FI80982B - Foerfarande foer framstaellning av en ny kamomillsort (benaemning manzana) och dess anvaendning. - Google Patents

Description

1 80982

Menetelmä uuden kamomillalajikkeen (nimitys Manzana) valmistamiseksi ja sen käyttö

Keksintö koskee menetelmää viljelykasvilajin aito 5 kamomilla (Chamomilla recutita (L.) Rauschert, synonyymi

Matricaria chamomilla L., Asteraceae) uuden tetraploidi-sen kamomillalajikkeen (nimitys Manzana) valmistamiseksi, jonka 40°C:ssa kuivatut kukat sisältävät kuiva-aineesta laskettuna vähintään 150 mg% kamatsuleenia, vähintään 300 10 mg% (-)-α-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg% muita bis- aboloideja.

Keksintö koskee myös menetelmiä kamomillarohdok-sen, uutteen ja eteerisen öljyn valmistamiseksi käyttäen uutta kamomillaa, sekä uuden kamomillan käyttöä uutteiden 15 tai eteerisen öljyn valmistukseen.

Aidon kamomillan [Chamomilla recutita (L.) Rauschert, synonyymi Matricaria chamomilla (L.)] kukkamyke-röistä saaduilla valmisteilla on niiden antiflogistisen ja spasmolyyttisen vaikutuksen vuoksi laajaa terapeuttis-20 ta käyttöä, ja ne muodostavat kasvikunnasta saatujen lääkkeiden tärkeän osan. Erityinen terapeuttinen merkitys on tällöin tehoaineilla (-)-a-bisabololi ja kamatsuleeni. Hyvässä kamomillarohdoksessa tulisi sen vuoksi olla mahdollisimman suuri pitoisuus näitä molempia aineita.

25 Nimellä DEGUMILL (tällöin on kyseessä DE-patentti- julkaisun 2 402 802 patenttivaatimuksessa mainittu kamo-millalajike; DDR-lajisuojaoikeus Degumlll; IT-patentti 1 035 096) tunnetaan kamomillalajike, jossa on samanaikaisesti suuri pitoisuus (-)-a-bisabololia ja kamatsulee-30 nia. Tämän kamomillalajikkeen DEGUMILL kamatsuleeni- ja bisabololipitoisuus on kuitenkin pysyvä vain silloin, kun estetään kaikki risteytyminen ja vastaavasti ristipölytys muiden, huomattavasti pienemmän bisabololi- ja kamatsu-leenipitoisuuden omaavien kamomillalajikkeiden kanssa, ja 35 vastaavasti kaikkialla esiintyvän tehoaineköyhän villika- momillan kanssa. Tämän ristipölytyksen kautta tapahtuvan

_____·- -- I

2 80932 risteytymisen vaara on olemassa melkein aina, koska vil-likamomillaa esiintyy käytännöllisesti katsoen kaikkialla.

Edelleen tunnetaan erilaisia tetraploidisia kamo-5 millalajikkeita (esim. BODEGOLD, DDR; POHORELICKY, CSSR; ZLOTY LAN, Puola ja BK-2, Unkari). Näissä tetraploidisis-sa kamomillalajikkeissa on kamatsuleenipitoisuus, joka ei ole olennaisesti uuden kamomillalajikkeen Manzana kamat-suleenipitoisuutta pienempi. Toisaalta näissä tunnetuissa 10 tetraploidisissa kamomillalajikkeissa on kuitenkin tär keätä tehoainetta (-)-a-bisabololia vain äärimmäisen vähäisenä määränä ja sen sijasta ovat vallitsevina muut bisaboloidit (bisabololoksidi A ja B sekä bisabolonoksi-di), jotka muodostavat yli puolet tunnettujen tetraploi-15 disten kamomillalajikkeiden eteerisestä öljystä.

Nyt on keksitty menetelmä uuden, edullisia ominaisuuksia omaavan kamomillalajikkeen valmistamiseksi. Keksinnölle on tunnusomaista patenttivaatimuksissa määritellyt kohteet ja vastaavasti tilanteet.

20 Uudelle menetelmän mukaiselle tetraploidiselle ka- momillalajikkeelle, josta käytetään nimikettä Manzana, on yllättävästi ominaista joukko tunnettuun kamomillalajik-keeseen DEGUMILL sekä muihin tunnettuihin tetraploidisiin kamomillalajikkeisiin nähden uusia ja edullisia ominai-25 suuksia. Päinvastoin kuin DEGUMILL, se ei enää ole altis ristipölytykselle luonnossa esiintyvien kamomillakasvus-tojen (villikamomillan) kanssa. Lisäksi siinä on huomattavasti suurempi pitoisuus tärkeätä tehoainetta (-)-a-bisabololia kuin lajikkeessa DEGUMILL.

30 Tunnetuista tetraploidisista kamomillalajikkeista menetelmän mukainen lajike Manzana eroaa yllättävästi siten, että siinä on verrattomasti suurempi pitoisuus tärkeätä tehoainetta (-)-a-bisabololia sekä hyvin pieni pitoisuus muita bisaboloideja.

3 80982

Sen lisäksi menetelmän mukainen lajike Manzana eroaa tunnetuista tetraploidisista kamomillalajikkeista vielä seuraavien ominaisuuksien vuoksi: siementen parempi itävyys; pienempi osuus käyttökelvotonta ruohomassaa (so.

5 suurempi kukkasato); kukintojen pienempi kosteus (so.

kuivattujen kukintojen parempi saanto ja lyhyemmät kuivatusajat); parempi soveltuvuus koneelliseen sadonkorjuuseen, koska kukinnot sijaitsevat suurelta osin samassa tasossa ja suurin osa kukinnoista kukkii samanaikaisesti 10 (siten tulee mahdolliseksi myös yhtenäinen sadonkorjuu- kausi); rohdoksen parempi pysyvyys (vähäisempi taipumus hajota ja murskaantua); ja erityisen arominen ja tyypillinen kamomillan tuoksu.

Edelleen menetelmän mukainen kamomillalajike Man-15 zana on toisin kuin aikaisemmin tunnetut tetraploidiset kamomillalajikkeet sisältämiensä aineosien suhteen homogeeninen, jolloin ominaisuudet ovat kamatsuleeni- ja (-)-a-bisabololipitoisuuden suhteen pysyvät (so. homo-tsygoottiset). Tunnettujen tetraploidisten kamomillala-20 jikkeiden yksittäisten yksilöiden kohdalla on erilaisia tyyppejä niihin sisältyviä aineosia, mikä tarkoittaa sitä, että jokainen pistonäyte, joka on otettu näistä valmistetuista rohdoksista, antaa sekä kvalitatiivisesti että myös kvantitatiivisesti erilaisen, epähomogeenisen 25 tuloksen.

Keksinnön tehtävänä on valmistaa uusi tetraploidi-nen kamomillalajike, jolla on paremmat ominaisuudet, varsinkin suurempi pitoisuus (-)-a-bisabololia.

Uuden menetelmän mukaisen kamomillalajikkeen val-30 laistaminen tapahtuu kamomillalajikkeen DEGUMILL tetra- ploidisoinnin (geenimutaation) ja siihen liittyvien muiden valinta- ja lisäämisvaiheiden kautta (kantamuodon jalostus vegetatiivisesti lisääntyviksi ristisiitoskykyi-siksi yksilöiksi). Manzana-lajike koostuu 34 kannasta tai 35 linjasta, joita on käsitelty toisistaan erotettuina ela tus jalostuksessa.

* 80982

Tetraploidisointi voi tapahtua esimerkiksi sinänsä tunnetulla tavalla siten, että DEGUMILL-kamomillakasvin osia (siemeniä, juuria, versojen kärkiä, ituja tai lehti-hankasilmuja) tai kudosta käsitellään kemikaaleilla, 5 röntgensäteillä, ganunasäteillä tai UV-säteillä. Se voi edelleen tapahtua dekapitointi-kallusmenetelmällä, siite-pölyviljelyn avulla tai käyttäen korkeita tai myös matalia lämpötiloja DEGUMILL-kamomillakasviin tai vastaavasti DEGUMILL-kamomillakasvin osiin tai kudoksiin. Tässä yh-10 teydessä viitataan esimerkiksi teokseen Werner Gott- schalk, "Die Bedeutung der Polyploidie fur die Evolution der Pflanzen"; Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1976; erityisesti sivut 13 - 22.

Tetraploidien valmistus kemikaalien avulla.

15 Tetraploidien valmistukseen soveltuvina kemikaa leina tulevat kysymykseen esimerkiksi kolkisiini, asenaf-teeni, alkaloidit, kuten esimerkiksi atropiini, veratrii-ni, nikotiini, sanguinariini, bentseenin, difenyylin ja fenantreenin johdannaiset, naftaliini ja naftaliinijoh-20 dannaiset, difenyyliamiini, tribromaniliini, para-dikloo- ribentseeni, metyylinaftokinoni, metyylinaftohydrokinoni, salisyylihappo ja läheiset yhdisteet, heksaklooriheksaa-ni, metamfetamiini (hydrokloridi), alkyyli-alkali-karba-maatti, kuten isopropyylinatriumkarbamaatti, fenyyliure-25 taani, kakodyylihapon suolat (esim. natriumsuola), kielon glykosidit, kuten esimerkiksi konvallariini, konvallatok-siini ja konvallamariini, heteroauksiini, germisaani (fe-nyylielohopeabrentskatekiini), orgaaniset elohopeayhdisteet, kuten esimerkiksi etyylielohopea-fosfaatti, etyyli-30 elohopea-kloridi, fenyyli-elohopea-hydroksidi, fenyyli- elohopea-dinaftyylimetaanidisulfonaatti, kloroformi, ilo-kaasu (N20) sekä näiden aineiden seokset. Edelleen tulevat kysymykseen öljykakut, komposti ja lehmänlanta.

Tässä mainituilla aineilla suoritettava käsittely 35 tapahtuu esimerkiksi 0 - 35°C:n lämpötiloissa, etupäässä 12 - 30°C;ssa, erityisesti 15 - 25°C:ssa.

5 80982 Käyttö tapahtuu esimerkiksi käsittelemällä siemeniä, versolatvuksia, juuria (erityisesti juurien kärkiä tai sirkkataimien juuria), sikiäimiä, lehtien tai varren poikkipintoja, kasvusolukkoviljelmien solususpensioita 5 tai haavakorkkiviljelmiä tai ruiskuttamalla varren tyvi osaan tai hankasilmujen alueelle. Kemikaaleja käytetään yleensä vesiliuosten, vähän alkoholia sisältävien (alkoholipitoisuus tavallisesti alle 5 %) tai heikosti happamien liuosten muodossa. Heikosti happamien liuosten pH-10 arvo on esimerkiksi 5,5 - 5,5, jolloin happameksi tekemi nen tapahtuu alempien, orgaanisten, alifaattisten happojen, kuten esimerkiksi etikkahapon avulla. Siinä tapauksessa, että käytetään alkoholiliuoksia, ne voivat myös olla heikosti happamia. Kemikaalioiden konsentraatiot 15 näissä liuoksissa voivat olla esimerkiksi 0,01 - 0,5 %, etupäässä 0,02 - 0,2 %, erityisesti 0,05 - 0,1 %. Kaasun muodossa olevia aineita käytetään sellaisenaan, mahdollisesti paineen alla (esimerkiksi 100 - 1000 kPa). Käsittelyaika on esimerkiksi 1 - 36, etupäässä 2 - 12, erityi-20 sesti 4-6 tuntia.

Tehokkaimmat konsentraatiot, samoin kuin vaikutusaika olisi tarkoituksenmukaista tutkia kulloinkin esiko-keiden avulla.

Erityisen edullinen on esimerkiksi kolkisiinilla 25 suoritettu käsittely 0 - 35°C:ssa, etupäässä 12 - 30°C:ssa, erityisesti 15 - 25°C:ssa. Tämä voidaan esimerkiksi suorittaa siten, että DEGUMlLL-kamomillalajikkeen siementen annetaan paisua 0,01 - 0,2-%:isessa, erityisesti 0,02 - 0,l-%:isessa, etupäässä 0,05-%:isessa kolkisii-30 niliuoksessa, tai että itäneet, 5-7 päivän ikäiset, hyvin kehittyneet DEGUMlLL-kamomillalajikkeen sirkkatai-met (sirkkalehdet alaspäin) upotetaan 0,01 - 0,2-%:iseen, erityisesti 0,02 - 0,l-%:iseen, etupäässä 0,05-%:iseen kolkisiiniliuokseen. Viimeksi mainitussa menetelmässä 35 tulee ympäröivän ilman suhteellisen kosteuden olla lähes 100 %. Kolkisiinikäsittelyn pituus on esimerkiksi 3-36 6 80982 tuntia, erityisesti 4-10 tuntia. Sirkkataimia käytettäessä on yleensä vaikutusaika aina 10 tuntiin asti riittävä. Siemeniä käytettäessä vaikutusaika voi mahdollisesti pidentyä 36 tuntiin saakka.

5 Kemikaaleilla suoritetun käsittelyn jälkeen tur votetut siemenet, sirkkataimet tai muut kasvinosat huuhdotaan useita kertoja vedellä. Turvotetut siemenet esimerkiksi kylvetään. Kasvit, joiden juuret tai muut kasvinosat on käsitelty, esimerkiksi istutetaan uudelleen 10 kasvilaatikkoihin. Kasvit kasvatetaan näin käsitellyistä siemenistä tai sirkkataimista (esimerkiksi kasvihuoneessa; lämpötila 18 - 25°C päivällä ja 10 - 16°C öisin), ja valitaan kasvit, joiden siitepöly on noin 1 1/2 kertaa suurempaa kuin lähtömateriaalin siitepöly tai joiden so-15 maattisten solujen kromosomilukumäärä on 36. Siinä tapauksessa, että kemikaaleilla käsitellään muita kasvinosia (maanpäällisiä tai maanalaisia kasvinosia), yksinomaan käsitellyistä osista alkunsa saaneita kasvaimia, juuria tai kukkia/siemeniä tutkitaan myöhemmin muodostu-20 neiden tetraploidien suhteen. Kun suoritetaan verso- tai lehtihankakäsittely, tutkitaan tämän jälkeen ainoastaan tästä lehtihangasta tai tästä versosta syntyvä uusi kasvi sekä siinä muodostuvat kukat tai siemenet kromosomiluvun suhteen.

25 Siitepölyn koon mittaus ja kromosomien laskeminen voidaan suorittaa esimerkiksi esimerkissä 1 esitetyllä tavalla.

Tetraploidien valmistus säteilytyksen avulla.

Vaikutus kohdistetaan esimerkiksi siemeniin tai 30 juurenkärkiin 0 - 35°C;n, etupäässä 10 - 30°C:n, erityisesti 15 - 25°C:n lämpötilassa. Säteilyn summa: 5 - 50 Krad. Kysymykseen tulevat etupäässä gamma- ja röntgensäteet. UV-säteinä tulevat esimerkiksi kysymykseen säteet, joiden aallonpituus on 400 - 30 nm, etupäässä 350 nm.

35 Näin säteilytettyjä kasveja tai kasvinosia käsitellään 7 80982 sitten samoin kuin kemikaaleilla suoritettavan käsittelyn yhteydessä.

Korkeiden ja alhaisten lämpötilojen käyttö.

Korkeina lämpötiloina tulevat kysymykseen esimer-5 kiksi 35 - 50°C:n lämpötilat, etupäässä 42 - 45°C. Näihin lämpötiloihin asetetaan esimerkiksi turvotettuja siemeniä, sirkkataimia, kasvaimen latvuksia ja kasvusolukkoku-dosta. Käsittelyn kesto on esimerkiksi 1-48, etupäässä 12 - 24 tuntia.

10 Alhaisina lämpötiloina tulevat kysymykseen esimer kiksi 0 - 5°C, etupäässä 0,5 - 4°C, erityisesti 2°C. Näihin lämpötiloihin asetetaan esimerkiksi turvotettuja siemeniä, sirkkataimia, latvakasvaimia ja kasvusolukkokudos-ta. Käsittelyn kesto on esimerkiksi 1 - 100, etupäässä 20 15 - 40 päivää.

Näin käsiteltyjä kasveja tai kasvien osia käsitellään sitten edelleen samoin kuin kemikaaleilla suoritettavan käsittelyn yhteydessä.

Dekapitointi-kallusmenetelmä (dekapitointi = lat-20 vominen tai kärjen poisto tai kärjen leikkuu).

Dekapitointi suoritetaan esimerkiksi nuorten kasvien varsista, edullisesti kärkien kasvupisteistä sen jälkeen, kun on muodostunut 4-6 lehteä tai myös lehtiruodista tai sivuversoista. Haavasolukosta (kallussolu-25 kosta) muodostuvat silmut tai vastaavasti versot leikataan irti, saatetaan juurtumaan, viljellään edelleen ruukuissa ja valitaan tetraploidisoituneet kasvit samalla tavalla kuin kemikaaleilla käsiteltäessä.

Ponsiviljelmät (yksinkertaisen kromosomiston omaa-30 vien kasvien tuottaminen heteiden ponsista ja sitä seuraava spontaani tai keinotekoinen tetraploidi- sointi)

Kukkivista kasveista kerätään suljetut torvikukat, joiden heteiden ponnet ovat ensimmäistä siitepölyn mitoo-35 siä edeltävässä vaiheessa. Heteiden ponnet otetaan mikro- manipulaattorin avulla kukannupuista ja siirretään petri- 8 80982 maljoihin, jotka on täytetty Nitsohin ja Nitschiri mukaisella elatusaineella (taulukko 1). Tämän jälkeen petri-maljoja säilytetään viljelyhuoneessa, jossa on 16-tun-tisia päiviä 28°C:ssa päivälämpötilassa ja 20°C:ssa yöl-5 lä. Noin 4 viikon kuluttua alkavat heteen ponnet avautua ja kasvit kasvaa. Diploidisten kasvien ollessa kysymyksessä nämä ovat haploidisia ja tetraploidisilla kasveilla nämä ovat dihaploidisia; juurien muodostumisen jälkeen ne siirretään esimerkiksi puutarhamaahan ja saatetaan kuk-10 kimaan kasvihuoneessa. Nämä (di)haploidiset kasvit ovat steriilejä; polyploidisia kasveja voidaan kuitenkin muodostaa käsittelemällä versolatvuksia, juuria ja varsia kemikaaleilla, kuten esimerkiksi kolkisiinilla, jolloin muodostuu homotsygoottisia kasveja, joita sitten voidaan 15 lisätä siementen avulla. Katso jatkokäsittely kemikaa leilla suoritettavan käsittelyn yhteydessä (esimerkiksi kolkisiinikäsittely).

9 80982

Taulukko 1

Nitschin ja Nltschin mukainen elatusaine (Science, 1969) mg/1 KN03 950 NH4N03 720

MgS04 x 7 H20 185

CaCl2 166 KH2P04 68

MnS04 x 4 H20 25 h3bo3 10

ZnS04 x 7 H20 10

Na2Mo04 x 2 H20 0,25

CuS04 x 5 H20 0,025 5 ml liuosta, jossa on 7,45 g etyleeni-diamiinitetraetikkahapon dinatriumsuolaa ja 5,57 g FeSC>4 x 7 H20 täytettynä 1000 mlrksi myo-inosiitti 100

Glysiini 2

Nikotiinihappo 5

Pyridoksiini-HCl 0,5

Tiamiini-HCl 0,5

Foolihappo 0,5

Biotiini 0,05

Sakkaroosi 20 g

Valmis elatusaine (DIFCO-Bacto-agar) 8 g

Indolietikkahappo 0,1

Elatusaineen pH säädetty 5,5:ksi 10 80982

Siitepölyhiukkasten koon mittaamisen ja/tai kromosomien laskemisen avulla valituista tetraploidi-sista kamomillakasveista, joita voidaan saada edellä kuvattujen vaihtoehtojen mukaisesti, valitaan sitten vie-5 lä ne kasvit, jotka täyttävät seuraavat ehdot: a) suunnilleen samanaikainen kukinta, b) tasainen, juuresta lähtevä haaroittuneisuus ja kapea noin 5 cm:n kukkavyöhyke, c) suuret kukkamykeröt, joiden ulkohalkaisija on 10 noin 30 mm (25 - 35 mm), d) vähimmäispitoisuus kamatsuleenia 150 mg% ja bisabololia 300 mg% ja muiden bisaboloidien (varsinkin bisabololoksidien) pitoisuus alle 50 mg% (laskettuna kuivatuista kukista; katso esimerkki).

15 Näin valittuja kasveja lisätään nyt pistokkais ta (kloonataan) ja suoritetaan valinta 3-5 sukupolven aikana, jolloin valinta tapahtuu aina edellä esitettyjen kriteerien a) - d) perusteella valitut kasvit kloonataan, kloonatuista kasveista otetaan siemen, tästä saaduista 20 kasveista suoritetaan valinta kriteerien a) - d) mukaan ja viime mainituista otetaan taas siemen.

Jakso kylvö - kohtien a) - d) mukainen valinta - siemenen-saanti voidaan toistaa 2-4 kertaa.

Siihen liittyy vielä kerran jakso kylvö - kohtien a) - d) 25 mukainen valinta - kloonaus - siemenensaanti.

Viimeksi saatu siemen on sitten menetelmän mukaisen Manzana-kamomillalajikkeen lisäämistuote.

Pistokaslisääminen tapahtuu tällöin seuraavasti:

Pistokaslisäämistä varten kantakasvien (klooniemo-30 kasvien) täytyy muodostaa olosuhteissa, joissa päiväaika on lyhyt, kukkasiImuttomia lyhytvesoja. Tämä tapahtuu vuoden talvipuoliskolla kasvihuoneessa ilman lisävalaistusta tai sääkammiossa päivän pituuden ollessa 6-10, edullisesti 8 tuntia ja lämpötilassa 10 - 15°C, edulli-35 sesti 12°C:ssa. Kloonaukseen tai vastaavasti lisäämiseen soveltuvat lehti-, verso- ja varsinkin lyhytverso-(sivuverso-)pistokkaat. Niiden juurruttaminen tapahtuu

II

11 80982 12-18°C:ssa, edullisesti 15°C:ssa ja päivän pituuden ollessa 12-16, edullisesti 14 tuntia suhteutetussa atmosfäärissä (n. 100 %:n suhteellinen ilmankosteus). Kasvualustana voidaan käyttää esimerkiksi turve-hiekka-seosta suh-5 teessä 1:1; siksi soveltuvat kuitenkin myös puhdas kvart-sihiekka, vuorivilla-pistokaskuutiot, turve-pistokaskuu-tiot ja niiden kaltaiset.

Kylvöä varten tässä yhteydessä tulevat kysymykseen esimerkiksi seuraavat alustat: puutarhamaa, humuspitoinen, 10 keskiraskas savimaa, savinen tai humuspitoinen hiekkamaa.

Kylvö voidaan suorittaa kasvihuoneessa tai myös avomaalla. Kasvien itäminen ja kasvu tapahtuvat esimerkiksi 12-24°C:n, erityisesti 18-20°C:n lämpötilassa. Siinä tapauksessa että kylvö suoritetaan avomaalle, kylvetään 15 etupäässä syksyllä (syyskuu/lokakuu) tai keväällä (maalis-kuu/huhtikuu). Nämä määräajat tarkoittavat kaikkia kysymykseen tulevia viljelyalueita (esim. pohjoista pallonpuoliskoa, lauhkeista subtrooppisiin ilmastoalueisiin).

Uusi, menetelmän mukainen kamomillalajike Manzana 20 kuuluu aidon kamomillan viljelykasvilajiin, jonka kasvitieteellinen nimi on Matricaria Chamomilla L. (synonyymi Chamomilla recutita (L.), Rauschert), ja sen määrittelevät patenttivaatimuksen 1 tiedot tehoaineista. Siinä annetut tehoainepitoisuudet on laskettu siitä kukkien kehitysvai-25 heesta, joka on saavutettu kun 30-70 %, erityisesti 40-60 % kaikista kukkamykeröiden torvikukista on avautunut (ts. teho-ainemäärityksessä käytetyt kukat poimittiin tänä ajankohtana ja kuivattiin sitten 72 tuntia 40°C:ssa kuivatuskaapis-sa) .

30 Jos kamomillakukkien sato korjataan sellaisena ajan kohtana, jossa kukkamykeröiden kehitysvaihe on ohittanut edellämainitun vaiheen, ts. esim. 100 % tai lähes 100 % kaikista kukkamykeröiden torvikukista on avautunut (esim. täyden kukinnan vaihe) ja/tai jos korjattujen kukkamykeröiden kuiva-35 tus suoritetaan yli 40°C:n lämpötilassa, niin vaikuttavien aineiden, kamatsuleenin ja (-) -o^-bisabololin pitoi- 12 80982 suus jää alhaisemmaksi. Jos siis sadonkorjuu suoritetaan kasvuvaiheessa, jossa 30-100 % kukinnon torvikukista on avautunut ja kuivatus suoritetaan lämpötilassa aina 60°G seen asti (edullisesti välttäen auringonvaloa, esimerkiksi 5 sellaisissa kuivatusolosuhteissa, joita kuvataan jäljempänä) , niin näin saatu kamomilla-lääkeaine sisältää vähintään 120 mg% kamatsuleenia ja vähintään 200 mg% (-)-e^-bisa-bololia, kun sen sijaan muiden bisaboloidien pitoisuus pysyy edelleen samana, alle 50 mg%.

10 Ilmaisulla "muut bisaboloidit" vaatimuksessa 1 tarkoi- koitetaan erityisesti (-) -«/-bisabololoksidi A:ta ja B:tä; (-) -(X-bisabolonoksidi A: ta, muita menetelmän mukaisen kamomil-lalajikkeen eteerisen öljyn aineosia ovat en-in-disykloeet-teri, farneseeni, spatulenoli ja pieninä pitoisuuksina 15 erilaiset helposti haihtuvat terpeenihiilivedyt. Kuivatus- kaapissa 40°C:ssa kuivatut menetelmän mukaisen Manzana-lajikkeen ( poimittu kukinnon kehitysvaiheessa, jossa 30-70 % kukka-mykeröiden torvikukista on avautunut) sisältävät esimerkiksi 150-200 mg% kamatsuleenia, 300-450 mg% (-)-^-bisabololia 20 ja vain vähän, ts. 5-50 mg% muita bisaboloideja laskettuna kuiva-aineesta (ts. laskettuna kukkien absoluuttisesta kuivapainosta). Tämä absoluuttinen kuivapaino määritetään kuivaamalla menetelmän mukaisen Manzana-lajikkeen ka-momillakukkien erillinen näyte kuivatuskaapissa 105°C:ssa 25 vakiopainoon (72-96 tuntia). Esimerkiksi 35-50°C:ssa kuivattujen kukkien (rohdoksen) tehoainepitoisuus lasketaan sitten kukkien 105°C:ssa ilmoitetusta kuivamassasta.

Ulkonäöltään menetelmän mukainen Manzana-lajike on ennestään tunnettujen tetraploidisten kamomillalajikkeiden 30 (esimerkiksi Bodegold, Zloty Lan, BK-2, Phorelicky

Velkokvety) kaltainen; se eroaa näistä varsinkin siten, että menetelmän mukaisessa Manzana-lajikkeessa on kukkien eteerisen öljyn pääkomponentti (-) -V-bisabololi, että sen lisäksi kamatsuleenipitoisuus on suurempi ja että 35 muiden bisaboloidien (bisabololoksidit A ja B; bisabolo-noksidi) pitoisuus on aivan huomattavasti pienempi.

i3 80982

Manzana-lajikkeen eteerisen öljyn muita aineosia ovat farneseeni, spatulenoli ja en-in-disykloeetteri.

Menetelmän mukaista kamomillalajiketta voidaan menestyksekkäästi viljellä kaikissa maalajeissa lukuunottamat-5 ta maalajeja, joissa orgaanisen aineen pitoisuus on suurempi kuin 20 % (humusaineita ja maaorganismejä); mitkään erityiset maanviljelystekniset menetelmät tai viljelytoi-menpiteet eivät ole tarpeen; viljelyä varten on ainoastaan tarpeen pitkä päiväaika päivän maksimipituuden ollessa 13 10 tuntia, se tarkoittaa, että viljelyssä tulevat erityisesti kysymykseen lauhkeat ja subtrooppiset vyöhykkeet.

Menetelmän mukaisella Manzana-kamomillalajikkeella on keskimyöhäinen korjuuaika, yhtenäinen kasvukorkeus, kapea kukkavyöhyke ja suuret kukinnot ja se on sen vuoksi 15 erityisen sopiva mekaaniseen sadonkorjuuseen. Tämän lisäksi Manzana-lajin samanaikaisesti kylvetyt kasvit puhkeavat yleensä kukkaan käytännöllisesti katsoen samanaikaisesti, niin että myös tämä yksinkertaistaa ja helpottaa sadonkorjuuta suuresti. Menetelmän mukainen Manzana-ka-20 momillalajike tuottaa suuren sadon. Käyttömahdollisuuksia ovat esimerkiksi kamomillarohdoksen, kamomillaöljyn, ka-momillauutteiden sekä luonnon (-)-^-bisabololin valmistus.

Menetelmän mukaisesta Manzana-kamomillalajikkeesta valmistetussa rohdoksessa on tehoaineiden, kamatsuleenin ja bi-25 sabololin maksimipitoisuus, kun kamomillakukintojen korjuu tapahtuu siinä kasvuvaiheessa, jossa esimerkiksi 30-70 %, edullisesti 40-60 %, ts. yleensä 50 %kukkamykeröiden torvi-kukista on avautunut ja kuivatus tapahtuu ilman lämpötilassa, joka on enintään 50°C, esimerkiksi 35-50°C.

30 Kuivatus voi tällöin tapahtua joko keinotekoisesti johdetun ilmavirran avulla tai myös kuivaamalla varjossa, mahdollisesti myös auringossa, jolloin on kuitenkin huolehdittava siitä, että tuotteeseen viety lämpömäärä ei ylitä määrää, joka on tarpeen täydellisen kuivumisen saavut-35 tamiseksi. On siis edullista, että saavutettu vakiopaino todetaan kulloinkin vertailupunnituksin. Kuivatus voi 14 80982 tapahtua spontaanisti tai keinotekoisesti (esimerkiksi lämmitetyllä ilmalla). Tehoainesaanto on suurimmillaan spontaanissa kuivumisessa auringonvalolta suojattuna. Kuivatusprosessin täytyy tapahtua mahdollisimman pian tai viipymättä sadonkorjuun jälkeen. Kuivatus tulee suorittaa käyttäen ohuita kerroksia kuivattavaa materiaalia, esimerkiksi 5-20 cm, edullisesti 10 cm paksuudeltaan .

Kamatsuleeni määritetään spektrofotometrisesti samankaltaisesta kuin on tavanomainen tapa kamomillauuttei-den suhteen. (-) u^-bisabololi sekä kamomillaöljyn muut aineosat määritetään tässä tarkoituksessa tavanomaisella kaasukromatografisella menetelmällä. Analyyttisten määritysmenetelmien tarkka kuvaus on liitteessä A.

Tehoaine kamatsuleeni ei ole kamomillankukissa sellaisenaan vaan seskviterpeenilaktonina, matrisiinina. Matrisiinilla on farmakologinen vaikutus, joka vastaa ka-matsuleenin vaikutusta. Tästä esivaiheesta, matrisiinis-ta, syntyy esimerkiksi kuumennettaessa (esimerkiksi vesi-höyrytislauksessa, teeuutossa) heti kamatsuleenia. Sen vuoksi on tavanomaista, että kamoraillasta ei anneta mat-risiinipitoisuutta, vaan tästä muodostuvan kamatsulee-nin analyyttisesti määritettävissä oleva pitoisuus.

Esimerkki 1 DEGUMILL-kamomillalajikkeen siemenet siirrettiin 0,05-prosenttisessa kolkisiinin vesiliuoksessa kastetulle suodatinpaperille ja niiden annettiin paisua huoneen lämmössä (20°C) 6 tuntia. Sen jälkeen ne poistettiin suodatinpaperilta, huuhdottiin vedellä useita kertoja ja kylvettiin kylvölaatikkoihin (kasvihuoneessa): maalaji: turve-hiekka -seos 1:1, lämpötila 18-20°C, suhteellinen ilmankosteus noin 60 %, päivän pituus keinovalossa 14 tuntia.

Itäneitä kasveja seurattiin kukintaan saakka, po-lyploidisoitumisen onnistuminen todettiin siitepölyhrukkasten ja siementen koon vertailumittauksin sekä laske- 15 80982 maila kasvien kromosomit (F^-jälkeläispolvi = ensimmäinen, tetraploidisiksi todettujen, kolkisiinilla käsiteltyjen kasvien siemenistä saatu jälkeläispolvi).

Tetraploidisointi voi tapahtua myös seuraavasti: 5 Veteen kastetulla suodatinpaperilla itäneet 5-7 vuorokautta vanhat, hyvin kehittyneet DEGUMILL-lajikkeen ka-momillataimet asetettiin huoneen lämmössä (20°C) 4-6 tunniksi 0,05-prosenttiseen kolkisiiniliuokseen sirkkalehdet alaspäin. Tällöin varottiin herkkiä sirkkajuuria; niille 10 aiheutuvien kuivumisvahinkojen välttämiseksi täytyy ympäröivän ilmakehän suhteellisen kosteuden olla lähes 100 %. Käsittelyn jälkeen taimet huuhdottiin useita kertoja vedellä ja istutettiin kasvilaatikkoihin. Jatkokäsittely tapahtui kuten siementen ollessa kyseessä.

15 Siitepölyn kokomittaukset suoritetaan Leitz-bin- okulaaritutkimusmikroskoopilla, jossa on mikrometri-mitta-okulaari ja mikrometriobjektilasi.

Kromosomien laskenta suoritetaan juurenkärjistä.

Kasvihuoneessa kasvatetuista taimista tai pistokas-20 kasveista kerätään 1-2 cm:n pituiset tuoreet juurten päät ja pannaan ne 5 tunniksi 0,002-molaariseen hydroksi-kinoliiniliuokseen ja sen jälkeen 15 minuutiksi IN HCl:ään. Tutkimista varten värjätään noin 1 mm juurien kärjistä 2-prosenttisella orseiini-etikkahapolla ja tutkitaan immer-25 sioöljymikroskooppisesti. Mitoosivaiheessa olevista soluis ta voidaan siten määrittää somaattisten solujen 4-kertainen kromosomisto (4n = 36).

Ne kasvit, joiden siitepölyhiukkasten halkaisija on noin 50 % suurempi kuin diploidisella lähtömateriaalil-30 la (noin 30 pm noin 20 pm:n sijasta) ja joilla somaattisten solujen kromosomisto on kaksinkertaistunut 36:ksi (diploidisella lähtömateriaalilla vastaava luku on 18), ovat tetraploidisia. Nämä valittiin erilleen. Noin 0,1 - 0,5 % siemenistä tai vastaavasti taimista tetraploidisoitui yllä 35 esitetyllä menetelmällä ja kehitti kukkivia vahingoittumattomia kasveja. Tämän jälkeen seurasivat seuraavat vaiheet: 809-82

Vaihe 1:

Valikoiduista (kuten edellä on esitetty) tetra-ploidisista kamomillakasveista valittiin ne yksilöt, jotka 5 A) kukkivat jokseenkin samanaikaisesti, B) haaroittuivat tasaisesti, juuresta lähtien ja joiden kukkavyöhyke oli kapea, noin 5 cm, C) joiden mykeröt olivat suuret, ulkoiselta läpimitaltaan noin 3Q mm, 10 D) joiden vähimmäispitoisuus kamatsuleenin suhteen saavuttaa 150 mg-% ja bisabololin suhteen 300 mg-% tai ylittää mainitut arvot ja joiden pitoisuus muiden bisaboloidien suhteen (erityisesti bisabololioksidien suhteen) on selvästi 50 mg-%:n alapuolella. (Kaikki arvot koskevat mykeröi-15 tä, jotka kuivattiin 40°C:ssa ja jotka koottiin vaiheessa, jolloin mykerön kaikista torvikukista vasta noin 50 % (40 - 60 %) oli auennut.

Nämä kasvit kloonattiin. Tämän lisäksi kasvit (kloonaukseen käytetyt emokasvit) leikeltiin siten, että verson 20 pituudeksi tuli noin 15 cm, ne saatettiin 8-10 tunnin päi-vänpituuteen ja 12-14°C:seen uusien verso jen muodostamiseksi (lyhyiden sivukasvaimien muodostamiseksi). Kääpiöversot leikattiin ja pantiin turve-hiekka-seokseen. Noin 100 %:n suhteellisessa ilmankosteudessa, 15°C:n ilman lämpötilassa 25 ja 14 tunnin päivänpituudessa pistokkaiden juurtuminen kesti 7-14 päivää.

Kuvatun, tavanomaisen kloonauksen (pistokaslisäys) sijasta voidaan myös käyttää kasvin jakaantumiskykyisten kudososien lisäystä in vitro (niin sanottua kasvusolukko-30 lisäystä). Kamomillasaunioviljelmän perustamiseen soveltu vat kasvin erilaiset osat, etupäässä latvakasvaimet tai hankasiImut.

Sen jälkeen kun kasvit oli huuhdottu I^C^lla aseptisissa olosuhteissa "laminaari-virtauksessa" (suurteho-35 leiju-suodatin vähäturbulenssisin poistotyöntövirtauksin), poistetaan lehtihankasiImujen versonhuiput ja siirretään ne koeputkiin, jotka on täytetty elatusaineella, joka on valmistettu esimerkiksi Murashigen ja Skoogin mukaan (Physiol. Plant. 51, 473-497, 1962). Koeputket asetetaan ilmastet- 17 80982 tuun huoneeseen, jossa päivänpituus on 12-18, etupäässä 16 tuntia (joka on saavutettu fluoresenssi-valoaineputkien avulla), valointensiteetti on 500-10 000 luxia, etupäässä 1000-3000 luxia ja lämpötila on 15-30°C, etupäässä 22-27°C. 5 Niin pian kuin siirrännäiset kasvavat hyvin, ne siirretään yllä mainittuun elatusaineeseen, jossa kuitenkin on suurempi sytokiniinikonsentraatio (sytokiniinit ovat kasvihormoneja, jotka edistävät solunjakautumista) (esim.

30 ml/1 N^-isopentenyyliadeniinia) ja vähän tai ei ollenkaan 10 auksiinia (0-0,3 mg/1 indolietikkahappoa). Vastaisuudessa rangat venyvät ja muodostuu myöhäiselimiä sekä enemmän hankasilmuja. Nämä voidaan poistaa ja niitä voidaan kasvattaa edellä mainitulla tavalla.

Kasvien lisäämistä varten suuremmassa määrin siir-15 retään tietyt siirrännäiset (3. työvaihe = 3. lisääntymis-sukupolvi) ensin mainitulla elatusaineella tapahtuneen juurtumisen ja kasvatuksen jälkeen ravintoalustalle, joka sisältää 10 mg/1 indolietikkahappoa tai 3-indolivoihappoa tai 0,1-0,3 mg/1 -naftyylietikkahappoa. Tällöin kasvit 20 juurtuvat, ja ne voidaan noin 4 viikon kuluttua istuttaa steriloidulla puutarhamaalla (12 tuntia noin 120°C:ssa höyrytetyllä) täytettyihin ruukkuihin ja kasvattaa edelleen kasvihuoneessa (olosuhteissa, jotka soveltuvat tavanomaiselle pistokkaista suoritettavalle lisäämiselle).

25 Elatusaine Murashigen & Skoogin mukaan: mg/1 mg/1 NH^NO^ 400 Indolietikkahappo 2,0

Ca(NO-j) 2'4H20 144 Furfuryyliadeniini 0,1 KNO^ 80 Tiamiini 0,1 30 KI^PO^ 12,5 Nikotiinihappo 0,5

MgSOij'7H20 7 2 Pyridoksiini 0,5 KC1 65 Glysiini 2,0

NaFe-EDTA 25 myo-inosiitti 100 H^BO^ 1,6 Kaseiini-hydroly- 1000 33 saatti 3 5

MnS0.*4H-,0 6,5 Sakkaroosi 2 % 4 2

ZnSO.*7H~C> 2,7 Puhdistettu agar-jauhe 1 % KI 0,75 18 80982

Vaihe 2:

Vaiheessa 1 saadut kasvit kukkivat eristetyissä sä olosuhteissa, kasvihuoneessa samanaikaisesti. Kasvit olivat tällöin 11 cm:n suuruisissa ruukuissa, jotka oli 5 täytetty puutarhamaalla, 18-24°C:n päivä- ja 12-14°C:n yö- lämpötilassa. Päivän pituus oli vähintään 14 tuntia, ja vuoden talvipuoliskolla se saavutettiin lisävalaistuksen 2 avulla (200 wattia/m ). Kastelu suoritettiin tarpeen mukaan .

10 Valittujen yksilöiden joukosta koottiin 4 viikon pituisena ajanjaksona jatkuvasti siementen saantia varten ne mykeröt, jotka olivat kukkineet ja olivat juuri putoamaasi Haan. Kuivaus suoritettiin hyvin ilmastetussa hallissa, ilman lämpötilan ollessa 20-30°C; tämän jälkeen 15 siemenet erotettiin siivilän (5 x 0,4 mm) avulla ja puhdistettiin jälkeenpäin viskurin avulla.

Vaihe 3:

Vaiheesta 2 saadusta siemensadosta otettiin pisto-koe, ja tästä kasvatettiin noin 2000 jälkeläistä (ekologi-20 set olosuhteet kuten vaiheessa 2) ja ne valikoitiin vaiheen 1 samanlaisten kriteerien A)-D) mukaisesti. Näin valittujen yksilöiden suhteen meneteltiin vaiheen 2 mukaisesti.

Vaihe 4; 25 Vaiheen 3 mukaisesta siemensadosta kylvettiin osa syksyllä kahdelle erilaiselle kasvupaikalle.

Kasvupaikka I

450 m NN, 48,5° pohjoista leveyttä/11,5° itäistä pituutta, 750 mm vuotuinen sademäärä, kostea-lauhkea 30 ilmasto, tammikuu -10 - 0°C, kesäkuu +10 - +20°C.

NN = pohjoinen normaalinolla = merenpinnan korkeus °N = pohjoista leveyttä (astetta) °0 = itäistä pituutta (astetta) 19 80982

Kasvupaikka II

200 m NN, 42° pohjoista leveyttä/l° itäistä pituutta, 400 min vuotuinen sademäärä, välimerenilmasto, tammikuu 0 - +10°C, kesäkuu +20 - +30°C.

5 Kylvö suoritettiin molemmissa kasvupaikoissa syys kuun lopussa/lokakuun alussa.

Näin saadut kenttäkoe-olosuhteet kokeiltiin uudelleen ja arvioitiin homogeenisen kasvun, kukkien koon ja korjuupäivän suhteen, sitäpaitsi tutkittiin kukkien koe-10 näytteet vaikuttavan aineen pitoisuuden suhteen. Kenttä-kasvusta valittiin uudelleen ne yksilöt, jotka vastasivat vaiheessa 1 mainittuja parametreja. Näistä saadaan siemenet vaiheen 2, viimeisen lauseen mukaisesti.

Vaihe 5: 15 Käyttäen vaiheen 4 mukaisia siemeniä, toistettiin vaiheet 3 ja 4 yllä annetussa järjestyksessä ja esitetyllä tavalla.

Vaihe 6:

Vaiheesta 5 saaduista siemenistä kasvatettiin noin 20 1500 yksilöä (ekologiset olosuhteet kuten vaiheessa 2), ja ne valikoitiin saman periaatteen mukaisesti kuin on esitetty vaiheessa 1. Näin valituista kasveista valittiin 34 yksilöä ja kloonattiin vaiheen 1 mukaisesti. Kunkin kloonin joka kymmenes kasvi istutettiin, jakamalla ne satun-25 naisesti 40 x 30 cm:n etäisyydelle avoimelle maalle (kasvupaikka I, katso vaihe 4), eristettyyn paikkaan. Maa oli lössisavea, pH 7,Q. Istuttaminen suoritettiin kesäkuun alussa, ensimmäinen siemensato saatiin heinäkuun puolivälissä, tämän jälkeen kasveja leikeltiin, ne kukkivat vielä kerran 30 ja tuottivat elokuun puolivälistä elokuun loppuun toisen siemensadon.

Tämän materiaalin siemensadon korjuu suoritettiin vaiheen 2 mukaisesti.

20 80982

Vaiheen 6 mukaiset siemenet ovat keksinnön mukaisen kamomillalajikkeen Manzana lisäämistuote.

Tästä lisäämistuotteesta saatujen kasvien kukat (kylvö syyskuu/lokakuu, sadonkorjuu seuraavan vuoden kesäkuun 5 alussa), jotka poimitaan sinä ajankohtana, jona noin 50 % (40 - 60 %) mykerön torvikukista on avautunut, ja. jotka kuivataan heti sen jälkeen 40°C:ssa 72 tuntia, sisältävät kuivattujen kukkien painosta (kuiva-aineesta) laskettuna esimerkiksi 150 mg% kamatsuleenia, 300 mg% (-)- Ot-bisaboΙοί 0 lia ja enintään 50 mg% muita bisaboloideja.

Muita esimerkinomaisia tietoja esimerkin mukaisesti saaduista, menetelmän mukaisen kamomillalajikkeen kasveista: 1. Kasvu

Yhtenäinen kasvukorkeus (tasaväkisyys) jossa on 15 kapea kukkavyöhyke, sen vuoksi erityisen sopiva mekaaniseen sadonkorjuuseen, suuret kukkamykeröt, keskinkertainen sato.

Muoto: juuresta haaroittunut (3 - 5-kertaisesti);

Varsi: pysty, vähän haaroittunut.

2. Lehdistö 20 Lehti: pariosainen, 2-3 -kertainen;

Vahvuus: keskinkertainen;

Pariliuskainen lehti, väri keskivihreä;

Pariliuskainen lehti (ruotikeskus); liuskaisuus: . keskinkertaisesta voimakkaaseen.

25 3. Kukinto

Mykerö (kukinto): noin 30 mm ulkohalkaisija, noin 15 mm sisähalkaisija;

Yksittäiskukinnon paino (kuiva): noin 45 mg; 30 Kukkaverso, pituus (mm): noin 700, kuitenkin riip puva viljelyseudusta (ilmastosta), kylvökaudesta, maaperästä, lannoituksesta, kasvien käsittelystä ja sääolosuhteista.

Kukinnan alku (vuorokausia tammikuun 1 päivästä lukien): noin 160 vuorokautta (kylvö syyskuussa, kasvupaik-35 ka Freising, Saksan Liittotasavalta, muuten riippuva yllä mainituista tekijöistä).

Il 21 80982

Kukinta :

Kesäkuun keskivaiheilla (katso edellä);

Kukinnot ilman vartta, eteerisen öljyn pitoisuus (% kuiva-aineesta): noin 1,0 %; atsuleenin pitoisuus etee-5 risessä öljyssä: vähintään 15 %;

Kuivattujen kukintojen, kukkarohdoksen hajoaminen on vähäinen, jos sadonkorjuu on suoritettu ennen viimeisten torvikukkien avautumista;

Siitepölyhiukkasten halkaisija: noin 30 Jim; 10 siementen pituus: noin 1,25 mm; somaattisten solujen kromosomiluku: 4n : 36; 4. Sato

Tuhannen siemenen massa (TKM): 0,06 - 0,13 g; 5. Itävyys (KF) 15 75 % 6. Puhtaus 94 - 95 % 7. Muita tuntomerkkejä

Kuivatussuhde tuore: kuiva (kukat) = 5,5 - 6:1, roh-20 dokselle ominainen arominen tuoksu, hienosti arominen tyypillinen teeuutteen maku.

Rohdoksen valmistus

Yllä kuvatulla tavalla saatu kamomilla kylvetään tavanomaiseen tapaan. Kun kasvit ovat kehittyneet ja mykeröt 25 ovat kasvuvaiheessa, jossa noin 50 % torvikukista on avautunut, mykeröt kerätään kamomillapoimurilla, jolloin poi-murin kampa säädetään siten, että vain ne mykeröt, joiden torvikukat ovat 50-% : isesti auenneet, poimitaan. Sato viedään mahdollisimman pian varjoon, jossa se levitetään ohueksi 30 kerrokseksi. Lopuksi mykeröt erotetaan varsista siivilöin-tilaitteessa ja kuivataan, kunnes paino pysyy vakiona.

Noin 80 % painosta menetetään. Kuivaus tapahtuu varjossa, hyvin tuuletetussa paikassa, parvella, noin 10 cm:n kerroksina.

35 Noin 2-3 päivän kuluttua kuivaus lopetetaan. Varsi- osien ja kukkamurskan erottamiseksi kuivunut aines siivilöidään ja puristetaan lopuksi paaleiksi.

22 8 o y 8 2

Analyysiarvot: eteerinen öljy 950 mg% kamatsuleeni 150 mg% (-)- od-bisabololi 300 mg% 5 Jos kuivaus suoritetaan esimerkiksi stationäärises- sä hihnakuivauslaitteessa keinotekoisesti lämmitetyllä ilmalla, lämpötilan ollessa välillä 50°C ja 60°C, kuivaus lopetetaan noin 4 tunnin kuluttua. Varsiosien ja kukka-murskan erottamiseksi kuivunut aine siivilöidään ja pu-10 ristetään lopuksi paaleiksi. Tällaisen rohdoksen analyysi-arvot ovat esimerkiksi: eteerinen öljy 850 mg% kamatsuleeni 80 mg% (-) - oi.-bisabololi 200 mg% 15

Liite A

Eteerisen öljyn valmistus Lähtöaine on Manzana-kamomillalajikkeesta saatu rohdos . Rohdoksen valmistamiseen käytetään vain sellaisia kukka-20 mykeröitä, joiden torvikukista on avautunut 30-70%, erityisesti 40-60 %. Kuivatus tapahtuu kuivatuskaapissa 40°C:ssa 72 tunnin kuluessa. Kamomillan kukkien eteerinen öljy saadaan kuten seuraavassa on kuvattu rohdoksen kaksituntisella vesihöyrytislauksella.

25 2,0 g hienontamatonta rohdosta pannaan 1 litran pyö- röpohjakoiviin yhdessä 250 ml:n kanssa vettä, josta on poistettu suola ja suoritetaan kaksituntinen palautustis-laus Clevenger-laitteessa (vesihöyrytislaus-palautuslait-teisto eteerisen öljyn pienten määrien määrittämiseksi).

30 Keräysaineena käytetään 1 ml pentaania analyysejä varten. Palautusnopeus on 40 +4 tippaa/minuutti. Tislauksen päätyttyä kaadetaan pentaaniin liuennut eteerinen Öljy mahdollisimman vedettömänä koeputkeen ja mahdollisesti jäljellä oleva laitteistoon tarttunut eteerinen öljy huuhdo-35 taan pentaanilla. Mahdollisten vesijäämien poistamiseksi lisätään liuokseen spaatelinkärjellinen kuivattua Na2SO^ ja liuos suodatetaan sen jälkeen lasisintterin läpi, jonka huokoisuus on D 3 tai D 4, pyöröreunapulloon. Kun pen-taani on haihdutettu pois 40°C:ssa vesihauteella ja sen 23 8 0 9 3 2 jälkeen on kuivattu eksikkaattorissa, määritetään öljymää-rä gravimetrisesti.

Näin saadusta öljystä (n. 20 mg) määritetään sen jälkeen kamatsuleeni ja bisabololi.

5 Kamatsuleenin spektrofotometrinen määritys

Mittaliuos: 2 g:sta rohdosta saatu eteerinen öljy (saatu kuten edellä on kuvattu) liuotetaan kokonaan (n. 20 mg) 25 ml:aan n-heksaania 10 tai sykloheksaania.

Mittalaite: Suodatinfotometri (esimerkiksi

Eppendorf).

Aallonpituus: 578 nm

Kyvetti: 1 cm 15 Kamatsuleenin spesi finen ekstinktio (1 g/100 ml; 1 cm): 20,8

Kompensointineste: n-heksaani tai syklohek- saani 20 Todettu kamatsuleeni- pitoisuus, mg/100 g 120jE^7g

Mikäli mittaukseen ei ole käytettävissä suodatin-fotometriä, voidaan määritys suorittaa myös spekt-25 rofotometrillä:

Mittalaite: Spektrofotometri (esimer kiksi PM Q II / tai PM Q III "ZEISS") 30 Aallonpituus: 605 nm

Kyvetti: 1 cm

Kamatsuleenin spesifinen ekstinktio (1 g/100 ml; 1 cm): 24,5 35 Kompensointineste: n-heksaani tai syklohek- saani

Todettu kamatsuleeni-pitoisuus, mg/100 g: 102;EgQg

Mittaliuoksesta määritetään sen jälkeen bisabololi.

24 80982

Bisabololin ja muiden bisaboloidien kaasukromatografinen määritys

Kaasukromatografi: Hewlett Packard Modell 5750, 5 Erba Fractovap 2350 tai sen kaltainen laite

Detektori: Liekki-ionisaatiodetektori

Kantajakaasu: Helium

Kolonni: <·ν0,32 cm(l/8"); 200 cm; teräs 10 Kolonnin täyte: 3 % nitriilisilikonikumi "XE 60" piigeelillä kantajana silanisoitu "Chromosorb WAW HP" 125 - 150 pn Lämpötila:

15 Detektori 320°C

Syöttösuutin: 220°C

Kolonni: 85 - 220°C

Lämpötilaohjelmointi: 4°/minuutti Näyteliuos: Käytetään kamatsuleenin mit- 20 taliuosta

Vertailuliuos: Noin 15 mg standardi-bisabo- lolia liuotetaan sykloheksaa-niin 25 ml:ksi

Syöttömäärä: Näyteliuoksesta ja vertailu- 25 liuoksesta kummastakin 5 μΐ

Arvostelu: Arvostelu tapahtuu huippujen pinta-alavertailun avulla

Bisabololin pitoisuus milligrammoina 30 100 g:ssa rohdosta: 10 x punnittu määrä(vertailu)

Cm C x

Pinta-alanäyte

Pinta-alavertailu

II

25 80982

Muiden bisaboloidien määritys voi samoin tapahtua kaasukromatografisesti, esimerkiksi seuraavissa koe-olosuh-teissa:

Laite: Packard, Modell 7721, 5 Serie 800, tai vastaavas ti Erba Fractovap Serie 2350

Kolonnit: Lasikolonnit, 3 m/2 mm halkaisija; 2 m/2 mm hal-10 kaisija Täyte: 3 % metyylifenyylisiliko- nikumi "OV 1” piigeelillä kantajana silanisoitu "Gashrom Q" 125 - 150 pm 15 Kantajakaasu: 30 ml/minuutti ^ Lämpötilaohjelmointi: 80°C:sta 180°C:seen 2,5 (3)°C minuutti

Injektio/detektori-

lämpötila: 200°C

20 Detektori: liekki-ionisaattoridetek- tori

Syöttömäärä: n. 2 pl noin suhteessa 1:50 laimennettua eteeristä öljyä 25

Arvostelu tapahtui osaksi ilman, osaksi käyttäen sisäistä standardia. Sisäiseksi standardiksi sopivat lau-riinihapon metyyliesteri tai heksadekaani kamatsuleeniköy-hille näytteille, öljyille, joiden kamatsuleenipitoisuus 30 on yli 5 %, on tämä katsottava paremmaksi sisäisenä standardina, jolloin pitoisuusmääritys tapahtuu fotometrisesti (578 nm:ssä).

Claims (5)

26 80982

1. Menetelmä viljelykasvilajin aito kamomilla (Cha-momilla recutita (L.) Rauschert, synonyymi Matricaria cha-5 momilla L., Asteraceae) uuden tetraploidisen kamomillala- jikkeen (nimitys Manzana) valmistamiseksi, jonka 40°C:ssa kuivatut kukat sisältävät kuiva-aineesta laskettuna vähintään 150 mg% kamatsuleenia, vähintään 300 mg% (-)-a-bis-abololia ja vähemmän kuin 50 mg% muita bisaboloideja, 10 tunnettu siitä, että diploidinen kamomillalajike DEGUMILL tetraploidisoidaan kemikaaleilla lämpötilassa 0 -35°C; gammasäteillä, röntgensäteillä tai UV-säteillä lämpötilassa 0 - 35°C; korkeiden lämpötilojen 33 - 50°C avulla; tai alhaisten lämpötilojen 0 - 5°C avulla; ja tetra-15 ploidisoinnin jälkeen a) suoritetaan tetraploidisten kasvien valinta te- hoainepitoisuuden (vähintään 150 mg% kamatsuleenia, vähintään 300 mg% bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg% muita bisaboloideja, kaikki laskettuna kuiva-aineesta), samanai- 20 kaisen kukintajakson, tasaisen juuresta lähtevän haaroit- tuneisuuden sekä 25 - 35 mm:n kukkamykeröiden suuruuden perusteella, siten valitut kasvit kloonataan ja kloonauksella saaduista kasveista otetaan siemen, b) näin saadusta siemenestä kasvatetaan jälkeläi- 25 siä, minkä jälkeen suoritetaan valinta kohdan a) mukaises ti ja valikoiduista kasveista otetaan taas siemen, c) kohdan b) mukaiset toimenpiteet toistetaan 2-4 kertaa, d) kohdan c) mukaisesti saadusta siemenestä kasva- 30 tetaan jälkeläisiä, näistä suoritetaan valinta kohdan a) mukaisesti, siten valitut kasvit kloonataan ja kloonauksella saaduista kasveista otetaan siemen, ja tästä lajikkeesta saaduista kamomillakasveista otetaan mahdollisesti lisäämistuote ja/tai tehdään kamomillarohdos. 27 80982

2. Menetelmä kamomillarohdoksen valmistamiseksi käyttäen patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettua uutta tetraploidista kamomillalajiketta (nimitys Manzana), tunnettu siitä, että kamomillojen kukat kerätään 5 kasvuvaiheessa, jossa vasta 30 - 70 % kukkamykeröiden tor- vikukista on avautunut ja kukat kuivataan enintään 50°C:n ilmanlämpötilassa.

3. Menetelmä kamomillarohdoksen valmistamiseksi käyttäen patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettua 10 uutta tetraploidista kamomillalajiketta (nimitys Manzana), tunnettu siitä, että saadut kamomillakasvit lisätään edelleen ja että kukat kerätään siinä kasvuvaiheessa, jossa 30 - 100 % kukkamykeröiden torvikukista on avautunut ja kukat kuivataan enintään 60°C:n lämpötilassa, jolloin 15 saadaan kuivaa materiaalia, joka sisältää vähintään 120 mg% kamatsuleenia, vähintään 200 mg% ( -)-a-bisabololia ja vähemmän kuin 50 mg% muita bisaboloideja.

4. Menetelmä alkoholipitoisten kamomillauutteiden tai eteerisen kamomillaöljyn valmistamiseksi käyttäen pa- 20 tenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettua tetraploidista kamomillalajiketta tai sen kuivattuja kukkia, tunnettu siitä, että alkoholeilla uuttamalla saadut uutteet sisältävät vähintään 5 mg% kamatsuleenia ja vähintään 15 mg% (-)-α-bisabololia ja vähemmän kuin 8 mg% muita bis-25 aboloideja, ja veden läsnäollessa tislaamalla saatu etee rinen öljy sisältää vähintään 5 % kamatsuleenia ja vähintään 15 % (- )-a-bisabololia ja vähemmän kuin 10 % muita bisaboloidej a.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistetun 30 tetraploidisen kamomillalajikkeen tai sen kuivattujen kuk kien käyttö alkoholipitoisten kamomillauutteiden valmistukseen tai eteerisen kamomillaöljyn valmistukseen. 28 80982