CZ280274B6

CZ280274B6 - Způsob přípravy nového bisabololem bohatého tetraploidního heřmánku

Info

Publication number: CZ280274B6
Application number: CS859445A
Authority: CZ
Inventors: Franz Dr. Habil.Dipl. Agr. Chlodwig; Otto Dr. Isaac
Original assignee: Degussa Ag
Priority date: 1984-12-19
Filing date: 1985-12-18
Publication date: 1995-12-13
Also published as: HUT42671A; GB8531273D0; DE3542756A1; ZA859667B; PL256902A1; GB2170404A; GB2170404B; SK944585A3; JPS61146132A; GR853074B; FR2574621A1; EG17654A; DE3542756C2; ES550090A0; NL8503481A; PL164481B1; ES550093A0; CH671674A5; IT8548943A0; NZ214552A

Abstract

Řešení se týká způsobu přípravy nového bisabololem bohatého tetraploidního heřmánku kulturního rostlinného druhu heřmánek pravý (Chamonilla recutita L., synonymního s Matricaria chamonilla L., Asteraceae), jehož při teplotě 40.degree. C sušené květy obsahují, vztaženo na sušinu, alespoň 100 mg% chamazulenu, alespoň 200 mg % (-)-.alfa.-bisabololu a méně než 50 mg % ostatních bisaboloidů, s výjimkou odrůdy heřmánku Manzana, který spočívá v tom, že se u 1 000 až 10 000 jednotlivých rostlin diploidní nebo tetraploidní populace heřmánku stanoví v silici obsah (-)-.alfa.-bisabololu a vyselektují se ty rostliny heřmánku, u nichž představuje (-)-.alfa.-bisabolol hlavní složku silice, a u nichž květy sušené při 40 .degree. C obsahují alespoň 100 mg % chamazulenu, alespoň 50 až 100 mg % (-)-.alfa.-bisabololu a méně než 50 mg % ostatních bisaboloidů, tyto rostliny se z výchozí populace oddělí, namnoží a podrobí dalším selekčním a množícím stupňům a popřípadě se z rostlin takto získaného heřmánkuŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy nového bisabololem bohatého tetraploidního heřmánku kulturního rostlinného druhu heřmánek pravý (Chamonilla recutita L., synonymního s Matricaria chamonilla L., Asteraceae), jehož při teplotě 40 ’C sušené květy obsahují, vztaženo na sušinu, alespoň 100 mg % chamazulenu, alespoň 200 mg % (-)-a-bisabololu a méně než 50 mg % ostatních bisaboloidů, s výjimkou odrůdy heřmánku Manzana.

Dosavadní stav techniky

Přípravky z květenství heřmánku pravého [Chamonilla recutita (L.) Rauschert, synonymního s Matricaria chamonilla, L.] nalézají v důsledku svého antiflogistického a spasmolytického účinku široké terapeutické využití a tvoří důležitou součást rostlinného léčivého surovinového sortimentu. Zvláštní terapeutický význam se přitom přičítá účinným složkám (-)-alfa bisabololu a chamazulenu. Vyhovující heřmánková droga by tudíž měla vykazovat vysoký obsah těchto obou látek.

Přirozeně se vyskytující diploidní heřmánky jsou, pokud se týká obsahu účinných látek, velice heterogenní. Zejména je k dispozici z důležitých účinných látek chamazulenu a (-)-alfa-bisabololu jenom jedna, nebo tyto účinné látky chybí zcela, nebo se vyskytují ve velice malém množství, přičemž v takových případech hlavní složka éterické silice sestává z méně účinných bisaboloidů (bisabolonoxidu A nebo B, bisabololoxidu A).

Pod označením DEGUMILL (jedná se přitom o odrůdu heřmánku, chráněnou a uvedenou v německém patentovém spisu 24 02 802; o chráněnou odrůdu, zapsanou v bývalé NDR pod pojmenováním Degumill, ital. patentem č. 1 035 096) je známa odrůda heřmánku, která obsahuje současně vysoký obsah (-)-alfa-bisabololu a chamazulenu. Obsah chamazulenu této heřmánkové odrůdy DEGUMILL je stálý jenom v tom případě, že se zabrání nahodilému křížení, případně cizímu opylení jinými odrůdami heřmánku, jejichž obsah bisabololu a chamazulenu je podstatně nižší, a obecné se vyskytujícím divokým heřmánkem, chudým na účinné látky. Nebezpečí křížení cizím opylením hrozí téměř všude, protože divoký heřmánek se vyskytuje prakticky obecně. Dále jsou známy rozličné tetraploidní formy heřmánku (například BODEGOLD, býv. NDR; POHOŘELICKÝ, ČR a SR; ZLOTY LAN, Polsko; BK-2, Maďarsko). Tyto tetraploidní formy mají sice uspokojivý obsah chamazulenu, důležitá účinná látka (-)-alfa-bisabolol je však v těchto tetraploidních druzích jen ve velmi malé míře a převažují ostatní bisaboloidy (bisabolol A a B, jakož i bisabolonoxid), které tvoří více než polovinu silice u známých tetraploidních druhů heřmánku.

Podstata vynálezu

Nyní bylo nalezeno, že zcela obecné lze z přirozeně se vyskytujících populací heřmánku, ať diploidních či tetraploidních pěstovaných heřmánků, určitým způsobem podle vynálezu získat

-1CZ 280274 B6 bisabololem bohaté tetraploidní heřmánkové rostliny, které na jedné straně již nejsou náchylné k cizímu opylení přirozeně se vyskytujícími heřmánky, a na druhé straně mají současně vysoký obsah chamazulenu a (-)-alfa-bisabololu, přičemž obsah (-)-alfabisabololu značné převyšuje obsah chamazulenu, a současně ostatní bisaboloidy se prakticky nevyskytují, nebo jenom v malé míře. Důležité je přitom i to, že vysoký obsah hlavních účinných látek (-)-alfa-bisabololu a chamazulenu u heřmánku podle vynálezu je trvalý, to znamená, že zůstává zachován při každém množení.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy nového bisabololem bohatého tetraploidního heřmánku kulturního rostlinného druhu heřmánek pravý (Chamonilla recutita L., synonymního s Matricaria chamonilla L., Asteraceae), jehož při teplotě 40 C sušené květy obsahují, vztaženo na sušinu alespoň 100 mg% chamazulenu, alespoň 200 mg% (-)-α-bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů, s výjimkou odrůdy heřmánku Manzana, jehož podstata spočívá v tom, že se u 1 000 až 10 000 jednotlivých rostlin diploidní nebo tetraploidní populace heřmánku stanoví v silici obsah (-)-a-bisabololu a vyselektují se ty rostliny heřmánku, u nichž představuje (-)-a-bisabolol hlavní složku silice, a u nichž kvéty, sušené při 40 'C, obsahují alespoň 100 mg% chamazulenu, alespoň 50 až 100 mg% (-)-a-bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů, tyto rostliny se z výchozí populace oddělí, namnoží a podrobí dalším selekčním a množícím stupňům a popřípadě se z rostlin takto získaného heřmánku získá osivo na množení a/nebo heřmánková droga, přičemž v případě, že se jako výchozího heřmánku použije diploidního heřmánku, z něhož je vyloučena odrůda Degumill, provede se po dokončení všech selekčních kroků tetraploidizace pomocí chemikálií při teplotách v rozmezí od 0 do 35 °C, pomocí gamma-záření, rentgenového záření, nebo UV záření při teplotě od 0 do 35 °C, pomocí zvýšených teplot v rozmezí od 33 do 50 “C, pomocí snížených teplot v rozmezí od 0 do 5 ’C, pomocí dekapitačně-kalusové metody, nebo pomocí prašníkových kultur.

Selekce a množení při způsobu podle vynálezu sestává z následujících kroků:

a) selekce nejméně 10 jedinců tetraploidních rostlin podle obsahu účinné látky, tj. nejméně 100 mg% chamazulenu, nejméně

200 mg% bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů, vše vztaženo na suchou látku, podle současnosti doby kvétu, podle rovnoměrnosti základního větvení, jakož i podle velikosti květů od 20 až 40 mm, klonování takto vyselektovaných rostlin a získávání osiva z rostlin, získaných klonováním,

b) pěstování potomstva z osiva, získaného podle odstavce a), následné selekce podle odstavce a) a získávání osiva z takto vyselektovaných rostlin,

c) troj- až pětinásobného opakování opatření podle odstavce b),

d) pěstování potomstva z osiva, získaného podle odstavce c), selekce těchto potomků podle odstavce a), klonování takto selektovaných rostlin a získávání osiva z rostlin, získaných klonováním.

-2CZ 280274 B6

Nový tetraploidní heřmánek podle vynálezu se vyznačuje překvapivě, ve srovnání se známými heřmánky, případně odrůdami heřmánku, řadou nových výhodných vlastností. Zejména již není náchylný k cizímu opylení přirozeně se vyskytujícími populacemi heřmánku (divoký heřmánek), j ako známá heřmánková odrůda DEGUMILL. Ve srovnání s diploidními a tetraploidními odrůdami heřmánku odlišuje se heřmánek podle vynálezu překvapivé vysokým obsahem účinné látky (-)-alfa-bisabololu (nejméně 200 mg%), zatímco obsah ostatních bisaboloidů (například bisabololoxidů) je velice nízký a činí méně než 50 mg%. Známé a v literatuře popsané druhy heřmánku vykazují všechny velice vysoký obsah bisaboloidů a zčásti bisabolonoxidů, které tvoří zpravidla 50 % silice drogy (to znamená při obsahu 1 % silice obsah asi 500 mg na 100 g drogy.)

Dále je heřmánek podle vynálezu na rozdíl od dosud známých tetraploidnich odrůd heřmánku co do obsažených látek homogenní, přičemž vlastnosti chamazulenu a (-)-alfa-bisabololu jsou konstantní (to znamená homozygotní).

Proti tomu, hodnocení jednotlivých rostlin známých tetraploidní ch odrůd heřmánků ukazuje, že jednotliví jedinci patří k různým typům co do obsažených látek, což znamená, že jednotlivý náhodný odběr z nich vyrobené drogy vykazuje jak kvalitativně, tak kvantitativné odlišný nehomogenní výsledek.

Kromě toho heřmánek podle vynálezu se překvapivě odlišujé od známých tetraploidnich odrůd heřmánku například jednou nebo více následujícími vlastnostmi: zlepšenou klíčivostí semen, menším obsahem neupotřebitelné zelené hmoty (tj. vyšší výtěžností květů); nižším obsahem vody v květech (vyšším výtěžkem sušených květů a kratší dobou sušení); větší vhodností pro mechanizovanou sklizeň, protože kvéty jsou významně lokalizovány v jedné rovině a většina jich rozkvétá současně (tím je umožněn i jednotný termín sklizně); lepší skladovatelností drogy (nižším sklonem k rozpadu a tvorbě odpadu); obzvlášť aromatickou typickou heřmánkovou vůni. Vpředu uvedené výhody vystoupí zejména tehdy, když kromě selekce na účinné látky se děje ještě selekce na jeden nebo více uvedených znaků, z vyselektovaných rostlin se získává osivo, z takto získaných potomků se provádí nová selekce a tato opatření se provádějí třikrát až pětkrát.

Jako výchozí diploidní heřmánky přicházejí například v úvahu Heřmánek argentinského původu /viz L.Z. Padula, R.V.D. Rondina J.D. Coussio, Kvantitativní hodnocení esenciální silice, celkových azulenů a chamazulenu v německém heřmánku, pěstovaném v Argentině; Planta med. 30, strany 273-280, 1976/, jakož i všechny heřmánky, které vykazují v silici měřitelné koncentrace (-)-alfabisabololu (zpravidla přes 5 % v silici. V úvahu přicházejí případné takové diploidní heřmánky, které jsou popsány následující literaturou: H. Schilcher, Novější poznatky při kvalitativním stanovení heřmánkové silice, případné květů heřmánku, Planta med. 23, 132-144 (1973); 0. Motl, M. Felklová, V. Lukeš a M. Jasicová K plynově-chromatologické analýze a k chemickým typům heřmánkové silice. Arch. Pharm. 310, 210 - 215 (1977); Ch. Franz, J. Hólzl a A. Vómel Předběžná morfologická a chemická charakteristika několika populací a variací Maticaria chamomile L., Acta Hort., 73, 109 - 114 (1978).

-3CZ 280274 B6

Jako výchozí heřmánek přichází v úvahu rovněž diploidní forma heřmánku Degumill. I v tomto případě se získá příkladně tetraploidmí heřmánek o obsahu chamazulenu nejmémě 150 mg% a o obsahu bisabololu nejméně 200 mg%, když se provádí sklizeň květenství tohoto heřmánku ve vegetačním stadiu, kdy teprve 30 až 70 % trubkových květů květenství je otevřeno, a sušení se provádí při teplotě vzduchu maximálně 50 °C.

Následujícím zařazením kroků selekce á množení podle tohoto vynálezu lze uvedené hodnoty bisabololu a chamazulenu ještě dále zvýšit.

ffilice heřmánku sestává zpravidla z hlavních složek farnesenu, spathulenolu, chamazulenu, jednoho ze čtyř bisaboloidů [(-)-alfa-bisabololu, bisabololoxidu A, bisabololoxidu B nebo bisabololoxidu A, bisabololoxidu B nebo bisabolonoxidu, pokud se to týká diploidních jednotlivých rostlin; ve směsném vzorku populace, jakož i u tetraploidních jedinců mohou být obsaženy rozličné bisabolidy vedle sebe] jakož i spiroéteru. Uvedené látky společně tvoří 70 až 80 % silice. Zvláště výhodnými jsou tudíž výchozí diploidní heřmánky, kde (-)-alfa-bisabolol představuje převládající složku (více než polovinu množství výše uvedených látek.

V úvahu přicházejí zejména diploidní heřmánky jako výchozí látky, u kterých například (-)-alfa-bisabolol tvoří nejméně 40 % éterické silice, nebo nejméně 50 % bisaboloidů.

Jako tetraploidní výchozí heřmánky přicházejí například v úvahu: druhy heřmánku Bodegold, býv. NDR/, Pohořelický (ČR a SR), Zloty Lan (Polsko), BK-2 (Madfarsko). Tyto druhy jsou popsány v následující literatuře: M. Chládek a V. Kosová, Pharmazie 13, 712-713 (1958), W. Czabajska, Diss. Poznaň (1963); W. Poethke a P. Bulin Pharm. Z. Halle, 108, 813-823 (1969); I. Sárkány, Herb. Hungar, 4. (1), 125-169 (1965). V podstatě platí pro tetraploidní výchozí heřmánky vzhledem k obsahu /-/-alfa-bisabolu totéž, jako pro diploidní výchozí heřmánky.

V úvahu přicházejí zejména takové diploidní a tetraploidní heřmánkové populace, které ve směsném vzorku obsahují zpravidla nejméně 100 mg% chamazulenu a 50 až 100 mg% /-/-alfa-bisabololu (vztaženo na sušinu květů, sušených při teplotě 40 ’C), to znamená, že z takových populací heřmánku se získává v případě diploidního výchozího heřmánku osivo a toto osivo se tetraploidizuje (bez ohledu a/nebo znalosti obsahu bisabololu rodičovských rostlin). V případě výchozího tetraploidního heřmánku se osivo, popsané vpředu potom podrobuje bezprostředné selekci a množení.

Vhodné diploidní a tetraploidní výchozí heřmánky jsou selektovány pomocí vyšetření jednotlivých rostlin. Obecné je zapotřebí z výchozí populace vyšetřit 1 000 až 10 000 jedinců a nalézt několik jedinců, kteří mají podle udaných kritérií vysoký obsah /-/-alfa-bisabololu a jsou výhodné jako výchozí heřmánek. Od takových vybraných jedinců se získá obvyklým způsobem osivo a toto se tetraploidizuje. Po skončení tohoto procesu se tetraploidní rostliny vyselektují od zbylých diploidních rostlin. Z takto získaných tetraploidních rostlin, případně po předchozím množení, se nyní vyselektují všechny rostliny, které mají v květech, sušených při teplotě 40 °C, nejméně 100 mg% chamazulenu,

-4CZ 280274 B6 nejméně 200 mg% /-/-alfa-bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů. Sklizeň těchto kvétů se přitom provádí v tom stadiu vývoje, kdy 30 až 70 % všech trubkových květů květenství je otevřeno. Nato popřípadě mohou navazovat další kroky selekce a množení, které například ovlivňují následující znaky nebo případně vlastnosti: termín současného kvetení, rovnoměrné základní větvení a úzká zóna květu (to znamená lepší vhodnost pro mechanizovanou sklizeň), velká květenství, lepší skladovatelnost drogy, zejména aromatickou vůni.

V případě, že se vychází předem z tetraploidního heřmánku, provádí se jenom dříve udaná selekce těch rostlin, jejichž květy, sušené při teplotě 40 *C, obsahují nejméně 100 mg% chamazulenu, nejméně 200 mg% /-/-alfa-bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů, přičemž rovněž sklizeň těchto květů se provádí ve vývojovém stadiu, kdy 30 až 70 % všech trubkových květů květenství je otevřeno. I v tomto případě mohou navazovat případně další kroky selekce a množení, které vedou k dalším zlepšením (jak je uvedeno vpředu).

Obzvláště výhodný heřmánek se získá, když se při selekci podle obsahu chamazulenu a /-/-alfa-bisabololu vyselektují takové rostliny (známé nebo připravené podle vynálezu), jejichž obsah chamazulenu činí nejméně 200 mg%, s výhodou 250 mg%, a jejichž obsah /-/-alfa-bisabololu činí nejméně 300 mg%, s výhodou 400 mg% (obsah ostatních bisaboloidů je stále pod 50 mg%).

Tetraploidizaci lze provádět o sobě známým způsobem ovlivněním rostlinných částí (semen, kořenů, konečků výhonků, klíčků, pažních poupat nebo tkání diploidních výchozích rostlin heřmánků) chemikáliemi, rentgenovými paprsky, gamapaprsky nebo UV-paprsky. Lze ji provádět dále metodou dekapitace kalusu, pomocí prašníkové kultury, nebo použitím vysokých nebo i nízkých teplot na rostliny heřmánku, případně na části rostlin nebo na tkáně rostlin heřmánku. Lze zde odkázat příkladně na knihu Wernera Gottschalka Die Bedeutung der Polyploidie fur die Evolution der Pflanzen, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1976, zejména na strany 13 až 22.

Tetraploidizace pomocí chemikálií:

Jako chemikálie pro tetraploidizaci přicházejí v úvahu například: kolchicin, acenaften, alkaloidy jako atropin, veratrin, nikotin, sanguinarin, deriváty benzenu, difenylu a fenanthrenu, naftalín a deriváty naftalinu difenylamin, tribromanilin, p-dichlorbenzen, methylnaftochinon, methylnaftohydrochinon, kyselina salicylová a příbuzné látky, hexachlorhexan, hydrochlorid methamfetaminu, alkylkarbamáty alkalických kovů, jako izopropylkarbamát sodný, fenylurethan, soli kyseliny kakodylové (například sodná sůl), glykosidy konvalinky, jako konvallarin, konvallatoxin a konvallamarin, heteroauxin, germisan (fenylmerkuripyrokatechin) deriváty organortuti (jako ethylfosfát, ethylchlorid, fenylhydroxid a fenyldinaftylmethandisulfonát rtuti), chloroform, rajský plyn (N₂0), jakož i směsi těchto látek. V úvahu přicházejí dále pokrutiny, kompost a kravská mrva (hnůj).

-5CZ 280274 B6

Působení zde uvedených látek se provádí například při teplotách mezi 0 a 35 ’C, s výhodou mezi 12 a 30 ’C, zejména při teplotách 15 až 25 °C.

Aplikace se provádí například působením na semena, hroty výhonků, kořeny (zejména na kořenová zakončení nebo kořeny klíčících sazenic) na čnělky, plochy řezů na listech nebo stoncích, na buněčné suspenze meristemové tkáně, kallusové kultury, nebo i injekcí na bazální oblasti stonků nebo do oblasti pažních pupenů. Chemikálií se obvykle používá ve formě roztoků ve vodě, slabě alkoholických roztoků (obsah alkoholu se pohybuje zpravidla pod 5 %), nebo ve formé slabě kyselých roztoků. Hodnota pH slabě kyselých roztoků se pohybuje příkladně mezi 5,5 a 6,5, přičemž okyselení se provádí pomocí nižších alifatických kyselin, jako kyseliny octové. Použije-li se alkoholických roztoků, mohou být rovněž slabé kyselé, Koncentrace chemikálií v těchto roztocích může činit příkladně 0,01 až 0,5 %, s výhodou 0,02 až 0,2 %, zejména 0,05 až 0,1 %. Plynné látky se používají jako takové, případné za tlaku (například 1 až 100 kPa). Doba působení činí například 1 až 36, s výhodou 2 až 12, zejména 4 až 6 hodin.

Nejúčinnější koncentrace, jakož i doba působení by měly být účelně testovány vždy v předpokusech.

Obzvláště příznivé je například působení kolchicinu při teplotách mezi 0 a 35 ’C, s výhodou při teplotě 12 až 30 ’C, zejména při 15 až 25 C. To lze provádět například tak, že semena diploidního výchozího heřmánku se nechají nabobtnat v 0,01 až 0,2%, zejména 0,02 až 0,1%, s výhodou v 0,05 roztoku kolchicinu, nebo naklíčené, 5 až 7 dní staré, dobře vyvinuté klíčící sazenice diploidního výchozího heřmánku (s klíčními listy dolů) se ponoří do 0,01 až 0,2%, zejména 0,02 až 0,1%, s výhodou 0,05 roztoku kolchicinu. Při posledním způsobu má mít okolní atmosféra 100 % relativní vlhkosti. Doba působení kolchicinem je například 4 až 10 hodin. Při použití klíčících sazenic je obecně postačující doba působení do 10 hodin. Při použití semen se doba působení případně může protáhnout až na 36 hodin.

Po působení chemikálií se nabobtnalá semena, klíčící sazenice, případně jiné části rostlin promyjí několikrát vodou. Nabobtnalá semena se potom vysejí. Rostliny s ošetřenými kořeny nebo jinými jejich částmi, nebo ošetřené klíčící sazenice se například pikírují do lísek pro rostliny. Z takto ošetřených semen, případně klíčících sazenic se rostliny pěstují (například ve skleníku: při teplotě mezi 18 až 25 ’C ve dne a 10 až 16 °C v noci), vyberou se rostliny, jejichž pyl je asi 1,5 x větší než pyl výchozího materiálu, případné mají v somatických buňkách počet chromozomů 36.

Působí-li se chemikáliemi na jiné rostlinné části (nadzemní nebo podzemní), podrobí se pozdějšímu zkoumání na provedenou tetraploidizaci výlučně výhonky, kořeny nebo květy/semena, vzešlé z takto chemikáliemi ošetřených částí. Když se například provede ošetřeni výhonku nebo paždí, zkoumají se potom jenom z tohoto paždí, případné z tohoto pupence vzniklý výhonek a květy na něm vytvořené, případně semena na počet chromozomů.

-6CZ 280274 B6

Měření velikosti pylu a počítání chromozomů lze například provádět tak, j ak j e uvedeno v příkladu 3:

Tetraploidizace pomocí záření:

Působení se provádí například na semena nebo na zakončení kořenů při teplotách mezi 0 a 35 ’C, s výhodou při 10 až 30 °C, zejména při 15 až 25 ’C. Množství ozáření: 5 až 50 Krad. S výhodou přicházejí v úvahu gama-paprsky a rentgenové paprsky.

Jako UV-paprsky přicházejí například v úvahu takové, které mají vlnovou délku 400 až 30 nm, s výhodou 350 nm.

Takto ozářené rostliny, případné rostlinné části, se pak ošetřují dále jako do působení chemikálií.

Použití vysokých a nízkých teplot: Jako vysoké teploty přicházejí v úvahu například teploty mezi 33 až 45 ’C. Těmto teplotám se například vystavují: nabobtnalá semena, klíčící sazenice, vrcholky výhonků a meristematická tkáň. Doba ošetření: například 1 až 48, s výhodou 12 až 24 hodin.

Jako nízké teploty přicházejí v úvahu 0 až 5 °C, s výhodou 0,5 až 4 ’C, zejména 2 °C. Těmto teplotám se například vystavují: nabobtnalá semena, klíčící sazenice, výhonky a meristematická tkáň. Doba ošetření: například 1 až 100, s výhodou 20 až 40 dní. Takto ošetřené rostliny: případně jejich části se dále ošetřují rovněž tak, jako po působení chemikálií.

Dekapitačně kalusový způsob [dekapitace = useknutí hlavičky nebo konečku (špičky), nebo zpětný řez]. Dekapitace se provádí například u mladých rostlin na stonku, s výhodou na konci vegetačního kužele, po vytvoření 4 až 6 listů, nebo i na řapících listů nebo postranních výhoncích. Pupeny, vzniklé na zraněné tkáni (kallusová tkáň), případně výhonky, se oddělí, přivedou k zakořenění a pěstují dále v kořenáčích a na tetraploidní formu převedené rostliny se selektují stejné, jako při působení chemikálii .

Prašníková kultura (příprava rostlin s jednoduchým počtem chromozomů z pylových váčků s následující spontánní nebo umělou tetraplodizací). Od kvetoucích rostlin se sklidí zavřené trubkovité kvéty, jejichž prašníky (pylové váčky) se nacházejí ve stadiu prvé mitózy pylu. Prašníky se vyjmou pomocí mikromanipulátoru a přenesou do Petriho misek, které jsou naplněny například živným prostředím podle Nitsche a Nitsche (tabulka 1). Potom se Petriho misky uchovávají v kultivačním prostoru po dobu 16 hodin za dne při teplotě 28 ’C, v noci při teplotě 20 °C. Přibližně po 4 týdnech začínají prašníky pukat a rostlinky vyrůstat. Tyto jsou u diploidního podílu rodičů haploidní, při tetraploidním podílu rodičů dihaploidní: po vytvoření kořenového systému se například přesadí do zahradní půdy a ve skleníku přivedou ke květu. Tyto (di)haploidní rostliny jsou sterilní, lze je však ošetřením konců výhonků, kořenu, nebo chemikáliemi, jako například působením kolchicinu převést na polyploidní formy, přičemž vznikají homozygotní rostliny, které lze potom dále množit semeny. Další postup viz ošetřování chemikáliemi, například působením kolchicinem.

-7CZ 280274 B6

Tabulka 1

Živné prostředí podle Nitsche a Nitsche (Science, 1969) mg/1

kno₃	950
nh₄no₃	720
MgSO₄ X 7 H₂0	185
CaCl₂	166
kh₂po₄	68
MnSO₄ x 4 H₂O	25
h₃bo₃	10
ZnSO₄ x 7 H₂O	10
Na₂Mo0₄ x 2 H₂O	0,25
CuSO₄ x 5 H₂O	0,025
5 ml roztoku ze 7,45 g dvojsodné
soli kyseliny ethylendiaminotetraoctové
a z 5,57 g FeSO₄ x 7 H₂0 na 1 000 ml
Myo-Inosit	100
Glycin	2
Nikotinová kyselina	5
Pyridoxin-HCl	0,5
Thiamin-HCl	0,5
listová kyselina	0,5
Biotin	0,05
Sacharóza	20 g
Živná půda hotová (DIFCO-Bacto-Agar)	8 g
Indolyloctová kyselina	0,1
pH prostředí se nastaví na 5,5

Změřením velikosti pylu a/nebo spočítáním chromozomů vyselektovaných tetraploidních heřmánkových rostlin, které mohou být získávány vpředu uvedenými možnostmi, se potom vyselektují rostliny, které mají minimální obsah chamazulenu 100 mg% a minimální obsah bisabololu 200 mg%, zatímco obsah ostatních bisabololoidů (zejména bisabololoxidů) má být pod 50 mg% (vztaženo na sušené kvéty, viz příklad 1).

Takto vyselektované rostliny se po odstranění již rozkvetlých květenství nechají odkvést ve skleníku při teplotě 18 až 24 ’C ve dne a 12 až 14 ’C v noci a délce dne minimálně 14 hodin, přičemž po dobu 4 týdnů se sklízí na osivo všechna květenství, která jsou rozkvetlá, nebo jsou před rozpadem. Po sušení při teplotě vzduchu mezi 20 až 35 °C se získává Osivo k množení heřmánku podle vynálezu.

Jako další kritéria v úvahu ještě následující:

této selekce mohou navíc přicházet

-8CZ 280274 B6

a)	přibližně současná doba květu,
b)	rovnoměrné základní větvení a úzká zóna 5 cm,	květů	asi 10,	zejména
c)	velká květenství o vnějším průměru asi zejména 25 až 35 mm.	30 mm	(20 až	40 mm),
	Použití těchto přídavných kritérií a)	, b)	a/nebo	c) vede

například k vysokým výnosům květů a drogy a je vhodnější pro strojovou sklizeň.

V případě, že se vychází již od známých tetraploidních heřmánků, provádí se dříve popsaná selekce, jakož i případně další kroky selekce a množeni.

Aby se získal heřmánek, který kromě obsahu nejméně 100 mg% chamazulenu a nejméně 200 mg% /-/-alfa-bisabololu (vztaženo na sušená květenství) by poskytoval i vysoký výnos květů a byl lépe vhodný pro strojovou sklizeň, doporučuje se následující postup: Vyselektované rostliny (jak je popsáno vpředu) se množí vegetativně kříženci a sledují se po dobu 3 až 5 generací, přičemž se stále provádí výběr podle uvedených kritérií, případně i přídavných kritérií a) až c). Rostliny, vypěstované podle těchto kritérií, se klonují, od klonovaných rostlin se získává osivo, z něho získané rostliny se opět selektují podle udaného minimálního obsahu chamazulenu a bisabololu, jakož i dalších kritérií a) až c) a z posledních se získává opět osivo.

Sled výsev - selekce podle výše uvedeného minimálního obsahu chamazulenu 100 mg% a /-/-alfa-bisabololu nejméně 200 mg% (ostatní bisaboloidy pod 50 mg%), jakož i podle dalších kritérií a) až c) - získávání osiva - lze 3 až 5x opakovat.

Na to navazuje ještě jeden sled výsev - selekce, jak bylo popsáno dříve (případné klonování) - získávání osiva.

Posléze získané osivo je potom osivo k množení heřmánku podle vynálezu.

Množení pomocí hříženců se přitom provádí následujícím způsobem: K množeni hříženci musí výchozí rostliny (klonové matečné rostliny) vytvořit za podmínek krátkého dne krátké výhonky, prosté pupenů. K tomu dochází v zimní polovině roku ve skleníku bez přídavného osvětlování, nebo v klimatizačních komorách při délce dne 6 až 10, s výhodou 8 hodin, a teplotách od 10 až 15 °C, s výhodou 12 ’C. Ke klonování, případně k množení jsou vhodní hříženci z listů výhonků a zejména krátkých výhonků (postranních výhonků). K jejich zakořenění dochází při teplotách 12 až 18 °C, s výhodou 15 C, a při délce dne 12 až 16, s výhodou 14 hodin, nasycené atmosféře (asi 100% relativní vlhkost vzduchu). Jako substrát lze například použít směs rašelina - písek v poměru 1:1; je vhodný i čistý křemenný písek, osinkové kostky pro hřížence, rašelinové kostky pro hřížence apod.

K výsevu jsou přitom vhodné například následující půdy:

zahradní půda, humózní středně těžká jílovitá půda, jílovité nebo humózní písčité půdy. Výsev lze uskutečnit ve sklenících i na

-9CZ 280274 B6 poli. Teploty pro klíčení a růst rostlin se pohybují mezi 12 až 24 °C, zejména 18 až 20 “C. Provede-li se vysev na volném poli, seje se s výhodou na podzim (září/říjen), nebo časně na jaře (březen/duben). Tyto termíny platí pro veškerá území, přicházející v úvahu pro území pěstování (například severní polokoule, území s mírným až subtropickým podnebím).

Nový heřmánek podle vynálezu náleží ke druhu kulturní rostliny heřmánek pravý, botanického označení Matricaria chamomilla L. (synonymum Chamomilla recutita (L.), Rauschert, a je definována údaji o účinných látkách v bodě 1 definice předmětu vynálezu. Udané hodnoty obsahů účinných látek chamazulenu, /-/-alfa-bisabololu a bisaboloxidů se vztahují vždy na ono rozvojové stadium květů, kdy 30 až 70 %, zejména 40 až 60 % všech trubkových květů květenství je otevřeno, to znamená, že kvéty, použité ke stanovení obsahu účinných látek, byly sklizeny k tomuto termínu a potom byly ve skříňové sušárně sušeny po dobu 72 hodin při teplotě 40 °C.

Když se sklizeň květů heřmánku stadium květů pokročilo dále, to nebo až 100 % všech trubkových (například ve stadiu plného květu) při teplotě vyšší než 40 “C, /-/-alfa-bisabololu a chamazulenu nižší, protože při vyšších teplotách a/nebo při pozdější sklizni může docházet k význačnějšímu rozkladu azulenu a bisabololu.

provede v době, kdy vývojové znamená, kdy například 100 % květů květenství je otevřeno a/nebo sklizené kvéty se suší 40 “C, může být obsah účinných látek

Pod označením ostatní bisaboloidy v bodě 1 definice předmětu vynálezu se rozumí zejména: /-/-alfa-bisabololoxid A a B; /-/-alfa-bisabolonoxid A; další složky silice odrůdy heřmánku podle vynálezu jsou En-In-dicykloéter, farnesen, spathulenol a v mírných koncentracích různé těkavé terpenické uhlovodíky.

podle vynálezu, sušené v sušárně (sklizené jak je uvedeno výše), chamazulenu, mezi 200 až 450 mg% , to znamená 5 až 50 mg% ostatna sušinu, což znamená vztaženo na

Například kvéty heřmánku (skříňové) při teplotě 40 ’C obsahují mezi 100 až 200 mg% /-/-alfa-bisabololu a jenom málo, to znamená nich bisaboloidů, vztaženo na sušinu, což znamená absolutně suchou hmotnost květů. Tato absolutně suchá hmotnost se určuje sušením separátního vzorku květů heřmánku ve skříňové sušárně při teplotě 105 ’C až do konstantní hmotnosti (72 až 96 hodin). Obsah účinných látek květů, sušených například při tě 35 až 50 ’C (drogy), se přepočte na suchou hmotnost stanovenou při teplotě 105 °C.

teplokvétů,

Ve svém fenotypu je heřmánek, získaný podle vynálezu, podobný dosud známým tetraploidním odrůdám heřmánku (například Bodegold, Zloty Lan, BK-2, Pohořelický velkokvětý); liší se od nich především tím, že u heřmánku podle vynálezu tvoří /-/-alfa-bisabolol hlavní složku silice květů a kromě toho obsah ostatních bisaboloidů (bisabololoxidu A a B, jakož i bisabolonoxidu) jsou zřetelně nižší. Další složky silice heřmánku jsou farnasen, spathulenol a En-In-dicykloéter.

Heřmánek získaný podle vynálezu lze pěstovat na všech půdách s výjimkou půd s obsahem více než 20 % organické látky (humus a půdní organismy); nejsou zapotřebí žádná agrotechnická a kulti-10CZ 280274 B6 vační opatření; pro pěstování je nezbytný jenom dlouhý den s více než 13 hodinami maximální délky dne, to znamená pro pěstování přicházejí v úvahu především mírná pásma a subtropická území.

Heřmánek získaný podle vynálezu má obvykle ještě další výhody: vyšší výnos, středně pozdní termín sklizně, jednotnou výšku vzrůstu, úzké zóny kvétů a velká kvétenství; tudíž zvláštní vhodnost pro mechanizovanou sklizeň. K tomu přibývá ještě skutečnost, že rostliny, vyseté ve stejné dobu, obvykle kvetou prakticky společně v tutéž dobu, což velice zjednodušuje a ulehčuje sklizeň.

Posléze uvedené výhody vyniknou potom, když se použije následujících podmínek postupu: z tetraploidních rostlin heřmánku, které mají obsah chamazulenu minimálně 100 mg% a /-/-alfabisabololu 200 mg%, zatímco obsah ostatních bisaboloidů (zejména bisabololoxidů) je pod 50 mg % (všechny vztaženy na sušená květenství) se selektují jenom ty rostliny, které

- kvetou zhruba ve stejnou dobu,

- mají rovnoměrné základní větvení a úzkou zónu kvétů asi 10 cm, jakož i

- velké kvétenství o vnějším průměru asi 30 mm.

Vyselektované rostliny se množí vegetativně hříženci a sledují se po dobu 3 až 5 generací, přičemž výběr se provádí stále podle výše uvedených kritérií. Vybrané rostliny se množí vegetativně (klonují), nechávají se společně odkvést a získává se od nich osivo. Z osiva získané rostliny se selektují opět podle výše uvedených kritérii a sled výsev - selekce - získávání osiva se 3 až 5krát opakuje.

Droga, připravená z heřmánku, získaného podle vynálezu, má maximální obsah účinných látek chamazulenu a /-/-alfa-bisabololu tehdy, když se provádí sklizeň kvétenství heřmánku ve vegetačním stadiu, kdy například 30 až 70 % trubkových kvétů, s výhodou 40 až 60 %, to znamená, že obecně 50 % trubkových kvétů kvétenství, je otevřeno, a sušeni se provádí při teplotě vzduchu maximálně 50 °C, například 35 až 50 ’C, zejména 40 °C.

Sušení lze provádět buď přiváděným vzduchem, ale i sušením ve stínu, je však třeba dbát na to, aby přiváděné teplo nepřekročilo množství, potřebné k dokonalému vysušení. Rovněž je výhodné přesvědčit se kontrolním vážením o dosažení konstantní hmotnosti. Sušení lze provádět spontánně nebo uměle (například uměle ohřívaným teplým vzduchem). Výtěžek účinných látek je největší při spontánním sušení za vyloučení slunečního světla, s výhodou při 40 až 60 “C, zejména při 40 až 50 °C. Proces sušení je třeba uskutečnit co možná nejdříve po sklizni. Sušení má probíhat v tenkých vrstvách, například 5 až 20 cm, s výhodou v tloušťce 10 cm. Sušení je možné provádět i v dobře větraných halách při teplotě mezi 20 až 30 C. Teplota vzduchu pro sušení nemá být vyšší než 60 “C. Příznivá je například teplota mezi 35 a 50 ’C.

Obsah účinných látek v droze, připravené z heřmánku, získaného podle vynálezu, zejména hlavních účinných látek, chamazulenu a /-/-alfa-bisabololu, závisí na vegetačním stadiu, v jakém se květy nalézají v době sklizně a před sušením sklizených kvétů.

Čím vyšší je teplota při sušení, tím značněji probíhá rozklad

-11CZ 280274 B6 účinných látek, to znamená tím nižší obsah účinných látek je v sušených kvétech. Ze stejného důvodu má přímé sluneční světlo nepříznivý vliv a má mu být podle možností zabráněno. Vegetační stadium květů je charakterizováno tím, kolik % trubkových květů květenství je v určitou dobu otevřeno (zde se míní doba sklizně). Lze sklízet i květy, kdy je například otevřeno 30 až 50 %, 30 až 70 %, 40 až 60 %, 60 až 100 %, nebo 90 až 100 % trubkových květů květenství. Obsah účinných látek je závislý na tom, ve kterém stadiu se květy vždy nacházejí, a je nejvyšší, když je otevřeno 40 až 60 % všech trubkových květů, a je nižší u méně i u více otevřených trubkových květů květenství.

Velikou výhodou heřmánku, získaného podle vynálezu, je tudíž to, že u něho probíhá rovnoměrné odkvětání, to znamená, že převážný počet rostlin po vysetí vykazuje stejné stadium kvetení, což znamená, že například u většiny je ve stejnou dobu otevřeno 40 až 60 % všech trubkových květů. Tím je právě možná u heřmánku, získaného podle vynálezu, dokonalá sklizeň květenství v optimální dobu a tento heřmánek je vhodný pro mechanizovanou sklizeň.

Vztah obsahu chamazulenu a /-/-alfa-bisabololu ke stadiu kvetení v době sklizně a k teplotě sušení při získávání drogy je uveden příkladně v následující tabulce (přičemž obsah ostatních bisaboloidů je ve všech případech menší než 50 %).

Tabulka

Teplota sušení (teplota vzduchu)	Vegetační stadium květů v době sklizně
30 až 70 % všech trubkových květů květenství otevřeno	70 až 100 % všech trubkových květů květenství otevřeno
	Obsah účinných látek	Obsah účinných látek
	v sušeném materiálu	v sušeném materiálu
maximálně	Chamazulen:	Chamazulen:
50 °C	nejméně 100 mg%	nejméně 40 mg%
	/-/-alfa-bisabolol:	/-/-alfa-bisabolol:
	nejméně 200 mg%	nejméně 120 mg%
	Obsah účinných látek	Obsah účinných látek
	v alkoholickém	v alkoholickém
	extraktu:	extraktu:
	Chamazulen:	Chamazulen:
maximálně	nejméně 5,0 mg%	nejméně 2,0 mg%
50 °C	/-/-alfa-bisabolol:	/-/-alfa-bisabolol:
	nejméně 10,0 mg%	nejméně 6,0 mg%
	Obsah účinných látek	Obsah účinných látek
	v sušeném materiálu:	v sušeném materiálu:
mezi 50 až	Chamazulen:	Chamazulen:
70 ’C	nejméně 50 mg%	nejméně 30 mg%

-12CZ 280274 B6

Pokračování tabulky

Teplota

Vegetační stadium květů v dobé sklizně sušení (teplota vzduchu) až 70 % všech trubkových květů květenství otevřeno až 100 % všech trubkových květů květenství otevřeno /-/-alfa-bisabolol: nejméně 150 mg% /-/-alfa-bisabolol: nejméně 100 mg%

Obsah účinných látek Obsah účinných látek v alkoholickém v alkoholickém mezi 50 až 70 ^eC extraktu extraktu

Chamazulen: nejméně 2,5 mg% /-/-alfa-bisabolol: nejméně 7,5 mg%

Chamazulen: nejméně 1,5 mg% /-/-alfa-bisabolol: nejméně 10,0 mg%

Z toho plyne, že z heřmánku, kterého se používá k výrobě prostředků podle vynálezu, například při sklizni, která se koná ve vegetačním stadiu, kdy je otevřeno 30 až 100 % trubkových květů květenství, a sušení lze provádět při vzdušných teplotách až 70 °C, se získává sychý materiál, jehož obsah chamazulenu je v každém případě nejméně 30 mg% a jehož obsah /-/-alfa-bisabololu je nejméně 100 mg%, zatímco obsah ostatních bisaboloidů je nižší než 50 mg%.

V alkoholických extraktech je obsah ostatních bisaboloidů stále nižší než 10 mg %.

V silici, která se vyrábí ze suchého materiálu za podmínek ve výše uvedené tabulce, je stále obsah nejméně 3,5 % chamazulenu, nejméně 10 % /-/-alfa-bisabololu a méně než 10 % ostatních bisaboloidů.

Stanovení /-/-alfa-bisabololu, jakož i ostatních obsahových látek v heřmánku probíhá obvyklým plynově-chromatografickým způsobem.

Přesný způsob analytického stanovení obsahuje příloha A (za textem příkladu č. 4).

Účinná látka chamazulen se nenachází ve kvétech heřmánku jako taková, nýbrž ve formě seskviterpenického laktonu matricinu.

Matricin vykazuje farmakologickou účinnost, blízkou chamazulenu. Z tohoto prekurzoru vzniká například při zahřátí (například destilaci vodní párou při přípravě nálevu čaje) okamžité chamazulen. U heřmánku je tudíž obvyklé neudávat obsah matricinu, nýbrž obsah z něho se vytvářejícího chamazulenu.

Možnosti použití heřmánku, získaného podle vynálezu, jsou následující: získávání drogy heřmánku, heřmánkové silice, heřmán-13CZ 280274 B6 kových extraktů, jakož i /-/-alfa-bisabololu, chamazulenu a ostatních obsahových látek heřmánku. Tak například lze z drogy, získávané z heřmánku podle vynálezu, například extrakcí alkoholem, případně vodně-alkoholickou směsí nebo extrakcí pomocí nadkritických plynů získat heřmánkové výtěžky, případně extrakty. Dále lze získat z drogy heřmánkovou silici, /-/-alfa-bisabolol, chamazulen a ostatní obsahové látky heřmánku.

Alkoholické výtažky drogy obsahují například nejméně

1,5 mg%, s výhodou 5,0 mg% chamazulenu a nejméně 5,0 mg%, s výhodou nejméně 10 mg% /-/-alfa-bisabololu v alkoholickém výtažku drogy a méně než 8 jng% ostatních bisaboloidů. Výroba takových výtažků se provádí obvyklým způsobem.

Pro extrakci lze použít například přístrojové zařízení, například takzvané korýtkové míchačky, perkolátory a jiná vhodná extrakční zařízení. Teplota během extrakce činí příkladně 10 až 50 ’C. Chlazení není nutné.

Jako rozpouštědla přicházejí v úvahu zejména přímé nebo rozvětvené alifatické jedno- nebo vícemocné alkoholy s 1 až 6 atomy uhlíku, jako například methanol, ethanol, 2-propanol, butanol, glycerol, izopropylidenglycerol a další, jakož i směs těchto rozpouštědel s vodou.

Lze používat i směsi těchto rozpouštědel. Minimální množství rozpouštědla činí 2 díly rozpouštědla na 1 díl sušeného materiálu. Obvykle se používá 2 až 20 dílů rozpouštědla na 1 díl sušeného materiálu, zejména 3 až 10 dílů rozpouštědla na 1 díl sušeného materiálu.

Pro výrobu extraktů, zejména alkoholických extraktů, lze používat i čerstvé kvéty heřmánku, případně zmrazené květy heřmánku (v případě, že čerstvé květy byly zmrazený).

Silice, připravená z drogy, obsahuje nejméně 3,5 % chamazulenu, s výhodou nejméně 5 % chamazulenu a nejméně 10 % /-/-alfabisabololu a méně než 10 % ostatních bisaboloidů.

Výroba takové silice se provádí obvykle tak, že se droga zahřeje s vodou, případné v přítomnosti kyseliny askorbové (například ve formě soli, zejména sodné soli kyseliny askorbové) k varu při hodnotě pH mezi 4a 6, s výhodou 5 až 5,5. Hodnota pH se nastavuje pomocí kyseliny, například kyseliny chlorovodíkové. Na jeden hmotnostní díl sušeného materiálu se používá například 10 až 50 hmotnostních dílů vody a případně 0,1 až 1 hmotnostní díl kyseliny askorbové.

Zahřívání se provádí obvykle po dobu 2 až 8 hodin.

Získaný vodný destilát se opakovaně vytřepe nižším alifatickým tekutým uhlovodíkem, jako petroléterem (například teploty varu 35 až 60 °C), pentanem, xylenem, dekalínem, organická fáze se suší (například nad síranem sodným), a organické rozpouštědlo se odstraní šetrným způsobem (například oddestilováním na rotační odparce, nebo destilací při 40 až 70 °C, s výhodou při teplotě 50 až 60 ’C). U výše vroucích rozpouštědel se provádí toto oddestilování ve vakuu.

-14CZ 280274 B6

Stanovení obsahových látek se provádí, jak bylo již udáno dříve.

Když se kvéty heřmánku sklízejí ve vegetačním stadiu, kdy 30 až 100 % trubkových květů květenství je otevřeno a kvéty se suší při teplotě vzduchu až do 70 ’C, potom obsahuje získaná droga nejméně 30 mg% chamazulenu, nejméně 100 mg% /-/-alfa-bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů, a silice, získaná destilací vodní párou z této drogy, obsahovala nejméně 3,5 % chamazulenu, nejméně 10 % /-/-alfa-bisabololu a méně než 10 mg% ostatních bisaboloidů, a alkoholický výtažek, připravený extrakcí s nižšími alkanoly obsahuje nejméně 1,5 % chamazulenu, nejméně 5,0 mg% /-/-alfa-bisabololu a méně než 10 mg% ostatních bisaboloidů.

Když se kvéty heřmánku sklízejí ve vegetačním stadiu, kdy je otevřeno 30 až 70 % trubkových květů a kvéty se suší při teplotě maximálně 50 *C, potom taková droga obsahuje například 100 mg% chamazulenu, nejméně 200 mg% /-/-alfa-bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů, a z ní připravená silice obsahuje nejméně 3,5 % chamazulenu, nejméně 10 mg% ostatních bisaboloidů, a alkoholický výtažek heřmánku, vyrobený pomocí nižších alkoholů, obsahuje 1,5 mg% chamazulenu, 5,0 mg% /-/-alfa-bisabololu a 10 mg% ostatních bisaboloidů.

Když se kvéty heřmánku sklízí ve vegetačním stadiu, kdy 30 až 70 % trubkových květů květenství je otevřeno a kvéty jsou sušeny při teplotě vzduchu mezi 50 až 70 ’C, potom obsahuje získaná droga například nejméně 50 mg% chamazulenu, nejméně 150 mg% /-/-alfa-bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů, a z nich připravená silice obsahuje nejméně 3,5 % chamazulenu, nejméně 10 % /-/-alfa-bisabololu a méně než 10 % ostatních bisaboloídů, a z toho připravený alkoholický výtažek obsahuje nejméně

2,5 mg% chamazulenu, nejméně 7,5 mg% /-/-alfa-bisabololu a méně než 10,0 mg% ostatních bisaboloidů.

Když se sklízí kvéty heřmánku ve vegetačním stadiu, kdy 70 až 100 % trubkových květů květenství je otevřeno a kvéty se suší při teplotě vzduchu mezi 50 až 70 °C, potom obsahuje takto získaná droga příkladně nejméně 30 mg% chamazulenu, nejméně 100 mg% /-/-alfa-bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů, případně z ní připravená silice obsahuje nejméně 3,5 % chamazulenu, nejméně 10 % /-/-alfa-bisabololu a méně než 10 % ostatních bisaboloidů, a alkoholický výtažek, připravený z této drogy, obsahuje nejméně 1,5 % chamazulenu, nejméně 10 mg% /-/-alfa-bisabololu a méně než 10,0 mg% ostatních bisaboloidů.

Příklady provedení

Příklad 1 (Výchozí heřmánek je tetraploidní)

Testem variability jednotlivých rostlin z počtu 10 000 rostlin tetraploidní odrůdy heřmánku, která byla popsána I. Sárkányem <· (Herba Hungar. 4/1), 125 až 169 (1965) se nalezlo, že asi na

000 jedinců přichází jedna rostlina, která má v silici vysoký

-15CZ 280274 B6 obsah chamazulenu, který činí 20 hmotnostních procent, jakož i vysoký obsah /-/-alfa-bisabololu, přičemž současné obsah ostatních bisaboloidů, zejména /-/-alfa-bisabolonoxidu) je velice nízký (méné než 5 hmotnostních procent). Jedinci byli vybráni a podrobeni následujícím stupňům:

Stupeň 1:

Z potomstva (jak je popsáno vpředu) vyselektovaných tetraploidních rostlin heřmánku byli vybráni ti jedinci, kteří

A) kvetou v přibližně stejnou dobu,

B) mají rovnoměrné základní větvení a úzkou zónu květu asi 10 cm, s výhodou 5 cm,

C) mají velká kvétenství o zevním průměru asi 30 mm, s výhodou 25 až 35 mm,

D) dosahují nebo překračují minimální obsah chamazulenu 150 mg% a bisabololu 300 mg%, a jejich obsah ostatních bisaboloidů (zejména bisabololoxidů) leží zřetelně pod 50 mg. (Všechny hodnoty se vztahují na kvétenství, která byla sušena při teplotě 40 °C a jejichž sklizeň byla provedena ve stadiu, kdy 30 až 70 % všech trubkových květu kvétenství je otevřeno.

Tyto rostliny byly klonovány. K tomu byly rostliny (klonové matečné rostliny) seřezány na cca 15 cm délky výhonků, při 8 až 10 hodinách délky dne a při teplotách 12 až 14 °C přivedeny k vytvoření nových výhonků (krátké postranní výhonky). Tyto krátké výhonky byly ořezány a zasazeny do směsi rašelina - písek. Zakořenění sazenic (hříženců) při 100% relativní vlhkosti a délce dne 14 hodin trvalo 7 až 14 dní.

Namísto uvedeného klonování (množení sazenicemi) bylo použito také in vitro množení tkáňových partií rostliny, schopných dělení (takzvané meristémové dělení). K etablování kultury heřmánku jsou vhodné různé části rostlin, s výhodou konce výhonů nebo pažní pupeny.

Po opláchnutí rostlin pomocí H₂O₂ se za aseptických podmínek v laminárním proudění (vysokovýkonný filtr s vytěsňovacím proudem nízké turbulence) odejmou konečky výhonků pažních listových pupenů a přenesou se do reagenčních nádobek s živným prostředím například podle Murashige a Skooga (Physiol. Plant. 15, 473-497, 1962). Reagenční nádobky se postaví do klimatizovaného prostoru na 12-18, s výhodou 16 hodin délky dne (dosaženo fluorescenčními zářivkami) za světelné intenzity 500 až 1000 luxů, s výhodou 1000 až 3000 luxů a teploty 15 až 30 “C, s výhodou 22 až 27 ’C. Jakmile je zřejmé, že explanáty dobře rostou, převádějí se na výše uvedené živné prostředí, avšak s vyšší koncentrací cytokininu* (například 30 mg/1 6-izopentenyladenin) a s malým množstvím nebo vůbec žádným auxinem (0 až 0,3 mg/1 kyselina indolyloctová). Následuje růst stonků (os) a tvoří se adventivní orgány, jakož i množení pažních pupenů. Tyto lze výše uvedeným postupem odnímat a pěstovat.

-16CZ 280274 B6

Pro množení rostlin ve větším počtu určené explanáty (třetí pasáže, tj. 3. rozmnožovací generace) se přenesou po nárůstu a vytvoření listů na prvně uvedeném živném prostředí, na živnou půdu, která obsahuje 10 mg/1 kyseliny indolyloctové, nebo 3-indolylmáselné, nebo 0,1 až 0,3 mg/1 kyseliny alfanaftyloctové. přitom se rostlinky zakořeňují, po asi 4 týdnech je lze pěstovat dále ve sterilizované zahradní půdě (spařené po dobu 12 hodin při teplotě 120 C) v květináčích a ve skleníku (za podmínek obvyklých pro sazenice).

Živné prostředí podle Murashige a Skooga:

mg/1

NH₄NO₃400

Ca/NO₃/₂.4 H₂0144

KNO₃80

KH₂PO₄12,5

MgSO₄.7 H₂O72

KC165

NaFe-EDTA25

H₃BO₃1,6

MnSO₄.4 H₂06,5

ZnSO₄.7 H₂02,7

KJ0,75 kyselina indolyloctová2,0 furfuryladenin0,1 thiamin0,1 kyselina nikotinová0,5 pyridoxin0,5 glycin2,0 myo-inosit100 kyselinový hydrolzát1 000 sacharóza 2 % čištěný agarový prášek 1 %

Poznámka k předchozímu výkladu výše:

* Cytokininy jsou fytohormony, které podporují dělení buněk.

Stupeň 2:

Rostliny, získané postupem podle stupně 1, kvetly společně za izolovaných podmínek ve skleníku. Rostliny přitom stály v 11 cm kořenáčích, naplněných zahradní zemí, při teplotách 18 až °C ve dne a 12 až 14 ’C v noci. Délka dne činila nejméně 14 hodin a byla dosahována v zimní polovině roku přídatným osvětlením 200 Watt/m². Voda byla dodávána podle potřeby.

-17CZ 280274 B6

Z celku selektovaných jedinců v časovém rozmezí 4 týdnů byla plynule sklízena za účelem získání osiva ta květenství, která rozkvetla a byla krátce před rozpadem. Sušení bylo prováděno v dobře větrané hale při teplotě vzduchu mezi 20 až 30 “C; potom bylo osivo proseto sítem (5 x 0,4 mm) a přečištěno pomocí prosévacího stroje.

Stupeň 3:

Z osiva, získaného postupem podle stupně 2, byl vzat namátkový vzorek a z něho vypěstováno asi 2 000 kusů potomstva (ekologické podmínky jako ve stupni 2) a podle stejných kritérií A) až D) stupně 1 selektováno. S takto selektovanými jedinci se postupovalo postupem podle stupně 2.

Stupeň 4:

Z osiva podle stupně 3 byl díl vyset na podzim na dvou různých stanovištích.

Stanoviště 1/

450 m NN, 48,5 * N/11,5 Ό,

750 mm celkových ročních srážek, vlhké mírné klima, leden -10 až 0 C, červenec +10 až 20 °C;

vysvětlení zkratek:

NN = severní výška nad mořem N = severní šířka (n-stupeň) Ό = východní délka (n-stupeň)

Stanoviště II/

200 m NN, 42 °N/1 Ό,

400 mm celkových ročních srážek středozemní klima, leden 0 až +10 ’C červenec +20 až +30 °C.

Výsev byl proveden na obou stanovištích v době konec září/začátek října.

Takto získané výsledky polního pokusu byly přezkoušeny a posouzeny (bonitovány) z hlediska homogenního růstu, velikosti květů a termínu sklizně, kromě toho byly zkoumány namátkové vzorky květů na obsah účinných látek. Z polního pokusu byly opět selektováni jedinci, kteří odpovídají uvedeným parametrům ze stupně 1. Z těch bylo získáno osivo, odpovídající stupni 2.

Stupeň 5:

S osivem podle stupně 4 byly opakovány stupně 3 a 4 v udaném sledu a postupu.

-18CZ 280274 B6

Stupeň 6:

Z osiva získaného podle stupně 5 bylo pěstováno asi 1 500 jedinců (ekologické podmínky jako ve stupni 2) a podle stejného principu jako ve stupni 1 selektováno. Z takto vyselektovaných rostlin bylo vybráno 34 jedinců a klonováno podle stupně 1. Vždy 10 rostlin každého klonu bylo pěstováno v náhodném rozdělení ve vzdálenosti 40 x 30 cm volné na poli (stanoviště I, viz stupeň 4), na izolovaném místě. Půdou byl propustný jíl o hodnotě pH 7,0; pěstování bylo prováděno začátkem června, první sklizeň uprostřed července, potom byly rostliny seřezány, kvetly znovu a poskytly od středu do konce srpna druhou sklizeň osiva.

Získání osiva z tohoto materiálu bylo provedeno postupem jako ve stupni 2.

Osivo, získané podle stupně 6, je osivo k množení heřmánku podle vynálezu.

Květy rostlin z tohoto osiva k množení (výsev září/říjen, sklizeň začátek června následujícího roku), které jsou sklizeny v době, když 30 až 70 % trubkových květů je otevřeno, a potom ihned sušeny při teplotě 40 *C ve skříňové sušárně po dobu 72 hodin, obsahují, vztaženo na hmotnost sušených květů (sušina) například minimálně: 150 mg% chamazulenu, 300 mg% /-/-alfa-bisabololu a maximálně 50 mg% ostatních bisaboloidů.

Další příkladné údaje k rostlinám, získaným podle vynálezu:

1. Růst

Stonek: přímý, málo větvený

2. Olistění

List: 2 až 3x zpeřený

Síla: střední zpeřený list, barva středně zelená, zpeřený list (střed stonku);

zpeření: středné až silné zpeřený.

3. Květenství

Květní hlavičky (květenství):

asi 30 mm vnější průměr, asi 15 mm vnitřní průměr;

Hmotnost jednotlivého květenství (sušeného): asi 45 mg;

Květní výhonek, délka (mm): asi 700 avšak závislá na pěstební lokalitě (klima), době výsevu, půdě, hnojení, ošetření rostlin, počasí;

Počátek kvetení (počítáno od 1. ledna):

asi 160. den (výsev září, stanoviště Freising, Spolková republika Německo, jinak závislé na výše uvedených faktorech).

-19CZ 280274 B6

Květy: Střed června (viz výše);

Květenství bez stopky, obsah silice (% sušiny): asi 1,0 %; obsah azulenu v silici: minimálně 15 %.

Rozpad sušených květenství, květové drogy: nepatrný, byla-li sklizeň provedena před otevřením posledních trubkových kvétů;

Průměr pylu: asi 30 μια; Délka semena: asi 1,25 mm; Počet chromozomů v somatických buňkách: 4n = 36.

4. Plod hmotnost tisíce semen (TKM): 0,06 až 0,13 g:

5. Klíčivost (KF) asi 75 %

6. Čistota až 95 %.

7. Další znaky

Poměr usušeni kvétů čerstvých: suchým = 5,5 až 6:1, charakteristická aromatická vůně drogy, jemně aromatická, typická chuť čajového nálevu.

Mohou kromě toho existovat následující vlastnosti:

Jednotný výškový růst (vyrovnanost) s úzkou květní zónou, tudíž obzvláště vhodné pro mechanickou sklizeň, velké květní košíčky (květenství), středné vysoký výnos; základně větvená forma (3 až Stinásobné).

Získávání drogy:

Heřmánek, získaný podle tohoto příkladu, se vyseje obvyklým způsobem na poli. Jakmile se rostliny vyvinuly a květenství je ve vegetačním stadiu, kdy asi 50 % trubkových kvétů je otevřeno, se heřmánek sklízí strojem na sklízení heřmánku, přičemž vzdálenosti hřebenů sklízecího stroje jsou nastaveny tak, aby byla sklízena jenom květenství, jejichž trubkové kvéty jsou otevřeny z 50 %. Sklizeň se pokud možno co nejrychleji dopraví na stinné místo a tam se až do dalšího zpracování rozprostře v tenké vrstvě. Potom se květenství odstraní pomocí sítového zařízení od lodyh a suší se až do konstantní hmotnosti. Ztráta hmotnosti činí asi 80 %. Sušení se provádí ve stínu na dobře větraném místě ve vrstvě o tloušťce asi 10 cm.

Asi po uplynutí 2 až 3 dnů je sušení skončeno. K odstranění částic lodyh a květního odpadu se heřmánková droga sítuje a potom lisuje do balíků.

-20CZ 280274 B6

Analýza

Silice: 960 mg% chamazulen: 162 mg% /-/-alfa-bisabolol 330 mg%

Provádi-li se sušení například ve stacionární pásové sušičce pomocí uměle ohřívaného vzduchu při teplotě mezi 50 a 70 °C, potom je sušení skončeno asi během 4 až 5 hodin. K odstranění částí lodyh a květního odpadu se droga sítuje a potom lisuje do balíků. Hodnoty analýzy takové drogy jsou následující:

silice: 870 mg% /-/-alfa-bisabolol: 197 mg% chamazulen: 94 mg%

Příklad 2 (Výchozí heřmánek je tetraploidní)

Variabilitním testem jednotlivých rostlin, provedeným na 10 000 rostlinách tetraploidní odrůdy heřmánku, podle I. Sarkánye (Herba Hungar. 4, 1, 125-169, 1965), bylo shledáno, že na asi 1 000 jedinců připadá jedna rostlina, která má v silici vysoký obsah chamazulenu 20 hmot. %, jakož i vysoký obsah /-/-alfa-bisabololu 50 hmot. %, přičemž zároveň obsah ostatních bisaboloidů, zejména /-/-alfa-bisabolonoxidu je velmi nepatrný (méně než 5 hmot.%).

Tyto jedinci byli vyselektováni a podrobeni následujícím stupňům:

Stupeň 1:

Z potomstva výše popsaných vyselektovaných tetraploidních heřmánkových rostlin byly vybráni takoví jedinci, kteří dosahují minimálního obsahu chamazulenu 100 mg% a /-/-alfa-bisabololu 200 mg% nebo jej překračují, a u nichž obsah ostatních bisaboloidů (zejména bisabololoxidů) je pod 50 mg%. Veškeré hodnoty se vztahují na květenství, která byla sušena při asi 40 ’C a jejichž sklizeň byla provedena ve stadiu, kdy asi 30 až 70 % všech trubkových květů květenství bylo otevřeno.

Stupeň 2

Z rostlin, získaných podle stupně 1, byly odstraněny všechny rozkvetlé květní hlavičky (květenství), potom přišly rostliny do skleníku a odkvetly za izolovaných podmínek společně. Rostliny přitom stály v 11-centimetrových květináčích, naplněných zahradní zemí, při denní teplotě 18 až 24 ’C a při noční teplotě 12 až 14 *C. Délka dne byla minimálně 14 hodin a byla v zimním pololetí dosahována přídatným osvětlením 200 W/m². Dodávka vody se prováděla podle potřeby.

Z celkového souhrnu selektovaných jedinců byla průběžně v období čtyř týdnů sklízena ta květenství, za účelem získávání osiva, která byla rozkvetlá a byla krátce před rozpadnutím. Sušení se provádělo v dobře provětrávané dvoraně (hale) při teplotě

-21CZ 280274 B6 vzduchu mezi 20 a 30 ’C; nového síta (5 x 0,4 mm) ce.

poté bylo osivo proséváno pomoci štěrbia dále přečišťováno na třepací prosévačStupeň 2 poskytuje osivo, které je osivem pro množení heřmánku pro postupy podle vynálezu.

Květy z rostlin z tohoto rozmnožovacího osiva (výsev září-říjen, sklizeň počátkem června následujícího roku), které jsou sbírány v tom období, kdy je otevřeno 30 až 70 % trubkových květů a které ihned potom byly sušeny ve skříňové sušárně při teplotě 40 ’C po dobu 72 hodin, obsahují, vztaženo na hmotnost usušených květů, nejméně 100 mg% chamazulenu, nejméně 200 mg% /-/-alfa-bisabololu a nejvýše 50 mg% ostatních bisaboloidů.

Získávání drogy:

Heřmánek, získaný podle tohoto příkladu, se vysévá obvyklým způsobem na poli. Jakmile se rostliny vyvinuly a květenství jsou ve vegetačním stadiu, kdy je asi 50 % trubkových květů otevřeno, sklízejí se tato květenství pomocí sklízecího stroje na heřmánek, přičemž vzdálenosti hřebenů sklízecího stroje jsou nastaveny tak, aby byly odtrhávány jenom ty květní hlavičky (květenství), jejich trubkové květy jsou otevřeny z padesáti procent. Sklizený materiál se dopraví co nejrychleji do stinného místa a tam se až do dalšího zpracování rozprostře v tenké vrstvě. V následné operaci se květní hlavičky (květenství) v odsévacím zařízení zbaví stonků a suší až k dosažení ustálené hmotnosti. Hmotnostní ztráta činí asi 80 %. Sušení se provádí ve stínu na dobře větraném místě na plošinách o tloušťce vrstev asi 10 cm.

Asi po 2 až 3 dnech je sušení ukončeno. Pro odstranění stonkových částí a květového odpadu se heřmánková droga prosévá na sítech a v zápětí se lisuje do balíků.

Analýza:

silice: 940 mg% chamazulen: 132 mg% /-/-alfa-bisabolol: 243 mg%

Provádí-li se sušení kupříkladu ve stacionárním pásovém sušicím zařízení pomocí uměle ohřívaného vzduchu, při teplotě mezi 50 a 70 °C, pak je sušení ukončeno asi po čtyřech až pěti hodinách. Pro odstranění částí stonků a květního prachu se droga prosévá na sítech, v zápětí nato se lisuje do balíků.

Hodnoty, zjištěné analýzou takovéto drogy, jsou například následuj ící:

silice: 775 mg% chamazulen: 65 mg% /-/-alfa-bisabolol: 163 mg%.

-22CZ 280274 B6

Příklad 3 (Výchozí heřmánek je diploidní)

Pomocí testů variability jednotlivých rostlin diploidních, málo bisabololu obsahujících, avšak nikoliv bisabololu prostých heřmánků, které jsou popsány CH. Franzem a J. Hólzlem a A. Vomelem v Acta Horticulturae 73, 109-114 (1978), bylo nalezeno, že maximálně až 20 % všech rostlin má v silici obsah asi 20 hmotnostních procent a/nebo vysoký obsah 50 hmotnostních procent /-/-alfa-bisabololu, přičemž současné obsah ostatních bisaboloidů (zejména /-/-alfa-bisabolonoxidu) je velice nízký. Tito jedinci byli vyselektováni a následujícím způsobem tetraplodizováni:

Semena takto vyselektovaných rostlin heřmánku byla nanesena na filtrační papír, napojený 0,05% vodným roztokem kolchicinu a při teplotě místnosti (20 °C) ponechána po dobu 6 hodin bobtnat. Potom byla odstraněna z filtračního papíru, několikrát promyta vodou a vyseta do lísek ve skleníku. Půda: směs rašelína + písek 1:1, teplota: 18 až 20 *C, relativní vlhkost: asi 60 %, délka dne při umělém osvětlení: 14 hodin.

Klíčící rostliny byly pozorovány až do doby kvetu, úspěch polyplodizace byl hodnocen pomocí srovnávacího měřeni velikosti pylu a semen, jakož i podle počtu chromozomů rostlin (Fj-potomstvo = první ze semen vypěstované potomstvo, které bylo potvrzeno jako tetraploidní kolchicinované rostliny).

Tetraplodizaci lze provádět i následujícím způsobem:

Na vodou navlhčeném filtračním papíru vyklíčené 5 až 7 dní staré dobře vyvinuté rostlinky heřmánku byly postaveny při teplotě místnosti (20 ’C) po dobu 4 až 6 hodin zárodečnými listy směrem dolů do 0.05% roztoku kolchicinu. Přitom byly ošetřeny citlivé kličkové kořeny; aby se na nich zamezilo škodám při sušení, musí okolní atmosféra obsahovat přibližně 100 % relativní vzdušné vlhkosti. Po ošetření byly klíčící sazenice vícekrát omyty vodou a pikírovány do lísek. Následovalo další ošetření jako u semen.

Měření velikosti pylu bylo prováděno pomocí Leitzova binokulárního mikroskopu s mikrometrickým měrným okulárem a mikrometrickým nosičem předmětu.

Počítání chromozomů se provádí na špičkách kořenů: Z mladých rostlin, vypěstovaných ve skleníku nebo z hříženců, byly odebrány 1 až 2 cm dlouhé čerstvé kořenové konce a ponořeny po dobu 5 hodin do 0,002 molárního roztoku hydroxychinolinu a potom vloženy po dobu 15 minut do IN HC1. Pro vyšetření se asi 1 mm kořenového vrcholu obarví 2% roztokem orcein, kyselina octová a pomocí mikroskopu se vyšetří v olejové imerzi. U buněk, nalézajících se v mitóze, lze tak stanovit 4násobný počet chromozomů (somatických buněk 4n = 36).

Ty rostliny, u kterých průměr pylu je cca o 50 % vyšší než u diploidního výchozího materiálu (cca 30 místo 20 μπι) a u těch, kde byl počet chromozomů zdvojnásoben na 36 (u diploidního výchozího materiálu je odpovídající číslo 18), jsou tetraploidní. Tyto

-23CZ 280274 B6 byly vyselektovány. Přibližné 0,1 až 0,5 % semen, případné klíčících sazenic, bylo výše uvedeným způsobem tetraploidizováno a rozvíjely květuschopné intaktní rostliny. Nyní navazují stupně 1 a 2, odpovídající příkladu 2.

Květy takto získaného heřmánku obsahují například nejméně 100 mg% chamazulenu, 200 mg% /-/-alfa-bisabololu' a nejvýše 50 mg% ostatních bisaboloidů (sklizeň provedena v době, kdy 30 až 70 % všech trubkových květů je otevřeno a sušeny 72hodinovým sušením v sušárně při teplotě 40 °C).

Získávání drogy:

Heřmánek, získaný podle tohoto příkladu, se vyseje obvyklým způsobem na poli. Když se rostliny rozvinuly a květenství jsou ve vegetačním stadiu, kdy asi 50 % trubkových květů je otevřeno, se tato květenství sklízí mechanizovaně, přičemž vzdálenosti hřebenů sklízecího stroje jsou voleny tak, aby byla trhána jenom ta květenství, jejichž trubkové kvéty jsou z 50 % otevřeny. Sklizený materiál se pokud možno rychle přenese na stinné místo a tam se rozprostře v tenké vrstvě až do dalšího zpracování. Potom se květenství zbaví sítováním zbytků stonků a suší se až do dosažení konstantní hmotnosti. Ztráta hmotnosti činí asi 80 %. Sušení se provádí ve stínu na dobře větraném místě ve vrstvě tloušťky asi 10 cm.

Sušení je asi po 2 až 3 dnech skončeno.

Pro odstraněni zbytků stonků a květního odpadu se droga sítuje a potom lisuje do balíků.

Analýza:

silice: 910 mg% chamazulen: 117 mg% /-/-alfa-bisabolol: 252 mg%

Příklad 4 (výchozí heřmánek je diploidní)

Pomocí testů variability jednotlivých diploidních heřmánků jenom málo bisabololu obsahujících, avšak nikoliv prostých bisabololu, popsaných Ch. Franzem, J. Hólzlem a A. Vómelem v Acta Horticulturae 73, 109-114 (1978), bylo nalezeno, že maximálně až 20 % všech jedinců má v silici obsah chamazulenu asi 20 hmotnostních procent a/nebo vysoký obsah /-/-alfa-bisabololu 50 hmotnostních procent, přičemž současně obsah ostatních bisaboloidů (zejména /-/-alfa-bisabolonoxidu) je velmi nízký. Tito jedinci se selektují a přesné tak, jak je to uvedeno v příkladu 3, se tetraploidizuji a tetraploidní jedinci se vyselektují. Asi 0,1 až 0,5 % semen, případně sazenic, bylo tetraploidizováno a vyvinulo květuschopné intaktní rostliny.

Dále navazují například stupně 1 až 6, odpovídající příkladu

1.

-24CZ 280274 B6

Květy takto získaného heřmánku obsahují například nejméně 150 mg % chamazulenu, 300 mg% /-/-alfa-bisabololu a nejvýše 50 mg% ostatních bisaboloidů (sklizeň v době, kdy 30 až 70 % trubkových květů, je otevřeno, a pak 72hodinové sušení ve skříňové sušárně při teplotě 40 ’C).

Ostatní vlastnosti odpovídají heřmánku, získanému podle příkladu 1.

Získávání drogy:

Heřmánek, získaný podle tohoto příkladu, se vyseje obvyklým způsobem na poli. Jakmile se rostliny vyvinuly a květenství jsou ve vegetačním stadiu, kdy asi 50 % trubkových květů je otevřeno, se tato květenství sklízejí sklízecím strojem, přičemž vzdálenosti mezi hřebeny jsou nastaveny tak, aby jenom ta květenství, jejichž trubkové kvéty jsou z 50 % otevřeny, byla trhána. Sklizeň se přepraví pokud možno rychle na stinné místo a tam se rozprostře v tenké vrstvě až do dalšího zpracování. Potom se květenství zbavují zbytků stonků síťováním a suší se až do dosažení konstantní hmotnosti. Ztráta hmotnosti činí asi 80 %. Sušení se provádí ve stínu na dobře větraném místě ve vrstvě tloušťky asi 10 cm.

Po asi 2 až 3 dnech je sušení skončeno, za účelem odstranění zbytků stonků a květního odpadu se heřmánková droga sítuje a potom se lisuje do balíků.

Analýza silice: 1 020 mg% chamazulen: 173 mg% /-/-alfa-bisabolol: 418 mg%

Příloha A

Výchozím materiálem je droga z heřmánku, získaného podle vynálezu. Při výrobě drogy se používají jenom ta květenství, u kterých je 30 až 70, zejména 40 až 60 % trubkových květů otevřeno. Sušení se provádí ve skříňové sušárně po dobu 72 hodin při teplotě 40 ’C. Silice heřmánkových květů se získává, jak bude dále popsáno, dvouhodinovou destilací drogy vodní párou:

2,0 g nerozdrobnéné drogy se smíchají v litrové kulaté baňce se 250 ml odsolené vody a podrobí se destilaci na Clevengerové refluxním zařízení (aparatura pro destilaci vodní párou) pro kvantitativní hodnocení malých množství silic. Jako předloha slouží 1 ml pentanu čistoty pro analýzu. Rychlost varu pod zpětným chladičem (rychlost refluxování činí 40 ± 4 kapky za minutu. Po skončení destilace se v pentanu rozpuštěná silice, pokud možno bezvodá, vypustí do zkumavek, a V aparatuře případně ulpélá silice se opláchne do dalšího pentanu. Pro odstranění případných zbytků vody se přidá k roztoku malé množství (na špičku lžičky) bezvodého síranu sodného a roztok se potom přefiltruje přes skleněnou fritu o poréznosti D₃ nebo D₄. Po odpaření pentanu při teplotě 40 C na vodní lázni a dosušení v exsikátoru se množství silice stanoví gravimetricky.

-25CZ 280274 B6

V této takto získané silici (asi 20 mg) se potom stanoví chamazulen a bisabolol.

Spektrální fotometrické stanovení chamazulenu

Měrný roztok: Veškerá ze 2 g drogy získaná silice (asi 20 mg), získaná, jak je popsáno vpředu, se rozpustí ve 25 ml n-hexanu nebo cyklohexanu

Měřicí zařízení: Fotometr s filtrem (například Eppendorf).

Vlnová délka: 578 nm

Kyveta: 1 cm

Specifické extinkce chamazulenu (1 g/100 ml; 1 cm):

20,8

Kompenzační tekutina: n-hexan nebo cyklohexan

Nalezený obsah chamazulenu v mg/100 g:

120 E₅₇₈

Není-li pro měření k dispozici fotometr s filtrem, lze toto měření provést i pomocí spektrálního fotometru takto:

Měřicí zařízení: Spektrální fotometr (například PM QII) nebo PM Q III Zeiss)

Vlnová délka: 605 nm

Kyveta: 1 cm

Specifická extinkce chamazulenu (1 g/100 ml;

cm/: 24,5

Kompenzační tekutina:

n-hexan nebo cyklohexan

Nalezený obsah chamazulenu v mg/100 g:

^{102 e}605

V měřeném roztoku se potom určí bisabolol.

Plynově chromatografické stanovení bisabololu a ostatních bisaboloidů

Plynový chromatograf: Hewlet Packard model 5750, Erba Fractovap

2350 nebo podobné zařízení,

Detektor: plamenový ionizační detektor,

Nosný plyn: helium,

-26CZ 280274 B6

Sloupec:	3,175 mm (= 1/8 palce); 200 cm; ocel,
Náplň sloupce:	3% nitrilsi1ikonový kaučuk XE 60 na silanované křemeliné chromosorb WAP HP 125 až 150 μπι jako nosič,

Teplota detektoru: vstřikovacího bloku: sloupce: Teplotní programování Roztok vzorku: Srovnávací roztok:	320 *C, 220 ’C, 85 až 220 ’C, 4 ·/minuta, použije se roztok pro měření chamazulenu, asi 15 mg standardního bisabololu se rozpustí v cyklohexanu na objem 25 ml,
Vstřikované množství:	po 5 μΐ roztoku vzorku a srovnávacího roztoku,
Vyhodnocení:	Vyhodnocení se provádí srovnáním maxim (ploch píků),
Obsah bisabololu v mg na 100 g drogy:	10 x navážka (srovnání) (mg) x Plocha (vzorek) Plocha (srovnání)

Stanovení ostatních bisaboloidů lze provádět rovněž pomocí plynové chromatografie, například za následujících podmínek:

Zařízení: Packard, model 7721, serie 800, případně

Erba Fractovap série 2350,

Sloupce: skleněné sloupce 3 m/2 mm v průměru;

m/2 mm v průměru,

Náplň: 3 % methylfenylsilikonového kaučuku ”0V 1 na silanované křemeliné Gaschrom Q 125 až 150 μπι jako nosič,

Nosný plyn: 30 ml/minuta N₂,

Teplotní program: 80 až 180 ’C, 2,5 (3/^eC) minuta,

Teplota injektoru/ detektoru: 200 C,

Detektor: plamenový ionizační detektor

Vstřikované množství: asi 2 μΐ cca 1:50 zředěné silice,

Hodnocení probíhá částečné bez, částečně s vnitřním standardem. Jako vnitřní standard je vhodný methylester kyseliny laurové nebo hexadekan pro chamazulenem chudé, případné chamazulenu prosté silice. U silic s obsahem nad 5 % je třeba dát tomuto přednost jako vnitřnímu standardu, přičemž stanovení obsahu se provádí fotometricky (při 578 nm).

-27CZ 280274 B6

Příklad 5

Výroba extraktu 2 heřmánkové drogy

Květy heřmánku pro použitou drogu se sklízejí podle příkladu 1 v době, kdy 30 až 70 % trubkových květů je otevřeno a jsou sušeny při teplotě nepřevyšující 50 ’C.

400 g takto získané heřmánkové drogy o obsahu 105 mg% chamazulenu a 212 mg% /-/-alfa-bisabololu se extrahuje se 2 100 g vodného ethanolu (40 hmotnostnostních procent ethanolu) v korýtkové míchačce při 30 otáčkách za minutu po dobu 3 hodin. Materiál drogy se potom vylisuje a extrakt se filtruje.

V extraktu se známým způsobem stanoví obsah účinné látky:

Chamazulen: 3,7 mg% /-/-alfa-bisabolol: 10,2 mg%

Příklad 6

Příprava extraktu z čerstvého heřmánku

758 g čerstvých květů heřmánku, které byly sklizeny podle příkladu 1 v době, kdy 30 až 70 % trubkových květů je otevřeno (obsah vody 74 %) se extrahuje v korýtkové míchačce při frekvenci 65 otáček za minutu po dobu 30 minut se 510 g ethanolu (84 hmotnostních procent). Zbytek drogy se vylisuje a extrakt se zfiltruje.

V extraktu se známým způsobem stanoví obsah účinných látek:

Chamazulen: 11,7 mg% /-/-alfa-bisabolol: 16,3 mg%

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy nového bisabololem bohatého tetraploidního heřmánku kulturního rostlinného druhu heřmánek pravý (Chamonilla recutita L., synonymního s Matricaria chamonilla L., Asteraceae), jehož při teplotě 40 “C sušené kvéty obsahují, vztaženo na sušinu, alespoň 100 mg% chamazulenu, alespoň 200 mg% (-)-a-bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů, s výjimkou odrůdy heřmánku Manzana, vyznačuj íc í se tím, že se u 1 000 až 10 000 jednotlivých rostlin diploidní nebo tetraploidní populace heřmánku stanoví v silici obsah (-)-a-bisabololu a vyselektují se ty rostliny heřmánku, u nichž představuje (-)-a-bisabolol hlavní složku silice, a u nichž kvéty, sušené při 40 ’C, obsahují alespoň 100 mg% chamazulenu, alespoň 50 až 100 mg% (-)-a-bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů, tyto rostliny se z výchozí populace oddělí, namnoží a podrobí dalším, selekčním a množícím stupňům a popřípadě se z rostlin takto získaného heřmánku získá osivo na množení a/nebo heřmánková droga, přičemž v případé, že se jako z výchozího heřmánku použije diploidního heřmánku, z něhož je vyloučena odrůda Degumill, provede se po dokončení všech selekčních kroků tetraploidizace pomocí chemikálií při teplotách v rozmezí od 0 do 35 ’C, pomocí gannna-záření, rentgenového záření, nebo UV záření při teplotě od 0 do 35 °C, pomocí zvýšených teplot v rozmezí od 33 do 50 ’C, pomocí snížených teplot v rozmezí od 0 do 5 °C, pomocí dekapitačné-kalusové metody nebo pomocí prašníkových kultur.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že selekce nebo množení sestává z následujících kroků:

a) selekce nejméně 10 jedinců tetraploidních rostlin podle obsahu účinné látky, tj. nejméně 100 mg% chamazulenu, nejméně 200 mg% bisabololu a méně než 50 mg% ostatních bisaboloidů, vše vztaženo na suchou látku, podle současností doby květu, podle rovnoměrnosti základního větvení, jakož i podle velikosti květů od 20 až 40 mm, klonování takto vyselektovaných rostlin a získávání osiva z rostlin, získaných klonováním.

b) pěstování potomstva z osiva, získaného podle odstavce a), následné selekce podle odstavce a) a získávání z osiva z takto vyselektovaných rostlin,

c) troj- až pětinásobného opakování opatření podle odstavce b),

d) pěstování potomstva z osiva, získaného podle odstavce c), selekce těchto potomků podle odstavce a), klonování takto selektovaných rostlin a získávání osiva z rostlin, získaných klonováním.