，故更期望於試片上添加的酵素量為 質量愈少愈佳。因此，期望取得每單位蛋白質之酵Ί 即，比活性為提高的吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫 還有，迄今未有關於在以鐵氰化物離子做為媒介 系中，比活性為提高的重組吡咯喹啉醌依存性葡萄 酵素之發表。 【發明内容】 f (發明所欲解決之問題） 本發明為以先前技術之課題做為背景，以PQQGDH 專一性做為課題且關於其改良。 又，在以鐵氰化物離子做為錤介之測定系中，令 °林醌依存性葡萄糖去氫酵素之比活性與野生型相比 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 依存性 b a c t e r 糖去氫 利文獻 於受質 生物感 子做為 溶解， 因黏度 以蛋白 活性， 酵素。 之測定 糖去氮 之受質 。比略口查 較更被 6 200525033 提高為其課題。
V (解決問題之手段） 本發明者等人為了解決上述課題，於野生型吼咯喹啉醌 依存性葡萄糖去氫酵素之胺基酸序列中，導入變異則可在 以鐵氰化物離子做為媒介之測定系中，使得吡咯喹啉醌依 存性葡萄糖去氫酵素之比活性與野生型相比較更被提高， 並且達到完成本發明。即，本發明為關於 [第1項] 一種重組PQQGDH，其特徵為對於雙醣類之作用性為比野 生型之吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫酵素（PQQGDH)更為降 低。 [第2項] 如第1項記載之重組PQQGDH，其為比野生型之吡咯喹啉 醌依存性葡萄糖去氫酵素（PQQGDH)之穩定性更為提高。 [第3項] 一種方法，其特徵為於野生型吡咯喹啉醌依存性葡萄糖 去氫酵素（PQQGDH)之胺基酸序列中，令一或數個胺基酸缺 失、取代或加入，與野生型相比較，使得在以鐵氰化物離 子做為媒介的測定系中，比活性提高。 [第4項] 一種重組σ比洛喧琳S昆依存性葡萄糖去氫酵素（P Q Q G D Η )， 其特徵為根據如第3項記載之方法，與野生型相比較，在 以鐵氰化物離子做為媒介之測定系中比活性提高。 [第5項] 7 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 一種基因，其特徵為表現如第1項或第3項記載之重組 PQQGDH ° [第6項] 一種載體，其特徵為含有如第5項記載之基因。 [第7項] 一種轉型體，其特徵為經如第6項記載之載體所轉型。 [第8項] 一種重組PQQGDH之製造方法，其特徵為培養如第7項記 載之轉型體。 [第9項] 一種葡萄糖分析套件，其特徵為含有如第1項或第3項 記載之重組PQQGDH。 [第1 0項] 一種葡萄糖感測器，其特徵為含有如第1項或第3項記 載之重組PQQGDH 。 [第1 1項] 一種葡萄糖測定方法，其特徵為含有如第1項或第3項 之重組PQQGDH。 (發明效果） 本發明之重組PQQGDH為比野生型PQQGDH對於雙醣類的 作用性更為降低的酵素。經由在葡萄糖分析套件及葡萄糖 感測器中使用本發明之重組 PQQGDH，貝ij比使用野生型 PQQGDH者可更高精確度分析，可提供穩定性更高之葡萄糖 分析套件及葡萄糖感測器。 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 或者，本發明之重組σ比洛啥σ林S昆依存性葡萄糖去氫酵素 為經由提高比活性，使得使用其之葡萄糖分析套件和葡萄 糖感測器的酵素添加量可減量，並且可廉價製造。 【實施方式】 以下，詳細說明本發明。 本發明之重組PQQGDH為比野生型PQQGDH對於雙醣類的 作用性更為降低的酵素。 所謂對於雙醣類的作用性，為意指將雙醣類脫氫之作 用。雙醣類可例示麥芽糖、蔗糖、乳糖、纖維雙醣等，特 別可例示麥芽糖。本案發明中，對於雙醣類之作用性降低， 亦表現出受質專一性提高。 對於雙醣類之作用性是否降低的判斷，為如下進行。 於後述試驗例 1 記載之活性測定法中，使用野生型 PQQGDH，測定以D -葡萄糖做為受質溶液時之P Q Q G D Η活性 值（a )、和以該雙醣類代替 D -葡萄糖做為受質溶液時之 P Q Q G D Η活性值（b )，求出相對於以葡萄糖做為受質時之測 定值視為1 0 0時的相對值（（b ) / ( a ) X 1 0 0 )。其次，使用重組 P Q Q G D Η進行同樣之操作，並且比較其值進行判斷。 本發明之重組 PQQGDH對於雙醣類的作用性若比野生型 PQQGDH降低，則對於葡萄糖之作用性為上升、不變、降低 之任一者均被包含於本發明之重組PQQGDH。 本發明之重組PQQGDH為包含於葡萄糖濃度之測定中，對 於雙醣類之作用性與使用野生型 PQQGDH之情況相比較為 降低者。較佳為對於麥芽糖之作用性降低者。對於麥芽糖 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 9 200525033 之作用性較佳為野生型P Q Q G D Η的9 0 %以下、更佳為7 5 %以 下、再佳為7 0 %以下、再更佳為6 0 %以下、特別以4 0 %以下、 特佳為2 0 %以下。 本發明之重組 PQQGDH為包含對於麥芽糖之作用性為對 於葡萄糖之作用性的9 0 %以下者。 本發明之重組PQQGDH為包含比野生型PQQGDH對於雙醣 類之Kn]值更大者。較佳為對於麥芽糖之Km值為大者。對 於麥芽糖之K m值較佳為8 m Μ以上、更佳為1 2 m Μ以上、特 佳為2 0 m Μ以上。 本發明之重組PQQGDH為包含對於雙醣類之Km值為比對 於葡萄糖之Km值更大者。較佳，對於麥芽糖之Km值為比 對於葡萄糖之 Km值更大者。或者，較佳，對於麥芽糖之 K m值為對於葡萄糖之K m值的1 . 5倍以上、更佳為 3倍以 上。 本發明之重組PQQGDH期望為比野生型PQQGDH對於雙醣 類的作用性更降低的酵素，更且，比野生型P Q Q G D Η之穩定 性更提高的酵素。 本發明中之穩定性（本案中，亦標記為熱穩定性）為根據 5 8 °C、3 0分鐘熱處理後之活性殘存率予以評價。本發明之 重組P Q Q G D Η為包含5 8 °C 、3 0分鐘熱處理後之活性殘存率 比野生型P Q Q G D Η更高者。活性殘存率較佳為4 8 %以上、更 佳為5 5 %以上、特佳為7 0 %。 比野生型 PQQGDH對於雙醣類之作用性更降低之本發明 的重組PQQGDH，可例示如於來自不動桿菌（Acinetobacter) 10 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 屬之P Q Q G D Η的胺基酸序列中，1 7 0位、2 4 5位、2 4 9位、 3 4 9位、及、4 2 9位所組成群中至少一個位置之胺基酸為被 取代的重組PQQGDH 。 上述來自不動桿菌屬之PQQGDH的胺基酸序列，較佳為來 自乙酸！弓不重力桿菌（Acinetobacter calcoaceticus)或鮑 氏不動桿菌（Acinetobacter baumannii)之 PQQGDH 的胺基 酸序列。其中較佳為序列編號1。序列編號1所示之野生 型P Q Q G D Η蛋白質及序列編號2所示之鹼基序列為以鮑氏不 動桿菌 N C I Μ Β 1 1 5 1 7 為起源，揭示於日本專利特開平 1 1 - 2 4 3 9 4 9號公報。還有，於上述及序列編號1中，胺基 酸之標記為已除去訊號序列之天冬醯胺加以編號為1。 鮑氏不動桿菌N C I Μ Β 1 1 5 1 7株，以前被分類成乙酸鈣不動 桿菌。 還有，本發明之重組PQQGDH只要具有葡萄糖去氫酵素活 性，較佳只要對於雙醣類之作用性和/或對於穩定性不會造 成實質的不良影響，再令其他胺基酸殘基之一部分缺失或 取代亦可，或者加入其他胺基酸殘基亦可。 比野生型 P Q Q G D Η對於雙醣類之作用性更降低之本發明 的重組P Q Q G D Η可例示例如於來自不動桿菌屬之P Q Q G D Η的 胺基酸序列中，於6 7位、6 8位、6 9位、7 6位、8 9位、1 6 7 位、1 6 8 位、1 6 9 位、1 7 0 位、3 4 1 位、3 4 2 位、3 4 3 位、3 5 1 位、4 9 位、1 7 4 位、1 8 8 位、1 8 9 位、2 0 7 位、2 1 5 位、245 位、2 4 9位、3 0 0位、3 4 9位、1 2 9位、1 3 0位、1 3 1位及 4 2 9位之至少一個位置有胺基酸取代、和/或、於4 2 8位與 11 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 4 2 9位之間插入胺基酸的重組PQQGDH。 受質專一性經改良之本發明的重組 PQQGDH可例示例如 於來自不動桿菌屬之PQQGDH的胺基酸序列中，有胺基酸取 代的GDH及於4 2 8位與4 2 9位之間插入胺基酸的GDH。 較佳 為具有 Q76N, Q76E, Q76T, Q76M, Q76G, Q76K, N1 67E， N167L, N1 67G, N167T, N1 67S, N1 67A, N1 67M, Q168 I， Q168V, Q168A, Q168C, Q1 68D, Q1 68E, Q1 68F, Q168G, Q168H， Q168K, Q168L, Q1 68M, Q1 68N, Q1 68R, Q168S, Q168W, LI69D, LI69S, LI 69W, LI 69Y, LI 6 9A， LI69N, LI 69M, LI69V, LI69C, LI 69Q, LI 69H, LI69F, LI69R, LI 69K, L1 69 I , LI69T, LI 69P, LI 69G, LI 6 9E, A170L， A170I， A170K， A170F， A170W, A170P, A170M， K89E， K 3 0 0 R, S 2 0 7 C, N1 88 I , T 3 4 9 S, K 3 0 0 T, L174F，K49N, S189G， F215Y， SI 89G, E245D， E245F, E245H, E245M, E245N, E245Q， E245V, E245C， N249G, N249A, N249E, N249Q, A351T, P67K, E68K, P67D, E68T, I 69C，P67R，E68R，El29R K130G, P131G， El 29N, PI31T, El29Q, ΚΙ30T, PI 31R, El29A, K 1 30R， PI 31K， E34 1 L, M342P, A343R, A 3 4 3 I , E341P, M342V， E341S, M 3 4 2 I， A343C, M342R， A343N, T349S， T349P， T349Y, N429F， N429P, N429L, N 4 2 9 Y, A343N, LI 69P， LI69G 及 LI 69E 所組成群 中之胺基 酸取代 之至少 一個、和 /或、於 4 2 8位與4 2 9位之間插入 L、A或 K的重組PQQGDH 0 6 7位 、6 8 位’ ' 6 9 位、 7 6位、 89 位、1 6 7 位、1 6 8 位、 3】2/發明說明書(補件)/93-12/93127096 12 200525033 1 6 9 位、3 4 1 位、3 4 2 位、3 4 3 位、3 5 1 位、4 9 位、1 7 4 位、 1 8 8 位、1 8 9 位、2 0 7 位、2 1 5 位、2 4 5 位、3 0 0 位、3 4 9 位、 1 2 9位、1 3 0位、1 3 1位及4 2 9位之取代可為一處且亦可為 多處。 此處，「Q76N」為意指76位之Q(Gln)為N(Asn)所取代、 下列段落所示之任一種取代、和/或、於 4 2 8位與 4 2 9 位之間插入L、A或K為有助於提高P Q Q G D Η的受質專一性。 Q76N, Q76E, Q76T, Q76M, Q76G, Q76K, Q168I, Q168V, Q168A, Q168C, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q168K, Q168L, Q168M, Q168N, Q168R, Q168S, Q168W, L169A, L169V, L169H, L169K, L169D, L169S, L169N, L169G, L169C, A170L, Α170Ι, Α170Κ, A170F, A170W, Α170Ρ, E245F, Ε245Η, Ε245Μ, Ε245Ν, E245Q, E245V, E245C, N249G, Ν249Α, Ν249Ε, N249Q, (Q168A+L169G+E245D), (Q168A+L169P+E245D), (K89E+K300R), (Q168A+ L169D), (Q168S+L169S), (N167E+Q168G+L169Τ), (N167S+Q168Ν+ L169R), (Q168G+L169T), (N167G+Q168S+L169Υ), (N167L+Q168S+ L169G), (N167G+Q168S+L169S+L174F+K49N), (Q168N+L168N+S189R), (N167E+Q168G+L169A+S189G), (N167G+Q168R+L169Α), (N167S+Q168G+ L169A), (N167G+Q168V+L169S), (N167S+Q168V+L169S), (N167T+Q168I+L169G), (N167G+Q168W+L169Ν), (N167G+Q168S+L169Ν), (N167G+Q168S+L169V), (Q168R+L169C), (N167S+Q168L+L168G), (Q168C+ L169S), (N167T+Q168N+L169K), (N167G+Q168T+L169A+S207C), (Ν167Α+ Q168A+L169P), (N167G+Q168S+L169G), (N167G+Q168G), (N167G+Q168D+ L169K), (Q168P+L169G), (N167G+Q168N+L169S), (Q168S+L169G), (Ν188Ι+ T349S), (N167G+Q168G+L169A+F215Y), (N167G+Q168T+L169G), (Q168G+ 13 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 L169V), (N167G+Q168V+L169T), (N167E+Q168N+L169A), (Q168R+L169A), (N167G+Q168R), (N167G+Q168T), (N167G+Q168T+L169Q), (Q168I+L169G+ K300T), (N167G+Q168A), (N167T+Q168L+L169K), (N167M+Q168Y+L169G), (N167E+Q168S), (N167G+Q168T+L169V+S189G), (N167G+Q168G+L169C), (N167G+Q168K+L169D), (Q168A+L169D), (Q168S+E245D), (Q168S+L169S), (A351T), (N167S+Q168S+L169S), (Q168I+L169Q), (N167A+Q168S+ L169S), (Q168S+L169E), (Q168A+L169G), (Q168S+L169P), (P67K+E68K), (P67R+E68R+I69C), (P67D+E68T+I69C), (El29R+K130G+P131G), (E129Q+ K130T+P131R), (E129N+P131T), (El29A+K130R+P131K), (E341L+M342P+ A343R), (E341S+M342I), A343I, (E341P+M342V+A343C), (E341P+M342V+ A343R), (E341L+M342R+A343N), (Q168A+L169A), (Q168A+L169C), (Q168A+ L169E), (Q168A+L169F), (Q168A+L169H), (Q168A + L1691), (Q168A+L169K), (Q168A+L169M), (Q168A+L169N), (Q168A+L169P), (Q168A+L169Q), (Q168A+L169R), (Q168A+L169S), (Q168A+L169T), (Q168A+L169V), (Q168A+L169W)及（Q168A+L169Y) 比野生型PQQGDH之熱穩定性更提高之本發明的PQQGDH 可例示例如於來自不動桿菌屬之 PQQGDH 的胺基酸序歹 中，於 2 0 位、7 6 位、8 9 位、1 6 8 位、1 6 9 位、2 4 5 位、2 4 6 位及 3 0 0 位之至少一個位置具有胺基酸取代的重組 PQQGDH ° 較佳 為具有 K20E, Q76M, Q76G, K89E, Q1 68A, Q1 68D, Q168E, Q168F, Q168G, Q1 68H, Q1 68M, Q1 68P, Q168W, Q1 68Y, Q168S, LI69D, LI69E, LI 69P, LI69S, Q246H, K300R, Q76N, Q76T, Q76K, L169A, L169C, LI69E, LI 69F, 312/發明說明書(補件)/93* 12/93127096 14 200525033 L169H， L169K， L169N， L169Q， L169R， L169T, L169Y 及 L 1 6 9 G所組成群中選出的胺基酸取代。2 0位、7 6位、8 9 位、1 6 8位、1 6 9位、2 4 6位及3 0 0位之取代可於一處，且 亦可於多處。 此處，「K 2 0 E」為意指將2 0位之K ( L y s )取代成E ( G 1 u )。 下列所示之任一種胺基酸取代為特別有助於提高 P Q Q G D Η的熱穩定性。 Κ20Ε, Q76M, Q76G, (K89E+K300R), Q168A, (Q168A+L169D), (Q168S+L169S), Q246H, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q168M, Q168P, Q168W, Q168Y, Q168S, (Q168S+L169Ε), (Q168S+L169Ρ), (Q168A+L169A), (Q168A+L169C), (Q168A+L169Ε), (Q168A+L169F), (Q168A+L169H), (Q168A+L169Κ), (Q168A+L169Ν), (Q168A+L169P), (Q168A+L169Q)， (Q168A+L169R), (Q168A+L169Τ), (Q168A+L169Υ), (Q168A+L169G), (Q168A+L169P+E245D), (Q168A+L169G+E245D) 或者，比野生型 PQQGDH對於雙醣類之作用性更為降低 之本發明的重組 P Q Q G D Η可例示例如於來自不動桿菌屬之 P Q Q G D Η的胺基酸序列中，於7 4位、1 4 6位、1 6 8位、1 6 9 位、1 7 0位、2 4 5位及3 4 2位之至少一個位置具有胺基酸取 代的重組PQQGDH 。 上述中，於7 4位、1 4 6位之至少一個位置具有胺基酸取 代的重組PQQGDH為更佳。經由在此些位置導入變異，則 可降低對於雙醣類的作用性，加上可期待與野生型酵素相 比較，對於葡萄糖反應之比活性更為提高。又，亦可考慮 於含有媒介之系中的反應度提高的可能性。 15 312/發明說明書(補件)/93-12/93 ] 27096 200525033 較佳為具有由 D74V、 S146A、 Q168A、 L169P、 A170L、 A170M、 A170I、 A170F、 E245D、 M342I、 M342V、 M342P、 M342A 所組成群中之胺基酸取代之至少一個的重組PQQGDH。 上述中，於D74V、S146A之至少一個位置具有胺基酸取 代的重組PQQGDH為更佳。 此處，「M342A」為意指342位之M(Met)取代成A(Ala)。 下列段落所示之任一種取代為有助於提高 P Q Q G D Η的受 質專一性。 D74V、Μ342 Ι、M342V、Μ342Ρ、Μ342Α、S146A、Q168A、L169P、A170L、Α170Μ、 Α170Ι 、 A170F 、 （S146A+A170L) 、 （Q168A+L169P+A170L) 、 （S146A+A170M)、 (Q168A+L169P+A170M) 、 （S146A+Q168A+L169P+A170L) 、 （S146A+Q168A+ L169P+A170M) ' (Q168A+L169Ρ+Α170L+E245D) > (Q168A+L169Ρ+Α170Μ+ E245D) 、 （S146A+M342I) 、 （Q168A+L169P+A170L+M342I) 、 （Q168A+L169P+ Α170Μ+Μ342Ι) 、 (S146A+M342V) 、 (Q168A+L169Ρ+Α170L+M342V)、 (Q168A+L169P+A170M+M342V) 、 （S146A+M342P) 、 （Q168A+L169P+A170L+ Μ342Ρ) 、 （Q168A+L169P+A170M+M342P) 、 （S146A+M342A) 、 （Q168A+L169P+ A170L+M342A) 、 （Q168A+L169P+A170M+M342A) 、 （D74V+S146A) 、 （D74V+ Q168A+L169P+A170L)、 （D74V+Q168A+L169P+A170M)、 （Q168A+L169P+A170L+ E245D+M342I)、（Q168A+L169P+A170M+E245D+M342I)、（Q168A+L169P+A170L+ E245D+M342V) 、 （Q168A+L169P+A170M+E245D+M342V) 、 （Q168A+L169P+ A170L+E245D+M342A) > (Q168A+L169Ρ+Α170M+E245D+M342A) 上述中，於D74V、S146A之至少一個位置具有胺基酸取 代的重組PQQGDH為更佳。 上述中，本發明之重組PQQGDH的其他組態更佳為胺基酸 16 3】2/發明說明書(補件)/93-12/93 ] 27096 200525033 取代為
A1 70V, A1 70L， A1 70 I， A170T, A1 70K, A170C, A1 70M, A1 70F, A170Y, A170W, A1 70P E245D, E245F, E245H, E245M, E245N, E245Q, E245S, E245T, E245V, E245W, E245R, E245G, E245C, N249G， N249A, N249L, N249E, N249Q, T349S, T349P, T 3 4 9 Y N429F, N429P, N429L, N 4 2 9 Y 所組成群中的重組PQQGDH。 或者，本發明之重組PQQGDH的其他組態較佳為胺基酸取 代為 (Q168A+L169G+E245D), (Q168A+L169P+E245D) (S146A+A170L), (Q168A+L169P+A170L), (S146A+A170M), (Q168A+L169P+ A170M), (S146A+Q168A+L169P+A170L), (S146A+Q168A+L169P+A170M), (Q168A+L169P+A170L+E245D), (Q168A+L169P+A170M+E245D), (S146A+ M342I), (Q168A+L169P+A170L+M342I), (Q168A+L169P+A170M+M342I), (S146A+M342V), (Q168A+L169P+A170L+M342V), (Q168A+L169P+A170M+ M342V), (S146A+M342P), (Q168A+L169P+A170L+M342P), (Q168A+L169P+ A170M+M342P), (SI46A+M342A), (Q168A+L169P+A170L+M342A), (Q168A+ L169P+A170M+M342A), (D74V+S146A), (D74V+Q168A+L169P+A170L), (D74V +Q168A+L169P+A170M), (Q168A+L169P+A170L+E245D+M3421 ), (Q168A+ L169P+A170M+E245D+M342I), (Q168A+L169P+A170L+E245D+M342V), (Q168A +L169P+A170M+E245D+M342V), (Q168A+L169P+A170L+E245D+M342A), (Q168A+L169P+A170M+E245D+M342A) 17 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 所組成群中的重組PQQGDH。 再佳者可列舉（Q168A+L169P+A170L+E245D+M342I)， (Q 1 6 8 A + L 1 6 9 P + E 2 4 5 D )。其不僅對於雙醣類的作用性降低， 且熱安定性亦優良故為佳。 本發明之令在以鐵氰化離子做為媒介的測定系中的比活 性提高的方法，係經由野生型吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去 氰酵素（於本說明書中亦稱為P Q Q G D Η )的胺基酸序列中，令 一個或數個胺基酸缺失、取代或加入則可達成。做為重組 材料的野生型 P Q Q G D Η，為以吡咯喹啉醌酉己位結合做為輔 酶，且為催化D -葡萄糖氧化生成D -葡萄糖酸-1，5 -内酯反 應的酵素，關於其來源和構造並無特別限定。 做為重組材料之野生型 PQQGDH的起源代表例為下列例 示的微生物。具體而言，可列舉例如乙酸鈣不動桿菌、鮑 氏不動桿菌（Acinetobacter baumanni i )、 綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)、螢光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)、氧 化葡萄糖桿菌等之氧化細菌和放射形土壤桿菌 (Agrobacterium radiobacter)、大腸桿菌、產氣克雷伯氏 菌（Klebsiella aerogenes)等之腸内細菌。但，將大腸桿 菌等中存在的膜上酵素改變成為可溶型乃為困難，選擇來 自屬於不動桿菌屬之微生物為佳。更佳為選擇乙酸鈣不動 桿菌或鮑氏不動桿菌等之可溶性PQQGDH。 上述來自不動桿菌屬之PQQGDH的胺基酸序列較佳為來 自乙酸鈣不動桿菌或鮑氏不動桿菌之 P Q Q G D Η的胺基酸序 18 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 列。其中較佳為序列編號 1。序列編號 1 所示之野生型 PQQGDH蛋白質及序列編號2所示之鹼基序列為以鮑氏不動 桿菌 N C I Μ B 1 1 5 1 7 株為起源，且揭示於日本專利特開平 1 1 _ 2 4 3 9 4 9號公報中。還有，於上述及序列編號1中，胺 基酸之標記為已除去訊號序列之天冬醯胺加以編號為1。 鮑氏不動桿菌N C I Μ Β 1 1 5 1 7株，以前被分類成乙酸鈣不 動桿菌。 本發明中所謂的比活性，為指在以鐵氰化物離子做為媒 介的活性測定系中，每單位重量酵素分子的活性，更詳言 之為純化酵素每1毫克之酵素活性的單位。 本發明中所謂的活性中心，為指於吡咯喹啉醌依存性葡 萄糖去氫酵素中，結合受質D -葡萄糖並使受質接受觸媒作 用的部位，由結合D -葡萄糖之受質結合部位及進行氧化觸 媒反應的啦17各喧琳酿結合部位所構成。 更且，本發明中所謂的野生型吡咯喹啉醌依存性葡萄糖 去氫酵素，為指自然界存在的所有°比ρ各噎。林S昆依存性葡萄 糖去氫酵素。另一方面，所謂重組吡咯喹啉醌依存性葡萄 糖去氫酵素，為指與野生型吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫 酵素相比較，其胺基酸序列中，於一或數個胺基酸察見缺 失、取代、插入者。 本發明中比活性的提高，一般為包含相對於野生型之比 活性提高為 1 0 %以上者。較佳為相對於野生型為提高 5 0 % 以上。 在以鐵氰化物離子做為媒介的測定系中，比野生型 19 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 P Q Q G D Η之比活性更為提高之本發明的P Q Q G D Η，例如，經由 令活性中心附近之胺基酸至少一處由其他胺基酸取代，與 野生型相比較，使得在以鐵氰化物離子做為媒介之測定系 中之比活性為被提高的重組吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫 酵素。 在以鐵氰化物做為媒介的測定系中，比野生型 PQQGDH 之比活性更提高之本發明的P Q Q G D Η，更詳言之為令由活性 中心至其半徑1 〇 Α以内存在的胺基酸至少一處為其他胺基 酸取代，或此胺基酸為，於來自不動桿菌屬之PQQGDH的胺 基酸序列中，由7 6位、1 4 3位、1 4 4位、1 6 3位、1 6 8位、 169 位、228 位、229 位、247 位、248 位、343 位、346 位、 3 4 8位、3 7 7位、4 0 6位、4 0 8位、4 2 4位所組成群中之胺 基酸。 又，本發明之 PQQGDH 可例示於來自不動桿菌屬之 P Q Q G D Η的胺基酸序列中，於1 6 8位、1 6 9位之至少一個位 置具有胺基酸取代的重組σ比咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫酵 素。 若更詳細例示本發明之P Q Q G D Η，則為於來自不動桿菌屬 之PQQGDH的胺基酸序列中，具有Q168A、（Q168A + L169G)、 (Q168A + L169C) 、 (Q1 68A + L169P) 、 (Q168S + L1 69E)、 (Q 1 6 8 S + L 1 6 9 P )所組成群中之胺基酸取代的吡咯喹啉醌依 存性葡萄糖去氫酵素。 此處，所謂 Q 1 6 8 A，為意指 1 6 8 位之 Q ( G 1 η )取代成 A(Ala) ° 20 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 還有，本發明之PQQGDH只要具有葡萄糖去氫酵素 較佳為只要在以鐵氰化物做為媒介之測定系中對於比 不會造成實質的不良影響，亦可再令其他胺基酸殘基 部分缺失或取代，或者亦可加入其他的胺基酸殘基。 又，本發明之PQQGDH，為於上述胺基酸取代中，即 活性中心附近的胺基酸也被取代，與野生型相比較， 鐵氰化物離子做為媒介的測定系中亦可維持提高之比 的重組σ比略啥。林S昆依存性葡萄糖去氫酵素。 詳言之，為具有2 4 5位之胺基酸取代的重組°比17各喹 依存性葡萄糖去氫酵素，更詳言之，胺基酸取代為具 (Q168A+L169G+E245D) 、 （Q168A+L169P+E245D)所組成 之胺基酸取代的吡咯喹啉醌依存性去氫酵素。 本發明之在以鐵氰化物離子做為媒介之測定系中， 咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫酵素的比活性比野生型提 方法，為經由令該酵素之胺基酸序列中，一個或數個 酸缺失、取代或加入而達成。 於本發明中，缺失、取代或加入的胺基酸並無特 定，但期望為活性中心附近的胺基酸。或者，缺失、 或加入的胺基酸期望為存在於活性中心至其半徑1 0 A 的胺基酸。 又，於本發明之方法中，吼咯喹啉醌依存性葡萄糖 酵素期望為於來自不動桿菌屬之 PQQGDH的胺基酸 中，7 6 位、1 4 3 位、1 4 4 位、1 6 3 位、1 6 8 位、1 6 9 位， 位、2 2 9 位、2 4 7 位、2 4 8 位、3 4 3 位、3 4 6 位、3 4 8 位 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 &性， 活性 之一 使非 在以 活性 琳酉昆 有由 群中 令。比 南白勺 胺基 別限 取代 以内 去氫 序列 、228 、377 21 200525033 位、4 0 6位、4 0 8位、4 2 4位所組成群中之至少一個胺基酸 為經其他胺基酸所取代。 又，於來自不動桿菌屬之PQQGDH的胺基酸序列中，期 望1 6 8位及1 6 9位所組成群中之至少一個胺基酸為經其他 胺基酸所取代。 更且，於來自不動桿菌屬之PQQGDH的胺基酸序列中， 期望胺基酸取代為由 Q168A 、 （Q168A + L169G)、 (Q168A + L169C) 、 (Q168 A + L169P ) 、 (Q168S + L169E )、 (Q168S + L169P)所組成群中選出。 又，於上述胺基酸取代中，儘管加上非活性中心附近的 胺基酸取代亦無妨，此時於來自不動桿菌屬之PQQGDH的胺 基酸序列中，期望為 2 4 5 位的胺基酸，且更期望由 (Q168A+L169G+E245D)、 （Q168A+L169P+E245D)所組成群中 選出。 然而，於本案申請時，來自乙酸鈣不動桿菌L M D 7 9 . 4 1 菌株之酵素的X射線晶體結構解析的結果已被報導，以活 性中心為首之該酵素的高級構造已闡明（參照非專利文獻 1、2、3、4) 〇 非專利文獻 l:J.Mol.Biol.289,319-333(1999) 非專利文獻 2:PNAS，96(21), 11787-11791(1999) 非專利文獻 3 ·· The EMBO Journal, 1 8 ( 1 9), 5 1 87-5 1 94( 1 999 ) 非專利文獻 4:Protein Science, 9， 1265-1273(2000) 根據關於此高級構造的發現，關於該酵素之構造和相關 機能的研究仍在進行中，但仍未能稱為完全闡明。例如， 22 312/發明說明書(補件)/9342/93 mo% 200525033 考察到對於水溶性葡萄糖去氫酵素第6個W -模組（W - m 〇 t i f ) 之連結B鏈和C鏈的環區域（W 6 B C )中之胺基酸殘基的構造 基因的特定部位導入變異，則可改良對於葡萄糖的選擇性 (例如，參照專利文獻 2 )。但是，將效果實證者則僅於實 施例中所揭示者。 專利文獻2 :日本專利特開2 0 0 1 - 1 9 7 8 8 8 此處，若以本案發明之成果為基礎重估關於此些高級構 造的發現，則對於雙醣類作用性之改變上，認為可能與參 與P Q Q結合的胺基酸和/或其周邊的胺基酸、參與葡萄糖結 合的胺基酸和/或其周邊的胺基酸、參與鈣離子結合的胺基 酸和/或其周邊的胺基酸之至少一者有關。 本發明之重組PQQGDH為於來自不動桿菌屬之PQQ依存 性葡萄糖去氫酵素，例如於序列編號1所記載之PQQ依存 性葡萄糖去氫酵素中，包含參與P Q Q結合的胺基酸和/或其 周邊的胺基酸、和/或、參與葡萄糖結合的胺基酸和/或其 周邊的胺基酸為經取代者。於非專利文獻3及4中，記載 與 PQQ 結合的胺基酸為 Y344、 W346、 R228、 N229、 K377、 R406、R408、D424，與葡萄糖結合的胺基酸為Q76、D143、 H144 、 D163 、 Q168 、 L169 等 ° 又，本發明之重組 PQQGDH為於來自不動桿菌屬之 PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素，例如於序列編號1所記載之PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素中，包含參與約離子結合的胺基酸 和/或其周邊的胺基酸為經取代者。於非專利文獻1中，記 載與活性中心之鈣離子結合的胺基酸為 P 2 4 8、G 2 4 7、 23 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 Q246 、 D252 、 T348 等 ° 又，本發明之重組 PQQGDH為包含於野生型酵素之活性 型立體構造中之活性中心至其半徑1 5 A以内、較佳為半徑 1 0 A以内範圍位置的胺基酸進行變異而取得者。 又，本發明之重組 PQQGDH為包含於野生型酵素之活性 型立體構造中之受質至其半徑1 0 A以内範圍位置的胺基酸 進行變異而取得者。特別是，於受質為葡萄糖時，於野生 型酵素之活性型立體構造中由受質至其半徑1 0 A以内範圍 位置的胺基酸進行變異而取得者。 又，本發明之重組 PQQGDH為包含於野生型酵素之活性 型立體構造中與受質第1個碳結合之0 Η基至其半徑1 0 A 以内範圍位置的胺基酸進行變異而取得者。特別是，於受 質為葡萄糖時，於野生型酵素之活性型立體構造中受質至 其半徑 1 0 A以内範圍位置之胺基酸進行變異而取得者為 佳。 又，本發明之重組 PQQGDH為於野生型酵素之活性型立 體構造中與受質第2個碳結合之0 Η基至其半徑1 0 A以内範 圍位置的胺基酸進行變異而取得者。特別是，於受質為葡 萄糖時，於野生型酵素之活性型立體構造中受質至其半徑 1 0 A以内範圍位置之胺基酸進行變異而取得者為佳。 根據上述之指示，業者可參照鮑氏不動桿菌N C I Μ B 1 1 5 1 7 菌株做為起源之序列編號1所示的野生型P Q Q G D Η蛋白質及 序列編號2所示之鹼基序列，對於來自與彼等相同性高（較 佳為具有8 0 %以上、更佳為9 0 %以上的相同性）之其他起源 24 312/發明說明書(補件)/93-】2/93127096 200525033 (不論是天然、經重組、人工合成者）的重組P Q Q G D Η，亦可 經由將該區域中之胺基酸殘基取代，而不需過度嘗試錯 誤，取得比野生型之PQQGDH對於雙醣類的作用性更為降低 的重組P Q Q G D Η。 或者，若以本案發明之成果為基礎由其他觀點重估關於 此些高級構造的發現，則以鐵氰化物離子做為媒介之測定 系中的比活性之提高，可考慮為與一個以上之活性中心附 近的胺基酸殘基的取代有關聯。 本案發明中所謂活性中心附近，為指參考PQQ、葡萄糖 和/或與P Q Q配位之妈離子結合的胺基酸，並將此以外的區 域稱為非活性中心附近。 又，本發明之重組 PQQGDH為包含令野生型酵素之活性 型立體構造中之活性中心至其半徑1 0 A以内範圍位置的胺 基酸進行變異而取得者。 又，本發明之重組 PQQGDH於實質上為包含在野生型酵 素之活性型立體構造中受質至其半徑1 0 A以内範圍位置之 胺基酸進行變異而取得者。特別是，於受質為葡萄糖時， 於野生型酵素之活性型立體構造中受質至其半徑1 0 A以内 範圍位置的胺基酸進行變異而取得者。 又，於本發明之重組 PQQGDH於實質上為包含在野生型 酵素之活性型立體構造中結合至受質第1個碳之0 Η基至其 半徑 Α 以内範圍位置的胺基酸進行變異而取得者。特別 是，於受質為葡萄糖時，於野生型酵素之活性型立體構造 中受質至其半徑1 〇 A以内範圍位置之胺基酸進行變異而取 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 25 200525033 得者為佳。 又，本發明之重組 PQQGDH於實質上為包含在野生型酵 素之活性型立體構造中結合至受質第2個碳之0 Η基至其半 徑 1 0 Α 以内範圍位置的胺基酸進行變異而取得者。特別 是，於受質為葡萄糖時，於野生型酵素之活性型立體構造 中受質至其半徑1 〇 A以内範圍位置之胺基酸進行變異而取 得者為佳。 還有，於改變處為複數時，全部的重組型與野生型相比 較，若在以鐵氰化物離子做為媒介之測定系中比活性提 高，則全部的變異處並非必要在活性中心附近。 根據上述之指示，業者對於來自其他起源的重組 PQQGDH，亦可經由將該區域中之胺基酸殘基取代，取得在 以鐵氰化物做為媒介之測定系中比野生型之 PQQGDH的比 活性更為提高的PQQGDH。 例如，序列編號1之胺基酸序列，若與來自乙酸鈣不動 桿菌 L M D 7 9 . 4 1菌株的胺基酸序列相比較，則不同處為些 微，相同性為 9 2. 3 °/〇(包含訊號序列），為非常類似，故序 列編號1中之殘基可輕易辨識相當於其他起源酵素的何種 胺基酸殘基。因此，根據本發明，此類於一處或以上處令 胺基酸殘基以其他胺基酸殘基予以缺失、取代或插入等， 則可取得比野生型之 PQQGDH對於雙醣類的作用性更為降 低的重組PQQGDH。此些重組PQQGDH葡萄糖去氫酵素亦被 包含於本發明之範圍内。 本發明為表現上述重組吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 26 200525033 酵素的基因。 本發明為表現比野生型之D比咯喹啉醌依存性葡萄糖去 氫酵素（P Q Q G D Η )對於雙醣類之作用性更為降低之重組 PQQGDH的基因。更且，含有該基因的載體。更且，經該載 體所轉型的轉型體。更且，培養該轉型體為其特徵之重組 PQQGDH的製造方法。 表現本發明之重組PQQGDH的基因，具有可由微生物等 之各種起源所得之含有表現野生型P Q Q G D Η基因的D N A片段 予以重組而取得的可能性。具體而言，可列舉例如乙酸鈣 不動桿菌、鮑氏不動桿菌、綠膿桿菌、惡臭假單胞菌、螢 光假單胞菌、氧化葡萄糖桿菌等之氧化細菌和放射形土壤 桿菌、大腸桿菌、產氣克雷伯氏菌等之腸内細菌。但，將 大腸桿菌等中存在的膜上酵素改變成為可溶型乃為困難， 其起源以選擇不動桿菌屬、更佳為相同性高的乙酸鈣不動 桿菌或鮑氏不動桿菌之任一者的可溶性PQQGDH為佳。 將表現野生型 PQQGDH基因改變的方法，可使用常用之 基因重組手法。即，經由變換具有蛋白質遺傳資料之 DN A 的特定鹼基、或者經由插入或缺失特定的鹼基，作成具有 重組蛋白質之遺傳資料的 DNA。重組DNA中之鹼基的具體 方法可列舉例如使用市售的套件 （T r a n s f 〇 r m e r Mutagenesis Kit ; Clonetech 製，E X 0 El / M u n g Bean Deletion Kit ; Stratagene 製 ，Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit； Stratagene 製等）或者利用 聚合酶鏈鎖反應法（P C R )。 27 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 所製作之具有重組蛋白質遺傳資料的DNA，以連結質體 之狀態移入宿主微生物中，生產重組蛋白質並且成為轉型 體。此時之質體例如以大腸桿菌做為宿主微生物之情形中 可使用pBluescript, pUC18等。宿主微生物例如可使用大 腸桿菌 W3110、大腸桿菌C600、大腸桿菌JM109、大腸桿 菌 D Η 5 α等。將重組載體移入宿主微生物之方法，例如於 宿主微生物為屬於大腸桿菌屬之微生物時，可採用於鈣離 子存在下進行重組DNA移入的方法等，更且亦可使用電穿 孔法。更且，亦可使用市售的勝任細胞（例如，C 〇 r n p e t e n t High JM1 09 ;東洋紡績製）。 此類基因可由此些菌株中萃取，或者化學合成亦可。更 且，經由利用PCR，亦可取得含有PQQGDH基因的DNA片段。 於本發明中，取得表現P Q Q G D Η基因的方法可列舉如下 之方法。例如，將乙酸鈣不動桿菌N C I Β 1 1 5 1 7之染色體分 離、純化後，使用超音波處理、限制酶處理等將DNA切斷 者、與線型表現載體以DNA連接酶將兩DNA的鈍端末端或 黏性末端予以結合閉鏈，構築重組載體。將該重組載體移 入可複製的宿主微生物後，以載體之標識基因與酵素活性 之表現為指標進行篩選，取得保持含有表現以PQQ做為輔 基之GDH基因之重組載體的微生物。 其次，將上述保持重組載體之微生物予以培養，且由該 培養微生物之菌體中將該重組載體分離、純化，並由該表 現載體採取表現G D Η的基因。例如，基因供給體之乙酸鈣 不動桿菌NCIB11517的染色體DNA，具體而言為如下處理 28 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 採集。 將該基因供給之微生物例如攪拌培養 1〜3日並將所得 之培養液離心集菌，其次，令其溶菌則可調製含有以 PQQ 做為輔基之GDH基因的溶菌物。溶菌的方法例如為以溶菌 酶等之溶菌酵素施以處理，視需要併用蛋白酶和其他酵素 和十二基硫酸鈉（S D S )等之界面活性劑。更且，亦可組合冷 凍融解和細胞均質機處理等之物理性破碎方法。 由如上述處理所得之溶菌物中將DNA分離純化上，依據 常法，例如以苯酚處理和蛋白酶處理之去蛋白處理、和核 糖核酸酶處理、酒精沈澱處理等之方法適當組合進行。 將從微生物中分離、純化的DNA予以切斷的方法例如以 超音波處理、限制酶處理等進行。較佳為以作用於特定核 苷酸序列的Π型限制酶為適當。 選殖時之載體為由在宿主微生物内可自律性增殖的噬 菌體或重組質體為適當。例如以大腸桿菌做為宿主微生物 之情形中，嗟菌體可例示Lambda gtlO、Lambda gtll等。 又，例如以大腸桿菌做為宿主微生物之情形中，質體可例 示 pBR322 、 pUC19 、 pBluescript % 〇 選殖時，如上述之載體，以切斷表現上述GDH基因供給 體微生物 DNA所使用的限制酶予以切斷則可取得載體片 段，但並非必要使用與切斷該微生物DNA所使用之限制酶 相同的限制酶。令微生物DNA片段與載體DNA片段結合的 方法，若使用公知的DNA連結酶方法即可，例如，將微生 物 DNA片段的黏性末端與載體片段的黏性末端予以黏接 29 312/發明說明書(補件)/93-12/93】27096 200525033 後，使用適當的DNA連接酶作成微生物DNA片段與載體DNA 片段的重組載體。視需要，黏接後，移入宿主微生物且利 用活體内之DNA連接酶製作重組載體亦可。 選殖所使用之宿主微生物若令重組載體穩定、且可自律 增殖並且可令外來性遺傳物質表現者即可，並無特別限 制。一般而言，可使用大腸桿菌W 3 1 1 0、大腸桿菌C 6 0 0、 大腸桿菌HB101、大腸桿菌JM109、大腸桿菌DH5a等。 於宿主微生物中移入重組載體的方法，例如於宿主微生 物為大腸桿菌之情形中，可使用以鈣處理的勝任細胞法和 電穿孔法等。 如上述處理所得之轉型體微生物培養基進行培養，則可 穩定生產大量的 GDH。關於目標之重組載體是否移入宿主 微生物之篩選，同時表現保持目標DNA之載體的抗藥性標 識基因、和經由PQQ添加後之GDH活性的微生物即可。例 如，選擇於含抗藥性標識基因可抗之藥劑的培養基上可生 長、且生成G D Η的微生物即可。 根據上述方法所得之以PQQ做為輔基之GDH基因的鹼基 序列為依 Science，第 214卷，1205(1981)所記載之DNA 定序法予以定序。又，GDH的胺基酸序列為由如上述定序 出之鹼基序列予以推定而成。 利用如上述處理所暫時選得之保有PQQ做為輔基之GDH 基因的重組載體，往具有PQQ生產能力之微生物中移入可 複製之重組載體，可經由將保有GDH基因的重組載體中以 限制酶和PCR法回收之GDH基因的DNA，與其他載體片段 30 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 結合則可輕易實施。又，以此些載體對於具有PQQ生產能 力之微生物的轉型，可使用以鈣處理的勝任細胞法和電穿 孔法等。 具有 PQQ生產能力的微生物可列舉曱基桿菌（Methylo bacterium)屬等之曱基同化性細菌、醋桿菌（Acetobacter) 屬和葡萄糖桿菌（Gluconobacter)屬之醋酸菌、黃桿菌 (Flavobacterium)屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬等之細菌。 其中，因為可利用假單胞菌屬細菌和不動桿菌屬細議的宿 主載體系已被確立且易於利用，故為佳。 假單胞菌屬細菌可使用綠膿桿菌、螢光假單胞菌、惡臭 假單胞菌等。又，不動桿菌屬細菌可使用乙酸鈣不動桿菌、 鮑氏不動桿菌等。 在上述微生物中可複製的重組載體，以來自R S F 1 0 1 0之 載體或具有其類似複製子之載體可利用於假單胞菌屬細 菌。可列舉例如 PKT 2 4 0、pmmB24 等（Μ· M· Bagdasarian 等 人、Gene， 26， 273(1983))、 PCN40、 pCN60 等（C.C. Nieto 等人，Gene，87，145(1990))和 pTS1137 等。又，亦可利用 PME290 等（Y· Itoh 等人、Gene， 36， 27(1985))、 pNI 111 、 pNI20C(N.Itoh 等人，J· Biochem·， 110， 614(1991))。 不動桿菌屬細菌中，可利用pWM4等（W.Minas等人，Appl. Environ· Microbiol·，59，2 8 0 7 ( 1 9 9 3 ) )、pKT 2 3 0、pWΗ 1 266 等（M.Hunger 等人，Gene， 87, 45(1990))做為載體。 如此處理所得之轉型體微生物為經由營養培養基中培 養，則可穩定生產大量的重組蛋白質。轉型體宿主微生物 31 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 的培養形態若考慮宿主的營養生理性質選擇培養條件即 可，且許多情況為以液體培養進行。工業上利於進行通氣 攪拌培養。 培養基的營養源可廣泛使用微生物培養中所通常使用之 物質。碳源若為可同化的碳化合物即可，可使用例如葡萄 糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糖蜜、丙酮酸等。又，氮源若 為可利用的氮化物即可，可使用例如蛋白胴、肉抽出物、 酵母萃取物、酪蛋白水解物、大豆粕鹼萃取物等。此外， 磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、鎂、鈣、鉀、鐵、錳、鋅等之 鹽類、特定之胺基酸、特定之維生素等可視需要使用。 培養溫度為在可成長、並且生產重組PQQGDH的範圍中 適當變更，但於具有如上述PQQ生產能力的微生物情況， 較佳為2 0〜4 2 °C左右。培養時間為根據條件而多少不同， 但若於重組 PQQGDH為到達最高產量之時期視為適當時期 且完成培養即可，通常為 6〜48 小時左右。培養基之 pH 為在菌可成長、並且生產重組PQQGDH的範圍中適當變更， 但較佳為pH6.0〜9.0左右之範圍。 培養物中之含有生產重組 P Q Q G D Η菌體的培養液就其原 樣採集，利用亦可，但一般，依據常法，於重組 PQQGDH 為存在於培養液中之情況為以過濾、離心等，令含有重組 P Q Q G D Η的溶液與微生物菌體分離後供利用。於重組P Q Q G D Η 為存在於菌體内之情況，由所得之培養物以過濾·或離心等 手段採集菌體，其次，將此菌體以機械性方法或溶菌酶等 之酵素性方法予以破壞，又，視需要，添加EDTA等之嵌合 32 312/發明說明書(補件)/93- ] 2/93127096 200525033 劑及界面活性劑令GDH可溶化，並且以水溶液型式分離採 集。 令如上述處理所得之含G D Η溶液，例如以減壓濃縮、膜 濃縮、及硫酸銨、硫酸鈉等之鹽析處理、或親水性有機溶 劑，例如曱醇、乙醇、丙酮等之分級沈澱法令其沈澱即可。 又，加熱處理和等電點處理亦為有效的純化手段。其後， 經由進行吸附劑或膠濾劑等之膠過濾、吸附層析、離子交 換層析、親和性層析，則可取得純化的G D Η。 例如，以 Sephadex 膠（Pharmacia Biotech)等之膠過 濾、DEAE Sepharose CL-6B(Pharmacia Biotech) 、 Octyl Sepharose CL-6B(Pharmacia Biotech)等之管柱層析法予 以分離、純化，取得純化酵素樣品。該純化酵素樣品為於 電泳（S D S - P A G E )上顯示被純化成單一帶（b a n d )程度為佳。 令如上述處理所得之純化酵素，例如以冷凍乾燥、真空 乾燥和噴霧乾燥等予以粉末化並且流通。此時，純化酵素 為於磷酸緩衝液、T r i s - H C 1緩衝液和 G 0 0 D之緩衝液中溶 解供使用。較佳者為G 0 0 D的緩衝液，其中以Ρ I P E S、Μ E S 或MOPS緩衝液為特佳。又，經由添加鈣離子或其鹽類、及 麩胺酸、麩胺醯胺、離胺酸等之胺基酸類、及血清白蛋白 等則可令GDH更加穩定化。 本發明之重組蛋白質的製造方法並無特別限定，可以如 下所示之手續進行製造。改變構成蛋白質之胺基酸序列的 方法，可使用通常進行改變遺傳資料的手法。即，經由變 換具有蛋白質遺傳資料之DNA的特定鹼基、或者經由插入 33 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 或缺失特定的鹼基，則可作成具有重組蛋白質遺傳資料的 DNA。變換DNA中鹼基的具體方法可列舉例如使用市售的套 件（Transfomer Mutagenesis Kit ; Clonetech 製，ΕΧΟΙΠ /Μ u η g Bean Deletion Kit ; Stratagene 製，QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit； Stratagene 製等）、 或利用聚合酶鏈鎖反應法（P C R )。 本發明為著眼於序列編號1所示之P Q Q G D H約7 6位、1 6 7 位、1 6 8位、1 6 9位、1 7 0位及2 4 5位，且於作成其胺基酸 取代體時，可取得受質專一性經改善的PQQGDH重組體。關 於受質專一性以 Q76K， Q168A， Α170Ρ， E245D, (Q168A+L169G+ E245D), (Q168A + L169P + E245D), (Q168S + L169S) , (Q168A + L169D), (Q168S + E245D), (Q168S + L16 9Ε), (Q168A + L169G ), (Q168S + L169P)， （Q168A+L169A), (Q168A+L169C), (Q168A+L169E)， (Q168A + L16 9Κ), (Q168A + L169Μ), (Q168A + L169Ν ), (Q168A + L169P)，（Q168A + L169S)及（Q168A + L169T)為特佳。 本發明為著眼於序列編號1所示之P Q Q G D Η的2 0位、7 6 位、89位、168位、169位、245位、246位及300位，且 於作成其胺基酸取代體時，可取得穩定性經改善的PQQGDH重組體。 關於熱穩定性，以 K20E， （K89E + K300R)，Q168A， （Q168A + L169D)， (Q168S+L169S)， （Q168S+L169E)， （Q168S+L169P)， （Q168A+L169G), Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q168M, Q168P, Q168S, Q168W, Q168Y, (Q168A + L169A), (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A + L169F), (Q168A + L169H), (Q168A + L169K), (Q168A + L169N), (Q168A + L169P), (Q168A + L169Q), (Q168A + L169R), (Q168A + L169T), (Q168A + 34 312/發明說明書(補件)/93·】2/93127096 200525033 L169Y)，（Q168A + L169G + E245D)，（Q168A + L169P + E245D)及 Q246H 之胺 基酸取代為特佳。 或者，本發明為著眼於序列編號1所示之 PQQGDH的74 位、1 4 6位、1 6 8位、1 6 9位、1 7 0位、2 4 5位及3 4 2位， 且於作成其胺基酸取代體時，可取得受質專一性經改善的 P Q Q G D Η重組體。關於受質專一性以D 7 4 V、Μ 3 4 2 I、Μ 3 4 2 V、 Μ342Ρ、 Μ342Α、 S146A、 Q168A、 L169P、 A170L、 Α170Μ、 Α170Ι 、 A170F、 （S146A+A170L)、 （Q168A+L169P+A170L)、 （S146A+A170M)、 (Q168A + L169P + A170M) ' (SI46A + Q168A + L169Ρ + Α170L) > (S146A + Q168A + L169P + A170M) ' (Q168A + L169P + A170L + E245D) > (Q168A + L169P + A170M + E245D) ' (S1 46A + M342 I) > (Q168A + L169P + A170L + M342I)、 （Q168A+L169P+A170M+M342I)、 （S146A+M342V)、 （Q168A+ L169P+A170L+M342V)、 （Q168A+L169P+A170M+M342V)、 （S146A+ M342P)、 （Q168A+L169P+A170L+M342P)、 （Q168A+L169P+A170M+ M342P)、 （S146A+M342A)、 （Q168A+L169P+A170L+M342A)、 （Q168A+ L169P+A170M+M342A)、 （D74V+S146A)、 （D74V+Q168A+L169P+ A170L)' (D74V + Q168A + L169P + A170M) > (Q168A + L169P + A1 70L + E24 5D + M342 I ) > (Q168A + L169P + A170M + E245D + M342 I) > (Q168A + L169P+A170L+E245D+M342V) ^ (Q168A+L169P+A170M+E245D+ M342V)、 （Q168A+L169P+A170L+E245D+M342A)、 （Q168A+L169P+ A170M+E245D+M342A)為特佳。 重組蛋白質可作成液狀（水溶液、懸浮液等）、粉末、冷 凍乾燥等各種形態。冷凍乾燥法並無特別限制可根據常法 進行。含有本發明酵素之組成物並非限於冷凍乾燥物，令 35 312/發明說明書(補件)/93-12/93127〇96 200525033 冷凍乾燥物以再溶解的溶液狀態亦可。又，進行葡萄糖測 定時，可採用葡萄糖分析套件，葡萄糖感測器等各種形式。 如此處理所得之經純化的重組蛋白質可根據如下方法予以 穩定化。 經由單獨或組合含有氯化鈣、醋酸鈣、檸檬酸鈣等之鈣 鹽、或麩胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、離胺酸等之胺基酸、 或α -酮基戊二酸、α -酮基葡萄糖酸、蘋果酸等之有機酸、 或血清白蛋白，則可令重組蛋白質更加穩定化。 令經純化的重組蛋白質與（1 )天冬醯胺、麩胺酸、α -酮 基戊二酸、蘋果酸、α -酮基葡萄糖酸、α -環糊精及其等 之鹽類所組成群中選出一種或二種以上之化合物及（2 )白 蛋白共存，則可使得重組蛋白質更加穩定化。 於冷束乾燥組成物中，P Q Q G D Η含量亦根據酵素之起源而 不同，通常為於約5〜5 0 % (重量比）之範圍中適於使用。若 換算成酵素活性，則於1 0 0〜2 0 0 0 U / m g之範圍中適於使用。 天冬醯胺、麩胺酸、α -酮基戊二酸、蘋果酸、及α -酮 基葡萄糖酸之鹽類可列舉鈉、鉀、銨、鈣、及鎂等之鹽類， 但並非特別限定。上述化合物和其鹽類及α -環糊精之添加 量以1〜9 0 % (重量比）之範圍為佳。此些物質可單獨使用， 且亦可組合數種。 所含有之緩衝液並無特別限定，可列舉 T r i s緩衝液、 磷酸緩衝液、硼酸緩衝液、G 0 0 D緩衝液等。該緩衝液之p Η 為於5 . 0〜9 . 0左右之範圍中根據使用目的而調整。冷凍乾 燥物中之緩衝劑的含量並無特別限定，較佳為 0 . 1 % (重量 36 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 比）以上、特佳為使用0 . 1〜3 0 % (重量比）之範圍。 可使用的白蛋白可列舉牛血清白蛋白（BSA)、蛋 白（0 V A )等。特別以B S A為佳。該白蛋白之含量較卷 8 0 % (重量比）、更佳為使用5〜7 0 % (重量比）之範圍 於組成物中，亦可再將其他穩定劑等在不會對 之反應造成特別不良影響的範圍中添加。本發明之 的配合法並無特別限制。可列舉例如於含有PQQGDΗ 液中配合穩定劑的方法、於含有穩定劑之緩衝液 PQQGDH的方法、或於緩衝液中同時配合PQQGDH和 的方法等。 又，即使添加鈣離子亦可取得穩定化效果。即， 含有鈣離子或鈣鹽，則可令重組蛋白質穩定化。鈣 示氣化鈣或醋酸鈣或檸檬酸妈等之無機酸或有機酸 等。又，於水性組成物中，飼離子之含量以1 X 1 0 _ 4〜 為佳。 含有鈣離子或鈣鹽所造成的穩定化效果，可經由 麩胺酸、麩胺醯胺及離胺酸所組成群中之胺基酸而 高。 麩胺酸、麩胺醯胺及離胺酸所組成群中之胺基酸 種或二種以上。於前述之水性組成物中，麵胺酸、 胺及離胺酸所組成群中選出之胺基酸的含量為 0.0 重量％為佳。 更且亦可含有血清白蛋白。於前述之水性組成物 血清白蛋白時，其含量以0.05〜0.5重量％為佳。 312/發明說明書(補件)/93· 12/93127096 白白蛋 :為1〜 〇 PQQGDH 穩定劑 之緩衝 中配合 穩定劑 經由使 鹽可例 的鈣鹽 1 xl 0_2M 使含有 更加提 可為一 麩胺醯 1-0.2 中添力口 37 200525033 緩衝劑可使用通常之物質，通常，組成物之ρ Η為5〜1 0 為佳。具體而言可使用T r i s - H C 1、石朋酸、G 0 0 D緩衝液，但 與鈣不會形成不溶性鹽的緩衝液皆可使用。 於前述之水性組成物中，視需要亦可添加其他成分，例 如界面活性劑、穩定劑、賦形劑等。 本發明為含有比野生型之吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去 氫酵素（P Q Q G D Η )對於雙醣類的作用性降低之重組 P Q Q G D Η 的葡萄糖分析套件。或者，含有該重組PQQGDH的葡萄糖感 測器。其次，含有該重組PQQGDH的葡萄糖測定方法。 於本發明中可根據下列各種方法測定葡萄糖。 葡萄糖分析套件 本發明為含有根據本發明之重組 PQQGDH的葡萄糖分析 套件為其特徵。本發明之葡萄糖分析套件為含有至少分析 一次之充分量的本發明之重組PQQGDH。典型上，套件為含 有本發明之重組 PQQGDH、加上分析所必要的緩衝液、媒 介、製作校正曲線用之葡萄糖標準溶液、及使用之指針。 根據本發明之重組PQQGDH為以各種形態，例如，以經冷凍 乾燥之試藥型式、或以適切保存溶液中之溶液型式提供。 較佳，本發明之重組PQQGDH為以全酶形態提供，但亦可以 脫輔基酶之形態提供，且於使用時予以全酶化。 葡萄糖感測器 本發明為以使用根據本發明之重組 P Q Q G D Η的葡萄糖感 測器為其特徵。電極可使用碳電極、金電極、鉑電極等， 於此電極上將本發明之酵素固定化。固定化方法有使用交 38 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 聯劑的方法、封入高分子間質中的方法，以透析膜覆 方法，光交聯性聚合物、導電性聚合物、氧化還原聚 等，或者與鐵素體或其衍生物所代表之電子媒介共同 於聚合物中或者於電極上吸附固定亦可，且亦可組 用。較佳為令本發明之重組PQQGDH以全酶之形態於電 固定，但亦可以脫輔基酶之形態固定化，令PQQ以其 型式或於溶液中提供。典型上，使用戊二醛將本發明 組PQQGDH於碳電極上固定後，以具有胺基之試藥處理 二醛予以封阻。 葡萄糖濃度之測定為如下進行。於恒溫槽中放入 液，並加入P Q Q及C a C ! 2、及媒介且維持於一定溫度。 可使用鐵氰化鉀、吩畊曱基硫酸鹽等。使用固定有本 之重組P Q Q G D Η的電極做為作用電極，並使用對極（例 電極）及參照電極（例如A g / A g C 1電極）。對碳電極外加 的電壓，且於電流變成恆定後，加入含有葡萄糖的試 且測定電流的增加。根據以標準濃度之葡萄糖溶液所 的校正曲線，則可計算試料中的葡萄糖濃度。 將吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫酵素使用於生物感 時，於此試片上，酵素為經由檢體的血液而溶解，但 與水和其他一般試藥所用之溶劑相比較，因黏度高且 性低，故於試片上添加的酵素量以蛋白質量愈少愈佳 若根據本案發明之方法，則可取得本案發明之吡咯 醌依存性葡萄糖去氫酵素之比活性為大於1的酵素， 取得1 . 1以上、更佳為1 . 5以上者。 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 蓋的 合物 固定 合使 極上 他層 之重 將戊 緩衝 媒介 發明 士σ ί白 一定 料並 製作 測器 血液 溶解 Ο 喹琳 較佳 39 200525033 若比活性高，則蛋白質的添加為少量即可，故本案發明 之葡萄糖感測器可令前述穩定劑等之添加量的上限限制減 低，可提高能確保更高穩定性的可能性。 (實施例） 以下，根據實施例更詳細說明本發明。 實施例1 : P Q Q依存性葡萄糖去氫酵素基因之表現質體的構 築 野生型P Q Q依存性葡萄糖去氫酵素之表現質體P N P G 5為 於載體 pBluescript SK(-)之多重選殖區插入來自鮑氏不 動桿菌N C I Μ B 1 1 5 1 7株之表現P Q Q依存性葡萄糖去氫酵素的 構造基因。其鹼基序列示於序列表之序列編號 2，由該鹼 基序列所推定之 PQQ依存性葡萄糖去氫酵素之胺基酸序 列示於序列表的序列編號1。 實施例2 :重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的製作 以含有野生型P Q Q依存性葡萄糖去氫酵素基因之重組 質體p N P G 5和序列編號3記載之合成寡核苷酸及其互補性 合成寡核苷酸為基礎，使用 QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE 製），並根 據其步驟進行重組處理操作。再定鹼基序列，取得表現序 列編號1記載之胺基酸序列第7 6個之麩胺醯胺以天冬醯胺 取代之重組 PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 (PNPG5M1 ) ° 以p N P G 5和序列編號4記載之合成寡核苷酸及其互補性 合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得表現序列編 40 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 號1記載之胺基酸序列第7 6個之麩胺醯胺以 重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 以p N P G 5和序列編號5記載之合成寡核苷 合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理，取 號1記載之胺基酸序列第7 6個之麩胺醯胺以 重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 以p N P G 5和序列編號6記載之合成寡核苷 合成募核苷酸為基礎，同上述方法處理，取 號1記載之胺基酸序列第7 6個之麩胺醯胺以 之重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的重組質 以p N P G 5和序列編號7記載之合成寡核苷 合成募核苷酸為基礎，同上述方法處理，取 號1記載之胺基酸序列第7 6個之麩胺醯胺以 重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 以p N P G 5和序列編號8記載之合成寡核苷 合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理，取 號1記載之胺基酸序列第7 6個之麩胺醯胺以 重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 以p N P G 5和序列編號9記載之合成寡核苷 合成募核苷酸為基礎，同上述方法處理，取 號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺 代之重組 PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素 (PNPG5M7) ° 以p N P G 5和序列編號1 0記載之合成寡核 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 麩胺酸取代之 (PNPG5M2) ° 酸及其互補性 得表現序列編 蘇胺酸取代之 (pNPG5M3)。 酸及其互補性 得表現序列編 曱硫胺酸取代 體（pNPG5M4)〇 酸及其互補性 得表現序列編 甘胺酸取代之 (PNPG5M5) ° 酸及其互補性 得表現序列編 離胺酸取代之 (pNPG5M6) ° 酸及其互補性 得表現序列編 以異白胺酸取 的重組質體 苷酸及其互補 41 200525033 性合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理， 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯 代之重組 P Q Q 依存性葡萄糖去氫酵素 (PNPG5M8) ° 以 p N P G 5和序列編號1 1記載之合成寡核 性合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理， 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麵胺醯 代之重組 PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素 (pNPG5M9) ° 以 p N P G 5和序列編號2 2記載之合成券核 性合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理， 編號1記載之胺基酸序列第2 0個之離胺酸以 重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 以p N P G 5和序列編號2 3記載之合成券核 性合成募核苷酸為基礎，同上述方法處理， 編號1記載之胺基酸序列第8 9個之離胺酸以 重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 質體和序列編號 2 4記載之合成寡核苷酸及 寡核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得表 記載之胺基酸序列第8 9個之離胺酸以麩胺 個之離胺酸以精胺酸取代之重組PQQ依存性 素的重組質體（p N P G 5 Μ 1 1 )。 以p N P G 5和序列編號2 5記載之合成寡核 性合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理， 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 取得表現序列 胺以纈胺酸取 的重組質體 苷酸及其互補 取得表現序列 胺以丙胺酸取 的重組質體 苷酸及其互補 取得表現序列 麩胺酸取代之 (PNPG5M1 0 ) ° 苷酸及其互補 取得表現序列 麩胺酸取代之 。更且，以此 其互補性合成 現序列編號 1 €取代、第3 0 0 葡萄糖去氫酵 苷酸及其互補 取得表現序列 42 200525033 編號1記載之胺基酸序列第2 4 6個之麩胺醯胺以組胺酸取 代之重組 PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 (pNPG5Ml 2) ° 以p N P G 5和序列編號2 6記載之合成寡核苷酸及其互補 性合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得表現序列 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺以絲胺酸取 代、第1 6 9個之白胺酸以絲胺酸取代之重組P Q Q依存性葡 萄糖去氫酵素的重組質體（p N P G 5 Μ 1 3 )。 以 p N P G 5和序列編號2 7記載之合成寡核苷酸及其互補 性合成募核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得表現序列 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺以丙胺酸取 代、第1 6 9個之白胺酸以精胺酸取代之重組P Q Q依存性葡 萄糖去氫酵素的重組質體（p N P G 5 Μ 1 4 )。 以p N P G 5和序列編號6 6記載之合成寡核苷酸及其互補 性合成募核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得表現序列 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺以絲胺酸取 代、第1 6 9個之白胺酸以麩胺酸取代之重組P Q Q依存性葡 萄糖去氫酵素的重組質體（p N P G 5 Μ 1 5 )。 以p N P G 5和序列編號6 7記載之合成寡核苷酸及其互補 性合成募核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得表現序列 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺以絲胺酸取 代、第1 6 9個之白胺酸以脯胺酸取代之重組P Q Q依存性葡 萄糖去氫酵素的重組質體（p N P G 5 Μ 1 6 )。 以p N P G 5和序列編號6 8記載之合成寡核苷酸及其互補 43 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 性合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得表現序列 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺以丙胺酸取 代、第1 6 9個之白胺酸以甘胺酸取代之重組P Q Q依存性葡 萄糠去氫酵素的重組質體（p N P G 5 Μ 1 7 )。 以 pNPG5 、 pNPG5Ml 、 pNPG5M2 、 pNPG5M3 、 pNPG5M4 、 PNPG5M5、pNPG5M6、pNPG5M7、pNPG5M8、pNPG5M9、pNPG5M10、 PNPG5M1 1 > pNPG5M12、pNPG5M13、pNPG5M14、pNPG5M15、 p N P G 5 M 1 6、p N P G 5 M 1 7之各重組質體轉型大腸桿菌勝任細胞 (E · c ο 1 i J Μ 1 0 9 ;東洋紡績製），分別取得該轉型體。 實施例3 :在假單胞菌屬細菌中可複製之表現載體的構築 將實施例2所得之重組質體p N P G 5 Μ 1之D N A 5微克以限制 酶BamHI及XHoI (東洋紡績製）切斷，單離出重組PQQ依存 性葡萄糖去氫酵素的結構基因部位。將所單離之DAN與以 BamHI及XHoI切斷之pTM33(l微克）以T4DNA連接酶1單 位於1 6 °C 、反應1 6小時，將D N A連結。經連結的D N A使 用大腸桿菌 D Η 5 α的勝任細胞進行轉型。將所得之表現質 體命名為PNPG6M1 。 對於 pNPG5、 pNPG5M2、 pNPG5M3、 pNPG5M4、 pNPG5M5、 pNPG5M6、pNPG5M7、pNPG5M8、pNPG5M9、pNPG5M10、pNPG5MH、 PNPG5M12、 pNPG5M13、 pNPG5Ml4 > pNPG5M15、 pNPG5M16、 p N P G 5 M 1 7之各重組質體亦以同上述方法處理取得表現質 體。將所得之表現質體分別命名為 pNPG6、pNPG6M2、 PNPG6M3、 pNPG6M4、 pNPG6M5、 pNPG6M6、 pNPG6M7、 pNPG6M8、 PNPG6M9、pNPG6M10、pNPG6Ml 1、pNPG6M12、pNPG6M13、 44 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 pNPG6M14、 pNPG6M15、 pNPG6M16、 pNPG6M17° 實施例4 :假單胞菌屬細菌之轉型體的製作 將惡臭假單胞菌T E 3 4 9 3 (微工研寄存1 2 2 9 8號）以L B G培 養基（L B培養基+ 0 · 3 %甘油）於3 0 °C培養1 6小時，且以離心 (12，000rpm、10分鐘）回收菌體。於此菌體加入冰冷之含 有3 0 0 m Μ蔗糖的5 m Μ K -磷酸緩衝液（p Η 7 . 0 ) 8毫升，令菌體 懸浮。再度以離心（1 2，0 0 0 r p m、1 〇分鐘）回收菌體，並於 此菌體加入冰冷之含有 3 0 0 m Μ蔗糖的 5 m Μ K -磷酸緩衝液 (ρ Η 7 . 0 ) 0 · 4毫升，令菌體懸浮。 於該懸浮液中加入 0 · 5微克實施例 3所得之表現質體 PNPG6M1，且以電穿孔法進行轉型。由含有1〇〇微克/毫升 鏈黴素之 L Β洋菜培養基上生長的菌落，取得目的之轉型 體。 對於 pNPG6 、 pNPG6M2 、 pNPG6M3 、 pNPG6M4 、 pNPG6M5 、 pNPG6M6、pNPG6M7、pNPG6M8、pNPG6M9、pNPG6M10、pNPG6Ml卜 pNPG6M12、 pNPG6M13、 pNPG6M14、 pNPG6M15、 pNPG6M16、 p N P G 6 M 1 7之各表現質體亦同上述方法處理，分別取得該轉 型體。 試驗例1 G D Η活性的測定方法（比活性測定以外使用） 測定原理 D -葡萄糖 + PMS + PQQGDH— D-葡萄糖基一 1,5 -内 S旨 +PMS(red) 2PMS(red)+NTB— 2PMS+二曱潛 以吩畊曱基硫酸鹽（P M S ) (r· e d )將硝基四唑藍（N T B )還原 45 312/發明說明書(補件)/93-〗2/93127096 200525033 所形成之二曱潛的存在，為於5 7 0 n m下以分光光度法測定。 單位之定義 1單位為指於下列記載之條件下每1分鐘形成0 . 5毫莫 耳二曱潛的PQQGDH酵素量。 (3 ) 方法 試藥 A . D -葡萄糖溶液：0 . 5 Μ ( 0 . 9 克 D -葡萄糖（分子量 180· 16)/1 0 毫升 Η2〇) Β. Ρ I P E S - N a 0 Η緩衝液，ρ Η 6 · 5 : 5 0 m Μ (於6 0毫升水中懸浮 1.51克PIPES(分子量302.36)於5NNa0H中溶解，並加入 2.2 毫升之 10% Triton X-100。使用 5N NaOH 於 25°C 下將 p Η調整至6 . 5 ± 0 . 0 5，加水作成1 0 0毫升） C. P M S溶液：3 . 0 m Μ ( 9 . 1 9毫克之吩畊曱基硫酸鹽（分子 量 817. 65)/10 毫升 Η2〇) D. ΝΤΒ 溶液：6.6mM(53.96 毫克之石肖基四°坐藍（分子量 81 7· 65)/1 0 毫升 H2〇) E. 酵素稀釋液：含有 ImM CaCl2、 0.1% Triton X-100、 0 · 1 % B S A 之 5 0 in Μ P I P E S - N a 0 Η 緩衝液（ρ Η 6 · 5 ) 步驟 於遮光瓶中調製以下之反應混合物，並於冰上貯藏（使用 時調製） 1 . 8毫升 D -葡萄糖溶液 （A ) 2 4 · 6 毫升 P I P E S - N a 0 Η 緩衝液（ρ Η 6 . 5 ) (Β) 2 . 0毫升 Ρ Μ S溶液 （C ) 46 312/發明說明劃補件)/93- ] 2/93127096 200525033 1 · 0毫升 Ν Τ Β溶液 （D ) [表1] 分析： 混合 物 中 之濃 度 PIPES 緩衝 液 4 2mM D -葡萄 糖 3 0 m Μ PMS 0 .20m Μ NTB 0 .22M m 將3 . 0毫升之反應混合液放入試管（塑膠製），並於3 7 °C 下預加溫5分鐘。 加入0 . 1毫升之酵素溶液，溫和反轉混合。 維持於 3 7 °C下以分光光度計 5 7 0 n m波長記錄相對於水 之吸光度的增力σ 4〜5分鐘，並由曲線之初期直線部分計算 每1分鐘的△ 0 D ( △ 0 D試驗值）。 同時，除了加入酵素稀釋液（Ε )代替酵素溶液以外，重 複相同方法，測定空白值（△ 0 D空白值）。 於分析前刻才以冰冷的酵素稀釋液（Ε )溶解酵素，並以 相同緩衝液稀釋成 0 . 1〜0 . 8 U / m 1 (因為該酵素之附著性故 以使用塑膠管為佳）。 計算 使用下式計算活性： U/m 1 = { Δ OD/m i η ( Δ 0D 試驗值 - AOD 空白值）xVtx df}/(20.lxl. OxVs)
U/mg=(U/nil )xl/C V t :總體積（3 · 1毫升） V s :樣品體積（1 · 0毫升） 47 312/發明說明書(補件)/93- ] 2/93127096 200525033 2 0 . 1 :二曱潛之1 / 2毫莫耳分子吸光係數 1 . 0 :光徑長（公分） d f :稀釋係數 C :溶液中之酵素濃度（c m g / m 1 ) 全酶型表現純化酵素的調製方法（本項為僅適用於實施例 1 〜1 4 ) 將500毫升之Terrificbroth分注入2公升容量的斜口 燒瓶，於1 2 1 °C ，進行2 0分鐘高麈滅菌處理，放冷後添加 另外無菌過濾的鏈黴素至其終濃度為1 0 0微克/毫升。於此 培養基中，接種預先以含有1 0 〇微克/毫升鏈徽素之Ργ培 養基於3 0 °C培養2 4小時之惡臭假單胞菌T E 3 4 9 3 ( p N P G 6 M 1 ) 的培養液5毫升，且於3 0 °C下通氣授拌培養4 0小時，培 養終了時之PQQ依存性葡萄糖去氫酵素活性為於前述活性 測定中，培養液每1毫升為約1 2 〇 ϋ / m 1 ° 將上述菌體以離心集菌，於2〇mM罐酸衝液（pH 7. 0)中懸 浮後，以超音波處理弄碎，再進行離心，取得上清液視為 粗製酵素液。所得之粗製酵素液以HiTrap-SP(Amersham P h a r m a c i a )離子交換管柱層析予以分離、純化。其次以 1 0 m Μ P I P E S - N a 0 Η緩衝液（p Η 6 · 5 )透析後添加氯化鈣至終濃 度為 ImM。最後以 HiTrap-PEAE(Aniersham - Pharmacia)離子 交換管柱層析予以分離、純化，取得純化酵素樣品。根據 本方法所得之樣品為於SDS-PAGE上顯示約為單一之帶。 對於以 pNPG6、 pNPG6M2、 pNPG6M3、 pNPG6M4' pNPG6M5 、 PNPG6M6、pNPG6M7、pNPG6M8、pNPG6M9、pNPG6Ml 0、 48 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 pNPG6Mll 、 pNPG6M12、 pNPG6M13、 pNPG6M14、 pNPG6M15、 p N P G 6 M 1 6、p N P G 6 M 1 7所造成之惡臭假單胞菌T E 3 4 9 3轉型 體亦同上述方法處理取得純化酵素樣品。 如此處理所取得之純化酵素使用性能之評價。 K m值之測定 根據上述之活性測定方法，測定PQQGDH的活性。對於葡 萄糖之 Km值的測定、為令上述活性測定方法之受質濃度變 化而實施。又，對於麥芽糖之Km值的測定為將上述活性測 定方法之葡萄糖溶液更換成麥芽糖溶液，與對於葡萄糖之 K m值測定同樣令受質濃度變化而實施。結果示於表2 A、表 2B、表6、表9及表14。 受質專一性（本項為僅適用於實施例1〜1 4 ) 根據上述之活性測定方法，測定PQQGDH的活性。測定以 葡萄糖做為受質溶液時的去氫酵素活性值和麥芽糖做為受 質溶液時的去氫酵素活性值，求出以葡萄糖做為受質時之 測定值視為1 0 0時的相對值。以麥芽糖做為受質溶液時之 去氫酵素活性時，調製0 . 5 Μ之麥芽糖溶液且使用於活性測 定。結果不於表2Α、表2Β、表4、表5、表6、表8、表9、 表11、表13及表14。 熱安定性之測定 各種 P Q Q G D Η 於酵素濃度 5 U / m 1、緩衝液（含有 1 πι Μ CaCl2、1/iM PQQ 之 10mM PIPES - NaOH(pH6.5)中保存，求 出於 5 8 °C下熱處理後的活性殘存率。結果示於表 2 A、表 2 B、表6、表9及表1 4。還有，進行熱處理之時間僅於表 49 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 2 B之試驗為3 0分鐘’其他試驗為2 0分鐘。 最適ρ Η之測定 於含有 0 · 2 2 % T r i t ο η - X 1 0 0之5 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 5 . 0 〜8.0)、含有 0.22% Triton-XlOO 之 50mM 8f 酸緩衝液 (ρΗ3·0 〜6.0)、含有 0.22% Triton-Χ100 之 50mM Ρ I PES-NaOH 緩衝液（ρ Η 6 · 0 〜7 · 0 )、含有 0.22% T r i t ο η - X 1 0 0 之 5 0 m Μ T r i s - H C 1 緩衝液（ρ Η 7 · 0 〜9 · 0 )中測 定酵素活性。結果示於圖1。又，顯示最高活性之pH示於 表2 A。於本表中，比活性為以酵素活性（U / m 1 )/ A 2 8 0 n m之 吸光度（ABS)表示。又，Km(Mal)為表示對於麥芽糖的 Km 值（mM)、Km(Glc)為表示對於葡萄糖的Km值（mM)。 [表2 ] A 變異 比活性 受質專一性 Km(Mal) Km(Glc) 最適pH 熱安定性 Q76N 49 6 6% 13.6 3 . 1 6 . 4 4 9. 1 % Q76E 36 68% 13.6 3 . 7 5.6 4 2.5% Q76T 32 8 4% 10.3 2. 5 6 . 4 4 9.0〇/〇 Q76M 1 08 8 1 % 8. 7 2.2 6. 4 5 5.3% Q76G 32 8 4% 10.6 2. 2 6.4 5 8. 5 % Q76K 84 3 2% 29.9 7. 9 6. 8 4 8.4% Q1 68 I 231 6 9$ 11.9 5 . 3 6 . 8 2 7. 3 °/〇 Q1 68V 377 7 1 °/〇 13 6 . 4 6.4 3 2.2% Q1 68A 333 3 7% 35.3 10.4 6.4 5 9. 2% 野生型 14 6 9 10 3% 4 . 1 6. 5 6. 4 4 6. 7% B 變異 比活性 受質專一性 熱安定性 K20E 924 10 5¾ 4 9. 7% Q76M 1 08 8 1 °/〇 5 2. 3 % Q76G 32 8 4% 5 5. 1 °/〇 K89E + K30 OR 1038 8 1 % 5 8. 8 % Q1 68A 333 3 7% 5 5.8% Q 2 4 6 H 686 1 9 2 % 8 2.2% Q1 68S + L1 69S 288 3 3% 7 3. 0 % Q1 68A + L1 69D 10 6 18% 7 8.8% Q1 68S + L169E 270 19% 4 7. 0 % Q1 68S + L1 69P 460 2 5% 4 7.2% Q1 68A + L1 69G 17 0 1 8% 7 8. 3 °/〇 野生型 1469 10 3% 4 3 . 4 °/〇 Q7 61(之葡萄糖定量性的確認 50 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 調整含有0 . 4 5 U / m 1之Q 7 6 1(的下述反應試藥。 50mM PIPES-NaOH 緩衝液（ρΗ6·5) 1 m M C a C 1 2
0. 2 2% Tr i ton-X 1 0 0 0.4mM PMS 0 . 2 6 m M W S T - 1 (水溶性四唑鹽、同仁化學研究所製） 根據下述所示之葡萄糖量的測定方法，測定做為試料之 純水、1 0 0 m g / d 1標準液及葡萄糖水溶液（6 0 0 m g / d 1 )的 1 0 個水準的稀釋系列，並確認直線性。 結果示於圖2。 葡萄糖量之測定方法 於試料量3微升中加入試藥3 0 0微升，且於添加試藥2 分鐘後求出1分鐘内的吸光度變化，並根據純水及葡萄糖 1 0 0 m g / d 1標準液的二點檢量線，求出試料中的葡萄糖量。 還有，測定裝置為使用曰立7 1 5 0型自動分析裝置，測定波 長為僅以主波長4 8 0 nm，且測定溫度為於37°C下實施。 由圖2可確認於0〜6 0 0 m g / d 1之範圍中有良好的直線性。 Q 7 6 K之麥芽糖作用性的確認 調製含有0 . 4 5 U / m 1之Q 7 6 K的下述反應試藥。 50mM PIPES-NaOH 緩衝液（ρΗ6· 5) 1 ηι M C a C 12
0. 2 2% Tri ton-Xl 00 0. 4mM PMS 0 · 2 6 ηι M W S T - 1 (同仁化學研究所製） 51 312/發明說明書(補件)/93-】2/93127096 200525033 於做為樣品之1 0 0 m g / d 1或3 0 0 m g / d 1之葡萄糖為基準液 且分別加入麥芽糖使之濃度各為0、120、240、360mg/dl。 根據上述葡萄糖量之測定方法，實施測定。 以不含有麥芽糖之1 0 0 m g / d 1葡萄糖溶液視為1 0 0，並將 基準液為1 0 0 m g / d 1葡萄糖之樣品測定值分別相對評價。同 樣，以不含有麥芽糖之3 0 0 in g / d 1葡萄糖溶液視為1 0 0，並 將基準液為 3 0 0 m g / d 1葡萄糖之樣品測定值分別相對評 價。結果示於圖3。 Q 7 6 E之麥芽糖作用性的確認 Q 7 6 K之麥芽糖作用性的確認同樣使用於Q 7 6 E並且評價 作用性。酵素為以0 . 2 4 U / m 1之濃度添加。結果示於圖4。 Q 1 6 8 V之麥芽糖作用性的確認 Q 7 6 K之麥芽糖作用性的確認同樣使用於Q 1 6 8 V並且評價 作用性。酵素為以0 . 3 5 U / m 1之濃度添加。結果示於圖5。 Q 1 6 8 A之麥芽糖作用性的確認 Q 7 6 K之麥芽糖作用性的確認同樣使用於Q 1 6 8 A並且評價 作用性。酵素為以0 . 6 U / m 1之濃度添加。結果示於圖6。 野生型酵素之麥芽糖作用性的確認 Q 7 6 K 之麥芽糖作用性的確認同樣使用於野生型酵素並 且評價作用性。酵素為以0 · 1 U / m 1之濃度添加。結果示於 圖7。 由圖3、圖4、圖5、圖6、圖7確認Q76K、Q76E、Q168V 及Q 1 6 8 A為比野生型酵素對於麥芽糖之作用性更為降低。 實施例5 :重組基因庫之構築和篩選 52 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 以表現質體p N P G 5做為模板，以P C R法於構造基因中之 167-169區域導入隨機變異。PCR反應為於表3所示組成之 溶液中，以9 8 °C 2分鐘、其次、以9 8 °C 2 0秒鐘、6 0 °C 3 0 秒鐘、及7 2 °C 4分鐘3 0個周期之條件下進行。 [表3 ] 試藥 液量 KOD Dash DNA 聚合酶（2.5U/微升） 1 . 0微升 模板DNA 1 . 0微升 正向引子（序列編號1 2中記載） 2. 5微升 反向引子（列列編號1 3中記載） 2. 5微升 1 0 X緩衝液 5. 0微升 2mM dNTPs 5. 0微升 H2O 3 3 . 0微升 將所得之重組基因庫以大腸桿菌 D Η 5 α轉型，並將所形 成之各菌落各別植菌於分注著1 8 0微升/孔穴LB培養基（含 有1 0 0微克/毫升之安比西林和2 6 # Μ之P Q Q)的微量滴定 盤，於3 7艺培養2 4小時。將培養液各5 0微升移至另一個 微量滴定盤，且以重複冷凍融解令培養菌體破碎後，進行 離心（2 0 0 0 r p m、1 0 分鐘），並回收上清液。將回收之上清 液於2牧微量滴定盤中各分注1 0微升。一微量滴定盤為用 作葡萄糖為受質之活性測定試藥並測定活性，另一為用作 麥芽糖為受質之活性測定試藥並測定活性，並且比較反應 性。取得許多對於麥芽糖之反應性變化的選殖體。 將對於麥芽糖之反應性有變化的選殖體以分注 5毫升 LB培養基（含有1 00微克/毫升之安比西林和26 // Μ之PQQ) 的試管培養，進行確認實驗時，取得許多對於麥芽糖之反 應性變化的選殖體。結果示於表4。 53 312/發明說明書(補件)/93· 12/93127096 200525033 [表4 ] 變異處 麥芽糖 作用性 變異處 麥芽糖 作用性 N167E+Q168G+L169T 64% N167S+Q168N+L169R 80% Q168G+L169T 42% N167G+Q168S+L169Y 55% N167L+Q168S+L169G 45% N167G+Q168S+L169S+L174F+K49N 39% Q168N+L169N+S189R 51% N167E+Q168G+L169A+S189G 58% N167G+Q168R+L169A 66% N167S+Q168G+L169A 48% N167G+Q168V+L169S 42% N167S+Q168V+L169S 71% N167T+Q168I+L169G 42% N167G+Q168W+L169N 72% N167G+Q168S+L169N 50% N167G+Q168S+L169V 36% Q168R+L169C 29% N167S+Q168L+L169G 41% Q168C+L169S 33°/〇 N167T+Q168N+L169K 68% N167G+Q168T+L169A+S207C 24¾ N167A+Q168A+L169P 63% N167G+Q168S+L169G 34% N167G+Q168G 46°/〇 N167G+Q168D+L169K 35% Q168P+L169G 23% N167G+Q168N+L169S 59¾ Q168S+L169G 22% N188I+T349S 64°/〇 N167G+Q168G+L169A+F215Y 32% N167G+Q168T+L169G 28% Q168G+L169V 43% N167G+Q168V+L169T 43% N167E+Q168N+L169A 52% Q168R+L169A 72°/〇 N167G+Q168R 23% N167G+Q168T 69% N167G+Q168T+L169Q 72% Q168I+L169G+K300丁 24% N167G+Q168A 33% N167T+Q168L+L169K 63% N167M+Q168Y+L169G 60% N167E+Q168S 32% N167G+Q168T+L169V+S189G 42% N167G+Q168G+L169C 37% N167G+Q168K+L169D 41% Q168A+L169D 16% Q168S+E245D 29% Q168S+L169S 26% A351T 74% N167S+Q168S+L169S 51% Q168I+L169Q 51% N167A+Q168S+L169S 40% Q168A 35% Q168S+L169P 20% Q168A+L169G 16% Q168S+L169E 15% 同樣處理亦於 6 7 - 6 9 區域（使用正向引子：序列編號 1 4 中記載、反向引子：序列編號1 5中記載）、1 2 9 - 1 3 1區域（使 用正向引子：序列編號1 6中記載、反向引子：序列編號17 中記載）、3 4 1 - 3 4 3區域（使用正向引子：序列編號1 8中記 載、反向引子：序列編號 19中記載）中導入變異。又，於 4 2 8與4 2 9 (使用正向引子.·序列編號2 0中記載、反向引子： 序列編號2 1中記載）之間嘗試插入。結果示於表5。 [表5] 54 312/發明說明書(補件)/93_ 12/93】27096 200525033 67-69區域 變異處 麥芽糖 作用性 變異處 麥芽糖 作用性 P67K+E68K 79% P67R+E68R+I69C 80% P67D+E68T+I69C 60% 129-131 區域 變異處 麥芽糖 作用性 變異處 麥芽糖 作用性 E129R+K130G+P131G 73% E129Q+K130T+P131R 80% E129N+P131T 67% E129A+K130R+P131K 70% 341-343 區域 變異處 麥芽糖 作用性 變異處 麥芽糖 作用性 E341L+M342P+A343R 80% E341S+M342I 80% A343I 45% E341P+M342V+A343C 50¾ E341P+M342V+A343R 76¾ E341L+M342R+A343N 51% 428與429之 間插入 插入胺基酸 麥芽糖 作用性 插入胺基酸 麥芽糖 作用性 L 73% A 71% K 79% 其中，選取對於麥芽糖之作用性大為降低的重組體 (Q168S+E245D、 Q168A+L169D、 Q168S+L169S、 Q168S+L169E、 Q168A + L169G、Q168S + L169P)，並由此些重組體中萃取質 體，且根據實施例3及實施例4記載之方法轉型假單胞菌 並表現全酶型酵素，取得純化酵素並評估特性。結果示於 表6。於表6中，比活性為以酵素活性（U / m 1 )/ A 2 8 0 n m之吸 光度表示。 [表6 ] 變異 比活性 受質專一性 Km(Mal ) K m ( G 1 c ) 熱穩定性 Q168S+E245D 7 14 2 9% 24. 3 14.4 5 5. 5 % Q1 68A + L1 69D 10 6 1 8% 65.9 20.8 8 9. 4 % Q168S + L1 69S 288 3 3% 55.1 14.4 8 3. 9 % Q1 68S + L1 69P 460 2 5% 87.1 24. 1 7 6. 3 °/〇 Q1 68A + L1 69G 1 70 18% 60.4 18.6 8 9. 5 % Q1 68S + L1 69E 270 1 9% 70.7 8. 9 6 3.3% Q1 68A 3 13 4 3% 6 4.4% 野生型 1469 110% 5 9. 8 % 實施例6 : Q 1 6 8部位之變異對於受質專一性的影響 根據實施例5記載之方法，變製出Q 1 6 8 C、Q 1 6 8 D、Q 1 6 8 E、 Q168F、 Q168G、 Q168H、 Q168K、 Q168L、 Q168M、 Q168N、 Q168P、 55 312/發明說明書(補件)/93-12/93 ] 27096 200525033 Q168R、 Q168S、 Q168T、 Q168W、 Q168Y 之各重組體。變製 各重組體所使用之引子示於表 7。又，使用所變製出的各 重組體，比較其等於試管培養後再製成之菌體破碎液對於 麥芽糖之反應性的結果示於表 8。更且，由各重組體中萃 取質體，根據實施例3及實施例4記載之方法轉型假單胞 菌並表現全酶型酵素，取得純化酵素並評估特性。結果示 於表 9。於表 9 中，比活性為以酵素活性（U / m 1 ) / A 2 8 0 n m 之吸光度表示。 [表7] 變異處 正丨 句』 3丨子 反丨 向1 引子 Q1 68C 序 列 編 號 22 序 列 編 號 23 Q1 68D 序 列 編 號 22 序 列 編 號 24 Q1 68E 序 列 編 號 22 序 列 編 號 25 Q1 68F 序 列 編 號 22 序 列 編 號 26 Q1 68G 序 列 編 號 22 序 列 編 號 27 Q1 68H 序 列 編 號 22 序 列 編 號 28 Q1 68K 序 列 編 號 22 序 列 編 號 29 Q1 68L 序 列 編 號 22 序 列 編 號 30 Q1 69M 序 列 編 號 22 序 列 編 號 3 1 Q1 68N 序 列 編 號 22 序 列 編 號 32 Q1 68P 序 列 編 號 22 序 列 編 號 33 Q1 68R 序 列 編 號 22 序 列 編 號 34 Q1 68S 序 列 編 號 22 序 列 編 號 35 Q1 68 丁 序 列 編 號 22 序 列 編 號 36 Q1 68W 序 列 編 號 22 序 列 編 號 37 Q1 68Y 序 列 編 號 22 序 列 編 號 38 [表8 ] 變異處 麥芽糖作用性 變異處 麥芽糖作用性 Q1 68C 5 4% Q1 69M 6 4% Q1 68D 2 9% Q1 68N 82% Q1 68E 3 6% Q1 68P 1 0 3 % Q1 68F 43% Q1 68R 3 6% Q1 68G 4 6% Q1 68S 6 0% Q1 68H 5 5% Q1 68T 9 4% Q1 68K 8 3% Q1 68W 8 7% Q1 68L 9 2% Q1 68Y 9 3% 野生型 10 4% 56 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 [表9 ] 變異 比活性 受質專一性 Km丨 (Mai) Km ( G 1 c ) 熱穩 定性 Q1 68C 5 5 5 8% 2 0 · 4 10.7 18. 2% Q1 68D 10 2 4 6% 2 7. 4 — 6 1. 4°/〇 Q1 68E 110 5 1 % 4. 7 8 . 6 75. 4°/〇 Q1 68F 1 37 5 2% 3 6. 4 10.3 55. 5% Q1 68G 667 7 8°/〇 1 1 . 1 — 78. 7°/〇 Q1 68H 486 5 8% 1 0· 2 5.4 76 . 0°/〇 Q 1 68K 5 8 0% 9.6 2 . 2 — Q1 68L 110 9 6% 8.6 4 . 3 37. 1 % Q 1 6 9M 19 0 6 8% 2 2. 7 5.3 78. 4% Q1 68N 68 93% 3.6 4.1 — Q1 68P 1 28 1 0 6 % 3. 5 5 . 1 8 2. 3% Q1 68R 5 7 6 0% 1 8. 4 3 . 8 32. 9% Q1 68S 483 8 1% 1 2. 5 3 . 7 80. 1 % Q1 68T 11 1 0 3 % 1 5. 0 6.9 — Q1 68W 287 9 6% 5. 3 3 . 2 5 9. 2% Q1 68Y 2 9 7 9 9% 1 2. 1 6 . 9 10 0 .0% 野生型 1285 10 6% 3. 8 6 . 3 52. 2% 實施例7 : L 1 6 9部位之變異對於受質專一性的影響 根據實施例2記載之方法，變製出L 1 6 9 A、L 1 6 9 V、L 1 6 9 Η、 L169Y、 L169K、 L169D、 L169S、 L169N、 L169G、 L169C 之 各重組體。變製各重組體所使用之引子示於表1 0。又，使 用所變製出的各重組體，比較其等於試管培養後再製成之 菌體破碎液對於麥芽糖之反應性的結果示於表1 1。 [表 1 0 ] 變異處 正1 句； 5丨子 反 向 引 子 LI 69A 序 列 編 號 39 序 列 編 號 39 互 補 性 合 成 寡 核 苷 酸 L1 69 V 序 列 編 號 40 序 列 編 號 40 互 補 性 合 成 寡 核 苷 酸 LI 69Y 序 列 編 號 4 1 序 列 編 號 41 互 補 性 合 成 寡 核 苷 酸 LI 69H 序 列 編 號 42 序 列 編 號 42 互 補 性 合 成 寡 核 苷 酸 LI 69K 序 列 編 號 43 序 列 編 號 43 互 補 性 合 成 寡 核 苷 酸 LI 69D 序 列 編 號 44 序 列 編 號 44 互 補 性 合 成 寡 核 苷 酸 LI 69S 序 列 編 號 45 序 列 編 號 45 互 補 性 合 成 募 核 苷 酸 LI 69N 序 列 編 號 46 序 列 編 號 46 互 補 性 合 成 寡 核 苷 酸 LI 69G 序 列 編 號 47 序 列 編 號 47 互 補 性 合 成 寡 核 苷 酸 LI 69C 序 列 編 號 48 序 列 編 號 48 互 補 性 合 成 寡 核 苷 酸 57 3】2/發明說明書(補件)/93-12/93 ] 27096 200525033 [表 1 1 ] 變異處 麥芽糖作用性 變異處 麥芽糖作用性 LI 69A 5 9% LI 69D 3 8% LI 69V 7 8% LI 69S 5 7% LI 69Y 1 0 7 % LI 69N 7 4% LI 69H 8 5% LI 69G 4 8% LI 69K 6 0% LI 69C 5 7% 野生型 9 7% 實施例8 : Q 1 6 8 A重組體相對於L 1 6 9部位變異 質專一性的影響 根據實施例 5 記載之方法，變製出 ς Q168A+L169C、 Q168A+L169E、 Q168A+L169F、 Q168A+L169I、 Q168A+L169K、 Q168A+L169M、 Q168A+L169P、 Q168A+L169Q、 Q168A+L169R、 Q168A + L169T、Q168A + L169V、Q1 68A + L169W 之各重組體。變製各重組體所使用之引子示 使用所變製出的各重組體，比較其等於試管 菌體破碎液對於麥芽糖之反應性的結果示於 由各重組體中萃取質體，根據實施例3及實 方法轉型假單胞菌並表現全酶型酵素，取得 估特性。結果示於表 1 4。於表1 4中，比活 性（U/ml)/A280nm之吸光度表示。 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 之組合對於受 丨168A + L1 69A、 Q168A+L169H 、 Q168A + L1 69N、 Q168A+L169S 、 、Q1 68A + L1 69Y 於表1 2。又， 培養後再製之 表1 3。更且， 施例4記載之 純化酵素並評 性為以酵素活 58 200525033 [表 1 2 ] 變異處 正 向 引 子 反 向 引 子 Q1 68A + L1 69A 序 列 編 號 12 序 列 編 號 49 Q1 68A + L1 69C 序 列 編 號 12 序 列 編 號 50 Q1 68A + L1 69E 序 列 編 號 12 序 列 編 號 5 1 Q1 68A + L1 69F 序 列 編 號 12 序 列 編 號 52 Q1 68A + L169H 序 列 編 號 12 序 列 編 號 53 Q1 68A + L1 69 I 序 列 編 號 12 序 列 編 號 54 Q1 68A + L1 69K 序 列 編 號 12 序 列 編 號 55 Q1 68A + L1 69M 序 列 編 號 12 序 列 編 號 56 Q1 68A + L1 69N 序 列 編 號 12 序 列 編 號 57 Q1 68A + L1 69P 序 列 編 號 12 序 列 編 號 58 Q1 68A + L1 69Q 序 列 編 號 12 序 列 編 號 59 Q1 68A + L1 69R 序 列 編 號 12 序 列 編 號 60 Q1 68A + L169S 序 列 編 號 12 序 列 編 號 6 1 Q1 68A + L1 69T 序 列 編 號 12 序 列 編 號 62 Q1 68A + L1 69V 序 列 編 號 12 序 列 編 號 63 Q1 68A + L1 69W 序 列 編 號 12 序 列 編 號 64 Q1 68A + L1 69Y 序 列 編 號 12 序 列 編 號 65
[表 13] 變異處 麥芽糖作用性 變異處 麥芽糖作用性 Q168A+L169A 1 9% Q168A + L1 69P 24% Q1 68A + L1 69C 7% Q168A+L169Q 4 2% Q1 68A + L1 69E 1 7% Q168A + L1 69R 4 2% Q1 68A + L1 69F 2 2% Q168A+L169S 14% Q1 68A + L1 69H 2 1% Q168A+L169T 2 4% Q1 68A + L169I 4 3% Q168A + L1 69V 3 4% Q168A+L169K 2 1% Q168A + L1 69W 3 3% Q168A + L1 69M 2 2% Q168A+L169Y 3 7% Q168A+L169N 1 9% 野生型 1 0 4 %
312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 59 200525033 [表 14] 變異 比活性 受質專一性 Km ( Ma1 ) Km(Glc) 熱穩定性 Q1 68A + L1 69A 1 54 1 9% 1 26 33. 0 8 6. 2 % Q1 68A + L1 69C 63 1 3% 10 3 35.6 10 0. 0 % Q 1 6 8A + L1 6 9E 90 19% 8. 6 20.4 10 0. 0 % Q1 68A + L1 69F 1 38 2 7% 44.7 10.4 8 0. 4 °/〇 Q1 68A + L1 69H 70 2 7% 99.2 15.5 10 0. 0 °/〇 Q1 68A + L1 69 I 43 5 3% 12.5 6.0 2 8. 7 % Q1 68A + L1 69K 1 29 2 0% 20.4 2 6.7 10 0. 0 °/〇 Q1 68A + L1 69M 80 2 3% 52.3 15.6 — Q1 68A + L1 69N 1 67 2 2% 59.1 34.5 8 3.5% Q1 68A + L1 69P 377 2 4% 58.0 13.9 7 9. 9 °/〇 Q1 68A + L1 69Q 117 4 9% 156.9 5.4 10 0. 0 °/〇 Q1 68A + Ll 69R 32 4 5% 59.0 9. 6 10 0. 0 °/〇 Q1 68A + L1 69S 42 2 4% 15.6 2 1.0 — Q1 68A + L169T 98 2 3% 33.5 15.2 8 3.7% Q1 68A + L1 69V 4 1 2 7% 49.1 24.7 4 0.4% Q1 68A + L1 69W 9 1 3 8% 63.3 10.8 4 9. 4 % Q1 68A + L1 69Y 3 1 5 2% 13.6 11.6 7 4. 3 % 野生型 1285 10 6% 3. 8 6. 3 5 2.2% 實施例9 : A 1 7 0部位之變異對於受質專一性的影響 根據實施例2記載之方法，變製出A 1 7 0 C、A 1 7 0 D、A 1 7 0 E、 A170F、 A170G、 A170H、 A170K、 A170L、 A170M、 A170N、 A170P、 A170R、 A170S、 A170T、 A170W、 A170Y、 A170V、 A170I、 A170Q 之各重組體。變製各重組體所使用之正向引子為序列編號 6 9記載之合成寡核苷酸。反向引子為與序列編號6 9互補 的合成募核苷酸。篩選所變製的重組基因庫，取得目的之 重組體。比較其等於試管培養後再製成之菌體破碎液對於 麥芽糖之反應性的結果示於表1 5。 60 312/發明說明書(補件)/93-12/931270% 200525033 [表 15] 變異處 麥芽糖作用性 變異處 麥芽糖作用性 A1 70G 98% A1 70K 87% A1 70V 9 1 % A1 70R 10 8% A1 70L 8 6% A1 70C 9 2% A1 70 I 8 5% A1 70M 9 0% A1 70S 10 0% A1 70F 8 2% A1 70T 9 2% A1 70Y 8 8% A1 70D 10 2% A1 70W 79¾ A1 70E 10 3% A1 70H 9 8% A1 70N 1 0 0 % A1 70P 2 8% A1 70Q 9 9% 野生型 9 8% 實施例1 0 .· E 2 4 5部位之變異對於受質專一性的影響 根據實施例2記載之方法，變製出E 2 4 5 C、E 2 4 5 D、 E245F、 E245G、 E245H、 E245K、 E245L、 E245M、 E245N、
E245R、 E245S、 E245T、 E245W、 E245Y、 E245V、 E245I 之各重組體。變製各重組體所使用之正向引子為序 E245A、 E 2 4 5 P、 、E245Q 列編號 70互補 目的之 液對於 [表 16] 7 0記載之合成寡核苷酸、反向引子為與序列編號 的合成募核苷酸。篩選所變製的重組基因庫，取得 重組體。比較其等於試管培養後再製成之菌體破碎 麥芽糖之反應性的結果示於表1 6。 變異4 麥芽糖作用性 變異處 麥芽糖作用性 E 2 4 5 A 9 9% E2 4 5 Q 7 2% E 2 4 5 D 4 9% E2 4 5 S 9 8% E 2 4 5 F 6 4% E2 4 5 T 8 9% E 2 4 5 H 5 4% E2 4 5 V 85% E 2 4 5 I 114% E 2 4 5 W 9 2% E 2 4 5 K 活性消失 E2 4 5Y 活性消失 E 2 4 5 L 活性消失 E 2 4 5 R 9 4% E 2 4 5 M 6 9% E 2 4 5 G 9 2% E 2 4 5 N 5 9% E 2 4 5 C 7 5% E 2 4 5 P 活性消失 野生型 9 9% 實施例1 1 : N 2 4 9部位之變異對受質專一性的影響 根據實施例2記載之方法，變製出N 2 4 9 C、N 2 4 9 D、 N249A、 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 61 200525033 N249F' N249G、 N249H、 N249K、 N249L、 N249M、 N249E、 N249P、 N249R、 N249S、 N249T、 N249W、 N249V、 N249I 、 N249Q 之 各重組體。變製各重組體所使用之正向引子為序列編號7 1 記載之合成寡核苷酸、反向引子為與序列編號7 1互補的合 成募核苷酸。篩選所變製的重組基因庫，取得目的之重組 體。比較其等於試管培養後再製成之菌體破碎液對於麥芽 糖之反應性的結果示於表1 7。 [表 17] 變異處 麥芽糖作用性 變異處 麥芽糖作用性 N 2 4 9 G 8 2% N 2 4 9 K 18 4% N 2 4 9 A 7 7% N 2 4 9 R 1 9 1 % N 2 4 9 V 15 7% N 2 4 9 C 10 7% N 2 4 9 L 9 4% N 2 4 9 M 17 0% N 2 4 9 I 13 7% N 2 4 9 F 活性消失 N 2 4 9 S 活性消失 N 2 4 9 W 活性消失 N 2 4 9 T 活性消失 N 2 4 9 H 3 4 3% N 2 4 9 D 活性消失 N 2 4 9 P 活性消失 N 2 4 9 E 8 6% 野生型 10 6% N 2 4 9 Q 7 9% 實施例1 2 : E 2 4 5 D變異之組合對於受質專一性的影響 根據實施例 2 記載之方法，變製出 (Q168A+L169G+E245D) 、 （Q168A+L169P+E245D)之各重組 體。變製各重組體所使用之正向引子為序列編號7 2記載之 合成寡核苷酸、反向引子為與序列編號7 2互補的合成寡核 苷酸。又，模板D N A為使用實施例8所取得之（Q 1 6 8 A + L 1 6 9 G ) 或（Q 1 6 8 A + L 1 6 9 P )的質體。比較其等變製出之重組體在試管 培養後再製成之菌體破碎液對於麥芽糖之反應性的結果示 於表1 8。 62 312/發明說明書(補件)/93-】2/93127096 200525033 [表 1 8 ] 變異 比活性 受質專 一性 Km(Mal) Km(Glc) 熱穩定性 Q168A+L169G+E245D 1 38 1 1 °/〇 2 2 8.8 59.5 97.2 Q168A+L169P+E245D 382 15% 12 6.8 4 1.6 86.2 野生型 12 8 5 10 7% 3 . 8 6 . 3 4 9. 6 % 實施例1 3 : T 3 4.9部位之變異對於受質專一性的影響 根據實施例2記載之方法，變製出Τ 3 4 9 S、Τ 3 4 9 Ρ、Τ 3 4 9 Υ 之各變異體。變製各重組體所使用之正向引子為序列編號 7 3記載之合成寡核苷酸、反向引子為與序列編號7 3互補 的合成募核苷酸。篩選所變製的重組基因庫，取得目的之 重組體。比較其等於試管培養後再製成之菌體破碎液對於 麥芽糖之反應性的結果示於表1 9。 [表 1 9 ] 變異處 麥芽糖作用性 變異處 麥芽糖作用性 T 3 4 9 S 4 9% T 3 4 9 Y 90% T 3 4 9 P 3 2% 實施例1 4 : Ν 4 2 9部位之變異對於受質專一性的影響 根據實施例2記載之方法，變製出Ν 4 2 9 F、Ν 4 2 9 Ρ、Ν 4 2 9 L、 Ν 4 2 9 Υ之各重組體。變製各重組體所使用之正向引子為序 列編號 7 4記載之合成寡核苷酸、反向引子為與序列編號 7 4互補的合成寡核苷酸。篩選所變製的重組基因庫，取得 目的之重組體。比較其等於試管培養後再製成之菌體破碎 液對於麥芽糖之反應性的結果示於表2 0。 63 312/發明說明書(補件)/93- ] 2/93127096 200525033 [表 20 ] 變異處 麥芽糖作用性 變異處 麥芽糖作用性 N 4 2 9 F 6 9% N 4 2 9 L 9 7% N 4 2 9 P 4 4% N 4 2 9 Y 6 8% 實施例1 0 1 : P Q Q依存性葡萄糖去氫酵素基因之表現質體的 構築 同實施例1記載的方法。 實施例1 0 2 :重組P Q Q依存性葡萄糖去氫酵素之製作 以含有野生型PQQ依存性葡萄糖去氫酵素基因之重組質 體p N P G 5和序列編號7 5記載之合成寡核苷酸及其互補性合 成寡核苷酸為基礎，使用QuickChange TM Site- Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製），並根據其步驟進行重 組處理操作，再定鹼基序列，取得表現序列編號1記載之 胺基酸序列第 74個之天冬醯胺以纈胺酸取代之重組 PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體（p N P G 5 _ 7 4 V )。 以p N P G 5和序列編號7 6記載之合成寡核苷酸及其互補 性合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得表現序列 編號1記載之胺基酸序列第3 4 2個之曱硫胺酸以異白胺酸 取代之重組 PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 (pNPG 5 - 3 4 2 I ) ° 其他同上述，使用設計成欲取代目的胺基酸部位之合成 募核苷酸及其互補性合成寡核苷酸，取得表現序列編號 1 記載之胺基酸序列第3 4 2個之曱硫胺酸以纈胺酸取代之重 組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體（PNPG 5 - 3 4 2 V)、 表現以脯胺酸取代之重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的重 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 64 200525033 組質體（p N P G 5 - 3 4 2 P )、表現以丙胺酸取代之重組p Q Q依存 性葡萄糖去氫酵素的重組質體（p N P G 5 - 3 4 2 A )。又，取得表 現第1 4 6個之絲胺酸以丙胺酸取代之重組P Q Q依存性葡萄 糖去氫酵素的重組質體（pNPG5-146A)、表現第170個之丙 胺酸以白胺酸取代之重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的重 組質體（p N P G 5 - 1 7 0 L )、表現第1 7 0個之丙胺酸以曱硫胺酸 取代之重組 PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 (PNPG5-170M)、表現第170個之丙胺酸以異白胺酸取代之 重組 PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 (PNPG5-170I)、表現第170個之丙胺酸以苯基丙胺酸取代 之重組 PQQ 依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 (p N P G 5 - 1 7 0 F )。各個合成寡核苷酸記載於序列編號 7 7〜 84 ° 以 pNPG5、 pNPG5-74V、pNPG 5 - 3 4 2 I、pNPG5-342V、 pNPG5-342P 、 pNPG5-342A 、 pNPG5-l46A 、 pNPG5-170L 、 pNPG5-170M、 pNPG5-170I 、 pNPG5-170F 之各重組質體轉 型大腸桿菌勝任細胞（E . c ο 1 i J Μ 1 0 9 ;東洋紡績製），分別 取得該轉型體。 實施例 1 0 3 :在假單胞菌屬細菌中可複製之表現載體的構 築 將實施例1 0 2所得之重組質體p N P G 5 - 7 4 V之D N A 5微克以 限制酶B a m Η I及X Η ο I (東洋紡績製）切斷，單離出重組P Q Q 依存性葡萄糖去氫酵素的結構基因部位。將所單離之 DAN 與以BamHI及XHoI切斷之pTM33(l微克）以T4DNA連接酶 65 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 1單位於1 6 °C、反應1 6小時，將D N A連結。經連結的D N A 使用大腸桿菌 D Η 5 α的勝任細胞進行轉型。將所得之表現 質體命名為PNPG6-74V。 對於 pNPG5 、 pNPG5-3421 、 pNPG5-342V 、 pNPG5-342P 、 pNPG5-342A 、 pNPG5-146A 、 pNPG5-170L 、 pNPG5-170M 、 pNPG5-170I、pNPG5-170F之各重組質體亦同上述方法處理 取得表現質體。所得之表現質體分別命名為pNPG 6、 pNPG6-342I 、 pNPG6-342V 、 pNPG6-342P 、 pNPG6-342A 、 pNPG6 - 146A 、 pNPG6-170L 、 pNPG6-170M 、 pNPG6-170I 、 PNPG6-170F ° 實施例1 0 4 :假單細胞菌屬細菌之轉型體的製作 將惡臭假單胞菌TE3 4 9 3 C微工研寄存1 2 2 9 8號）以LBG培 養基（L B培養基+ 0 . 3 %甘油）於3 0 °C培養1 6小時，且以離心 (12，000rpm、10分鐘）回收菌體。於此菌體加入冰冷之含 有300mM蔗糖的5mMK-磷酸緩衝液（pH7.0)8毫升，令菌體 懸浮。再度以離心（1 2，0 0 0 r p m、1 0分鐘）回收菌體，並於 此菌體加入冰冷之含有 3 0 0 m Μ蔗糖的 5 m Μ K -磷酸緩衝液 (ρ Η 7 . 0 ) 0 . 4毫升，令菌體懸浮。 於該懸浮液中加入0 . 5微克實施例1 〇 3所得之表現質體 pNPG6 - 74V，且以電穿孔法進行轉型。由含有100微克/毫 升鏈黴素之LB洋菜培養基上生長的菌落，取得目的之轉型 體。 對於 pNPG6 > pNPG6-342I 、 pNPG6-342V 、 pNPG6-342P 、 pNPG 6 - 3 4 2A、pNPG6-146A、pNPG6-170L、pNPG6-170M、 66 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 PNPG6-170I、pNPG6-170F之各表現質體亦同上述方法處 理，分別取得該轉型體。 實施例1 0 5 :全酶型表現純化酵素的調製方法（本項為僅適 用於實施例1 0 1〜1 0 6 ) 將500毫升之Terrificbroth分/主入2公升谷里的斜口 燒瓶，於1 2 1 °C ，進行2 0分鐘高麇滅菌處理’放冷後添加 另外無菌過濾的鏈黴素至其終濃度為1 0 0微克/毫升。於此 培養基中，接種預先以含有1 0 〇微克/毫升鏈徽素之PY培 養基於 30 °C培養 24小時之惡臭假單胞菌 TE3493(pNPG6-74V)的培養液5毫升’且於30°c下通氣攪 拌培養4 0小時，培養終了時之P Q Q依存性葡萄糖去氫酵素 活性為於前述活性測定中，培養液每1毫升為約3 0 u /m 1。 將上述菌體以離心集菌，於2 〇 m Μ磷酸緩衝液（p Η 7 · 0 )中 懸浮後，以超音波處理弄碎，再進行離心，取得上清液視 為粗製酵素液。所得之粗製酵素液以Η 1 T r a Ρ — S P ( A m e r s h a m - P h a r m a c i a )離子交換管柱層析予以分離、純化。其次以 1 0 m Μ P I P E S - N a 0 Η緩衝液（p Η 6 · 5 )透析後添加氣化鈣至終濃 度為 ImM。最後以 HiTrap-DEAE(Amersham-Pharmacia)離子 交換管柱層析予以分離、純化，取得純化酵素樣品。根據 本方法所得之樣品為於SDS-PAGE上顯示約為單一之帶。 對於以 pNPG6、 pNPG6_342I、 pNPG6-342V、 pNPG6-342P 、 pNPG6-342A 、 pNPG6-146A 、 pNPG6-170L 、 pNPG6-l70M 、 p N P G 6 - 1 7 0 I、p N P G 6 - 1 7 0 F所造成之惡臭假單胞菌T E 3 4 9 3 轉型體亦同上述方法處理取得純化酵素樣品。 67 312/發明說明書(補件)/93-12/931270% 200525033 使用如此處理所得之純化酵素評估性能。 受質專一性（本項為僅適用於實施例1 〇 1〜1 〇 6 ) 根據上述之活性測定方法，測定PQQGDH的活性。測定以 葡萄糖做為受質溶液時的去氫酵素活性值和麥芽糖做為受 質溶液時的去氫酵素活性值，求出以葡萄糖做為受質時之 測定值視為1 0 0時的相對值。以麥芽糖做為受質溶液時之 去氫酵素活性時’調製0 · 5 Μ之麥芽糖溶液且使用於活性測 定。結果示於表1 0 2。 野生型PQQGDH中，葡萄糖與麥芽糖之反應性為大約相 等，相對地，本案發明之重組PQQGDH為麥芽糖的反應性降 低0 [表 1 02 ] 胺基酸取代部位 麥芽糖作用性 M 3 4 2 I 79 M 3 4 2 V 74 M 3 4 2 P 80 M 3 4 2 A 83 D74V 90 SI 46A 90 A1 70L 77 A1 70M 76 A1 70 I 74 A1 70F 65 野生型 1 00 實施例1 0 6 :多重重組體之作成和受質專一性 以 pNPG5、 pNPG5-74V、 pNPG5~342I > pNPG5-342V、 pNPG5-342P 、 pNPG5-342A、 pNPG5-146A、 pNPG5-170L、 PNPG5-170M、 pNPG5-1701、 pNPG5-170F 之各質體做為模 板，分別使用序列編號8 0記載之合成募核苷酸及其互補性 合成募核苷酸、設計成第1 6 8個之麩胺醯胺以丙胺酸取代 68 312/發明說明書(補件)/93-12/93127〇% 200525033 且第1 6 9個之白胺酸以脯胺酸取代且第1 7 0個之丙胺酸以 白胺酸取代之序列編號 8 5記載之合成寡核苷酸及其互補 性合成寡核苷酸、設計成第1 6 8個之麩胺醯胺以丙胺酸取 代且第1 6 9個之白胺酸以脯胺酸取代且第1 7 0個之丙胺酸 以曱硫胺酸取代之序列編號 8 6記載之合成寡核苷酸及其 互補性合成寡核苷酸及設計成第2 4 5個之麩胺酸以天冬醯 胺取代之序列編號 8 7記載之合成寡核苷酸及其互補性合 成寡核苷酸，根據實施例1 0 2記載之方法，取得表現序列 編號1記載之胺基酸序列第1 4 6個之絲胺酸以丙胺酸取代 且第1 7 0個之丙胺酸以白胺酸取代之重組P Q Q G D Η的重組質 體（pNPG5-146A+170L)，以下同義，取得 pNPG5-168A+169P + 170L 、 pNPG5-l46A + 170M 、 pNPG5 - 168 A+169P+17 Ο Μ 、 pNPG5-146A+168A+169P+170L、pNPG5 - 146 A + 168 A +169P + 170M、pNPG5-Ql 68A + L169P + A170L + E 2 4 5 D、pNPG5- 1 68A + 169P+170M + 2 4 5 D、pNPG5 - 1 46 A + 3 4 2 I > pNPG5-l 68A + 169P + 170L + 3 4 2 I、pNPG5-l68A + 169P+170M + 3 4 2 I > pNPG5-146A + 3 4 2 V、pNPG5-168A + 169P+170L + 3 4 2 V、pNPG5 - 168 A + 1 69P + 170M + 3 4 2 V、pNPG5-146A + 3 4 2 P、pNPG5-l68A + 169P+1 70L + 3 4 2 P' pNPG5-l68A + 169P+170M + 3 4 2 P > pNPG5 - 146 A + 3 4 2 A > PNPG5-168A + 169P+1 70L + 3 4 2 A > pNPG5-l68A+169P + 1 70M + 3 4 2 A、pNPG5-74V+1 46A、pNPG5-74V+168 A + 169P+170L、 pNPG5-74V+168A+169P+170M、 pNPG5-168A+169P+170L+
2 4 5 D + 3 4 2 I、pNPG5- 1 68 A +169P+170M + 2 4 5 D + 3 4 2 I、pNPG5 -168A+169P+170L + 245D + 342V、pNPG5-l68A + 169P+1 70M 69 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 +245D+342V、 pNPG5-168A+169P+170L+245D+342A、 pNPG5 -168A+169P+170M + 245D + 342A，再取得該轉型體。還有，關 於由第一次導入變異無法取得該重組質體者，使用不同的 合成寡核苷酸，再重複相同方法則可取得該重組質體。 再根據實施例 1 0 3〜1 0 5記載之方法，由各轉型體取得 (SI46A + A170L)、（Q168 A + L 1 69P + A 170L )、(S146 A + A 1 70 Μ ) > (Q168A + L169P + A1 70M) 、 (S146 A + Q168 A + L169P + A 170L)、 (S146A+Q168A+L169P+A170M) 、 (Q168A+L169P+A170L+ E 2 4 5 D)、（Q168A + L1 69P + A1 70M + E 2 4 5 D)、（ S 1 46 A + M 3 4 2 I )、 (Q168A + L1 69P + A1 70L + M 3 4 2 I ) > (Q168A + L169P + A170M + M 3 4 2 I)、（SI 46A + M 3 4 2 V)、（ Q 1 68 A + L169P + A 170L + M 3 4 2V)、 (Q168A + L1 69P + A1 70M + M 3 4 2 V) > (S 1 46 A + M3 4 2 P )、（Q168A + LI69P + A170L + M 3 4 2 P) 、 (Q1 68A + L169P + A 170M + M 3 4 2 P)、 (SI46A + M 3 4 2 A)、(Q1 68A + L1 69P + A170L + M 3 4 2 A) > (Q168A + L1 69P + A1 70M + M 3 4 2 A)、（D74V + S146 A )、(D74V + Q1 68A + L169P + A1 70L)、(D74V + Q1 68A + L169P + A170M) > (Q168A + LI 69P + A1 70L + E 2 4 5 D + M 3 4 2 I ) > (Q1 68A + L169P + A170M + E 2 4 5 D + M 3 4 2 I ) 、 (Q168A + L169P + A170L + E245D + M342V)、 (Q168A + L169P + A170M + E245D + M342V)、(Q168A + L1 69P + A170L+E245D+M342A)、 （Q168A+L169P+A170M+E245D+M342A) 之純化酵素樣品，並評估受質專一性。結果示於表1 0 3。 70 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 [表 1 0 3 ] 胺基酸取代部位 麥芽糖作用性 SI46A + A1 70L 73 Q168A + L1 69P + A170L 22 SI 46A + A1 70M 73 Q168A + L1 69P + A170M 25 S146A+Q168A+L169P+A170L 18 SI 46A + Q1 68A + L169P + A170M 22 Q168A + L1 69P + A1 70L + E 2 4 5 D 14 Q1 68A + L1 69P + A170M + E 2 4 5 D 14 S1 46A + M 3 4 2 I 75 Q168A+L169P+A170L+M342I 14 Q168A + L1 69P + A170M + M 3 4 2 I 15 SI 46A + M 3 4 2 V 73 Q168A + L1 69P + A1 70L + M 3 4 2 V 14 Q1 68A + L1 69P + A170M + M 3 4 2 V 16 SI 46A + M 3 4 2 P 76 Q168A + L1 69P + A1 70L + M 3 4 2 P 25 Q1 68A + L1 69P + A170M + M 3 4 2 P 25 SI 46A + M 3 4 2 A 78 Q168A+L169P+A170L+M342A 20 Q1 68A + L1 69P + A170M + M 3 4 2 A 20 D74V+S146A 78 D74V + Q1 68A + L1 69P + A170L 2 1 D74V + Q1 68A + L169P + A170M 24 Q168A+L169P+A170L+E245D+M342I 6. 9 Q168A+L169P+A170M+E245D+M342I 8. 8 Q168A+L169P+A170L+E245D+M342V 7.9 Q168A+L169P+A170M+E245D+M342V 8.4 Q168A+L169P+A170L+E245D+M342A 10 Q168A+L169P+A170M+E245D+M342A 14 野生型 1 02 [實施例2 0 1 ] 以下，於序列編號1所記載之吡咯喹啉醌依存性葡萄糖 去氫酵素中，使用 Q168A 、 （Q168A+L169G)、 (Q168A + L1 69C) 、 (Q1 68A + L169Ρ) 、 (Q1 68S + L1 69Ε)、 (Q 1 6 8 S + L 1 6 9 Ρ )之各重組σ比ρ各噎琳S昆依存性葡萄糖去氫酵 素，具體說明本發明。當然不需贅言，本發明並非被限定 於下列實施例。 還有，本實施例所使用之 Q 1 6 8 A、（ Q 1 6 8 A + L 1 6 9 G )、 (Q168A+L169C) 、 (Q168A+L169P) 、 (Q168S+L169E)、 (Q 1 6 8 S + L 1 6 9 P )各重組吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫酵素 71 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 之純化酵素樣品為依下列記載之步驟取得。 PQQ依存性葡萄糖之去氫酵素基因之表現質體的 野生型PQQ依存性葡萄糖去氫酵素之表現質體 於載體 pBluescript SK(-)之多重選殖區插入來 動桿菌N C I Μ B 1 1 5 1 7株之表現p q q依存性葡萄糖去 構造基因。其鹼基序列示於序列表之序列編號2 基序列所推定之 PQQ依存性葡萄糖去氫酵素之 列示於序列表的序列編號1。 重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的製作 以含有野生型P Q Q依存性葡萄糖去氫酵素基因 體p N P G 5和序列編號8 8記載之合成寡核苷酸及其 成募核苦酸為基礎，使用QuickChange(TM) Site-Mutagenesis Kit(STRATAGENE 製 ）， 並根 據其步 組處理操作。再定鹼基序列，取得表現序列編號 胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺以丙胺酸取代之 依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體（p N P G 5 Μ 1 6 8 A ) 以p N P G 5和序列編號8 9記載之合成募核苷酸 性合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺以 代、第1 6 9個之白胺酸以甘胺酸取代之重組P Q Q 萄糖去氫S孝素的重組質體（pNPG5M168A+169G)。 以p N P G 5和序列編號9 0記載之合成寡核苷酸 性合成募核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺以 312/發明說明書(補件)/93-12奶127〇96 構築 pNPG5 為 自鮑氏不 氫酵素的 ，由該驗 胺基酸序 之重組質 互補性合 Directed 驟進行重 1記載之 重組P Q Q 〇 及其互補 表現序列 丙胺酸取 依存性葡 及其互補 表現序列 丙胺酸取 72 200525033 代、第1 6 9個之白胺酸以胱胺酸取代之重組P Q Q依存性葡 萄糖去氫酵素的重組質體（PNPG5M168A+169C)。 以p N P G 5和序列編號9 1記載之合成募核苷酸及其互補 性合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得表現序列 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺以丙胺酸取 代、第1 6 9個之白胺酸以脯胺酸取代之重組P Q Q依存性葡 萄糖去氫酵素的重組質體（PNPG5M168A+169P)。 以p N P G 5和序列編號9 2記載之合成寡核苷酸及其互補 性合成募核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得表現序列 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺以絲胺酸取 代、第1 6 9個之白胺酸以麩胺酸取代之重組P Q Q依存性葡 萄糖去氫酵素的重組質體（PNPG5M168S + 169E)。 以p N P G 5和序列編號9 3記載之合成寡核苷酸及其互補 性合成寡核苷酸為基礎，同上述方法處理，取得表現序列 編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺醯胺以絲胺酸取 代、第1 6 9個之白胺酸以脯胺酸取代之重組P Q Q依存性葡 萄糖去氫酵素的重組質體（PNPG5M168S+169P)。 以 pNPG5M168A、 pNPG5M168A+169G、 pNPG5M168A+169C、 PNPG5M168A+169P > pNPG5 Μ 168S+169E > pNPG5 Μ 168S+ 1 69Ρ 之各重組質體轉型大腸桿菌勝任細胞 （Ε. c ο 1 i J Μ 1 0 9 ;東洋紡績製），分別取得該轉型體。 在假單胞菌屬細菌中複製之表現載體的構築 將重組質體p N P G 5 Μ 1 6 8 Α之D N A 5微克以限制酶B a m Η I及 X Η ο I (東洋紡績製）切斷，單離出重組P Q Q依存性葡萄糖去 73 3 ] 2/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 氫酵素的結構基因部位。將所單離之D N A與B a m Η I及X Η ο I 切斷之ρ Τ Μ 3 3 ( 1微克）以Τ 4 D Ν Α連接酶1單位於1 6 °C、反 應1 6小時，將D N A連結。經連結的D N A使用大腸桿菌D Η 5 α的勝任細胞進行轉型。將所得之表現質體命名為 pNPG6Ml68Α ° 對於 pNPG5M168A+169G、pNPG5M168A+169C、pNPG5M168A +169P、 pNPG5M168S+169E、 pNPG5Ml68S+169P 之各重組質 體亦同上述方法處理取得表現質體。將所得之表現質體分 別命名為 pNPG6M168A+169G 、 pNPG6Ml68A+169C > pNPG6M168A+169P、 pNPG6M168S+169E、 pNPG6M168S+169P° 假單胞菌屬細菌之轉型體的製作 將惡臭假單胞菌Τ E 3 4 9 3 (微工研寄存1 2 2 9 8號）以L B G培 養基（L B培養基+ 0 . 3 %甘油）於3 0 °C培養1 6小時，且以離心 (1 2 , 0 0 0 r p m、1 0 分鐘）回收菌體。於此菌體加入冰冷之含 有3 0 0 m Μ蔗糖的5 m Μ K -磷酸緩衝液（ρ Η 7 . 0 ) 8毫升，令菌體 懸浮。再度以離心（1 2 , 0 0 0 r p in、1 0 分鐘）回收菌體，並於 此菌體加入冰冷之含有 3 0 0 m Μ蔗糖的 5 m Μ K -罐酸緩衝液 (ρ Η 7 . 0 ) 0 . 4毫升，令菌體懸浮。 於該懸浮液中加入0 · 5微克表現質體p N P G 6 Μ 1 6 8 A，且以 電穿孔法進行轉型。由含有100微克/毫升鏈黴素之LB洋 菜培養基上生長的菌落，取得目的之轉型體。 對於 pNPG6M168A+169G、 pNPG6M168A+169C、 pNPG6M168A +169P、 pNPG6M168S+169E、 pNPG6Ml68S+169P 分別同才策實 施，取得目的之轉型體。 74 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 全酶型表現純化酵素的調製方法 將500毫升之Terrificbroth分注入2公升容量的斜 燒瓶，於1 2 1 〇C ，進行2 0分鐘高壓滅菌處理，放冷後添# 另外無菌過濾的鏈黴素至其終濃度為1 0 0微克/毫升。於& 培養基中，接種預先以含有1 〇 〇微克/毫升鏈黴素之ρ γ 0 結 養基於 30 r 培養 24 小時之惡臭假單胞 TE3493(pNPG6M168A)的培養液5毫升，且於30°C下通乳 拌培養4 0小時。將上述菌體以離心集«，於2 0 m Μ磷® 衝液（ρ Η 7 . 0 )中懸浮後，以超音波處理弄碎，再進行離心 取得上清液視為粗製酵素液。所得之粗製酵素浪 HiTrap-SP(Amershaiii_Pharmacia)離子交換管柱層析予 Θ 分離、純化。其次以1 0 m Μ P I P E S - N a 0 Η緩衝液（p Η 6 . 5 )透析 後添加氯化鈣至終濃度為 ImM 。 最後 α HiTrap-DEAE(Amersham-Pharniacia)離子交換管柱層析予 以分離、純化，取得純化酵素樣品。根據本方法所得之樣 品為於SDS-PAGE上顯示約為單一之帶。 對於以 pNPG6M168A+169G 、 pNPG6M168A+169C 、 pNPG6M168A+169P、 pNPG6M168S+169E、 pNPG6M168S+169P 所造成之惡臭假單胞菌 T E 3 4 9 3轉型體亦同上述方法處理 取得純化酵素製品。 使用如此處理所取得之純化酵素評估性能。 以鐵氰化物離子做為媒介之吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫 酵素活性的測定方法 •測定原理 75 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 D -葡萄糖+鐵氰化物離子+ P Q Q G D Η — D -葡萄糖基-1，5 -内S旨+鐵氰化物離子 經由鐵氰化物離子之還原所產生之亞鐵氰化物離子的存 在，為根據分光光度法測定於波長4 2 0 n m下之吸光度的減 少下而確認。 •單位之定義 1單位為指於下列記載之條件下每1分鐘將1毫莫耳之 D -葡萄糖氧化之吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫酵素的酵素 量。 (3 ) 方法 試藥 A . D -葡萄糖溶液：1 Μ ( 1 · 8 克 D -葡萄糖（分子量 180· 16)/10 毫升 Η2〇) Β. Ρ I P E S - N a 0 Η緩衝液，ρ Η 6 . 5 : 5 0 m Μ (於6 0毫升水中懸浮 1.51克PIPES(分子量302.36)於5NNa0H中溶解，並加入 2 . 2 毫升之 1 0 % T r i t ο η X - 1 0 0。使用 5 N N a 0 Η 於 2 5 °C 下將 pH調整至6. 5±0. 05，加水作成100毫升） C . 鐵氰化鉀溶液：5 0 m Μ ( 0 . 1 6 5 克鐵氰化鉀（分子量 329.25)/10 毫升 Η2〇) D. 蒸餾水 Ε. 酵素稀釋液：含有 lmM CaCl2、0.1% Triton Χ-100、 0 · 1 % B S A 之 5 0 m Μ Ρ I Ρ E S - N a 0 Η 緩衝液（ρ Η 6 . 5 ) 步驟 1 . 於遮光瓶中調製以下之反應混合物，並於冰上貯藏（使 76 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 用時調製） 0. 9 毫升 D -葡萄糖溶 液 (Α) 25. 5亳升 PIPES-NaOH 緩衝液（p Η 6 · 5 ) (Β) 2. 0 毫升 鐵氰化鉀溶 液 (C) 1.0 毫升 蒸餾水 (D) [表 20 1 ]
分析混合物中之濃度 Ρ I P E S緩衝液 42mM D -葡萄糖 30mM 鐵氰化鉀 3. 4mM 2. 將3 . 0毫升之反應混合液放入試管（塑膠製），並於3 7 °C下預加溫5分鐘。 3. 加入0 . 1毫升之酵素溶液，溫和反轉混合。 4 . 維持於3 7 °C下以分光光度計4 2 0 n m波長記錄相對於水 之吸光度的增加4〜5分鐘，並由曲線之初期直線部分計算 每1分鐘的△ 0 D ( 0 D試驗值）。 同時，除了加入酵素稀釋液（E )代替酵素溶液以外，重 複相同方法，測定空白值（△ 0 D空白值）。 酵素溶液為於分析前刻才以冰冷的酵素稀釋液（E )稀釋 至1 . 0 U / m 1 (因為該酵素的附著性故以使用塑膠管為佳）。 計算 使用下式計算活性： 體積活性（U/ml)={A0D/min(A0D試驗值-AOD空白值） xVtxdf } /( 1 . 04x1 . OxVs)
重量活性（U/mg)=(U/ml)xl/C 77
312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 V t ··總體積（3 · 1毫升） V s :樣品體積（0 . 1毫升） 1 . 0 4 :鐵氰化鉀之毫莫耳分子吸光係數 1 · 0 :光徑長（公分） d f :稀釋係數 C :溶液中之酵素濃度（c m g / m 1 ) 比活性之測定 每單位液量之蛋白質含量根據 B r a d f 〇 r d法做為原理的 蛋白質分析法予以測定。實際上使用B i o r a d公司製的蛋白 質分析套件，並且依據其步驟。於稀釋5倍之市售染色液 5毫升中添力口 0 . 1毫升的酵素溶液，混合後，於室溫放置 3 0分鐘後，以5 9 5 n m之波長測定吸光度。此時，將已知濃 度之牛血清白蛋白同樣測定作成檢量線，並由此測定各酵 素溶液之每單位液量的蛋白質含量。 另一方面，根據上述活性測定法測定每單位液量的活性 值，將每單位液量之活性值除以每單位液量之蛋白質含 量，求出σ比咯啥°林S昆依存性葡萄糖去氫酵素的比活性。 結果示於表2 0 2。 [表 2 0 2 ] 變異 比活性（U / m g ) 野生型 1 . 0 Q1 68A 8.6 Q1 68A + L1 69G 2. 5 Q1 68A + L1 69C 1 . 9 Q1 68A + L1 69P 20.1 Q1 68S + L169E 1.1 Q168S+L169P 13.1 比活性之測定結果，以鐵氰化物離子做為媒介測定酵素 78 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 活性時，任一種重組吡咯喹琳醌依存性葡萄糖去氫酵素均 比野生型，可確認比活性增大。 於野生型吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫酵素之胺基酸序 列中，經由一或數個胺基酸缺失、取代或加入，使得比活 性增大的理由可推論如下。 。比咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫酵素之詳細的反應機制為 將受質D -葡萄糖氧化，電子傳達至與酵素配位結合的吡咯 喹啉醌，再傳達至媒介之鐵氰化物離子。成為酵素反應之 決定速率步驟點，由於由吡咯喹啉醌至鐵氰化物離子之反 應性低，故認為在電子傳達至媒介之鐵氰化物離子的過程。 例如，若考慮將活性中心附近的胺基酸予以變異後，由 於包含活性中心之活性中心附近之酵素的立體構造改變， 鐵氰化物離子變得易於進入，故酵素反應決定步驟之對於 鐵氰化物的電子傳達順利，其結果，提高比活性。 即，推測經由令活性中心附近之胺基酸一個或以上進行 取代變異，則同樣於鐵氰化物做為媒介之酵素活性測定中 的比活性可提高。或者，另一種見解中，本發明期望令變 異為對於活性中心至其半徑1 0 A以内存在的胺基酸進行。 活性中心附近之胺基酸具體可列舉位於7 6位、1 4 3位、 144 位、163 位、168 位、169 位、228 位、229 位、247 位、 248 位、343 位、346 位、348 位、377 位、406 位、408 位、 4 2 4位的胺基酸（例如，參照非專利文獻5 )。 非專利文獻 5:Protein Science(2000)，9:1265-1273 [實施例2 0 2 ] 79 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 又，實施例2 0 1中所確認之比活性的提高效果即使加以 非活性中心附近之胺基酸取代亦可維持，乃使用 (Q168A+L169G+E245D)、 （Q168A+L169P+E245D)之各重組吡 咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫酵素予以具體說明。當然不需 贅言，本發明並非被限定於實施例。 還有，本實施例所使用之（Q168A + L169G + E245D)、 (Q 1 6 8 A + L 1 6 9 P + Ε 2 4 5 D )各重組吡咯喹啉醌依存性葡萄糖去 氫酵素之純化酵素樣品取得及性能評估為同實施例2 0 1實 施。以p N P G 5 Μ 1 6 8 A + 1 6 9 G和序歹|J編號9 4記載之合成寡核苷 酸及其互補性合成寡核苷酸為基礎，作成表現序列編號 1 記載之胺基酸序列第1 6 8個之Μ胺醯胺以丙胺酸取代、第 1 6 9個之白胺酸以甘胺酸取代、第2 4 5個之麩胺酸以天冬 醯胺取代之重組 PQQ依存性葡萄糖去氫酵素的重組質體 (PNPG5M168A+169G+E245D)，同樣由 pNPG5M168A+169P 作成 表現序列編號1記載之胺基酸序列第1 6 8個之麩胺酸以丙 胺酸取代、第1 6 9個之白胺酸以脯胺酸取代、第2 4 5個之 麵胺酸以天冬醯胺取代之重組PQQ依存性葡萄糖去氫酵素 的重組質體（PNPG5M168A+169P + E245D)。將此些重組質體同 實施例2 0 1處理，實施表現載體之構築、假單胞菌屬細菌 之轉型體的製作、全酶型表現純化酵素之調製、及性能評 估。結果示於表2 0 3。 [表 2 0 3 ] 變異 比活性（U / m g ) 野生型 0,9 Q168A+L169G+E245D 7. 8 Q 1 6 8 A + L 1 6 9 P + E 2 4 5 D 22.8 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 80 200525033 由實施例2 0 2之結果，確認於非活性中心附近導入的胺 基酸取代，並不會妨礙於活性中心附近導入之胺基酸取代 變異所造成之比活性提高效果。 (產業上之可利用性） 若根據本發明，則可取得受質專一性經改善的PQQGDH、 較佳為熱安定性亦經改善的PQQGDH。此重組PQQGDH可利 用於葡萄糖分析套件、葡萄糖感測器。 又，本發明之重組吼咯喹啉醌依存性葡萄糖去氫酵素為 經由提高比活性，而減低對於測定系的酵素添加量，故可 廉價製造以鐵氰化物做為媒介的葡萄糖分析套件和葡萄糖 感測器。可利用於臨床檢查和食品分析等廣泛用途領域 中，於產業界之貢獻大。 【圖式簡單說明】 圖 1 示出 Q76N、 Q76E、 Q168I、Q168V、Q76T、 Q76M、Q168A、 野生型、Q76G、Q76K之最適pH的測定結果。橫軸為表示 p Η、縱軸為表示相對活性。圖中，黑圈（A c e t a t e )為以含有 0. 22% Triton-X100 之 50mM 醋酸緩衝液（ρΗ3· 0 〜6· 〇)測定 酵素活性的結果。同樣地，黑四角（Ρ I Ρ Ε S )為以含有〇 . 2 2 %
Triton-ΧΙΟΟ 之 50mM PIPES-NaOH 緩衝液（ρΗ6·〇〜7.0)、 黑三角（Κ-ΡΒ)為以含有0.22% Triton - Χ100之50mM碌酸、緩 衝液（ρΗ5·0〜8.0)。黑菱形（Tris-HC1)為以含有 0.22% Triton - X100 之 50mM Tris - HC1 緩衝液（ρΗ7·〇 〜9.0)中浪j 定酵素活性的結果。還有，測定值為以顯示最大活性者視 為1 0 0 %之相對值表示。 81 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 圖2示出Q 7 6 K 之葡萄糖定量性的確認結果。橫軸 示一水準之稀釋系列、縱軸為表示葡萄糖濃度之測 (m g / d 1 ) 〇 圖3示出Q 7 6 K之麥芽糖作用性的確認結果。橫軸為 加入之麥芽糖濃度（m g / d 1 )、縱軸為表示麥芽糖添加濃 0時之測定值視為1 0 0 %時的相對％。圖中，黑三角為示 為樣品之 1 0 0 m g / d 1葡萄糖為基準液且加入麥芽糖 況，黑菱形為示出做為樣品之3 0 0 m g / d 1葡萄糖為基準 加入麥芽糖的情況。 圖4示出Q 7 6 E之麥芽糖作用性的確認結果。橫軸為 加入之麥芽糖濃度（m g / d 1 )、縱軸為表示麥芽糖添加濃 0時之測定值視為1 0 0 %時的相對％。圖中，黑三角為示 為樣品之 1 0 0 m g / d 1葡萄糖為基準液且加入麥芽糖 況，黑菱形為示出做為樣品之3 0 0 m g / d 1葡萄糖為基準 加入麥芽糖的情況。 圖5示出Q 1 6 8 V之麥芽糖作用性的確認結果。橫軸 示加入之麥芽糖濃度（m g / d 1 )、縱軸為表示麥芽糖添加 為 0時之測定值視為1 0 0 %時的相對％。圖中，黑三角 出做為樣品之 1 0 0 m g / d 1葡萄糖為基準液且加入麥芽 情況，黑菱形為示出做為樣品之3 0 0 m g / d 1葡萄糖為基 且加入麥芽糖的情況。 圖6示出Q 1 6 8 A之麥芽糖作用性的確認結果。橫軸 示加入之麥芽糖濃度（m g / d 1 )、縱軸為表示麥芽糖添加 為0時之測定值視為1 0 0 %時的相對％。圖中，黑三角 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 為表 定值 表+ 度為 出做 的情 液且 表示 度為 出做 的情 液且 為表 濃度 為不 糖的 準液 為表 濃度 為不 82 200525033 出做為樣品之 1 0 0 m g / d 1葡萄糖為基準液且加入麥芽糖的 情況，黑菱形為示出做為樣品之3 0 0 m g / d 1葡萄糖為基準液 且加入麥芽糖的情況。 圖7示出野生型酵素之麥芽糖作用性的確認結果。橫軸 為表示加入之麥芽糖濃度（m g / d 1 )、縱軸為表示麥芽糖添加 濃度為0時之測定值視為1 0 0 %時的相對％。圖中，黑三角 為不出做為樣品之 lOOmg/dl 萄糖為基準液且加入麥牙 糖的情況，黑菱形為示出做為樣品之3 0 0 m g / d 1葡萄糖為基 準液且加入麥芽糖的情況。 83 312/發明說明書(補件)/93· 12/93127096 1 200525033 序列表 <110> Toyo Boseki Kabushiki Kaisya <12〇>受質專一性優異之重組吡咯喹。林 ' 依1生葡萄糖^去氮酉孝素 (PQQ dependent glucose dehydrogenase excellent in substrate spec if ici ty) <130> 040014PC1 <160> 94 <170> Patentln version 3. 1
<210> 1 <211> 455 <212〉 PRT 〈213>鮑氏不動桿菌 <400〉 1
Asp lie Pro Leu Thr Pro Ala Gin Phe Ala Lys Ala Lys Thr Glu Asn 15 10 15
Phe Asp Lys Lys Val lie Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His' Ala Leu 20 25 30
Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gin lie Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45
Lys lie Leu Arg Val Asn Pro Val Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Phe 50 55 60
Gin Val Pro Glu lie Val Ser Asp Ala Asp Gly Gin Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80
Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys His Asn Pro Tyr lie Tyr lie 85 90 95
Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 no 84 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033
Gin Thr lie Me Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Thr Thr Asp Thr Phe 115 120 125
Glu Lys Pro lie Asp Leu He Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140
Gin Ser Gly Arg Leu Val lie Gly Pro Asp Gin Lys lie Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 I le Gly Asp Gin Gly Arg Asn Gin Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175
Gin Ala Gin His Thr Pro Thr Gin Gin Glu Leu Asn Ser Lys Asp Tyr 180 185 190
His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Val 195 200 205
Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Me Tyr Thr 210 215 220
Leu Gly His Arg Asn Pro Gin Gly Leu Ala Phe Ala Pro Asn Gly Lys 225 230 235 240
Leu Leu Gin Ser Glu Gin Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Me Asn Leu 245 250 255
Val Leu Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys 260 265 270
Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Thr Asn Lys 275 280 285
Ser Gin lie Lys Asp Leu Ala Gin Asn Gly lie Lys Val Ala Thr Gly 290 295 300 3】2/發明說明書(補件)/93-12/93 ] 27096 85 200525033
Val Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro 305 310 315 320
Pro Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gin Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp 325 330 335
Pro Thr Cys Gly Glu Met Ala Tyr lie Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro 340 345 350
Ser Ser Ala Tyr Val Tyr Thr Gly Gly Lys Lys Ala Me Pro Gly Trp 355 360 365
Glu Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val lie Phe Arg 370 375 380
Me Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Leu Asp Asp Ala lie Pro 385 390 395 400
Met Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val lie Ala Ser Pro Glu 405 410 415
Gly Asn Thr Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gin Lys 420 425 430
Asp Asp Gly Ser Val Thr His Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Me 435 440 445
Lys Phe Thr Tyr Asn Gly Lys 450 455
<210> 2 <211> 1368 <212> DNA 〈213〉鮑氏不動桿菌 <400> 2 86 312/發明說明！：(補件)/93-〗2/93127096 4 4200525033 gatatacctc tgacacctgc tcagttcgca aaagcgaaaa cagaaaattt tgataaaaaa 60 gtgattctgt ccaatttaaa taaaccacat gctttgttat gggggccaga taatcaaatt 120 tggttaaccg aacgtgcaac tggcaaaatt ttaagagtaa atcctgtatc tggtagcgcg 180 aaaacagtat ttcaggttcc tgaaattgtg agtgatgctg atgggcaaaa tggtttgtta 240 ggttttgctt ttcatcctga ctttaaacat aacccttata tctatatttc aggcactttt 300 aaaaatccaa aatctacaga taaagagtta cctaatcaga cgattattcg tagatatacc 360 tataataaaa ctacagatac atttgaaaag cctattgatt tgattgcagg tttaccgtca 420 tcaaaagatc atcagtctgg tcgtctcgtt attggtccag accaaaaaat ctactatacg 480 attggtgacc aaggtcgtaa tcagttagct tatctgttct taccgaatca ggcacagcat 540 actccgactc agcaagagct caatagtaaa gactaccata catatatggg taaagtatta 600 cgcttaaatc tggacggcag tgtacctaaa gacaacccaa gctttaacgg cgtagtgagt 660 catatctaca ctttagggca ccgtaatcca caaggtttag catttgcccc aaatggaaag 720 cttttacaat ctgagcaagg accaaattct gatgatgaaa ttaaccttgt attaaaaggt 780 ggtaactatg gctggccaaa tgtagctggt tataaagatg acagtggtta tgcctatgca 840 aactattcgg cagcaaccaa taaatcacaa attaaagatt tagctcaaaa cgggataaaa 900 gtagcaacag gtgttcctgt gactaaagag tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtgccg 960 cctttgaaaa ctttatatac ggtacaagat acctataact ataatgaccc tacttgtggt 1020 gagatggcat atatttgctg gccaacggtt gcaccgtcat cagcatatgt atatacggga 1080 ggcaaaaaag cgattccagg gtgggaaaat acattattgg tcccatcttt aaaacgtggg 1140 gtgattttcc gtattaaatt ggacccgaca tatagcacga ctttggatga tgctatccca 1200 atgtttaaaa gcaataaccg ttatcgtgat gtcatcgcta gtccagaagg taatacctta 1260 tatgtgctga ctgatacagc ggggaatgta caaaaagatg atggttctgt cactcatact 1320 ttagagaatc ccggttctct cattaaattt acatataacg gtaagtaa 1368 <210〉 3 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 87 200525033 A j 3 N 、 3 D y > > > -—2 3 1— 1— 1— OL oxu nyL < < < <220> <223〉人工序列寡核苷酸 <400〉 3 agtgatgctg atgggaataa tggtttgtta ggt <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213>人工 <220〉 <223> 人工序列寡核苷酸 <400> 4 agtgatgctg atggggagaa tggtttgtta ggt <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213〉人工 〈220〉 <223〉人工序列寡核苷酸 <400> 5 agtgatgctg atgggacaaa tggtttgtta ggt 〈210〉 6 <210 33 <212> DNA 〈213〉人工 <220〉 <223>人工序列寡核苷酸 <400〉 6 agtgatgctg atgggatgaa tggtttgtta ggt <210〉 7 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 3 N /X 3 D // > > > i~ OL 3 1 1J 1— 2 2 2 < < < <220〉 <223〉人工序列寡核苷酸 <400〉 7 agtgatgctg atggggggaa tggtttgtta ggt <210> 8 <2Π> 33 <212> DNA 〈213> 人工<220> <223〉 人工序列寡核苷酸 <400〉 8 agtgatgctg atgggaagaa tggtttgtta ggt <210〉 9 <210 33 <212> DNA <213〉人工<220〉 <223〉人工序列寡核苷酸 <400> 9 gaccaaggtc gtaatatttt agcttatctg ttc <210> 10 <211〉 33 <212〉 DNA <213〉人工<220〉 〈223>人工序列寡核苷酸 <400> 10 gaccaaggtc gtaatgtatt agcttatctg ttc <210〉 11 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 工 3ΝΑ人 oo nu y \/ \/ \/ -—2 3 2 2 2 < < < <220〉 <223>人工序列寡核苷酸 <400> 11 gaccaaggtc gtaatgcatt agcttatctg ttc <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213〉人工 〈220〉 〈223>人工序列寡核苷酸 <400> 12 cgaatcaggc acagcatact ccgactcagc aagagctcaa tag 43 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213〉人工<220> 〈223>人工序列寡核苷酸 > > > > ο -— 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 < < < < mi sc_feature (17)·. (25)n代表任何驗基 <400> 13 gtaagaacag ataagcnnnn nnnnnacgac cttggtcacc aatcg <210) 14 <210 40 <212) DNA <213) 人工 <220> 〈223〉 人工序列寡核苷酸 3 12/發明說明書(補件)/93· 12/93127096 90 8200525033 <400> 14 gatgctgatg ggcaaaatgg tttgttaggt tttgcttttc A ^ 5 8 N /\ 1 3 D // > > > > o i— 2 3 2 2 2 2 < < < < <220> <223〉人工序列寡核苷酸<220> <221〉 misc—feature <222〉(7).. (15) <223><220> 〈221> misc一feature <222〉（7).. (15) 〈223〉η代表任何驗基 <400> 15 actcacnnnn nnnnnaacct gaaatactgt tttcgcgc <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213〉 人工 〈220〉 〈223〉 人工序列寡核苷酸 <400〉 16 tttaccgtca tcaaaagatc atcagtctgg tcgtctcgtt attggtccag <210> 17 〈211〉 52 <212> DNA <213〉 人工 <220> <223> 人工序列寡核苷酸 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 <220〉 <Z21> misc_feature <222〉（18).· (26) <223〉n代表任何驗基 〈400〉 17 cctgcaatca aatcaatnnn nnnnnnaaat gtatctgtag ttttattata gg 〈210〉 18 <211〉 39 <212> DNA <213〉 人工 <220〉 <223> 人工序列募核苷酸 <400〉 18 acggttgcac cgtcatcagc atatgtatat acgggaggc <210> 19 <211> 39 <212〉 DNA <213> 人工 〈220> <223〉 人工序列寡核苷酸 <220> <221> misc-feature <222> (16).. (24) <223〉 n代表任何驗基 <400〉 19 tggccagcaa atatannnnn nnnnaccaca agtagggtc <210〉 20 <2Π> 34 <212> DNA <213〉人工 〈220〉 <223>人工序列寡核苷酸 312/發明說明書(補件)/93-12/931270% 10 200525033 <400> 20 atggttctgt cactcatact ttagagaatc ccgg <210> 21 <211) 35 <212〉 DNA <213) 人工 <220> <223〉 人工序列募核苷酸 <220〉 <221> misc一feature <222〉 (17).. (19) <223) η代表任何驗基 <400〉 21 catctttttg tacattnnnc cccgctgtat cagtc <210〉 22 <211> 33 <212> DNA 〈213>人工 <220〉 … <223〉人工序列募核苷酸 <400〉 22 ttaccgaatc aggcacagca tactccgact cag <210〉 23 <211> 33 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉人工序列寡核苷酸 <400> 23 gaacagataa gctaagcaat tacgaccttg gtc 33 <210> 24 <ΖΠ> 33 93 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 11 11200525033 <212> DNA <213〉 <220> 人工 〈223>人工序列募核苷酸 <400〉 24 gaacagataa gctaartcat tacgaccttg gtc <210> 25 <211> 33 <212> DNA 〈213>人工 〈220〉 <223〉 人工序列寡核苷酸 <400〉 25 gaacagataa gctaaytcat tacgaccttg gtc <210> 26 <2Π> <212> <213〉 33 DNA 人工 <220> <223〉 人工序列寡核苷酸 <400> 26 gaacagataa gctaaraaat tacgaccttg gtc <210> 27 <211> <212〉 <213> 33 DNA 人工 <220〉 <223> 人工序列寡核苷酸 〈400> 27 gaacagataa gctaagccat tacgaccttg gtc <210> 28 <211> 33 312/發明說明書(補件)/93-] 2/931270% 12200525033 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉人工序列寡核苷酸 <400> 28 gaacagataa gctaartgat tacgaccttg gtc > > > > o i— 2 3 2 oc OL oc < < < < A工 9 3 N 2 3 D y 〈220> 〈223>人工序列寡核苷酸 <400〉 29 gaacagataa gctaayttat tacgaccttg gtc <210〉 30 <211> 33 <212> DNA <213>人工 〈220〉 <223〉人工序列寡核苷酸 > > > > o i— 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 < < < < misc_feature (16).. (16) n代表任何驗基 <400> 30 gaacagataa gctaanagat tacgaccttg gtc
<210> 31 <211〉 33 <212> DNA <213> 人工 <220〉 <223> 人工序列募核苷酸 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 95 13 200525033 <400〉 31 gaacagataa gctaacatat tacgaccttg gtc 33 <210> 32 〈211〉 33 <212> DNA <213〉人工 〈220〉 <223〉人工序列寡核苷酸 <400> 32 gaacagataa gctaarttat tacgaccttg gtc 33 <210〉 33 <211> 33 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉人工序列寡核苷酸 <220〉 〈221> misc—feature <222> (16).. (16) 〈223> η代表任何鹼基 <400〉 33 gaacagataa gctaanggat tacgaccttg gtc 33 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> 人工 <220〉 <223> 人工序列寡核苷酸 <220> <221> misc一feature <222> (16).. (16) <223〉 η代表任何驗基 96 312/發明說明書(補件)/93-12/93 ] 270% 14 14200525033 <400> 34 gaacagataa gctaancgat tacgaccttg gtc <210> 35 <211> <212〉 <213> 33 ONA 人工 <220> 〈223〉 人工序列寡核苷酸 <400〉 35 gaacagataa gctaagctat tacgaccttg gtc <210〉 36 <211> <212> <213> 33 DNA 人工 <220> 〈223> 人工序列寡核苦酸 <400> 36 gaacagataa gctaacgtat tacgaccttg gtc <210> 37 <211> <212> <213〉 33 DNA 人工 〈220> 〈223> 人工序列寡核苷酸 <400> 37 gaacagataa gctaaccaat tacgaccttg gtc <210> 38 <211> 〈212> <213〉 33 DNA 人工 <220〉 <223〉 人工序列寡核苦酸 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 15200525033 <400〉 38 gaacagataa gctaartaat tacgaccttg gtc <210〉 39 <2Π> 39 <212> DNA <213〉 人工 <220〉 〈223〉 人工序列寡核苷酸 <400> 39 gaccaaggtc gtaatcaggc agcttatctg ttcttaccg <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 人工序列寡核苷酸 <400> 40 gaccaaggtc gtaatcaggt tgcttatctg ttcttaccg <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213〉 人工 <220> <223> 人工序列寡核苷酸 〈400〉 41 gaccaaggtc gtaatcagta tgcttatctg ttcttaccg <210> 42 <211> 39 <212〉 DNA <213〉 人工 <220〉 <223> 人工序列寡核苷酸 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 16200525033 <400> 42 gaccaaggtc gtaatcagca tgcttatctg ttcttaccg <210> 43 <2Π> 39 <212> DNA 〈213〉 人工 <220〉 <223〉 人工序列寡核苷酸 <400) 43 gaccaaggtc gtaatcagaa agcttatctg ttcttaccg <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> 人工 <220〉 <223> 人工序列寡核苷酸 <400〉 44 gaccaaggtc gtaatcagga tgcttatctg ttcttaccg <210> 45 <211> 39 <212〉 DNA <213〉 人工 <220〉 <223> 人工序列募核苷酸 <400> 45 gaccaaggtc gtaatcagtc agcttatctg ttcttaccg <210〉 46 <211> 39 <212> DNA <213> 人工 <220> <223〉 人工序列募核苷酸 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 17200525033 <400> 46 gaccaaggtc gtaatcagaa tgcttatctg ttcttaccg Λ 7 9 N 4 3 0 y > > > > o -— 2 3 2 2 2 2 < < < < <220> <223〉人工序列寡核苷酸 <400> 47 gaccaaggtc gtaatcaggg agcttatctg ttcttaccg 39 <210〉 48 <211> 39 <212> DNA <213> 人工 <220〉 〈223〉 人工序列券核皆酸 <400〉 48 gaccaaggtc gtaatcagtg tgcttatctg ttcttaccg 39 <210〉 49 <211> 45 <212> DNA <213〉 人工 <220〉 <223〉 人工序列寡核苷酸 <220> <221> misc一feature <222> (17).. (17) <223> η代表任何鹼基. <400〉 49
gtaagaacag ataagcngat gcattacgac cttggtcacc aatcg <210> 50 <211> 45 100 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223>人工序列寡核苷酸 <400〉 50 gtaagaacag ataagcrcat gcattacgac cttggtcacc aatcg <210> 51 <211> 45 <212> DNA <213> 人工 <220〉 <223〉 人工序列寡核苷酸 <400〉 51 gtaagaacag ataagcytct gcattacgac cttggtcacc aatcg 45 <210〉 52 <211> 45 <212> DNA <213> 人工 <220〉 <223> 人工序列寡核苷酸 <400> 52 gtaagaacag ataagcraat gcattacgac cttggtcacc aatcg 45 <210> <211> <212> <213〉 工 A j 5345DN人
<220〉 <223〉人工序列寡核苷酸 <400> 53 gtaagaacag ataagcrtgt gcattacgac cttggtcacc aatcg <210〉 54 <210 45 3】2/發明說明書(補件)/93q 2/93127096 101 19 19200525033 <212> DNA 〈213>人工 <220> <223〉人工序列寡核苷酸 <400> 54 gtaagaacag ataagcdatt gcattacgac cttggtcacc aatcg <210> 55 <211〉 45 <212> DNA <213> 人工 <220> <223〉 人工序列寡核苷酸 <400〉 55 gtaagaacag ataagcyttt gcattacgac cttggtcacc aatcg <210> 56 <211> 45 <212> DNA <213〉 人工 〈220> <223〉 人工序列寡核苷酸 <400> 56 gtaagaacag ataagccatt gcattacgac cttggtcacc aatcg <210> 57 <211> 45 〈212〉 DNA <213〉人工 <2 20) 〈223>人工序列寡核苷酸 <400> 57 gtaagaacag ataagcrttt gcattacgac cttggtcacc aatcg <210> 58 <211> 45 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 20 20200525033 <212) DNA <213〉人工 <220〉 〈223>人工序列寡核苷酸 <220> 〈221> misc一feature <222> (17).. (17) 〈223> η代表任何鹼基 <400> 58 gtaagaacag ataagcnggt gcattacgac cttggtcacc aatcg <210> 59 <211> 45 <212〉 DNA <213〉 人工 <220〉 <223> 人工序列寡核苷酸 <400〉 59 gtaagaacag ataagcytgt gcattacgac cttggtcacc aatcg <210> 60 〈211> 45 <212> DNA <213〉 人工 〈220> <223> 人工序列寡核苷酸 <220> <221〉 misc_feature <222> Π7).. (17) <223〉 η代表任何驗基1 <400> 60 gtaagaacag ataagcncgt gcattacgac cttggtcacc aatcg <210> 61 <211> 45 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 21 21200525033 <212> DNA <213〉人工！ <220> 〈223>人工序列寡核苷酸 <220> <221> misc_feature <222〉（17)·· (17) 〈223〉η代表任何驗基 <400> 61 gtaagaacag ataagcngat gcattacgac cttggtcacc aatcg 〈210〉 62 <211> 45 〈212〉 DNA <213〉人工， <220〉 <223〉人工序列募核苷酸 <220> <221〉 misc_feature <222> (17).. (17) 〈223> η代表任何驗基 <400> 62 gtaagaacag ataagcngtt gcattacgac cttggtcacc aatcg <210〉 63 <211> 45 <212〉瞧 〈213>人工 <220> <223〉人工序列寡核苷酸 <220> 〈221> niiscjeature <222> (17)·. (17) <223〉η代表任何鹼基 312/發明說明書(補件)/93-12/93127〇96 45 22 200525033 <400> 63 gtaagaacag ataagcnact gcattacgac cttggtcacc aatcg <210〉<211><212> <213〉 64 45 DNA 人工 <223〉人工序列寡核苦酸 <400〉 64 45 gtaagaacag ataagcccat gcattacgac cttggtcacc aatcg <210><211><212〉 〈213〉<220〉 <223〉 65 45 DNA 人工 人工序列募核苷酸 <400> 65 · 45 gtaagaacag ataagcrtat gcattacgac cttggtcacc aatcg <210〉 66 <211〉 36 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉 人工序列寡核苷酸 <400> 66 36 gaccaaggtc gtaatagtga ggcttatctg ttctta <210> <211〉 <212) <213〉 <220> <223>人工序列募核苷酸 312/發明說明書(補件)/93_】2/93127096 105 36 23 200525033 <400> 67 gaccaaggtc gtaatagtcc cgcttatctg ttctta 〈210〉 68 <2Π> 36 <212〉 DNA <213> 人工 〈220〉 〈223〉 人工序列寡核苷酸 <400〉 68 gaccaaggtc gtaatgcagg cgctti <210> 69 〈211〉 39 <212> DNA <213> 人工 <220〉 <223〉 人工序列寡核苷酸 <220〉 <221〉 misc一feature 〈222〉 (19).. (2⑴ <223〉 n代表任何驗基 〈400〉 69 caaggtcgta atcagttann statctgttc ttaccgaat 36 39 〈210〉 70 <211> 39 <212> DNA <213〉人工 〈220〉 〈223〉人工序列募核苷醆 > > > > ο -— 2 3 0/L ού 2 9U 2 2 2 2 < < < < misc_feature (19).. (20) n代表任何鹼基 106 312/發明說明書(補件)/93-12奶127〇% 24 200525033 <400> 70 ggaaagcttt tacaatctnn scaaggacca aattctgat <210> 71 <211> 39 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉人工序列寡核苷酸 > > > > o -— 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 < < < < misc一feature (19).. (20) n代表任何鹼基 <400> 71 caatctgagc aaggaccann stctgatgat gaaattaac 39 <210> 72 <211〉 38 <212〉 DNA <213> 人工 <220> <223〉 人工序列寡核苷酸 <400> 72 gcttttacaa tctgaccaag gaccaaattc tgatgatg 38 <210〉 73 <211> 39 <212> DNA <213〉 人工 <220> <223〉 人工序列寡核苷酸 <400> 73 ggcatatatt tgctggccan nngttgcacc gtcatcagc
<210> 74 <211> 39 107 312/發明說明書(補件)/93-12/93127〇% 25 25200525033 <212> DNA <213〉人工 〈220〉 <223〉人工序列寡核苷酸 <400> 74 gctgactgat acagcggggn nngtacaaaa agatgatgg
<210> 75 <2Π> 41 <212> DNA <2〗3>命名為seq[75之經設計聚核苷酸的序列 <400〉 75 gtgagtgatg ctgttgggca aaatggtttg ttaggttttg c
<210〉 76 〈211〉 38 <212> DNA ⑺3〉命名為seq76之經設計聚核苷酸的序列 <400〉 76 gaccctactt gtggtgagat tgcatatatt tgctggcc
<210> 77 <211> 38 <212> DNA 〈213〉命名為seq77之經設計聚核苷酸的序列 <400> 77 gaccctactt gtggtgaggt tgcatatatt tgctggcc 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 <210〉 78 <211> 38 <212> DNA <213> 命, <400> 78 gaccctactt <210〉 79 〈211〉 38 26200525033 <212> DNA <213〉命名為seq79之經設計聚核苷酸的序列 <400〉 79 gaccctactt gtggtgaggc tgcatatatt tgctggcc 38 <210〉 80 〈211〉 34 <212> DNA <2〗3>命名為seq80之經設計聚核苷酸的序列 <400〉 80 gatcatcagg ctggtcgtct cgttattggt ccag 34 <210〉 81 <210 39 <212> DNA 〈213〉命名為sgq8 1之經設計聚核苦酸的序列
<400> 81 gaccaaggtc gtaatcagtt actttatctg ttcttaccg 39 〈210〉 82 <211> 39 <212> DNA 〈213>命名為seq82之經設計聚核苷酸的序列 <400> 82 gaccaaggtc gtaatcagtt aatgtatctg ttcttaccg 39 <210> 83 <211> 39 <212> DNA <213〉命名為seq83之經設計聚核苷酸的序列
<400> 83 gaccaaggtc gtaatcagtt aatttatctg ttcttaccg 39 <210〉 84 <211> 39 <212> DNA <213〉命名為seq84之經設計聚核苷酸的序列 312/發明說明書(補件)/93-12/93127096 109 27 200525033 <400> 84 gaccaaggtc gtaatcagtt attttatctg ttcttaccg 39
<210> 85 <211> 39 <212> DNA <213>命名為seq85之經設計聚核苷酸的序列 <400> 85 39 gaccaaggtc gtaatgcacc actttatctg ttcttaccg <210> 86 <211> 39 <212> DNA 〈213〉 命名為seq86之經設計聚核苷酸的序列 <400〉 86 gaccaaggtc gtaatgcacc aatgtatctg ttcttaccg
39 <210> 87 <2Π> 38 <212> DNA <213> 命名為seq87之經設計聚核苷酸的序列 <400> 87 gcttttacaa tctgaccaag gaccaaattc tgatgatg 38 <210〉 88 <211> 39 <212> DNA <213> 合成DNA <400> 88 gaccaaggtc gtaatgcgtt agcttatctg ttcttaccg
39 <210> 89 <2Π> 39 <212〉 DNA <213> 合成DNA 〈400〉 89 gaccaaggtc gtaatgcggg agcttatctg ttcttaccg 39 312/發明說明書(補件)/93-12/93〗27096 110 28200525033 <210> 90 <211> 39 <212) DMA 〈213〉 合成DNA 〈400〉 90 gaccaaggtc gtaatgcgtg tgcttatctg ttcttaccg 39 〈210〉 91 <211> 39 〈212〉 DNA <213〉 合成DNA 〈400〉 91 gaccaaggtc gtaatgcgcc agcttatctg ttcttaccg 39 <210〉 92 <210 39 <212> DNA <213) 合成DNA <400> 92 gaccaaggtc gtaattcgga agcttatctg ttcttaccg 39 〈210〉 93 <210 39 〈212〉 DNA 〈213〉 合成DNA <400〉 93 gaccaaggtc gtaattcgcc agcttatctg ttcttaccg 39 <210> 94 〈211〉 38 <212> DNA <213> 實施例202中所述之經設計聚核苷酸的序列 <400〉 94 gcttttacaa tctgaccaag gaccaaattc tgatgatg 38 3】2/發明說明書(補件)/93-12/93127096 111

Claims (1)

  1. 200525033 十、申請專利範圍： 1 . 一種重組P Q Q G D Η，其特徵為比野生型之吡咯喹啉醌依 θ 存性葡萄糖去氫酵素（P Q Q G D Η )對於雙醣類的作用性更為降 低。 2 .如申請專利範圍第1項之重組P Q Q G D Η，其為比野生型 之吼洛喹。林醌依存性葡萄糖去氫酵素（P Q Q G D Η )之穩定性更 為提高。 3 . —種方法，其特徵為於野生型吡咯喹啉醌依存性葡萄 糖去氫酵素（P Q Q G D Η )之胺基酸序列中，令一或數個胺基酸 缺失、取代或加入，與野生型相比較，則可使得在以鐵氰 化物離子做為媒介之測定系中，比活性提高。 4. 一種重組σ比洛喹琳艇依存性葡萄糖去氫酵素 (P Q Q G D Η )，其特徵為根據如申請專利範圍第3項之方法， 與野生型相比較，在以鐵氰化物離子做為媒介之測定系中 之比活性為更提高。 5 . —種基因，其特徵為表現如申請專利範圍第1或3項 之重組PQQGDH。 6 . —種載體，其特徵為含有如申請專利範圍第5項之基 因。 7 . —種轉型體，其特徵為經如申請專利範圍第6項之載 體所轉型。 8 . —種重組P Q Q G D Η之製造方法，其特徵為培養如中請專 利範圍第7項之轉型體。 9 . 一種葡萄糖分析套件，其特徵為含有如申請專利範圍 112 31W發明說明書(補件)/93-12/93127096 200525033 第1或3項之重組PQQGDH。 I 0 . —種葡萄糖感測器，其特徵為含有如申請專利範圍 第1或3項之重組PQQGDH。 II . 一種葡萄糖測定方法，其特徵為含有如申請專利範 圍第1或3項之重組PQQGDH。
    113 312/發明說明® 補件)/93-12/93127096
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