FI81007C - Foerfarande foer erhaollandet av ett aemne med antiinflammatorisk verkan ur matricaria chamomilla. - Google Patents

Description

1 81007

Menetelmä aineen saamiseksi, jolla on tulehduksenvastais-ta vaikutusta, Matricaria chamomillasta

Keksintö koskee menetelmää aineen saamiseksi, jol-5 la on tulehduksenvastaista vaikutusta, Matricaria chamomillasta.

Lääkeaineilla ja kosmeettisilla aineilla, jotka on valmistettu aidon kamomillasaunion (Chamomilla recutita (L.) Rauschert, synonyymi Matricaria chamomilla L.:lle) 10 mykeröistä, on niiden tulehduksenvastaisen ja spasmolyyt- tisen vaikutuksen vuoksi laajaa käyttöä. Erityistä merkitystä on tällöin vaikuttavilla aineilla (-)-a-bisabolo-lilla ja kamatsuleenilla. Kamomillasauniosta valmistetun aineen tulisi tästä syystä sisältää mahdollisimman paljon 15 näitä molempia aineita.

Nyt on keksitty menetelmä uuden aineen valmistamiseksi käyttämällä tetraploidista kamomillasauniota, jolla aineella on edullisia ominaisuuksia.

Esillä olevan keksinnön tehtävänä on valmistaa ai-20 ne, jolla on tulehduksenvastaista vaikutusta, joka johtuu erityisesti (-)-a-bisabololin ja kamatsuleenin korkeasta pitoisuudesta, jolloin kamatsuleenin pitoisuus on vähintään 30 mg-%, (-)-a-bisabololin pitoisuus on vähintään 100 mg-% ja muiden bisaboloidien pitoisuus on vähemmän 25 kuin 50 mg-%. Nimityksellä "muut bisaboloidit" tarkoitetaan erityisesti (-)-a-bisabololioksidi A:ta ja B:tä sekä (-)-a-bisabolonioksidi A:ta.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että diploidisen tai tetraploidisen kamomillapopulaa-30 tion 1 OOOrsta - 10 000:sta yksittäisestä kasvista määritetään kulloinkin eteerisen öljyn (-)-a-bisabololin pitoisuus ja valitaan ne kamomillakasvit, joilla (-)-a-bis-abololi edustaa eteerisen öljyn pääkomponenttia, jolloin tetraploidisen lähtökamomillan ollessa kyseessä, 40°C:ssa 35 kuivatut kukat sisältävät vähintään 100 mg-% kamatsulee-nia, vähintään 200 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän 2 81007 kuin 50 mg-% muita bisaboloideja, ja diploidisen lähtöka-momillan ollessa kyseessä, 40°C:ssa kuivatut kukat sisältävät vähintään 100 mg-% kamatsuleenia, vähintään 50 -100 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita 5 bisaboloideja, ja edellyttäen, että diploidinen lähtöka-momilla ei ole kamomillalajike Degumill, lähtöpopulaatiosta erotetut kamomillat kasvatetaan edelleen ja näistä kasveista valitaan vähintään 10 yksilöä, joilla on samanaikainen kukintakausi, joiden mykeröiden koko on 20 - 40 10 mm ja joiden vaikuttavan aineen pitoisuus on vähintään 100 mg-% kamatsuleenia, vähintään 200 mg-% bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloideja (kaikki laskettuna kuiva-ainepitoisuudesta), mahdollisesti nämä valitut diploidiset tai tetraploidiset kasvit lopuksi kloonataan, 15 ja a) näin saaduista kasveista otetaan siemeniä, b) kasvatetaan kohdassa a) saatujen siemenien jälkeläisiä, tehdään lopuksi valinta vaikuttavan aineen pitoisuuden sekä samanaikaisen kukintakauden, säännöllisen 20 juuresta lähtevän haarautumisen ja 20 - 40 mm:n mykeröi den koon perusteella, kuten edellä on kuvattu, mahdollisesti näin valitut kasvit kloonataan ja otetaan niistä siemeniä, c) kohdan b) toimenpiteet toistetaan 3-5 kertaa, 25 d) kasvatetaan kohdassa c) saatujen siemenien jäl keläisiä, jälkeläisistä suoritetaan valinta kohdan a) mukaisesti, mahdollisesti näin valitut kasvit kloonataan ja otetaan siemeniä näin saaduista kasveista, ja diploidisten kamomillojen ollessa kyseessä, nä-30 mä tetraploidisoidaan lopuksi kemikaalien avulla lämpöti la-alueella 0 - 35°C, gamma-säteiden, röntgensäteiden tai UV-säteilyn avulla 0 - 35°C:ssa, korkeampia lämpötiloja 30 -50°C käyttäen, alemmissa lämpötiloissa 0 - 5°C:ssa tai dekapitointikallusmenetelmällä tai heteen ponsivil-35 jelmän avulla, joka lopuksi tetraploidisoidaan ja näin saaduista kasveista kerätään kukat, jotka ovat kasvuvai- 3 81 007 heessa, jossa 30 - 100 % mykerön torvikuklsta on avautunut, ja kuivataan ne korkeintaan 70°C:n lämpötilassa, jotta saadaan kuivaa materiaalia, joka sisältää vähintään 30 mg-% kamatsuleenia, vähintään 100 mg-% (-)-a-bisabolo-5 lia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloideja; ja mahdollisesti näin saadusta kuivasta materiaalista valmistetaan tislaamalla veden läsnäollessa eteerinen öljy, joka sisältää vähintään 3,5 % kamatsuleenia, vähintään 10 % (-)-a-bisabololia sekä vähemmän kuin 10 % muita bisaboloi-10 deja, tai uuttamalla alempien alkoholien kanssa valmiste taan alkoholipitoinen kamomillasauniouute, joka sisältää vähintään 1,5 mg-% kamatsuleenia, vähintään 5,0 mg-% (-)-α-bisabololia ja vähemmän kuin 10 mg-% muita bisaboloideja.

15 Esillä olevan keksinnön mukaisessa valmistusmene telmässä käytetään tetraploidista kamomillasauniota, jossa eteerisen öljyn pääkomponenttina on (-)-a-bisabololi.

Näistä kamomillasaunioista valitaan kasvit, joiden 40°C:ssa kuivatut kukat sisältävät kamatsuleenia vähin-20 tään 100 mg-%, (-)-a-bisabololia vähintään 200 mg-% ja muita bisaboloideja korkeintaan 50 mg-% (kukkien korjuu-ajankohtana, jolloin mykeröiden torvikukista kukkii 30 -70 %), ja tähän liitetään muita valinta- ja kasvuvaiheita (kantamuodon kasvatus vegetatiivisesti lisättävää risti-25 hedelmöittäjää varten).

Tetraploidisina kamomillasaunion kantakasveina tulevat kysymykseen esimerkiksi kamomillasauniolajikkeet Bodagols (Saksan Demokraattinen Tasavalta), Pohorelicky (Tsekkoslovakia), Zloty Lan (Puola) ja BK-2 (Unkari).

30 Näitä lajikkeita on kuvattu kirjallisuudessa seuraavissa julkaisuissa: M. Chlädek ja V. Kosova, Pharmazie 13, (1958), ss. 712 -713; W. Czabajska, Diss. Poznän (1963); 35 W. Poethke ja P. Bulin, Pharm. ZHalle 108 (1969), ss. 813 - 823; ja I. Särkäny, Herb. Hungar. 4 (1) (1965), ss. 125 - 169.

4 81007

Muuten pidetään tetraploidisia kamomillasaunion lähtökasveja (-)-a-bisabololipitoisuuden suhteen samanarvoisina kuin diploidisia kamomillasaunion lähtökasveja (kts. edelleen jatkossa).

5 Tetraploidisen kamomillasaunion lähtökasvi voidaan saada myös diploidisista kamomillasaunioista, joilla (-)-a-bisabololi edustaa eteerisen öljyn pääkomponenttia. Sellaiset diploidiset kamomillasauniot tetraploidisoidaan (geenimutaatio), valitaan näin saadut tetraploidiset kas-10 vit ja näistä valituista tetraploidisista kasveista valitaan jälleen ne kasvit, joiden 40°C:ssa kuivatuissa kukissa kamatsuleenin vähimmäispitoisuus on 100 mg-%, (-)-a-bisabololin vähimmäispitoisuus on 200 mg-% ja muiden bisaboloidien määrä on korkeintaan 50 mg-% (kukkien 15 korjuu tapahtuu ajankohtana, jolloin mykerön torvikukista 30 - 70 % on avautunut), ja mahdollisesti tähän liittyy muita valinta- ja kasvuvaiheita esimerkkien mukaisesti.

Diploidisten kamomillasaunioiden lähtökasvit saadaan esimerkiksi seuraavista kamomillasaunioista: 20 "Kamomille argentinischer Provenienz" [kts. L. Z. Padula, R. V. D. Rondina ja J. D. Coussio; Quantitative Determination of Essential Oil, Total Azulenes and Chamazulene in German Chamomille, Matricatia chamomilla, Cultivated in Argentina; Planta med. 30 (1976), ss. 273 - 280]; 25 samoin kuin kaikki kamomillasauniot, joiden eteerisissä öljyissä on selvästi mittavia konsentraatioita (-)-a-bis-abololia (tavallisesti yli 5 % eteerisestä öljystä). Kysymykseen tulevat esimerkiksi sellaiset diploidiset kamomillasauniot, joita kuvataan seuraavissa kirjallisuus-30 viitteissä: H. Schilder; "Neuere Erkenntnisse bei der Qualitätsber-teilung von Kamilleöl bezieungsweise KamilleblUten", Planta med. 23 (1973), ss. 132 - 144; 0. Motl, M. Felklovä, V. Lukes ja M. Jasicovä; "Zur 35 gaschromatographisen Analyse und zu chemischen Typen von kamilleöl", Arch. Pharm. 310 (1977), ss. 210 - 215; ja li 5 81007

Ch. Franz, J. Hölzl ja Vömel; "Preliminary Morphological and Chemical Characterization of some Populations and Va-rietes of Matricaria chamomilla L.", Acta Hort. 73 (1978), ss. 109 - 114.

5 Käytettäessä lähtökasvina kamomillalajiketta DEGUMILL saadaan myös esimerkiksi tetraploidinen kamomil-lasaunio, jonka kamatsuleenipitoisuus on vähintään 150 mg-% ja bisabololipitoisuus on vähintään 200 mg-%, siinä tapauksessa, että kamomillasaunion kukkien mykeröt kor-10 jataan kasvuvaiheessa, jossa vasta 30 - 70 % mykerön tor-vikukista on avautunut, ja kuivaus suoritetaan ilman lämpötilassa, joka on korkeintaan 50°C (DE-patentti-julkaisu 2 402 802).

Tämän julkaisun mukaisesti jälkeenpäin liitettyjen 15 valinta- ja kasvuvaiheiden avulla voidaan tässä yhteydessä vielä lisätä mainittuja bisabololi- ja atsuleeniarvo- ja·

Kamomillasaunion eteerinen öljy koostuu tavallisesti pääkomponenteista, farneseenista, spatulenolista, 20 kamatsuleenista ja yhdestä bisaboloidista neljän bisabo- loidin joukosta [(-)-a-bisabololi, bisabololioksidi A, bisabololioksidi B tai bisabolonioksidi, sikäli kun on kysymys yksittäisistä kasveista; sekanäytteisiin sekä tetraploidisiin yksilöihin voi rinnan sisältyä useampia 25 bisaboloideja] sekä spiroeettereistä. Mainitut aineet muodostavat parhaasta päästä 70 - 80 % eteerisestä öljystä. Tämän vuoksi erityisen sopivia ovat diploidiset kamo-millasaunioiden kantakasvit, joissa (- )-ct-bisabololi muodostaa pääkomponentin (enemmän kuin puolet edellä mainit-30 tujen aineiden summasta). Kamomillasaunion lähtökasveina erityisesti tulevat kysymykseen diploidiset kamomillasau-niot, joilla esimerkiksi (-)-a-bisabololi muodostaa vähintään 40 % eteerisestä öljystä tai vähintään 90 % bis-aboloideista.

6 81007

Erityisesti tulevat kysymykseen sellaiset diploi-diset tai tetraploidiset kamomillapopulaatiot, jotka roh-dosnäytteissä tavallisesti sisältävät vähintään 100 mg-% kamatsuleenia ja 50 - 100 mg-% (-)-a-bisabololia 5 (40°C:ssa kuivattujen kukkien kuiva-aineen suhteen); tämä merkitsee sitä, että sellaisista kamomillasauniopopulaa-tioista diploidisen kamomillasaunion lähtökasvin tapauksessa saadaan siemenet ja nämä siemenet tetraploidisoidaan (ottamatta huomioon ja/tai tuntematta isäntäkasvien 10 bisabololipitoisuutta). Tetraploidisen kamomillasaunion lähtökasvin ollessa kysymyksessä, edellä kuvatut siemenet käytetään välittömästi seuraaviin valinta- ja kasvuvaiheisiin.

Sopivat diploidiset ja tetraploidiset kamomilla-15 saunioiden lähtökasvit valitaan yksittäisiä kasveja kos kevan tutkimuksen avulla. Yleensä on tarpeellista tutkia yhdestä lähtöpopulaatiosta esimerkiksi 1 000 - 10 000 yksilöä, jotta löydettäisiin muutamia yksilöitä, joilla edellä annettujen kriteerien mukaisesti on suuri (-)-a-20 bisabololipitoisuus ja jotka soveltuvat kamomillasaunioi- den lähtökasveiksi. Tällaisista valituista yksilöistä saadaan sitten tavanomaisella tavalla siemenet ja nämä tetraploidisoidaan. Päättyneen tetraploidisoinnin jälkeen valitaan tetraploidiset kasvit muista diploidisiksi jää-25 neistä kasveista. Näin saaduista tetraploidisista kasveista, mahdollisesti edeltä käyvän lisäämisen jälkeen, valitaan nyt kaikki kasvit, joiden 40°C:ssa kuivatut kukat sisältävät vähintään 100 mg-% kamatsuleenia, vähintään 200 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% 30 muita bisaboloideja. Näiden kukkien korjuu suoritetaan kehitysvaiheessa, jossa mykerön kaikista torvikukista 30 - 70 % on avautunut. Mahdollisesti voidaan tähän liittää muita valinta- ja kasvuvaiheita, jotka parantavat esimerkiksi seuraavia tuntomerkkejä ja ominaisuuksia: samanai-35 kainen kukintakausi; tasainen, juuresta lähtevä haarautu minen, ja kapea kukintavyöhyke (tämä merkitsee parempaa li 7 81007 soveltuvuutta koneelliseen korjuuseen), suuret mykeröt, parempi rohdoksen, erityisesti hyvänhajuisen tuoksun säilyminen .

Siinä tapauksessa, että alusta pitäen lähdetään 5 tetraploidisista kamomillasaunioista, valitaan edellä mainitulla tavalla ainoastaan sellaisia kasveja, joiden 40°C:ssa kuivatut kukat sisältävät vähintään 100 mg-% kamatsuleenia, vähintään 200 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloideja, jolloin myös 10 näiden kukkien korjuu suoritetaan kukkien kehitysvaihees sa, jossa mykerön torvikukista 30 - 70 % on avautunut. Tähän yhteyteen voidaan mahdollisesti liittää muita valinta- ja kasvuvaiheita, joiden tuloksina ovat muut parannukset (kuten edellä on mainittu).

15 On erityisen edullista, että kamatsuleeni- ja (-)-a-bisabololipitoisuuden perusteella valitaan sellaisia kasveja (tunnettuja tai menetelmän mukaisesti valmistettuja). joiden kamatsuleenipitoisuus on vähintään 200 mg-%, etupäässä 250 mg-%, ja joiden (-)-a-bisabololi-20 pitoisuus on vähintään 300 mg-%, etupäässä 400 mg-% (muiden bisabololien pitoisuuden ollessa 50 mg-%:n alapuolella) .

Tetraploidien aikaansaanti tapahtuu käsittelemällä kasvinosia (siemeniä, juuria, versolatvuksia, alkioita ja 25 hankasilmuja) tai diploidisten kamomillasaunioiden lähtö-kasveja kemikaalioilla, röntgensäteillä, gammasäteillä tai UV-säteillä. Se voi tapahtua myös heteen ponsiviljel-mien ja tätä seuraavien tetraploidien valmistuksen avulla tai käyttämällä kamomillasauniokasveihin tai kasvinosiin 30 tai kamomillasaunion kudoksiin kohdistuvia korkeita tai alhaisia lämpötiloja.

8 81007

Tetraploidien valmistus kemikaalien avulla.

Tetraploidien valmistukseen soveltuvina kemikaaleina tulevat kysymykseen esimerkiksi kolkisiini, asenaf-teeni, alkaloidit, kuten esimerkiksi atropiini, veratriini, 5 nikotiini, sanguinariini, bentseenin, difenyylin ja fenan-treenin johdannaiset, naftaliini ja naftaliini-johdannaiset, difenyyliamiini, tribromaniliini, para-diklooribent-seeni, metyylinaftokinoni, metyylinaftohydrokinoni, salisyylihappo ja läheiset yhdisteet, heksaklooriheksaani, 10 metamfetamiini (hydrokloridi), alkyyli-alkali-karbamaatti, kuten isopropyylinatriumkarbamaatti, fenyyliuretaani, kakodyylihapon suolat (esim. natriumsuola), kielon glykosidit, kuten esimerkiksi konvallariini, konvallatok-siini ja konvallamariini, heteroauksiini, germisaani (fe-15 nyylielohopeabrentskatekiini), orgaaniset elohopeayhdisteet, kuten esimerkiksi etyylielohopea-fosfaatti, etyyli-elohopea-kloridi, fenyyli-elohopea-hydroksidi, fenyyli-elohopea-dinaftyylimetaanidisulfonaatti, kloroformi, ilo-kaasu (N20) sekä näiden aineiden seokset. Edelleen tule-20 vat kysymykseen öljykakut, komposti ja lehmänlanta.

Tässä mainituilla aineilla suoritettava käsittely tapahtuu esimerkiksi 0-35°C:n lämpötiloissa, etupäässä 12-30°C:ssa, erityisesti 15-25°C:ssa.

Käyttö tapahtuu esimerkiksi käsittelemällä sieme-25 niä, versonlatvuksia, juuria (erityisesti juurien kärkiä tai sirkkataimien juuria), sikiäimiä, lehtien tai varren poikkipintoja, kasvusolukkoviljelmien solususpensioita tai haavakorkkiviljelmiä tai ruiskuttamalla varren tyviosaan tai hankasilmujen alueelle. Kemikaaleja käytetään yleensä 30 vesiliuosten, vähän alkoholia sisältävien (alkoholipitoisuus tavallisesti alle 5 %) tai heikosti happamien liuos-

It 9 81007 ten muodossa. Heikosti happamien liuosten pH-arvo on esimerkiksi 5,5-6,5, jolloin happameksi tekeminen tapahtuu alempien, orgaanisten, alifaattisten happojen, kuten esimerkiksi etikkahapon avulla. Siinä tapauksessa että käy-5 tetään alkoholiliuoksia, voivat ne myös olla heikosti happamia. Kemikalioiden konsentraatiot näissä liuoksissa voivat olla esimerkiksi 0,01-0,5 %, etupäässä 0,02-0,2 %, erityisesti 0,05-0,1 %. Kaasun muodossa olevia aineita käytetään sellaisenaan, mahdollisesti paineen alla (esimerkik-10 si 100-1000kPa). Käsittelyaika on esimerkiksi 1-36, etupäässä 2-12, erityisesti 4-6 tuntia.

Tehokkaimmat konsentraatiot, samoin kuin vaikutusaika olisi tarkoituksenmukaista tutkia kulloinkin esikokei-den avulla.

15 Erityisen edullinen esimerkiksi on kolkisiinilla suoritettu käsittely 0-35°C:ssa, etupäässä 12-30°C:ssa, erityisesti 15-25°C:ssa. Tämä voidaan esimerkiksi suorittaa siten, että diploidisten kamomillasaunioiden lähtökas-vien siementen annetaan paisua 0,01 - 0,2-%:isessa, erityi-20 sesti 0,02 - l-%:isessa, etupäässä 0,05-%:isessa kolkisiini- liuoksessa tai että itäneet, 5-7 päivän ikäiset, hyvin kehittyneet diploidisen kamomillasaunion lähtökasvin alkiot (alkio-lehdet alaspäin) upotetaan 0,01 - 0,2-%:iseen, erityisesti 0,02 - 0,l-%:iseen, etupäässä 0,5-%:iseen kolkisiini-25 liuokseen. Viimeksi mainitussa menetelmässä tulee ympäröivän ilman suhteellisen kosteuden olla 100 %. Kolkisiini-käsittelyn pituus on esimerkiksi 3-36 tuntia, erityisesti 4-10 tuntia. Alkioita käytettäessä on yleensä vaikutusaika aina 10 tuntiin asti riittävä. Siemeniä käytettäessä vai-30 kutusaika voi mahdollisesti pidentyä 36 tuntiin saakka.

Kemikaaleilla suoritetun käsittelyn jälkeen turvotetut siemenet, alkiot tai muut kasvinosat huuhdotaan useita kertoja vedellä. Turvotetut siemenet esimerkiksi kylvetään. Kasvit, joiden juuret on käsitelty, tai muut 35 kasvinosat, esimerkiksi istutetaan uudelleen kasvilaatikoi- 10 81 007 hin. Kasvit kasvatetaan näin käsitellyistä siemenistä tai sirkkataimista (esimerkiksi kasvihuoneessa; lämpötila 18-25°C päivällä ja 10-16°C öisin), ja valitaan kasvit, joiden siitepöly on noin 1 1/2 kertaa suurempaa kuin läh-5 tömateriaalin siitepöly tai somaattisten solujen kromosomi lukumäärä on 36. Siinä tapauksessa, että kemikaaleilla käsitellään muita kasvinosia (maanpäällisiä tai maanalaisia osia), yksinomaan käsitellyistä osista alkunsa saaneita kasvaimia, juuria tai kukkia/siemeniä tutkitaan 10 myöhemmin muodostuneiden tetraploidien suhteen. Kun suoritetaan verso- tai lehtihankakäsittely, tutkitaan tämän jälkeen ainoastaan tästä lehtihangasta tai tästä versosta syntyvä uusi kasvi sekä siinä muodostuvat kukat tai siemenet kromosomiluvun suhteen.

15 Siitepölyn koon mittaus ja kromosomien laskeminen voidaan suorittaa esimerkiksi esimerkissä 3 esitetyllä tavalla.

Tetraploidien valmistus säteilytyksen avulla.

Vaikutus kohdistetaan esimerkiksi siemeniin tai 20 juurenkärkiin 0-35°C:n, etupäässä 10-30°C:n, erityisesti 15-25°C:n lämpötilassa. Säteilyn summa: 5-50 Krad. Kysymykseen tulevat etupäässä gamma- ja röntgensäteet.. UV-säteinä tulevat esimerkiksi kysymykseen säteet, joiden aallonpituus on 400-30 nm, etupäässä 350 nm.

25 Näin säteilytettyjä kasveja tai kasvinosia käsi tellään sitten samoin kuin kemikaaleilla suoritettavan käsittelyn yhteydessä.

Korkeiden ja alhaisten lämpötilojen käyttö.

Korkeina lämpötiloina tulevat kysymykseen esimer-30 kiksi 33-50°C:n lämpötilat, etupäässä 42-45°C. Näihin lämpötiloihin asetetaan esimerkiksi turvotettuja siemeniä, sirkkataimia, kasvaimen latvuksia ja kasvusolukkokudosta. Käsittelyn kesto on esimerkiksi 1-48, etupäässä 12 -24 tuntia.

35 Alhaisina lämpötiloina tulevat kysymykseen esimer kiksi 0-5°C, etupäässä 0,5-4°C, erityisesti 2°C. Näihin

II

11 81007 lämpötiloihin asetetaan esimerkiksi turvotettuja siemeniä, sirkkataimia, latvakasvaimia ja kasvusolukkokudosta. Käsittelyn kesto on esimerkiksi 1-100 , etupäässä 20-40 päivää. Näin käsiteltyjä kasveja tai kasvien osia käsitellään sit-5 ten edelleen samoin kuin kemikaaleilla suoritettavan käsittelyn yhteydessä.

Heteen ponsiviljelmä (kasvien, joilla on yksinkertainen kromosomisarja, siittäminen heteen ponnen avulla sekä sitä seuraava tetraploidien muodostaminen kemikaalien 10 ja säteilytyksen avulla).

Kukkivista kasveista kerätään suljetut torvikukat, joiden heteiden ponnet ovat ensimmäistä siitepölyn mitoosia edeltävässä vaiheessa. Heteiden ponnet otetaan mikro-manipulaattorin avulla kukannupuista ja siirretään petri-15 maljoihin, jotka ovat täytetyt Nitschin ja Nitschin mukaisella elatusaineella (taulukko 1) . Tämän jälkeen säilytetään petrimaljoja viljelyhuoneessa, jossa on 16-tuntisia päiviä 28°C:n päivälämpötilassa ja 20°C:ssa yöllä. Noin 4 viikon kuluttua alkavat heteen ponnet avautua ja kasvit kasvaa. Di-20 ploidisten kasvien ollessa kysymyksessä nämä ovat haploi-disia ja tetraploidisilla kasveilla nämä ovat dihaploidi-sia; juurien muodostumisen jälkeen ne siirretään esimerkiksi puutarhamaahan ja saatetaan kukkimaan kasvihuoneessa. Nämä (di)haploidiset kasvit ovat steriilejä, polyploi-25 disia kasveja voidaan kuitenkin muodostaa käsittelemällä versolatvuksia, juuria ja varsia kemikaaleilla, kuten esimerkiksi kolkisiinilla, jolloin muodostuu homotsygoot-tisia kasveja, joita sitten voidaan lisätä siemenien avulla. Katso jatkokäsittely kemikaaleilla suoritettavan käsitte-30 lyn yhteydestä (esimerkiksi kolkisiinikäsittely).

12 81 007

Taulukko 1

Nitschin ja Nitschin mukainen elatusaine (Science, 1969) mg/1 KN03 950 NH-NO-3 720

MgS04 x 7 H20 185

CaCl2 166 KH2P04 68

MnS04 x 4 H20 25 h3bo3 10

ZnS04 x 7 H20 10

Na2Mo04 x 2 Η2<3 0,25

CuS04 x 5 H20 0,025 5 ml liuosta, jossa on 7,45 g etyleeni-diamiinitetraetikkahapon dinatriumsuolaa ja 5,57 g FeSC>4 x 7 H20 täytettynä 1000 ml:ksi myo-inosiitti 100

Glysiini 2

Nikotiinihappo 5

Pyridoksiini-HCl 0,5

Tiamiini-HCl 0,5

Foolihappo 0,5

Biotiini 0,05

Sakkaroosi 20 g

Valmis elatusaine (DIFCO-Bacto-agar) 8 g

Indolietikkahappo 0,1.

Elatusaineen pH säädetty 5,5:ksi 13 81 007

Siitepölyn koon ja/tai kromosomiluvun laskemisen avulla valituista kamomillasauniokasveista, jotka voidaan saada edellä kuvattujen mahdollisuuksien mukaisesti, valitaan sitten ne kasvit, joilla kamatsuleenin 5 vähimmäispitoisuus on 100 mg-% ja joilla bisabololin vähimmäispitoisuus on 200 mg-%, kun taas muiden bisaboloi-dien pitoisuuden (erityisesti bisabololioksidien) tulee olla 50 mg-%:n alapuolella (kuivattujen kukkien suhteen, katso esimerkki 1).

10 Näiden näin valittujen kasvien, sen jälkeen kun kaikki jo kukkaan puhjenneet mykeröt on korjattu, annetaan lopettaa kukintansa kasvihuoneessa, 18-24°C:n päivä- ja 12-14°C:n yölämpötilassa ja päivän pituuden ollessa vähintään 14 tuntia, jolloin neljän viikon pituisena aikana 15 kaikki mykeröt, jotka ovat kuihtuneet tai ovat juuri mure-nemaisillaan, kootaan siemenien saantia varten. Kuivauksen jälkeen, joka suoritetaan 20-35°C:n ilmanlämpötilas-sa, saadaan esimerkiksi tällaisen kamomillasaunion siemensato.

20 Valintaperusteina voidaan edelleen käyttää seu- raavia seikkoja: a) suunnilleen samanaikainen kukinta; b) tasainen, juuresta lähtevä haaroittuminen ja kapea ku-kintavyöhyke, noin 10, erityisesti 5 cm; 25 c) suuret mykeröt, joiden ulkoläpimitta on noin 30 mm (20-40 mm), erityisesti 25-35 mm.

Lisäkriteereiden a), b) ja/tai c) käyttö johtaa esimerkiksi suurempiin kukka- ja rohdossatoihin sekä parempaan soveltuvuuteen koneellista sadonkorjuuta varten.

30 Siinä tapauksessa että lähtökasveina käytetään jo tunnettuja tetraploidisia kamomillasaunioita, edellä kuvattu valinta, samoin kuin mahdollisesti muut valinta- ja kasvuvaiheet, tapahtuu samalla tavalla.

Kamomillasaunion saamiseksi, joka, paitsi että se 35 sisältää vähintään 100 mg-% kamatsuleenia ja vähintään 14 81 007 200 mg-% (-)-Oi -bisabololia (kuivattujen mykeröiden suhteen^ antaa vielä suuren kukkasadon ja soveltuu paremmin koneelliseen sadonkorjuuseen, suositellaan seuraavaa menettelyä: valittuja kasveja (kuten yllä kuvattuja) lisä-5 tään vegetatiivisesti pistokkaista ja valitaan 3-5 sukupolven aikana, jolloin valinta suoritetaan aina yllä annetun arvosteluperusteen tai mahdollisesti lisäkriteerei-den a)-c) mukaisesti. Näiden kriteereiden perusteella valitut kasvit kloonataan, kloonatuista kasveista saadaan 10 siemensato, näistä saadut kasvit jälleen valitaan yllä annettujen kamatsuleenin ja bisabololin vähimmäispitoisuuksien sekä mahdollisesti lisäkriteereiden a)-c) perusteella, ja viimeksi mainituista saadaan jälleen siemensato.

Jakso, kylvö-valinta, yllä esitetyn kamatsuleenin 15 vähimmäispitoisuuden 100 mg-% ja (-)-Qi-bisbololin vähimmäismäärän 200 mg-% (muita bisaboloideja alle 50 mg-%) samoin kuin mahdollisesti lisäkriteerien a)-c) mukaisesti, - siemensadon saanti, voidaan toistaa 3-5 kertaa.

Tähän liittyy vielä kerran jakso, kylvö-valinta, 20 samoin kuin edellä (mahdollisesti kloonaus) - siemensadon saanti.

Viimeksi saatu siemensato on sitten kamomillasau-nion lisäämiseen käytettävä siemen.

Pistokkaista lisääminen suoritetaan seuraavalla 25 tavalla: Pistokkaista suoritettavaa lisäystä varten täytyy lähtökasvien (klooniemokasvien) muodostaa lyhyen päivän olosuhteissa kääpiöversoja, joissa ei ole kukannuppuja.

Tämä tapahtuu kasvihuoneessa vuoden talvipuoliskclla, ilman lisävalaistusta tai ilmastoidussa kammiossa, päivän-30 pituuden ollessa 6-10, etupäässä 8 tuntia ja lämpötilan 10-15°C, etupäässä 12°C. Kloonaukseen tai lisäykseen soveltuvat lehti-, kasvain- ja erityiset kääpiöverso-(sivu-verso-) pistokkaat. Niiden juurtuminen tapahtuu 12-18°C:ssa, etupäässä 15°C:ssa ja päivänpituuden ollessa 12-16, etu-35 päässä 14 tuntia tiiviissä kaasukehässä (noin 100-%:inen

II

15 81 007 ilmankosteus). Pohjana voidaan käyttää esimerkiksi turve-hiekka-seosta suhteessa 1:1; mutta sellaiseksi soveltuu myös puhdas kvartsihiekka, vuorivilla-pistokas-alusta, turve-pistokasalusta yms.

5 Kylvöä varten tässä yhteydessä tulevat kysymykseen esimerkiksi seuraavat alustat: puutarhamaa, humuspitoinen, keskiraskas savimaa, savinen tai humuspitoinen hiekkamaa.

Kylvö voidaan suorittaa kasvihuoneessa tai myös avomaalla. Kasvien itäminen ja kasvu tapahtuvat esimerkik-10 si 12-24°C:n, erityisesti 18-20°C:n lämpötilassa. Siinä tapauksessa että kylvö suoritetaan avomaalle, kylvetään etupäässä syksyllä (syyskuu/lokakuu) tai keväällä (maalis-kuu/huhtikuu). Nämä määräajat tarkoittavat kaikkia kysymykseen tulevia viljelyalueita (esim. pohjoista pallonpuolis-15 koa, lauhkeista subtrooppisiin ilmastoalueisiin).

On erityisen edullista, jos seuraavat menettely-edellytykset ovat käytettävissä:

Tetraploidisista kamomillasauniokasveista, joilla kamatsuleenipitoisuus on vähintään 100 mg-% ja (-)-Oi-bi-20 sabololin vähimmäispitoisuus on 200 mg-%, kun taas muiden bisaboloidien (erityisesti bisabololioksidien) pitoisuus on alle 50 mg-% (kaikki arvot kuivattujen mykeröiden suhteen esitettyinä), valitaan ainoastaan ne, jotka - kukkivat suunnilleen samanaikaisesti, 25 - haarautuvat tasaisesti, juuresta lähtien ja joilla on kapea kukintavyöhyke, läpimitaltaan noin 10 cm, sekä - suuret mykeröt, läpimitaltaan noin 30 mm.

Valittuja kasveja lisätään vegetatiivisesti pistokkaiden avulla ja valikoidaan 3-5 sukupolven aikana, jolloin 30 valinta suoritetaan aina yllä mainittujen kriteerien mukaisesti. Valikoituja kasveja lisätään vegetatiivisesti (kloonataan), niiden annetaan kuihtua yhdessä, ja niistä otetaan siemenet. Siemenistä saadut kasvit valikoidaan jälleen yllä esitettyjen kriteerien mukaisesti ja jakso, 35 kylvö-valinta-siemenen saanti-kylvö toistetaan 3-5 kertaa.

16 81 007

Kamomillasaunio, jota käytetään keksinnön mukaisessa menetelmässä, on aidon kamomillasaunion viljelyskasvilaatu, jonka kasvitieteellinen nimitys on Matricaria chamomilla L. (synonyymi Chamomilla 5 recutita (L.), Rauschert). Jossain, korkeintaan 70°C:n lämpötilassa kuivattu materiaali, joka on saatu tämän kamomillasaunion kukista, jotka on korjattu siinä kasvuvaiheessa, jossa 30-100 % mykeröiden torvikukista on avautunut, sisältää vähintään 30 mg-% kamatsuleenia, vähintään 10 100 mg-% (-)-Qi-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloideja.

Siinä tapauksessa että kamomillasaunion kukkien korjuu suoritetaan ajankohtana, jolloin kukkien kehitysvaihe jatkuu edelleen, se merkitsee, että silloin esimer-15 kiksi 100 %, tai aina 100 %:iin saakka mykerön kaikista torvikukista on avautunut (esimerkiksi täyden kukinnan vaihe) ja/tai siinä tapauksessa että korjattujen kukkien kuivaus suoritetaan 40°C:ssa, voi vaikuttavien aineiden (-)-Ct-bisabololin ja kamatsuleenin pitoisuus olla alhaisempi, 20 koska korkeammassa lämpötilassa ja/tai myöhemmin korjuuta suoritettaessa atsuleeni ja bisabololit voivat hajota voimakkaammin .

Esimerkiksi kuivauskaapissa 40°C:ssa kuivatut kamomillasaunion kukat (jotka on koottu edellä ku-25 vatulla tavalla) sisältävät 100-200 mg-% kamatsuleenia, 200-450 mg-% (-)- CC-bisabololia ja vain vähän, so, 5-50 mg-%, muita bisaboloideja kuiva-aineen suhteen ( laskettuna kukkien absoluuttisen kuivapainon suhteen). Tämä absoluuttinen kuivapaino määritetään kuivaamalla kamo-30 millasaunion kukkien erillinen näyte kuivauskaapissa, 105°C:ssa vakiopainoon (72-96 tuntia). Esimerkiksi 35-50°C: ssa kuivattujen kukkien vaikuttavan aineen pitoisuus lasketaan sitten 105°C:ssa ilmoitetun kuiva-aineen suhteen.

Saadaan erityisen vaikuttava aine (jossa on suurin 35 mahdollinen vaikuttavien aineiden kamatsuleenin ja (-)-Ct- 17 81 007 bisabololin pitoisuus), kun kamomillasaunion mykeröt kootaan kasvuvaiheessa, jossa mykerön torvikukista esimerkiksi 30-70 %, etupäässä 40-60 %, mikä tarkoittaa, että ylipäänsä 50 % on avautunut, ja kuivaus suoritetaan ilman-5 lämpötilan ollessa korkeintaan 50°C, esimerkiksi 35-50°C, erityisesti 50°C. Esimerkiksi kuivauskaapissa 40°C:ssa kuivatut kukat (koottu silloin, kun 40-60 % mykerön torvikukista on avautunut) sisältävät vähintään 100 mg-%, esimerkiksi 100-150 mg-% kamatsuleenia, vähintään 300 mg-%, esimerkiksi 200-300 mg-% (-)-Oi, -bisabololia ja vain vähän (so. 5-50 mg-% bisaboloideja kuiva-aineen suhteen (laskettuna kukkien absoluuttisen kuivapainon suhteen). Tämä absoluuttinen kuivapaino määritetään kuivaamalla kamomillasaunion kukkien erillinen näyte kuivauskaapissa 105°C:ssa vakiopainoon 25 (72-96 tuntia). Esimerkiksi 35-50°C:ssa kuivattujen kukkien vaikuttavan aineen pitoisuus lasketaan sitten kukkien 105°C:ssa ilmoitetun kuiva-aineen suhteen.

Kamomillasaunion kukkien kuivaus voi tapahtua joko koneellisen ilmansyötön avulla tai myös kuivaamalla var-20 jossa, mahdollisesti myös auringossa, jolloin on kuitenkin huomioitava, että lämmönsyöttö ei ylitä täydelliseen kuivaukseen tarvittavaa määrää. On myös edullista, että kontrollipunnituksen avulla varmistutaan saavutetusta va-kiopainosta. Kuivaus voidaan suorittaa omaehtoisesti tai 25 keinotekoisesti (esimerkiksi keinollisesti lämmitetyn ilman avulla). Vaikuttavan aineen saanto on suurimmillaan auringon valon poissaollessa, etupäässä 40-60°C:ssa, erityisesti 40-50°C:ssa. Kuivausvaiheen tulee tapahtua mahdollisimman pian tai ensi tilassa korjuun jälkeen. Kuivaus 30 tulee suorittaa ohuina kerroksina, esimerkiksi 5-20 cm:n, etupäässä 10 cm:n paksuisina kerroksina. Kuivaus on mahdollista myös hyvin ilmastoiduissa halleissa, joissa ilman lämpötila on 20-30°C. Yleensä ei ilman lämpötilan kuivausta varten tule olla korkeamman kuin 6Q°C. Edullinen 35 on ilman.lämpötila, joka on 35-50°C.

18 81 007

Kyseessä olevan keksinnön mukaisen aineen vaikuttavan aineen pitoisuus pääasiallisten vaikuttavien aineiden kamatsuleenin ja (-)-OC-bisabololin suhteen riippuu kasvuvaiheesta, jossa kamomillasaunion kukat korjataan 5 sekä korjattujen kukkien kuivauksesta. Mitä korkeampi on kuivauslämpötila, sitä voimakkaammin vaikuttava aine hajoaa; se merkitsee sitä, että sitä alhaisempi on kuivattujen kukkien vaikuttavan aineen pitoisuus. Samaan perustuu myös se, että suoralla auringonvalolla on kuivauksessa haital-10 linen vaikutus ja sitä tulee välttää mahdollisuuksien mukaan .

Kukan kasvuvaihetta luonnehditaan sen avulla, kuinka monta prosenttia mykerön torvikukista tiettynä ajankohtana (tässä yhteydessä korjuun ajankohtana) on avautunut.

15 Voidaan myös korjata kukat, joissa esimerkiksi 30-50 %, 30-70 %, 40-60 %, 60-100 % tai 90-100 % mykerön torvikukista on avautunut; vaikuttavan aineen pitoisuus riippuu siitä, missä vaiheessa kukat kulloinkin ovat, kyseessä olevan keksinnön mukaisesti käytetyillä kamomillasaunioilla 20 se on suurimmillaan, kun 40-60 % kaikista torvikukista on avautunut, ja se on sekä vähemmän että enemmän avautuneilla mykerön torvikukilla vähäisempi.

Kuvatun kamomillan suurena etuna on se, että sillä yksittäisten kasvien kuihtuminen tapahtuu saman-25 aikaisesti, ts. että tietystä kylvöstä muodostuneiden kasvien pääosalla on sama kukkimisvaihe; se merkitsee sitä, että verrattomasti useimmilla kasveilla 40 - 60 % mykerön kaikista torvikukista on avautunut. Mykeröiden täydellinen käsittely optimi-ajankohtana on täten mahdollista. Kamo-30 millasaunio, jota käytetään keksinnön mukaiseen aineen valmistamiseen, soveltuu sen vuoksi erityisesti mekaaniseen korjuuseen.

Kamatsuleeni- ja (-)-Oi -bisabololipitoisuuden yhteys, toisaalta kukintavaiheeseen korjuun ajankohtana ja 35 toisaalta aineen saamiseksi käytettyyn kuivauslämpötilaan, esitetään seuraavassa taulukossa (muiden bisaboloidien pitoisuus on kaikissa tapauksissa vähemmän kuin 50 %).

Il 19 O 1 Π O 7 u I uu /

Kuivaus- Kukkien kasvuvaihe korjausajankohtana |ämp^ila 30-70 % mykerön 70-100 % mykerön kaikista ,„ ... ., > kaikista torvikukista torvikukista on avautu- 1α"Ρ*ιΐ3) on avautunut nut

Vaikuttavan aineen pitoi- Vaikuttavan aineen pitoisuus kuivatussa aineessa: suus kuivatussa aineessa:

Ei-korkeampi Karaatsuleeni: Kamatsuleeni: kuin 50¾ Vähintään 100 mg-% Vähintään 40 mg-% (-)-Qf-bisabololi: (-)-Φ-bisabololi: Vähintään 200 mg-% Vähintään 120 mg-%

Vaikuttavan aineen Vaikuttavan aineen pitoisuus alkoholi- pitoisuus alkoholi- uutteessa: uutteessa:

Ei korkeampi Kamatsuleeni: Kamatsuleeni: kuin 50¾ Vähintään 5,0 mg-% Vähintään 2,0 mg-% (-) -^-bisabololi: (-)-Qt-bisabololi: Vähintään 10,0 mg-% Vähintään 6,0 mg-%

Vaikuttavan aineen pitoi- Vaikuttavan aineen pi- suus kuivatussa aineessa: toisuus kuivatussa ai neessa: Välillä Kamatsuleeni: Kamatsuleeni: 50-70°C Vähintään 50 mg-% Vähintään 30 mg-% (-)-^-bisabololi: (-)-Ct-bisabololi: Vähintään 150 mg-% Vähintään 100 mg-%

Vaikuttavan aineen pitoi- Vaikuttavan aineen pitoisuus alkoholiuutteessa: suus alkoholiuutteessa: Välillä Kamatsuleeni: Kamatsuleeni: 50-7QOC Vähintään 2,5 mg-% Vähintään 1,5 mg-% (-) -Λ -bisabololi: (-) -Cl -bisabololi: Vähintään 7,5 mg-% Vähintään 10 mg-% Tästä seuraa, että kanomillasauniosta, jota käytetään aineen valmistamiseen, esimerkiksi keruussa, joka tapah-30 tuu kasvuvaiheessa, jossa 30 - 100 % mykiöiden torvikukista on avautunut, ja jossa kuivaus voidaan suorittaa ilman lämpötilassa aina 70°C:seen saakka, saadaan kuivattua ainetta, jonka kamatsuleenipitoisuus joka tapauksessa nousee vähintään 30 mg-%:iin ja jonka (-)-Oo -bisabololipitoisuus on vähintään 35 100 mg-%, samalla kun muita bisaboloideja on aina vähemmän kuin 50 mg-%.

20 8 1 007 Näissä alkoholiuutteissa muiden bisaboloidien pitoisuus on aina alhaisempi kuin 10 mg-%.

Eteeristen öljyjen, jotka valmistetaan kuivatusta materiaalista yllä esitetyssä taulukossa kerrottujen olo-5 suhteiden mukaisesti, pitoisuus kamatsuleenin ja bisabolo- lin suhteen on aina vähintään 3,5 % kamatsuleenia, vähintään 10 % (-)- Oi -bisabololia ja vähemmän kuin 10 % muita bisabo-loideja.

Kamomillasauniolla, jota käytetään esillä olevan 10 keksinnön mukaisessa menetelmässä, on kohtalaisen myöhäinen korjuuajankohta, yhtenäinen kasvukorkeus kapein kuk-kavyöhykkein ja suuri mykerö, ja siitä syystä se soveltuu erityisesti koneelliseen sadonkorjuuseen. Tämän lisäksi, samaan aikaan kylvetyt, uuden tetraploidisen kamomillasau-15 nion kasvit yleensä käytännöllisesti katsoen kuihtuvat yhdessä samanaikaisesti, niin että täten myös korjuu tulee hyvin yksinkertaiseksi ja helpottuu. Nämä uudet kamomilla-sauniot antavat sitäpaitsi suuren sadon. Tästä kamomilla-sauniosta, kyseessä olevan keksinnön mukaisesti valmistet-20 tuja, bisabololi- ja kamatsuleenipitoisia aineita, joilla on tulehduksenvastaista vaikutusta, käytetään esimerkiksi ruokavalio-opin mukaisissa tuotteissa, kosmetiikassa sekä teevalmisteiden muodossa. Täten voidaan kyseessä olevan ; keksinnön mukaisesti saadusta kuivatusta materiaalista 25 saada esimerkiksi alkoholeilla tai vettä sisältävillä alko-holiseoksilla uuttamalla tai uuttamalla ylikriittisillä kaasuilla kamomillasauniohauteita tai kamomillasaunio-uutteita. Uutteiden, erityisesti alkoholiuutteiden valmistukseen, voidaan käyttää myös tuoreita tai jäädytettyjä 30 (siinä tapauksessa, että tuoreet kukat jäädytettiin) kamo- millasaunion kukkia.

Lisäksi kuivatusta materiaalista voidaan saada ka-momillaöljyä, (-)-Λ-bisabololia, kamatsuleenia ja muita kamomillapitoisia aineita.

21 81007 Näin ollen, patenttivaatimuksessa 1 mainitut kuivatun materiaalin alkoholiuutteet sisältävät vähintään 1,5 mg-% etupäässä 5,0 mg-% kamatsuleenia ja vähintään 5,0 mg-%, etupäässä vähintään 10,0 mg-% (-)-^-bisabololia alkoholi-5 pitoisessa rohdosuutteessa ja muita bisaboloideja vähemmän kuin 8 mg-%.

Sellaisten uutteiden valmistus tapahtuu uutteiden valmistuksen suhteen tavanomaisella tavalla.

Uuttamiseen voidaan käyttää esimerkiksi sekoitus-10 laitteita, esimerkiksi niin sanottuja allassekoituslaittei-ta, perkolaattoreita ja muita sopivia uuttamislaitteita. Uuttamisen aikana lämpötila nousee esimerkiksi 10-50°C:seen. Jäähdyttäminen ei ole tarpeellista.

Liuottimina tulevat kysymykseen erityisesti suora-15 tai haaraketjuiset, yksi- tai moniarvoiset alkoholit, joissa on 1-6 hiiliatomia, kuten esimerkiksi metanoli, etanoli, propanoli-(2), butanoli, glyseriini, isopropylideeni-gly-seroli ja muut vastaavanlaiset liuottimet, kuten näiden liuottimien seokset veden kanssa.

20 Voidaan käyttää myös näiden liuottimien seoksia.

Liuottimen vähimmäismäärä on 2 osaa liuotinta yhtä osaa kohti kuivattua ainetta. Yleensä käytetään 2-20 osaa liuotinta yhtä osaa kohti kuivattua ainetta, erityisesti 3-10 osaa liuotinta yhtä osaa kohti kuivattua ainetta.

25 Keksinnön mukaisesti valmistetusta kuivatusta mate riaalista saatava eteerinen öljy sisältää vähintään 3,5 %, etupäässä vähintään 5 % kamatsuleenia ja vähintään 10 %, etupäässä vähintään 15 % (-)- Cfc-bisabololia ja vähemmän kuin 10 % muita bisaboloideja.

30 Eteerinen öljy valmistetaan yleensä siten, että kui vattu aine kuumennetaan kiehumapisteeseen veden kanssa, esimerkiksi askorbiinihapon (esim. suolana, erityisesti natriumsuolana) läsnäollessa, pH-arvossa 4-6, etupäässä 22 81 007 5-5,5. pH-arvo säädetään hapon, esimerkiksi suolahapon avulla.

Yhtä paino-osaa kohti kuivattua ainetta käytetään esimerkiksi 10-50 paino-osaa vettä ja mahdollisesti 0,1-1 5 paino-osaa askorbiinihappoa.

Yleensä kuumennetaan 2-8 tunnin ajan. Saatua, vettä sisältävää tislettä ravistellaan useita kertoja jonkin alemman alifaattisen nestemäisen hiilivedyn kanssa (esim. petrolieetterin (esim. kp 35-60°C), pentaanin, ksyleenin, 1Q dekaliinin kanssaj , orgaaninen jae kuivataan (esimerkiksi natriumsulfaatin avulla) ja orgaaninen jae poistetaan varovaisesti (esimerkiksi tislaamalla pyöröhaihduttajassa tai tislaamalla 40-70°C:ssa, etupäässä 50-60°C:ssa). Korkealla kiehuvan liuottimen ollessa kysymyksessä tislaus suorite-15 taan tyhjössä.

Kamatsuleenin määritys suoritetaan spektrofotomet-risesti, kamomillauutteille tavanomaisella tavalla.

(_)_Λ-bisabololin sekä muiden kamomillaöljyyn sisältyvien aineiden määrittäminen suoritetaan näille tavan-20 omaisilla, kaasukromatografisilla menetelmillä.

Liite A sisältää tarkan, analyyttisiä määritysmenetelmiä koskevan kuvauksen.

Vaikuttava aine kamatsuleeni ei ole kamomillasaunion kukissa sellaisenaan, vaan seskviterpeenilaktonin matri-25 siinin muodossa. Matrisiinilla on farmakologista vaikutusta, joka on samankaltaista kuin kamatsuleenin farmakologinen vaikutus. Tästä matrisiini-esiasteesta syntyy esimerkiksi heti kuumennettaessa (esim. vesihöyrytislauksen, teen uuttamisen yhteydessä) kamatsuleenia. Siksi on tullut 30 tavaksi ilmoittaa kamomillasaunion yhteydessä matrisiinista muodostuvan kamatsuleenin pitoisuus eikä matrisiinin pitoisuutta.

Jos kuvatun tetraploidisen kamomillasaunion kukat kootaan kasvuvaiheessa, jossa mykerön torvikukista 30-100 % 35 on avautunut, ja kukat kuivataan ilman lämpötilassa aina 70°C:seen saakka, niin saatu aine sisältää esimerkiksi väli 23 81 007 hintään 3Q mg-% kamatsuleenia, vähintään 100 mg-% (_)_Oi-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisa-boloideja, ja tästä vesihöyrytislauksen avulla valmistettu eteerinen öljy sisältää vähintään 3,5 % kamatsuleenia, 5 vähintään 10 % (-) - £Z/-bisabololia ja vähemmän kuin 10% muita bisaboloideja, ja alemmilla alkoholeilla uuttamalla saatu alkoholiuute sisältää vähintään 1,5 mg-% kamatsuleenia, vähintään 5,0 mg-% (-)-<3>bisabololia ja vähemmän kuin 10 mg-% muita bisaboloideja.

10 Jos kuvatun tetraploidisen kamomillasaunion kukat kootaan kasvuvaiheessa, jossa 30-70 % mykerön torvikukis-ta on avautunut, ja kukkia ei kuivata korkeammassa ilman lämpötilassa kuin 50°C, niin näin saatu aine sisältää esimerkiksi vähintään 100 mg-% kamatsuleenia, vähintään 200 15 mg-% (-)-Ot-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloide ja, mahdollisesti tästä valmistettu eteerinen öljy sisältää vähintään 3,5 % kamatsuleenia, vähintään 10 % (-)-Qi-bisabololia ja vähemmän kuin 10 % muita bisaboloide ja, ja alkoholiuute sisältää vähintään 5,0 mg-% kamatsu-20 leenia, vähintään 10,0 mg-% (-)- Cfc-bisabololia ja vähemmän kuin 10,0 mg-% muita bisaboloideja.

Jos kuvatun tetraploidisen kamomillasaunion kukat kootaan kasvuvaiheessa, jossa 30-70 % mykerön torvikukis-ta on avautunut, ja kukat kuivataan ilman lämpötilassa, 25 joka on 50-70°C, niin näin saatu aine sisältää esimerkiksi vähintään 50 mg-% kamatsuleenia, vähintään 150 mg-% (_) _CX»-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloide ja, mahdollisesti tästä valmistettu eteerinen öljy sisältää vähintään 3,5 % kamatsuleenia, vähintään 30 10 % (-)-05-bisabololia ja vähemmän kuin 10 % muita bisa boloide ja, ja alkoholiuute sisältää vähintään 2,5 mg-% kamatsuleenia, vähintään 7,5 mg-% (-)-Ä-bisabololia ja vähemmän kuin 10,0 mg-% muita bisaboloideja.

Jos kukat kootaan kasvuvaiheessa, jossa 70-100 % 35 mykerön torvikukista on avautunut ja kukat kuivataan ilman 24 81 007 lämpötilassa, joka ei ole korkeampi kuin 50°C, niin näin saatu aine sisältää esimerkiksi vähintään 40 mg-% kamatsu-leenia, vähintään 120 mg-% (-)-Qt-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloideja, tästä mahdollisesti val-5 mistettu eteerinen öljy sisältää vähintään 3,5 % kamatsu-leenia, vähintään 10 % (-)- G-bisabololia ja vähemmän kuin 10 % muita bisaboloideja ja alkoholiuute sisältää vähintään 2,0 mg-% kamatsuleenia, vähintään 6,0 mg-% (-)-Ql·-bisabolo-lia ja vähemmän kuin 10,0 mg-% muita bisaboloideja.

1Q Jos kuvatun tetraploidisen kamomillasaunion kukat kootaan kasvuvaiheessa, jossa mykerön torvikukista 70-100 % on avautunut ja kukat kuivataan ilman lämpötilassa, joka on 50-70°C:n välillä, niin näin saatu aine sisältää esimerkiksi kamatsuleenia vähintään 30 mg-%, vähintään 100 mg-% 15 (“) -Ot-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisa- boloideja, tästä mahdollisesti valmistettu eteerinen öljy sisältää vähintään 3,5 % kamatsuleenia, vähintään 10 % (-)- Ot -bisabololia ja vähemmän kuin 10 % muita bisaboloi-deja ja alkoholiuute sisältää vähintään 1,5 mg-% kamatsu-20 leenia, vähintään 10 mg-% (-)- Ot-bisabololia ja vähemmän kuin 10,0 mg-% muita bisaboloideja.

Esimerkki 1

Aineen, jolla on tulehduksenvastaista vaikutusta, saanti tetraploidisen kamomillasaunion lähtökasvista: 25 Kamomillasaunio, joka saadaan myöhemmin kuvatulla tavalla, kylvetään maanviljelyksessä tavanomaisella tavalla. Niin pian kuin kasvit ovat kehittyneet ja mykeröt ovat kasvuvaiheessa, jossa noin 50 % torvikukista on avautunut, korjataan nämä mykeröt kamomillasaunionpoimintakoneella, 3q jossa poimintakoneen kampojen etäisyys on siten asetettu, että irrotetaan vain ne mykeröt, joiden torvikukista 50 % on avautunut. Sato kuljetetaan mahdollisimman nopeasti johonkin varjoisaan paikkaan ja levitetään siellä ohueksi kerrokseksi jatkokäsittelyä varten. Tämän jälkeen mykeröt 35 irrotetaan varsista siivilöintilaitteessa ja kuivataan 25 81 007 vakiopainoon. Painohäviö nousee noin 80 %:iin. Kuivaus suoritetaan varjossa, hyvin ilmastetussa paikassa, ristikoiden päällä, kerroksen paksuuden ollessa noin 10 cm.

Noin 2-3 päivän kuluttua kuivaus päättyy. Varsi-5 osien ja kukkamurskan erottamiseksi kuivattu materiaali siivilöidään ja puristetaan tämän jälkeen palloiksi.

Analyysi:

Eteeristä öljyä 960 mg-%

Kamatsuleenia 162 " 10 (-) - ^-bisabololia 330 "

Siinä tapauksessa, että kuivaus suoritetaan kiinteässä liukuhihnakuivauslaitteessa keinotekoisesti lämmitetyn ilman avulla, lämpötilassa, joka on 50-70°C, niin kuivaus päättyy 4-5 tunnin kuluttua. Varsiosien ja kukka-15 murskan erottamiseksi kuivattu materiaali seulotaan ja puristetaan tämän jälkeen palloiksi.

Tällaisen aineen analyysiarvot ovat esimerkiksi: Eteeristä öljyä 870 mg-%

Kamatsyleenia 94 " 2Q (-) - ^-bisabololia 197 " Käytetyt tetraploidisen kamomillasaunion lähtökas-vit saadaan seuraavasti: yksittäisille kasveille suoritetun valintatestin avulla, joka suoritettiin 10 000 kasville, jotka olivat 25 tetraploidista kamomillasauniolajiketta, jotal. Särkäny kuvasi /Herba Hungar. 4(1), 125-169 (1965^, havaittiin, että noin 1000 yksikköä kohti saadaan kasvi, jonka eteerisen öljyn korkea kamatsuleenipitoisuus oli noin 20 painoprosenttia sekä korkea (-)-CC -bisabololipitoisuus oli 50 painoprosent-30 tia, jolloin samanaikaisesti muiden bisaboloidien (erityisesti (-)- o&-bisabolonioksidin) pitoisuus on erittäin vähäinen (vähemmän kuin 5 painoprosenttia). Nämä yksilöt valittiin, ja niitä käsiteltiin seuraavissa vaiheissa: 26 81 007

Vaihe 1:

Valittujen, tetraploidisten kamomillasauniokasvien jälkeläisistä (kuten yllä on kuvattu) valittiin sellaiset yksilöt, jotka 5 A) kukkivat jokseenkin samanaikaisesti, B) haaroittuivat tasaisesti, juuresta lähtien ja joiden kukkavyöhyke oli kapea, noin 10 cm, etupäässä 5 cm, C) joiden mykeröt olivat suuret, ulkoiselta läpimitaltaan noin 3Q mm, etupäässä 25-35 mm, 10 D) joiden vähimmäispitoisuus kamatsuleenin suhteen saavut taa 150 mg-% ja bisabololin suhteen 300 mg-% tai ylittää mainitut arvot ja joiden pitoisuus muiden bisaboloidien suhteen (erityisesti bisabololioksidien suhteen) on selvästi 50 mg-%:n alapuolella. (Kaikki arvot koskevat mykeröi-15 tä, jotka kuivattiin 40°C:ssa ja jotka koottiin vaiheessa, jolloin mykerön kaikista torvikukista 30-70 % oli avautunut).

Nämä kasvit kloonattiin. Tämän lisäksi kasvit (kloonaukseen käytetyt emokasvit) leikeltiin siten, että verson 20 pituudeksi tuli noin 15 cm, ne saatettiin 8-10 tunnin päi-vänpituuteen ja 12-14°C:seen uusien vesojen muodostamiseksi (lyhyiden sivukasvaimien muodostamiseksi). Kääpiöversot leikattiin ja pantiin turve-hiekka-seokseen. Noin 100 %:n suhteellisessa ilmankosteudessa, 15°C:n ilman lämpötilassa 25 ja 14 tunnin päivänpituudessa pistokkaiden juurtuminen kesti 7-14 päivää.

Kuvatun, tavanomaisen kloonauksen (pistokaslisäys) sijasta voidaan myös käyttää kasvin jakaantumiskykyisten kudososien lisäystä in vitro (niin sanottua kasvusolukko-30 lisäystä). Kamomillasaunioviljelmän perustamiseen soveltu vat kasvin erilaiset osat, etupäässä latvakasvaimet tai hankasiImut.

Sen jälkeen kun kasvit oli huuhdottu HjOjilla aseptisissa olosuhteissa "laminaari-virtauksessa" (suurteho-35 leiju-suodatin vähäturbulenssisin poistotyöntövirtauksin), poistetaan lehtihankasiImujen versonhuiput ja siirretään ne koeputkiin, jotka on täytetty elatusaineella, joka on valmistettu esimerkiksi Murashigen ja Skoogin mukaan (Physiol. Plant. 51, 473-497, 1962). Koeputket asetetaan ilmastet- I! 27 81 007 tuun huoneeseen, jossa päivänpituus on 12-18, etupäässä 16 tuntia (joka on saavutettu fluoresenssi-valoaineputkien avulla), valointensiteetti on 500-10 000 luxia, etupäässä 1000-3000 luxia ja lämpötila on 15-30°C, etupäässä 22-27°C. 5 Niin pian kuin siirrännäiset kasvavat hyvin, ne siirretään yllä mainittuun elatusaineeseen, jossa kuitenkin on suurempi sytokiniinikonsentraatio (sytokiniinit ovat kasvihormoneja, jotka edistävät solunjakautumista) (esim.

30 ml/1 6-isopentenyyliadeniinia) ja vähän tai ei ollenkaan 10 auksiinia (10-0,3 mg/1 indolietikkahappoa). Vastaisuudessa rangat venyvät ja muodostuu myöhäiselimiä sekä enemmän hankasilmuja. Nämä voidaan poistaa ja niitä voidaan kasvattaa edellä mainitulla tavalla.

Kasvien lisäämistä varten suuremmassa määrin, siir-15 retään tietyt siirrännäiset (3. työvaihe = 3. lisääntymis-sukupolvi) ensin mainitulla elatusaineella tapahtuneen juurtumisen ja kasvatuksen jälkeen ravintoalustalle, joka sisältää 10 mg/1 indolietikkahappoa tai 3-indolivoihappoa tai 0,1-0,3 mg/1 -naftyylietikkahappoa. Tällöin kasvit 20 juurtuvat, ja ne voidaan noin 4 viikon kuluttua istuttaa steriloidulla puutarhamaalla (12 tuntia noin 120°C:ssa höyrytetyllä) täytettyihin ruukkuihin ja kasvattaa edelleen kasvihuoneessa (olosuhteissa, jotka soveltuvat tavanomai- selle pistokkaista suoritettavalle lisäämiselle) .

25 Elatusaine Murashigen & Skoogin mukaan: - _mg/1_mg/1 NH4NO3 400 Indolietikkahappo 2,0

Ca(NO^)2’4H2° 144 Furfuryyliadeniini 0,1 KN03 80 Tiamiini 0,1 30 Κί^ΡΟ^ 12,5 Nikotiinihappo 0,5

MgSO^^f^O 72 Pyridoksiini 0,5 KC1 65 Glysiini 2,0

NaFe-EDTA 25 myo-inosiitti 100 Z'; H~BCU 1,6 Kaseiini-hydroly- 1000 . 35 saatti .**; MnS0^'4H20 6,5 Sakkaroosi 2 % : ZnS0^*7H20 2,7 Puhdistettu agar-jauhe 1 % ] KJ 0,75 28 81 007

Vaihe 2:

Vaiheessa 1 saadut kasvit kuihtuivat eristetyissä olosuhteissa, kasvihuoneessa samanaikaisesti. Kasvit olivat tällöin 11 cm:n suuruisissa ruukuissa, jotka oli 5 täytetty puutarhamaalla, 18-24°C:n päivä- ja 12-14°C:n yö-lämpötilassa. Päivän pituus oli vähintään 14 tuntia, ja vuoden talvipuoliskolla se saavutettiin lisävalaistuksen 2 avulla (200 wattia/m ). Kastelu suoritettiin tarpeen mukaan .

10 Valittujen yksilöiden joukosta koottiin 4 viikon pituisena ajanjaksona jatkuvasti siementen saantia varten ne mykeröt, jotka olivat kukkineet ja olivat juuri pu-toamaisillaan. Kuivaus suoritettiin hyvin ilmastetussa hallissa, ilman lämpötilan ollessa 20-30°C; tämän jälkeen 15 siemenet erotettiin siivilän (5 x 0,4 mm) avulla ja puhdistettiin jälkeenpäin viskurin avulla.

Vaihe 3:

Vaiheesta 2 saadusta siemensadosta otettiin pisto-koe, ja tästä kasvatettiin nojn 2000 jälkeläistä (ekologi-20 set olosuhteet kuten vaiheessa 2) ja ne valikoitiin vaiheen 1 samanlaisten kriteerien A)-D) mukaisesti. Näin valittujen yksilöiden suhteen meneteltiin vaiheen 2 mukaisesti.

Vaihe 4: 25 Vaiheen 3 mukaisesta siemensadosta kylvettiin osa syksyllä kahdelle erilaiselle kasvupaikalle.

Kasvupaikka I

450 m NN, 48,5° pohjoista leveyttä/ll,5° itäistä pituutta, 750 mm vuotuinen sademäärä, kostea-lauhkea 30 ilmasto, tammikuu -10 - 0°C, heinäkuu +10 - +20°C.

li 29 81 007

Kasvupaikka II

200 m NN, 42° pohjoista leveyttä/10 itäistä pituutta, 400 min vuotuinen sademäärä, välimerenilmasto, tammikuu 0 - +10°C, heinäkuu +20 - +30°C.

5 Kylvö suoritettiin molemmissa kasvupaikoissa syys kuun lopussa/lokakuun alussa.

Näin saadut kenttäkoe-olosuhteet kokeiltiin uudelleen ja arvioitiin homogeenisen kasvun, kukkien koon ja korjuupäivän suhteen, sitäpaitsi tutkittiin kukkien koe-10 näytteet vaikuttavan aineen pitoisuuden suhteen. Kenttä-kasvusta valittiin uudelleen ne yksilöt, jotka vastasivat vaiheessa 1 mainittuja parametreja. Näistä saadaan siemenet vaiheen 2, viimeisen lauseen mukaisesti.

Vaihe 5: 15 Käyttäen vaiheen 4 mukaisia siemeniä, toistettiin vaiheet 3 ja 4 yllä annetussa järjestyksessä ja esitetyllä tavalla. NN = korkeus merenpinnasta.

Vaihe 6:

Vaiheesta 5 saaduista siemenistä kasvatettiin noin 20 1500 yksilöä (ekologiset olosuhteet kuten vaiheessa 2), ja ne valikoitiin saman periaatteen mukaisesti kuin on esitetty vaiheessa 1. Näin valituista kasveista valittiin 34 yksilöä ja kloonattiin vaiheen 1 mukaisesti. Kunkin kloonin joka kymmenes kasvi istutettiin, jakamalla ne satun-25 naisesti 40 x 30 cm:n etäisyydelle avoimelle maalle (kasvupaikka I, katso vaihe 4), eristettyyn paikkaan. Maa oli lössisavea, pH 7,0. Istuttaminen suoritettiin kesäkuun alussa, ensimmäinen siemensato saatiin heinäkuun puolivälissä, tämän jälkeen kasveja leikeltiin, ne kukkivat vielä kerran 30 ja tuottivat elokuun puolivälistä elokuun loppuun toisen siemensadon.

Tämän materiaalin siemensadon korjuu suoritettiin vaiheen 2 mukaisesti.

Vaiheen 6 mukaiset siemenet ovat kyseessä olevan 30 81 007 keksinnön mukaisen kamomillasaunion kylvöön käytettävät siemenet.

Näistä kylvösiemenistä muodostuvien kasvien kukat (kylvö syyskuu/lokakuu, korjuu tätä seuraavan vuoden kesä-5 kuun alku), jotka poimitaan sinä ajankohtana, jolloin 30-70 % torvikukista on avoinna ja joita heti tämän jälkeen kuivataan kuivauskaapissa 40°C:ssa, 72 tunnin ajan, sisältävät kuivattujen kukkien painon suhteen (kuiva-aine), esimerkiksi vähintään 150 mg-% kamatsuleenia, 300 mg-% (-)-O^ -10 bisabololia ja korkeintaan 50 mg-% muita bisaboloideja.

Esimerkki 2

Aineen, jolla on tulehduksenvastaista vaikutusta, saanti kamomillasaunion tetraploidisesta kantakasvista:

Kamomillasaunio, joka saadaan jälkeenpäin kuvatulla 15 tavalla, kylvetään tavanomaisesti, maanviljelystavan mukaisesti. Heti kun kasvit ovat kehittyneet ja mykeröt ovat siinä kasvuvaiheessa, jossa noin 50 % torvikukista on avautunut, nämä mykeröt korjataan kamomillasaunionpoimintakoneel-la, jolloin poimintakoneen kampojen etäisyydet on säädetty 20 siten, että vain ne kukkamykeröt, joiden torvikukista 50 % on avautunut, irrotetaan. Korjattu sato siirretään mahdollisimman nopeasti varjoisaan paikkaan ja levitetään siellä jatkokäsittelyä varten ohueksi kerrokseksi. Tämän jälkeen mykeröt erotetaan siivilälaitteessa varsista ja 25 kuivataan vakiopainoon. Painohäviö on noin 80 %. Kuivaus suoritetaan varjossa, jossain hyvin ilmastetussa paikassa kuivatusarinoilla, kerroksen paksuuden ollessa noin 10 cm.

Kuivatus päättyy 2-3 päivän kuluttua. Varsiosien ja kukkamurskan erottamiseksi kuivattu materiaali siivilöidään 30 ja tämän jälkeen puristetaan palloiksi.

Analyysi:

Eteerinen öljy 940 mg-%

Kamatsuleeni 132 " (_)_ Ot-bisabololi 243 " 35 Jos kuivaus suoritetaan esimerkiksi kiinteässä liu-

II

3i 81007 kuhihnakuivauslaitteessa, keinotekoisesti lämmitetyn ilman avulla, jossain 5Q°C:n ja 70°C:n välisessä lämpötilassa, niin kuivaus päättyy noin 4-5 tunnin kuluttua. Varsi-osien ja kukkamurskan poistamiseksi kuivattu materiaali 5 siivilöidään ja tämän jälkeen se puristetaan palloiksi.

Sellaisen aineen analyysiarvot ovat esimerkiksi: Eteerinen öljy 775 mg-%

Kamatsuleeni 65 " (_) _ Ot-bisabololi 163 " 10 Käytetyt, tetraploidiset kamomillasaunion kanta- kasvit saadaan seuraavasti:

Yksittäiskasvien muuntelukokeen avulla, joka suoritettiin 10 000 kasville, jotka olivat tetraploidista kamo-millalaatua, jota I. Särkäny /kerba Hungar. 4(1), 125-169 15 (1965)] kuvasi, havaittiin, että noin 1000 yksilöä kohti muodostuu kasvi, jonka eteerisissä öljyissä kamatsuleeni-pitoisuus on korkea, 20 paino-% sekä korkea (-)~<X -bisa-bololipitoisuus on 50 paino-%, jolloin samanaikaisesti muiden bisaboloidien (erityisesti (-)-Ct-bisabolonioksidin) 20 määrä on erittäin alhainen (vähemmän kuin 5 paino-%). Nämä yksilöt valittiin, ja niille suoritettiin seuraavat toimenpiteet:

Toimenpide 1:

Yllä kuvattujen, valittujen tetraploidisten kamo-25 millasauniokasvien jälkeläisistä valittiin ne yksilöt, jotka saavuttavat kamatsuleenin suhteen vähimmäispitoisuuden 100 mg-% ja (-)- Cfc-bisabololin suhteen 200 mg-% tai ylittävät nämä arvot ja joissa muiden bisaboloidien pitoisuus on alle 50 mg-%. Kaikki arvot tarkoittavat kukkamykeröitä, 30 jotka kuivattiin noin 4Q°C:ssa ja joiden korjuu tapahtui vaiheessa, jolloin noin 30-7Q % mykerön kaikista torviku-kista oli avautunut.

Toimenpide 2:

Toimenpiteen 1 mukaan saaduista kasveista poistet-35 tiin kaikki auenneet kukkamykeröt, tämän jälkeen kasvit siir- 32 81 007 rettiin kasvihuoneeseen ja ne lopettivat kukintansa eristetyissä olosuhteissa yhteisesti. Kasvit sijaitsivat tällöin 11 cm:n suuruisissa ruukuissa, jotka oli täytetty puutarhamaalla, 18-24°C:n päivä- ja 12-14°C:n yölämpötilas-5 sa. Päivänpituus oli vähintään 14 tuntia, ja se saavutettiin vuoden talvipuoliskolla lisävalaistuksen avulla (200 o wattia/m ). Kastelu suoritettiin tarvittaessa.

Valittujen yksilöiden kokonaismäärästä koottiin jatkuvasti 4 viikon kuluessa siementen saantia varten ne 10 mykeröt, jotka olivat kuihtuneet ja jotka olivat juuri hajoamaisillaan. Kuivaus suoritettiin hyvin ilmastoidussa hallissa, ilman lämpötilassa, joka oli 20-30°C; tämän jälkeen siement poistettiin siivilöimällä täyttösiivilässä (5 x 0,4 mm) ja puhdistettiin tämän jälkeen viskurissa 15 (Steigsichter).

Toimenpiteen 2 jälkeen saadut siemenet ovat keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettyjä kamomillasaunion kylvösiemeniä. Tästä kylvösiemenestä saatujen kasvien kukat (kylvö syyskuu/lokakuu, korjuu seuraavan vuoden kesäkuun alussa), 20 jotka poimitaan sinä ajankohtana, jolloin 30-70 % torvi-kukista on avautunut, ja joita kuivattiin heti tämän jälkeen kuivauskaapissa 40°C:ssa 72 tunnin ajan, sisältävät, kuivattujen kukkien painon suhteen, vähintään 100 mg-% kamatsuleenia, vähintään 200 mg-% (-) - C*-bisabololia ja 25 korkeintaan 50 mg-% muita bisaboloideja.

Esimerkki 3

Aineen, jolla on tulehduksenvastaista vaikutusta, saanti diploidisesta kamomillasaunion kantakasvista:

Kamomillasaunio, joka saadaan yllä kuvatulla ta-30 valla, kylvetään tavanomaisen maanviljelyskäytännön mukaisesti. Niin pian kuin kasvit ovat kehittyneet ja kukkamy-keröt ovat kasvuvaiheessa, jossa noin 50 % torvikukista on avautunut, nämä kukkamykeröt korjataan kamomillasaunion-poimintakoneella, jolloin poimintakoneen kampojen etäisyy-35 det on niin asetettu, että ainoastaan ne kukkamykeröt,

II

33 81 007 joiden torvikukista 50 % on avautunut, vedetään pois. Sato kuljetetaan mahdollisimman nopeasti johonkin varjoisaan paikkaan ja levitetään siellä ohueksi kerrokseksi jatkokäsittelyä varten. Tämän jälkeen mykeröistä irrotetaan var-5 ret siivilälaitteessa, ja mykeröt kuivataan painovakioon. Painotappio on noin 80 %. Kuivaus suoritetaan varjossa, jossain hyvin ilmastetussa paikassa, kuivausarinalla, noin 1Q cm:n paksuisena kerroksena.

Kuivaus päättyy 2-3 päivän kuluttua. Varsiosien ja 10 kukkamurskan poistamiseksi kuivattu materiaali siivilöidään ja puristetaan tämän jälkeen palloiksi.

Analyysi:

Eteerinen öljy 910 mg-%

Kamatsuleeni 117 " 15 (-) - (X -bisabololi 252 " Käytetty diploidinen kamomillasaunion kantakasvi saadaan seuraavasti:

Yksittäiskasvien muuntelutestin avulla, joka suoritettiin diploidisille, vain vähän bisabololia sisältäville, 20 mutta ei bisabololittomille kamomillasaunioille, joita

Franz, Ch., J. Hölzl ja A. Vömel kuvaavat: Acta Horticul-turae 73, 109-114 (1978), että korkeintaan 20 %:lla kaikista yksilöistä eteerisissä öljyissä kamatsuleenipitoisuus oli noin 20 paino-% ja (-)-Cfci-bisabololipitoisuus oli kor-25 kea, 50 paino-%, jolloin samanaikaisesti muiden bisaboloi-dien pitoisuus (erityisesti (-)-O^-bisabolonioksidin) on erittäin alhainen. Nämä yksilöt valittiin ja niistä muodostettiin tetraploideja seuraavasti:

Valittujen kamomillasaunioiden siemenet pantiin 30 0,05 -% : isella kolkisiinin vesiliuoksella imeytetylle suo datinpaperille, ja ne jätettiin huoneenlämpötilaan (20°C) 6 tunniksi. Sitten ne poistettiin suodatinpaperilta, huuhdottiin vedellä useita kertoja, kylvetettiin kylvölaatik-koon (kasvihuone): maa: turve-hiekka-seos 1:1, lämpötila: 35 18-20°C, suhteellinen kosteus: noin 60 %, päivänpituus kei- 34 81 007 notekoisessa valaistuksessa: 14 tuntia.

Itäviä kasveja tarkkailtiin kukintaan saakka, poly-ploidisoinnin tulos määritettiin siitepöly- ja siemenkoon vertailevalla mittauksella sekä laskemalla kasvien kromo-5 somit (F^-jälkeläiset = tetraploidisiksi todistettujen, kolkisiinilla käsiteltyjen kasvien siemenistä kasvatetut-ensimmäiset jälkeläiset).

Tetraploidien muodostaminen voi tapahtua myös seu-raavalla tavalla: 1Q Veteen upotetulla suodatinpaperilla itäneet, 5-7 päivän ikäiset, hyvin kehittyneet kamomillasaunicn sirkka-taimet asetettiin huoneen lämpötilassa (20°C) 4-6 tunniksi, sirkkalehdet alaspäin,0,05-% : iseen kolkisiiniliuokseen. Herkkiä sirkkataimia kohdeltiin tällöin varoen; kuivuus-15 vaurioiden välttämiseksi niissä, täytyy ympäröivän ilmakehän suhteellisen ilmankosteuden olla lähes 100 %. Käsittelyn jälkeen alkioita huuhdeltiin useita kertoja, vedellä, ja ne istutettiin uudelleen kasvilavoille. Jatkokäsittely suoritettiin kuten siemenille.

20 Siitepölykoon mittaukset suoritetaan Leitzin bin- okulaarisellatutkimusmikroskoopilla, jossa on mikrometri-mittaokulaari ja käyttäen mikrometriobjektin laseja.

Kromosomit lasketaan juurien kärjistä: Kasvihuoneessa kasvatetuista taimista tai pistokkaista kootacin 1-2 cm:n 25 mittaisia, tuoreita juurenpäitä, ne pannaan 5 tunniksi 0,002 molaariseen hydroksikinoliini-liuokseen ja tämän jälkeen 15 minuutiksi IN HCl:iin. Tutkimista varten noin 1 mm juurenpäistä värjätään 2-%: isella orseiinietikkahapolla ja tutkitaan mikroskoopin avulla, öljyimmersiota käyttäen.

30 Mitoosissa olevilla soluilla voidaan näin määrittää somaattisten solujen 4-kertainen kromosomisarja (4n = 36).

Ne kasvit, joilla siitepölyn läpimitta on noin 50 '& suurempi kuin siitepölyn läpimitta diploidisella lähtömateriaalilla (noin 30 noin 20 pm:n sijasta) ja joilla 35 somaattisten solujen kromosomisarja oli kahdennettu 36:ksi

II

35 81007 (joilla diploidisen lähtömateriaalin vastaava luku on 18), olivat tetraploidisia. Nämä kasvit valittiin. Noin 0,ΙΟ, 5 % siemenistä tai sirkkataimista muodostivat tetraploi-deja yllä annetulla menetelmällä, ja ne muodostivat kukki-5 miskykyisiä, vahingoittumattomia kasveja. Tämä on nyt yhteydessä esimerkiksi toimenpiteitä 1 ja 2 vastaavaan esimerkkiin 2.

Näin saatujen kamomillasaunioiden kukat sisältävät esimerkiksi vähintään 100 mg-% kamatsuleenia, 200 mg-% 10 (-)-Ä-bisabololia ja korkeintaan 50 mg-% muita bisaboloi- deja (sato ajankohtana, jossa 30-70 % torvikukista on avautunut, ja on käytetty 72-tuntista kuivausta kuivauskaapissa, 40°C:ssa).

Esimerkki 4 15 Tulehduksenvastaisesti vaikuttavan aineen saanti diploidisesta kamomillasaunion kantakasvista:

Kamomillasaunio, joka saadaan seuraavassa kuvatulla tavalla, kylvetään tavanomaisen maanviljelystavan mukaisesti. Niin pian kuin kasvit ovat kehittyneet ja kukka-20 mykeröt ovat kasvuvaiheessa, jossa noin 50 % torvikukista on avautunut, nämä kukkamykeröt korjataan kamomillanpoimin-takoneella, jolloin poimintakoneen kampojen etäisyydet on asetettu niin, että ainoastaan kukkamykeröt, joiden torvikukista 50 % on avautunut, vedetään pois. Sato kul-25 jetetaan mahdollisimman nopeasti varjoisaan paikkaan ja levitetään siellä ohuena kerroksena jatkokäsittelyä varten. Tämän jälkeen siivilälaitteessa kukkamykeröt irrotetaan varsista ja kuivataan vakiopainoon. Painohäviö on noin 80 %.

Kuivaus suoritetaan varjossa, hyvin ilmastetussa 30 paikassa, kuivausarinan päällä, kerroksen paksuuden ollessa noin 10 cm.

Kuivaus päättyy noin 2-3 päivän kuluttua. Varsiosien ja kukkamurskan poistamiseksi kuivattu materiaali siivilöidään ja puristetaan tämän jälkeen palloiksi.

36 81 007

Analyysi :

Eteerinen öljy 1020 mg-%

Kamatsuleeni 173 " (-)- Ot-bisabololi 418 " 5 Käytetyt, diploidiset kamomillasaunion lähtökas- vit saadaan seuraavasti:

Yksittäiskasvien muuntelutestin avulla, joka suoritettiin diploidisille, vain vähän bisabololia sisältäville, mutta ei sellaisille kamomillasaunioille, jotka eivät 10 sisällä bisabololia, joita Franz, Ch.# J. Hölzl ja A.

Vömel kuvaavat julkaisussa Acta Horticulturae 73, 109-114 (1978), todettiin että korkeintaan 20 %:iin saakka kaikista yksilöistä eteerisessä öljyssä kamatsuleenipitoisuus on noin 20 paino-%, ja/tai (-)--bisabololipitoisuus on 15 niin korkea kuin 50 paino-%, jolloin saman aikaisesti muiden bisaboloidien, erityisesti (-)-oo-bisabolonioksidin) pitoisuus on erittäin vähäinen. Nämä yksilöt valittiin, ja niistä muodostettiin tetraploideja täsmälleen esimerkissä 3 esitetyllä tavalla, ja tetraploidiset yksilöt valittiin. 20 Noin 0,1-0,5 % siemenistä tai sirkkataimista muodos tivat tetraploideja ja kehittivät kukkimiskykyisiä, vahingoittumattomia kasveja.

Tämä on nyt yhteydessä esimerkiksi toimenpiteisiin 1-6, vastaten esimerkkiä 1.

25 Näin saadun kamomillasaunion kukat sisältävät esi merkiksi vähintään 150 mg-% kamatsuleenia, 300 mg-% (-)-^-bisabololia ja korkeintaan 50 mg-% muita bisaboloi-deja (sadonkorjuu ajankohtana, jossa 30-70 % torvikukista on avautunut, ja satoa on kuivattu 72 tunnin ajan kuivaus-30 kaapissa, 40°C:ssa).

Muut ominaisuudet vastaavat esimerkissä 1 saadun kamomillasaunion ominaisuuksia.

Esimerkki 5

Uutteen valmistaminen kamomilla-rohdoksesra 35 Kamomillakukat käytettävää rohdosta varten korja taan esimerkin 1 mukaisesti ajankohtana, jolloin 30-70 %

II

37 81 007 torvikukista on avautunut, ja kuivataan ilmassa alle 50°C lämpötilassa.

400 g näin saatua kamomillarohdosta, joka sisältää 105 mg-% kamatsuleenia ja 212 mg-% (-)-^-bisabololia uute-5 taan 2100 g:11a vesipitoista etanolia (40 paino-% etanolia) allassekoittimessa, jonka kierrosluku on 30 kierrosta/min 3 tuntia. Rohdostuote puserretaan tämän jälkeen ja uute suodatetaan.

Uutteen vaikuttavien aineiden pitoisuus määritetään 10 tavanomaisella tavalla: kamatsuleeni: 3,7 mg-% (-)-G'-bisabololi : 10,2 mg-%

Esimerkki 6

Eteerisen kamomillaöljyn valmistaminen 15 200 g esimerkin 1 mukaisesti saatuja kuivattuja ka- momillan kukkia (kuivaus 50°C:ssa auringonvalolta suojattuina) saatetaan reagoimaan 5 l:n pyörökolvissa 3,6 l:n kanssa vettä ja 2 g:n kanssa natriumaskorbaattia; seoksen pH säädetään arvoon 5,0 IN Helillä. Seokseen lisätään kie-20 humakiviä ja seos kuumennetaan kiehumispisteeseen. Noin 3 tunnin kuluessa saadaan noin 1,2 1 tislettä.

Tislauksen päättymisen jälkeen tisle ravistellaan 3 kertaa aina 100 ml:n kanssa petrolieetteriä ja kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla. Kuivattu liuos suodate-25 taan, jonka jälkeen liuotin poistetaan tislaamalla pyörö-haihduttimessa.

Saadun eteerisen Öljyn kamatsuleeni- ja (-)-Qi-bisa-bololipitoisuus määritetään tämän jälkeen.

Saanto: 1,44 g eteeristä öljyä 30 Kamatsuleeni: 3,6 % öljystä (-) - Oi -bisabololi : 10,2 % öljystä

Liite A

Eteerisen öljyn saanti Lähtöaine on kamomillasauniosta saatua kuivattua ma-35 teriaalia, joka kysymyksessä olevan keksinnön mukaisesti tu- 38 81 007 lee kysymykseen tulehduksen vastaisen aineen valmistuksessa. öljyn valmistuksessa käytetään ainoastaan sellaisia mykeröitä, joiden torvikukista 30-70 %, erityisesti 40-60 % on avautunut. Kuivaus suoritetaan kuivauskaapissa 5 40°C:ssa 72 tunnin kuluessa.

Eteerinen öljy saadaan kuivatusta materiaalista seu-raavassa kuvatun, kaksituntisen vesihöyrytislauksen avulla: 2,0 g pienentämättömiä, kuivattuja kukkia pannaan yhden litran vetoiseen pyörökolviin 250 ml:n kanssa vettä, 10 josta suolat on poistettu, ja suoritetaan kahden tunnin mittainen palautustislaus Clevenger-laitteessa (vesihöyrytis-laus-palautuslaite eteerisen öljyn pienten määrien kvantitatiivista määritystä varten). Keräysastiassa on 1 ml pen-taania analyysiä kohti. Palautusnopeus on 40 + 4 pisaraa/-15 minuutti. Tislauksen päätyttyä, pentaaniin liuennut öljy tyhjennetään mahdollisimman vedettömänä koeputkiin, ja mahdollisesti jäljelle jäänyt, laitteeseen tarttunut eteerinen öljy huuhdotaan pentaanilla. Mahdollisten vesijään-teiden poistamiseksi lisätään liuokseen spaattelinkärjel-20 linen kuivattua Ν32εο^, ja tämän jälkeen liuos suodatetaan imussa lasisintteri-imusuodattimen läpi, jonka huokoskoko on D 3 tai D 4, kierteisellä suuosalla varustetuissa pulloissa. Sen jälkeen kun pentaani on poistettu haihduttamalla 40°C:ssa vesihauteessa ja kuivaus on suoritettu 25 eksikaattorissa, öljyn määrä määritetään gravimetrisesti.

Näin saadusta öljystä (noin 20 mg) määritetään tämän jälkeen kamatsuleeni ja bisabololi.

Kamatsuleenin spektrofotometrinen määritys Mitattava liuos: 30 Koko määrä, 2 g:sta kuivattua materiaalia saatua, eteeristä öljyä (noin 20 mg) (saatu edellä kuvatulla tavalla) liuotetaan 25 ml:aan n-heksaania tai sykloheksaania.. Mittauslaite:

Suodatinfotometri (esim. Eppendorf).

Il 39 81 007

Aallonpituus: 578 nm Kyvetti: 1 cm

Kamatsuleenin spesifinen ekstinktio (1 g/100 ml: 1 cm): 20,8 Kompensaationeste: n-heksaani tai sykloheksaani 5 Kamatsuleenin havaittu pitoisuus mg/100 g: 120 E^g

Siinä tapauksessa, että käytettävissä ei ole suoda-tinfotometria, voidaan määritys suorittaa myös spektro-fotometrillä:

Mittauslaite: Spektrofotometri (esim. PM Q II/ tai PM Q 10 HI "ZEISS")

Aallonpituus: 605 nm Kyvetti: 1 cm

Kamatsuleenin spesifinen ekstinktio (1 g/100 ml; 1 cm): 24,5 Kompensaationeste: n-heksaani tai sykloheksaani 15 Kamatsuleenin havaittu pitoisuus mg/100 g: 102 Egg^

Mitattavasta liuoksesta määritetään tämän jälkeen bisabololi.

Bisabololin ja muiden bisaboloidien kaasukromatografinen määritys: 20 Kaasukromatografia: Hewlett Packard malli 5750, Erba Fracto-vap 2350 tai joku muu samankaltainen laite Detektori: Liekki-ionisaatio-detektori Kantokaasu: Helium

Pylväs: 0,32 cm (4/8"); 200 cm? terästä 25 Pylvään täyte: 3 % nitriilisilikonikumi "XE 60" piimaal- la silanoidulla "Cromosorb WAW HP":11a 125-150 pm, kan-toaineena Lämpötila:

Detektotori: 320°C 30 Injektiopesä: 220°C Pylväs: 85-220°C Lämpötilaohjelmointi: 4°/min Näyteliuos: Käytetään mittaliuosta, joka on läheinen kamatsu-leenilie 35 Vertailuliuos: Noin 15 mg standardi-bisabololia liuotetaan 81 007 40 sykloheksaaniin 25 ml:ksi

Injektoitava määrä: Näyteliuosta ja vertailuliuosta, kutakin 5 μΐ

Mittaus: Mittaus tapahtuu piikkien pinta-alojen vertailun 5 avulla

Bisabololi-pitoisuus: mg/100 g kuivattuja kukkia: 10 x punnittu erä (vertailu) /mg7 x pinta-ala (näyte)

Pinta-ala (vertailu)

Muiden bisaboloidien määrittäminen voidaan suorit-10 taa samoin kaasukromatografisesti, esimerkiksi seuraavis-sa mittausolosuhteissa:

Laite: Packard, malli 7721, sarja 800 tai Erba Fractovap sarja 2350

Pylväät: Lasipylväät, 3 m/2 mm läpimitaltaan; 2 m/2 mm lä-15 pimitaltaan Täyte: 3 % metyylifenyylisilikonikumia "OV 1" piimaalla silanoidulla "Gaschrom Q":lla, 125-150 |um, kantoaineena Kantokaasu: 30 ml/minuutti N2

Lämpötilaohjelmointi: 80-180°C, 2,5 (3)°C/min 20 Injektori/detektorilämpötila: 200°C

Detektori: Liekki-ionisaatio-detektori

Injektoitu määrä: 1:50 laimennettua eteeristä öljyä noin 2 pl

Mittaus suoritetaan osittain ilman sisäistä standar-25 dia, osittain sisäisen standardin avulla. Sisäiseksi standardiksi soveltuvat lauriinihappometyyliesteri tai heksa-dekaani kamatsuleenia vähän sisältäville tai kamatsulee-nittomille öljyille, öljyillä, joissa kamatsuleenipitoisuus on yli 5 %, pidetään tätä parempana sisäisenä standardina, 30 jolloin pitoisuusmääritys suoritetaan fotometrisesti (578 nm:ssä).

Claims (5)

41 810 07

1. Menetelmä aineen saamiseksi, jolla on tulehduk-senvastaista vaikutusta, Matricaria chamomillasta, 5 tunnettu siitä, että diploidisen tai tetraploidi- sen kamomillapopulaation 1 000:sta - 10 000:sta yksittäisestä kasvista määritetään kulloinkin eteerisen öljyn (-)-a-bisabololin pitoisuus ja valitaan ne kamomillakas-vit, joilla (-)-a-bisabololi edustaa eteerisen öljyn pää-10 komponenttia, jolloin tetraploidisen lähtökamomillan ol lessa kyseessä, 40°C:ssa kuivatut kukat sisältävät vähintään 100 mg-% kamatsuleenia, vähintään 200 mg-% (-)-a-bis-abololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloideja, ja diploidisen lähtökamomillan ollessa kyseessä, 40°C:ssa kui-15 vatut kukat sisältävät vähintään 100 mg-% kamatsuleenia, vähintään 50 - 100 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloideja, ja edellyttäen, että diploi-dinen lähtökamomilla ei ole kamomillalajike Degumill, lähtöpopulaatiosta erotetut kamomillat kasvatetaan edelleen 20 ja näistä kasveista valitaan vähintään 10 yksilöä, joilla on samanaikainen kukintakausi, joiden mykeröiden koko on 20 - 40 mm ja joiden vaikuttavan aineen pitoisuus on vähintään 100 mg-% kamatsuleenia, vähintään 200 mg-% bisabo-lolia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloideja (kaikki 25 laskettuna kuiva-ainepitoisuudesta), mahdollisesti nämä valitut diploidiset tai tetraploidiset kasvit lopuksi kloonataan, ja a) näin saaduista kasveista otetaan siemeniä, b) kasvatetaan kohdassa a) saatujen siemenien jäl-30 keläisiä, tehdään lopuksi valinta vaikuttavan aineen pitoisuuden sekä samanaikaisen kukintakauden, säännöllisen juuresta lähtevän haarautumisen ja 20 - 40 mm:n mykeröiden koon perusteella, kuten edellä on kuvattu, mahdollisesti näin valitut kasvit kloonataan ja otetaan niistä siemeniä, 35 c) kohdan b) toimenpiteet toistetaan 3-5 kertaa, 42 81 007 d) kasvatetaan kohdassa c) saatujen siemenien jälkeläisiä, jälkeläisistä suoritetaan valinta kohdan a) mukaisesti, mahdollisesti näin valitut kasvit kloonataan ja otetaan siemeniä näin saaduista kasveista, 5 ja diploidisten kamomillojen ollessa kyseessä, nämä tetraploidisoidaan lopuksi kemikaalien avulla lämpötila-alueella 0 - 35°C, gamma-säteiden, röntgensäteiden tai UV-säteilyn avulla 0 - 35°C:ssa, korkeampia lämpötiloja 30 -50°C käyttäen, alemmissa lämpötiloissa 0 - 5°C:ssa tai de-10 kapitointikallusmenetelmällä tai heteen ponsiviljelmän avulla, joka lopuksi tetraploidisoidaan ja näin saaduista kasveista kerätään kukat, jotka ovat kasvuvaiheessa, jossa 30 - 100 % mykerön torvikukista on avautunut, ja kuivataan ne korkeintaan 70°C:n lämpötilassa, jotta saadaan kuivaa 15 materiaalia, joka sisältää vähintään 30 mg-% kamatsulee-nia, vähintään 100 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloideja; ja mahdollisesti näin saadusta kuivasta materiaalista valmistetaan tislaamalla veden läsnäollessa eteerinen öljy, joka sisältää vähintään 3,5 % 20 kamatsuleenia, vähintään 10 % (-)-a-bisabololia sekä vä hemmän kuin 10 % muita bisaboloideja, tai uuttamalla alempien alkoholien kanssa valmistetaan alkoholipitoinen kamo-millasauniouute, joka sisältää vähintään 1,5 mg-% kamatsuleenia, vähintään 5,0 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän 25 kuin 10 mg-% muita bisaboloideja.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kukat kerätään kasvuvaiheessa, jossa mykerön torvikukista 30 - 70 % on avautunut, kukat kuivataan ilman lämpötilassa, joka ei ole korkeampi 30 kuin 50°C ja näin saatu, kuivattu materiaali sisältää vähintään 100 mg-% kamatsuleenia, vähintään 200 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloideja, ja mahdollisesti tästä valmistettu eteerinen öljy sisältää vähintään 3,5 % kamatsuleenia, vähintään 10 % (-)-a-bis-35 abololia ja vähemmän kuin 10 % muita bisaboloideja, ja tästä valmistettu alkoholipitoinen uute sisältää vähintään II 43 81 007 5,0 mg-% kamatsuleenia, vähintään 10,0 mg-% (-)-a-bisabo-lolia ja vähemmän kuin 10,0 mg-% muita bisaboloideja.

3. Yhden tai useamman edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 5 kukat kerätään kasvuvaiheessa, jossa 30 - 70 % mykerön torvikukista on avautunut, ja kukat kuivataan 50 - 70°C:n ilman lämpötilassa, ja näin saatu kuivattu materiaali sisältää vähintään 50 mg-% kamatsuleenia, vähintään 150 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisabo-10 loideja, ja mahdollisesti tästä valmistettu eteerinen öljy sisältää vähintään 3,5 % kamatsuleenia, vähintään 10 % (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 10 % muita bisaboloideja, ja tästä valmistettu alkoholipitoinen uute sisältää vähintään 2,5 mg-% kamatsuleenia, vähintään 7,5 mg-% (-)-15 α-bisabololia ja vähemmän kuin 10,0 mg-% muita bisaboloi deja.

4. Yhden tai useamman edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kukat kerätään kasvuvaiheessa, jossa 70 - 100 % mykerön 20 torvikukista on avautunut, ja kukat kuivataan ilman lämpötilassa, joka ei ole korkeampi kuin 50°C, ja näin saatu kuivattu materiaali sisältää vähintään 40 mg-% kamatsuleenia, vähintään 120 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisaboloideja, ja mahdollisesti tästä val-25 mistettu eteerinen öljy sisältää vähintään 3,5 % kamatsu leenia, vähintään 10 % (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 10 % muita bisaboloideja, ja tästä valmistettu alkoholipitoinen uute sisältää vähintään 2,0 mg-% kamatsuleenia, vähintään 6,0 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 10,0 30 mg-% muita bisaboloideja.

5. Yhden tai useamman edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kukat kerätään kasvuvaiheessa, jossa 70 - 100 % mykerön torvikukista on avautunut, ja kukat kuivataan 50 - 70°C:n 35 ilman lämpötilassa, ja näin saatu kuivattu materiaali si sältää vähintään 30 mg-% kamatsuleenia, vähintään 100 mg- 44 81 007 % (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg-% muita bisabo-loideja, ja mahdollisesti tästä valmistettu eteerinen öljy sisältää vähintään 3,5 % kamatsuleenia, vähintään 10 % (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 10 mg-% muita bisabo-5 loideja, ja tästä valmistettu alkoholipitoinen uute sisältää vähintään 1,5 mg-% kamatsuleenia, vähintään 10,0 mg-% (-)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 10,0 mg-% muita bisabo-loideja. 45 81 007