SK944585A3

SK944585A3 - Process for extracting tetraploid camomile enriched with bisabolol

Info

Publication number: SK944585A3
Application number: SK9445-85A
Authority: SK
Inventors: Franz Chlodwig; Otto Isaac
Original assignee: Degussa
Priority date: 1984-12-19
Filing date: 1985-12-18
Publication date: 2000-06-12
Also published as: ES550093A0; DE3542756A1; JPS61146132A; DE3542756C2; ES8702113A1; SK280689B6; GB8531273D0; NL8503481A; HU202034B; FR2574621A1; ES550090A0; ZA859667B; PL164481B1; CZ944585A3; CH671674A5; GR853074B; CZ280274B6; PL256902A1; GB2170404A; DE3542756C3

Description

Sposob prípravy nového tetraploidného rumančeka bohatého na bisabolol

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu prípravy nového tetraploidného rumačeka, bohatého na bisabolol, kultúrneho rastlinného druhu rumanček pravý /Chamomilla recutiťa L., synonymného s Matricaria chamcmilla L., Asteraceae/, ktorého kvety sušené pri 40 °C obsahujú vzhíadom na sušinu aspoň 100 mg% chamazulénu, aspoň 200 mg% (-)-zX-bisabololu a menej ako 50 mg% ostatných bisaboloidov, s výnimkou odrody rumančeka Manzana.

I

Doterajší stav techniky

Prípravky z kvetenstva rumančeka pravého /Chamomilla recutit’a (ľ.) Rauscnert, synonymného s Matricaria Chamomilla, L./ majú v dôsledku svojho antiflogistického a spazmol.ytické- , ho účinku široké terapeutické využitie a tvoria dôležitú súčasť rastlinného liečivého surovinového sortimentu. Zvláštny terapeutický význam sa pritom prisudzuje účinným zložkám (-)alfa-bisabololu a chamazulénu. Vyhovujúca rumančeková droga by mala teda vykazovať vysoký obsah týchto obidvoch látok.

Prirodzene sa vyskytujúce diploidné rumančeky sú, čo sa týka obsahu účinných látok, veími heterogénne. K dispozícii býva len jedna z dôležitých účinných látok chamazulénu a (-)alfa-bisabololu, alebo - tieto účinné látky chýbajú celkom, alebo sa vyskytujú vo veími .malom množstve, pričom v takých prípadoch hlavná zložka éterickej silice pozostáva z menej účinných bisaboloidov /bisabolonoxidu A alebo B, bisabololoxidu A/.

Pod označením DEGUMILL /jedná sa pritom o odrodu rumančeka, chránenú a uvedenú v západonemeckom patentovom spise 24 02 802; o chránenú odrodu zapísanú v bývalej NDR poc,pomenovaním Degumill; tal. patentom č. 1 035 096/ je známa odroda rumančeka, ktorá obsahuje súčasne vysoký obsah (-)-alfabisabololu a chamazulénu. Obsah chamazulénu tejto rumarpČekovej odrody DEGUMILL je stály len v tom prípade, že sa zabráni náhodnému kríženiu, prípadne cudziemu opeleniu inými odrodami rumančeka, ktorých obsah bisabololu a chamazulénu je podstatne nižší, a všeobecne sa vyskytujúcim divým rumančekom chudobným na účinné látky. Nebezpečenstvo kríženia cudzím opelením hrozí takmer všade, pretože divý rumanček sa vyskytuje prakticky všeobecne. Ďalej sú známe rozličné tetrsploidné formy rumančeka /napríklad BODEGOLD, NDR; POHOÉELICKÝ, ČR a SR; ZLOTÝ ĽAN, Poísko; Bľ<-2, Madarsko/. Tieto tetrapioidné formy majú síce uspokojivý obsah chamazulénu, avšak dôležitá účinná látka (-)-alfa-bisabolol je v týchto tetraploidr.ých druhoch len vo ve'ími malej miere a prevažujú ostatné bisaboloidy /bisabolol A a B, ako aj bisabolonoxid/, ktoré tvoria viac ako polovicu silice u známych tetraploidných druhcv rumančeka .

Podstata vynálezu

Teraz sa zistilo, že úplne všeobecne je možné z priro-. dzene sa vyskytujúcich populácií rumančeka, či už diploidných, alebo tetraploidných pestovaných rumančekov, určitým spôsobom podlá vynálezu získať na bisabolol bohaté tetraploidné rumančekové rastliny, ktoré na jednej strane už ni.e sú náchylné na cudzie opelenie prirodzene sa vyskytujúcijii rumančekmi a na druhej strane majú súčasne vysoký obsah chamazulénu a (-)-alfa-bisabololu, pričom obsah C-)-alfa-bisabololu značne prevyšuje obsah chamazulénu a súčasne ostatné bisaboloidy sa prakticky nevyskytujú alebo len v malej miere.

Dôležité pritom Je aj to, že vysoký obsah hlavných účinných látok C-) -cŕ-bisabololu a chamazulénu v rumanček^ podľa vynálezu Je trvalý, to znamená, že zostáva zachovaný pri každom množení.

Predmetom vynálezu je spôsob prípravy nového na bisabolol bohatého tetraploidného rumančeka kultúrneho rastlinného druhu rumanček pravý CChamonilla recutita L., synonymného s ľlatricana chamonilla L., Asteraceae), ktorého pri teplote 40 °C sušené kvety obsahujú, vztiahnuté na sušinu, aspoň 100 mg% chamazulénu, aspoň 200 mg% C-)-cč-bisabololu a menej ako 50 mg% ostatných bisaboloidov, s výnimkou odrody rumančeka ľlanzana, ktorého podstata spočíva v tom, že sa u 1 000 až 10 000 Jednotlivých rastlín diploidnej alebo tetraploldnej populácie rumančeka stanoví v silici obsah C-)-cč-bisabololu a vyselektujú sa tie rastliny rumančeka, u ktorých predstavuje C-)-tó-bisabolol hlavnú zložku silice a u ktorých kvety, sušené pri 40 °C, obsahujú aspoň 100 mg% chamazulénu, aspoň 50 až 100 mgX (-cŕ-bisabololu a menej ako 50 mg% ostatných bisaboloidov, tieto rastliny sa z východiskovej populácie oddelia, namnožia a podrobia sa ďalším selekčným a množiacim stupňom a poprípade: sa z rastlín takto získaného rumančeka získa osivo na množenie a/alebo rumančeková droga, pričom v prípade, že sa ako východiskový rumanček použije diploidný rumanček, z ktorého je vylúčená odroda Degumill, uskutoční sa po dokončení všetkých selekčných krokov tetraploidizácia pomocou chemikálií pri teplotách v rozmedzí od D do 35 °C, pomocou gama-žiarema, roritgenového žiarenia alebo UV žiarenia pri teplote od 0 do 35 °C, pomocou zvýšených teplôt v rozmedzí od 33 do 50 °C, pomocou znížených teplôt v rozmedzí od 0 do 5 °C, pomocou dekapitačne-kalusovej metódy alebo pomocou prašníkových kultúr.

Selekcia a množenie pri spôsobe podľa vynálezu sa skladá z nasledujúcich krokov:

- 4 a/ selekcia najmenej 10 jedincov tetraploidných rastlírj pódia obsahu účinnej látky, t.j. najmenej 100 mg% chamazulénu, najmenej 200 mg% bisabololu a menej ako 50 mg% ostatných bisaboloidov, všetky hodnoty sú vztiahnuté na suchú látku, pódia súčasnosti doby kvetu, pódia rovnomernosti zá- kladného vetvenia, ako aj podía veľkosti kvetov od <0 do 40 mm, klonovanie takto vyselektovaných rastlín a získavanie osiva z rastlín získaných klonovaním, b/ pestovanie potomstva z osiva získaného pódia odstavca a/, následná selekcia pódia odstavca a/ a získavanie osiva z takto vyselektovaných rastlín, c/ troj- až päťnásobné opakovanie opatrení pódia odstavca b/j l

d/ pestovanie potomstva z osiva získaného pódia odstavca c/, selekcia týchto potomkov pódia odstavca a/, klonovanie takto selektovaných rastlín a získavanie osiva z rastlín získaných klonovaním.

Nový tetraploidný rumanček pódia vynálezu sa vyznačuje prekvapivo v porovnaní so známymi rumančekmi, prípadne odrodami rumančeka, radom nových výhodných vlastností. Najmä už nie je náchylný na cudzie opelenie prirodzene sa vyskytujúcimi populáciami rumančeka /divý rumanček/ ako známa rumančeková odroda DEGUMILL. V porovnaní s diploidnými a tetraploidnými odrodami rumančeka sa rupanček pódia vynálezu odlišuje prekvapivo vysokým obsahom účinnej látky (-)-alfa-bisabololu /najmenej 200 mg%/, zatiaíčo obsah ostatných bisaboloidov /napríklad bisabololoxidov/ je veimi nízky a predstavuje menej ako 50 mg%. Známe a v literatúre popísané druhy rumančeka vykazujú všetky veimi vysoký obsah bisaboloidov a Čiastočne bisabolonoxidov, ktoré tvoria spravidla 50 % silice drogy

- 5 /to znamená pri obsahu 1 % silice obsah asi 500 mg na 100 g drogy/.

I

Ďalej je rumanček podía vynálezu na rozdiel od doteraz známych tetraploidných odrôd rumančeka homogénny, čo sa týka nachádzajúcich sa látok v ňom, pričom vlastnosti chamazulénu a (-)-alfa-bisabololu sú konštantné /to znamená homozygótne/.

Naproti tomu hodnotenie jednotlivých rastlín známych tetraploidných odrôd rumančeka ukazuje, že jednotlivé^- jedincej, patria k rôznym typom, čo sa týka obsahu látok, čo znamená, že jednotlivý náhodný odber z nich vyrobenej drogy vykazuje kvalitatívne i kvantitatívne odlišný nehomogénny výsledok.

Okrem toho rumanček podía vynálezu sa prekvapivo odlišuje od známych tetraploidných odrôd rumančeka napríklad jednou alebo viacerými nasledujúcimi vlastnosťami: zlepšenou klíčivosťou semien, menším obsahom neupotrebitelnej zelenej hmoty /t.j. vyššou výťažnosťou kvetov/; nižším obsahom vody v kvetoch /vyšším výťažkom sušených kvetov a kratším časom sušenia/; väčšou vhodnosťou na mechanizovaný zber, pretože kvety sú významne lokalizované v jednej rovine a väčšina z nich rozkvitá súčasne /tým je umožnený aj jednotný termín zberu/; lepšou skladovatelnosťou drogy /nižším sklonom k rozpadu a tvorbe odpadu/; mimoriadne aromatickou typickou rumančekovou vôňou. Vpredu uvedené výhody vystúpia najmä vtedy, keá sa okrem selekcie na účinné látky robí ešte selekcia na jeden alebo viac uvedených znakov, z vyselektovaných rastlín sa získava osivo, z takto získaných potomkov sa uskutoční nová selekcia a tieto opatrenia sa uskutočňujú trikrát až päťkrát.

Ako východiskové diploidné rumančeky prichádzajú ‘ do úvahy napríklad Rumanček argentínskeho pôvodu”

- 6 /viď L. Z. Padula, R. V.-D. Ro'ndiňa a J. D. Coussió/'kvanti-’ tatívne -'.hodnotenie . esenciálnej silice / celkových ázuléňov a'-;· chamazulánu-y nemeckom '-rumančeku 'pestovanom -v-Argentíné; -Plaň-., ta med. 30, strany 273 ~'230> 1976/, ako aj všetky rumančeky./ ktor é v silici vykazujú-meráťelné/koncentrácie;Z-)^álfa/'bi’ša^ bololu /spravidla-nad-5:% v --silici/.' Do úvahy'prichádzajú prípadne také diploiďné rumančeky, ktoré sú popísané ’v nasledujú; H.;-Sčhilcheŕ, -/Novšie poznatky pri '-kvalita^ /silice, prípadné kvetovŕj?úniäň-y Planta medí--'23j í-32 - Ί44-71973/; ΐ 0. Kotlý;M.Aŕtílkló'+.y. Lukeš a M.'Jašičová K ''plynovó-chromatograficke j i-analýArcfc, .pharnú;

PWlzl a A·'Vdmely Predr.ľ cej literatúre; H. Sčhilcheŕ, tívnom stanovení,rumaneékovej čeka, vá, V.

ze a k chemickým, typom rumančekovej „silice.

310, 210 - 2Í5 /1977/; Ch. Franz, J bežná morfologická ‘a -chemická charakteristika niekolkých/'-po-;/ pulácií a variácií Matricaria chamomile L., ActaHôrť. ,'- 73, 109 - 114 /1978//

- 7 Silica rumančeka sa obvykle skladá z hlavných zložiek farnesenu, spatulenolu, charaazulénu, jedného zo štyroch bisaboloidov /(-)-alfa-bisabololu, bisabololoxidu A, bisabololoxidu B alebo bisabolonoxidu, pokiaí sa týka diploidných .. jednotlivých rastlín; v ztnesovej vzorke populácie, ako aj u. tetraploidných jedincoch sa môžu nachádzať rozličné bisabolidy vedia seba/, ako aj spiroéteru. Uvedené látky tvoria spolu 70 až 80 % silice. Obzvlášť výhodnými sú teda východiskové diploidné rumančeky, kde C-)-alfa-bisabolol predstavuje prevládajúcu zložku /viac ako polovicu množstva vyššie uvedených látok/

Do úvahy prichádzajú predovšetkým diploidné rumančeky ako východiskové látky, u ktorých napríklad (-)-alfa-bisabolol tvorí najmenej 40 % éterickej silice alebo najmenej 50 % bisaboloidov.

Ako tetraploidné východiskové rumančeky prichádzajú do úvahy napríklad: druhy rumančeka Bodegold /NDR/, Pohorelický /ČSSR/, Zlotý Lan /Poísko/, BK-2 /MaČarsko/. Tieto druhy sú popísané v nasledujúcej literatúre: M. Cnládek a V. Košová, Pnarmazie 13, 712 - 713 /1958/, W. Czabajska, Diss. Poznaň /1963/; W. Poethka a P. Bulin Pharm. Z. Halle, 103, 813 - 823 /1969/; I. Sárkány, Herb. Hungar, 4. /1/, 125 - 169 /1965/. V podstate platí pre tetraploidné východiskové rumančeky to isté vzhladom na obsah (-)-alfa-bisabololu ako pre diploidné východiskové rumančeky.

Do úvahy prichádzajú najmä také diploidné a tetraploidné rumančekové populácie, ktoré v zmesovej vzorke obsahujú spravidla najmenej 100 mg% chamazulénu a 50 až 100 mg% (-)-alfabisabololu /vzhíadom na sušinu kvetov sušených pri teplote . 40 °C/, to znamená, že z takých populácií rumančeka sa získa va v prípade diploidného východiskového rumančeka osivo a toto osivo sa tetraploidizuje /bez ohíadu a/alebo znalosti obsahu bisabololu ro dičovských rastlín/. V prípade východiskového tetraploidného rumančeka sa osivo, popísané ako vpredu uvedené, potom podrobuje bezprostredne .selekcii a množeniu.

Vhodné diploidné a tetraploidné východiskové rumančeky sú selektované pomocou vyšetrenia .jednotlivých rastlín. Všeobecne je potrebné vyšetriť 1 000 až 10 000 jedincov z východiskovej populácie a nájsť niekoíko jedincov, ktoré majú podlá uvedených kritérií vysoký obsah (-)-alfa-bisabololu a sú výhodné ako východiskový rumanček. Od takých vybratých jedincov sa získa obvyklým spôsobom osivo a toto sa tetraploidizuje. Po skončení tohto procesu sa tetraploidné rastliny vyselektujú od zvyšných' diploidných rastlín. Z takto získaných tetraploidných rastlín po prípadnom predchádzajúcom množení sa teraz vyselektujú všetky rastliny, ktoré majú v kvetoch sušených pri teplote 40 °C najmenej 100 mg% chamazulénu, najmenej 200 mg% (-)-alfa-bisabololu a menej ako 50 mg% ostatných bisaboloidov. Zber týchto kvetov sa pritom uskutočňuje v tom štádiu vývoja, kedy 30 až 70 % všetkých rúrkových kvetov kvetenstva je otvorených. Na to poprípade môžu nadväzovať číalšie kroky selekcie a množenia, ktoré ovplyvňujú napríklad nasledujúce znaky alebo prípadne vlastnosti: térmín súčasného kvitnutia, rovnomerné základné vetvenie a úzku zónu kvetu /to znamená lepšiu vhodnosť na mechanizovaný zber/, veiké kvetenstvá, lepšiu skladovatelnosť drogy, najmä aromatickú vôňu.

V prípade, že sa vychádza vopred z tetraploidného rumančeka, uskutočňuje sa len predtým uvedená selekcia tých rastlín, ktorých kvety sušené pri teplote 40 °C obsahujú najmenej 100 mg% chamzulénu, najmenej 200 mg% (-)-alfa-bisabololu a.

- 9 menej ako 50 mg% ostatných bisaboloidov, pričom zber týchto kvetov sa uskutočňuje vo vývojovom štádiu, kedy 30 až 70 % všetkých rúrkových kvetov je otvorených. Aj v tomto prípade môžu nadväzovať prípadne ňalšie kroky selekcie a množenia, ktoré vedú k äalším zlepšeniam /ako bolo uvedené vyššie/.

Mimoriadne výhodný rumanček sa získa vtedy, ked sa pri selekcii podlá obsahu chamazulénu a (-)-alfa-bisabololu vyselektujú také rastliny /známe alebo pripravené podlá vynálezu/, ktorých obsah chamazulénu je najmenej 200 mg%, s výhodou 250 mg%, a ktorých obsah (.-)-alfa-bisabololu je najmenej 300 mg%, s výhodu 400 mg% /obsah ostatných bisaboloidov je stále pod 50 mg%/.

Tetraploidizáciu je možné uskutočňovať spôsobom známym samým o sebe ovplyvnením rastlinných častí /semien, koreňov, končekov výhonkov, klíčkov, pazušných pukov alebo pletív diploidných východiskových rastlín rumančeka/ chemikáliami, rĎntgenovými lúčmi, lúčmi gama alebo UF-lúČmi. Je možné uskutočňovať ju Čalej metódou dekapitácie kalusu, pomocou prašníkovej kultúry alebo použitím vysokých alebo nízkych teplôt na rastliny rumančeka, prípadne na časti rastlín alebo na pletiva rastlín rumančeka. Tu je možné príkladne odkázať na knihu V/ernera Gottschalka ”Die Eedeutung der Polyploidie fttr die Evolution der Pflanzen”, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1976, najmä na strany 13 až 22.

Tetraploidizácia pomocou chemikálií:

Ako chemikálie na tetraploidizáciu prichádzajú do úvahy napríklad: kolchicín, acenaftén, alkaloidy, ako je atropín, veratrín, nikotín, sanguinarín, deriváty benzénu, bifenylu a fenantrénu, naftalénu a derivátov naftalénu, difenylamín, tribromanilín, p-dichlorbenzén, metylnaftochinón, metylnaftohydrochinón, kyselina salicylová a príbuzné látky, hexachlórhexán, hydrochlorid metamfetamínu, alkylkarbamáty alkalických kovov, ako je izopropylkarbamáť sodný, fenyluretán, soli kyseliny kakodylovéj /napríklad sodná sol/, glykozidy konvalinky, ako konvalarín, konvalatoxín a konvalamarín, heteroauxín, germisan /fenylmerkuripyrokatechín/deriváty organoortuti /ako etylfosfát, etylchlorid, fenylhydroxid a fenyldinaftylmetándisulfonát ortuti/, chloroform, rajský plyn /N_o0/. ako ’

I aj zmesi týchto látok. Do úvahy dalej prichádzajú pokrutiny, kompost a kravský hnoj.

Pôsobenie tu uvedených látok prebieha napríklad pri teplotách medzi 0 a 35 °C, s výhodou medzi 12 a 30 °C, najmä pri teplotách 15 až 25 °C.

!

: Aplikácia sa uskutočňuje napríklad pôsobením na semená, hroty výhonkov, korene /najmä na koreňové zakončenia alebo korene klíčiacich sadeníc/, na Čnelky, plochy rezov na listoch alebo stonkách, na bunkové suspenzie meristémovéhp pletiva, kalusové kultúry alebo aj injekciou na bazálne oblasti stoniek alebo do oblasti pazušných pupeňov. Chemikálie sa obvykle používajú vo forme roztokov vo vode, slabo alkoholových roztokov /obsah alkoholu sa pohybuje spravidla pod 5 %/, aleI bo vo forme slabo kyslých roztokov. Hodnota pH slabo kyslých roztokov sa pohybuje napríklad medzi 5,5 a 6,5, pričom okyselenie sa uskutočňuje pomocou nižších alifatických kyselín, ako kyseliny octovej. Ak sa použijú alkoholové roztoky, môžu byť tiež slabo kyslé. Koncentrácia chemikálií v týchto roztokoch môže byť napríklad 0,01 až 0,5 %, s výhodou 0,02 až 0,2 %, najmä 0,05 až 0,1 %. Plynné látky sa používajú ako také, prípadne za tlaku /napríklad 1 až 100 kPa/. Čas pôsobenia je napríklad 1 až 36, s výhodou 2 až 12, najmä 4 až 6 hodín. '

1

Najúčinnejšia koncentrácia, ako aj čas pôsobenia by mali byť účelne testované vždy v predbežných pokusoch.

Mimoriadne priaznivé je napríklad pôsobenie kolchicínu pri teplotách medzi 0 a 35 °C, s výhodou pri teplote 12 až 30 C, najmä pri teplote 15 až 25 °C. To je možné uskutočňovať napríklad tak, ze sa nechajú semená diploidného východiskového rumančeka napučať v 0,01 až 0,2%, najmä 0,02 až 0,1%, s výhodou v 0,0% roztoku kolchicínu, alebo sa naklíčené päť- až sedemdňové dobre vyvinuté klíčiace sadenice diploidného východiskového rumančeka /s klíčnymi listami dolu/ ponoria do 0,01 až 0,2%, najmä 0,02 až 0,1%, s výhodou 0,0 roztoku koT^chicínu. pri poslednom spôsobe má mať okolitá atmosféra 100% relatívnu vlhkosť. Čas pôsobenia kolchicínu je napríklad 4 až 10 hodín. Pri použití klíčiacich sadeníc je všeobecne postačujúci čas pôsobenia do 10 hodín. Pri použití semien sa čas pôsobenia môže prípadne predĺžiť až na 36 hodín.

Po pôsobení chemikálií sa napučané semená, klíčiace sadenice, prípadne iné časti rastlín premyjú niekoľkokrát vodou. Napuča.né semená sa potom napríklad vysejú. Rastliny s oeštrenými koreňmi alebo iné ich Časti alebo ošetrené klíčiace sadenice sa napríklad pikírujú do liesok na rastliny. Z takto ošetrených semien,prípadne klíčiacich sadeníc sa rastliny pestujú /napríklad v skleníku: pri teplote madzi 18 až 25 °C vo dne a 10 až 16 °C v noci/, vyberú sa rastliny, ktorých peí je asi 1,5-krát väčší ako peí východiskového materiálu, prípadne majú v somatických bunkách počet chromozómov 36.

Ak sa pôsobí na iné rastlinné časti /nadzemné alebo pozemné/, podrobia sa neskoršiemu skúmaniu na uskutočnenú tetraploidizáciu výlučne výhonky, korene alebo kvety /semená, ktoré vzišli z takto chemikáliami ošetrených častí. Kecí sa napríklad uskutoční ošetrenie výhonku alebo pazúch, skúma sa potom len výhonok vzniknutý z tejto pazuchy, prípadne z tohto pupenca a kvety vytvorené na ňom, prípadne semená na počet chixmozómov.

Meranie veľkosti peľu a počítanie chromozómov je možné uskutočňovať napríklad tak, ako je uvedené v príklade 3.

Tetraploidizácia pomocou žiarenia:

Pôsobenie sa uskutočňuje napríklad na semená alebo zakončenia koreňov pri teplotách medzi 0 až 35 °C, s výhodou pri 10 až 30 °C, najmä pri 15 až 25 °C. Množstvo ožiarenia: 5 až 50 Krad. Do úvahy s výhodu prichádzajú lúče gama a räntgenové lúče.

Ako UF-lúče-prichádzajú do úvahy také, ktoré majú napríklad vlnovú dĺžku 400 až 30 nm, s výhodou 350 nm.

Takto ožiarené rastliny, prípadne rastlinné časti, sa potom ošetrujú Šalej ako po pôsobení chemikáliami.

Použitie vysokých a nízkych teplôt:

Ako vysoké teploty prichádzajú do úvahy napríklad teploty medzi 33 až 45 °C. Týmto teplotám sa vystavujú napríklad: napučané semená, klíčiace sadenice, vrcholky výhonkov a meristémové pletivo. - čas ošetrenia: napríklad 1 až 48, s výhodou 12 až 24 hodín.

Ako nízke teploty prichádzajú do úvahy: 0 až 5 C, s výhodou 0,5 až 4 °C, najmä' 2 ^Q _;C. Týmto teplotám,sa výstavujú napríklad: napučané semená, klíčiace sadenice, výhonky a

- 13 meristémové pletivo. Čas ošetrenia: napríklad 1 až 100, s výhodou 20 až 40 dní. Takto ošetrené rastliny, prípadne ich časti sa čalej ošetrujú rovnako ako po pôsobení chemikáliami .

Dekapitačno-kalusový spôsob /dekspitácia = useknutie hlavičky alebo končeka /špičky/ alebo spätný rez/. Dekapitácia sa uskutočňuje napríklad u mladých rastlín na stonke, s výhodou na konci vegetačného kužeľa, po vytvorení 4 až 6 listov alebo aj na listových stopkách alebo bočných výhonkoch. Puky vzniknuté na poranenom pletive /kalusové pletivo/, prípadne výhonky, sa oddelia, privedú k zakoreneniu, pestujú sa číale j v črepníkoch a' rastliny prevedené na tetraploidnú formu sa selektujú rovnako ako pri pôsobení chemikálií.

Prašníková kultúra /príprava rastlín s jednoduchým počtom chromozómov z peľových váčkovs nasledujúcou spontánnou alebo umelou tetraploidizáciou/. Z kvitnúcich rastlín sa pozberajú zavreté rúrkovité kvety, ktorých prašníky /peľové váčky / sa nachádzajú v štádiu prvej mitózy peľu. Prašníky sa vyberú pomocou mikromanipulátora a prenesú do Petriho misiek, ktoré sú naplnené napríklad živným prostredím podľa Nitscha a Nitscha /tabuľka 1/. Potom sa Petriho misky uchovávajú v kultivačnom priestore 16 hodín vo dne pri teplote 28 . °C, v noci pri teplote 20 °C. Približne po 4 týždňoch začínajú prašníky pukať a rastlinky vyrastať. Tieto sú u diploidného podielu rodičov haploidné, pri tetraploidnom podieli rodičov dihaploidné: po vytvorení koreňového systému sa presadia napríklad do záhradnej pôdy a skleníku sa nechajú rozkvitnúť. Tieto /di/haploidné rastliny sú sterilné, dajú sa však ošetrením koncov výhonkov, koreňov alebo stoniek chemikáliami, ako.napríklad pôsobením kolchicínu, premeniť na polyplo- idné formy, pričom vznikajú homozygótne rastliny, ktoré je možné potom ďalej množiť semenami, CalŠí postup viď pri ošetrovaní chemikáliami, napríklad pôsobením kolchicínu.

Tabuľka 1

Živné prostredie podľa Nitscha a Nitscha /Science, 1969/ mg/1

KN0₃	950
ΝΗ.ΝΟ_ί 4 3	720
MgSO₄.7H₂O	185
CaCl₂	166
kh₂po₄	I 68
MnSO₄.4H₂O	25
h₃bo₃	1 0
ZnS0₄.7H_?0	1 0
Na₂Mo0₄.2H₂0	0,25
CuSO₄.5H₂O	0,025

ml roztoku zo 7,45 g disodnej soli kyseliny etyléndiamintetraoctovej a z 5,57 g FeSO^^HgO na 1 000 ml myo-inozit100 glycín2 kyselina nikotínová5 pyridoxín-HCl0,5 tiamín-HCl 0,'j.

Tabuíka 1 - pokračovanie mg/1 kyselina listová biotín sacharóza živná pôda hotová /DIFCO-Bacto-Agar/ kyselina indolyloctová

0,5

0,05 g

0,1 pH prostredia sa nastaví na 5,5.

Zmeraním veíkosti peíu a/alebo spočítaním chromozómov vyselektovaných tetraploidných rastlín rumančeka, ktoré môžu byť získavané vy-ššie uvedenými možnosťami, sa potom vyselektujú rastliny, ktoré majú minimálny obsah chamazulénu 100 mg% a minimálny obsah bisabololu 200 mg%, zatiaíčo obsah ostatných bisaboloidov /najmä bisabololoxidov/ má byt pod 50 mg% /vzhľadom na sušené kvety, vi3 príklad 1/.

Takto vyselektované rastliny sa po odstránaní už rozkvitnutých kvetenstiev nechajú odkvitnúť v skleníku pri teplote 18 až 24 °C vo dne a pri 12 až 14 °C v noci a dĺžke dňa minimálne 14 hodín, pričom DOČas 4 týždňov sa .zberajú'· na osivo všetky kvetenstvá, ktoré sú rozkvitnuté alebo sú pred rozpadom. Po sušení pri teplote vzduchu medzi 20 až 35 °C sa získava osivo na množenie rumančeka pódia vynálezu.

Ako óalšie kritériá tejto selekcie môžu navyše prichádzať do úvahy ešte nasledujúce:

a/ približne súčasná doba kvetu, b/ rovnomerné základné vetvenie a úzka zóna kvetov, asi 10 cm, najmä 5 cm, c/ veíké kvetenstvá s vonkajším priemerom asi 30 mm /20 až mm/, najmä 25 až 35 mm.

Použitie týchto prídavných kritérií a/, b/ a/alebo c/ vedie napríklad k vysokým výnosom kvetov a drogy a je vhodnejšie na strojový zber.

V prípade, že sa vychádza už od známych tetraploidriých rumančekov, uskutočňuje sa vyššie popísaná selekcia, ako aj prípadne čalšie kroky selekcie a množenia.

Aby sa získal rumanček, ktorý .okrem obsahu aspoň-1Q0 mg^ chamazulénu a najmenej 200 mg% (-)-elfa-bisabololu /vzhíadom na sušené kvetenstvá/ poskytuje i vysoký výnos kvetov a je vhodnejší prestrojový zber, doporučuje sa tento nostup: Vyselektované, rastliny/ ako je popísané vpredu/ sa. množia vegetatívne potápancami a sledujú sa počas 3.až 5 &enerá.c.ií, pričom sa stále robí výber podlá uvedených kritérií, prípadne i prídavných kritérií &./ až c/. Rastliny vypestované podlá týchto kritérií sa klonujú, z klonovaných rastlín sa získa osivo, z ktorého získané rastliny sa opäť selektujú podía udaného minimálneho obsahu chamazúlénu a bisabololu, ako aj áalších kritérií a/ až c/ a z posledných sa získava opäť osivo.

Sled výsev - selekcia podía vyššie uvedeného minimálneho obsahu chamazulénu 100 mg% a C-)-alfa-bisabololu najmenej 200 mg% /ostatné bisaboloidy pod 50 mg%/, ako aj podía 3al ších kritérií a/ až c/ - získavanie osiva je možné tri- až päťkrát opakovať.

Na to nadväzuje ešte jeden sled výsev -selekcia, ako je popísané predtým /prípadne klonovanie/ - získavanie osiva.

Potom získané osivo je osivo na množenie rumančeka podlá vynálezu.

Množenie pomocou potápancov sa pritom uskutočňuje nasledujúcim spôsobom: Na množenie potápancami musia východiskové rastliny /klonové materské rastliny/ vytvoriť za podmienok krátkeho dňa krátke výhonky bez púčikov. K tomu dochádza v zimnej polovici roka v skleníku bez prídavného osvetlenia alebo v klimatizačných komorách pri dĺžke dňa 6 až 10, s výhodou 8 hodín, a teplotách od 1C do 15 °C, s výhodou 12 °C. Na klonovanie, prípadne· na množenie, sú vhodné potápance z listov výhonkov a najmä krátkych výhonkov /bočných výhonkov/. K ich zakoreneniu dochádza pri teplotách 12 až 18 °C, s výhodou 15 C, a pri dĺžke dna 12 až 16, s výhodou 14 hodín, pri nasýtenej atmosfére /asi 100% relatívna vlhkosť vzduchu/. Ako substrát je možné použiť napríklad zmes rašeliny a piesku v pomere 1 : 1; vhodný je aj čistý kremenný piesok, azbestové kocky pre potápance, rašelinové kocky pre potápance a pod.

Na výsev sú pritom vhodné napríklad nasledujúce pôdy: záhradná podá, humózna stredne ťažká ílovitá pôda, ílovitá alebo humózna piesočnatá pôda. Výsev je možné uskutočniť v skleníkoch alebo aj na poli. Teploty na klíčenie a rast rastlín sa pohybujú medzi 12 až 24 °C, najmä 18 až 20 °C. Ak sa uskutoční výsev na voľnom poli, seje sa s výhodou na jeseň /september/október/ alebo skoro na jar /marec/apríl/. Tieto, termíny platia pre všetky územia prichádzajúce do úvahy pre územia pestovania /napríklad severná pologuľa, územia s miernym až subtropickým podnebím/.

Nový rumanček podľa vynálezu patrí k druhu kultúrnej rastliny rumanček pravý, botanického označenia Matricaria chamomilla L. /synonymum Chamomilla recutita /L./, Rauschert, a je definovaná údajmi o účinných látkach v bode 1 definície predmtu vynálezu. Udané hodnoty obsahov účinných látok chamazulénu, (-)-alfa-bisabololu a bisaboloidoxidov sa vzťahujú vždy na to vývojové štádium kvetov, kedy 30 až 70 najmä 40 až 60 % všetkých rúrkovitých kvetov kvetenstva je otvorených, to znamená, že kvety použité na stanovenie obsahu účinných látok boli pozberané k tomuto termínu a potom boli v skriňovej sušiarni sušené 72 hodín pri teplote 40 °C.

Ak sa zber kvetov rumančeka uskutoční v čase, kedy vývojové štádium kvetov pokročilo čalej, to znamená, kedy napríklad 100 % alebo až 100 % všetkých rúrkovitých kvetov kvetenstva je otvorených /napríklad v štádiu plného kvetu/ a/alebo pozberané kvety sa sušia pri teplote vyššej ako 40 °C, môže byť obsah účinných látok C-)-alfa-bisabololu a chamazulénu nižší, pretože pri vyšších teplotách a/alebo pri neskoršom zbere môže dochádzať k výraznejšiemu rozkladu azulénu a bisabololu.

Pod označením ‘'ostatné bisaboloidy v bode 1 definície predmetu vynálezu sa rozumie najmä: (-)-alfa-bisabololoxid A a B; (-)-alfa-bisabolonoxid A; áalšie zložky silice odrody rumančeka podľa vynálezu sú En^-In-dicykloéter, farnesen, spatulenol a v miernych koncentráciách rôzne prchavé terpénické uhľovodíky.

Napríklad kvety rumančeka podľa vynálezu sušené v sušiar ni /skriňovej/ pri teplote 40 °C /pozberané, ako je uvedené vyššie/ medzi 100 až 200 mg% chamazulénu, medzi 200 až 450 mg% (-)-alfa-bisabololu a len málo, to znamená 5 až 50 mg% ostatných bisaboloidov vzhladom na sušinu, čo znamená vzhľadom na absolútne suchú hmotnosť kvetov. Táto absolútne suchá hmotnosť sa určuje sušením pomocou separátnej vzorky kvetov rumančeka v skriňovej sušiarni pri teplote 105 C až do konštantnej hmotnosti /72 až 96 hodín/. Obsah účinných látok kvetov sušených napríklad pri teplote 35 až 50 °C /drogy/ sa prepočíta na suchú hmotnosť kvetov stanovenú pri teplote 105 °C.

Vo svojom fenotype je rumanček získaný podlá vynálezu podobný doteraz známym tetraploidným odrodám rumančeka /napríklad Bodegold, Zlotý Lan, BK-2, Pohoŕelický veľkokvetý/; líši sa od nich predovšetkým tým', že v rumančeku podľa vynálezu tvorí (-)-alfa-bisabolol hlavnú zložku silice kvetov a okrem toho obsah ostatných bisaboloidov /bisabololoxidu A a B, ako aj bisabolonoxidu/ je zreteľne nižší. Ďalšie zložky silice rumančeka sú farnesen, spatulenol a En-In-dicykloéter.

Rumanček získaný podľa vynálezu sa dá pestovať na všetkých pôdach s výnimkou pôd s obsahom viac ako 20 % organickej látky /humus s pôdne mikroorganizmy/; nie sú potrebné žiadne agrotechnické a kultivačné opatrenia; na pestovanie je nevyhnutný len dlhý deň s viac ako 13 hodinami maximálnej dĺžky dňa, to znamená pre pestovanie prichádzajú do úvahy predovšetkým mierne pásma a subtropické územia.

Rumanček získaný podľa vynálezu má obvykle ešte ďalšie výhody: vyšší výnos, stredne neskorý termín zberu, jednotnú výšku vzrastu, úzke zóny kvetov a veľké kvetenstvá; teda mimoriadnu vhodnosť na mechanizovaný zber. K tomu pribúda ešte skutočnosť, že rastliny vysiate v rovnaký čas zvyčajne kvitnú prakticky spoločne v tom istom čase, čo velmi zjednodušuje a uíahčuje zber.

Nakoniec uvedené výhody vyniknú potom, ked sa použijú nasledujúce podmienky postupu: z tetraploidných rastlín rumančeka, ktoré majú obsah chamazulénu minimálne 100 mg# a (-)-alfa-bisabololu 200 mg%, zatiaíčo obsah ostatných bisaboloidov /najmä bisabololoxidov/ je pod 50 mg% /všetky hodnoty vzhľadom na sušené kvetenstvá/ sa selektujú len tie rastliny, ' ktoré

- kvitnú približne v rovnakom čase

- majú rovnomerné základné vetvenie a úzku zónu kvetov - asi 10 cm, ako aj

- veíké kvetenstvá s vonkajším priemrom asi 30 mm.

Vyselektované rastliny sa množia vegetatívne potápancami a sledujú sa počas 3 až 5 genarácií, pričom výber sa uskutočňuje stále podía vyššie uvedených kritérií. Vybraté rastliny sa množia vegetatívne /klonujú/, nechávajú sa spoločne odkvitnúť a získava sa od nich osivo. Z osiva získané rastliny sa selektujú opäť podía vyššie uvedených kritérií a sled výsev - selekcia -získavanie osiva sa trikrát až päťkrát opakuje.

Droga pripravená z rumančeka získaného podía vynálezu má maximálny obsah účinných látok chamazulénu a (-)-alfa-bisabololu vtedy, ke<3 sa zber kvetenstvá rumančeka uskutočňuje vo vegetačnom štádiu, kedy napríklad 30 až 70 % rúrkov'Ltých kvetov, s výhodou 40 až 60 %, to znamená, že všeobecne 50 % rúrkovitých kvetov kvetenstvá je otvorených a sušenie sa uskutočňuje pri teplote vzduchu maximálne 50 C, napríklad 35 až 50 °C, najmä 40 °C.

Sušenie sa môže uskutočňovať buá privádzaným vzduchom, ale aj sušením v tieni, je však potrebné dbať na to, aby.privádzané teplo neprekročilo množstvo potrebné na dokonalé vysušenie. Je výhodné presvedčiť sa aj o dosiahnutí konštantnej hmotnosti kontrolným vážením. Sušenie je možné uskutočňovať spontánne alebo umelo /napríklad umelo ohrievaným teplým vzduchom/. Výťažok účinných látok je najväčší pri spontánnom sušení za vylúčenia slnečného svetla, s výhodou pri 40 až 60 °C, najmä pri 40 až 50 °C, Proces sušenia je treba uskutočniť čo možno najskôr po zbere. Sušenie má prebiehať v tenkých vrstvách, napríklad 5 až 20 cm, s výhodou v hrúbke 10 cm. Sušenie je možné uskutočňovať aj v dobre vetraných halách pri teplote medzi 20 až 30 °C. Teplota vzduchu na sušenie nemá byť vyššia ako 60 °C. Priaznivá je napríklad teplota medzi 35 a 50 °C.

Obsah účinných látok v droge pripravenej z rumančeka získaného podlá vynálezu, najmä hlavných účinných látok, chamazulénu a (- )-alfa-bisabololu, závisí od vegetačného štádia, v ktorom sa kvety nachádzajú v čase zberu a pred sušením pozberaných kvetov. Čím vyššia je teplota pri sušení, tým výraznejšie prebieha rozklad účinných látok, to znamená, tým nižší obsah účinných látok je v sušených kvetoch. Z rovnakého dôvodu má priame slnečné svetlo nepriaznivý vplyv a má sa mu podlá možností zabrániť. Vegetačné štádium kvetov je charakterizované tým, koíko % rúrkovitých kvetov kvetenstva je v určitom čase otvorených /tu sa mieni čas zberu/. Je možné zberať i kvety, ak je napríklad otvorených 30 až 50 &, 30 až 70 %, 40 až 60 %, 60 až 100 % alebo 90 až 100 % rúrkovitých kvetov kvetenstva. Obsah účinných látok je závislý od toho, v ktorom štádiu sa kvety vždy nachádzajú a je najvjšší, keň je otvorené 40 až 60 % všetkých rúrkovitých kvetov, a je nižší u menej alebo viac otvorených rúrkovitých kvetov kvetenstva.

Veľkou výhodou rumančeka získaného podľa vynálezu je teda to, že prebieha u neho rovnomerné odkvitanie, to znamená že prevažný počet rastlín po vysiatí vykazuje rovnaké štádium kvitnutia, Čo znamená, že napríklad u väčšiny rastlín je v rovnakom čase otvorených 40 až 60 % všetkých rúrkovitýzh kvetov. Tým je práve umožnený pri rumančeku získanom podľa vynálzu dokonalý zber kvetenstiev v optimálnom čase a tento rumanček je vhodný na mechanizovaný zber.

Vzťah obsahu chamazulénu a (-)-alfa-bisabololu k štádiu kvitnutia v čase zberu a k teplote sušenia pri získavaní drogy je uvedený napríklad v nasledujúcej tabuľke /pričom obsah ostatných bisaboloidovje vo všetkých prípadoch menší ako 50 %/.

Tabuľka

Teplota sušenia /teplota vzduchu/

Vegetačné štádium kvetov v čase zberu až 70 % všetkých 70 až 100 % všetkých rúrkovitých kvetov rúrkovitých kvezov kvekvetenstva otvorených tov kvetenstva otvorených

Pokračovanie tabuľky

Obsah účinných látok v sušenom materiáli

Obsah účinných'látok v sušenom materiáli

maximálne 50 °C	Chamazulén: najmenej 100 mg% (-) -alfa-bisabolol: najmenej 200 mg%	Chamazulén: najmenej 40 mg% (-)-alfa-bisabolol: najmenej 120 mg%
	Obsah účinných látok v alkoholovom extrakte:	Obsah účinných látok v alkoholovom extrakte:
maximálne 50 °C	Chamazulén: najmenej 5,0 mg% (-)-alfa-bisabolol: najmenej 10,0 mg%	Chamazulén: najmenej 2,0 mg% (.-) -alfa-bisabolol: najmenej 6,0 mg%
	Obsah účinných látok v sušenom materiáli;	Obsah účinných látok v sušenom materiáli:
medzi 50 až 70 °C	Chamazulén: najmenej 50 mg%	Chamazulén: najmenej 30 mg%

Teplota	Vegetačné štádium kvetov v čase zberu
sušenia /teplota	30 až 70 % všetkých	70 až 100 % všetkých
vzduchu/	rúrkovitých kvetov kve	rúrkovitých kvetov-kve-
•	tenstva otvorených	tenstva otvorených
	(-) -alfa-bisabolol:	<-?-alfa-bisabolol:
	najmenej 150 mg%	najmenej 100 mg%

medzi 50 až	Obsah účinných látok v alkoholovom extrakte:	Obsah účinných látok v alkoholovom extrakte:
70 °C	Chamazulén:	Chamazulén:
	najmenej 2,5 mg#	najmenej 1,5 mg#
	(-)-alfa-bisabolol:	(-)-alfa-bisabolol:
	najmenej 7,5 mg#	najmenej 10,0 mg#

Z toho vyplýva, že z rumančeka, ktorý sa používa na výrobu prostriedkov podľa vynálezu, napríklad pri zbere, ktorý sa koná vo vegatečnom štádiu, kedy je otvorených 30 až 100 % rúrkovitých kvetov kvetenstva a sušenie je možné uskutočňovať pri teplotách vzduchu až 70 °C, sa získava suchý materiálj ktorého obsah chámazuléhu je v každom prípade najmenej 30 mg# a ktorého obsah (-)-alfa-bisabololu je najmenej 100 mg#, zatiaľčo obsah ostatných bisaboloidov je nižší ako 50 mg%.

V alkoholových extraktoch je obsah ostatných bisaboloidov stále nižší ako 10 mg#.

Obsah silice, ktorá sa vyrába zo suchého materiálu za podmienok vo vyššie uvedenej tabuľke, je stále obsah najmenej

3,5 % chamazulénu, najmenej 10 % (-)-alfa-bisabololu a nenej ako 10 % ostatných bisaboloidov.

Stanovenie (-)-alfa-bisabololu, ako aj ostatných obsahových látok k rumančeku prebieha obvyklým plynovo-chromatografickým spôsobom.

Presný spôsob analytického stanovenia obsahuje príloha A /za[textom príkladu Č. 4/.

I

Účinná látka chamazulén sa nenachádza v kvetoch rumančeka ako taká, ale vo forme seskviterpénického laktónu matricínu.

Matricín vykazuje farmakologickú účinnosť blízku chamazulénu. Z tohto prekurzora vzniká matricín napríklad pri zohriatí /napríklad destiláciou vodnou parou pri príprave nálevu čaju/ okamžite chamazulén. U rumančeka je teda obvyklé neudávať obsah matricínu, ale obsah z neho sa vytvárajúceho chamazulénu.

Možnosti použitia rumančeka získaného podlá vynálezu sú nasledujúce: Získavanie drogy rumančeka, rumančekovej silice, rumančekových extraktov, ako, aj (,-)-alfa-bisabololu, chamazulénu a ostatných obsahových látok rumančeka. Tak napríklad je možné z ,drogy získavanej z rumančeka pódia vynálezu napríklad extrakciou alkoholom, prípadne vodno-alkoholovou zmesou, alebo extrakciou pomocou nadkritických plynov získať rumančekové výťažky, prípadne extrakty. Ďalej je možné získať z drogy rumančekovú silicu, í-)-alfa-bisabolol, chamzulén a ostatné obsahové látky rumančeka.

Alkoholové výťažky drogy obsahujú napríklad najmenej 1,5 mg%, s výhodou 5,0 mg% chamazulénu a najmenej 5,0 mg%, s výhodou najmenej 10 mg% -alfa-bisabololu v alkoholovom výťažku drogy a menej ako 8 mg % ostatných bisaboloidov. Výroba takých výťažkov sa uskutočňuje obvyklým spôsobom.

Na extrakciu je možné použiť napríklad prístrojové zariadenie, napríklad takzvané korýtkové miešačky, perkolátory a iné vhodné extrakčné zariadenia. Teplota počas extrakcií¹ je napríklad 1 0 až 50 °C. Chladenie nie je nutné.

Ako rozpúšťadlá prichádzajú do úvahy najmä priame alebo rozvetvené alifatické jedno- alebo viacsýtne alkoholy s 1 až 6 atómami uhlíka, ako napríklad metanol, etanol, 2-propanol, butanol, glycerol, izopropylidénglycerol a áalšie, ako aj zmes týchto rozpúšťadiel s vodou.

Jé možné používať aj zmesi týchto rozpúšťadiel. Minimálne množstvo rozpúšťadla sú 2 diely rozpúšťadla na 1 diel sušeného materiálu. Obvykle sa používa 2 až 20 dielov rozpuš- ťadla na 1 diel sušeného materiálu, najmä 3 až 10 dielov rozpúšťadla na 1 diel sušeného materiálu.

Na výrobu extraktov, najmä alkoholových extraktov, sa dajú používať aj 'čerstvé kvety rumančeka, prípadne zmrazené kvety rumančeka /v prípade, že čerstvé kvety boli zmrazené/.

Silica pripravená z drogy obsahuje najmenej 3,5 % chamazulénu, s výhodou najmenej 5 % chamazulénu a najmenej 10 % (-)-alfa-bisabololu a menej ako 10 % ostatných bisaboloLdov.

Výroba takej silice sa uskutočňuje zvyčajne tak, že sa droga zohreje s vodou, prípadne v prítomnosti kyseliny askorbovej /napríklad vo forme soli, najmä sodnej soli kyseliny askorbovej/ do varu pri hodnote pH medzi 4 a 6, s výhodou 5 až 5,5. Hodnota pH sa nastavuje pomocou kyseliny, napríklad kyseliny chlorovodíkovej. Na jeden hmotnostný diel sušeného materiálu sa používa napríklad 10 až 50 hmotnostných dielov vody a prípadne 0,1 až 1 hmotnostný diel kyseliny askorbovej.

Zohrievanie sa uskutočňuje 2 až 8 hodín.

- 27 Získaný vodný destilát sa opakovane pretrepe s nižším alifatickým kvapalným uhľovodíkom, ako je petroléter /napríklad s teplotou varu 35 až 60 °/, pentánom, xylénom, dekalínom, organická fáza sa suší /napríklad nad síranom sodným/, a organické rozpúšťadlo sa odstráni šetrným spôsobom /napríklad oddestilovaním na rotačnej odparke alebo destiláciou pri 40 až 70 °C, s výhodou pri teplote 50 až 60 °C/. V prípade rozpúšťadiel s vyššou teplotou varu sa toto oddestilovanie uskutočňuje vo vákuu;

Stanovenie obsahových látok sa uskutočňuje tak, ako bolo predtým uvedené.

Keň sa kvety rumančeka zberajú vo vegetačnom štádiu, kedy je 30 až 100 % rúrkovitých kvetov kvetenstva otvorených, a kvety sa sušia pri teplote vzduchu až do 70 °C, potom získaná droga obsahuje najmenej 30 mg% chamazulénu, najmenej 100 mg% ŕ-) -alfa-bisabololu a menej ako 50 ostatných bisaboloidov a silica získaná destiláciou vodnou parou z tejto drogy obsahovala najmenej 3,5 % chamazulénu, najmenej 10 % (-3alfa-bisabololu a menej ako 10 mg% ostatných bisaboloidov a alkoholový výťažok pripravený extrakciou s nižšími alkanolmi obsahuje najmenej 1,5 % chamazulénu, najmenej 5,0 mg% C-)-alfa-bisabololu a menej ako 10 mg% ostatných bisaboloidov.

Keň sa kvety rumančeka zberajú vo vegetačnom Štádiu, kedy je otvorených 30 až 70 % rúrkovitých kvetov a kvety sa sušia pri teplote maximálne 50 °C, potom taká droga obsahuje napríklad 100 mg% chamazulénu, najmenej 200 mg% (-)-alfa-bisabololu a menej ako 50 mg% ostatných bisaboloidov a z nej pripravená silica obsahuje najmenej 3,5 % chamazulénu, najmenej 10 mg% ostatných bisaboloidov, a alkoholový výťažok rumančeka vyrobený pomocou nižších alkoholov obsahuje 1,5 mg% chamazulénu, 5,0 mg% (-)-alfa-bisabololu a 10 mg% ostatných bisaboloidov.

Ak sa kvety; rumančeka zberajú vo vegetačnom štádiu, kedy je 30 až 70 % rúrkovitých kvetov kvetenstva otvorených a kvety sú sušené pri teplote vzduchu medzi 50 až 70 °C, potom získaná droga obsahuje napríklad najmenej 50 mg% chamazulénu, najmenej 150 mg% (-)-alfa-bisabololu a menej ako 50 mg% ostatných bisaboloidov, a z nej pripravená silica obsahuje najmenej 3,5 % chamazulénu, najmenej 10 % 6->-alfa-bisabololu a menej ako 10 % ostatných bisaboloidov a z toho pripravený alkoholový výťažok obsahuje najmenej 2,5 mg% chamazulénu, najmenej 7,5 mg% (-)-alfa-bisabololu a menej ako 10,0 mg% ostatných bisaboloidov.

Ak sa kvety rumančeka zberajú vo vegetačnom štádiu, kedy 70 až 100 % rúrkovitých kvetov je otvorených a kvety sa sušia pri teplote vzduchu medzi 50 až 70 °C, potom obsahuje takto získaná droga napríklad najmenej 30 mg% chamazulénu, najmenej 100 mg% (-)-alfa-bisabololu a menej ako 50 tngfr ostatných bisaboloidov, z nej prípadne pripravená silica obsahuje najmenej 3,5 % chamazulénu, najmenej 10 % q-)-alfa-bissbololu a menej ako 10 % ostatných bisaboloidov a alkoholový výťažok pripravený z tejto drogy obsahuje menajmenej 1 ,5 % chaciazulénu, najmenej 10 mg% (-)-alfa-bisabololu a menej ako 10,0 mg% ostatných bisaboloidov.

- 29 Príklady uskutočnenia

Príklad - 1 /Východiskový rumanček je tetraploidný/

Testom variability jednotlivých rastlín z počtu 10 000 rastlín tetraploidnej odrody rumančeka, ktorá bola popísaná

I. Sarkányom /Herba Hungar. 4/1/, 125 až 169 /1965// sa zistilo, že asi na 1 000 jedincov pripadá jedna rastlina, ktorá má v silici vysoký obsah chamazulénu, ktorý predstavuje 20 hmotnostných %, ako aj vysoký obsah (-) -alfa-bisabololu, pričom súčasne obsah ostatných bisaboloidov, najmä ί-7-alfabisabolonoxidu je veľmi nízky /menej ako 5 % hmotnostných/. Jedince boli vybraté a podrobené nasledujúcim stupňom:

Stupeň 1:

Z potomstva /ako je popísané vpredu/ vyselektovaných tetraploidných rastlín rumančeka boli vybraté tie jedince, ktoré

A/ kvitnú v približne rovnakom čase,

B/ majú rovnomerné základné vetvenie a úzku zónu kvetu, asi cm, s výhodou 5 cm,

C/ majú veľké kvetenstvá s vonkajším priemerom asi 30 mm, s výhodou 25 až 35 mm,

D/ dosahujú, alebo prekračujú minimálny obsah chamazulénu

150 mg% a bisabololu 300 mg% a ich obsah ostatných bisabo- 30 loidov /najmä bisabololoxidov/ leží zreteľne pod 50 mg. /Všetky hodnoty sa vzťahujú na kvetenstvá, ktoré boli sušené pri teplote 40 °C a ich zber sa uskutočnil v štádiu, kedy 30 až 70·% všetkých rúrkovitých kvetov kvetenstjev je otvorených./

Tieto rastliny boli klonované. K tomu boli rastliny /klonované materské rastliny/ zrezané na cca 15 cm dĺžky výhonkov, pri 8 až 10 hodinách dĺžky dňa a pri teplotách 12 až 14 °C privedené k vytvoreniu nových výhonkov /krátke bočné výhonky/. Tieto krátke výhonky sa orezali a zasadili do zmesi rašeliny a piesku. Zakorenenie sadeníc /potápancov/ pri 100% relatívnej vlhkosti a dĺžke dňa 14 hodín trvalo 7 až 14 dní.

| t

Namiesto uvedeného klonovania /množenia sadenicami/ bolo použité aj in vitro množenie pletivových partií rastliny schopných delenia /takzvané meristémové delenie/. Na etablovanie kultúry rumančeka sú vhodné rôzne časti rastlín, s výhodou konce výhonov alebo púčiky pazúch.

Po opláchnutí rastlín pomocou sa za aseptických podmienok v laminárnom prúdení /vysokovýkonný filter s vytesňovacím prúdom nízkej turbulencie/ odoberú končeky výhonkov alebo pazušné listové púčiky a prenesú sa do reagenčných ných nádobiek so živným prostredím, napríklad podľa Murashiga a Skooga /Physiol. Plent. 15, 473 - 497, 1962/. Reagenčné nádobky sa postavia do klimatizovaného priestoru na 12 - 18, s výhodou 16 hodín dĺžky dňa /dosiahnuté fluorescenčnými žiarivkami/ za intenzity osveťleniajôOO až 1 000 luxov, s výhodou 1 000 až 3 000 luxov a teploty 15 až 30 °C, s výhodou 22 až 27 °C. Akonáhle je zrejmé, že explanáty dobre rastú, prenesú sa na vyššie uvedené živné prostredie, avšak s vyŠ- 31 šou koncentráciou cytokinínu* /napríklad 30 mg/1 6-izopentenyladenín/ a s malým množstvom alebo ú phe bez auxínu /0 až 0,3 mg/1 kyselina indolyloctová/. Nasleduje rast stoniek /os/ a tvoria sa edventívne orgány, ako aj množenie pazušných púčikov. Tieto sa-dajú vyššie uvedeným spôsobom odoberať a pestovať. '

Na množenie rastlín vo väčšom počte určené, explanáty /tretej pasáže, t.j. 3· rozmnožovacej generácie/ sa po náraste a vytvorení listov na prvom uvedenom živnom prostredí prenesú na živnú pôdu, ktorá obsahuje 10 mg/1 kyseliny indolyloctovej alebo 3-indolylmaslovej alebo 0,1 až 0,3 mg/1 kyseliny ot-naf tyloctove j. Pritom sa rastliny, zakoreňujú} po asi 4 týždňoch je možné ich pestovať Čalej v sterilizovanej záhradnej pôde /sparenej počas 12 hodín pri teplote 120 °C/ v kvetináčikoch a v skleníku /za podmienok obvyklých pre sadenice/.

- 32 Živné prostredie podľa Murashigu a Skooga:

' tng/1

NH.NO. 4 3	400
Ca/NO₃/₂.4H₂O	144
kno₃	80
kh₂po₄	12,5
MgS0₄.7H₂0	72
KC1	65
NaFe-EDTA	25
h₃bo₃	1 ,6
MnS0₄.4H₂0	6,5
ZnS0₄.7H₂0	2,7
KI	0,75
kyselina indolyloctová	2,0
furfuryladenín	0,1
tiamín	0,1
kyselina nikotínová	0,5
pyridoxín	0,5
glycín	2,0
myo-inozit	1 00
kyselinový hydrolyzát	1 000
sacharóza	2 %
Čistený agarový prášok	1 %

Poznámka k predchádzajúcemu výkladu vyššie:

* Cytokiníny sú fytohornóny, ktoré podporujú delenie buniek.

Stupeň 2:

Rastliny získané postupom pódia stupňa 1 kvitli spoločne za izolovaných podmienok v skleníku. Rastliny pritom stáli v 1 1 cm kvetináčoch naplnených záhradnou zeminou pri teplotách 18 až 24 °C vo dne a 12 až 14 °C v noci. DÍžka dňa bola najmenej 14 hodín a v zimnej polovici roka sa dosahovala prídavným osvetlením 200 Watt/m^. Voda sa dodávala podlá potreby.

Z celkového množstva selektovaných jedincov boli v časovom rozmedzí 4 týždňov plynulé zberané za účelom získania osiva tie kvetenstvá, ktoré rozkvitli a boli krátko pred rozpadom. Sušenie prebiehalo v dobre vetranej hale pri teplote vzduchu medzi 20 a 30 °C; potom sa osivo preosialo cez sito /5 x 0,4 mm/ a prečistilo pomocou presievacieho stroja.

Stupeň 3:

Z osiva získaného postupom podía stupňa 2 sa zobrala náhodná vzorke a z nej sa vypestovalo asi 2 000 kusov potomstva /ekologické podmienky ako v stupni 2/ a podlá rovnakých kritérií A/ až D/ stupňa 1 selektovalo. S takto selektovanými jedincami sa postupovalo postupom podľa stupňa 2.

Stupeň 4:

Z osiva podľa stupňa 3 sa vysial diel na jeseň na dvoch rôznych stanovištiach.

- 34 Stanovište 1/

450 m NN, 48,5° N/11,5 °0

750 mm celkových-ročných zrážok, vlhká mierna klíma, január -10 až 0 °C, júl +10 až 20 °C;

Vysvetlenie skratiek:

NN = severná výška nad morom °N = severná šírka /n-stupeň/ °0 = východná dĺžka /n-stupeň/.

Stanovište II/

200m NN, 42 °N/1°O,

400 mm celkových ročných zrážok, stredozemná klíma, január 0 až +10 °C, júl +20 až +30 °C.

Výsev sa uskutočnil na obidvoch stanovištiach v čase koniec septembra/začiatok októbra.

Takto získané výsledky poíného pokusu sa preskúšali a posúdili /bonitovali/ z híadiska homogénneho rastu, veíkosti kvetov a termínu zberu, okrem toho sa skúmali náhodné vzorky kvetov na obsah účinných látok. Z poíného pokusu sa opSí selektovali jedince, ktoré zodpovedajú uvedeným parametrom zo stupňa 1. Z týchto sa získalo osivo zodpovedajúce stupňu

2.

Stupeň 5:

S osivom podía stupňa 4 sa opakovali stupne 3 s 4 v udanom slede a postupe.

Stupeň 6:

Z osiva získaného-podía,stupňa .5 sa vypestovalo asi

50C jedincov /ekologické podmienky ako v stupni 2/ a podía rovnakého princípu ako v stupni 1 sa selektovalo. Z takto vyselektovaných rastlín sa vybralo 34 jedincov a klonovalo podie stupňa 1. Vždy 10 rastlín každého klonu sa pestovalo v náhodnom rozdelení vo vzdialenosti 40 x 30 cm volne na poli /stanovište I, viň stupeň 4/ na izolovanom mieste. Pôdou priepustný íl s hodnotou pH 7,0; pestovanie bolo uskutočnené začiatkom júna, prvý zber uprostred júla, potom sa rastliny zrezali, kvitli znovu a poskytli druhý zber osiva od stredu do konca augusta.

Získanie osiva z tohto materiálu sa uskutočnilo postupom ako v stupni 2.

Osivo získané podía stupňa 6 je osivo na množenie rumančeka podía vynálezu.

Kvety rastlín z tohto osiva na množenie /výsev september/október, zber na začiatku júna nasledujúceho roka/, ktoré -sú pozberané v čase, kedy 30 až 70 % rúrkovitých kvetov je otvorených a potom ihneá sušené pri teplote 40 °C v skriňovej sušiarni 72 hodín, obsahujú vzhíadom na hmotnosť sušených kvetov /sušina/ napríklad minimálne : 150 mg% chama zulénu, 300 mg% (-)-alfa-bisabololu a maximálne 50 mg% ostatných bisaboloidov.

Ďalšie príkladné údaje k rastlinám získaným podľa vynálezu:

1. Rast

Stonka: priama, málo vetvená

2. Olistenie:

List: 2 a 3x perovito zložený

Sila: stredná perovito zložený list, farba stredne zelená perovito zložený list /stred stonky/; perovité zloženie; stredne až silno perovito zložený.

3. Kvetenstvo

Kvetné hlavičky /kvetenstvá/: vonkajší priemer asi 30 mm, vnútorný priemer asi 15 am;

Hmotnosť jednotlivého kvetenstva /sušeného/:

asi 45 mg;

Kvetný výhonok, dĺžka /mm/: asi 700, avšak závislá od lokality pestovania /klíma/, času výsevu, pôdy, hnojenia, ošetrenia rastlín, počasia;

Počiatok kvitnutia /počítané od 1. januára/:

asi 160. deň /výsev september, stanovište Freising,

Ňemecká/spolková republika, inak závislé od vyššie uvedených faktorov/.

- 37 Kvety: stred júna /viet vyššie/;

Kvetenstvo bez stonky, obsah silice /% sušiny/: asi 1,0%;

obsah azulénu v silici: minimálne 15

Rozpad sušených kvetenstiev, kvetovej drogy: nepatrný, ak bol zber uskutočnený pred otvorením posledných rúrkovitých kvetovPriemer peíu: asi 30 p®;

DÍžka semena: asi 1 ,25 mtn;

Počet chromozómov v somatických bunkách: 4n = 36.

4. Plod hmotnosť 1 000 semien /TKM/: 0,06 až 0,13 g;

5. Klíčivosť /KF/ asi 75

6. Čistota až 95 %.

7. Ďalšie znaky

Pomer usušenia kvetov čerstvých:suchým = 5,5 až 6 : 1, charakteristická vôňa drogy, jemne aromatická, typická chuť čajového nálevu.

Okrem toho môžu existovať nasledujúce vlastnosti:

Jednotný výškový -.rast /vyrovnanosť/ s úzkou kvetnou zónou, teda obzvlášť vhodný na mechanizovaný zber, velké kvetné košíčky /kvetenstvá/, stredne vysoký výnos; základne vetvená forma /troj- až päťnásobne/.

Získavanie drogy:

Rumanček získaný podľa tohto príkladu sa vyseje obvyklým spôsobom na poli. Akonáhle sa rastliny vyvinú a kvotenstvo je vo vegetačnom Štádiu, kedy je otvorených asi 50 % rúrkovitých kvetov, zberá sa rumanček strojom na zber rumančeka, pričom vzdialenosti hrebeňov zberového, stroja sú nastavené tak, aby sa zberali len kvetenstvá, ktorých rúbkovité kvety sú otvorené na 50 %. Úroda sa pokiaľ možno čo najrýchlejšie dopraví na tienisté miesto a tam sa až do ďalšieho spracovania rozprestrie v tenkej vrstve. Potom sa kvetenstvá odstránia pomocou sitového zariadenia od byli· . a sušia sa až po konštantnú hmotnosť. Strata hmotnosti je asi 80 %. Sušenie prebieha v tieni na dobre vetranom mieste vo vrstve s hrúbkou asi 10 cm.

Po uplynutí, približne 2 až 3 dní je sušenie ukončené. Na odstránenie častí bylí a kvetného odoadu sa rumanČeková droga preosieva a lisuje do balíkov.

Analýza silica: . >960 mg% chamazulén; 162 mg% (-)-alfa-bisabolol 330 mg%.

Ak sa sušenie uskutočňuje napríklad v stacionárnej pásovej sušičke pomocou umelo zohrievaného vzduchu pri teplote medzi 50 a 70 °C, potom je sušenie skončené asi po 4 až 5 hodinách. Na odtránenie častí bylí a kvetového odpadu sa droga preosieva a potom lisuje do balíkov. Hodnoty analýzy takej drogy sú nasledujúce:

- 39 silica :

(-)-alfa-bisabolol: chamazulén:

870 mg%

197 tng% 94 mg%.

Príklad 2 /Východiskový rumanček je tetrápioidný/

Testom variability jednotlivých rastlín, uskutočneným na 10 000 rastlinách tetraploidnej odrody rumančeka podía I. Sarkányho /Herba Hungar. 4, 1, 125 - 169, 1965/ sa zistilo, že na asi 1 000 jedincov pripadá jedna rastlina, ktorá má v silici vysoký obsah chamazulénu: 20 % hmôt., ako aj vysoký obsah (-)-alfa-bisabololu: 50 % hmôt., pričom zároveň obsah ostatných bisaboloidov, najmä. (-) -alfa-bisabolonoxidu je velmi nepatrný /menej ako 5 % hmôt./.

Tieto jedince boli vyselektované a podrobené nasledujúcim stupňom:

Stupeň 1 :

Z potomstva vyššie popísaných vyselektovaných tetraploidných rumančekových rastlín sa vybrali také jedince, ktoré dosahujú minimálny obsah chamazulénu 100 mg% a (.-) -alfa-bisabololu 200 mg%, alebo ich prekračujú a u ktorých obsah ostatných bisaboloidov /najmä bisabololoxidov/ je pod 50 mg%. Všetky hodnoty sa vzťahujú na kvetenstvá, ktoré boli sušené pri asi 40 °C a ktorých zber sa uskutočnil v štádiu, kedy asi 30 až 70 % všetkých rúrkovitých kvetov kvetenstiev bolo otvorených.

Stupeň 2:

Z rastlín získaných pódia stupňa 1 boli odstránené všetky rozkvitnuté kvetné hlavičky /kvetenstvá/, potom boli v skleníku a odkvitli za izolovaných podmienok spojJLočne. Rastliny pritom stáli v 11-centimetrových kvetináčoch naplnených záhradnou zeminou, pri dennej teplote 18 až 24 C a pri nočnej teplote 12 až 14 °C. DÍžka dňa bola minimálne 14 hodín a dosahovala sa v zimnom polroku prídavným osvetlením 200 W/m . Voda sa dodávala pódia potreby.

Z celkového súhrnu selektovaným jedincov boli priebežne v období 4 týždňov zberané za účelom získania osiva tie kvetenstvá, ktoré boli rozkvitnuté a boli krátko pred rozpadnutím. Sušenie sa sukutočňovalo v dobre prevetrávanej dvorane /hale/ pri teplote vzduchu medzi 20 a 30 °C; potom sa osivo preosievalo pomocou štrbinového sita /5 x 0,4 mm/ a ďalej prečíslovalo na trepacom osievadle.

Stupeň 2 poskytuje osivo, ktoré je osivom na množenie rumančeka pre postupy pódia vynálezu.

Kvety z rastlín z tohto rozmnožovacieho osiva /výsev september-október, zber začiatkom júna nasledujúceho roka/, ktoré sú zberané v tom období, kedy je otvorených 30 ε,ζ 70 % rúrkovitých kvetov a ktoré ihneď potom boli sušené v skriňovej sušiarni pri teplote 40 °C 72 hodín, obsahujú vzhľadom na hmotnosť usušených kvetov najmenej 100 mg% chamazulénu, najmenej 200 mg% <-)-alfa-bisabololu a nanajvýš 50 mg# ostatných bisaboloidov.

Získavanie drogy:

Rumanček získaný podľa tohto príkladu sa vysieva obvyk lým spôsobom na poli. Akonáhle sa rastliny vyvinú a kvetena — stvá sú vo vegetačnom štádiu, kedy je asi 50 % rúrkovitých kvetov otvorených, zberajú sa tieto kvetenstvá pomocou zberového stroja na rumanček, pričom vzdialenosti hrebeňov zberového stroja sú nastavené tak, aby boli odtrhávané len tie kvetpé hlavičky /kvetenstvá/, ktorých rúrkovité kvety sú otvorené na 50 %. Zberaný materiál sa dopraví čo najrýchlejšie do tienistého miesta a tam sa až do čalšieho spracovania rozostrie v tenkej vrstve. V následnej operácii sa kvetné hlavičky /kvetenstvá/ v odsievacom zariadení zbavia stoniek a sušia sa až po dosiahnutie ustálenej hmotnosti. Strata -hmotnosti je asi 80 %. Sušenie sa uskutočňuje v tieni na dobre vetranom mieste na plošinách s hrúbkou vrstiev asi 10 cm.

Asi po 2 až·3 dňoch je sušenie ukončené. Kvôli odstrá-

neniu stonkových častí ga preosieva na sitách	a kvetového odpadu sa rumančeková dro-
a v	zápfití sa lisuje do balíkov.
Analýza:
silica:	940	□g%
chamzulén:	132	mg%
(-)-alfa-bisabolol:	243	mg%.

Ak sa sušenie uskutočňuje napríklad v stacionárnom pásovom sušiacom zariadení pomocou umelo zohrievaného vzduchu pri teplote madzi 50 a 70 °C, potom sa sušenie ukončí asi po štyroch až piatich hodinách. Kvôli odstráneniu časti stoniek a kvetového prachu sa droga preosieva na sitách a v_zápätí nato sa lisuje do balíkov.

Hodnoty zistené analýzou takej drogy sú napríklad nasledujúce: :

silica:

chamazulén (-)-alfa-bisabolol

775 tng% mg%

163 mg%.

Príklad 3 /Východiskový rumanček je diploidný/

Pomocou testov variability jednotlivých diploidných rastlín rumančekov, obsahujúcich malé množstvo bisabololu, avšak nie bez bisabololu, ktoré sú popísané Ch. Franzom a J. Häzlom a A. VOmelom a Acta Eorticulturae 73, 109 - 114 /1978/ sa zistilo, že maximálne až 20 % všetkých rast.Lín má v silici obsah asi 20'hmotnostných % a/alebo vysoký obsah 50 hmotnostných % (-)-alfa-bisabololu, pričom súčasne obsah ostatných bisaboloidov /najmä č-J-alfa-bisaboloňoxidu/ je veimi nízky. Tieto jedince boli vyselektované a nasledujúcim spôsobom tetraploidizované:

Semená takto vyselektovaných rastlín rumančeka sa naniesli na filtračný papier napustený 0,05% vodným roztokom kolchicínu a ponechali napučiavať 6 hodín. Potom sa odstránili z filtračného papiera, niekoľkokrát premyli vodou a vysiali do liesok v skleníku. Pôda: zmes rašeliny a piesku v oomere 1:1, teplota: 18 až 20 °C, realtívna vlhkosť: asi 63 %, dĺžka dňa pri umelom osvetlení: 14 hodín.

Klíčiace rastliny sa pozorovali až do doby kvetu, úspech, polyploidizácie sa vyhodnocoval pomocou porovnávacieho merania veíkosti peíu a semien, ako aj pódia počtu chromozómov rastlín /F^-potomstvo = prvé potomstvo vypestované zo’ semien, ktoré bolo potvrdené ako tetraplidné kolchicínované rastliny/.

Tetraploidizáciu je možné uskutočňovať aj nasledujúcim spôsobom:

Na vodou navlhčenom filtračnom papieri vyklíčené päť- až sedemdňové dobré vyvinuté rastlinky rumančeka sa postavili pri teplote miestnosti /20 °C/ na 4 až 6 hodín zárodkovými listami smerom dolu do 0,05% roztoku kolchicínu. Pritom boli ošetrené citlivé klíčkové korene, aby sa na nich zabránilo škodám, pri sušení musí okolitá atmosféra obsahovať približne 100 % realtívnej vzdušnej vlhkosti. Po ošetrení sa klíčiace sadenice viackrát omyli vodou a pikírovali do liesok. Nasledovalo Óalšie ošetrenie ako pri semenách.

Veíkosť peíu sa merala pomocou Leitzovho binokulárneho mikroskopu s mikrometrickým meracím okulárom a mikrometrickým nosičom predmetu.

Počítanie chromozómov sa uskutočňuje na špičkách koreňov: Z mladých rastlín vypestovaných v skleníku alebo z potápancov sa odobrali 1 až 2 cm dlhé čerstvé koreňové konce a ponorili na 5 hodín do 0,002 molového roztoku hydroxycholínu a potom vložili na 15 minút do 1N HC1. Na vyše.trenie sa 'asi 1 mm koreňového vrcholu zafarbí 2% roztokom orceín kyselina octová a pomocou mikroskopu sa vyšetrí v olejovej imerzii. V bunkách nachádzajúcich sa v mitóze sa tak dá stanoviť štvornásobný počet chromozómov /somatických buniek /4n = 36/.

Tie rastliny, u ktorých je priemer peíu cca o 50 % 'väčší ako _u diploidného východiskového materiálu /cca 30 namiesto 20 pm/ a u tých, kde bol počet chromozómov zdvojnásobený na 3.6 /u diploidného východiskového materiálu je zodpo44 vedajúce číslo 18/, sú tetraploidné. Tieto sa vyselektujú. Približne 0,1 až 0,5 # semien, prípadne klíčiacich sadeníc, sa vyššie uvedeným spôsobom tetraploidizovalo a rozvíjali sa kvetaschopné intaktné rastliny. Teraz nadväzujú stupne 1 a 2 zodpovedajúce príkladu 2.

Kvety takto získaného rumančeka obsahujú napríklad najmenej 100 mg# chamazulénu, 200 mg# (-)-alfa-bisabololu a najviac 50 mg# ostatných bisaboloidov /zber uskutočnený v čase, kedy 30 až 70 # všetkých rúrkovitých kvetovfje otvorených a sušené 72-hodinovým sušením v sušiarni pri teplote 40 °C/.

I

Získavanie drogy:

Rumanček získaný podľa tohto príkladu sa vyseje zvyčajným spôsobom na poli. Kečí sa rastliny rozvinú a kvetenstvá sú vo vegetačnom štádiu, kedy je asi 50 # rúrkovitých kvetov otvorených, zberajú sa tieto kvetenstÝá mechanizované, pričom vzdialenosti hrebeňov zberového stroja sú volené tak, aby sa trhali len tie kvetenstvá, ktorých rúrkovité kvety sú otvorené na 50 #. Pozberaný materiál sa pokiaľ možno rýchlo prenesie na tienisté miesto a tam sa rozostrie v tenkej vrstve až do ďalšieho spracovania. Potom sa kvetenstvá zbavia sitovaním zvyškov stoniek a sušia sa až po dosiahnutie konštantnej hmotnosti. Strata hmotnosti je asi 80 %. Sušenie prebieha v tieni na dobre vetranom miesta vo vrstve s hrúbkou asi 10 cm.

Sušenie je asi po 2 až 3 dňoch ukončené.

Kvôli odstráneniu zvyškov stoniek a kvetového odpadu sa droga preosieva a potom lisuje do balíkov.

Analýza :

silica chamazulén (-) -alfa-bisabolol

910 mg%

117 mg%

252 mg%

Príklad 4 /Východiskový rumanček je diploidný/

Pomocou testu variability jednotlivých diploidných rumančekov obsahujúcich len malé množstvo bisabololu, avšak nie bez bisabololu, popísaných Ch. Franzom, J. Häzlom a A. Vämelom v Acta Horticulturae 73, 109 - 11 /1978/ sa zistilo, že maximálne 20 % všetkých jedincov má v silici obsah chamazulénu asi 20 % hmotnostných a/alebo vysoký obsah č-J-alfabisabololu 50 % hmotnostných, pričom súčasne obsah ostatných bisaboloidov,/najmä(-)-alfa-bisabolonoxidu/ je veími malý. Tieto jedince sa selektujú a presne tak, ako je uvedené v príklade 3, sa tetraploidizujú a tetraploidné jedince sa vyselektujú. Asi 0,1 až 0,5 % semien, prípadne sadeníc, sa tetraploidizovalo a vyvinulo kvetaschopné intaktné rastliny.

fialej nadväzujú napríklad stupne 1 až 6,zodpovedájúce príkladu 1.

Kvety takto záskaného rumančeka obsahujú napríklad najmenej 150 mg% chamazulénu, 300 mg% C-)-alfa-bisabololu a nanajvýš 50 mg% ostatných bisaboloidov ./zber v čase, kedy je otvorených 30 až 70 % rúrkovitých kvetov a potom 72-hodinové sušenie v skriňovej sušiarni pri .teplote 40 C/. .

- 46 Ostatné vlastnosti zodpovedajú rumančeku získanému podía príkladu 1.

Získavanie drogy:

Rumanček získaný podía tohto príkladu sa vyšeje.obvyklým spôsobom na poli. Akonáhle sa rastliny vyvinú a kveten-’ stvá sú vo vegetačnom ,'štádiu, kedy je otvorených asi '50 % rúrkovitých kvetov, tieto kvetenstvá sa zberajú zberovým strojom, pričom vzdialenosti hrebeňov sú nastavené tak, aby sa :trhali len tie kvetenstvá, ktorých rúrkovité kvety sú otvorené na 50 %. Úroda sa prepraví čo najrýchlejšie nia tienisté miesto a tam sa rozostrie v tenkej vrstve až do ďalšieho spracovania. Potom sa kvetenstvá zbavujú zvyškov stoniek preosievaním a sušia sa až po dosiahnutie konštantnej hmotnosti. Strata hmotnosti je asi 80 %. Sušenie sa uskutočňuje v tieni na dobre vetranom mieste vo .vrstve s hrúbkou asi

0 cm.

Po asi 2 až 3 dňoch je sušenie ukončené, rumančeková droga sa preosieva za účelom odstránenia zvyškov stoniek a kvetového odpadu a potom sa lisuje do balíkov.

Analýza:

silica 1020 mg% cham^ulén 173 mg% (-)-alfa-bisabolol 418 mg%

Príloha A

Východiskovým materiálom je droga z rumančeka získaného, podía vynálezu. Pri výrobe drogy sa používajú len tie kveten- 47 stvá, ktorých 30 až 70, najmä 40 až 60 % rúrkovitých kvetov je otvorených. Sušenie sa uskutočňuje v skriňovej sušiarni 72 hodín pri teplote 40 °C. Silica rumančekových kvetov sa získava, ako bude popísané áalej, dvojhodinovou destiláciou drogy vodnou parou:

2,0 g nerozdrobenej drogy sa zmiešajú v litrovej guľatej banke s 250 ml odsolenej vody a podrobia sa destilácii na Clevengerovom refluxnom zariadení /aparatúra na destiláciu vodnou parou/ pre kvantitatívne vyhodnotenie malých množstiev silíc. Ako predloha slúži 1 ml pentánu s čistotou pre analýzu. Rýchlosť varu pod spätným chladičom /rýchlosť refluxovania/je 40+4 kvapky za minútu. Po skončení destilácie sa v pentáne rozpustená silica, pokiaľ možno bezvodá, vypustí do skúmaviek a silica, prípadne prilipnutá v aparatúre, sa opláchne do čalšieho množstva,pentánu. Na odstránenie prípadných zvyškov vody sa pridá k roztoku malé množstvo /na špičku lyžičky/ bezvodého síranu sodného a roztok sa potom

odparení pentánu pri teplote 40 °C na vodnom kúpeli a dosušení v exsikátore sa množstvo silice stanoví gravimetrický.

V takto získanej silici /asi 20 mg/ sa potom stanoví chamazulén a bisabolol.

Spektrálne fotometrické stanovenie chamazulénu

Merný roztok: Celé množstvo silice, získané z 2 g drogy /asi 20 mg/, získanej, ako bolo popísané hore sa rozpustí v 25 ml n-hexánu alebo.cyklohexánu

Meracie zariadenie: Fotometer s filtrom /napríklad Eppen-'.

dorf/.

Vlnová dĺžka:

578 nm

Kyveta:

I

Špecifická extinkcia cm chamazulénu /1 g/100 ml; 1 cm/: 20,8

Kompenzačná kvapalina: n-hexán alebo cyklohexán

Nájdený obsah:

v ^{1 20 E}578 chamazulénu mg/100 g:

je na meranie k dispozícii fotometer s filtrom, je možné toto merania uskutočniť aj pomocou spektrálneho fotometra takto:

Ak nie

Meracie zariadenie:

Spektrálny fotometer /napríklad

PM QII alebo PM QIII Zeiss’7

Vlnová dĺžka:

605 nm

Kyveta:

cm

Špecifická extinkcia chamzulénu /1g/100 ml; 1 cm/:

24,5

Kompenzačná tekutina:

n-hexán alebo cyklohexán

Nájdený obsah chamazulénu v mg/100 g:

'^{02 E}6C5

V meranom roztoku sa potom určí bisabolol.

- 49 Plynovo-chromatografické stanovenie bisabololu a ostatných bisaboloidov

Plynový chromatograf:	Hewlett Packard model 5750, Erba Fractovap 2350 alebo podobné zariadenie
Detektor:	plameňový ionizačný detektor
Nosný plyn:	hélium
Stĺpec:	3,175 mm /=1/8 palca/; 200 cm; oceí
Náplň stĺpca:	3% nitrilsilikónový kaučuk XE 60 na silanizovanej kremeline Chromosorb WAW HP 125 až 150 pm ako nosič
Teplota detektora;	320 °C
vstrekovacieho bloku:	220 °C
stĺpca:	85 až 220 °C
Teplotné programovanie:	4 °/minúta
Roztok vzorky:	použije sa roztok na meranie chamazulénu
Porovnávací roztok:	asi 15 mg Štandardného bisabololu sa rozpustí v cyklohexáne na objem 25 ml
Vstrekované množstvo:	po 5 /il roztoku vzorky a porovnávacieho roztoku

Vyhodnotenie:	Vyhodnotenie sa uskutočňuje porovnaním maxím /plôch píkov/.
I Obsah bisabololu, v mg na 100 g drogy:	10 x návažok /porovnanie/ /mg/ x plocha /vzorka/ plocha /porovnanie/

Stanovenie ostatných bisaboloidov sa dá uskutočňovať tactiež pomocou plynovej chromatografie, napríklad za nasledujúcich podmienok:

Zariadenie:	Packard, model 7721, séria 800, prípadne Erba Fractovap, séria 2350
Stĺpce:	sklené stĺpce 3o/2 mm v priemere; 2 m/2 mm v priemere
Náplň:	3 % metylfenylsilikónového kaučuki. ’OV 1 na silanizovanej kremeline Gaschrom Q” 125 až 150 μαι ako nosič
Nosný plyn:	30 tni/minúta N g
Teplotný program:	80 až 180 °C, 2,5 /3/°C/minúta
Teplota injektora/ detektora:	200 °C
Detektor:	plameňový ionizačný detektor

Vstrekované množstvo: asi 2 ýjl cca 1 : 50 zriedenej silice

Vyhodnotenie prebieha čiastočne bez, čiastočne s vnútorným štandardom. Ako vnútorný štandard je vhodný met.ylester kyseliny laurovej alebo hexadekán pre silice chudobné na chamazulén, prípadne bez chamazulénu. Pri siliciach s obsahom nad 5 % je treba dať prednosť tomuto ako vnútornému štandardu, pričom stanovenie obsahu sa uskutočňuje fotometrický /pri 578 nm/.

Príklad 5

Výroba extraktu z rumančekovej drogy

Kvety rumančeka pre použitú drogu sa zberajú podľa príkladu 1 v čase, kedy je 30 až 70 % rúrkovitých kvetov otvorených a sú sušené pri teplote neprevyšujúcej 50 °C.

400 g takto získanej rumančekovej drogy s obsahom

105 mg% chamazulénu a 212 mg% (-)-alfa-bisabololu sa extrahuje 2 1 00 gramami vodného roztoku etanolu /40 % hmotnostných etanolu/ v korýtkovej miešačke pri 30 otáčkach za minútu počas 3 hodín. Materiál drogy sa potom vylisuje a extrak sa filtruje.

V extrakte sa známym spôsobom stanoví obsah účinnej látky:

chamazulén: 3,7 mg% (-)-alfa-bisabolol 10,2 mg%.

Príklad 6

Príprava extraktu z čerstvého rumančeka

I

758 g čerstvých kvetov rumančeka, ktoré boli zberané podía príkladu 1 v čase, kedy bolo otvorených 30 až 70 % rúrkovitých kvetov /obsah vody 74 %/, sa extrahuje v korýtkovej miešačke pri frekvencií 65 otáčok za minútu počas 30 minút s 510 g etanolu /84 % hmotnostných/. Zvyšok drogy sa vylisuje a extrakt filtruje.

V extrakte sa známym spôsobom stanoví obsah účinných látok:

chamazulén:

(-) -alfa-bisabolol

11,7 Og%

16,3 mg#.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1.

Spôsob prípravy nového na bisabolol bohatého tetraploidného rumančeka kultúrneho rastlinného druhu rumanček pravý

C Chamonilla recutita L.

synonymného s ňatricaria chamonilla L.,

Asteraceae), ktorého pri teplote 40 °C sušené kvety obsahujú.

vztiahnuté na sušinu aspoň 100 mg% chamazulénu aspoň 200 mg%

C-) -αί-bisabololu a menej ako

50 mg% ostatných bisaboloidov.

výnimkou odrody rumančeka

Planzana, v y z tým, že sa u

1 000 až 10 000 Jednotlivých rastlín diploidnej alebo tetraploidnej populácie rumančeka stanoví v silici obsah C-) -οί-bisabololu a vyselektujú sa tie rastliny rumančeka, u ktorých predstavuje ζ->-cŕ-bisabolol hlavnú zložku silice a u ktorých kvety, sušené pri 40 °C, obsahujú aspoň 100 mg% chamazulénu, aspoň 50 až 100 mg% C-)-aí-bisabololu a menej ako 50 mg% ostatných bisaboloidov, tieto rastliny sa z východiskovej populácie oddelia, namnožia a podrobia sa ďalším selekčným a množiacim stupňom a poprípade sa z rastlín takto získaného rumančeka získa os^ivo na množenie a/alebo rumančeková droga, pričom v prípade, že sa ako východiskový rumanček použije

I diploidný rumanček, z ktorého je vylúčená odroda Degumill, uskutoční sa po dokončení všetkých selekčných krokov tetraploidizácia pomocou chemikálií pri teplotách v rozmedzí od 0 do 35 °C, pomocou gama-žiarema, rontgenového žiarenia alebo UV žiarenia pri teplote od 0 do 35 °C, pomocou zvýšených teplôt v rozmedzí od 33 do 50 °C, pomocou znížených teplôt v rozmedzí od 0 do 5 °C, pomocou dekapitačne-kalusovej metódy alebo pomocou prašníkových kultúr.
2. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že selekcia alebo množenie Je zložené z týchto krokov:

a) selekcie najmenej 10 Jedincov tetraploidných rastlín podľa obsahu účinnej látky, to znamená najmenej 100 mg% chamazulénu, najmenej 200 mg% bisabololu a menej ako 50mg% ostatných bisaboloidov, všetko vztiahnuté na suchú látku, podľa súčasnosti doby kvetu, podľa rovnomernosti základného vetvenia, ako aj podľa veľkosti kvetov od 20 do 40 mm, klonovanie takto vyselektovaných rastlín a získavanie osiva z rastlín, získaných klonovaním,

b) pestovania potomstva z osiva, získaného podľa odstavca a), následnej selekcie podľa odstavca a) a získavania z osiva z takto vyselektovaných rastlín,

c) troj- až päťnásobného opakovania opatrení podľa odstavca b),

d) pestovania potomstva z osiva, získaného podľa odstavca c), selekcie týchto potomkov podľa odstavca a), klonovania takto selektovaných rastlín a získavania osiva z rastlín, získaných klonovaním.