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Verfahren zur Herstellung eines neuen Mittels mit
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antiphlogistischer Wirkung Arzneimittel und kosmetische Mittel aus
Zubereitungen der Blütenköpfchen der Echten Kamille (Chamomilla recutita (L.) Rauschert,
synonym mit Matricaria chamomilla L.) finden wegen ihrer antiphlogistischen und
spasmolytischen Wirkung eine breite Verwendung.
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Besondere Bedeutung kommt dabei den Wirkstoffen (-)-OL-Bisabolol und
Chamazulen zu. Ein aus Kamille hergestelltes Mittel sollte deshalb einen möglichst
hohen Gehalt an diesen beiden Substanzen aufweisen.
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Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Mittels mit
vorteilhaften Eigenschaften unter Verwendung von tetraploiden Kamillen gefunden.
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Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung eines neuen Mittels mit
aniphlogistischer Wirkung, welches sich insbesondere durch einen erhöhten Gehalt
an Bisabolol und Chamazulen auszeichnet, wobei der Gehalt an Chamazulen mindestens
30 mg%, an Bisabolol mindestens 100 mg% und der Gehalt an übrigen Bisaboloiden weniger
als 50 mg% ist.
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Unter der Bezeichnung übrige Bisaboloide" wird insbesondere verstanden:
(-)-C<-Bisabololoxid A und B; (-) «-Bisabolonoxid A.
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Die Erfindung betrifft die durch die Patentansprüche definierten Gegenstände
beziehungsweise Sachverhalte.
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Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels werden folgende Kamillen
verwendet: a) Bekannte diploide Kamillen, bei denen (-)-0G-Bisabolol die Hauptkomponente
des ätherischen Öls darstellt.
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Diese Kamillen werden tetraploidisiert (Genom-Mutation), die so erhaltenen
tetraploiden Pflanzen aus selektiert und von diesen ausgewählten tetraploiden Pflanzen
wiederum die Pflanzen aus selektiert, deren bei 400 C getrocknete Blüten einen Mindestgehalt
an Chamazulen von 100 mg%; einen Mindestgehalt an (-)-oL-Bisabolol von 200 mg% und
einen Gehalt an übrigen Bisaboloiden von höchstens 50 mg% aufweisen (Ernte der Blüten
zu dem Zeitpunkt, wo 30 - 70 % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens aufgeblüht
sind), und gegebenenfalls hieran weitere übliche Selektions-und Vermehrungsschritte
angeschlossen (Mutterstammbaumzüchtung für vegetativ vermehrbare Fremdbefruchter)
-b) Bekannte tetraploide Kamillen, bei denen (-)-cL-Bisabolol die Hauptkomponente
des ätherischen Öls darstellt.
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Von diesen Kamillen werden die Pflanzen ausselektiert, deren bei
400 C getrocknete Blüten einen Mindestgehalt an Chamzulen von 100 mg%, einen Mindestgehalt
an (-)-d-Bisabolol von 200 mg% und einen Gehalt an übrigen Bisaboloiden von höchstens
50 mg% aufweisen (Ernte der Blüten zu dem Zeitpunkt, wo 30 - 70 % der Röhrenblüten
eines Blütenköpfchens aufgeblüht sind), und gegebenen-
falls hieran
weitere übliche Selektions- und Vermehrungsschritte angeschlossen (Mutterstammbaumzüchtung
für vegetativ vermehrbare Fremdbefruchter).
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Die diploiden Ausgangskamillen werden zum Beispiel aus folgenden Kamillen
erhalten: "Deutsche" Kamille (siehe L.Z. Padula, R.V.D. Rondina und J.D. Coussio,
Quantitative Determination of Essential. Oil, Total Azulenes and Chamazulene in
German Chamomile, Matricaria chamomilla, Cultivated in Argentina; Planta med. 30,
Seiten 273-280, 1976) sowie alle Kamillen, welche im ätherischen Öl deutlich meßbare
Konzentrationen an (-)-d-Bisabolol (in der Regel über 5 % des ätherischen Öls) aufweisen.
Beispielsweise kommen solche diploiden Kamillen in Frage, die in folgenden Literaturstellen
beschrieben sind: Schilcher, H.
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"Neuere Erkenntnisse bei der Qualitätsbeurteilung von Kamillenöl beziehungsweise
Kamillenblüten", Planta med.
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23, 132-144 (1973); Motl, O., M. Felklová, V. Lukes & M. Jasicova
"Zur gaschromatographischen Analyse und zu chemischen Typen von Kamillenöl", Arch.
Pharm. 310, 210-215 (1977); Franz, Ch., J. Hölzl & A. Vömel "Preliminary Morphological
and Chemical Characterization of some Populations and Varieties of Matricaria chamomilla
L.", Acta Hort. 73, 109-114 (1978).
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Weiterhin kommt als Ausgangskamille die diploide Kamillensorte DEGUMILL
(Deutsches Patent 24 02 802) in Frage. Auch in diesem Fall erhält man beispielsweise
eine tetraploide Kamille mit einem Chamazulengehalt von mindestens 150 mg% und einem
Bisabololgehalt von mindestens 200 mg%, falls die Ernte der Kamillenblütenköpfchen
dieser Kamille in dem Vegetationsstadium erfolgt, wo erst 30 - 70 % der Röhrenblüten
eines Köpfchens geöffnet sind, und die Trocknung bei einer Lufttemperatur von höchstens
50°
C durchgeführt wird.
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Durch nachgeschaltete Selektions- und Vermehrungsschritte gemäß dieser
Anmeldung lassen sich die angegebenen Bisabolol- und Azulenwerte auch hier noch
weiter erhöhen.
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Das ätherische Öl der Kamille(nblüten) besteht in der Regel aus den
Hauptkomponenten Farnesen, Spathulenol, Chamazulen (beziehungsweise Matricin), einem
der 4 Bisaboloide ((-)- i-Bisabolol, Bisabololoxid A, Bisabololoxid B oder Bisabolonoxid,
soweit es die Einzelpflanze betrifft; in der Mischprobe der Population können mehrere
Bisaboloide nebeneinander enthalten sein) sowie aus den Spiroäthern. Die genannten
Stoffe machen zusammen meist 70 - 80 % des ätherischen Öls aus. Besonders geeignet
sind daher diploide Ausgangskamillen, wo (-)-d-Bisabolol die überwiegende Komponente
(mehr als die Hälfte der Summe der vorgenannten Stoffe) darstellt. Insbesondere
kommen als Ausgangskamillen diploide Kamillen in Frage, bei denen zum Beispiel das
(-)- d-Bisabolol mindestens 40 % des ätherischen Öls oder mindestens 90 % der Bisaboloide
darstellt.
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Als tetraploide Ausgangskamillen kommen zum Beispiel in Frage: Die
Kamillensorten Bodegold (DDR), Pohorelicky (CSSR), Zloty Lan (Polen), BK-2 (Ungarn).
Diese Sorten sind in den folgenden Literaturstellen beschrieben: M. Chladek und
V. Kosova, Pharmazie 13, 712-713 (1958); W. Czabajska, Diss. PoznaS (1963); W. Poethke
und P. Bulin, Pharm. ZHalle 108, 813-823 (1969); I. Sárkány, Herb. Hungar. 4 (1),
125-169 (1965).
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Im übrigen gilt für die tetraploiden Ausgangskamillen hinsichtlich
des (-)-O(-Bisabololgehalts dasselbe wie für die diploiden Ausgangskamillen.
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Insbesondere kommen solche diploiden und tetraploiden
Kamillenpopulationen
in Betracht, welche in der Drogen-Mischprobe in der Regel mindestens 100 mg% Chamazulen
und 50 - 100 mg% (-)- 4-Bisabolol aufweisen (bezogen auf die Trockensubstanz der
bei 400 C getrockneten Blüten), das heißt aus solchen Kamillenpopulationen wird
im Falle einer diploiden Ausgangskamille Saatgut gewonnen und dieses Saatgut tetraploidisiert
(ohne Berücksichtigung und/oder Kenntnis des Bisabololgehaltes der Elternpflanzen).
Im Falle einer tetraploiden Ausgangskamille wird das wie oben beschriebene Saatgut
dann unmittelbar den folgenden Selektions- und Vermehrungsschritten unterworfen.
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Die geeigneten diploiden und tetraploiden Ausgangskamillen werden
durch Einzelpflanzen-Untersuchungen herausselektiert. Im allgemeinen ist es erforderlich,
von einer Ausgangspopulation beispielsweise 1000 -10000 Individuen zu untersuchen,
um einige Individuen zu finden, die einen hohen (-)-«-Bisabololgehalt gemäß den
oben angegebenen Kriterien aufweisen und als Ausgangskamille geeignet sind. Von
solchen ausgesuchten Individuen wird dann in üblicher Weise Saatgut gewonnen und
dieses tetraploidisiert. Nach der abgeschlossenen Tetraploidisierung werden die
tetraploiden Pflanzen von den übrigen diploid gebliebenen Pflanzen ausselektiert.
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Von den so erhaltenen tetraploiden Pflanzen, gegebenenfalls nach vorhergehender
Vermehrung, werden nun alle die Pflanzen aus selektiert, deren bei 400 C getrocknete
Blüten mindestens 100 mg% Chamazulen, mindestens 200 mg% (-)-d-Bisabolol und weniger
als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden enthalten. Die Ernte dieser Blüten erfolgt dabei
in dem Entwicklungsstadium, wo 30 - 70 % aller Röhrenblüten des Blütenköpfchens
geöffnet sind. Gegebenenfalls können sich hieran weitere Selektions-und Vermehrungsschritte
anschließen, die zum Beispiel
eine Verbesserung hinsichtlich folgender
Merkmale beziehungsweise Eigenschaften bewirken: Gleichzeitiger Blühtermin, gleichmäßige
grundständige Verzweigung und schmale Blühzone (das heißt bessere Eignung für die
maschinelle Ernte), große Blütenköpfchen, bessere Haltbarkeit der Droge, besonders
aromatischer Geruch.
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Falls man von vornherein von einer tetraploiden Kamille ausgeht, erfolgt
lediglich die zuvor angegebene Selektion solcher Pflanzen, deren bei 400 C getrocknete
Blüten mindestens 100 mg% Chamazulen, mindestens 200 mg% (-)-c(-Bisabolol und weniger
als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden enthalten, wobei ebenfalls die Ernte dieser Blüten
in dem Entwicklungsstadium erfolgt, wo 30 - 70 % aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens
geöffnet sind. Auch in diesem Fall können sich gegebenenfalls weitere Selektions-
und Vermehrungsschritte anschließen, aus denen weitere Verbesserungen (wie oben
angegeben) resultieren.
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Besonders günstig ist es, wenn bei der Selektion nach dem Chamazulen-
und (-)-O<-Bisabololgehalt solche Pflanzen (bekannte oder verfahrensgemäß hergestellte)
aus selektiert werden, deren Chamazulengehalt mindestens 200 mg%, vorzugsweise 250
mg% und deren (-)-oL-Bisabololgehalt mindestens 300 mg%, vorzugsweise 400 mg% beträgt
(Gehalt an übrigen Bisaboloiden stets unter 50 mg%).
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Die Tetraploidisierung kann in an sich bekannter Weise durch Behandlung
von Pflanzenteilen (Samen, Wurzeln, Sproßspitzen, Keimen, Achselknospen) oder Gewebe
der diploiden Ausgangs-Kamillenpflanzen mit Chemikalien, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen
oder UV-Strahlen erfolgen.
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Sie kann weiterhin durch Antherenkultur oder durch Anwendung von hohen
oder auch niedrigen Temperaturen auf die Kamillenpflanzen beziehungsweise Pflanzenteile
oder Gewebe der Kamillenpflanzen erfolgen. Es wird hierzu beispielsweise auf das
Buch von Werner Gottschalk "Die Bedeutung der Polyploidie für die Evolution der
Pflanzen", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1976, insbesondere Seiten 13 bis 22
verwiesen.
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Die Tetraploidisierung durch Chemikalien.
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Als Chemikalien für die Tetraploidisierung kommen zum Beispiel in
Frage: Colchicin, Acenaphthen, Alkaloide wie Atropin, Veratrin, Nicotin, Sanguinarin,
Derivate des Benzols, Diphenyls und Phenanthrens, Naphthalin und Naphthalinderivate,
Diphenylamin, Tribromanilin, Paradichlorbenzol, Methylnaphtochinon, Methylnaphthohydrochinon,
Salicylsäure und verwandte Substanzen, Hexachlorhexan, Methamphetamin (Hydrochlorid),
Alkyl-Alkali-Carbamate wie Isopropyl-Natrium-Carbamat, Phenylurethan, Salze der
Kakodylsäure (zum Beispiel Natriumsalz), Glykoside von Convallaria wie Convallarin,
Convallatoxin und Convallamarin, Heteroauxin, Germisan (Phenylmercuribrenzkatechin),
organische Quecksilberverbindungen wie Ethyl-Quecksilber-Phosphat, Ethyl-Quecksilber-Chlorid,
Phenyl-Quecksilber-Hydroxid, Phenyl-Quecksilber-Dinaphthylmethandisulfonat, Chloroform,
Lachgas (N2O) sowie Gemische dieser Stoffe. Weiterhin kommen auch Ölkuchen, Kompost
und Kuhdung in Betracht.
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Die Behandlung mit den hier erwähnten Stoffen erfolgt beispielsweise
bei Temperaturen zwischen 0 und 350 C, vorzugsweise zwischen 12 und 300 C, insbesondere
15 und 250 C.
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Die Applizierung erfolgt beispielsweise durch Behandeln von Samen,
Sproßspitzen, Wurzeln (insbesondere Wurzelspitzen oder Wurzeln von Keimlingen),
Fruchtknoten, von Schnittflächen an Blättern oder Stengeln, von Zellsuspensionen
aus Meristem-Gewebe, von Kalluskulturen oder auch durch Injektion in die basale
Stengelregion oder in den Bereich der Achselknospen. Die Chemikalien werden im allgemeinen
in Form von Lösungen in Wasser, schwach alkoholischen (Alkoholgehalt in der Regel
unter 5 %) oder schwach sauren Lösungen angewendet.
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Der pH-Wert der schwach sauren Lösungen liegt beispielsweise bei 5,5
- 6,5, wobei das Ansäuern beispielsweise mittels niederen organischen aliphatischen
Säuren wie Essigsäure erfolgt. Falls man alkoholische Lösungen verwendet, können
diese ebenfalls schwach sauer sein. Die Konzentrationen der Chemikalien in diesen
Lösungen kann beispielsweise 0,01 bis 0,5 %, vorzugsweise 0,02 bis 0,2 %, insbesondere
0,05 bis 0,1 % betragen. Gasförmige Stoffe kommen als solche, gegebenenfalls unter
Druck (zum Beispiel 1 bis 10 bar) zur Anwendung. Die Behandlungsdauer beträgt beispielsweise
1 bis 36, vorzugsweise 2 bis 12, insbesondere 4 bis 6 Stunden.
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Die wirksamsten Konzentrationen sowie die Einwirkungsdauer sollte
zweckmäßig jeweils in Vorversuchen getestet werden.
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Besonders günstig ist zum Beispiel die Behandlung mit Colchicin bei
Temperaturen zwischen 0 und 35° C, vorzugsweise 12 bis 300 C, insbesondere 15 bis
25° C. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß Samen der
diploiden
Ausgangskamille in einer 0,01 bis 0,2 Eigen, insbesondere 0,02 bis 0,1 %igen, vorzugsweise
0,05 %igen Colchicinlösung zum Quellen gebracht werden oder daß ausgekeimte, 5 bis
7 Tage alte gut entwickelte Keimlinge der diploiden Ausgangskamille (mit den Keimblättern
nach unten) in eine 0,01 bis 0,2 %ige, insbesondere 0,02 bis 0,1 %ige, vorzugsweise
0,05 %ige Colchicinlösung getaucht werden. Bei letzterem Verfahren soll die umgebende
Atmosphäre nahezu 100 % relative Luftfeuchtigkeit aufweisen. Die Dauer der Colchicin-Behandlung
beträgt beispielsweise 3 bis 36 Stunden, insbesondere 4 bis 10 Stunden. Bei der
Verwendung von Keimlingen ist im allgemeinen eine Einwirkungsdauer bis zu 10 Stunden
ausreichend. Bei der Verwendung von Samen kann sich die Einwirkungsdauer gegebenenfalls
bis zu 36 Stunden erstrecken.
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Nach der Behandlung mit den Chemikalien werden die gequellten Samen,
Keimlinge, beziehungsweise sonstige Pflanzenteile, mit Wasser mehrmals gespült.
Die gequellten Samen werden beispielsweise ausgesät. Die Pflanzen mit behandelten
Wurzeln oder sonstige Pflanzenteile oder die behandelten Keimlinge werden beispielsweise
in Pflanzkisten pikiert. Aus den so behandelten Samen beziehungsweise Keimlingen
werden die Pflanzen aufgezogen (zum Beispiel im Gewächshaus: Temperatur zwischen
18 bis 250 C am Tag und 10 bis 160 C nachts) und die Pflanzen ausgewählt, deren
Pollen etwa 1 1/2 mal größer sind als die Pollen des Ausgangsmaterials beziehungsweise
eine Chromosomenzahl der somatischen Zellen von 36 aufweisen.
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Falls man sonstige Pflanzenteile (ober- oder unterirdische Teile)
der Chemikalienbehandlung unterwirft, werden ausschließlich die aus den behandelten
Teilen hervorgegangenen Triebe, Wurzeln oder Blüten/Samen einer späteren Untersuchung
auf erfolgte Tetraploidisierung
unterzogen. Wenn beispielsweise
eine Sproßbehandlung oder eine Achselbehandlung vorgenommen wurde, wird anschließend
nur der aus dieser Achsel beziehungsweise aus diesem Sproß entstehende neue Trieb
und die auf ihm gebildeten Blüten beziehungsweise Samen auf Chromosomenzahl untersucht.
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Die Pollengrößenmessungen und die Chromosomenzählung können beispielsweise
so durchgeführt werden wie in Beispiel 3 angegeben ist.
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Die Tetraploidisierung durch Strahlen.
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Die Einwirkung erfolgt beispielsweise auf Samen oder Wurzelspitzen
bei Temperaturen zwischen 0 und 350 C, vorzugsweise 10 und 30° C, insbesondere 15
und 250 C.
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Bestrahlungssumme: 5 bis 50 Krad. Vorzugsweise kommen Gamma- oder
Röntgenstrahlen in Frage.
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Als UV-Strahlen kommen beispielsweise solche mit einer Wellenlänge
von 400 bis 30 nm, vorzugsweise von 350 nm in Frage.
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Die so bestrahlten Pflanzen beziehungsweise Pflanzenteile werden dann
ebenso weiterbehandelt wie nach der Behandlung mit Chemikalien.
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Anwendung hoher und niedriger Temperaturen.
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Als hohe Temperaturen kommen beispielsweise Temperaturen zwischen
33 und 500 C, vorzugsweise 42 bis 450 C in Frage. Diesen Temperaturen werden beispielsweise
ausgesetzt: gequollene Samen, Keimlinge, Triebspitzen und meristematisches Gewebe.
Dauer der Behandlung: zum Beispiel 1 bis 48, vorzugsweise 12 bis 24 Stunden.
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Als niedrige Temperaturen kommen beispielsweise in Frage: 0 bis 50
C, vorzugsweise 0,5 bis 40 C, insbesondere 20 C. Diesen Temperaturen werden beispiels-
weise
ausgesetzt: gequollene Samen, Keimlinge, Triebe und meristematisches Gewebe. Dauer
der Behandlung: zum Beispiel 1 bis 100, vorzugsweise 20 bis 40 Tage.
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Die so behandelten Pflanzen beziehungsweise Pflanzenteile werden ebenso
weiterbehandelt wie nach der Behandlung mit Chemikalien.
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Antherenkultur (Erzeugung von Pflanzen mit einfachem Chromosomensatz
aus den Staubbeuteln mit anschließender Tetraploidisierung durch Chemikalien oder
Strahlen).
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Von blühenden Pflanzen werden geschlossene Röhrenblüten geerntet,
deren Antheren (Staubbeutel) sich im Stadium vor der ersten Pollenmitose befinden.
Die Antheren werden mittels Mikromanipulator aus den Blütenknospen entnommen und
in Petrischalen übertragen, die beispielsweise mit dem Nährmedium nach Nitsch und
Nitsch (Tabelle 1) gefüllt sind. Anschließend werden die Petrischalen in einem Kulturraum
im 16-Stunden-Tag bei 280 C Tag- und 200 C Nachttemperatur aufbewahrt. Nach circa
vier Wochen beginnen die Antheren aufzubrechen und Pflänzchen herauszuwachsen. Diese
sind bei diploidem Elternteil haploid, bei tetraploidem Elternteil dihaploid; sie
werden nach Ausbildung von Wurzeln beispielsweise in Gartenerde getopft und im Gewächshaus
zum Blühen gebracht. Diese (di)haploiden Pflanzen sind steril, können jedoch durch
Sproßspitzen-, Wurzel- oder Stengelbehandlung mit Chemikalien, wie zum Beispiel
Colchicin polyploidisiert werden, wobei homozygote Pflanzen entstehen, die sich
dann über Samen weitervermehren lassen. Weiteres VQrgehen siehe bei der Behandlung
mit Chemikalien (zum Beispiel Colchicinbehandlung).
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Tabelle 1 Kulturmedium nach Nitsch und Nitsch (Science, 1969) mg/l
KN03 950 NH4NO3 720 MgSO4 x 7 H2O 185 CaCl2 166 KH2PO4 68 MnS04 x 4 H2O 25 H3BO3
10 ZnSO4 x 7 H20 10 Na2MoO4 x 2 H20 0,25 CuSO4 x 5 H2O 0,025 5 ml einer Lösung aus
7,45 g Ethylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz und 5,57 g FeS04 x 7 H2O auf 1000
ml myo-Inosit 100 Glycin 2 Nicotinsäure 5 Pyr idoxin-HCl 0,5 Thiamin-HCl 0,5 Folsäure
0,5 Biotin 0,05 Saccharose 20 g Fertignährboden (DIFCO-Bacto-Agar) 8 g Indoles sigsäure
0,1 pH des Mediums eingestellt auf 5,5
Von den durch Pollengrößenmessung
und/oder Chromosomenzählung ausselektierten tetraploiden Kamillenpflanzen, die nach
den vorstehend beschriebenen Möglichkeiten erhalten werden können, werden dann die
Pflanzen ausselektiert, die einen Mindestgehalt an Chamazulen von 100 mg% und einen
Mindestgehalt an Bisabolol von 200 mg% aufweisen, während der Gehalt an übrigen
Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxide) unter 50 mg% (bezogen auf die getrockneten
Blüten, siehe Beispiel 1) liegen soll.
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Die so aus selektierten Pflanzen werden nach Entfernung aller bereits
aufgeblühten Blütenkörbchen im Gewächshaus bei 18 - 240 C Tag- und 12 - 140 C Nacht-Temperatur
und einer Tageslänge von mindestens 14 Stunden abblühen lassen, wobei über einen
Zeitraum von 4 Wochen alle Blütenköpfchen die verblüht oder kurz vor dem Zerfallen
sind, zur Saatgutgewinnung geerntet werden. Nach Trocknen bei einer Lufttemperatur
zwischen 20 - 350 C erhält man beispielsweise das Vermehrungsgut einer solchen Kamille.
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Als weitere Kriterien für diese Selektion können zusätzlich noch die
folgenden zur Anwendung kommen: a) ungefähr gleichzeitiges Blühen, b) eine gleichmäßige,
grundständige Verzweigung und eine schmale Blühzone von circa 10, insbesondere 5
cm, c) große Blütenköpfchen mit einem Außendurchmesser von circa 30 mm (20 bis 40
mm), insbesondere 25 - 35 mm, Die Anwendung der zusätzlichen Kriterien a), b) und/
oder
c) führt beispielsweise zu hohen Blüten- und Drogenerträgen und besserer Eignung
für die maschinelle Ernte.
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Falls man von bereits bekannten tetraploiden Kamillen ausgeht, erfolgt
die zuvor beschriebene Selektion sowie gegebenenfalls die weiteren Selektions- und
Vermehrungsschritte in gleicher Weise.
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Um eine Kamille zu erhalten, die außer einem Gehalt von mindestens
100 mg% Chamazulen und mindestens 200 mg% (-)-oQ-Bisabolol (bezogen auf die getrockneten
Blütenköpfchen) auch noch einen hohen Blütenertrag aufweist und für die maschinelle
Ernte besser geeignet ist, empfiehlt sich folgendes Vorgehen: Die aus selektierten
Pflanzen (wie oben beschrieben) werden vegetativ durch Stecklinge vermehrt und über
3 bis 5 Generationen ausgelesen, wobei die Auswahl stets nach dem oben angegebenen
Kriterium sowie gegebenenfalls den zusätzlichen Kriterien a) - c) erfolgt. Die gemäß
diesen Kriterien ausgesuchten Pflanzen werden verklont, aus den verklonten Pflanzen
wird Saatgut gewonnen, die hieraus erhaltenen Pflanzen wiederum nach dem oben angegebenen
Mindestgehalt an Chamazulen und Bisabolol sowie gegebenenfalls den zusätzlichen
Kriterien a) - c) ausselektiert und aus letzteren wieder Saatgut gewonnen.
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Die Sequenz Aussaat - Selektion gemäß dem oben angegebenen Mindestgehalt
an Chamazulen von 100 mg% und (-)-OC-Bisabolol von mindestens 200 mg% (andere Bisaboloide
unter 50 mg%) sowie gegebenenfalls den zusätzlichen Kriterien a) - c) - Saatgutgewinnung
kann 3 - 5 mal wiederholt werden.
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Daran schließt sich nochmals eine Sequenz Aussaat -wie zuvor angegebene
Selektion (gegebenenfalls Verklonung) - Saatgutgewinnung an.
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Das zuletzt erhaltene Saatgut ist dann das Vermehrungsgut der erfindungsgemäßen
Kamille.
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Die Stecklingsvermehrung erfolgt dabei auf folgende Weise: Zur Stecklingsvermehrung
müssen die Ausgangspflanzen (Klonmutterpflanzen) unter Kurztagbedingungen blütenknospenfreie
Kurztriebe ausbilden. Dies erfolgt im Winterhalbjahr im Gewächshaus ohne Zusatzbeleuchtung
oder in Klimakammern bei einer Tageslänge von 6 bis 10, vorzugsweise 8 Stunden und
Temperaturen von 10 bis 15Q C, vorzugsweise 120 C. Zur Verklonung beziehungsweise
Vermehrung eignen sich Blatt-, Trieb- und insbesondere Kurztrieb-(Seitentrieb-)Stecklinge.
Ihre Bewurzelung erfolgt bei 12 bis 180 C, vorzugsweise 150 C und Tageslängen von
12 bis 16, vorzugsweise 14 Stunden in gespannter Atmosphäre (ca. 100 % relative
Luftfeuchte). Als Substrat kann beispielsweise ein Torf-Sand-Gemisch im Verhältnis
1:1 verwendet werden; es eignen sich aber auch reiner Quarzsand, Steinwolle-Stecklingswürfel,
Torf-Stecklingswürfel und ähnliches.
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Für die Aussaat kommen hierbei beispielsweise folgende Böden in Betracht:
Gartenerde; humose, mittelschwere Lehmböden; lehmige oder humose Sandböden.
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Es kann im Gewächshaus oder auch im Freiland ausgesät werden. Die
Temperaturen für Keimung und Wachstum der Pflanzen liegen beispielsweise zwischen
12 bis 240 C, inbesondere 18 bis 200 C. Falls im Freiland ausgesät wird, wird vorzugsweise
im Herbst (September/Oktober) oder im Frühjahr (März/April) gesät. Diese Termine
gelten für sämtliche in Frage kommenden Anbaugebiete (zum Beispiel nördliche Hemisphäre,
gemäßigte bis subtropische Klimagebiete).
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Besonders günstig ist es, wenn folgende Verfahrensbedingungen zur
Anwendung kommen: Von den tetraploiden Kamillenpflanzen, die einen Mindestgehalt
an Chamazulen von 100 mg% und an (-)-d-Bisabolol von 200 mg% aufweisen, während
der Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxiden) unter 50 mg% liegt
(alle Werte bezogen auf die getrockneten Blütenköpfchen), werden nur diejenigen
ausselektiert, welche - ungefähr gleichzeitig blühen, - eine gleichmäßige grundständige
Verzweigung und eine schmale Blühzone von ca. 10 cm sowie - große Blütenköpfchen
mit einem Außendurchmesser von ca. 30 mm aufweisen.
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Die aus selektierten Pflanzen werden vegetativ über Stecklinge vermehrt
und über 3 - 5 Generationen ausgelesen, wobei die Auswahl stets nach den oben genannten
Kriterien erfolgt. Die ausgesuchten Pflanzen werden vegetativ vermehrt (verklont),
gemeinsam abblühen gelassen, und es wird hiervon das Saatgut gewonnen. Die aus dem
Saatgut erhaltenen Pflanzen werden wiederum nach den oben angegebenen Kriterien
selektiert und die Sequenz Aussaat-Selektion-Saatgutgewinnung-Aussaat wird 3 - 5mal
wiederholt.
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Die Kamille, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mittel verwendet
wird, gehört zur Kulturpflanzenart der echten Kamille mit der botanischen Bezeichnung
Matricaria Chamomilla L. (synonym Chamomilla recutita (L.), Rauschert). Das bei
einer Temperatur von höchstens 70" C getrocknete Material aus den Blüten dieser
Kamille, die in dem Vegetationsstadium geerntet wird, wo 30 - 100 % der Röhrenblüten
eines Blütenköpfchens geöffnet sind, enthält mindestens 30 mg% Chamazulen, mindestens
100 mg% (-)-« -Bisabolol und weniger als 50 mg% an übrigen Bisaboloiden.
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Falls die Ernte der Kamillenblüten zu einem Zeitpunkt erfolgt, in
dem das Blüten-Entwicklungsstadium weiter fortgeschritten ist, das heißt, wo beispielsweise
100 % oder bis zu 100 % aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet sind (zum
Beispiel Stadium der Vollblüte) und/oder falls die Trocknung der geernteten Blüten
bei höherer Temperatur als 400 C erfolgt, kann der Gehalt an den Wirkstoffen (-)-d-Bisabolol
und Chamazulen niedriger sein, da durch höhere Trockentemperaturen und/oder bei
späterer Ernte ein stärkerer Abbau des Azulens und Bisabolols eintreten kann.
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Beispielsweise enthalten die im Trockenschrank bei 40° C getrockneten
Blüten (geerntet wie oben angegeben) der verfahrensgemäßen Kamille zwischen 100
bis 200 mg% Chamazulen, zwischen 200 bis 450 mg% (-)-d-Bisabolol und nur wenig,
das heißt zwischen 5 bis 50 mg% andere Bisaboloide bezogen auf die Trockensubstanz
(das heißt bezogen auf das absolute Trockengewicht der Blüten).
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Dieses absolute Trockengewicht wird durch Trocknung einer separaten
Probe von Kamillenblüten im Trockenschrank bei 1050 C bis zur Gewichtskonstanz (72
bis 96 Stunden) bestimmt. Der Wirkstoffgehalt der bei beispielsweise 35 bis 500
C getrockneten Blüten wird dann auf die bei 1050 C ermittelte Trockenmasse der Blüten
berechnet.
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Ein besonders wirkungsvolles Mittel erhält man (mit maximalem Gehalt
an den Wirkstoffen Chamazulen und (-)-çX-Bisabolol), wenn die Ernte der Kamillenblütenköpfchen
in dem Vegetationsstadium erfolgt, wo beispielsweise 30 bis 70 %, vorzugsweise 40
bis 60 %, das heißt im allgemeinen 50 % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens geöffnet
sind und die Trocknung bei einer Lufttemperatur von höchstens 500 C, beispielsweise
35 bis 500 C, insbesondere 40° C erfolgt. Beispielsweise enthalten im Trockenschrank
bei 400 C getrocknete Blüten (geerntet, wo 40 -60 % der Röhrenblüten eines Blütenköpfchens
geöffnet sind) mindestens 100 mg%, zum Beispiel zwischen 100 bis 150 mg% Chamazulen,
mindestens 200 mg%, zum Beispiel zwischen 200 und 300 mg% (-)-aC-Bisabolol und nur
wenig, das heißt zwischen 5 bis 50 mg% andere Bisaboloide bezogen auf die Trockensubstanz
(das heißt bezogen auf das absolute Trockengewicht der Blüten). Dieses absolute
Trockengewicht wird durch Trocknung einer separaten Probe von Kamillenblüten im
Trockenschrank bei 1050 C bis zur Gewichtskonstanz (72 bis 96 Stunden) bestimmt.
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Der Wirkstoffgehalt der bei beispielsweise 35 bis 500 C getrockneten
Blüten wird dann auf die bei 1050 C ermittelte Trockenmasse der Blüten berechnet.
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Die Trocknung der Kamillenblüten kann entweder durch künstliche Luftzufuhr
oder auch durch Trocknung im Schatten, gegebenenfalls auch in der Sonne erfolgen,
wobei jedoch darauf geachtet werden soll, daß die Wärmezufuhr nicht über das zur
vollständigen Trocknung erforderliche Maß hinausgeht. Es ist also vorteilhaft, daß
man sich durch Kontrollwägungen von der erreichten Gewichtskonstanz überzeugt. Die
Trocknung kann spontan oder künstlich (zum Beispiel mit künstlicher Warmluft) erfolgen.
Die Wirkstoffausbeute ist am größten bei spontaner Trocknung unter Ausschluß des
Sonnenlichts, vorzugsweise bei 40 - 60° C, insbesondere 40 - 500 C.
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Der Trocknungsprozeß soll möglichst bald beziehungsweise umgehend
nach der Ernte stattfinden. Die Trocknung soll in dünnen Schichten, beispielsweise
von 5 bis 20 cm, vorzugsweise 10 cm Dicke durchgeführt werden. Die Trocknung ist
zum Beispiel auch in gut durchlüfteten Hallen bei einer Lufttemperatur zwischen
20 - 300 C möglich. Im allgemeinen soll die Lufttemperatur für die Trocknung nicht
höher als 609 C sein. Günstig ist zum Beispiel eine Lufttemperatur zwischen 35 und
500 C.
-
Der Wirkstoffgehalt der erfindungsgemäßen Mittel, insbesondere an
den Hauptwirkstoffen Chamazulen und (-)-d-Bisabolol, ist abhängig von dem Vegetationsstadium,
in dem sich die Kamillenblüten zum Ernte zeitpunkt befinden und von der Trocknung
der geernteten Blüten. Je höher die Trocknungstemperatur ist, desto stärker ist
der Abbau der Wirkstoffe, das heißt desto niedriger der Gehalt der getrockneten
Blüten an den Wirkstoffen.
-
Aus dem gleichen Grund hat direktes Sonnenlicht bei der Trocknung
einen nachteiligen Einfluß und soll nach Möglichkeit vermieden werden.
-
Das Vegetationsstadium einer Blüte wird dadurch charakterisiert, wieviel
% der Röhrenblüten eines
Blütenköpfchens zu einem bestimmten Zeitpunkt
(hier dem Zeitpunkt der Ernte) geöffnet sind. Es können also Blüten geerntet werden,
wo beispielsweise zwischen 30 - 50 %, 30 - 70 %, 40 - 60 %, 60 - 100 % oder 90 -
100 % der Röhrenblüten eines Köpfchens geöffnet sind; Der Wirkstoffgehalt ist abhängig
davon, in welchem Stadium sich die Blüten jeweils befinden und er ist bei der Kamille,
die erfindungsgemäß eingesetzt wird, am größten, wenn 40 - 60 % aller Röhrenblüten
geöffnet sind und nimmt ab in dem Maße, wie der Prozentgehalt an geöffneten Röhrenblüten
eines Blütenköpfchens zunimmt. Es ist daher gerade ein großer Vorteil dieser Kamille,
daß bei ihr das Abblühen der einzelnen Pflanzen gleichmäßig erfolgt, das heißt,
daß von einer Aussaat die überwiegende Zahl der Pflanzen jeweils das gleiche Blühstadium
aufweisen, das heißt, daß beispielsweise bei den weitaus meisten Pflanzen 40 - 60
% aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens zum gleichen Zeitpunkt geöffnet sind.
Dadurch ist eine vollständige Erfassung der Blütenköpfchen zum optimalen Zeitpunkt
möglich.
-
Die Kamille, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mittel verwendet
wird, ist deshalb besonders geeignet für die mechanische Ernte.
-
Der Zusammenhang des Gehalts an Chamazulen und d-Bisabolol einerseits
mit dem Blühstadium zur Zeit der Ernte und andererseits mit der Trocknungstemperatur
zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Mittel ist beispielsweise in folgender Tabelle
dargestellt (der Gehalt an übrigen Bisaboloiden ist in allen Fällen weniger als
50 %).
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Trocknungs- Vegetationsstadium der Blüten zum Ernte zeitpunkt temperatur
30 - 70 % aller Röhren- 70 - 100 % aller Rtren-(Luft- blüten eines Blüten- blüten
eines Blütentertperatur) köpfchens geöffnet köpfchens geöffnet Wirkstoffgehalt im
ge- Wirkstoffgehalt im getrockneten Material: trockneten Material: nicht höher Chamazulen:
Chamazulen: als 500 C mindestens 100 mg% mindestens 40 mg% (-)-α -Bisabolol:
(-)- i-Bisabolol: mindestens 200 mg% mindestens 120 mg% Wirkstoffgehalt im Wirkstoffgehalt
im alkoholischen Auszug: alkoholischen Auszug: nicht höher Chamazulen: Chamazulen:
als 500 C mindestens 5,0 mg% mindestens 2,0 mg% (-)- ot-Bisabolol: (-)- «-Bisabolol:
mindestens 10,0 mg% mindestens 6,0 mg% Wirkstoffgehalt im ge- Wirkstoffgehalt im
getrockneten Material: trockneten Material: zwischen Chamazulen: Chamazulen: 50-70°
C mindestens 50 mg% mindestens 30 mg% (-) - «-Bisabolol: (-)- «-Bisabolol: mindestens
150 mg% mindestens 100 mg% Wirkstoffgehalt im Wirkstoffgehalt im alkoholischen Auszug:
alkoholischen Auszug: zwischen Chamazulen: Chamazulen: 50-70° C mindestens 2,5 mg%
mindestens 1,5 mg% (-) - oC-Bisabolol: (-) -«-Bisabolol: mindestens 7,5 mg% mindestens
10 mg%
Hieraus folgt, daß aus der Kamille, die zur Herstellung
der erfindungsgemäßen Mittel eingesetzt wird, beispielsweise bei einer Ernte, die
im Vegetationsstadium stattfindet, wo zwischen 30 - 100 % der Röhrenblüten der Blütenköpfchen
geöffnet sind und die Trocknung bei Lufttemperaturen bis zu 70° C erfolgen kann,
ein trockenes Material erhalten wird, dessen Chamazulengehalt in jedem Fall mindestens
30 mg% und dessen (-)-G(-Bisabololgehalt mindestens 100 mg% beträgt, während der
Gehalt an übrigen Bisaboloiden stets geringer als 50 mg ist.
-
In den alkoholischen Auszügen ist der Gehalt an übrigen Bisaboloiden
stets niedriger als 10 mg%.
-
Der Gehalt des ätherischen Öls, welches gemäß den Bedingungen der
vorstehend angegebenen Tabelle aus einem getrockneten Material hergestellt wird,
an Chamazulen und Bisabolol ist stets mindestens 3,5 % Chamazulen, mindestens 10
% (-)-«-Bisabolol und weniger als 10 % an übrigen Bisaboloiden.
-
Die Kamille, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mittel verwendet
wird, hat einen mittelspäten Erntetermin, eine einheitliche Wuchshöhe mit schmaler
Blühzone und große Blütenköpfchen und ist daher besonders für mechanische Ernte
geeignet. Hinzu kommt, daß zu gleicher Zeit ausgesäte Pflanzen der neuen tetraploiden
Kamille im allgemeinen praktisch zur gleichen Zeit gemeinsam abblühen, so daß auch
hierdurch die Ernte sehr vereinfacht und erleichtert wird.
-
Diese neue Kamille erbringt außerdem einen hohen Ertrag.
-
Die erfindungsgemäß aus dieser Kamille hergestellten bisabolol- und
chamazulenreichen Mittel mit antiphlogistischer Wirkung werden zum Beispiel in der
Medizin, der Kosmetik sowie in Form von Tees verwendet.
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So können aus dem erfindungsgemäß erhaltenen getrockneten Material
zum Beispiel durch Extraktion mit Alkoholen beziehungsweise wässrigen Alkoholmischungen
oder durch Extraktion mit überkritischen Gasen Kamillenauszüge beziehungsweise Kamillenextrakte
erhalten werden.
-
Weiterhin können aus dem getrockneten Material Kamillenöl, (-)-OC-Bisabolol,
Chamazulen und andere Kamilleninhaltsstoffe erhalten werden.
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So enthalten alkoholische Auszüge des trockenen Materials gemäß Anspruch
1 mindestens 1,5 mg%, vorzugsweise 5,0 mg% Chamazulen und mindestens 5,0 mg%, vorzugsweise
mindestens 10,0 mg% (-)-«-Bisabolol im alkoholischen Drogenauszug und weniger als
8 mg% an übrigen Bisaboloiden.
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Die Herstellung solcher Auszüge erfolgt in der hierfür üblichen Weise.
-
Für die Extraktion können beispielsweise Mischt in richtungen, zum
Beispiel sogenannte Muldenmischmaschinen, Perkolatoren und andere geeignete Extraktionsapparaturen
verwendet werden. Die Temperatur während der Extraktion beträgt beispielsweise 10
bis 500 C. Eine Kühlung ist
nicht erforderlich.
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Als Lösungsmittel kommen insbesondere gerade oder verzweigte aliphatische,
ein- oder mehrwertige Alkohole mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Solketal (2-Dimethyl-4-oxymethyl-1,3-dioxolan)
in Frage, wie zum Beispiel Methanol, Ethanol, Propanol-(2), Butanol, Glycerin und
ähnliche, sowie Gemische dieser Lösungsmittel mit Wasser.
-
Es können auch Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden. Die
Mindestmenge an Lösungsmitteln beträgt 2 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil des getrockneten
Materials. Im allgemeinen verwendet man 2 bis 20 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil
des getrockneten Materials, insbesondere 3 bis 10 Teile Lösungsmittel auf 1 Teil
des getrockneten Materials.
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Ein aus dem trockenen Material gemäß Anspruch 1 erhaltenes ätherisches
Öl enthält mindestens 3,5 %, vorzugsweise mindestens 5 % Chamazulen und mindestens
10 %, vorzugsweise mindestens 15 % (-)-d-Bisabolol und weniger als 10 % an übrigen
Bisaboloiden.
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Die Herstellung des ätherischen Öls erfolgt im allgemeinen dadurch,
daß man das getrocknete Material mit Wasser, beispielsweise in Gegenwart von Ascorbinsäure
(zum Beispiel als Salz, insbesondere als Natriumsalz) bei einem pH-Wert zwischen
4 und 6, vorzugsweise 5 bis 5,5 zum Sieden erhitzt. Der pH-Wert wird beispielsweise
mittels einer Säure, wie Salzsäure, eingestellt.
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Auf 1 Gewichtsteil des getrockneten Materials werden beispielsweise
10 bis 50 Gewichtsteile Wasser und gegebenenfalls 0,1 bis 1 Gewichtsteil Ascorbinsäure
verwendet.
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Es wird im allgemeinen.2 bis 8 Stunden erhitzt.
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Das erhaltene wässrige Destillat wird mehrmals mit einem niederen
aliphatischen, flüssigen Kohlenwasserstoff (zum Beispiel Petrolether (zum Beispiel
Kp 35 - 60° C), Pental, Xylol, Decalin) mehrmals ausgeschüttelt, die organische
Phase getrocknet (zum Beispiel mittels Natriumsulfat) und das organische Lösungsmittel
in schonender Weise entfernt (beispielsweise durch Abdestillieren im Rotationsverdampfer
oder durch Destillation bei 40 - 700 C, vorzugsweise bei 50 - 600 C).
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Bei höhersiedenden Lösungsmitteln wird dieses Abdestillieren unter
Vakuum durchgeführt.
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Die Bestimmung des Chamazulens erfolgt spektralphotometrisch ähnlich
der bei Kamillenextrakten üblichen Weise.
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Die Bestimmung des (-)-d-Bisabolols sowie der übrigen Inhaltsstoffe
des Kamillenöls erfolgt nach der hierfür üblichen gaschromatographischen Methode.
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Eine genaue Schilderung der analytischen Bestimmungsmethoden enthält
die Anlage A.
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Der Wirkstoff Chamazulen liegt in den Kamillenblüten nicht als solcher,
sondern in Form des Sesquiterpenlactons Matricin vor. Das Matricin besitzt eine
pharmakologische Wirkung, die der des Chamazulens entspricht. Aus dieser Vorstufe
Matricin entsteht beispielsweise beim Erhitzen (zum Beispiel Wasserdampfdestillation,
Teeaufguß) sofort das Chamazulen. Es ist daher üblich, bei der Kamille nicht den
Gehalt an Matricin, sondern den analytisch erfaßbaren Gehalt des sich hieraus bildenden
Chamazulens anzugeben.
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Beispiel 1 Gewinnung eines Mittels mit antiphlogistischer Wirkung
aus einer tetraploiden Ausgangskamille: Eine Kamille, die man so erhält wie nachstehend
beschrieben ist, wird in üblicher Weise feldmäßig ausgesät. Sobald die Pflanzen
sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in dem Vegetationsstadium sind, wo
etwa 50 % der Röhrenblüten geöffnet sind, werden diese Blütenköpfchen mit einer
Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände der Pflückmaschine so eingestellt
sind, daß nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten zu 50 % offen sind, abgestreift
werden. Das Erntegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert
und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet. Anschließend werden
die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet. Der Gewichtsverlust beträgt etwa 80 %. Die Trocknung erfolgt im Schatten
an einer gut belüfteten Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10 cm.
-
Nach etwa 2 - 3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von
Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend
in Ballen gepreßt.
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Analyse Xtherisches Öl: 960 mg% Chamazulen: 162 mg% (-)-i -Bisabolol:
330 mg%.
-
Erfolgt die Trocknung beispielsweise in einer stationären Bandtrockenanlage
mittels künstlich erwärmter Luft bei einer Temperatur zwischen 50 und 700 C, so
ist die Trocknung nach etwa 4 - 5 Stunden beendet. Zur Entfernung von Stengelteilen
und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend in Ballen
gepresst.
-
Die Analysenwerte eines solchen Mittels sind zum Beispiel: thermisches
Öl: 870 mg% Chamazulen: 94 mg% (-)-oC-Bisabolol: 197 mg%.
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Die verwendete tetraploide Ausgangskamille wird wie folgt erhalten:
Durch Einzelpflanzenvariabilitätstests in der tetraploiden Kamillensorte, die von
I. Sárkány (Herba Hungar. 4(1), 125 - 169 (1965) beschrieben wurde, (es wurden ca.
10000 Pflanzen getestet) wurde gefunden, daß auf etwa 1000 Individuen eine Pflanze
kommt, die im ätherischen Öl einen hohen Chamazulengehalt von 20 Gewichtsprozent
sowie einen hohen (-)-oC-Bisabololgehalt von 50 Gewichtsprozent aufweist, wobei
gleichzeitig der Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere (-)-d-Bisabplonoxid
sehr gering (weniger als 5 Gewichtsprozent) ist.
-
Diese Individuen wurden aus selektiert und folgenden Schritten unterworfen:
Schritt 1: Von den (wie oben beschriebenen) ausselektierten tetraploiden Kamillenpflanzen
wurden diejenigen Individuen ausgelesen, die A) etwa gleichzeitig blühen,
B)
eine gleichmäßige, grundständige Verzweigung und eine schmale Blühzone von ca. 10
cm, vorzugsweise 5 cm, aufweisen, C) große Blütenköpfchen mit einem Außendurchmesser
von ca. 30 mm, vorzugsweise 25 - 35 mm aufweisen, D) einen Mindestgehalt für Chamazulen
von 150 mg% und Bisabolol von 300 mg% erreichen oder überschreiten und deren Gehalt
an übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxide) deutlich unter 50 mg% liegt.
(Sämtliche Werte beziehen sich auf Blütenköpfchen, die bei 400 C getrocknet wurden
und deren Ernte in dem Stadium erfolgte, wo 30 - 70 % aller Röhrenblüten eines Blütenköpfchens
geöffnet sind.
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Diese Pflanzen wurden verklont. Hierzu wurden die Pflanzen (Klonmutterpflanzen)
zunächst auf circa 15 cm Sproßlänge zurückgeschnitten, unter 8 bis 10 Stunden Tageslänge
und 12 bis 140 C zum Neuaustrieb (kurze Seitentriebe) gebracht. Die Kurztriebe wurden
geschnitten und in ein Torf-Sand-Gemisch gesteckt. Bei circa 100 % relativer Luftfeuchte,
150 C Lufttemperatur und einer Tageslänge von 14 Stunden dauerte die Bewurzelung
der Stecklinge 7 bis 14 Tage.
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Anstelle der angegebenen konventionellen Verklonung (Stecklingsvermehrung)
kann auch die in-vitro-Vermehrung teilungsfähiger Gewebspartien der Pflanze eingesetzt
werden (sogenannte Meristem-Vermehrung). Zur Etablierung einer Kamillen-Kultur eignen
sich verschiedene Teile der Pflanze, vorzugsweise die Sproßspitzen oder die Achselknospen.
-
Nach Abspülen der Pflanzen mit H 202 werden unter aseptischen Bedingungen
im "Laminar Flow" (Hochleistungs-Schwebstoff-
Filter mit turbulenzarmer
Verdrängungsströmung) Sproßspitzen der Blattachselknospen entnommen und in Reagenzgläser
übertragen, die mit einem Nährmedium, beispielsweise nach Murashige und Skoog (Physiol.Plant.
15, 473-497, 1962) gefüllt sind. Die Reagenzgläser werden in einen Klimaraum mit
12-18, vorzugsweise 16 Stunden Tageslänge (erreicht durch Fluoreszenz-Leuchtstoffröhren),
einer Lichtintensität von 500 - 10.000 lux, vorzugsweise 1.000 -3.000 lux und einer
Temperatur von 15 - 300 C, vorzugsweise 22 - 270 C gestellt.
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Sobald die Explantate ein gutes Wachstum zeigen, werden sie auf ein
obengenanntes Nährmedium, jedoch mit einer höheren Cytokininkonzentration (30 mg/l
N6-Isopentenyladenin) und wenig oder gar keinem Auxin (0 - 0,3 mg/l Indolessigsäure)
überführt. In der Folge strecken sich die Achsen und es werden Adventivorgane sowie
vermehrt Achselknospen gebildet. Diese können nach der vorerwähnten Weise entnommen
und angezogen werden.
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Die für die Pflanzenvermehrung in größerer Zahl bestimmten Explantate
(der 3. Passage = 3. Vermehrungsgeneration) werden nach Anwachsen und Ausbildung
der Blätter auf dem erstgenannten Nährmedium auf einen Nährboden übertragen, welcher
10 mg/l Indolessigsäure oder 3-Indolbuttersäure oder 0,1 - 0,3 mg/l i -Naphthylessigsäure
enthält. Dabei bewurzeln sich die Pflänzchen und können nach etwa 4 Wochen in mit
sterilisierter Gartenerde (12 Stunden bei 1200 C gedämpft) gefüllte Töpfe gepflanzt
und im Gewächshaus (unter Bedingungen wie für die konventionelle Stecklingsvermehrung
üblich) weiterkultiviert werden.
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Nährmedium nach Murashige & Skoog: mg/l mg/l NH4N03 400 Indolessigsäure
2,0 Ca (NO3) 2.4H20 144 Furfuryladenin 0,1 KN03 80 Thiamin 0,1 KH2PO4 12,5 Nicotinsäure
0,5 MgSO4.7H2O 72. Pyridoxin 0,5 KCl 65 Glycin 2,0 NaFe-EDTA 25 myo-Inosit 100 H3BO3
1,6 Casein-Hydrolys. 1000 MnS04.4H20 6,5 Saccarose 2 % ZnS04.7H20 2,7 gereinigtes
KJ 0,75 Agar-Pulver 1 % Schritt 2: Die nach Schritt 1 erhaltenen Pflanzen blühten
unter isolierten Bedingungen im Gewächshaus gemeinsam ab.
-
Die Pflanzen standen hierbei in 11-cm-Töpfen, gefüllt mit Gartenerde,
bei 18 bis 240 C Tag- und 12 bis 140 C Nacht-Temperatur. Die Tageslänge betrug mindestens
14 Stunden und wurde im Winterhalbjahr durch Zusatzbelichtung (200 Watt/m2) erreicht.
Die Wasserversorgung erfolgte nach Bedarf.
-
Von der Gesamtheit der selektierten Individuen wurden über einen Zeitraum
von 4 Wochen laufend diejenigen Köpfchen zur Saatgutgewinnung geerntet, die verblüht
und kurz vor dem Zerfallen waren. Trocknung erfolgte in einer gut durchlüfteten
Halle bei einer Lufttemperatur zwischen 20 - 300 C; anschließend wurde das Saatgut
mittels eines Schlitzsiebes (5 x 0,4 mm) abgesiebt und durch einen Steigsichter
nachgereinigt.
-
Schritt 3: Aus dem nach Schritt 2 erhaltenen Saatgut wurde eine Stichprobe
entnommen und hieraus circa 2000 Nachkommen gezogen (ökologische Bedingungen wie
bei Schritt 2) und nach den gleichen Kriterien A) bis D) von Schritt 1 selektiert.
Mit den so selektierten Individuen wurde dann gemäß Schritt 2 verfahren.
-
Schritt 4: Von dem Saatgut gemäß Schritt 3 wurde ein Teil an zwei
verschiedenen Standorten im Herbst ausgesät.
-
Standort I) 450 m NN, 48,50 N / 11,50 0, 750 mm Jahresniederschlagssumme,
feucht-gemäßigtes Klima, Januar -10 bis 0° C, Juli +10 bis +200 C, Standort II)
200 m NN, 420 N / 10 0, 400 mm Jahresniederschlagssumme, mediterranes Klima, Januar
0 bis +100 C, Juli +20 bis +300 C.
-
Die Aussaat erfolgte an beiden Standorten Ende September/ Anfang Oktober.
-
Die so erhaltenen Feldversuchsbestände wurden hinsichtlich homogenem
Wuchs, Blütengröße und Erntetermin überprüft und beurteilt (bonitiert), außerdem
wurden NN = nördlich Normalnull = Seehöhe ON = nördliche Breite (ngrad) 0O = östlinge
Länge (ngrad)
Stichproben der Blüten auf die Wirkstoffgehalte untersucht.
-
Aus dem Feldbestand wurden erneut diejenigen Individuen selektiert,
die den bei Schritt 1 genannten Parametern entsprechen. Von diesen wird Saatgut
entsprechend Schritt 2,'letzter Satz, gewonnen.
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Schritt 5: Mit dem Saatgut gemäß Schritt 4 wurden die Schritte 3 und
4 in der angegebenen Reihenfolge und Weise wiederholt.
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Schritt 6: Aus dem nach Schritt 5 gewonnenen Saatgut wurden circa
1500 Individuen gezogen (Ökologische Bedingungen wie bei Schritt 2) und nach dem
gleichen Prinzip, wie bei Schritt 1 angegeben ist, selektiert. Von den so ausselektierten
Pflanzen wurden 34 Individuen ausgewählt und gemäß Schritt 1 verklont. Je 10 Pflanzen
jedes Klons wurden in zufälliger Verteilung im Abstand 40 x 30 cm im Freiland (Standort
I, siehe Schritt 4) an isolierter Stelle aufgepflanzt. Der Boden war Lößlehm, pH
7,0; die Pflanzung erfolgte Anfang Juni, die erste Ernte der Samen Mitte Juli, danach
wurden die Pflanzen zurückgeschnitten, blühten nochmals und lieferten Mitte bis
Ende August eine zweite Saatguternte.
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Die Saatgutgewinnung dieses Materials erfolgte gemäß Schritt 2.
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Das nach Schritt 6 erhaltene Saatgut ist das Vermehrungsgut der verfahrensgemäßen
Kamille.
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Blüten von Pflanzen aus diesem Vermehrungsgut (Aussaat September/Oktober,
Ernte Anfang Juni des darauffolgenden Jahres), die zu dem Zeitpunkt gepflückt werden,
wenn
30 - 70 % der Röhrenblüten geöffnet sind, und die sofort anschließend
im Trockenschrank bei 400 72 Stunden getrocknet wurden, enthalten, bezogen auf das
Gewicht der getrockneten Blüten (Trockensubstanz), beispielsweise mindestens: 150
mg% Chamazulen, 300 mg% (-)-d-Bisabolol und höchstens 50 mg% übrige Bisaboloide.
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Beispiel 2 Gewinnung eines Mittels mit antiphlogistischer Wirkung
aus einer tetraploiden Ausgangskamille: Eine Kamille, die man so erhält wie nachstehend
beschrieben ist, wird in üblicher Weise feldmäßig ausgesät. Sobald die Pflanzen
sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in dem Vegetationsstadium sind, wo
etwa 50 % der Röhrenblüten geöffnet sind, werden diese Blütenköpfchen mit einer
Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände der Pflückmaschine so eingestellt
sind, daß nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten zu 50 % offen sind, abgestreift
werden.
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Das Erntegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert
und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet. Anschließend werden
die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet. Der Gewichtsverlust beträgt etwa 80 %. Die Trocknung erfolgt im Schatten
an einer gut belüfteten Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10 cm.
-
Nach etwa 2 - 3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von
Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend
in Ballen gepreßt.
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Analyse Xtherisches Öl: 940 mg% Chamazulen: 132 mg% (-)- i -Bisabolol:
243 mg%.
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Erfolgt die Trocknung beispielsweise in einer stationären Bandtrockenanlage
mittels künstlich erwärmter Luft bei
einer Temperatur zwischen
50 und 700 C, so ist die Trocknung nach etwa 4 - 5 Stunden beendet. Zur Entfernung
von Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend
in Ballen gepresst.
-
Die Analysenwerte eines solchen Mittels sind zum Beispiel: Atherisches
Öl: 775 mg% Chamazulen: 65 mg% (-)-d -Bisabolol: 163 mg%.
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Die verwendete tetraploide Ausgangskamille wird wie folgt erhalten:
Durch Einzelpflanzenvariabilitätstests in der tetraploiden Kamillensorte, die von
1. Sarkany (Herba Hungar. 4(1), 125 - 169 (1965) beschrieben wurde, (es wurden ca.
10000 Pflanzen getestet) wurde gefunden, daß auf etwa 1000 Individuen eine Pflanze
kommt, die im ätherischen Öl einen hohen Chamazulengehalt von 20 Gewichtsprozent
sowie einen hohen (-)-ot-Bisabololgehalt von 50 Gewichtsprozent aufweist, wobei
gleichzeitig der Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere (-)-«-Bisabolonoxid
sehr gering (weniger als 5 Gewichtsprozent) aufweist.
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Diese Individuen wurden ausselektiert und folgenden Schritten unterworfen:
Schritt 1: Von den wie oben beschriebenen ausselektierten tetraploiden Kamillenpflanzen
wurden diejenigen Individuen ausgelesen, die einen Mindestgehalt für Chamazulen
von 100 mg% und für (-)-oL-Bisabolol von 200 mg% erreichen oder überschreiten und
deren Gehalt an übrigen Bisaboloiden (insbesondere Bisabololoxiden) unter 50 mg%
liegt. Sämtliche Werte beziehen sich auf Blütenköpfchen,
die bei
ca. 400 C getrocknet wurden und deren Ernte in dem Stadium erfolgte, wenn ca. 30
- 70 % aller Röhrenblüten eines Köpfshens geöffnet sind.
-
Schritt 2: Von den nach Schritt 1 erhaltenen Pflanzen wurden alle
aufgeblühten Blütenkörbchen entfernt, anschließend kamen die Pflanzen in ein Gewächshaus
und blühten unter isolierten Bedingungen gemeinsam ab. Die Pflanzen standen hierbei
in 11-cm-Töpfen, gefüllt mit Gartenerde, bei 18 bis 240 C Tag- und 12 bis 140 C
Nacht-Temperatur.
-
Die Tageslänge betrug mindestens 14 Stunden und wurde im Winterhalbjahr
durch Zusatzbelichtung (200 Watt/m2) erreicht. Die Wasserversorgung erfolgte nach
Bedarf.
-
Von der Gesamtheit der selektierten Individuen wurden über einen Zeitraum
von 4 Wochen laufend diejenigen Köpfchen zur Saatgutgewinnung geerntet, die verblüht
und kurz vor dem Zerfallen waren. Trocknung erfolgte in einer gut durchlüfteten
Halle bei einer Lufttemperatur zwischen 20 - 300 C; anschließend wurde das Saatgut
mittels eines Schlitzsiebes (5 x 0,4 mm) abgesiebt und durch einen Steigsichter
nachgereinigt.
-
Das nach Schritt 2 erhaltene Saatgut ist das Vermehrungssaatgut der
verfahrensgemäßen Kamille.
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Blüten von Pflanzen aus diesem Vermehrungsgut (Aussaat September/Oktober,
Ernte Anfang Juni des darauffolgenden Jahres), die zu dem Zeitpunkt gepflückt werden,
wenn 30 - 70 % der Röhrenblüten geöffnet sind, und die sofort anschließend im Trockenschrank
bei 400 C 72 Stunden getrocknet wurden, enthalten, bezogen auf das Gewicht der getrockneten
Blüten, mindestens 100 mg% Chamazulen, mindestens 200 mg% (-)-Oc-Bisabolol und höchstens
50 mg% übrige Bisaboloide.
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Beispiel 3 Gewinnung eines Mittels mit antiphlogistischer Wirkung
aus einer diploiden Ausgangskamille: Eine Kamille, die man so erhält wie nachstehend
beschrieben ist, wird in üblicher Weise feldmäßig ausgesät.
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Sobald die Pflanzen sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in
dem Vegetationsstadium sind, wo etwa 50 % der Röhrenblüten geöffnet sind, werden
diese Blütenköpfchen mit einer Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände
der Pflückmaschine so eingestellt sind, daß nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten
zu 50 % offen sind, abgestreift werden. Das Erntegut wird möglichst rasch an einen
schattigen Ort transportiert und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage
ausgebreitet. Anschließend werden die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den
Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der Gewichtsverlust beträgt
etwa 80 %. Die Trocknung erfolgt im Schatten an einer gut belüfteten Stelle auf
Horden in einer Schichtdicke von etwa 10 cm.
-
Nach etwa 2 - 3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von
Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend
in Ballen gepreßt.
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Analyse Ätherisches Öl: 910 mg% Chamazulen: 117 mg% (-)-oL-Bisabolol:
252 mg% Die verwendete diploide Ausgangskamille wird wie folgt erhalten:
Durch
Einzelpflanzenvaribilitätstests der diploiden nur wenig Bisabolol enthaltenden,
aber nicht bisabololfreien Kamillen, die in Franz, Ch., J. Holzl und A. Vömel: Acta
Horticulturae 73, 109 - 114 (1978) beschrieben werden, wurde gefunden, daß maximal
bis zu 20 % aller Individuen im ätherischen Öl einen Chamazulengehalt von etwa 20
Gewichts-% und/oder einen hohen (-) - d.-Bisabololgehalt von 50 Gewichts-% aufweisen,
wobei gleichzeitig der Gehalt an den übrigen Bisaboloiden (insbesondere (-)-Ot-Bisabolonoxid)
sehr gering ist.
-
Diese Individuen wurden aus selektiert und wie folgt tetraploidisiert:
Samen der so aus selektierten Kamillenpflanzen wurden auf ein mit 0,05 %iger wässriger
Colchicinlösung getränktes Filterpapier aufgebracht und bei Raumtemperatur (200
C) 6 Stunden quellen lassen. Daraufhin wurden sie vom Filterpapier entfernt, mit
Wasser mehrmals gespült und in Saatkisten (Gewächshaus) ausgesät: Erde: Torf-Sand-Gemisch
1:1, Temperatur: 18 bis 200 C, relative Luftfeuchtigkeit: circa 60 %, Tageslänge
bei künstlicher Belichtung: 14 Stunden.
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Die keimenden Pflanzen wurden bis zur Blüte beobachtet, der Polyploidisierungserfolg
wurde durch Vergleichsmessung der Pollen- und Samengröße sowie durch Chromosomenzählung
der Pflanzen (F1-Nachkommenschaft = erste, aus Samen gezogene Nachkommenschaft der
als tetraploid bestätigten colchicinierten Pflanzen) festgestellt.
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Die Tetraploidisierung kann auch auf folgende Weise erfolgen: Auf
wassergetränktem Filterpapier ausgekeimte, 5 bis 7 Tage alte, gut entwickelte Kamillenkeimlinge
wurden bei Raumtemperatur (200 C) für 4 bis 6 Stunden mit den Keimblättern nach
unten in eine 0,05 %ige Colchicinlösung gestellt. Die empfindlichen Keimwurzeln
wurden dabei geschont; um Trockenschäden an ihnen zu vermeiden, muß die umgebende
Atmosphäre nahezu 100 % relative Luftfeuchte aufweisen. Nach der Behandlung wurden
die Keimlinge mit Wasser mehrmals gespült und in Pflanzkistchen pikiert.
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Die weitere Behandlung erfolgte wie bei den Samen.
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Die Pollengrößenmessungen werden mit einem Leitz-Binokular-Forschungsmikroskop
mit Mikrometer-Meßokular und Mikrometer-Objektträger durchgeführt.
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Die Chromosomenzählung findet an Wurzelspitzen statt: Von den im Gewächshaus
gezogenen Jungpflanzen oder Stecklingspflanzen werden 1 bis 2 cm lange frische Wurzelenden
gesammelt, 5 Stunden in 0,002 molare Hydroxychinolin-Lösung und anschließend 15
Minuten in 1N HCl eingelegt. Zur Untersuchung werden circa 1 mm der Wurzelspitzen
mit 2 %iger Orcein-Essigsäure angefärbt und in Ölimmersion mikroskopisch untersucht.
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Bei den in Mitose befindlichen Zellen kann so der 4-fache Chromosomensatz
der somatischen Zellen bestimmt werden (4n = 36).
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Diejenigen Pflanzen, bei welchen der Pollendurchmesser um circa 50
% größer als derjenige des diploiden Ausgangsmaterials (circa 30 statt circa 20
Fm) und bei denen der
Chromosomensatz der somatischen Zellen auf
36 verdoppelt war (bei dem diploiden Ausgangsmaterial ist die entsprechende Zahl
18) sind tetraploid. Diese wurden ausselektiert. Ungefähr 0,1 bis 0,5 % der Samen
beziehungsweise der Keimlinge wurden bei der oben angegebenen Methode tetraploidisiert
und entwickelten blühfähige, intakte Pflanzen. Es schließen sich nun beispielsweise
die Schritte 1 und 2 entsprechend Beispiel 2 an.
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Die Blüten der so erhaltenen Kamille enthalten beispielsweise mindestens
100 mg% Chamazulen, 200 mg% (-)-QL-Bisabolol und höchstens 50 mg% an übrigen Bisaboloiden
(Ernte zu dem Zeitpunkt, wo 30 - 70 % der Röhrenblüten geöffnet sind und 72stündiges
Trocknen im Trockenschrank bei 40° C).
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Beispiel 4 Gewinnung eines antiphlogistisch wirkenden Mittels aus
einer diploiden Ausgangskamille: Eine Kamille, die man so erhält wie nachstehend
beschrieben ist, wird in üblicher Weise feldmäßig ausgesät.
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Sobald die Pflanzen sich entwickelt haben und die Blütenköpfchen in
dem Vegetationsstadium sind, wo etwa 50 % der Röhrenblüten geöffnet sind, werden
diese Blütenköpfchen mit einer Kamillenpflückmaschine geerntet, wobei die Kammabstände
der Pflückmaschine so eingestellt sind, daß nur die Blütenköpfchen, deren Röhrenblüten
zu 50 % offen sind, abgestreift werden.
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Das Erntegut wird möglichst rasch an einen schattigen Ort transportiert
und dort bis zur Weiterverarbeitung in dünner Lage ausgebreitet. Anschließend werden
die Blütenköpfchen in einer Siebanlage von den Stengeln befreit und bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet. Der Gewichtsverlust beträgt etwa 80 %. Die Trocknung erfolgt im Schatten
an einer gut belüfteten Stelle auf Horden in einer Schichtdicke von etwa 10 cm.
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Nach etwa 2 - 3 Tagen ist die Trocknung beendet. Zur Entfernung von
Stengelteilen und Blütengrus wird das getrocknete Material gesiebt und anschließend
in Ballen gepreßt.
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Analyse Ätherisches Öl: 1020 mg% Chamazulen: 173 mg% (-)--Bisabolol:
418 mg%.
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Die verwendete diploide Ausgangskamille wird wie folgt erhalten:
Durch
Einzelpflanzenvaribilitätstests der diploiden, nur wenig Bisabolol enthaltenden,
aber nicht bisabololfreien Kamillen, die in Franz, Ch., J. Hölzl und A. Vömel: Acta
Horticulturae 73, 109 - 114 (1978) beschrieben werden, wurde gefunden, daß maximal
bis zu 20 % aller Individuen im ätherischen Öl einen Chamazulengehalt von etwa 20
Gewichts-% und/oder einen hohen (-)-d -Bisabololgehalt von 50 Gewichts-% aufweisen,
wobei gleichzeitig der Gehalt an den übrigen Bisaboloiden (insbesondere (-)-oL-Bisabolonoxid)
sehr gering ist.
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Diese Individuen wurden ausselektiert und genau wie in Beispiel 3
angegeben ist tetraploidisiert und die tetraploiden Individuen aus selektiert.
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Ungefähr 0,1 bis 0,5 % der Samen beziehungsweise der Keimlinge wurden
tetraploidisiert und entwickelten blühfähige, intakte Pflanzen.
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Es schließen sich nun beispielsweise die Schritte 1 bis 6 entsprechend
Beispiel 1 an.
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Die Blüten der so erhaltenen Kamille enthalten beispielsweise mindestens
150 mg% Chamazulen, 300 mg% (-)-O(-Bisabolol und höchstens 50 mg% an übrigen Bisaboloiden
(Ernte zu dem Zeitpunkt, wo 30 - 70 % der Röhrenblüten geöffnet sind und 72stündiges
Trocknen im Trockenschrank bei 40° C).
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Die übrigen Eigenschaften entsprechen denen der nach Beispiel 1 erhaltenen
Kamille.
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Beispiel 5 Herstellung eines ätherischen Öls: 200 g erfindungsgemäß
erhaltene getrocknete Kamillenblüten (Trocknung erfolgte bei 500 C Lufttemperatur
unter Ausschluß von Sonnenlicht) werden in einem 5-Liter-Rundkolben mit 3,6 Liter
Wasser und 2 g Natrium-Ascorbat versetzt und mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 5,0
eingestellt. Nach Zugabe von Siedesteinen wird zum Sieden erhitzt. Innerhalb von
ca. 3 Stunden werden ca. 1,2 Liter Destillat aufgefangen.
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Nach beendeter Destillation wird das Destillat dreimal mit je 100
ml Petroläther ausgeschüttelt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die
getrocknete Lösung wird filtriert und das Lösungsmittel anschließend im Rotationsverdampfer
abdestilliert. Die Ausbeute beträgt 1,44 g ätherisches Öl.
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In dem erhaltenen ätherischen Öl wird anschließend der Gehalt an Chamazulen
und (-)-cC-Bisabolol bestimmt.
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Anlage A Gewinnung des ätherischen Öls Ausgangsmaterial ist ein getrocknetes
Material aus einer Kamille, die gemäß der Erfindung zur Herstellung des antiphlogistisch
wirksamen Mittels in Frage kommt.
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Zur Herstellung des Öls werden nur solche Blütenköpfchen verwendet,
bei denen 30 bis 70 %, insbesondere 40 bis 60 % der Röhrenblüten geöffnet sind.
Die Trocknung erfolgt in einem Trockenschrank bei 400 C während 72 Stunden.
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Das ätherische Öl der Kamillenblüten wird wie im folgenden beschrieben
durch zweistündige Wasserdampfdestillation des getrockneten Materials gewonnen:
2,0 g unzerkleinerte getrocknete Blüten werden in einem Liter-Rundkolben mit 250
ml entsalztem Wasser versetzt und einer zweistündigen Rücklaufdestillation in einer
Clevenger-Apparatur (Wasserdampf-Destillations-Rücklauf-Apparatur zur gravimetrischen
Bestimmung kleiner Mengen ätherischer Öle) unterzogen. Als Vorlage dient 1 ml Pentan
pro analysi. Die Rücklaufgeschwindigkeit beträgt 40 + 4 Tropfen/Minute. Nach Beendigung
der Destillation wird das in Pentan gelöste ätherische Öl möglichst wasserfrei in
Reagenzgläser abgelassen und eventuell restliches in der Apparatur anhaftendes ätherisches
Öl mit Pentan nachgespült. Zur Entfernung eventueller Wasserreste wird der Lösung
eine Spatelspitze getrocknetes Na2SO4 zugesetzt und die Lösung anschließend durch
eine Glasfilternutsche der Porosität D 3 oder D 4 in Rollrandfläschchen abgenutscht.
Nach Abdunsten des Pentans bei 400 C im Wasserbad und Nachtrocknen im Exsikkator
wird die ölmenge gravimetrisch bestimmt.
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In dem so erhaltenen Öl (ca. 20 mg) werden anschließend das Chamazulen
und das Bisabolol bestimmt.
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Spektralphotometrische Bestimmung des Chamazulens Meßlösung: Das gesamte,
aus 2 g des getrockneten Materials erhaltene ätherische Öl (ca. 20 mg) (erhalten
wie vorstehend beschrieben) wird in 25 ml n-Hexan oder Cyclohexan gelöst.
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Meßgerät: Filterphotometer (zum Beispiel Eppendorf).
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Wellenlänge: 578 nm Küvette: 1 cm Spezifische Extinktion von Chamazulen
(1 g/100 ml; 1 cm): 20,8 Kompensationsflüssigkeit: n-Hexan oder Cyclohexan Gefundener
Gehalt an Chamazulen in mg/100 g: 120 E578 Steht zur Messung kein Filterphotometer
zur Verfügung, so kann die Bestimmung auch mit einem Spektralphotometer durchgeführt
werden: Meßgerät: Spektralphotometer (zum Beispiel PM Q II / oder PM Q III "ZEINS")
Wellenlänge: 605 nm Küvette: 1 cm
Spezifische Extinktion von Chamazulen
(1 g/100 ml; 1 cm): 24,5 Kompensationsflüssigkeit: n-Hexan oder Cyclohexan Gefundener
Gehalt an Chamazulen in mg/100 g: 102 E605 In der Meßlösung wird anschließend das
Bisabolol bestimmt.
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Gaschromatographische Bestimmunq des Bisabolols und der ubrigen Bisaboloide
Gaschromatograph: Hewlett Packard Modell 5750, Erba Fractovap 2350 oder ähnliches
Gerät Detektor: Flammen-Ionisations-Detektor Trägergas: Helium Säule: 1/8 Zoll;
200 cm; Stahl Säulenfüllung: 3 % Nitrilsilicongummi "XE 60" auf Kieselgur silanisiert
"Chromosorb WAW HP" 125 bis 150 ßm als Trägermaterial Temperatur: Detektor: 3200
C Einspritzblock: 2200 C Säule: 85 - 2200 C Temperaturprogrammierung: 40/Minute
Probenlösung: Es wird die Meßlösung für das Chamazulen verwandt Vergleichslösung:
Circa 15 mg Standard-Bisabolol werden in Cyclohexan zu 25 ml gelöst Einspritzmenge:
Von Probenlösung und Vergleichslösung je 5 ßl Auswertung: Die Auswertung erfolgt
durch Peakflächenvergleich
Gehalt an Bisabolol in mg pro 100 g
getrocknete Blüten: 10 x Einwaage(Vergleich) /mg x Fläche (Probe) Fläche (Vergleich)
Die Bestimmung der übrigen Bisaboloide kann ebenfalls durch Gaschromatographie,
beispielsweise unter folgenden Aufnahmebedingungen erfolgen: Geräte: Packard, Modell
7721, Serie 800 beziehungsweise Erba Fractovap Serie 2350 Säulen: Glassäulen, 3
m/2 mm im Durchmesser; 2 m/ 2 mm im Durchmesser Füllung: 3 % Methylphenylsilicongummi
"OV 1" auf Kieselgur silanisiert "Gaschrom Q" 125 bis 150 ßm als Trägermaterial
Trägergas: 30 ml/Minute N2 Temperatur-Programm: 80 bis 1800 C, 2,5 (3)0 C/Minute
Injektor/Detektor-Temperatur: 2000 C Detektor: Flammen-Ionisations-Detektor Einspritzmenge:
ca. 2 ßl des ca. 1:50-verdünnten ätherischen Öls Die Auswertung erfolgt teils ohne,
teils mit innerem Standard. Als innerer Standard eignen sich Laurinsäuremethylester
oder Hexadecan für chamazulenarme beziehungs-
weise chamazulenfreie
Öle. Bei Ölen mit einem Chamazulengehalt über 5 % ist dieser als innerer Standard
vor zuziehen, wobei die Gehaltsbestimmung photometrisch (bei 578 nm) erfolgt.