SK288189B6 - Enzymatické cyklické stanovenie homocysteínu a cystationínu - Google Patents

Abstract

Tento vynález poskytuje enzymatické cyklické kvantitatívne stanovenie homocysteínu a/alebo cystationínu v roztokoch, ako je krv, krvné deriváty a moč. Stanovenie predstavujú stupne spočívajúce v kontaktovaní roztoku obsahujúceho homocysteín a/alebo cystationín v reakčnej zmesi s CBS alebo jeho derivátom, L-serínom a CBL alebo jeho derivátom na čas postačujúci na katalýzu cyklickej konverzie homocysteínovej formy na cystationín a spätnej konverzie cystationínu na homocysteín za vzniku pyruvátu a amoniaku, v stanovení množstva homocysteínu a/alebo amoniaku prítomných v reakčnej zmesi a určení množstva homocysteínu a/alebo cystationínu prítomných v roztoku na základe množstva vzniknutého pyruvátu a/alebo amoniaku. Taktiež sa poskytujú expresívne vektory a izolačné postupy pre CBS alebo jej deriváty a CBL alebo jej deriváty rovnako ako testovacie súpravy na uskutočňovanie stanovenia. Vo výhodnom uskutočnení sa stanovenia môžu vykonávať v intervale 15 minút alebo menej s minimálnou spotrebou enzýmu.

Description

Vysoké koncentrácie homocysteínu v ľudskej plazme znamenajú vysoké riziko koronárneho ochorenia srdca, mŕtvice, artériosklerózy a ďalších chorôb. Preto je žiaduce vykonávať radové testy zvýšených obsahov tejto aminokyseliny v populácii. Na uľahčenie tohto testovania vo veľkom rozsahu je nutné vyvinúť dobre vykonateľné, nové a menej nákladné skúšky.

Doterajší stav techniky

Obsah homocysteínu v plazme sa bežne meria vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) a kombináciou plynová chromatografia/hmotnostná spektrometria (GC/MS) pri nákladoch nad 100 dolárov na jeden test, čo tieto spôsoby fyzikálnej separácie robí príliš drahými na prieskum v rozsahu celej populácie. Napríklad je možné pripraviť vzorky moču a krvi na chromatografiu aminokyselín a L-homocysteín a zisťovať separáciou a detekciou chromatografiou HPLC. Fiskerstrand a ďalší opisujú (Clin. Chem., zv. 39, s. 263 až 271 (1993)) zisťovanie L-homocysteínu pomocou fluorescenčného značenia sérových tiolov, po ktorom nasleduje separácia pomocou HPLC a detekcia derivátov L-homocysteínu z rôznych iných sírnych zlúčenín. Tieto spôsoby však sú v typickom prípade časovo náročné, nákladné a pre niektoré laboratóriá neuskutočniteľné.

Tiež boli vyvinuté nepriame imunologické testy na homocysteín, ale tieto spôsoby využívajúce protilátky sú pri asi 24 dolároch na test dosiaľ pomerne nákladné. Jeden z týchto nepriamych imunotestov mení enzymatický homocysteín na adenozylhomocysteín a množstvo adenozylhomocysteínu sa stanoví kompetitívnym testom ELISA (imunotest viazaný na enzým) pomocou protilátky proti adenozylhomocysteínu (príklad uvádza patent USA 5 827 645, ktorého obsah je tu zahrnutý vo forme odkazu).

Na kvantitatívne stanovenie L-homocysteínu sa vyvinuli nepriame enzymatické stanovenia. K testovanej vzorke sa napríklad pridáva enzým S-adenozylhomocysteínhydroláza a adenozín. Výsledná koncentrácia adenozínu v reakčnej zmesi alebo jej zmena slúži ako indikátor pre počiatočnú koncentráciu homocysteínu vo vzorke.

Na meranie množstva homocysteínu boli tiež opísané priame enzymatické stanovenia. V typickom prípade tieto postupy ireverzibilné konvertujú homocysteín na iné zlúčeniny, ktoré je možné kvantitatívne stanoviť. Napríklad sa použil enzým homocysteíndehydratáza na odstránenie sulfhydrylovej skupiny z homocysteínu. Potom sa zmerala koncentrácia odstránenej sulfhydrylovej skupiny. Hlavným nedostatkom tohto enzymatického stanovenia a ďalších enzymatických stanovení homocysteínu je, že použité enzýmy reagujú s inými aminokyselinami a zlúčeninami obsahujúcimi síru a príbuznými s homocysteínom, čo vedie k vysokému a nekonzistentnému „absorpčnému pozadiu“ a meranie homocysteínu v plazme je nepresné.

Enzymatické (alebo enzýmové) cyklické stanovenia boli opísané pre veľmi malý počet analytov. Pri enzymatickom cyklickom stanovení sa používa aktivita dvoch alebo viacerých enzýmov, ktoré recyklujú substrát a stanovovanú zlúčeninu nekonvertujú ireverzibilné. Namiesto toho sa uvedená zlúčenina pri tomto stanovení používa ako katalyzátor na reguláciu rýchlosti konverzie na uvedenú kvantitatívne stanovovanú zlúčeninu. Preto si príslušný analyt udržuje rovnovážnu koncentráciu, ktorá je dostatočne nízka, aby reakčná rýchlosť bola pseudoprvého rádu. Tým je daný lineárny vzťah rovnovážnej koncentrácie analytu k rýchlosti celého stanovenia. Pri meraní reakčných rýchlostí sa ľahko stanoví množstvo analytu. Enzymatické cyklické stanovenia sa niekedy nazývajú amplifikačné stanovenia, pretože tieto spôsoby typicky zvyšujú citlivosť merania analytu 100 až 1000 x. Amplifikované meranie je priamym dôsledkom toho, že sa neznižuje rovnovážna koncentrácia zlúčeniny. Na meranie homocysteínu nebolo doposiaľ opísané žiadne enzymatické cyklické stanovenie.

Tento vynález ponúka enzymatické cyklické stanovenie pre homocysteín a/alebo cystationín, ktoré je menej nákladné a umožňuje väčší počet stanovení za časovú jednotku (vyššiu produktivitu analytického pracoviska) než dnes dosiahnuteľné stanovenia. Vynález ďalej poskytuje spôsoby a vektory na rekombinantnú prípravu enzýmov, ktoré je možné použiť pri príprave reagentov na túto analýzu, a tiež ponúka testovacie súpravy na zisťovanie množstva homocysteínu a cystationínu vo vzorke.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje spôsob enzymatického cyklického stanovenia množstva homocysteínu alebo cystationínu v roztoku. Tento spôsob využíva reakciu homocysteínu a L-serínu za vzniku cystationínu účinkom enzýmu cystationín-p-syntázy (CBS) alebo jej derivátu a enzymatickú konverziu cystationínu na homocysteín, pyruvát a amoniak účinkom cystationín-p-lyázy (CBL). Tento spôsob stanovenia poskytuje rovnovážnu koncentráciu homocysteínu a/alebo cystationínu, ktorá je v lineárnom vzťahu k rýchlosti celkovej re2

SK 288189 Β6 akcie. Množstvo homocysteínu a/alebo cystationínu stanovené vo vzorke je určené množstvom vytvoreného pyruvátu a/alebo amoniaku alebo množstvom serínu odstráneného z reakčnej zmesi. Roztoky, ktoré je možné analyzovať spôsobom podľa tohto vynálezu, môžu zahŕňať laboratórne vzorky krvi, krvného séra, plazmy, moču a iných biologických vzoriek. Okrem toho je možné testovať akúkoľvek ďalšiu kvapalnú vzorku.

V jednom uskutočnení tento vynález poskytuje spôsob stanovenia množstva homocysteínu a/alebo cystationínu v roztoku, ktorý pozostáva z týchto stupňov;

a) uvedenie roztoku obsahujúceho homocysteín a/alebo cystationín (buď pred, alebo po stupni redukcie disulfidu) do kontaktu s CBS alebo jej derivátom, L-serínom a CBL alebo jej derivátom na vytvorenie reakčnej zmesi na čas potrebný na to, aby sa katalyzovala cyklická konverzia homocysteínu na cystationín a rekonverzia cystationínu na homocysteín za vzniku pyruvátu a amoniaku;

b) stanovenie množstva pyruvátu a/alebo amoniaku prítomného v reakčnej zmesi; a

c) stanovenie množstva homocysteínu a/alebo cystationínu prítomného v roztoku na základe určenia množstva pyruvátu a/alebo amoniaku.

Tento spôsob najmä umožňuje zistenie množstva homocysteínu pridaním lacnej aminokyseliny L-serínu. Množstvo pyruvátu v reakčnej zmesi je možné merať rôznymi spôsobmi. V jednom špecifickom uskutočnení tohto vynálezu sú v reakčnej zmesi prítomné laktátdehydrogenáza (LDH) alebo jej derivát a NADH (redukovaný nikotínamidový kofaktor) alebo jeho derivát. LDH konvertuje v prítomnosti NADH pyruvát na laktát, pričom prebieha oxidácia NADH na NAD⁺ (oxidovaný nikotínamidový kofaktor).

Oxidácia NADH na NAD⁺ sa môže sledovať množstvom spôsobov v odbore známych vrátane monitorovania reakčnej zmesi na vlnovej dĺžke 340 nm. Vznik NAD⁺ sa tiež môže sledovať podľa oxidácie farbiva prejavujúcej sa pozorovateľnou zmenou farby. Farbivá výhodné na použitie v tomto vynáleze zahŕňajú okrem iného 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoovú kyselinu), 2,6-dichlórfenylindolenol, tetrazóliové zlúčeniny, fenazínmetosulfát, metylviologén alebo deriváty ktoréhokoľvek z týchto farbív. Množstvo homocysteínu a/alebo cystationínu prítomných v roztoku je úmerné intenzite pozorovanej farby v porovnaní so štandardnou krivkou konštruovanou pre vzorky so známou koncentráciou analytu.

V alternatívnom uskutočnení sa na zistenie množstva pyruvátu prítomného vo vzorke používa pyruvátoxidáza s chrenovou peroxidázou v prítomnosti peroxidu vodíka a chromogénu. Výhodnými chromogénmi pre túto kolorimetrickú reakciu sú A-etyl-/V-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidín (TOOS) a ďalšie deriváty N-etyl-/V-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-anilínu. Rovnako ako vyššie je množstvo homocysteínu a/alebo cystationínu prítomných v roztoku úmerné intenzite pozorovanej farby v porovnaní so štandardnou krivkou konštruovanou pre vzorky so známou koncentráciou analytu.

Množstvo homocysteínu a/alebo cystationínu prítomných v roztoku sa tiež môže merať na základe množstva amoniaku prítomného v reakčnej zmesi. Je celý rad spôsobov stanovenia koncentrácie amoniaku v roztoku. V jednom konkrétnom uskutočnení podľa tohto vynálezu sa množstvo amoniaku meria s pomocou bežne prístupného štandardného amoniakového senzora.

V inom uskutočnení je tento vynález zameraný na spôsob stanovenia množstva homocysteínu a/alebo cystationínu vo vzorke, ktorý zahŕňa stupne kontaktovania roztoku s redukčným činidlom na čas dostatočný na redukovanie v podstate všetkého homocysteínu a ďalších disulfidov prítomných v roztoku homocysteínu. Reakcia s redukčným činidlom môže tiež spôsobiť uvoľnenie homocysteínu viazaného na proteín (a ďalších molekúl prítomných v roztoku) disulfidickými väzbami. Po tejto redukcii prichádza roztok do styku s CBS alebo jeho derivátom, L-serínom a CBL alebo jeho derivátom a to na čas potrebný na katalýzu cyklickej konverzie homocysteínu na cystationín a konverzie cystationínu na homocysteín za vzniku pyruvátu a amoniaku. Na zistenie množstva homocysteínu a/alebo cystationínu prítomného v roztoku stačí stanoviť množstvo pyruvátu a/alebo amoniaku prítomného v reakčnej zmesi, ako je uvedené. Výhodnými redukčnými činidlami na použitie v tomto vynáleze sú borohydridové soli a tiolové redukčné činidlá. Typické tiolové redukčné činidlo vhodné na použitie v tomto uskutočnení predstavuje ditioerytritol (DTE), ditiotreitol (DTT), β-merkaptoetanol (βΜΕ)), tris-(karboxyetyl)fosfinhydrochlorid (TCEP) alebo tiooctová kyselina, alebo akýkoľvek jej derivát a podobne.

V ešte inom uskutočnení stanovenia množstva homocysteínu a/alebo cystationínu prítomného v roztoku je možné predbežne kontaktovať roztok s cystationín-y-lyázou (CGL) alebo jej derivátom na čas potrebný na odstránenie všetkého cystationínu z reakčnej zmesi konverziou cystationínu na α-ketoglutarát. Po odstránení cystationínu sa z reakčnej zmesi odstráni cystationín-y-ylyáza alebo sa odbúra. V typickom uskutočnení sa cystationín-y-lyáza odbúra zahriatím roztoku na čas dostatočný na zásadné odstránenie jej enzymatickej aktivity. Cystationín-y-lyáza sa tiež môže imobilizovať na nerozpustnom substráte alebo na povrchu, ako sú napríklad mikročastice alebo guľôčky, ktoré je možné ľahko odstrániť.

V ešte inom uskutočnení tohto vynálezu sa uplatňuje spôsob zisťovania množstva homocysteínu alebo cystationínu prítomných v roztoku, ktorý spočíva v reakcii roztoku s L-serínom a CBS alebo jeho derivátom a CBL alebo jeho derivátom, imobilizovanými na pevnom povrchu. Pevný povrch môže predstavovať napríklad papier, filtračný papier, nylon, sklo, keramika, oxid kremičitý, oxid hlinitý, diatomit, buničinu, polymetakrylát, polypropylén, polystyrén, polyetylén, polyvinylchlorid a ich deriváty. Pevný povrch môžu predsta3 vovať strany a dno experimentálnej nádoby alebo materiál pridaný do experimentálnej nádoby. Vo výhodnom uskutočnení pevný povrch tvoria guľôčky pridané do experimentálnej nádoby.

CBS alebo jeho derivát, CBL alebo jeho derivát a cystationín-y-lyáza alebo jej derivát, používané podľa tohto vynálezu, je možné získať ako surový extrakt z buniek. V jednom uskutočnení tohto vynálezu sa cystationín-p-syntáza (CBS) alebo jej derivát, cystationín-p-lyáza CBL a/alebo cystationín-y-lyáza (CGL) získavajú prečistením z ľudských alebo bakteriálnych buniek alebo z kvasiniek. Vo zvlášť výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sa gény kódujúce enzýmy izolujú alebo syntetizujú a exprimujú sa ako rekombinantný proteín v hostiteľských bunkách. Najmä sa dáva prednosť tomu, aby sa do génového konštruktu pridala sekvencia DNA kódujúca peptidovú sekvenciu s fúnkciou afmitného značenia (affmity tag) a napomohla prečisteniu a/alebo detekcii rekombinantne vzniknutých enzýmov. Rekombinantné postupy je možné použiť aj na získanie fúznych proteínov, ktoré obsahujú enzýmové aktivity CBS a CBL v jedinej bielkovine. Afmitné peptidové značenie (affinity tag) môže tiež byť časťou konštruktu fúzneho proteínu, aby pomohlo pri prečistení fúzneho proteínu.

Tento vynález tiež poskytuje taký spôsob na zisťovanie množstva homocysteínu vo vzorke, pri ktorom koreluje množstvo komplexu homocysteín/transkripčný faktor viazaného na konvenčnú polynukleotidovú väzbovú sekvenciu. V špecifickom uskutočnení tento spôsob zahŕňa kontaktovanie vzorky s redukčným činidlom na čas potrebný na uvoľnenie homocysteínu z väzby s akýmkoľvek proteínom, kontaktovanie redukovaného homocysteínu s transkripčným faktorom viažucim homocysteínový metabolit v podmienkach napomáhajúcich tvorbe komplexu, primiešanie vzorky do konvenčnej polynukleotidovej sekvencie špecificky rozpoznávanej komplexom homocysteín/transkripčný faktor a stanovenie množstva homocysteínu obsiahnutého vo vzorke z množstva komplexu homocysteín/transkripčný faktor viazaného na konvenčnú polynukleotidovú sekvenciu. Redukčné činidlá použiteľné v tomto spôsobe zahŕňajú soľ borohydridu alebo tiolové redukčné činidlá vrátane ditioerytritolu (DTE), ditiotreitolu (DTT), β-merkaptometanolu, tris-(karboxyetyl)fosfínu (TCEP) alebo tiooctovej kyseliny alebo akejkoľvek ich soli. Transkripčný faktor viažuci homocysteínový metabolit zahŕňa MetR z E. coli rozpoznávajúci konvenčnú polynukleotidovú sekvenciu, napríklad polynukleotidovú sekvenciu opísanú v SEQ ID č.: 11 (Marconi a ďalší, Biochem. Biophys. Res. Commun., zv. 175. ss. 1057- 1063 (1991)) alebo jej derivát.

Ďalšie uskutočnenie tohto vynálezu predstavuje testovacia súprava obsahujúca nádobu na roztok, v ktorom sa má zisťovať množstvo homocysteínu a/alebo cystationínu, L-serín, CBS alebo jeho derivát, CBL alebo jeho derivát a akýkoľvek pufer, pomocné látky a rozpúšťadlá potrebné na zaistenie podmienok umožňujúcich vysokú aktivitu enzýmov. Testovacia súprava môže ďalej obsahovať laktátdehydrogenázu alebo jej derivát a NADH alebo jeho derivát. NADH je možné merať priamo na vlnovej dĺžke 340 nm alebo sa môže pridať farbivo schopné privodiť farebnú zmenu v dôsledku oxidácie. Množstvo homocysteínu a/alebo cystationínu zodpovedá zmene priebežne meranej absorbancie.

Vo výhodnom uskutočnení sa enzýmy aplikujú imobilizované na pevnom podklade. Tento pevný podklad môže predstavovať povrch nádoby, ktorá obsahuje testovanú vzorku, alebo to môže byť guľôčka alebo iný predmet vložený do nádoby. V ďalšom uskutočnení tohto vynálezu sa môže aplikovať cystationín-y-lyáza ako súčasť testovacej súpravy na odstránenie cystationínu z testovaného roztoku pred uskutočnením enzymatického cyklického stanovenia. Pred pridaním zostávajúcich komponentov potrebných na enzymatickú cyklizáciu homocysteínu sa musí v reakčnej zmesi odstrániť alebo zničiť prakticky všetka aktivita cystationín-ylyázy alebo jej derivátu.

Zistilo sa, že výhodný spôsob stanovenia podľa vynálezu sa môže uskutočniť za pomerne krátky čas a s pomerne malými množstvami enzýmu, takže tento spôsob má značné komerčné výhody. Výhodný spôsob stanovenia napríklad zahŕňa vytvorenie reakčnej zmesi obsahujúcej vzorku s homocysteínom, serín, CBS, CBL, laktátdehydrogenázu, NADH a redukčné činidlo, ako je DTE alebo DTT, pričom pomer CBS/CBL v zmesi je od asi 1 : 1 do asi 25 : 1, výhodnejšie asi 1 : 10 a najvýhodnejšie od asi 2 : 1 do asi 5 : 1. Ďalšou výhodou je, že sa zistilo, že redukčné činidlo môže byť v zmesi obsiahnuté spolu s detekčným systémom (to znamená laktátdehydrogenázou a NADH) bez toho, aby to malo nepriaznivé účinky na stanovenie. Preto sa toto stanovenie podľa vynálezu môže vykonávať bez oddeleného stupňa redukcie, čím sa ušetrí čas potrebný na celý test. Preto môže byť časový interval medzi stupňom vytvorenia reakčnej zmesi a reakciou iba 10 až 50 sekúnd (pri celkovom reakčnom čase pre danú vzorku do asi 20 minút) v tých prípadoch, keď sa takto testuje väčší počet vzoriek postupným vytváraním v nádobe (napríklad v kyvete spektrofotometra) reakčnej zmesi, ktorú tvorí vzorka, serín, CBS, CBL, laktátdehydrogenáza, NADH a redukčné činidlo, a meraním množstva pyruvátu v reakčnej zmesi priebežným sledovaním vzniku NAD⁺. Ešte výhodnejšie je, že celkový reakčný čas pre danú vzorkuje do asi 15 minút a ešte výhodnejšie už asi 13 minút. V prípade pomalších prístrojov tak môže byť celkový počet testovaných vzoriek za hodinu 15-30, ale pre rýchlejšie prístroje až 200 až 400 vzoriek. V tomto výhodnom stanovení sa pripraví prvá reakčná zmes obsahujúca vzorku, serín, laktátdehydrogenázu, NADH a redukčné činidlo a ponechá sa inkubačný čas potrebný na uvoľnenie väčšiny (a výhodnejšie všetkého) homocysteínu (celkový homocysteín) prítomného vo vzorke vo viazanom, oxidovanom a/alebo voľnom stave. Potom sa pridajú CBS a CBL na kompletizáciu reakčnej zmesi a začatie enzymatickej cyklickej reakcie medzi homocysteínom a/alebo cystationínom.

V inom výhodnom uskutočnení sa môže cystationín použiť vo funkcii kalibrátora na stanovenie enzýmu (pretože pri enzymatickom cyklickom stanovení prebieha vzájomná konverzia homocysteínu a cystationínu). Inými slovami, v opísanom systéme stanovenia je možné použiť známe koncentrácie cystationínu na kalibráciu alebo štandardizáciu stanovenia a/alebo prístroja, čo umožňuje kvantifikáciu výsledkov testovania vzorky. Pri tomto uskutočnení sa k biologickej vzorke pridá známa koncentrácia cystationínu, a potom sa podrobí testu používanému v jednom z ostatných uskutočnení. Výsledok sa použije na vytvorenie kalibračnej krivky, ktorá sa potom použije na vynesenie diagramu pre homocysteín (vzhľadom na vysoký stupeň korelácie medzi oboma líniami). Alternatívne je možné známe koncentrácie cystationínu použiť na kontrolu kvality činidiel a správneho spôsobu stanovenia. Pri uskutočňovaní tejto kontroly kvality sa tieto „známe“ koncentrácie cystationínu určujú, ako keby šlo o neznáme vzorky, a výsledky sa porovnávajú s ich známymi a očakávanými hodnotami s cieľom overiť správnu funkciu systému stanovenia.

Výhodné stanovenia sa uskutočňujú s izolovanými (purifikovanými) enzýmami CBL a CBS, ktoré sa vyznačujú najmenej asi 80 % (a výhodne asi 90 %) sekvenčnou identitou s enzýmami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z SEQ ID č. 19 a 20. Tu sa používa v odbore známy termín sekvenčná identita na charakterizáciu stupňa príbuznosti medzi dvoma alebo viacerými proteínovými alebo polypeptidovými sekvenciami alebo dvoma alebo viacerými polynukleotidovými sekvenciami, totiž referenčnou sekvenciou a danou sekvenciou porovnávanou s referenčnou sekvenciou. Sekvenčná identita sa stanoví porovnaním danej sekvencie s referenčnou sekvenciou, ale predtým sa sekvencie optimálne usporiadajú tak, aby dosiahli čo najväčší stupeň sekvenčnej podobnosti určenej zhodou medzi reťazcami takých sekvencií. Po tomto usporiadaní sa sekvenčná totožnosť zisťuje ako „poloha po polohe“, takže sekvencia je napríklad identická v určitej polohe, ak sú v tejto polohe identické nukleotidy alebo zvyšky aminokyselín. Celkový počet takých polohových identít sa potom delí celkovým počtom nukleotidov alebo zvyškov v referenčnej sekvencii a získa sa % sekvenčnej identity. Sekvenčná identita sa môže ľahko vypočítať známymi spôsobmi vrátane tých (ale nie iba na ne obmedzených), ktoré opisuje Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., vyd. Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., vyd. Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, časť I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., vyd. Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primér, Gribskov, M., Devereux, J., vyd. M. Stockton Press, New York (1991); a Carillo, H., Lipman, D., SIAM J. Applied Math., zv. 48, s. 1073 (1988), ktorých poznatky sú tu zahrnuté vo forme odkazu. Výhodné spôsoby stanovenia sekvenčnej identity sú navrhnuté tak, aby dosiahli maximálnu zhodu medzi testovanými sekvenciami. Spôsoby stanovenia sekvenčnej identity sú kodifikované vo všeobecne dostupných počítačových programoch, ktoré stanovia sekvenčnú identitu medzi danými sekvenciami. Príklady takých programov zahŕňajú okrem iného programový balík GCG (Devereux, J. a ďalší, Nucleic Acids Research, zv. 12 (1), s. 387 (1984)), BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S. F. a ďalší, J. Molec. Biol., zv. 215, s. 403 - 410 (1990). Program BLASTX je verejne dostupný od NCBI a ďalších zdrojov (BLAST Manual, Altschul. S. a ďalší, NCVINLM NIH Bethesda. MD 20894, Altschul, S. F. a ďalší, J. Molec. Biol., zv. 215, ss. 403 - 410 (1990), ktorých informácie sú tu zahrnuté vo forme odkazu). Tieto programy optimálne systemizujú sekvencie na základe hmotnosti vopred nastavených medzier v DNA (default gap weights) s cieľom dosiahnuť maximálnu sekvenčnú identitu medzi danými a referenčnými sekvenciami. Na ilustráciu, v prípade polynukleotidu s nukleotidovou sekvenciou, ktorá má najmenej napríklad 95 % sekvenčnej identity vo vzťahu k sekvencii referenčného nukleotidu, sa týmto mieni, že nukleotidová sekvencia daného polynukleotidu je identická s referenčnou sekvenciou s tou výhradou, že daná nukleotidová sekvencia môže obsahovať až 5 bodov mutácií na každých 100 nukleotidov referenčnej nukleotidovej sekvencie, inými slovami, v nukleotide, ktorý má nukleotidovú sekvenciu s najmenej 95 % identitou vo vzťahu k referenčnej nukleotidovej sekvencii, je možné až 5 % nukleotidov v referenčnej sekvencii vypustiť alebo nahradiť inými nukleotidmi, alebo až 5 % nukleotidov zo všetkých nukleotidov v referenčnej sekvencii sa môže vložiť do referenčnej sekvencie. K týmto mutáciám referenčnej sekvencie môže dochádzať v koncových pozíciách 5' alebo 3' referenčnej nukleotidovej sekvencie alebo kdekoľvek medzi týmito koncovými pozíciami referenčnej nukleotidovej sekvencie, a to rozptýlené buď individuálne medzi nukleotidmi referenčnej sekvencie, alebo v jednej alebo viacerých susediacich skupinách vnútri referenčnej sekvencie. Analogicky sa v prípade polypeptidov s danou sekvenciou aminokyselín, ktorá má najmenej napríklad 95 % sekvenčnej identity so sekvenciou referenčnej aminokyseliny týmto mieni, že daná sekvencia aminokyselín polynukleotidu je identická s referenčnou sekvenciou s tou výhradou, že daná polypeptidová sekvencia môže obsahovať až 5 odlišných aminokyselín na každých 100 aminokyselín referenčnej sekvencie aminokyselín. Inými slovami, na získanie danej polypeptidovej sekvencie s najmenej 95 % identitou vo vzťahu k referenčnej sekvencii aminokyselín je možné až 5 % zvyškov aminokyselín v referenčnej sekvencii vypustiť alebo nahradiť inými aminokyselinami, alebo až 5 % zvyškov aminokyselín v referenčnej sekvencii sa môže vložiť do referenčnej sekvencie. K týmto obmenám referenčnej sekvencie môže dochádzať v koncových karboxylových alebo amínových koncových polohách referenčnej sekvencie aminokyseliny alebo kdekoľvek medzi týmito koncovými pozíciami, a to rozptýlené buď individuálne medzi zvyškami aminokyselín referenčnej sekvencie, alebo v jednej alebo viacerých susediacich skupinách vnútri referenčnej sekvencie. Je výhodné, keď sa polohy zvyškov, ktoré nie sú identické, líšia konzervatívnymi substitúciami aminokyselín. Pri stanovení sekvenčnej identity však konzervatívne substitúcie neovplyvňujú stupeň zhody.

Reagencie použiteľné v tomto vynáleze zahŕňajú CBS, CBL, L-serín. LDH, NADH, DTE, βΜε, DTT, TCEP, tiooctovú kyselinu CGL. Koncentrácie enzýmu CBS použiteľného v tomto vynáleze sú v rozmedzí od asi 0,1 do asi 100 KU/1, ešte výhodnejšia je koncentrácia CBS od asi 0,5 do asi 75 KU/1 a ešte výhodnejšie od asi 1 do asi 50 KU/1. Najvýhodnejšie je, keď koncentrácia CBS je od asi 1 do asi 30 KU/1. Koncentrácia enzýmu CBL použiteľného v tomto patente je v rozmedzí od asi 0,01 do asi 100 KU/1. Ešte výhodnejšie je, keď je koncentrácia CBL od asi 0,05 do asi 50 KU/1 a ešte výhodnejšie od 0,1 do asi 30 KU/1. Najvýhodnejšie je, keď je koncentrácia CBL od asi 0,1 do asi 15 KU/1. L-serín môže byť prítomný v konečnej koncentrácii od asi 1 pM do asi 50 mM. Ešte výhodnejšie sa L-serín pridá s konečnou koncentráciou od asi 10 pM do asi 40 mM a ešte výhodnejšie s konečnou koncentráciou od asi 100 pM do asi 20 mM. Najvýhodnejšia je finálna koncentrácia pridaného L-serínu od asi 0,2 mM do asi 10 mM. Pri použití v ktoromkoľvek uskutočnení je LDH prítomné v reakčnej zmesi v konečnej koncentrácii od asi 30 do asi 5000 U/l. Výhodnejšia je finálna koncentrácia prítomného LDH v reakčnej zmesi od asi 30 do asi 3000 U/l a ešte výhodnejšie od asi 50 do asi 2500 U/l. Najvýhodnejšie je, keď je LDH prítomné v reakčnej zmesi v konečnej koncentrácii od asi 100 do asi 2000 U/l. Ďalej, keď sa NADH použije v ktoromkoľvek uskutočnení, množstvo NADH prítomného v reakčnej zmesi môže kolísať medzi asi 0,1 mM do asi 2 mM. Výhodnejšie je, keď je NADH prítomné v reakčnej zmesi vo finálnej koncentrácii od asi 0,1 mM do asi 1,5 mM a ešte výhodnejšie v koncentrácii medzi asi 0,1 do asi 1 mM. Najvýhodnejšie je, keď je NADH prítomné v reakčnej zmesi vo finálnej koncentrácii od asi 0,2 do asi 0,8 mM. Keď sa v tomto vynáleze použije DTE, môže byť koncentrácia v rozmedzí od asi 0,01 mM do asi 100 mM. Výhodnejšia je koncentrácia DTE v rozmedzí od asi 0,01 mM do asi 50 m a ešte výhodnejšia je v rozmedzí od asi 0,1 mM do asi 25 mM. Najvýhodnejšia je finálna koncentrácia DTE v rozmedzí od asi 0,1 mM do asi 10 mM. Podobne, keď sa v tomto vynáleze použije DTT, jeho finálna koncentrácia môže byť v rozmedzí od asi 0,01 mM do asi 100 mM. Výhodnejšie je, keď koncentrácia DTT je v rozmedzí od asi 0,01 mM do asi 50 mM a ešte výhodnejšie, keď je od asi 0,1 mM do asi 25 mM. Najvýhodnejšie je, keď je finálna koncentrácia DTT v rozmedzí od asi 0,1 mM do asi 10 mM. Nakoniec, keď sa v tomto vynáleze použije CGL, môže byť finálna koncentrácia od asi 0,1 KU/1 do asi 100 KU/1. Výhodnejšie je, keď je koncentrácia CGL v rozmedzí od asi 0,5 KU/1 do asi 75 KU/1 a ešte výhodnejšie od asi 1 KU/I do asi 50 KU/1. Najvýhodnejšie je, keď je finálna koncentrácia CGL v rozmedzí od asi 1 KU/1 do asi 50 KU/1, ešte výhodnejšie však je, keď je finálna koncentrácia CGL v rozmedzí od asi 1 KU/1 do asi 30 KU/1.

V niektorých výhodných uskutočneniach je pufrom v Reagente 1 TRIS v množstve 250 mM pri pH 8,4. Keď sa však TRIS použije ako pufer, potom pH môže kolísať v rozmedzí 7,0 až 9,0. Je výhodnejšie, keď je pH v rozmedzí od asi 7,5 do 8,5 a ešte výhodnejšie asi 8,1 až asi 8,5. Použitie zvýšenej koncentrácie TRIS zlepšuje konzistenciu tým, že pomáha udržiavať konštantnejšie pH, pretože ide o koncentrovanejší pufer. Navyše sú CBS a CBL v tomto výhodnom rozmedzí pH podstatne aktívnejšie, a to zvlášť pri pH medzi asi 8,1 a 8,5.

Tento vynález umožňuje rovnako dobre aj stanovenie uskutočnené so zakalenými vzorkami. Problémy so zákalom sa zmenšujú pridaním lipázy a α-cyklodextrínu k Rl. Toto pomáha zmenšiť zákal hydrolýzou triglyceridov na glycerol a voľné mastné kyseliny účinkom lipázy a tvorbou komplexov α-cyklodextrínu s voľnými mastnými kyselinami. Pridanie týchto dvoch zložiek pomohlo vyčíriť reakčnú zmes pred pridaním Reagenta 3. Náhrada lipázy a α-cyklodextrínu EDTA poskytuje ďalšiu možnosť na presnú analýzu zakalených vzoriek.

Iný variant tohto vynálezu testoval účinky objemových zmien reagencií. Tieto zmeny nemali podstatný vplyv na presnosť stanovenia.

Tento vynález tiež testoval účinky rôznych detergentov a ich rôznych koncentrácií. Napríklad Genapol X-80 môže byť prítomný v Reagente 1 v koncentráciách medzi asi 0,05 až 0,5 %. Výhodnejšie v koncentrácii medzi 0,1 a 0,5 % a ešte výhodnejšie medzi asi 0,2 až 0,4 %. Z uvedených koncentrácií sa testovali tri koncentrácie (0,1 %, 0,3 % a 0,5 %), pričom koncentrácia 0,3 % dávala najpresnejšie výsledky. Brij-35 mal v Reagente 1 tiež premenlivé koncentrácie. Brij-35 sa v tomto vynáleze môže použiť v Rl v koncentráciách medzi asi 0,01 až 0,5 %. Výhodnejšie je, keď je koncentrácia v rozmedzí od asi 0,015 do 0,1 % a ešte výhodnejšie od asi 0,020 do 0,030 %. Z testovaných koncentrácií (0,025 %, 0,05 %, 0,1 % a 0,5 %) sa najpresnejšie a najkonzistentnejšie výsledky získali pri koncentrácii 0,025 %.

V rámci tohto vynálezu sa tiež testovalo nahradenie redukčného činidla DTE činidlom tris-(2-karboxyetylfosfínjhydrochlorid (TCEP), ktorý je v prečistenej vode po dlhý čas stabilný. Toto nahradenie viedlo k redukcii reakcie činidla slepého pokusu z asi 12 15 mA/min na asi 4 - 5 mA/min, čo umožňuje dosiahnuť pri tomto stanovení väčšiu presnosť. Keď sa v tomto vynáleze použije TCEP, môže byť jeho koncentrácia v rozmedzí 6 až 53 mM. Je výhodnejšie, keď je táto koncentrácia v rozmedzí od asi 10 do asi 45 mM a ešte

SK 288189 Β6 výhodnejšie v rozmedzí od asi 20 do 30 mM. Z koncentrácií testovaných v tejto aplikácii dávala koncentrácia 26,44 mM najpresnejšie výsledky stanovenia.

Menila sa aj kompozícia v zmesi tvoriacej Reagent 3. Napríklad sa pufer TRIS nahradil fosfátovým pufrom a k tomuto pufru sa pridal glycerol. Fosfát bol účinný v koncentráciách v rozmedzí od asi 50 mM do asi 500 mM pri pH 7,6. Koncentrácie glycerolu boli v rozmedzí od asi 0,5 % do 15 % (obj./obj.). Fosfát a glycerol sa použili, aby predĺžili čas skladovania enzýmov, čo pufer TRIS neumožňoval.

Jednou z predností tohto vynálezu je, že sa môže použiť s ktorýmkoľvek z početných prístrojov. Tento spôsob stanovenia bol napríklad uspôsobený na testovanie na dvoch rozdielnych prístrojoch, Hitachi 911a Beckman CX5. Je pozoruhodné, že na oboch prístrojoch sa dosiahli presné a konzistentné výsledky. Navyše je možné uskutočniť stanovenie s použitím len dvoch reagencií zmiešaním zložiek Rl a R2 dohromady v správnom pomere vychádzajúcom z požiadaviek použitého prístroja.

Konečne, tento vynález je možné prispôsobiť na použitie s jediným kalibračným bodom. Je dôležité, že výsledky dosiahnuté s jediným kalibračným bodom boli rovnako presné ako kalibračná krivka zostrojená z mnohých kalibračných bodov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 je diagram zmeny absorbancie s časom získaný s použitím vhodných roztokov pyruvátu (5 až 100 μΜ), ktorý ukazuje kvantitatívne stanovenie pyruvátu. Zložky reagenta sú opísané v tabuľke 1 a parametre prístroja sú uvedené v tabuľke 2.

Obrázok 2 ukazuje štandardnú krivku hodnôt absorbancie vynášaných proti známym množstvám pyruvátu (0 až 100 μΜ). Čas stanovenia bol 5 minút.

Obrázok 3 ukazuje krivky absorbancie proti času získané s vodnými roztokmi cystationínu (0 až 100 μΜ).

Cystationín sa stanovil enzymatickou konverziou cystationínu na homocysteín, pyruvát a amoniak účinkom CBL.

Obrázok 4 ukazuje štandardné krivky stanovenia cystationínu získané s vodnými roztokmi cystationínu (0 až 100 μΜ). Reakčný čas bol buď 5, alebo 20 minút.

Obrázok 5 zobrazuje krivky absorbancie proti času demonštrujúce cyklický a signálny systém CBS/CBL/pyruvátoxidáza/peroxidáza. Cystationín sa rozpustil vo vode, a tak sa pripravili štandardy s koncentráciami medzi 0 a 100 μΜ.

Obrázok 6 zobrazuje krivky absorbancie proti času demonštrujúce cyklický a signálny systém CBS/CBL/pyruvátoxidáza/peroxidáza. Homocysteín sa rozpustil vo vode, a tak sa pripravili štandardy s koncentráciami medzi 0 a 100 μΜ.

Obrázok 7 zobrazuje typickú kalibračnú krivku získanú s použitím vodných roztokov homocysteínu (0 až 100 μΜ) pomocou cyklického a detekčného systému CBS/CBL/PO/HRP.

Obrázok 8 zobrazuje typický graf absorpcie proti času získaný s homocysteínom (0 - 100 μΜ) vo vodnom roztoku s použitím CBS/CBL/LDH systému bez ditiotreitolu.

Obrázok 9 zobrazuje typický graf absorpcie proti času získaný s homocysteínom (0 - 100 μΜ) vo vodnom roztoku s použitím cyklického CBS/CBL/LDH systému s ditiotreitolom.

Obrázok 10 zobrazuje kalibračnú krivku koncentrácie homocysteínu (0 - 100 μΜ) proti absorbancii s ditiotreitolom a bez neho. Reakčný čas bol 5 minút.

Obrázok 11 zobrazuje koreláciu medzi výsledkami kvantitatívneho stanovenia získanými s pomocou CBS/CBL/LDH enzymatického cyklického systému na meranie obsahu homocysteínu vo vzorkách ľudskej plazmy s použitím DTT ako redukčného činidla v porovnaní s výsledkami kvantitatívneho stanovenia Abbott IMx homocysteínovým spôsobom.

Obrázok 12 zobrazuje korelačný graf ilustrujúci koreláciu medzi kvantitatívnym stanovením podľa tohto vynálezu (y) proti stanoveniu komerčne dostupného IMx (x), opísaného v príklade 7.

Obrázok 13 zobrazuje korelačný graf ilustrujúci koreláciu medzi kvantitatívnym stanovením podľa tohto vynálezu (y) proti konvenčnému stanoveniu HPLC (x), opísanému v príklade 7.

Obrázok 14 zobrazuje korelačný graf ilustrujúci koreláciu medzi kvantitatívnym stanovením IMx (x) proti stanoveniu HPLC (y), opísanému v príklade 7.

Obrázok 15 zobrazuje graf absorbancie proti času na kvantitatívne stanovenie pyruvátu bez DTT opísané v príklade 9.

Obrázok 16 zobrazuje graf absorbancie proti času na kvantitatívne stanovenie pyruvátu v prítomnosti DTT opísané v príklade 9.

Tento vynález poskytuje spôsob homogénneho enzymatického cyklického stanovenia homocysteínu vo vzorke. Enzymatické cyklické stanovenie udržiava koncentráciu homocysteínu v rovnovážnom stave a ďalej umožňuje vzrast citlivosti stanovenia homocysteínu. Ďalej tento vynález poskytuje gény a expresívne vektory na rekombinantnú prípravu enzýmov používaných v tomto vynáleze. Tiež poskytuje súpravy na stanovenie homocysteínu a/alebo cystationínu v roztoku.

Homocysteín je prítomný v bunkách ako intermediálna aminokyselina vznikajúca, keď je metionín metabolizovaný na cysteín. Obvykle je v organizme vzniknutý homocysteín rýchlo metabolizovaný jedným z dvoch spôsobov: (1) kondenzáciou so serínom za vzniku cystationínu alebo (2) konverziou na metionín, takže jeho koncentrácia (rovnako ako jeho oxidované formy homocysteínu) je v tele za normálnych okolností nízka. Priemerná koncentrácia homocysteínu v plazme je u zdravého človeka asi 12 μΜ u mužov, pričom rozpätie je medzi asi 8,6 až asi 17,1 μΜ a pre ženy je v rozmedzí od asi 3,9 do 16,8 μΜ (Vester a ďalší, Eur. J. Clin. Chem. Biochem., zv. 29, 549 - 554, (1991) Jacobsen a ďalší, Clin. Chem. zv. 40, ss. 873 - 881 (1994)).

Nedávno sa konštatovalo, že koncentrácia homocysteínu v biologickej vzorke má pri mnohých zdravotných stavoch veľký klinický význam. Zvýšené množstvá homocysteínu v krvi korelovali s vývojom aterosklerózy (Čiarke a ďalší, New. Eng. J. Med., zv. 324. ss. 1149 - 1155 (1991)). Aj mierna forma homocysteínomie sa dnes považuje za rizikový faktor pri srdcových a cievnych ochoreniach. Presné dodržiavanie normálneho rozpätia hodnôt hladiny homocysteínu v organizme normálnych dospelých jedincov je veľmi dôležité, pretože sa zistilo, že riziko srdcového ochorenia výrazne rastie už pri zvýšení koncentrácie o 30 % nad normál a s tým spojený rizikový faktor tým rastie 3,4x (Stampfer a ďalší, JAMA. zv. 268. ss. 877 - 881 (1992)).

Tu používaný termín stanovenie zahŕňa tak kvantitatívne ako aj kvalitatívne stanovenie množstva homocysteínu a/alebo cystationínu v testovanom roztoku. Tu používaný termín roztok alebo testovaný roztok sa týka klinickej alebo biologickej tekutej vzorky alebo extraktu z tkaniva a môže zahŕňať napríklad krv, krvné deriváty ako plazmu alebo moč a podobne.

Vzorka obsahujúca homocysteín reaguje s L-serínom v prítomnosti enzýmu CBS za vzniku cystationínu. Cystationín potom môže byť ďalším enzýmom CBL konvertovaný na homocysteín, pyruvát a amoniak. Výsledkom použitia týchto anabolických a katabolických enzýmov pôsobiacich súčasne je plytvavý cyklus, pri ktorom sa 1) cystationín a homocysteín kontinuálne na seba navzájom konvertujú, 2) serín sa odbúra a 3) vznikne pyruvát a amoniak.

Používanie relatívne vysokých koncentrácií serínu v porovnaní s homocysteínom vytvára podmienky podporujúce celkovú reakčnú rýchlosť zodpovedajúcu kinetike pseudoprvého rádu v priamej závislosti od množstva homocysteínu a cystationínu v reakcii. Keď je koncentrácia cystationínu v porovnaní s koncentráciou homocysteínu veľmi nízka, bude sa celková reakčná rýchlosť meniť lineárne s množstvom homocysteínu. Meraním poklesu serínu alebo prírastku, buď pyruvátu, alebo amoniaku sa môže stanoviť množstvo homocysteínu v neznámom roztoku alebo vzorke porovnaním s kontrolnými reakciami známych množstiev homocysteínu podstupujúcich tie isté enzymatické reakcie. Enzymatický cyklický spôsob stanovenia podľa tohto vynálezu umožňuje amplifikačný (násobiaci) spôsob, pri ktorom vzniká ďaleko väčšie množstvo konečných produktov, než koľko pravdepodobne je homocysteínu v testovanom roztoku, to jest v krvi. Preto nemusí byť stanovenie množstva pyruvátu alebo amoniaku touto reakciou extrémne citlivé a môže sa merať existujúcimi spôsobmi známymi skúseným odborníkom.

Pyruvát sa typicky meria enzymatickou konverziou na laktát pomocou laktátdehydrogenázy alebo jeho deriváty. Táto reakcia enzymatickej konverzie vyžaduje kofaktor NADH (redukovaný nikotínamidový kofaktor) alebo jeho derivát, ktorý sa konvertuje na NAD⁺ (oxidovaný nikotínamidový kofaktor). Táto reakcia sa môže sledovať meraním absorbancie na vlnovej dĺžke 340 nm. Tu používaný termín deriváty vo vzťahu ku kofaktorom sa týka solí, solvátov a iných chemicky modifikovaných foriem, ktoré si zachovávajú celkovú kofaktorovú aktivitu, ale vo vodných roztokoch môžu mať zvýšenú stabilitu. Deriváty môžu okrem iného zahŕňať acetylderiváty NADH vrátane 3-pyridínaldehyd-NADH, 3-acetylpyridín-NADH, 3-tionikotínamidNADH a podobne (pozri napríklad patent USA 5 801 006).

Ďalšie vhodné spôsoby detekcie oxidácie NADH alebo jeho derivátov zahŕňajú napríklad meranie fluorescencie, ktoré opisuje Passoneau a ďalší v Enzymatic Analysis, A Practical Guide, ss. 219-222 (1993) (tu zahrnutom vo forme odkazu). V inom uskutočnení NADH alebo jeho derivát reaguje s pyruvátom v prítomnosti laktátdehydrogenázy za vzniku NAD⁺, ktorý ďalej reaguje s farbivom schopným po oxidácii farebnej zmeny, najlepšie vo viditeľnej časti spektra. Farebná zmena farbiva môže slúžiť na stanovenie celkového rozsahu oxidačnej reakcie NADH na NAD⁺, čo zodpovedá množstvu pyruvátu vytvoreného enzymatickou cyklickou reakciou. Príklady farbív, ktoré je možné použiť v tomto vynáleze, zahŕňajú, ale nie sú na ne obmedzené, 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoovú kyselinu), 2,6-dichlórfenolindofenol, tetrazóliové zlúčeniny, fenazínmetosulfát, metylviologén a ich deriváty.

Pyruvát je tiež možno merať pomocou reakcie s pyruvátoxidázou alebo jej derivátmi v prítomnosti peroxidázy, to znamená peroxidázy z chrenu a podobne. Množstvo pyruvátu konvertovaného na peroxid vodíka sa stanoví oxidačnou kondenzáciou napríklad vo vode rozpustného donora vodíka, čím vznikne farebná zlúčenina na fotometrické stanovenie koncentrácie peroxidu. Zvlášť výhodné donory vodíka poskytujúce stabilný farebný reakčný produkt predstavujú vo vode rozpustné deriváty A-alkyl-A-sulfopropylanilínu, t. j. sodnú soľ A-etyl-A-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidínu (TOOS) (Tamaoku a ďalší, Chem. Pharm. Bull., zv. 30 ss. 2492 - 2497 (1982)). Množstvo H₂O₂ sa môže merať elektrometricky. Týka sa to ampérometrických a potenciometrických meraní. Stanovenie množstva homocysteínu a/alebo cystationínu sa uskutočňuje koreláciou množstva peroxidu vzniknutého konverziou pyruvátoxidázy počas vopred určeného času.

Amoniak je možné tiež kvantitatívne merať rôznymi spôsobmi vrátane použitia amoniakového senzora (Willems a ďalší, Clin. Chem., zv. 34, s. 2372 (1988)). Amoniak je možné dobre detegovať i známymi kolorimetrickými spôsobmi. Amoniak vytvorený vo vzorke je napríklad možné zmeniť reakciou na farebný produkt, ktorého vznik sa môže odhaliť spektrofotometricky. Jedna z takých metód opísaná v Mehods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer), zv. 1, ss. 1049 - 1056 (1970) tu zahrnutá vo forme odkazu spočíva v reakcii amoniaku s fenolom v prítomnosti chlómanu v alkalických podmienkach za vzniku farbiva indofenolu. Ako katalyzátor je možné použiť nitroprusid sodný. Tiež je možné použiť modifikáciu týchto spôsobov s použitím napríklad rôznych derivátov. Farebný finálny produkt sa vytvorí v množstve priamo úmernom amoniaku, a preto aj homocysteínu. Iný spôsob môže zahŕňať napríklad analýzu mikrodifúziou (Seligson a ďalší, J. Lab. Clin. Med., zv. 49, ss. 962 - 974 (1957)) ionomeničovou technikou (Forman, Clin. Chem., zv. 10, ss. 497 až 508 (1964)) a rôznymi enzymatickými spôsobmi (pozri napríklad Mondzac a ďalší, J. Lab. Clin. Med., zv. 66, ss. 526-531 (1979)).

Enzymatický cyklický spôsob stanovenia množstva homocysteínu a/alebo cystationínu obmedzuje ťažkosti, s ktorými sa stretávame pri stanovení podľa starších patentových spisov, keď vedľajšie reakcie a ich produkty (pozadie - background) vytvárajú „šum“. Pri stanovení podľa tohto vynálezu je možné pridať veľké množstvo lacnej aminokyseliny L-serínu a uskutočniť kvantitatívnu zmenu na pyruvát a amoniak. Vo výhodnom uskutočnení je možné použiť serín v koncentrácii 250 μΜ alebo viac a následne ho konvertovať na pyruvát a amoniak. Plazma typicky obsahuje asi 100 μΜ serínu. Toto množstvo endogénneho serínu je pre toto stanovenie nepodstatné, pretože tento spôsob stanovenia meria rýchlosť konverzie, ktorú určuje množstvo homocysteínu, a nie množstvo serínu. Neočakáva sa, že by koncentrácia L-serínu 0,1 mM až 10 mM mohla ovplyvniť citlivosť alebo presnosť opisovaného stanovenia.

Ďalej enzymatická cyklická reakcia podľa tohto vynálezu poskytuje rýchlosť konverzie L-serínu, ktorá je závislá od koncentrácie homocysteínu v reakcii pseudoprvého rádu. Normálne koncentrácie pyruvátu v krvi sú typicky medzi asi 0,4 a 2,5 mg/100 ml (Lehninger, A. L., Principles of Biochemistry, 1982, Worthington Publishers, Inc., s. 707, tu zahrnuté vo forme odkazu), čo zodpovedá asi 45 - 284 μΜ. Táto koncentrácia pyruvátu by mohla spôsobiť malú chybu v meraní, ale toto stanovenie meria časový priebeh zmeny a je možné ho ľahko upraviť pre počiatočnú koncentráciu pyruvátu v roztoku. Navyše je možné pyruvát odstrániť predbežnou inkubáciou s laktátdehydrogenázou alebo ďalšími enzýmami. Ešte dôležitejšie je, že cysteín a iné sírne zlúčeniny napríklad v krvi podstatne neprispievajú k výsledku enzymatickej cyklickej reakcie, a preto sú považované za nevýznamný zdroj „šumu“ v systéme.

V alternatívnom uskutočnení tohto vynálezu sa vzorka môže upraviť tak, aby sa odstránil cystationín, a tým sa zvýši presnosť meraní homocysteínu. Ako špecifický príklad tato úprava zahŕňa kontaktovanie roztoku s cystationín-y-ylyázou s cieľom konvertovať cystationín na α-ketoglutarát (zlúčeninu, ktorá sa nemôže zúčastniť v opísanej enzymatickej cyklickej reakcii). Pred uskutočnením enzymatického cyklického stanovenia na určenie množstva homocysteínu musí byť zo vzorky odstránená aktivita cystationín-y-lyázy alebo odbúraná napríklad teplom alebo podobne.

Toto špecifické uskutočnenie vynálezu sa tiež môže použiť na stanovenie množstva cystationínu porovnaním rozdielu v rozsahu produkcie pyruvátu a/alebo amoniaku vo vzorke upravenej alebo neupravenej cystationín-y-lyázou pred enzymatickým cyklickým stanovením. Preto sa tento vynález môže použiť na stanovenie množstva cystationínu v neznámej vzorke, dokonca aj keď táto vzorka obsahuje homocysteín.

V niektorých biologických vzorkách, ako je krv, je homocysteín často viazaný disulfidickými väzbami na proteíny, tioly a ďalšie bunkové zložky. V typickom prípade je možné na vzorku pôsobiť redukčným činidlom, ako je borohydrid sodný alebo draselný, tiol ako ditioerytritol, β-merkaptoetanol, ditiotreitol, tioglykolová kyselina alebo glutatión, fosfín alebo trialkylfosfín, ako je tributylfosfin a tris(2-karboxyetyl)fosfín (TCEP) a podobne, s cieľom uvoľniť disulfidicky viazaný homocysteín. Staršie spôsoby stanovenia vyžadované pre detekčný stupeň protilátky musia meniť oxidačno-redukčné podmienky reakčnej zmesi (väčšina protilátok je prepojená disulfidickou väzbou). Ale pri tomto spôsobe nie je nutné premývanie alebo zmena redoxných podmienok, pretože použité CBS a CBL sú aktívne v redukčných podmienkach. Preto má postup stanovenia podľa tohto vynálezu menej stupňov než v mnohých imunotestoch podľa starších patentových spisov.

V typickom uskutočnení sa vzorka obsahujúca krv, krvné frakcie, krvné sérum, krvnú plazmu alebo moč redukuje redukčným činidlom a priamo testuje na obsah homocysteínu. Zahrievanie vzorky pred stanovením na urýchlenie uvoľnenie homocysteínu a dezaktiváciu degradujúcich enzýmov a ďalších faktorov interferujúcich pri stanovení môže byť tiež výhodné. Všeobecné zásady zaobchádzania so vzorkami krvi pri stanovení homocysteínu sú skúseným odborníkom známe aj vďaka iným spôsobom, ako sú napríklad testy HPLC.

SK 288189 Β6

CBS a CBL sú enzýmy bežne sa vyskytujúce v prírode. Ľudia a kvasinky používajú CBS na syntézu metionínu a ľudská cDNA pre CBS môže nahradiť gén pre CBS v pivovarských kvasniciach (Kruger a ďalší, Hum. Molec. Genet., zv. 4, ss. 1155 - 1161 (1995)). CBL sa nachádza v mnohých baktériách vrátane E. coli (Laber a ďalší, FEBS Lett., zv. 379, ss. 94 - 96 (1996)). V uvedených organizmoch i v iných druhoch sú známe celé sekvencie DNA pre gény CBS a CBL, takže skúsení molekulárni biológovia majú zdroj umožňujúci ľahko klonovať alebo syntetizovať tieto gény alebo ich deriváty.

Tu používaný výraz derivát sa v prípade enzýmov týka mutantov vzniknutých adíciou, deléciou, náhradou alebo modifikáciami aminokyselín, mutantov pripravených rekombinantne a/alebo premiestnením DNA (DNA shuffling) rovnako ako solí, solvátov a ďalších chemicky modifikovaných foriem enzýmu, ktoré si uchovávajú enzymatickú aktivitu izolovaného prírodného enzýmu. Spôsob vytvorenia derivátu enzýmu pomocou premiestnenia DNA (shuffling DNA) použiteľný v tomto vynáleze sa opisuje v patente USA 5 605 793 (tu zahrnutom vo forme odkazu). Tieto dva enzýmy boli izolované z radu organizmov aj bez klonovania. Pozri napríklad ONO a ďalší, Yeast. zv. 10. ss. 333 - 339 (1994), Dwivedi a ďalší, Biochemistry, zv. 21, ss. 3064 - 3069 (1982), tu zahrnuté vo forme odkazu. Vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sa ponúkajú geneticky modifikované organizmy na prípravu CBS alebo jeho derivátov alebo na prípravu CBL a jeho derivátov, ktoré sa môžu použiť pri enzymatickom cyklickom stanovení na prípravu reagencií za znížených nákladov, a na zlepšenie možnosti prečistenia enzýmov.

Podobne sa termín derivát vo vzťahu k nukleotidovým sekvenciám týka variantov a mutantov vzniknutých adíciou, deléciou, substitúciou a/alebo modifikáciou nukleotidu a/alebo kombinatorickou chémiou, mutantov pripravených rekombinantne a/alebo pomocou premiestnenia DNA, a solí, solvátov a iných chemicky modifikovaných foriem sekvencie, ktoré si zachovávajú potrebnú aktivitu sekvencie, ako sú väzbové vlastnosti MetR. Je výhodné, keď pri použití modifikovaných derivovaných sekvencii majú tieto sekvencie najmenej asi 60 % sekvenčnú identitu s originálnou sekvenciou. Ešte výhodnejšie je, keď je táto identita najmenej asi 70 % a ešte výhodnejšie, keď je najmenej asi 85 %. Najvýhodnejšie je, keď také sekvencie majú najmenej asi 95 % sekvenčnú identitu s originálnou sekvenciou.

Gén CBS bol rovnako ako celý genóm Saccharomyces cerevisiae sekvencovaný. Podobne je tiež známy gén CBL a ostatné gény E. coli. Preto je možné s využitím techník bežných v molekulárnej biológii klonovať a exprimovať gény kódujúce CBS a CBL v oboch organizmoch. Sú známe a boli publikované spôsoby purifikácie oboch enzýmov s použitím štandardných spôsobov purifikácie proteínov. Každý z týchto enzýmov sa však môže konštruovať ako fúzny proteín, ktorý zahŕňa napríklad časť inej bielkoviny, ktorá pomáha pri solubilizácii a/alebo opätovnom poskladaní aktívneho enzýmu alebo sekvencii aminokyselín, ktoré je možné pridať na uľahčenie purifikácie. Príklad sekvencii aminokyselín pridaných na purifikáciu zahŕňa peptidové sekvencie s funkciou afinitného značenia (affinity tags), ako je poly-His alebo glutatión-S-transferáza (GST), ktoré sa môžu pridať na urýchlenie prečistenia proteínov cez jedinú kolónu afinitnej chromatografie. I keď enzýmy nevyžadujú pre diagnostický test podľa tohto vynálezu purifikáciu až do homogenity, je možné prečistením znížiť obsah proteáz a ďalších aktivít, ktoré konvertujú serín na pyruvát, na bezvýznamné hodnoty.

Navyše koncentrácia enzýmov vedie obvykle k zvýšeniu stability enzymatickej aktivity pri reakcii a pri dlhodobom skladovaní. Očakáva sa, že CBS a CBL z iných organizmov, než je S. cerevisiae a E. coli, zvlášť z termofilných organizmov, budú zdrojmi enzýmov s dokonca ešte väčšou stabilitou. Izolované enzýmy je tiež možno selektovať na vyššiu afinitu k homocysteínu. Navyše môže proteínové inžinierstvo kvasinkového CBS a bakteriálneho CBL viesť k enzýmom so zlepšenými komerčnými vlastnosťami, ako sú vyššie afinity, vyššie reakčné rýchlosti, ľahšie čistenie a dlhší polčas životnosti pri skladovaní.

Podobne bola cystationín-y-lyáza (CGL) podrobne opísaná v mnohých druhoch organizmov (pozri napríklad článok Yamagata a ďalší, J. Bacteriol., zv. 175, ss. 4800 - 4808 (1993) tu zahrnutý vo forme odkazu). Manipulácia génov kódujúcich CGL sa môže ďalej modifikovať geneticky štandardnými rekombinantnými spôsobmi a vložiť do hostiteľských buniek s cieľom vytvoriť kmene s vyššou úrovňou produkcie.

Typické sú rekombinantné expresie génov pre CBS, CBL a CGL. Tieto spôsoby môžu poskytnúť veľké množstvá prečisteného enzýmu a gény je možné modifikovať tak, aby napríklad pridali definovanú peptidovú sekvenciu (afinitné značenie affinity tag) k exprimovaným enzýmom, ktoré je možné použiť pri afinitnom čistení. Použitím peptidových sekvencii na afinitné značenie (affinity tags) pri expresii rekombinantných enzýmov je možné značne zjednodušiť prečistenie a imobilizáciu týchto enzýmov, čo znižuje náklady. Tieto peptidové afinitné značenia (affinity tags) sú v odbore známe a zahŕňajú napríklad, ale nie sú na ne obmedzené, polyhistidín, GST (glutatión-S-transferáza), typy „streptag, „flag“, sekvencie c-myc a podobne. Značenia (tags) sa v značnom rozsahu používajú na afinitnú purifikáciu rekombinantne exprimovaných proteínov a mnohé z nich sú komerčne dostupné.

Vo výhodnom uskutočnení sa CBS a CBL imobilizujú na pevných povrchoch tak, aby sa zachovali aktivity enzýmov a aby homocysteín zostal voľný a mohol interagovať s proteínmi. Ak sa mobilizácia enzýmov uskutoční pri vysokých hustotách, zmenšia sa difúzne vzdialenosti medzi rôznymi proteínmi na jednej strane a enzýmami. V dôsledku toho veľmi vzrastie celková reakčná rýchlosť stanovenia, pretože produkt jedného enzýmu môže reagovať s iným enzýmom a opačne. Zvýšenie reakčnej rýchlosti je spôsobené vzrastom

SK 288189 Β6 miestnej koncentrácie medziproduktov, ktoré sú vplyvom imobilizácie v tesnejšej blízkosti k vedľajšiemu enzýmu. Zvýšenie rýchlosti stanovenia homocysteínu môže byť významným faktorom predajnosti diagnostického produktu, pretože K_m CBS a CBL je v milimolámom ráde, ale koncentrácia homocysteínu v krvi je približne 10 μΜ. Je známe, že difúziou limitované reakcie vyžadujú vysoké koncentrácie enzýmov, aby vykazovali vysokú reakčnú rýchlosť. Imobilizácia enzýmov pri cyklickom stanovení prekonáva ťažkosti, ktoré môžu vzniknúť z nízkych afinít týchto dvoch enzýmov k ich príslušným substrátom.

V ešte inom výhodnom uskutočnení sú CBS a CBL imobilizované ako fúzny protein. Je možné regulovať vzájomnú vzdialenosť a orientáciu dvoch rôznych proteínov pri konštrukcii expresívneho vektora fúzneho génu. Pri správnej lokalizácii oboch aktivít vo fúznom proteíne môže dôjsť k vzájomnej konverzii homocysteínu a cystationínu extrémne rýchlo prakticky vnútri proteínu, pretože je možné minimalizovať difúzne vzdialenosti medzi oboma aktívnymi centrami. Homocysteín sa preto v celkovej enzymatickej cyklickej reakcii, ktorou vzniká pyruvát a amoniak z L-serínu, správa ako kofaktor.

Enzymatické cyklické stanovenie podľa tohto vynálezu sa môže realizovať v rade uskutočnení (formátov) testu. Najjednoduchší formát stanovenia predstavuje roztok činidiel, ktorý obsahuje L-serín, CBS alebo jeho deriváty, CBL alebo jeho deriváty, rôzne pufre a pomocné látky potrebné na optimalizáciu enzymatických reakcií. Vo zvlášť výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sa CBS alebo jeho deriváty a CBL alebo jeho deriváty používajú imobilizované na pevnom povrchu.

Imobilizácia enzýmov na pevnom povrchu zachováva v podstate všetky aktivity enzýmu a jej spôsoby sú v odbore dobre známe. Na imobilizáciu sa použilo niekoľko spôsobov vrátane kovalentnej väzby, fyzikálnej absorpcie, oklúzie a elektrochemickej depozície. Ako jeden príklad uveďme glutaraldehyd, ktorý sa použil na imobilizáciu kreatiníndeaminázy a glutamátoxidázy na sklenených guľôčkach s kontrolovanou porozitou a derivatizovaných propylamínom (Rui a ďalší, Ann. NY Acad. Sci., zv. 672, ss. 264 - 271 (1992)). Iné príklady zahŕňajú, ale nie sú na ne obmedzené, použitie karbodiimidov na kovalentnú väzbu enzýmov na sklenené guľôčky derivatizované sukcinátom (Rui a ďalší, pozri vyššie) a použitie hetero- alebo homobifúnkčných sieťovacích činidiel (napríklad SPDP, A-sukcínimidyl-3-(2-pyridylditio)propionát, SMPT, sukcínimidyloxykarbonyl-a-metyl-a-(2-pyridylditio)toluén, DSP, ditiobis(sukcínimidylpropionát), DTSSP, 3,3'-ditiobis(sulfosukcínimidylpropionát), DSS, disukcimmidylsuberát a podobne) na kovalentné spojenie enzýmu cez napríklad amínovú alebo sulfhydrylovú skupinu na derivatizovaný pevný povrch (Wilson a ďalší, Biosens. Bioelektro, zv. 11, ss. 805 - 810 (1996)).

Tu používaný termín pevný povrch môže zahŕňať porézny alebo neporézny vo vode nerozpustný materiál, ktorý môže mať niektorý z mnohých možných tvarov, ako sú prúžky, tyčinky, guľôčky a podobne. Vhodné materiály sú v odbore dobre známe a môžu zahŕňať napríklad papier, filtračný papier, nylon, sklo, keramiku, oxid kremičitý, oxid hlinitý, diatomit, celulózu, polymetakrylát, polypropylén, polystyrén, polyetylén, polyvinylchlorid a ich deriváty. Pevný povrch môžu predstavovať strany a dno testovacej nádoby, alebo to môže byť materiál do testovacej nádoby pridaný. V jednom výhodnom uskutočnení predstavujú pevný povrch guľôčky pridané do nádoby.

Kvasinky aj baktérie obsahujú enzýmy konvertujúce L-serín na pyruvát, čo sú aktivity niekedy označované ako seríndeamináza alebo seríndehydratáza. Tieto aktivity je možné do značnej miery obmedziť alebo celkom eliminovať dobre zavedenými mutagénnymi spôsobmi, pretože môžu podstatne prispieť ku vzniku nežiaducich vedľajších reakcií a produktov (pozadie) pri cyklickom stanovení homocysteínu. Zvlášť Saccharomyces cerevisiae je možné geneticky manipulovať s cieľom odstrániť aktivity seríndeaminázy, čo je nevyhnutné na 1) syntézu izoleucínu a 2) kultiváciu na seríne ako zdroji uhlíka alebo dusíka s pomocou jednoduchého spôsobu zvaného roztrhnutie génu („gene disruption“). Deléciou génu chal z kvasiniek sa odstráni väčšina aktivity seríndeaminázy, a tým sa odstráni potenciálny problém s absorpčným pozadím (vedľajšími produktmi) pri cyklickom stanovení. Okrem toho môže byť delécia génu chal užitočná pri selekcii fúznych proteínov CBS-CBL a pre genetické inžinierstvo takých fúznych proteínov. Kmeň s deletovaným génom chal nie je schopný kultivácie na seríne ako jedinom zdroji uhlíka alebo dusíka. Fúzny gén CBS-CBL je schopný komplementovať deléciu, pokiaľ je ako „kofaktor“ prítomný homocysteín, pretože cyklický systém vedie k rovnakému konečnému výsledku ako seríndeamináza. Preto sa môže delécia génu chal použiť na selekciu a zachovanie zlepšených fúzií CBS-CBL, zvlášť keď je populácia fúznych génov mutovaná a umiestnená na jednokópiové vektory alebo na chromozómy v kvasinkách. Bunky, ktoré rýchlejšie rastú na serínovej pôde alebo majú znížené požiadavky na homocysteín, môžu obsahovať mutácie kódujúce rýchlejšie enzýmy alebo proteiny s vyššími afinitami pre homocysteín a cystationín.

Tento vynález tiež dáva možnosť použiť ako alternatívu na zistenie množstva homocysteínu vo vzorke transkripčný faktor rozpoznávajúci metabolit. Keď sa transkripčný faktor rozpoznávajúci metabolit naviaže na príslušný metabolit, komplex s faktorom sa naviaže na polynukleotidovú sekvenciu špecifického receptora. Väzba komplexu transkripčného faktora na konvenčnú sekvenciu receptora sa môže sledovať a korelovať s množstvom metabolitu prítomného vo vzorke.

V odbore je známe množstvo transkripčných faktorov, ktoré sa po spojení s malou molekulou metabolitu viažu na špecifické väzbové miesta DNA. Napríklad E. coli má ako operónový regulačný prvok transkripčný faktor MetR, ktorý v reakcii na pripojenie k homocysteínu reguluje operón Met (Cai a ďalší, Biochem. Biophys. Res. Commun, zv. 163, ss. 79 - 83 (1989)). MetR alebo jeho deriváty regulujú gény, ako je MetE (kobolamín independentná metionínsyntáza), MetH (kobolamín dependentná metionínsyntáza) a GlyA (serínhydrogenáza). MetR a jeho deriváty sa preferenčne viažu v prítomnosti homocysteínu na ich konvenčnú sekvenciu DNA a za jeho neprítomnosti sú v bunkovej cytoplazme voľné. Väzba MetR v prítomnosti homocysteínu sa môže využiť na stanovenie množstva homocysteínu vo vzorke, o ktorej sa predpokladá, že môže obsahovať homocysteín.

V špecifickom uskutočnení vynálezu stanovenie zahŕňa polynukleotidovú sekvenciu kódujúcu konvenčnú sekvenciu pre receptorový polynukleotid pre MetR imobilizovaný na pevnom podklade takým spôsobom, ktorý umožňuje prístup konvenčnej receptorovej sekvencie k pripojeniu na MetR. Nukleotidová sekvencia môže byť napríklad

GTTAATGTTGAACAAATCTCATGTTGCGTG (SEQ ID č. 11)

Vzorka ako plazma, krv alebo moč sa najskôr upraví v pufri v prítomnosti imobilizovanej konvenčnej receptorovej sekvencie - s cieľom uvoľniť všetok homocysteín viazaný na proteín - v podmienkach podporujúcich vznik komplexu, a potom sa vzorka zmieša s roztokom reagenta obsahujúcim MetR. Po inkubačnej perióde sa pevný podklad premyje na odstránenie nenaviazaných reagentov a určí sa množstvo MetR viazaného na pevný podklad. Stanovenie množstva MetR, ktoré zostáva viazané na pevný podklad, sa typicky môže uskutočniť metódou ELISA, povrchovou plazmónovou rezonanciou, t. j. BIACORE, alebo jednoducho štandardným stanovením bielkovín, a toto množstvo sa porovnáva s množstvom homocysteínu prítomného vo vzorke.

Úprava vzorky na uvoľnenie homocysteínu sa môže uskutočniť redukčným činidlom. Ako sa uvádza, v odbore je známe množstvo týchto činidiel. V typickom prípade sa vzorka zmieša s roztokom pufra obsahujúcim dostatočné množstvo redukčného činidla, aby došlo k uvoľneniu v zásade všetkého homocysteínu z akýchkoľvek proteínových väzieb prítomných vo vzorke. Bežne používané redukčné činidlá zahŕňajú, ale nie sú na ne obmedzené, borohydrid sodný a draselný, β-merkaptoetanol, ditiotreitol, ditioerytritol, tioglykolovú kyselinu alebo glutatión, fosfin alebo trialkylfosfin, ako je tributylfosfin a tris(2-karboxyetyl)fosfín (TCEP) a podobne.

Proteín MetR sa tiež môže modifikovať inkorporáciou detegovateľného značenia, napríklad chromoforu, íluoroforu a podobne, na zlepšenie rýchlosti a citlivosti stanovenia. Vnesenie detegovateľného značenia môže skrátiť čas potrebný na stanovenie elimináciou určitých stupňov manipulácie so vzorkou, napríklad dodatočného premývania. Vnesenie íluoroforu, ktorý emituje svetlo na vlnovej dĺžke absorbovanej oligonukleotidmi, do konvenčnej väzbovej sekvencie umožňuje merať prenos fluorescenčnej energie, a tým kvantitatívne merať väzbu proteínu na konvenčnú sekvenciu. Spôsoby, ktoré je možné použiť na meranie prenosu energie, zahŕňajú napríklad FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer - prenos energie fluorescenčnou rezonanciou) alebo stanovenie proximitnou scintiláciou. Ďalšia modifikácia konvenčnej väzbovej sekvencie pre MetR pridaním ďalšieho detegovateľného značenia do väzbovej domény môže tiež zlepšiť špecifickú stanovenia.

Navyše je možné v záujme uľahčenia purifikácie a detekcie pridať k proteínu MetR definovanú peptidovú sekvenciu (afinitné značenie - affinity tag). Afinitné značenia (affinity tags) sú v odbore známe, zahŕňajú napríklad, ale nie sú na ne obmedzené, polyhistidín, strep-tag, „flag“, sekvenciu c-myc a podobne. Značenia sa široko používajú na afinitné čistenie rekombinantne exprimovaných proteínov a mnohé sú komerčne dostupné. Ďalej je možné použiť mutačné zmeny na zlepšenie rozpoznávacej afinity rekombinantne exprimovaného MetR, ak chceme získať ďalšie činidlá potrebné na stanovenie.

V samostatnom uskutočnení tohto vynálezu je možné stanoviť množstvo homocysteínu vo vzorke enzymatickou utilizáciou homocysteínu obsiahnutého vo vzorke. Pri konverzii homocysteínu sa v bunkovom metabolizme typicky uvoľňuje protón zo sulfhydrylového zvyšku homocysteínu. Uvoľnenie tohto protónu sa použilo na meranie väzbovej afinity homocysteínu ku kobolamín dependentnej metionínsyntáze E. coli (Jerret a ďalší, Biochemistry, zv. 36. ss. 15739 až 15748 (1997)). Enzymatické reakcie katalyzované proteínmi, ako je metionínsyntáza, obvykle vyžadujú kofaktory alebo ďalšie substráty na dokončenie reakcie. Keď tieto kofaktory a substráty nie sú prítomné, zostáva homocysteín viazaný na enzým. V tomto spôsobe sa meraním protónu uvoľneného enzymatickou reakciou odstraňuje uvoľnený protón, a tým sa reakcia zameriava na spotrebu homocysteínu vo vzorke. Meranie zmeny pH spojené s uvoľnenými protónmi umožňuje stanovenie množstva homocysteínu vo vzorke. Vo výhodnom uskutočnení sa pri stanovení môže použiť napríklad kobolamín independentná metionínová syntáza.

Kvôli väčšiemu pohodliu je možné reagencie potrebné v tomto patente prechovávať na použitie pri tomto stanovení vo forme testovacej súpravy. Typická súprava obsahuje zostavu zloženú z nádoby na testovaný roztok, L-serín, CBS alebo jeho derivát, CBL alebo jeho derivát, pomocné pufre a látky potrebné na vytvorenie optimálnych reakčných podmienok. Je dôležité, aby v súprave všetkých reagencií boli spolu s reagentmi súpravy a/alebo enzýmami v záujme predĺženia času skladovania a tiež „on line“ životnosti pri testovaní vzorky zahrnuté aj rôzne ochranné prostriedky a/alebo stabilizačné činidlá. Súprava môže tiež obsahovať redukčné činidlá alebo CGL na predbežnú úpravu vzorky pred cyklickým stanovením. Súprava môže ďalej obsahovať laktátdehydrogenázu, NADH a farbivo meniace farbu v dôsledku oxidácie.

Za vhodných podmienok môže byť jedna alebo viac reagencií v súprave v roztoku (s konzervačným prostriedkom alebo bez neho a/alebo so stabilizačnými činidlami), alebo ako suchý prášok obvykle lyofilizovaný a obsahujúci excipienty, konzervačné prostriedky a/alebo stabilizačné činidlá, ktorý po rozpustení môže poskytnúť reagenčný roztok s vhodnou koncentráciou na stanovenie podľa tohto vynálezu. Na zlepšenie všestrannosti tohto vynálezu sa môžu reagencie poskytovať v pripravených kombináciách v tej istej nádobe alebo v oddelených nádobách, takže pomer činidiel zaisťuje značný stupeň optimalizácie spôsobu stanovenia. Reagencie môžu byť každá vo vlastnej nádobe alebo rôzne reagencie sa môžu kombinovať v jednej alebo viacerých nádobách podľa stability reagencií. Na zvýšenie pohodlia sa môžu reagencie používané pri spôsobe stanovenia podľa tohto vynálezu používať vo vopred stanovených množstvách. Testovacia súprava môže tiež obsahovať napísané inštrukcie o spôsobe použitia reagencií a/alebo ako vykonávať konkrétne stanovenie, a to napríklad vo forme vloženého príbalového letáku.

Nasledujúce príklady sa ponúkajú na ilustráciu a nie na to, aby akokoľvek obmedzovali iné možnosti.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Klonovanie a expresia génu cystationín-P-lyázy z E. coli

V tomto príklade sa na klonovanie génu CBL z E. coli použili štandardné procedúry polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Izolovaný gén sa vložil do expresívneho vektora s peptidovou sekvenciou afmitného značenia (affinity tag) (6HIS) a exprimovaný proteín sa purifikoval v kolóne afinitnej chromatografie. Z bunkových lyzátov sa purifikovalo značné množstvo enzymatickej aktivity CBL transformovanej v hostiteľských bunkách konštruktom expresívneho vektora.

Klonovanie cystationín-p-lyázového génu z E. coli (CBL, EC 4.4.1.8)

Štandardné postupy PCR používajúce systém Expand High Fidelity PCR (Roche Biochemicals) sa použili na amplifikáciu génu CBL E. coli pomocou kompetentných buniek E. coli ONE SHOT TOP 10 (Invitrogen) ako zdroje genómového DNA. Primérové sekvencie v PCR na klonovanie CBL boli: (primér CBL s N-koncom: 5'-CGACGGATCCGATGGCGGACAAAAAGCTTG-3'; SEQ ID č: 1) a (primér CBL s C-koncom: 5'-CGCAGCAGCTGTTATACAATTCGCGCAAA-3'; SEQ ID č: 2). Produktový gén CBL amplifikovaný v PCR sa potom prečistil elektroforézou cez agarózový gél, digeroval s reštrikčnými endonukleázami BamHI a PvuII a opäť sa čistil elektroforézou na agarózovom géli. Prečistený gén CBL z E. coli bol potom vložený ligáciou do expresívneho vektora (Invitrogen) proteínu pRSETB prečisteného na géli a digerovaného s BamHI/PvuII. Výsledný konštrukt dáva gén CBL pod kontrolou transkripčného promótora T7 klonovaný v čítacom rámci s vedúcou sekvenciou so zvyškom zo šiestich histidínov (6HIS) a s amínovým koncom (ďalej označovaným ako 6HISCBL), čo umožňuje vhodnú expresiu, afinitné prečistenie a analýzu rekombinantného proteínu z buniek E. coli 6HISCBL pomocou imunofarbenia. Uvádza sa sekvencia DNA génu cystationín-β-lyázy (CBL) E. coli (SEQ ID: 21). Tiež sa uvádza proteínová sekvencia klonovanej cystationín^-lyázy (CBL) z E. coli, ktorá má afinitné značenie (affinity tag) 6 Histidín (6HIS) s amino-(NH3)-koncom a je výsledkom klonovania génu CBL do bakteriálneho expresívneho plazmidu pRSETB (SEQ ID č. 19).

Expresia a prečistenie proteínu cystationín^-lyázy

Plazmidový konštrukt pRSETB(ÓHISCLB) sa transformoval do kmeňa BL21(DE3)pLysS E. coli (Invitrogen), naniesol sa na agarové platne LB/agar obsahujúce (100 pg/ml ampicilínu a 35 pg/ml chloramfenikolu), a potom sa cez noc inkuboval pri 37 °C. Jednotlivé kolónie baktérií sa potom preniesli a pestovali cez noc v bankách obsahujúcich 100 ml kultivačného média LB obsahujúceho ampicilín a chloramfenikol. 100 ml tejto kultúry pestovanej cez noc sa potom pridalo do viacerých baniek obsahujúcich 1 1 čerstvej kultivačnej pôdy LB obsahujúcej ampicilín a ponechalo sa rásť do dosiahnutia A_6Oo 0,6 (asi 2,5 hod.). S cieľom indukovať expresiu proteínu CBL podporovanú promótorom T7 sa potom ku kultivačnej pôde pridal izopropyl^-D-tiogalaktopyranozid (IPTG) do dosiahnutia konečnej koncentrácie od 0,1 do 1 mM. Počas indukcie sa do kultivačného média pridal kofaktor enzýmu CBL pyridoxál-5'-fosfát (PLP) do konečnej koncentrácie 100 pM. Po päťhodinovom monitorovaní rastu buniek a expresie proteínu 6HISCBL sa bunky E. coli oddelili odstredením, resuspendovali a podrobili lýze pridaním BUGBUSTER Proteín Extraction Reagent (Novagen Inc.) v prítomnosti úplného inhibítora proteázy bez EDTA (Roche Biochemicals), ako sa opisuje v návode výrobcu. Bunkový lyzát bol potom upravený činidlom DNáza I, vyčírený odstredením a vnesený do afinitnej kolóny s náplňou Poly-His Proteín Purification Resin (Roche Biochemicals). Potom sa kolóna premyla ekvi13

SK 288189 Β6 libračným pufrom 1 (50 mM KPi, pH 7,8, 0,5 M NaCl) v množstve desaťnásobku objemu vrstvy a elučným pufrom 1 (50 mM KPi, pH 7,8. 0,5 M NaCl, 10 mM imidazolu, EB1) v množstve päťnásobku objemu vrstvy, elučným pufrom 2 (50 mM KPi, pH 7,8, 0,5 M NaCl, 50 m imidazolu. EB2) v množstve päťnásobku objemu vrstvy a elučným pufrom 3 (50 mM KPi, pH 7,8, 0,5 M NaCl, 500 mM imidazolu, EB3). Vzorky odoberané v každom stupni prečistenia sa potom analyzovali gélovou elektroforézou s denaturáciou proteinu (SDS-PAGE) a zafarbili sa buď Coomassie Brilliant Blue, alebo sa podrobili analýze westernovým prenosom s použitím na detekciu monoklonového proti-polyhistidínového myšieho imunoglobulínu konjugovaného s peroxidázou podľa návodu výrobcu (Sigma).

Zistilo sa, že prečistený protein 6HISCBL sa vymýva najľahšie v elučných pufroch 2 a 3 (EB2 a EB3). Eluát obsahujúci CBL sa potom zahustil s použitím odstredivých filtračných komôr (Amicon), dialyzoval sa cez noc pri 4 °C proti pufiru na dlhodobé uchovávanie (skladovaciemu) (50 mM TrisHCl, pH 8, 100 mM NaCl, 5 mM PLP), rozdelil do alikvotných podielov a skladoval v zmrazenom stave pri -80 °C. Koncentrácia prečisteného homogénneho enzýmu CBL sa potom vypočítala pomocou extinkčného koeficientu pri vlnovej dĺžke 280 nm a hmotnosti podjednotky 43,312 Da (Clausen a ďalší, Biochem., zv. 36, ss. 12633 - 12642 (1997)). Typický výťažok prečisteného 6HISCBL bol v rozmedzí 20 - 30 mg 6HISCBL na gram pasty z E. coli.

Stanovenie aktivity CBL

Aktivita CBL afinitne prečisteného rekombinantného proteinu 6HisCBL exprimovaného z plazmidového konštruktu pRSETB(6HisCBL) sa prejavovala v podstate rovnako, ako sa opisuje vyššie v prameni (Clausen a ďalší, Biochem., zv. 36, ss. 12633 - 42 (1997)), ktorý je tu zahrnutý vo forme odkazu. Stručne povedané, analyzované zmesi obsahovali 100 mM Tris/HCl (pH 8,5), 5 mM L-cystationínu, 1 mM 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoovej kyseliny) (DNTB, Ellmanovo činidlo) a enzým 6HisCBL vo finálnom objeme 1 ml. Po reakcii sa zaznamenal časový priebeh rastu absorbancie na 412 nm. Tá istá enzymatické reakcia sa tiež uskutočnila so vzorkami so známou koncentráciou substrátu na vytvorenie štandardnej krivky. V podstate všetka aktivita CBL zistená v úplnom bunkovom lyzáte sa našla v experimentálne prečistených vzorkách rekombinantného enzýmu 6HisCBL pripravených z plazmidového konštruktu pRSETB(6HisCBL).

Príklad 2

Klonovanie a expresia kvasinkového génu cystationín-p-syntázy (CBS) v kvasinkách

V tomto príklade sa na klonovanie génu CBS z kvasiniek použili metódy PCR. Fragment z PCR obsahujúci gén CBS sa vložil do expresívneho vektora jednak s peptidovou sekvenciou s funkciou afinitného značenia (affinity tag), ktorá sa pridala na uľahčenie izolácie exprimovaného génového produktu, jednak bez nej.

Ako zdroj génu CBS sa použil laboratórny kmeň Saccharomyces cerevisiae (5153-11-1) (his3met2). Bunky sa kultivovali na pôde YEPD pri 32 °C, odstredili, premyli vodou a previedli do 200 μϊ pufra kvasinkového plazmidu (Yeast Plasmid Buffer) (100 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA, 0,2 % SDS). Bunková suspenzia sa zmiešala s rovnakým objemom sklenených guľôčok s priemerom 0,45 mm a trepala vo vortexe 3 x 30 sekúnd pri vysokej rýchlosti. Kvapalina sa odstránila pipetou a odstreďovala dve minúty v mikroodstredivke na odstránenie bunkových zlomkov. Kalová voda sa extrahovala PCI (fenol: chloroform : izoamylalkoholy 25 : 24 : 1) a chloroformom. Pridal sa chlorid sodný (5 M, asi 20 μϊ) a DNA sa vyzrážala rovnakým objemom izopropanolu.

Kvasinková genómová DNA bola amplifikovaná PCR s primérmi CI-001 (CGGGGATCCTGATGCATG CATGATAAGGA, SEQ ID č. 3) a CI-012 (CGGCATTACCGTTTCACTAATTTATTG, SEQ ID č. 4), čo sú zverejnené nukleotidové sekvencie lemujúce štruktúrny gén pre kvasinkovú CBS. Primér CI-001 (SEQ ID č. 3) obsahuje miesto pre BamHI nachádzajúce sa na netranslatovanej strane 3' génu CBS. S cieľom pridať sekvenciu BamHI ku strane 5' fragmentu z PCR bol tento gén ďalej amplifikovaný pomocou PCR priméry CI-001 (SEQ ID č. 3) a CI-002 (GTTGGATCCGGCATTACCGTTTCAC, SEQ ID č. 5). Výsledný produkt PCR bola sekvencia DNA s približne 1937 pármi báz vrátane 1521 párov báz, ktoré kódujú protein CBS. Ďalšia DNA lemujúca kódujúcu sekvenciu obsahuje prírodný promótor a transkripčné terminačné sekvencie génu CBS z kvasiniek.

Proti smeru génu CBS bol vložený silnejší promótor na zvýšenie úrovne expresie proteinu. Kvasinkový promótor TP11 bol štandardnou reakciou PCR klonovaný z tej istej genómovej kvasinkovej DNA pomocou primérov CI-009 (GGTGGATCCATCAATAGATACGTACGTCCT, SEQ ID č. 6) a CI-010 (TTTTAGTTT ATGTATGTGTTTTTTG, SEQ ID č. 7). Na pripojenie kódujúcej oblasti CBS k promótoru TPI1 sa používa adaptorový primér CI-011 (AACACATACATAAACTAAAAATGACTAAATCTGAGCAGCAA, SEQ ID č. 8), obsahujúci 20 báz promótora TPI1 a prvých 21 báz génu CBS. Sekvencia CBS získaná vyššie sa amplifikovala pomocou PCR s primérmi CI-001 (SEQ ID č. 3) a CI-011 (SEQ ID č. 8). Výsledný produkt polymerázovej reťazovej reakcie PCR sa zmiešal s produktom klonovania promótora TPI1 získaným vyššie a zmes sa amplifikovala pomocou PCR s primérmi CI-001 (SEQ ID č. 3) a CI-009 (SEQ 1D č. 6) za vzniku fúzneho

SK 288189 Β6 génu označovaného TP1CBS obsahujúceho promótor TPI1, sekvenciu kódujúcu CBS a transkripčný terminátor CBS.

CBS a TPICBS z reakcie PCR obsahujú miesta pre BamHI na oboch stranách 5 a 3 kódujúcej oblasti. Tieto produkty PCR sa prečistili spôsobom PCR WIZARD PREP (Promega) podľa odporúčania výrobcu a nasledovalo štiepenie pomocou BamHI. Výsledné BamHI nukleotidové fragmenty sa separovali na 1 % géli Agarose TBE Gel a prečistili na papieri NA45 firmy S & S. Kvasinkový a E. coli kyvadlový vektor má jediné miesto pre BamHI v géne na rezistenciu proti tetracyklínu a použil sa na expresiu génu CBS. Vektor Cl-1 bol štiepený pomocou BamHI podľa návodu výrobcu (Roche Biochemicals) a kontaktovaný s alkalickou fosfatázou z gamáta. Fragmenty CBS a TPICBS sa vniesli ligáciou do linearizovaného vektora Cl-1. Ligačná reakcia sa transformovala do buniek TOP1O (Invitrogén), ktoré sa naniesli na platne s LB ampicilínom. Amp-rezistentné transformanty sa preniesli na platne LB amp a LB tet na stanovenie klonov citlivých na tetracyklín. Z LB amp platní sa vybralo niekoľko kolónií citlivých na tetracyklín, cez noc sa pestovali na LB amp platniach a ďalej spracovali alkalickou lýzou pre plazmidy DNA. Nasledovalo štiepenie DNA pomocou BamHI a jej izolácia na 1 % agarózovom géli na zistenie, ktoré plazmidy obsahujú inzerty CBS a TPICBS.

Plazmidy Cl-1 nesúce inzerty boli transformované do kvasinkového kmeňa INVSc-1, diploidného kmeňa komerčne dostupného od firmy Invitrogén. INVSc-1 má mutáciu v oboch kópiách génu LEU2 a potrebuje gén LEU2 z plazmidu Cl-1 na selektívny rast na pôde bez leucínu. INVSc-1 bol transformovaný plazmidmi príbuznými s Cl-1 s pomocou zostavy Yeast Transformation Kit od firmy Invitrogén podľa inštrukcií výrobcu. Tento súbor umožňoval prípravu sféroplastov z buniek pomocou výrobku Zymolyasa, po ktorej nasledovala úprava vápnikom na transformáciu DNA. Transformanty sa naniesli na syntetickú pôdu obsahujúcu sorbitol 1, kvasnicovú dusíkatú bázu a kvasnicové doplnky s výnimkou leucínu. Transformanty boli viditeľné na agarovom nátere po troch dňoch inkubácie pri 32 °C.

Pripojenie polyhistidínu k cystationín-P-syntáze na expresiu kvasiniek

Sekvencia DNA kódujúca 6 histidínov sa pridala k 3'koncu oblasti kódujúcej CBS v oboch vektorových konštruktoch CBS a TPICBS. K pôvodnému klonu CBS sa pridali sekvencie kódujúce polyhistidín amplifikáciou uvedeného fragmentu CBS z PCR s primérom CI-017 (ATGATGATGATGATGATGACCTG CTAAGTAGCTCAGTAA, SEQ ID č. 9) a primérom CI-002 (SEQ ID č. 5). Výsledný produkt PCR obsahuje oblasť prírodného promótora CBS, oblasť kódujúcu CBS a ďalšiu kódujúcu sekvenciu pre glycínový zvyšok a 6 histidínových zvyškov. Glycínový zvyšok sa pridal na zlepšenie priestorovej flexibility poly-hispeptidu po translácii. Poly-hisCBS ako produkt PCR sa prečistil gélom na separáciu od pôvodnej DNA CBS, a potom bol pomocou PCR postupne dvakrát amplifikovaný primérmi CI-002 (SEQ ID č. 5) a CI-017 (SEQ ID č. 9), aby sa prakticky odstránila pôvodná DNA CBS.

Podobne sa uvedený TPICBS ako produkt PCR amplifikoval s primérmi CI-009(SEQ ID č. 6) a CI-017 (SEQ ID č. 9). Produkt PCR bol prečistený na géli a dvakrát reamplifikovaný s CI-009 (SEQ-ID č. 6) a CI-017 (SEQ ID č. 9) s cieľom maximálne znížiť inkorporáciu sekvencie DNA TPICBS.

CBS gén bol tiež klonovaný reakciou PCR s primérmi CI-001 (SEQ ID č. 3) a C-018 (CATCATCATCA TCATCATTAAATAAGAACCCACGCT, SEQ ID č. 10) s cieľom vytvoriť polyhistidínovú sekvenciu s terminačným kodónom TAA, za ktorou nasleduje transkripčná terminačná sekvencia. Tento krátky produkt PCR (terminátor) s veľkosťou asi 190 bp bol tiež prečistený na géli a klonovaný PCR s tými istými primérmi. Polyhistidínová CBS a fragmenty terminátora sa spojili do jednej reakcie PCR s primérmi CI-001 (SEQ ID č.

3) a CI-002 (SEQ ID č. 5). Výslednou amplifikáciou vznikla molekula nukleovej kyseliny označovaná CBSH obsahujúca prírodný promótor CBS, oblasť kódujúcu celú CBS, jeden ďalší glycylový zvyšok, šesť histidylových zvyškov s terminačným kodónom a transkripčný terminátor CBS.

Podobne sa polyhistidínová TPICBS a fragmenty terminátora spojili do jednej reakcie PCR s primérmi CI-001 (SEQ ID č. 3) a CI-009 (SEQ ID č. 6).

Výsledný produkt nukleovej kyseliny označovaný TPICBSH bol rovnaký ako sekvencia SBSH s tým rozdielom, že promótor TPI1 nahradil prírodný promótor CBS. CBSH a TPICBSH, ktoré oba obsahovali polyhistidínovú peptidovú sekvenciu pre afinitné značenie (affinity tag), sa podrobili štiepeniu BamHI a ligácii do Cl-1 rovnako ako v prípade sekvencií pre CBS a TPICBS. Ligačné zmesi sa transformovali na INVSc-1. Kolónie citlivé na tetracyklín sa testovali na inzerciu vhodných klonovaných génov do Cl-1 enzýmovou reštrikčnou analýzou.

Príklad 3

Klonovanie, expresia a čistenie kvasinkového génu cystationín-p-syntázy (CBS) v E. coli

V tomto príklade sa použili PCR a štandardné spôsoby molekulárnej biológie na klonovanie génu cystationín-p-syntázy (CBS) Saccharomyces cerevisiae (INVScl) ako fúzneho proteínu s glutatión-S-transferázou (GST) s amínovým koncom. Pridanie tejto oblasti glutatión-S-transferázy umožňuje jednostupňové afinitné čistenie proteínu CBS z kultivačného média E. coli a tiež môže napomôcť solubilizácii a/alebo podporiť potrebné rozbalenie enzýmu do aktívnej formy.

Klonovanie

Laboratórny kmeň Saccharomyces cerevisiae (INVScl) (Invitrogen) sa použil ako zdroj génu CBS. Jediná kolónia kvasinkového INVScl sa varila v 100 pl deionizovanej vody 5 minút a rýchle sa trepala vo vortexe 2 minúty v prítomnosti rovnakého množstva sklenených guľôčok s priemerom 0,45 mm. 1 mikroliter tohto bunkového lyzátu sa potom použil ako zdroj DNA na amplifikáciu pomocou PCR kvasinkového génu CBS s využitím primérov CI-024 (GCGGGTCGACTATGACTAAATCTGAGCAGCAAGCC, SEQ ID č. 12) a CI-025 (GCGTGCGGCCGCGTTATGCTAAGTAGCTCAG, SEQ ID č. 13), ktoré obsahujú lemujúce sekvencie uvedeného génu kvasinkovej CBS a reštrikčné miesta na klonovanie do expresívneho vektora pGEX-6P-2 (Amersham Pharmacia). Výsledný produkt PCR (asi 1548 bp) sa potom izoloval a čistil extrakciou DNA na agarózovom géli s použitím komerčnej súpravy (Roche). Prečistený produkt PCR obsahujúci gén CBS lemovaný miestami reštrikčného enzýmu Sali (5'-koniec) a Nôti (3'-koniec) sa potom digeroval (pomocou Sali a Nôti) a prečistil gélom a pripojil ligáciou do expresívneho vektora pGEX6P-2 (Amersham Pharmacia). Použilo sa mapovanie reštrikčného enzýmu na overenie identity DNA amplifikovanej pomocou PCR ako génu kvasinkovej CBS. Sekvencia DNA pre klonovaný gén cystationín-p-syntázy (CBS) zo Saccharomyces cerevisiae je opísaná v (SEQ ID, č. 14). Tiež je opísaná proteínová sekvencia klonovaného enzýmu CBS zo Saccharomyces cerevisiae, ktorá má fúzny protein GST s amínovým (NH3) koncom pripojený v dôsledku klonovania do bakteriálneho expresívneho vektora pGEX6P-2 (SEQ ID č. 20)

Expresia a čistenie

Expresívny vektor pGEX6P-2 obsahujúci klonovaný gén kvasinkovej CBS (opísaný vyššie) sa transformoval na bunky E. coli TOP 10 (Invitrogen). Odobrali sa jednotlivé kolónie a bunkové štruktúry sa pestovali na pôde LB obsahujúcej 100 pm/ml ampicilínu pri 30 °C do dosiahnutia absorbancie pri 600 nm asi 0,5 OD. Ako induktor expresie fuzneho proteínu GST-CBS (podporovanej promótorom tac) sa pridával do kultivačného média izopropyl-p-tiogalaktopyranozid (IPTG) do dosiahnutia finálnej koncentrácie 0,1 mM. Pyridoxál 5'-fosfát sa ako kofaktor CBS počas indukcie tiež pridával do kultivačnej pôdy do 100 μΜ konečnej koncentrácie. Potom sa indukované bunky kultivovali pri 30 °C ďalších 21 hodín pred izoláciou odstredením.

Afinitne čistenie proteínu GST-CBS s použitím afmitnej živice Glutatione Sepharose 4B sa potom uskutočňovalo v zásade tak, ako sa opisuje v návode výrobcu (Amersham Pharmacia). Stručne povedané, bunky sa suspendovali vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS) a dezintegrovali sonikáciou na ľade. Potom sa pridával TritonX-100 do finálnej koncentrácie 0,1 % obj./obj. a sonikát sa trepal 30 - 45 minút pri izbovej teplote. Potom sa bunkový lyzát zbavil nerozpustných zlomkov odstredením, kontaktoval s DNázou I a vniesol na stĺpec afmitnej živice Glutatione Sepharose 4B. Nešpecifický viazané proteíny sa odstránili premytím PBS v množstve desaťnásobku objemu kolóny, a potom sa žiadaný protein GST-CBS vymyl z afinitnej živice pridaním elučného pufra (50 mM Tris, pH 8, 1,4 mM β-merkaptoetanolu (BME), 100 mM NaCl, 0,1 % vol./vol. TritonX-100 a 50 mM redukovaného glutatiónu) v množstve päťnásobku objemu kolóny. Výsledok čistenia fúzneho proteínu GST-CBS sa potom overil chromatografiou SDSPAGE (gélová chromatografia s dodecylsulfátom sodným a polyakrylamidom) s farbivom Coomassie Blue. Eluovaný GST-CBS sa potom dialyzoval do skladovacieho pufra (50 mN TrisHCl, pH 8, 100 mM NaCl, 5 μΜ PLP), rozdelil do alikvotných podielov a skladoval pri -80 °C. Koncentrácia prečisteného GSI-CSB sa potom určila pomocou súpravy na stanovenie proteínov MICRO BCA Protein Assay Kit (Pierce Chemical). Typický výťažok prečisteného GST-CSB bol v rozmedzí 5 - 10 mg GST-CSB na gram pasty E. coli.

Stanovenie aktivity CBS

Enzymatická CBS aktivita prečisteného fuzneho proteínu kvasinkového GTS-CBS sa zisťovala tak, ako opisuje Kashiwamata a Greenberg, Biochem. Biophy. Acta, zv. 212, ss. 488 - 500 (1970). Toto stanovenie sa zakladá na schopnosti CBS syntetizovať cystationín zo serínu a homocysteínu. Množstvo cystationínu vytvorené z CBS sa potom stanovilo spektrofotometricky detekciou chromagénu z reakcie s ninhydrínom na vlnovej dĺžke 455 nm a porovnaním so štandardnou krivkou vytvorenou použitím vzoriek so známymi koncentráciami cystationínu. Aktivita CBS sa tiež určovala nižšie opísanými enzymatickými metódami stanovenia alebo inými analytickými spôsobmi dobre známymi odborníkom.

Príklad 4

Vytvorenie fúzneho konštruktu ADH2CYS4

Expresia a čistenie kvasinkovej cystationín^-syntázy v kvasinkách

V tomto príklade sa vložil protismeme ku génu CYS A silný promótor ADH2 a použil sa ako fuzny konštrukt s kvasinkovým génom CBS na zvýšenie expresie proteínu. Promótor ADH2 sa reguluje pomocou Adr -Ip, je reprimovaný pri kultivácii buniek v médiu obsahujúcom glukózu a dereprimovaný pri kultivácii kvasinkových buniek v nefermentovateľnom uhlíkovom zdroji. To umožňuje regulovanú expresiu, ak je nadprodukcia proteínu pre bunky letálna.

Konštrukcia génu ADH2CYS4

Genómová DNA z kvasiniek sa amplifikovala pomocou primérov CI-029 (CTATATCGTAATAATGA CTAAATCTGAGCAGCAAGCCGATTCA, SEQ ID č. 15) a CI-017 (ATGATGATGATGATGATGACCT CGTAAGTAGCTCAGTAA, SEQ ID č. 9) na prípravu celého génu CYS4 bez terminačného kodónu a transkripčného terminátora. Primér CI-029 (SEQ ID č. 15) obsahuje najmenej 13 báz z oblasti promótora ADH2 klonovaných navyše k prvým desiatim kodónom génu CYS4. Primér CI-017 (SEQ ID č. 9) má sekvenciu pre najmenej šesť kodónov génu CYS4 s výnimkou terminačného kodónu, glycylového zvyšku a šiestich histidylových zvyškov. Výsledný produkt PCR obsahuje kódujúcu oblasť CYS4 a ďalšiu kódujúcu sekvenciu pre glycín a šesť histidínových zvyškov. Glycín bol pridaný na zlepšenie priestorovej pružnosti poly-his peptidu po translácii. Fragment terminátora sa vytvoril amplifikáciou tej istej genómovej DNA s primérmi CI-018 (CATCATCATCATCATCATTAAATAAGAACCCACGCT, SEQ ID č. 10) a CI-040 (AGGGCTCGAGGA TCCCGGGGGTGCTATTATGAATGCACGG, SEQ ID č. 16) na prípravu polyhistidínovej sekvencie s terminačným kodónom TAA nasledovaným transkripčným terminátorom. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) primérov CI-029/CI-017 vytvorila fragment s približne 1530 bp, zatiaľ čo reakcia primérov CI-018/0-040 vytvorila fragment s približne 331 bp. Tieto dva priméry sa spojili zmiešaním ich produktov z polymerázovej reťazovej reakcie PCR a amplifikáciou s primérmi CI-029/CI-040. Výsledný produkt bol označený CYS4H a bol dlhý asi 1861 bp.

Na spojenie promótora ADH2 s génovým fragmentom CYS4H sa najskôr vytvoril produkt PCR s primérom CI-027 (CGGGGATCCGACGTTTTGCCCGCAGGCGGGAAACC, SEQ ID č. 17) a s primérom CI-028 (AGATTTAGTCATTATTACGATATAGTTAATAGTTGATAG, SEQ ID č. 18) z tej istej kvasinkovej genómovej DNA na vytvorenie sekvencie promótora ADH2. Primér CI-028 (SEQ ID č. 18) obsahuje prvých 12 nukleotidov z kódujúcej oblasti génu CYS4. Preto existuje medzi primérmi CI-028 (SEQ ID č. 18) a CI-029 (SEQ ID č. 15) 25 nukleotidov, ktorých produkty sa vyznačujú komplementaritou DNA. Produkt reakcie PCR ADH2 sa zmiešal s fragmentom CYS4H a amplifikoval s primérmi CI-027 (SEQ ID č. 17) a CI-040 (SEQ ID č. 16) za vzniku produktového fragmentu s dĺžkou približne 2201 bp označovaného ADH2CYS4H. Všetky tieto produkty polymerázovej reťazovej reakcie sa overili reštrikčnou endonukleázovou analýzou.

Produkt ADH2CYS4H sa klonoval do YEp24 štiepením oboch DNA pomocou BamHI a ligáciou s využitím T4 DNA ligázy. Po ligách sa produkty transformovali do buniek E. coli TOP 10 (Invitrogen) a naniesli na platne s pôdou LB-agar plus ampicilín. Plazmidy pripravené pomocou súpravy Plasmid Preparation Kit (Roche) podľa odporúčania výrobcu z predpokladaných rekombinantov sa analyzovali reštrikčnou endonukleázovou analýzou. Plazmidy z klonov s overeným správnym inzertom sa transformovali do S. cerevisiae (BJ5460) a naniesli sa na úplnú syntetickú pôdu bez uracilu (SC-ura) doplnenú 2 % glukózy. Po dvoch dňoch sa predpokladané rekombinanty znovu naočkovali na taký istý typ platní s cieľom izolovať kolónie. Bunky sa indukujú kultiváciou na médiu SC-ura plus 2 % etanolu a 1 % peptónu, obvykle doplnenom 0,1 % glukózy, umožňujúcom kultiváciu buniek v priebehu 24 hodín. Po celonočnej kultivácii sa bunky izolovali odstredením a potom sa bunkové pelety držali pri -70 °C až do uskutočnenia lýzy. Bunky sa podrobili lýze resuspendovaním bunkových peliet v 0,05-násobnom objeme pôvodného objemu v pufre na lýzu. Na meniskus pufru sa potom pridali sklenené guľôčky.

Celá suspenzia sa trepala vo vortexe štyrikrát po jednej minúte, medzi vortexovaním sa bunky chladili 1 minútu na ľade. Lyzát sa preniesol do čistej skúmavky a 10 minút sa odstreďoval rýchlosťou 10.000 x g. Vyčírený lyzát sa umiestnil ako vrstva do kolóny s náplňou His-Resin (Roche) a proteín sa čistil podľa návodu výrobcu. Čiastočne prečistený proteín sa získal treťou elúciou.

Príklad 5

Príklady necyklickej časti postupov stanovenia homocysteínu

V tomto príklade sa demonštruje necyklická časť stanovenia pyruvátu a cystationínu.

Stanovenie pyruvátu

Pyruvát: tento vynález poskytuje meranie homocysteínu na základe použitia enzýmov CBS a CBL na cyklizáciu homocysteínu s prípravou pyruvátu a amoniaku. Rýchlosť prípravy pyruvátu a amoniaku je podľa predpokladu úmerná pôvodnej koncentrácii homocysteínu vo vzorke. Meranie tejto rýchlosti pomocou vhodného enzýmu alebo enzýmov predstavuje možnosť homogénneho stanovenia homocysteínu.

V jednom aspekte tohto vynálezu bol vyvinutý vysoko citlivý spôsob kvantitatívneho stanovenia pyruvátu. V tomto spôsobe pyruvátoxidáza konvertuje pyruvát na acetylfosfát, oxid uhličitý a peroxid. Následne peroxidáza mení peroxid vodíka, TOOS a 4-aminoantipyrín na chromogén, ktorý vykazuje absorpčné maximum blízko vlnovej dĺžky 550 nm. Moláma absorpčná kapacita chromogénu je dosť vysoká, okolo 36 l.mo. '.cm'¹.

Pomocou zložiek reagenta uvedených v tabuľke 1 a parametrov prístroja uvedených v tabuľke 2 sa pyruvát ľahko zmeral v μΜ rozsahu s včasným odčítaním slepého pokusu a koncového bodu reakcie počas 5 až 10 minút. Na obrázku 1 sa vynáša absorbancia proti času pre vodné kalibrátory a na obrázku 2 sa znázorňuje použitá kalibračná krivka.

SK 288189 Β6

Tabuľka 1

Pyruvátový spôsob: zložky reagenta
Chemikálie	Koncentrácia
Reagent 1
HEPES, hemisodná soľ	21,5 mM
HEPES, kyselina	28,6 mM
EDTA, (4 Na)	5,0 mM
MgSO4.7H2O	49,8 M
K2HPO4, dvojsýtna	7,5 mM
TOOS	1,4 mM
TTHA	0,8 mM
TPP	0,2 mM
4-aminoantipyrín	1,0 mM
BSA	1,9 g/1
Hexakyanoželeznatan draselný	0,07 mM
Chrenová peroxidáza	3,0 KU/1
Pyruvátoxidáza	3,0 KU/1
pH = 7,0

Tabuľka 2

Pyruvátový spôsob, parametre Cobas FARA
Parameter	Nastavenie
VŠEOBECNE
Spôsob merania	ABS
Spôsob reakcie	P-A
Spôsob kalibrácie	SLOPE AVG
Reagent slepého pokusu	REAG/DIL
Vlnová dĺžka	550 nm
Teplota	37 °C
ANALÝZA
Objem vzorky	40 μΐ
Objem riedidla	10 μΐ
Názov riedidla	H2O
Objem reagenta	250 μΐ
Čas inkubácie	60 sekúnd
Počiatočný objem reagenta	neznámy
Názov riedidla	h2o
Objem riedidla	neznámy
Čas inkubácie	neznámy
Počiatočný objem reagenta 2	neznámy
Názov riedidla	H2O
Objem riedidla	neznámy
Teplotné zdržanie	neznáme
ODČÍTANIE ABSORBANCIE
Prvé odčítanie	0,5 sekúnd
Počet	14
Interval	30 sekúnd
KALKULÁCIA
Počet stupňov	1
Stupeň kalkulácie 1	KINETICKÝ
Prvý	1
Posledný	14
KALIBRÁCIA
Počet štandardov (STD)	1
STDI	50 μΜ
Replikácia	2

Stanovenie cystationínu

Cystationín sa stanovil pridaním CBL k opísanému reagentu pre pyruvát. CBL konvertuje cystationín na homocysteín, pyruvát a amoniak. Potom sa pyruvát meral ako je opísané vyššie. Zloženie reagenta používaného na stanovenie cystationínu je uvedené v tabuľke 3. Meranie sa môže uskutočniť s pomocou ktoréhokoľ5 vek vhodného prístroja. V tomto vynáleze sa použil systém Cobas FARA (firma Roche, Bazilej, Švajčiarsko). Typické parametre tejto reakcie sú uvedené v tabuľke 4. Obrázok 3 znázorňuje graf premeny absorbancie s časom uskutočnenej s použitím vhodných roztokov cystationínu. Reakcia dosahuje koncový bod skôr než za desať minút.

Tabuľka 3

Cystationínový spôsob: zložky reagenta
Chemikálie	Koncentrácia
Reagent 1
HEPES, hemisodná soľ	20,3 mM
HEPES, kyselina	27,0 mM
EDTA,(4 Na)	4,7 mM
MgSO4.7H2O	47,1 mM
K2HPO4, dvojsýtna	7,1 mM
TOOS	1,3 mM
TTHA	0,8 mM
TPP	0,2 mM
4-aminoantipyrín	0,9 mM
BSA	1,8 g/l
Hexakyanoželeznatan draselný	0,07 mM
Chrenová peroxidáza	2.8 KU/1
Pyruvátoxidáza	2,8 KU/1
CBL	1,9 g/l
pH = 7,0

Tabuľka 4

Cystationínový spôsob: parametre Cobas FARA
Parameter	Nastavenie
VŠEOBECNE
Spôsob merania	ABS
Spôsob reakcie	P-A
Spôsob kalibrácie	LIN INTER
Reagent slepého pokusu	REAG/DIL
Vlnová dĺžka	550 nm
Teplota	37 °C
ANALÝZA
Objem vzorky	30 μΐ
Objem riedidla	10 μΐ
Názov riedidla	H2O
Objem reagenta	260 μΐ
Čas inkubácie	60 sekúnd
Počiatočný objem reagenta	neznámy
Názov riedidla	H2O
Objem riedidla	neznámy
Čas inkubácie	neznámy
Počiatočný objem reagenta 2	neznámy
Názov riedidla	h2o
Objem riedidla	neznámy
Teplotné zdržanie	neznáme
ODČÍTANIE ABSORBANCIE
Prvé odčítanie	5 sekúnd
Počet	21

SK 288189 Β6

Cystationínový spôsob: parametre Cobas FARA
Interval	| 60 sekúnd
KALKULÁCIA
Počet stupňov	1
Stupeň kalkulácie 1	Koncový bod
Prvý	1
Posledný	10
KALIBRÁCIA
Počet štandardov (STD)	1
STD1	50 μΜ
Replikácia	2

Obrázok 4 znázorňuje štandardné krivky získané s vodnými roztokmi cystationínu. Tieto krivky sú lineárne najmenej v rozmedzí koncentrácií cystationínu 0-100 μΜ. Vytvorený chromofor bol stabilný približne 15-20 minút, keď sa však testovali vzorky s 10- až 20-krát vyšším obsahom cystationínu, bola zrejmá istá nestabilita chromogénu.

Pri niektorých pokusoch obsahovala reakčná zmes serín. Serín v koncentrácii 250 μΜ nevykazoval pozorovateľný efekt. Pri týchto stanoveniach boli tolerované aj vyššie koncentrácie serínu. Neintervencia serínu je významným poznatkom, pretože pri stanovení homocysteínu je prítomnosť serínu nevyhnutná.

Príklad 6

Enzymatické cyklické stanovenia homocysteínu

V tomto príklade sa poskytujú enzymatické cyklické systémy stanovenia koncentrácie homocysteínu s pomocou buď signálneho systému pyruvátoxidáza/peroxidáza, alebo signálneho systému laktátdehydrogenáza.

Demonštrácia cyklického systému: enzymatický cyklický systém CBS/CBL/PO/HRP

Bol ukázaný cyklický systém, v ktorom bola reakcia začatá buď homocysteínom, alebo cystationínom. V tabuľke 5 sú uvedené zložky reagenta použitého v tomto experimente. CBS a serín sa pridali oddelene až po zmiešaní vzorky s reagentom 1, ktorý obsahuje všetky ostatné zložky. Príslušné parametre Cobas FARA sú uvedené v tabuľke 6. Cystationín alebo homocysteín sa rozpustili vo vode, aby sa mohli pripraviť štandardy s vhodnou koncentráciou. Na obrázkoch 5 a 6 sú znázornené grafy časových zmien absorbancie. Po intervale oneskorenia troch až šiestich minút boli tieto vzťahy lineárne. Typická kalibračná krivka homocysteínu na obrázku 7 sa môže použiť, aj keď nie je celkom lineárna, na kvantitatívne stanovenie koncentrácie homocysteínu vo vhodných vzorkách s použitím vhodnej techniky na konštrukciu krivky.

Tabuľka 5

Cyklické použitie CBS/CBL, spôsob PO/HPR
Zložky reagenta
Chemikálie	Koncentrácia
Reagent 1
HEPES, hemisodná soľ	20,3 mM
HEPES, kyselina	27,0 mM
EDTA,(4 Na)	4,7 mM
MgSO4.7H2O	47,1 mM
K2HPO4, dvojsýtna	7,1 mM
TOOS	1,3 mM
TTHA	0,8 mM
TPP	0,2 mM
4-aminoantipyrín	0,9 mM
BSA	1,8 g/1
Hexakyanoželeznatan draselný	0,07 mM
Chrenová peroxidáza	3,0 KU/1
Pyruvátoxidáza	3,0 KU/1
CBL
pH = 7,0
Reagent SRI

SK 288189 Β6

Cyklické použitie CBS/CBL, spôsob PO/HPR
Serín	3,1 mM
Reagent SR2
CBS	1,23 g/1

Tabuľka 6

Cyklický systém CBS/CBL/PO/HPR: parametre Cobas FARA
Parameter	Nastavenie
VŠEOBECNE
Spôsob merania	ABS
Spôsob reakcie	P-I-SR 1 -I-SR2-A
Spôsob kalibrácie	LIN INTER
Reagent slepého pokusu	REAG/DIL
Vlnová dĺžka	550 nm
Teplota	37 °C
ANALÝZA
Objem vzorky	30 μΐ
Objem riedidla	10 μΐ
Názov riedidla	H2O
Objem reagenta	260 μΐ
Čas inkubácie	60 sekúnd
Počiatočný objem reagenta	30 μΐ (serín)
Názov riedidla	h2o
Objem riedidla	5 μΐ
Čas inkubácie	10 sekúnd
Počiatočný objem reagenta 2	30 μΐ (CBS)
Názov riedidla	H2O
Objem riedidla	5 μΐ
Teplotné zdržanie	neznáme
ODČÍTANIE ABSORBANCIE
Prvé odčítanie	0,5 sekúnd
Počet	14
Interval	30 sekúnd
KALKULÁCIA
Počet stupňov	1
Stupeň kalkulácie A	ENDPOINT alebo KINETIC
Prvý	1
Posledný	14
KALIBRÁCIA
Počet štandardov (STD)	1
STD1	50 μΜ
Replikácia	2

Redukcia disulfidových väzieb

V ľudskej plazme je prítomného len veľmi málo homocysteínu v redukovanom stave s inou než disulfidovou väzbou. Väčšina homocysteínu je na proteíny alebo na malé molekuly viazaná disulfidovými väzbami. Redukcia disulfidov týchto zlúčenín je nevyhnutná na uvoľnenie homocysteínu na uskutočnenie merania akýmkoľvek spôsobom na stanovenie celkového homocysteínu. Tento príklad ukazuje, že použitie redukčné10 ho činidla je kompatibilné so systémom, ktorý používa laktátdehydrogenázu a NADH. Použiteľné redukčné činidlá zahŕňajú DTE, DTT, n-acetylcysteín, tioglykolovú kyselinu, TCEP a podobne. Pri použití týchto zlúčenín v rámci spôsobu podľa tohto vynálezu je nutné presné nastavenie koncentrácie redukčného činidla a parametrov použitého prístroja. Predchádzajúce údaje, že určité redukčné činidlá by mohli inhibovať pôsobenie pyruvátoxidázy a/alebo chrenovej peroxidázy, viedli k objaveniu alternatívneho systému detekcie pyruvá15 tu, ktorý sa opisuje ďalej.

SK 288189 Β6

Demonštrácia cyklického systému: systém CBS/CBL/LDH

Pyruvát reaguje s NADH v prítomnosti enzýmu laktátdehydrogenázy za vzniku kyseliny mliečnej a NAD.

Pyruvát je možné kvantitatívne určiť meraním poklesu absorbancie na vlnovej dĺžke 340 nm. Moláma absorptivita NADH je asi 6x menšia než moláma absorptivita chromagénu generovaného peroxidázou. To však systém podľa tohto vynálezu nijako neovplyvňuje, pretože cyklické stanovenie homocysteínu pomocou CBS/CBL je schopné generovať pomerne veľké množstvá pyruvátu.

Zloženie reagenta použitého pri vzniku údajov prezentovaných na obrázkoch 8, 9, 10 a 11 zahŕňa serín, CBL a laktátdehydrogenázu v pufri HEPES (pH 7,2) tvoriacich prvý reagent. Potom sa do sekvencie pridajú NADH v pufri Tris (pH 8,5) a CBS. Všetky uvedené zložky je možné však kombinovať aj inak, aby vytvorili systém buď dvoch, alebo troch reagentov na stanovenie homocysteínu. V tabuľke 7 sa uvádzajú koncentrácie reagenta a parametre Cobas a FARA sú uvedené v tabuľke 8. Koncentrácia NADH sa modifikovala, aby sa zaistila dostatočná linearita a umožnila sa absorpcia vzorky plazmy na vlnovej dĺžke 340 nm.

Tabuľka 7

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: zložky reagenta
Chemikálie	Koncentrácia
Reagent 1
HEPES, hemisodná soľ	39,4 mM
HEPES, kyselina	12,6 mM
Serín	0,72 mM
Laktátdehydrogenáza	33,000 U/l
CBL	6,05 pg/l
pH = 7,2
Reagent SR1
NADH	4,16 mM
Tris	50 mM
pH = 8,5
Reagent SR2
CBS	996 mg/1
TRIS	50 mM
Chlorid sodný	100 mM
Pyridoxál fosfát	5 μΜ
Riedidlo vzorky
DTT	13 mM
HEPES, hemisodná soľ	56,7 mM
Hepes, kyselina	18,1 mM
pH = 7,2

Tabuľka 8

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: parametre Cobas FARA
Parameter	Nastavenie
VŠEOBECNE
Spôsob merania	ABS
Spôsob reakcie	P-I-SR1-I-SR2-A
Spôsob kalibrácie	LIN 1NTER
Reagent slepého pokusu	REAG/DIL
Vlnová dĺžka	340 nm
Teplota	37 °C
ANALÝZA
Objem vzorky	30 μΐ
Objem riedidla	10 μΐ
Názov riedidla	H2O (alebo redukčné činidlo)
Objem reagenta	250 μΐ
Čas inkubácie	60 sekúnd

SK 288189 Β6

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: parametre Cobas FARA
Parameter	Nastavenie
Počiatočný objem reagenta	15 μΐ (NADH)
Názov riedidla	H2O
Objem riedidla	5 μΐ
Čas inkubácie	10 sekúnd
Počiatočný objem reagenta 2	30 μΐ (CBS)
Názov riedidla	H2O
Objem riedidla	10 μΐ
Teplotné zdržanie	neznáme
ODČÍTANIE ABSORBANCIE
Prvé odčítanie	5 sekúnd
Počet	16
Interval	30 sekúnd
KALKULÁCIA
Počet stupňov	1
Stupeň kalkulácie A	ENDPOINT alebo KINETIC
Prvý	6
Posledný	20
KALIBRÁCIA
Počet štandardov (STD)	1
STD1	25 - 50 μΜ
Replikácia	2

Analýza vodných roztokov:

Systém fungoval dobre pri zisťovaní homocysteínu vo vodných roztokoch. Na obrázkoch 8 a 9 sú znázornené typické grafy časovej závislosti absorbancie. Tieto diagramy boli lineárne s malým alebo zanedba5 teľným časovým oneskorením. Rýchlosti vymiznutia NADH boli pomerne vysoké. Navyše bol kalibračný diagram koncentrácia homocysteínu versus absorbancia vo vzorke lineárny v rozmedzí 0-100 μΜ (obrázok 10). Preto bol na kalibráciu potrebný len jeden kalibrátor (napríklad 25 μΜ) spolu s reagentom slepého pokusu.

Homocysteínové roztoky sa pripravili v rôznych koncentráciách s úmyslom demonštrovať použiteľnosť tohto spôsobu pri koncentráciách homocysteínu v rozmedzí 2-20 μΜ. Výsledky sa uvádzajú v tabuľke 9 jednak pre prípad prítomnosti, jednak neprítomnosti DTT. Ako je uvedené, DTT slúži na redukciu disulfidových väzieb vo vzorkách (napríklad sérum, plazma a podobne). DTT významne neinterferuje v reakcii katalyzovanej laktátdehydrogenázou.

Tabuľka 23

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: demonštrácia linearity reakčný čas = 3 minúty
Koncentrácia homocysteínu (μΜ)	Zistená hodnota μΜ
	(-) DTT	(+) DTT
2	2	1,2
5	5,2	4,3
8	8,2	7,4
10	10,4	9,9
12,5	12,7	12,5
16,7	16,8	16,3
20	20,5	20

Analýza kontrolných produktov na báze ľudskej plazmy

Presná funkcia cyklického systému CBS/CBL/LDH bola demonštrovaná pomocou kontrolných produk20 tov homocysteínu na báze ľudskej plazmy vyrábaných firmou Bio-Rad Co. Použili sa rôzne koncentrácie DTT a inkubačné časy sa menili s cieľom dosiahnuť optimálny výťažok homocysteínu. Inkubačné časy 5 až 15 minút s koncentráciami DTT v rozmedzí 1,6 až 3,2 mM umožnili stanovenie homocysteínu v rozmedziach obvyklých pre rôzne iné spôsoby.

SK 288189 Β6

Vzorky ľudskej plazmy:

Cyklické stanovenie homocysteínu fungovalo dobre pri použití vzoriek ľudskej plazmy s DTT ako redukčným činidlom. Výsledky sa dobre zhodujú s výsledkami nezávislého laboratória používajúceho spôsob Abbott IMx pre homocysteín (obrázok 11). Parametre Cobas FARA použité v tomto experimente sa uvádzajú v tabuľke 10 a zložky reagenta sú v tabuľke 7. Pri tomto stanovení sa použil vodný kalibrátor homocysteínu (25 μΜ). Grafy časovej závislosti absorbancie boli pre vodné vzorky v neprítomnosti DTT lineárne a v prítomnosti DTT takmer lineárne. Grafy časovej závislosti absorbancie však boli pri použití plazmy po prvých troch minútach odlišné, to znamená nelineárne. Zdá sa že za podmienok uvedených v tabuľkách 7 a 10 sa cyklizácia s časom postupne spomaľuje. Napriek tomu korelačná štúdia na obrázku 11 ukazuje relatívne tes10 nú zhodu medzi týmto spôsobom podľa vynálezu (tabuľky 7 a 10) a výsledkami získanými spôsobom IMx pri testovaní vzoriek ľudského séra.

Tabuľka 10

Cyklický systém CBS/CBL/LDH : parametre Cobas FARA pre korelačnú štúdiu s ľudskou plazmou
Parameter	Nastavenie
VŠEOBECNE
Spôsob merania	ABS
Spôsob reakcie	P-T-I-SR1-I-SR2-A
Spôsob kalibrácie	LIN INTER
Reagent slepého pokusu	REAG/DIL
Vlnová dĺžka	340 nm
Teplota	37 °C
ANALÝZA
Objem vzorky	30 μΐ
Objem riedidla	10 μΐ
Názov riedidla	H2O (alebo redukčné činidlo)
Teplotné zdržanie	900 sekúnd
Objem reagenta	250 μΐ
Čas inkubácie	60 sekúnd
Počiatočný objem reagenta	15 μΐ (NADH)
Názov riedidla	H2O
Objem riedidla	5 μΐ
Čas inkubácie	10 sekúnd
Počiatočný objem reagenta 2	30 μΐ (CBS)
Názov riedidla	H2O
Objem riedidla	10 μΐ
Teplotné zdržanie	neznáme
ODČÍTANIE ABSORBANCIE
Prvé odčítanie	5 sekúnd
Počet	24
Interval	30 sekúnd
KALKULÁCIA
Počet stupňov	1
Stupeň kalkulácie 1	ENDPOINT alebo KINETICKÝ
Prvý	1
Posledný	6
KALIBRÁCIA
Počet štandardov	1
STDI	25 alebo 50 μΜ
Replikácia	2

Vo výhodnom uskutočnení sa rýchlosti merali v prvých troch minútach po začatí reakcie. Ďalšia optimalizácia systému vrátane zmien v koncentráciách soli a detergenta bude pravdepodobne postupovať v smere konzistentnejších výsledkov s vodnými a plazmovými vzorkami. Stanovenie bolo rovnako presné, keď sa vzorky spojili do dvoch alebo troch zmesí reagentov.

SK 288189 Β6

Príklad 7

Porovnanie rôznych spôsobov stanovenia homocysteínu

V tomto príklade sa testoval výhodný spôsob stanovenia homocysteínu podľa tohto vynálezu a porovnával sa s dvoma existujúcimi spôsobmi stanovenia, totiž s bežnou technikou HPLC a komerčne dostupným spôsobom IMx.

Stanovenie podľa vynálezu sa uskutočňovalo s použitím troch reagentov, ako sa uvádza v tabuľke 11. Prvý reagent Rl bol spočiatku v práškovej forme a rozpustil sa v pomere 1,5 g prášku v 100 ml vody. Úplná súprava na stanovenie tiež obsahovala kalibrátory obsahujúce L-cystationín, ktorým bol v rôznych koncentráciách obohatený matrix ľudskej plazmy, rovnako ako dve kontrolné vzorky zostavené v upravenom matrixe ľudskej plazmy.

Tabuľka 11

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: zložky reagenta
Chemikália	Koncentrácia
Reagent 1
HEPES, hemisodná soľ	43,3 mM
HEPES, kyselina	12,7 mM
Serín	1,295 mM
Laktátdehydrogenáza	>800 U/l
NADH	1,06 mM
TritonX-100	0,05 % obj./obj.
Azid sodný	7,7 mM
pH = 8,0
Reagent SRI
DTE	6,75 mM
citrónová kyselina	20 mM
pH = 2,0
Reagent SR2
CBS	18,7 KU/1
CBL	8,9 KU/1
Sorbitol	1,65 M
Chlorid sodný	100 mM
Pyridoxál fosfát	5 μΜ
Azid sodný	7,7 mM
TRIS/HC1	50 mM
pH = 8,0

Tabuľka 12

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: parametre Cobas MIRA
Parameter	Nastavenie
VŠEOBECNE
Spôsob merania	absorpčné
Spôsob reakcie	R-S-SR1-SR2
Spôsob kalibrácie	Lin Regre
Reagent slepého pokusu	Reag/Dil
Čistiaci prostriedok	nie je
Vlnová dĺžka	340 nm
Rád v desiatkovej sústave	2
Jednotka	pmol/l
ANALÝZA
Faktor po rozpustení (Post Dil. Factor)	nie
Koncentračný faktor	nie
Cyklus vzorky	1
Objem vzorky	30,0 μΐ

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: parametre Cobas MIRA
Parameter	Nastavenie
Názov rozpúšťadla	H2O
Objem rozpúšťadla	25,0 μΐ
Cyklus reagenta	1
Objem reagenta	90 μΐ
Počiatočný cyklus R1	2
Objem počiatočného cyklu R1	25 μΐ
Názov riedidla	H2O
Objem riedidla	25 μΐ
Počiatočný cyklus R2	17
Objem počiatočného cyklu R2	35 μΐ
Názov riedidla	Η2Ο
Objem riedidla	15 μΐ
KALKULÁCIA
Limit vzorky	nie
Smer reakcie	pokles
Kontrola	vypnuté (off)
Nadbytok antigénu	nie
Faktor konverzie (Covers. Factor)	1,00
Posun (Offset)	0,00
Testovací rozsah nízky (Test Range Low)	zapnuté (on)
Testovací rozsah vysoký (Test Range High)	zapnuté (on)
Bežný rozsah nízky (Normál Range Low)	nie
Bežný rozsah vysoký (Normál Range High)	nie
Počet stupňov	1
Kalkulačný stupeň A	Kinetic
Prvé odčítanie	18
Posledné odčítanie	32
Limit reakcie	nie
KALIBRÁCIA
Kalibračný interval	každá séria
Slepý pokus
Rozpätie reagentov nízke (Reag. Range Low)	nie
Rozpätie reagentov vysoké (Reag. Range High)	nie
Rozpätie slepého pokusu nízke (Blank Range Low)	nie
Rozpätie slepého pokusu vysoké (Blank Range High)	nie
Štandardy	1
1	3,5 pmol/l
2	7,0 pmol/l
3	17 pmol/l
4	27 pmol/l
5	47 pmol/l
6	nie
7	nie
Replikácia	jediná
Odchýlka (Deviation)

SK 288189 Β6

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: parametre Cobas MIRA
Parameter	Nastavenie
Opravný štandard	nie
Kontrola
Poloha CS1 (CS1 position)	nie
Poloha CS2 (CS2 position)	nie
Poloha CS3 (CS3 position)	nie

Pri tomto stanovení sa použili komerčné prístroje Cobas MIRA. Softvér Cobas MIRA umožňuje 50 programovateľných 25-sekundových cyklov. Tento prístroj bol programovaný podľa parametrov v tabuľke 12. V prvom cykle sa do kyvety pridalo 1,30 μΐ vzorky, potom 25 μΐ výplachovej vody a 90 μΐ kvapalného Rea5 genta Rl. Na začiatku cyklu 2 sa pridalo 2,25 μΐ reagenta SR1 s ďalšími 25 μΐ výplachovej vody. Potom sa zmes nechala inkubovať počas 15 cyklov (6,25 min.), aby redukčné činidlo mohlo uvoľniť všetok viazaný homocysteín a dezintegrovať všetok prítomný endogénny pyruvát. V tomto okamihu sa pridalo 35 μΐ enzýmového reagenta CBS/CBL s ďalšími 15 μΐ výplachovej vody. Medzi cyklami 18 a 32 sa priebežne meral pokles absorbancie na vlnovej dĺžke 340 ako miera homocysteínu vo vzorke. Celkový čas stanovenia medzi pridaním vzorky a finálnym odčítaním absorbancie bol 32 cyklov alebo 13 minút a 20 sekúnd. Keďže sa viac vzoriek stanovuje naraz, MIRA produkuje ďalšie výsledky vzoriek rýchlosťou jedna za 30 - 90 sekúnd v závislosti od dĺžky cyklu a počtu kalibrátorov v tomto analytickom systéme. S použitím podobných programových parametrov sa toto stanovenie môže adaptovať na ešte rýchlejšie automatické analytické systémy (napríklad Roche INTEGRA, Hitachi, ACE a pod.), ktoré môžu ponúknuť väčšie výkony za jednotku času.

Všetkých 24 vzoriek sa testovalo s pomocou spôsobu stanovenia podľa vynálezu a známych komparatívnych stanovení. Tabuľka 13 uvedená nižšie ukazuje koncentrácie homocysteínu získané s pomocou týchto troch spôsobov. Obrázky 12 - 14 sú korelačné grafy znázorňujúce graficky výsledky z tabuľky 13. Ako je možné vidieť, spôsob podľa vynálezu tesne koreluje s IMx a HPLC, pričom tesnejšia zhoda je zrejmá s IMx. Tento spôsob podľa vynálezu je však podstatne menej nákladný, je možné ho uskutočniť rýchlejšie a s použi20 tím bežne dostupných prostriedkov chemickej analýzy.

Vynález sa vyznačuje dobrou presnosťou výsledkov medzi sériami, ako je zrejmé z tabuľky 14. Typické koncentračné odchýlky vnútri sérií boli menšie než 4 % v rozmedzí koncentrácií homocysteínu 7-20 pmol/l.

Tabuľka 27

Porovnanie spôsobov stanovenia homocysteínu
č. vzorky	HPLC	Koncentrácia homocysteínu (μΜ)
Vynález	IMx
1	9,5	11,5	11,7
2	14,3	13,1	12,1
3	8,8	7,8	7,5
4	10,6	10,1	9,4
5	10,5	10,1	9,9
6	8,6	9,2	7,2
7	7,6	5,8	6,2
8	5,2	3,5	3,1
9	9,6	9,3	9,7
10	7,7	8,7	7,5
11	11,2	11,1	9,4
12	10,5	8,3	8,1
13	11,9	8,4	8,3
14	10,8	9,2	8,9
15	14,1	12,3	12,5
16	24,3	16,3	17,9
17	20,9	17,7	17,8
18	24,2	22,7	22,1
19	33,6	26,4	26,4
20	21,0	20,7	18,9
21	22,7	19,6	18,1
22	20,5	17,3	16,6
23	25,6	23,3	22,0

SK 288189 Β6

Porovnanie spôsobov stanovenia homocysteínu
č. vzorky	HPLC	Koncentrácia homocysteínu (μΜ)
Vynález	IMx
24	20,5	17,0	15,8
Priemer	15,2	13,3	12,8
INTCP [Intercept] [HPLC]		1,4	0,9
Smernica [Slope] [HPLC]		1,2	1,2
R [HPLC]		0,957	0,974
INTCP [Intercept] [IMx]	-0,3	0,5
Smernica [Slope] [IMx]	0,8	1,0
r [IMx]	0,976	0,990

Tabuľka 14

Presnosť medzi sériami
Homocysteín (μπιοί/ΐ)
Vzorka	Séria 1	Séria 2	Priemer	Koncentračná variabilita, %
1	16,35	16,46	16,41	0,47
2	12,13	12,58	12,36	2,58
3	19,45	21,6	20,53	7,41
4	16,29	16,79	16,54	2,14
5	11,13	10,01	10,57	7,49
6	7,33	7,56	7,45	2,18
7	6,31	7,24	6,78	9,71
8	7,13	5,54	6,34	17,75
9	14,87	14,5	14,69	1,78
10	13,81	13,41	13,61	2,08
11	26,86	28,66	27,76	4,58
12	12,45	13,05	12,75	3,33
13	10,15	10,74	10,45	3,99
14	9,6	10,39	10,00	5,59
15	12,53	13,67	13,10	6,15
16	14,60	15,20	14,90	2,85
17	25,03	25,65	25,34	1,73
18	20,77	20,03	20,40	2,56
19	31,83	32,10	31,97	0,60
20	36,86	36,43	[36,65	0,83
21	11,65	11,48	11,57	1,04
22	40,22	38,25	39,24	3,55
23	31,68	32,62	32,15	2,07
24	7,68	6,38	7,03	13,08
Priemerná koncentračná variabilita (CV), % = 4,22

Príklad 8

Účinok koncentračných výkyvov

V tomto príklade sa uskutočnilo stanovenie výhodným spôsobom podľa vynálezu opísaným v príklade 7 s premenlivými koncentráciami niektorých zložiek reagentov, menovite LDH, NADH a serínu. Cieľom bolo určenie optimálneho množstva týchto zložiek reagentov. Stanovenia sa uskutočňovali, ako je opísané vyššie, pričom sa koncentrácie zložiek menili. Tabuľka 15 uvádza výsledky týchto testov.

SK 288189 Β6

Tabuľka 15

Účinok variácií koncentrácie zložiek reagenta
(LDH) (U/l) finálna reakčná zmes	Smernica (Slope) (mA/min./μΜ)	INTCP (Intercept) mA/min.	Slepý pokus (mA/min.)	Cieľové rozmedzie pre homocysteín v kontrolnej vzorke: 25 - 35 μΜ
114,5	1,21	-0,14	-10,2	25,8
229,3	1,14	0,12	-11,2	28,1
458,7	1,17	0,14	-11,3	26,6
917,5	0,88	1,89	-11,3	27,2
(NADH) (mM)
0,130	0,77	4,23	-10,7	32,9
0,259	1,12	0,05	-11	25,2
0,389	1,09	0,45	-10,7	26,8
0,519	1,13	0,49	-11,1	26,0
(Serín) (mM)
0,125	0,64	2,23	-6,7	30,9
0,25	0,92	1,26	-9,0	28,1
0,5	1,13	0,63	-10,8	27,1
1	1,16	0,15	-13,6	28,3
2	1,23	0,33	-15,4	28,2

Výsledky v tabuľke 15 umožňujú selekciu finálnych koncentrácií zložiek reagenta, ktoré vykazujú potrebnú 5 citlivosť pri minimálnom rozsahu slepého pokusu (blank rate) a zároveň minimalizujú náklady na reagent.

Príklad 9

Účinok zmeny vo formulácii R1 na cyklické stanovenie.

Tento príklad zisťoval účinok zmeny pH zámenou pufru za TRIS v množstve 250 mM pri pH 8,4 a prí10 davkom lipázy a α-cyklodextrínu k reagentu 1. Po uskutočnení týchto formulačných zmien sa testovala účinnosť stanovenia. Tabuľka 16 uvádza podrobne zložky reagenta použité na tieto experimenty.

Tabuľka 16

Cyklický systém s CBS/CBL/LDH: zložky reagenta

Chemikália	Koncentrácia
Reagent 1
TRIS	250 mM
alfa-cyklodextrín	0,1 %
Lipáza	>200 kU/1
Serín	1,295 mM
Laktátdehydrogenáza	>800 U/l
NADH	1,06 mM
TritonX-100	0,05 % obj ./obj.
Azid sodný	7,7 mM
pH = 8,2
Reagent SR1
TCEP	26,3 mM
Reagent SR2
CBS	28,5 KU/1
CBL	9,4 KU/1
Glycerol	10%
Sorbitol	1 %
Pyridoxál fosfát	5 μΜ
Azid sodný	7,7 mM
Fosforečnan draselný	100 mM
pH = 7,6

SK 288189 Β6

Keď sa zmenil pufer reagenta 1 na TRIS v množstve 250 mM pri pH 8,4, zlepšila sa konzistencia stanovenia. Bolo tomu tak preto, že CBS a CBL sú pri pH 8,4 podstatne aktívnejšie a rýchlosť cyklizácie sa zvýšila asi trikrát.

Lipáza a α-cyklodextrín sa pridali, aby vyriešili problém so zakalenými vzorkami (lipemickými), s kto5 rými sa v klinickom laboratóriu niekedy stretávame. Také vzorky môžu vzniknúť, keď pacient, ktorému sa vzorky odobrali, jedol krátko pred odobratím vzoriek krvi, alebo keď u neho prebiehajú niektoré chorobné procesy. Zákal môže interferovať s výsledkami tohto testovania, pretože vyvolá na vlnovej dĺžke 340 nm takú vysokú hodnotu absorbancie, že tento prístroj nemôže presne merať malé zmeny v absorbancii, ku ktorým dochádza pri konverzii NADH na NAD. Zákal tiež môže interferovať s výsledkami testovania dynamicky, a to priebežnými zmenami pri meraní konverzie NADH na NAD. Napríklad, keď klesá množstvo zákalu, absorbancia na 340 nm tiež klesá, pretože sa zmenší rozptyl svetla. Tento efekt sa kombinuje s poklesom absorbancie spôsobeným redukciou pyruvátu, a preto môže následné stanovenie homocysteínu dať príliš vysoké výsledky. Prídavok lipázy a α-cyklodextrínu zmenšuje zákal vzoriek, pravdepodobne hydrolýzou triglyceridov na glycerol a tým, že voľné mastné kyseliny vytvárajú komplexy s α-cyklodextrínom. Preto sa zakalené reakčné zmesi vyčíňa, dokiaľ sa pridá SR2 (R3), a tým sa umožní presné meranie rýchlosti produkcie pyruvátu. Absorbancia na vlnovej dĺžke 340 nm mnohých zakalených reakčných zmesí takto rýchle poklesla a vyrovnala sa počas niekoľkých minút. Výsledky homocysteínu boli presné. Niektoré zakalené vzorky sa však celkom nevyčírili pred pridaním SR2 (R3), a preto výsledky pri niektorých vzorkách boli trochu nepresné. Predsa len sa zdá, že použitie lipázy a α-dextrínu predstavuje sľubný spôsob, ako docieliť presné výsledky stanovenia pri zakalených vzorkách.

Okrem zmien v zložení reagentov sa testoval tiež účinok zmien ich objemov na účinnosť stanovenia. Tieto zmeny sa uvádzajú v tabuľke 17, ktorá ukazuje typické parametre cyklizácie pri použití systému Cobas MIRA. Po uskutočnení týchto zmien sa uskutočnila korelačná štúdia s 86 ľudskými vzorkami s výsledkami uvedenými v tabuľke 18.

Tabuľka 17

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: parametre Cobas MIRA
Parameter	Nastavenie
VŠEOBECNE
Spôsob merania	absorpčný
Spôsob reakcie	R-S-SR1-SR2
Spôsob kalibrácie	lineárna regresia
Reagent slepého pokusu	Reag/Sol
Čistiaci prostriedok	nie
Vlnová dĺžka	340 nm
Rád v desiat, sústave	2
Jednotka	pmol/l
ANALÝZA
Faktor po rozpustení (Post Dil. Factor)	nie
Koncentračný faktor	nie
Cyklus vzorky	1
Objem vzorky	20,0 μΐ
Názov rozpúšťadla	H2O
Objem rozpúšťadla	45,0 μΐ
Cyklus reagenta	1
Objem reagenta	90 μΐ
Počiat. cyklus R1	2
Objem počiat. cyklu R1	21 μΐ
Názov riedidla	h2o
Objem riedidla	26 μΐ
Počiat. cyklus R2	17
Objem počiat. cyklu R2	13 μΐ
Názov riedidla	Η2Ο
Objem riedidla	10 μΐ

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: parametre Cobas MIRA
Parameter	Nastavenie
KALKULÁCIA
Limit vzorky	nie
Smer reakcie	pokles
Kontrola	vypnuté (oŕf)
Nadbytok antigénu	nie
Faktor konverzie (Covers. Factor)	1,00
Posun (Offset)	0,00
Testovací rozsah nízky (Test Range Low)	zapnuté (on)
Testovací rozsah vysoký (Test Range High)	zapnuté (on)
Bežný rozsah nízky (Normál Range Low)	nie
Bežný rozsah vysoký (Normál Range High)	nie
Počet stupňov	1
Kalkulačný stupeň A	Kinetic
Prvé odčítanie	20
Posledné odčítanie	31
Limit reakcie	nie
KALIBRÁCIA
Kalibračný interval	každá séria
Slepý pokus
Rozpätie reagentov nízke (Reag. Range Low)	nie
Rozpätie reagentov vysoké (Reag. Range High)	nie
Rozpätie slepého pokusu nízke (Blank Range Low)	nie
Rozpätie slepého pokusu vysoké (Blank Range High)	nie
Štandardy (Standard Position)	1
1	0,0 gmol/l
2	8,5 pmol/l
3	17,2 pmol/l
4	25,2 pmol/l
5	43,0 pmol/l
6	nie
7	nie
Replikácia	dvakrát
Odchýlka (Deviation)
Opravný štandard	nie
Kontrola
Poloha CS 1 (CS 1 position)	nie
Poloha CS2 (CS2 position)	nie
Poloha CS3 (CS3 position)	nie

Tabuľka 18

Korelačné údaje so zlepšením uvádzaných v tabuľkách 16 a 17

Vzorka	IMx(pmol/l)	Zachytené (pmol/l)
2-01	11,0	12,0
2-02	17,7	17,3
2-03	18,6	18,4
2-04	22,1	21,2
2-05	12,2	13,8
2-06	15,2	14,9
2-07	17,6	20,4
2-09	51,8	49,9
2-11	29,1	28,2
2-13	19,6	19,2
2-15	25,0	24,7
2-16	22,9	23,7
2-17	21,9	21,3
2-18	25,0	23,80
2-19	22,2	22,10
2-21	23,6	20,80
2-22	13,0	13,60
2-23	23,1	21,80
2-24	17,0	17,60
2-26	15,9	14,80
2-27	8,8	9,30
2-28	9,1	9,40
2-29	5,2	5,40
2-30	8,2	8,10
2-31	4,7	5,40
2-32	6,6	6,80
2-33	7,8	8,10
2-34	7,0	7,0
2-35	6,9	7,3
2-36	4,8	5,7
4-01	7,2	7,3
4-02	7,3	9,1
4-03	6,2	5,8
4-04	9,5	9,5
4-05	6,2	7,4
4-06	8,2	8,0
4-07	6,8	6,7
4-08	8,1	7,4
4-09	6,5	7,9
4-10	7,5	8,5
4-11	8,1	8,6
4-12	6,1	5,7
4-13	6,19	6,20
4-14	5,31	5,90
4-15	7,17	6,80
4-16	5,05	7,00
4-17	5,93	7,80
4-18	8,57	8,10
4-19	4,87	5,70
4-21	19,37	19,50
4-22	8,61	9,30
4-23	11,02	12,50
4-24	12,75	13,30

SK 288189 Β6

Vzorka	IMx(pmol/l)	Zachytené (pmol/l)
4-25	12,28	12,00
4-26	14,63	14,30
4-27	9,33	11,30
4-29	18,39	19,60
4-30	14,13	14,20
4-31	8,63	8,60
4-32	9,95	9,80
4-33	8,08	10,20
4-34	12,34	12,00
4-35	12,16	13,10
4-36	15,75	16,30
4-37	14,37	14,30
4-38	14,72	15,20
4-39	10,26	11,20
4-40	12,26	14,00
4-41	24,62	25,00
4-43	27,25	29,50
4-46	21,26	19,60
4-47	22,08	23,30
4-50	15,14	15,50
EI	4,74	4,90
E2	8,24	8,00
E3	5,10	5,30
E6	13,79	14,50
E8	8,79	10,00
E9	10,57	11,50
Eli	7,10	7,40
E13	7,65	7,30
E14	12,19	12,30
E15	6,47	6,14
E16	5,28	4,70
E20	7,93	7,80
Priemer	12,6	12,9
Smernica [Slope]		0,957
INTCP [Intercept]		0,8135
R		0,9927

Z porovnávacej tabuľky vyplýva, že výsledky tohto stanovenia so zmenenými formuláciami boli v porovnaní s komerčne dostupným stanovením IMx veľmi presné.

Príklad 10

Použitie iných detergentov a príslušné koncentračné výkyvy

V tomto príklade sa ako zložky R1 používali rôzne detergenty v kombinácii s EDTA. Je známe, že EDTA stabilizuje lipidové častice. Cieľom teda opäť bolo dosiahnuť správne výsledky, aj keď boli vzorky zakalené. Najmä sa študovali detergenty Brij-35 a Genapol X-80. Zistilo sa, že EDTA bola zvlášť účinná pri analýze lipemických vzoriek v koncentrácii 2,5 mM na minimalizáciu nešpecifického poklesu absorbancie v dôsledku zmien turbidity. Aj tu boli koncentrácie detergenta premenlivé, ako ukazuje tabuľka 19 a 20. V tabuľke 21 sa uvádza jedna výhodná kompozícia reagenta Rl. Brij 35 bol prítomný v koncentrácii 0,025 % obj./obj. a EDTA v koncentrácii 2,5 mM. V kompozícii neboli prítomné lipáza a α-cyklodextrín, pretože nie sú nevyhnutné na spresnenie výsledkov, keď je prítomná EDTA. Brij-35 v množstve 0,025 % tiež nahradil Triton X15 100 v SR2 (R3). Toto môže byť sľubná náhrada, pretože v niektorých krajinách sa Triton X-100 považuje za environmentálne riziko. Tabuľka 22 ukazuje výsledky korelačnej štúdie uskutočňované s výhodnými zložkami reagenta.

SK 288189 Β6

Tabuľka 19

Zmeny koncentrácie Genapol X-80

Vzorky	Mx (pmol/l)	Výsledky zmien obsahu Genapol X-80 v R1 (pmol/l)
		0,1 %	0,3 %	0,5 %
Nízke	7,00	6,31	6,19	5,64
Stredné	12,50	11,96	11,48	10,37
Vysoké	25,00	23,08	22,96	22,86
D910	14,30	14,38	14,50	14,11
D912	9,40	9,41	10,60	9,50
D913	5,00	5,58	6,47	4,53
D915	21,20	23,85	21,93	20,92
PBI27	7,40	7,69	7,70	6,82
PBI28	6,80	7,33	7,19	5,96
PBI 29	7,10	7,83	7,50	6,85
PBI 10	8,90	9,61	9,07	7,67
MAS 1	5,90	4,63	4,45	4,15
MAS 2	14,50	14,46	15,33	14,47
MAS 3	23,10	22,60	23,07	23,65
D913X2	2,50	2,45	2,46	2,12
Priemer	11,37	11,41	11,39	10,64

Tabuľka 20

Vplyv rôznych koncentrácií Brij-35 v R1

Vzorky	IMx (pmol/l)	Výsledky zachytenia (pmol/l) ako funkcie koncentrácie Brij-35 v R1
		0,025 %	0,05 %	0,1 %	0,5 %
1	5,88	5,03	5,35	5,26	5,09
2	14,57	15,46	16,30	15,92	15,60
3	23,52	24,66	24,89	23,67	24,02
2	6,49	6,80	7,04	8,44	10,74
18	10,15	10,72	11,29	9,95	10,42
21	4,62	4,86	5,84	5,73	4,96
32	8,90	8,17	8,38	8,67	8,43
Priemer	10,59	10,81	11,28	11,09	11,32

Tabuľka 21

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: zložky reagenta

Chemikálie	Koncentrácia
Reagent 1
TRIS	250 mM
EDTA	2,5 mM
Serín	1,295
Laktátdehydrogenáza	>800 U/l
NADH	1,06 mM
Brij-35	0,025 % hmotn./obj.
Azid sodný	7,7 mM
pH = 8,2
Reagent SR1
TCEP	26,3 mM
Reagent SR2
CBS	28,5 KU/1
CBL	9,4 KU/1
Glycerol	10%

Chemikálie	Koncentrácia
Sorbitol	1 %
Pyridoxál fosfát	5 μΜ
Azid sodný	7,7 mM
Fosforečnan draselný	100 mM
pH = 7,6

Tabuľka 22

Korelačné údaje vzoriek s najlepším zlepšením

Vzorka	IMx(pmol/l)	Zachytené (pmol/l)
1	5,90	5,15
2	14,57	15,36
3	23,52	23,52
701	17,95	17,03
702	11,51	11,55
703	11,81	12,97
704	10,13	10,64
705	22,37	21,87
706	16,97	16,79
707	7,76	7,76
708	9,35	9,90
709	7,33	6,60
710	7,24	6,90
711	8,50	8,54
712	19,93	19,00
713	6,82	6,04
715	6,91	6,93
716	7,35	7,05
717	9,44	9,26
718	14,16	15,61
719	5,73	5,25
720	6,32	6,00
721	11,30	12,75
722	16,23	17,55
723	11,77	12,11
724	8,39	9,72
725	10,17	11,48
726	6,69	6,14
727	8,01	7,50
728	10,45	10,64
729	11,73	11,27
730	14,39	14,87
731	8,61	8,76
732	7,56	7,67
733	7,35	7,56
734	6,54	8,34
735	8,39	7,91
Priemer	10,79	10,92
Smernica (Slope)		1,0035
INTCP (Intercept)		0,0195
R		0,9873

Keď sa Triton X-100 a lipáza plus α-cyklodextrín nahradili detergentom Brij-35 a EDTA, došlo k istému vyčíreniu zakalenej reakčnej zmesi. Zrejme však nie v takej miere, ako keď sa tiež použila lipáza a a-cyklodextrín. Je dôležité, že sa absorbancie na vlnovej dĺžke 340 nm rýchle stabilizovali pri nulových rýchlostiach zmien. Preto sa po prídavku SR2 (R3) rýchlosť produkcie pyruvátu zmeria presne a presné výsledky sa získa35

SK 288189 Β6 jú aj v prípadoch, keď vzorky majú vzhľad mlieka. Toto je dokonca prípad, keď sa čas medzi pridaním R1 a SR2 (R3) skráti o 2 - 4 minúty, čo môže byť dôležité, keď sa na stanovenie homocysteínu podľa tohto vynálezu použijú iné prístroje.

Príklad 11

Výsledky prechodu redukčného činidla na TCEP a zmien koncentrácie TCEP

V tomto príklade sa redukčné činidlo DTE nahradilo tris-(2-karboxyetylfosfín)hydrochloridom (TCEP).

Prednosťou TCEP je, že je dlhý čas stabilný v čistej vode. Nahradením DTE činidlom TCEP sa redukovala reakcia reagenta pre slepý pokus z 12 až 15 mA/min. na približne 4 až 5 mA/min. Nižšia hodnota reagenta v slepom pokuse zvyšuje presnosť stanovenia homocysteínu. Na nájdenie optimálnej koncentrácie TCEP pri stanovení homocysteínu sa testoval rad koncentrácií a výsledky týchto experimentov sa uvádzajú v tabuľke 23.

Tabuľka 23

Zmeny koncentrácií TCEP v SRI

	Výsledné hodnoty homocysteínu (pmol/l)
	IMx	Zachytené
SR 1		A	B	C	D	E	F
Formulácia
MAS 1	5,88	6,37	6,18	5,48	5,51	4,42	4,17
MAS 2	14,57	16,49	15,67	15,95	16,03	15,80	14,77
MAS 3	23,52	23,19	21,98	23,33	25,11	24,02	23,09
PBI20	7,2	5,81	6,24	7,81	8,00	6,95	8,33
PBI22	7,8	7,61	7,66	8,28	8,69	8,44	8,23
PBI 36	5,1	4,16	4,61	4,71	5,05	5,18	4,71
PBI 39	4,6	3,11	4,25	4,38	4,47	3,68	4,09
Doreen 709	7,33	6,68	6,64	6,71	7,28	6,23	6,43
Priemer	9,50	9,17	9,15	9,58	10,02	9,34	9,22

Koncentrácia TCEP: A = 6,3 mM, B = 13,89 mM, C = 26,44 mM, D = 32,74 mM, E = 39,03 mM, F = 52,88 mM.

Príklad 12

Stanovenie účinku zmeny pufra v R3 na fosfát a prídavku glycerolu k pufru

S cieľom nájsť enzýmové zmesi s dlhšou stabilitou a kompatibilitou pri analýze sa formulácia zmenila na zmesi so značne dlhšou skladovacou lehotou, než mali predchádzajúce formulácie. Podstatné zmeny spočívali v náhrade pufra Tris fosfátom a v prídavku glycerolu k pufru. Použil sa fosforečnan draselný v koncentráciách v rozmedzí od 50 mM do 500 mM pri pH 7,6 a koncentrácie glycerolu v rozmedzí od 0,5 % do 15,0 % (obj./obj.) V dôsledku týchto zmien sa skladovací čas pri 4 °C podstatne predĺžil z týždňov na viac než rok. Vo výhodnom uskutočnení môže byť množstvo fosfátu od 50 mM do asi 250 mM. Ešte výhodnejšie je koncentračné rozmedzie od asi 75 mM do asi 150 mM. Zvlášť účinná koncentrácia fosforečnanu draselného v tomto experimente bola 100 mM. Obsah glycerolu môže byť v rozmedzí od asi 1 do asi 15 %. Výhodnejšie je, keď je toto rozmedzie od asi 5 do asi 13 %. Zvlášť účinná koncentrácia glycerolu bola v tomto pokuse 10 %.

Príklad 13

Výsledky získané s rôznymi prístrojmi

Na stanovenie celkového zlepšenia, ku ktorému došlo počas použitia všetkých týchto zmien pri stanovení, boli s pomocou rôznych prístrojov uskutočnené testy presnosti a testovací protokol sa písal spôsobom špecifickým pre daný prístroj. V tabuľke 24 sa uvádzajú parametre a nastavenie použité v súlade s týmto vynálezom pomocou systému Roche Hitachi 911a tabuľka 25 uvádza tie isté parametre a nastavenia pri použití prístroja Beckman CX-5. Nasledujúce tabuľky uvádzajú výsledky týchto testov presnosti. Tieto výsledky sú podstatne lepšie než výsledky získané s predchádzajúcimi formuláciami stanovenia. Na prístroji Hitachi 911 (tabuľka 26) a Beckman CX5 (tabuľka 27) sa každá vzorka testovala 20x a stanovila sa presnosť vnútri sérií testov. Percentuálna C. V. (koncentračná variabilita) pre vzorky s koncentráciou 5,92 pmol/l bola len 3,31 % a pre vzorky s koncentráciou v rozmedzí 23,01 pmol/l až 25,4 pmol/l bola 1,9 % až 2,03 %. Na prístroji Cobas MIRA Plus sa získala hodnota celkovej presnosti medzi 7,3 % a 2,6 % (tabuľka 28) pre vzorky s homocysteínom v koncentračnom rozmedzí 4,6 pmol/l až 27 pmol/l. Každá vzorka sa testovala opakovane, 2x denne počas celkom 20 dní.

Tabuľka 24

Parametre metódy zachytenia homocysteínu prístrojom Roche Hitachi 911

Test	THCY
Kód stanovenia	Rate-A, 15
Vlnová dĺžka (druhá/prvá)	376/340
Bod stanovenia (Assay point)	35-49-0-0
Sérum
objem vzorky (normálny)	28
objem vzorky (pokles)	20
objem vzorky (vzrast)	30
Moč
objem vzorky (normálny)	10
objem vzorky (pokles)	10
objem vzorky (vzrast)	10
Absolútny limit	0-0-pokles
(Prozone limit)	0-0-nižší
Reagent
TI	200 μ1-0-0-00322-0
T2	25 μί 0-0-00322-0
T3	0 - 0-00322-0
Typ kalibrácie	lineámy-2-2-0
Automatické zdržanie (Auto Time Out)
Slepý pokus (Blank)	0
Rozpätie (Span)	0
2 body (2 Point)	0
Plný (Full)	0
Automatická zmena (Auto Change)
Dávka (Lot)	zrušiť
Fľaša (Bottle)	zrušiť
Voľba testov pomocou klávesnice	Enter
Limit SD (SD limit)	100
Dvojnásobný limit (Duplicate limit)	1000
Limit citlivosti	0
Absolútny limit SI (Limit SI ABS)	(-32000) (32000)
Kompenzovaný limit	blank
Parameter strana 2
Test	THCY-00322
Názov testu	jednotka THCY: μπιοί/ΐ
Data Móde	On Board
Názov správy	homocysteín
kontrolný interval	0
inštrumentálny faktor (Y = aX + b)
a	1
b	0
očakávané hodnoty	definuje užívateľ
Technický limit
sérum	0-10000
moč	(-99999) (999999)
Standard (STD)	Conc.-Pos.-Sample-Pre.-Dl.-Calib.
1	0.0-18-28-0-0-501
2	25,2-26-28-0-0-026

SK 288189 Β6

Test	THCY
3	0
4	0
5	0
6	0

Na tento pokus sa pripraví TI zmiešaním R1 a deionizovanej vody v pomere 9 ku 8,1. Činidlá T2 a T4 zodpovedajú reagentom SR1 a SR2.

Tabuľka 25

Parametre metódy zachytenia homocysteínu prístrojom Beckman CX-5

Chemický názov	HOMOCYSTEÍN
Názov testu	HOMO
Výpočtový faktor	0
Typ reakcie	Rýchlosť 1
Matematický model	lineárny
Časový limit výpočtu	24 hod.
Smer reakcie	pokles
Počet kalibrátorov	2
Jednotky	pmol/l
Presnosť v decimálnom vyjadrení	X,XX
Primárna vlnová dĺžka	340 nm
Sekundárna vlnová dĺžka	380 nm
Objem vzorky	25 μΐ
PRIMÁRNY REAGENT
A	179 μΐ
B	22 μΐ
SEKUNDÁRNY REAGENT
C	14 μΐ
Prídavný čas	592 sekúnd
KALIBRÁTORY
č. 1	0,00
č. 2	24,8
Viacbodové rozpätie (MULTIPO1NT SPAN)
1 -2	-0,001
Reagent slepého pokusu (REAGENT BLANK)
Začiatok odčítania	100 sekúnd
Koniec odčítania	200 sekúnd
Nízky absolútny limit	-1,5
Vysoký absolútny limit	1,5
Použiteľné rozpätie
Nižší limit	0,00
Vyšší limit	99999,00
ÚBYTOK SUBSTRÁTU
Počiatočná rýchlosť	-99,999
Absolútny inkrement (Delta ABS)	1,5

Na tento pokus sa pripraví A zmiešaním R1 a deionizovanej vody v pomere 9 ku 8,1. Činidla B a C zodpovedajú reagentom MIRA SR1 a SR2.

Tabuľka 26

Stanovenie presnosti pri meraní vnútri série na Hitachi 911

		Vnútri série
Nízka Priemer = 8,3 pmol/l	Štandardná odchýlka	0,224
	Koncentračná variabilita, %	2,17
Stredná Priemer = 11,9 /lmol/1	Štandardná odchýlka	0,324
	Koncentračná variabilita, %	2,71
Vysoká Priemer = 25,4 /lmol/1	Štandardná odchýlka	0,516
	Koncentračná variabilita, %	2,03

Tabuľka 27

Stanovenie presnosti vnútri série na prístroji Beckman CX5

		Vnútri série
Nízka Priemer = 5,92 /μπιο1/1	Štandardná odchýlka	0,196
	Koncentračná variabilita, %	3,31
Stredná Priemer =11,12 μιηοΐ/ΐ	Štandardná odchýlka	0,195
	Koncentračná variabilita, %	1,70
Vysoká Priemer = 23,01 pmol/l	Štandardná odchýlka	0,437
	Koncentračná variabilita. %	1,90

Tabuľka 2839

Stanovenie celkovej presnosti na Roche MIRA-Plus		Vnútri série	Medzi sériami	Medzi dňami	Celkom
Nízka Priemer = 4,6 pmol/l	Štandardná odchýlka	0,31	0,14	0,04	0,34
	Koncentračná variabilita, %	6,6	3,1	0,8	7,3
Stredná Priemer = 11,6 pmol/l	Štandardná odchýlka	0,40	0,08	0,23	0,47
	Koncentračná variabilita, %	3,5	0,7	2,0	4,0
Vysoká Priemer = 27,0 pmol/l	Štandardná odchýlka	0,44	0,39	0,39	0,71
	Koncentračná variabilita, %	1,6	1,5	1,4	2,6

Príklad 14

Adaptibilita spôsobu stanovenia pre systém s 2 reagentmi

Tento vynález sa tiež môže použiť pre systém, ktorý používa len 2 reagenty. Tým sa vynález stáva použiteľným pre širší súbor prístrojov vrátane takých, ktoré používajú výhradne dva reagenty. Tabuľka 29 uvádza obsahy reagentov v systéme s dvoma reagentmi a tabuľka 30 uvádza MIRA a parametre stanovenia uskutočňovaného uvedeným chemickým analyzátorom. V tabuľke 31 sú uvedené údaje získané s použitím systému s

3 reagentmi v porovnaní s údajmi pre systém s 2 reagentmi.

SK 288189 Β6

Tabuľka 29

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: zložky reagenta pri použití dvoch reagentov

Chemikália	Koncentrácia
Reagent 1
TRIS	250 mM
EDTA	2,5 mM
Serín	1,295 mM
Laktátdehydrogenáza	>800 U/l
NADH	1,06 mM
Brij-35	0,025 % obj./obj.
Azid sodný	7,7 mM
TCEP	4,05 mM
pH = 8,2
Reagent SRI
CBS	28,5 KU/1
CBL	9,4 KU/1
Glycerol	10%
Sorbitol	1 %
Pyridoxál fosfát	5 μΜ
Azid sodný	7,7 mM
Fosforečnan draselný	100 mM
pH = 7,6

Tabuľka 30

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: parametre Cohas MIRA
Parameter	Nastavenie
VŠEOBECNE
Spôsob merania	absorpčné
Spôsob reakcie	R-S-SR1
Spôsob kalibrácie	lineárna regresia
Reagent slepého pokusu	Reag/Sol
Čistiaci prostriedok	nie
Vlnová dĺžka	340 nm
Rád v desiat, sústave	2
Jednotka	pmol/l
ANALÝZA
Faktor po rozpustení (Post Dil. Factor)	nie
Koncentračný faktor	nie
Cyklus vzorky	1
Objem vzorky	20,0 μΐ
Názov rozpúšťadla	H2O
Objem rozpúšťadla	45,0 μΐ
Cyklus reagenta	1
Objem reagenta	137 μΐ
Počiat. cyklus Rl	16
Objem počiat. cyklu Rl	13 μΐ
Názov riedidla	H2O
Objem riedidla	10 μΐ
KALKULÁCIA
Limit vzorky	nie
Smer reakcie	pokles

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: parametre Cohas MIRA
Parameter	Nastavenie
Kontrola	vypnuté (off)
Nadbytok antigénu	nie
Faktor konverzie (Covers. Factor)	1,00
Posun (Oľťset)	0,00
Testovací rozsah nízky (Test Range Low)	zapnuté (on)
Testovací rozsah vysoký (Test Range High)	zapnuté (on)
Bežný rozsah nízky (Normál Range Low)	nie
Bežný rozsah vysoký (Normál Range High)	nie
Počet stupňov	1
Kalkulačný stupeň A	Kinetic
Prvé odčítanie	19
Posledné odčítanie	30
Limit reakcie	ne
KALIBRÁCIA
Kalibračný interval	každá séria
Slepý pokus (Blank) Sol-Pos	1
Rozpätie reagentov nízke (Reag. Range Low)	nie
Rozpätie reagentov vysoké (Reag. Range High)	nie
Rozpätie slepého pokusu nízke (Blank Range Low)	nie
Rozpätie slepého pokusu vysoké (Blank Range High)	nie
Štandardy (Standard Position)	1
1	0,0 pmol/l
2	8,5 pmol/l
3	17,2 pmol/l
4	25,2 pmol/l
5	43,0 pmol/l
6	nie
7	nie
Replikácia	dvakrát
Odchýlka (Deviation)
Opravný štandard	nie
Kontrola
Poloha CS1 (CS1 position)	nie
Poloha CS2 (CS2 position)	nie
Poloha CS3 (CS3 position)	nie

Tabuľka 31

Porovnanie systému s 2 reagentmi a systému s 3 reagentmi

Vzorky	IMx (pmol/l)	Zachytenie homocysteínu vrátane stanovenia, (pmol/l)
		Systém s 2 reagentmi	Systém s 3 reagentmi
MAS 1	5,88	5,55	5,17
MAS 2	14,57	16,14	15,70
MAS 3	23,52	23,99	23,47
P 10	8,90	9,32	9,65
Pil	7,60	7,45	7,27
P 33	7,80	8,11	8,29

SK 288189 Β6

Vzorky	IMx (pmol/l)	Zachytenie homocysteínu vrátane stanovenia, (pmol/l)
		Systém s 2 reagentmi	Systém s 3 reagentmi
P 34	5,93	5,21	5,69
754 + 848	16,00	15,68	16,15
Priemer	11,28	11,43	11,42

Príklad 15

Možnosť prispôsobenia tohto vynálezu na použitie pri jednobodovej kalibrácii

Stanovenie homocysteínu podľa tohto vynálezu sa prispôsobilo na použitie jediného kalibračného bodu, pričom nulový kalibrátor poslúžil ako blank (slepý pokus). Tabuľka 32 uvádza parametre uskutočnenia jednobodovej kalibrácie na prístroji MIRA. Údaje uvedené v tabuľke 33 ukazujú, že použitie jednobodovej kalibrácie smemicovým spôsobom vedie k výsledkom, ktoré sú v podstate rovnocenné s výsledkami pri použití viacbodovej kalibračnej krivky.

Tabuľka 32

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: parametre Cobas MIRA pri jednobodovej kalibrácii
Parameter	Nastavenie
VŠEOBECNE
Spôsob merania	absorpčný
Spôsob reakcie	R-S-SR1
Spôsob kalibrácie	Smernicový (Slope Average)
Reagent slepého pokusu	Reag/Sol
Čistiaci prostriedok	nie
Vlnová dĺžka	340 nm
Rád v desiat, sústave	2
Jednotka	pmol/l
ANALÝZA
Faktor po rozpustení (Post Dil. Factor)	nie
Koncentračný faktor	nie
Cyklus vzorky	1
Objem vzorky	20,0 μΐ
Názov rozpúšťadla	H2O
Objem rozpúšťadla	45,0 μΐ
Cyklus reagenta	1
Objem reagenta	137 μΐ
Počiat. cyklus Rl	16
Objem počiat. cyklu Rl	13 μΐ
Názov riedidla	H2O
Objem riedidla	10 μΐ
KALKULÁCIA
Limit vzorky	nie
Smer reakcie	pokles
Kontrola	vypnuté (off)
Nadbytok antigénu	nie
Faktor konverzie (Covers. Factor)	1,00
Posun (Offset)	0,00
Testovací rozsah nízky (Test Range Low)	zapnuté (on)
Testovací rozsah vysoký (Test Range High)	zapnuté (on)
Bežný rozsah nízky (Normál Range Low)	nie
Bežný rozsah vysoký (Normál Range High)	nie

SK 288189 Β6

Cyklický systém CBS/CBL/LDH: parametre Cobas MIRA pri jednobodovej kalibrácii
Parameter	Nastavenie
Počet stupňov	1
Kalkulačný stupeň A	Kinetic
Prvé odčítanie	19
Posledné odčítanie	30
Limit reakcie	nie
KALIBRÁCIA
Kalibračný interval	každá séria
Slepý pokus (Blank) Sol-Pos	1
Rozpätie reagentov nízke (Reag. Range Low)	nie
Rozpätie reagentov vysoké (Reag. Range High)	nie
Rozpätie slepého pokusu nízke (Blank Range Low)	nie
Rozpätie slepého pokusu vysoké (Blank Range High)	nie
Štandardy (Standard Position)	4
1	25,2 pmol/l
2	nie
3	nie
Replikácia	dvakrát
Odchýlka (Deviation)
Opravný štandard	nie
Kontrola
Poloha CS1 (CS1 position)	nie
Poloha CS2 (CS2 position)	nie
Poloha CS3 (CS3 position)	nie

Tabuľka 33

Porovnanie jednobodovej a viacbodovej kalibrácie

Vzorky	IMx (pmol/l)	Zachytenie homocysteínu vrátane porovnania, (pmol/l)
Jednobodová kalibrácia	Viacbodová kalibrácia
MAS 1	5,88	5,55	5,17
MAS 2	14,57	16,14	15,70
MAS 3	23,52	23,99	23,47
P 10	8,90	9,32	9,65
P 11	7,60	7,45	7,27
P 33	7,80	8,11	8,29
P 34	5,93	5,21	5,69
754 + 848	16,00	15,68	16,15
Priemer	11,28	11,43	11,42

Príklad 16

Štúdia spôsobov stanovenia homocysteínu opísaných v patentoch WO 00/28071

Publikácia PCT WO 00/28071 podrobne opisuje dva spôsoby stanovenia homocysteínu. V prvom usku10 točnení sa stanovenie uskutočňuje bez redukčného stupňa. Pri modifikácii tohto spôsobu na spôsob použiteľný na meranie homocysteínu v ľudskej plazme sa musí zaradiť buď izolovaný, alebo homogénny redukčný stupeň. Publikácia WO 00/28071 opisuje separátny redukčný stupeň zrejme preto, že ide o cyklický systém s pyruvátoxidázou. Tento stupeň zahŕňa dvadsaťminútovú inkubáciu pred samotnou analýzou redukovanej vzorky, čo značne predlžuje celkový čas potrebný na stanovenie a náklady analýzy. Okrem toho, keď sa vzorka musí v klinickom laboratóriu určovať v podobe viac než jedného analytu, musí sa primáme sérum alebo plazma rozdeliť do dvoch rovnakých dielov, jeden pre homocysteín a druhý pre akýkoľvek ďalší požadovaný laboratórny test. Naproti tomu tento vynález umožňuje homogénnu redukciu, pretože ide o aplikáciu cyklického systému LDH (príklad 7).

SK 288189 Β6

Tu sa v príklade 16 (tabuľka 34) dokazuje, že DTT skutočne interferuje s pyruvátoxidázovým detekčným systémom opísaným v druhom uskutočnení v WO 00/28071. Najmä sa aplikoval reagent a kompozície DTT opísané v druhom uskutočnení a uskutočnili sa stanovenia s alebo bez DTT proti známym pyruvátovým štandardom (12,5, 25, a 50 pmol/l) s pomocou prístroja Cobas FARA. V prípade testu s DTT sa 40 μΐ každého štandardu zmiešalo s 30 μΐ roztoku DTT a nasledovala inkubácia na 100 sekúnd. Potom sa pridalo 90 μΐ pyruvátoxidázového reagenta a nasledovala inkubácia na 30 sekúnd. Absorbancie sa odčítali po 30, 60, 90, 120, 150, 180 a 210 sekundách. V teste bez DTT sa uskutočnil ten istý postup, ale nepridávalo sa DTT. Tabuľka 34 uvádza výsledky týchto experimentov pri odčítaní po 210 sekundách. Obrázky 15 a 16 ďalej ilustrujú výsledky týchto testov.

Tabuľka 34

Účinok DTT na pyruvátový detekčný systém PO/HRP
	Bez DTT	S DTT
Slepý pokus (blank)	0,0021	-0,0021
Faktor	2212	-11765
Štandard, 50 pmol/l	51,5	35,3
Štandard 25 pmol/l	24,1	0,0
Štandard, 12,5 pmol/l	9,7	-21,2
Zmena delta po 30 sek. (50 pmol štand.)	0,0643	-0,0062
Zmena delta po 90 sek. (50 pmol štand.)	0,0890	-0,0103
Zmena delta po 120 sek. (50 pmol štand.)	0,0903	-0,0113
Zmena delta po 210 sek. (50 pmol štand.)	0,0906	-0,0113

Tieto údaje jasne ukazujú nevyhnutnosť samostatného redukčného stupňa opísaného v druhom uskutočnení podľa patentu WO 00/28071. Prítomnosť redukčného činidla interferuje s pyruvátoxidázovým detekčným systémom používaným na stanovenie pyruvátu. Preto tu uvádzané údaje potvrdzujú, že časovo náročný separátny redukčný stupeň je v druhom uskutočnení nevyhnutný. Pochopiteľne samostatný redukčný stupeň opísaný vo WO 00/28071 pravdepodobne podstatne zvýši zložitosť a nákladnosť stanovenia v porovnaní s týmto vynálezom.

I keď bol uvedený vynález v záujme lepšieho pochopenia podrobne opísaný pomocou príkladov a ilustrácií, je zrejmé, že v rozsahu pripojených nárokov je možné uskutočniť určité zmeny a modifikácie. Rozsah vynálezu preto nemá byť definovaný vo vzťahu k predchádzajúcemu opisu, ale má byť určený podľa pripojených nárokov a podľa ich ekvivalentov v ich úplnom rozsahu.

Všetky publikácie a patentové dokumenty uvádzané v tejto prihláške sú teda zahrnuté v ich úplnosti ako odkazy pre všetky možné použitia a v tom istom rozsahu, ako keby každá jednotlivá publikácia alebo patentový dokument boli takto individuálne označené.

Claims (10)

1. Enzymatické cyklické kvantitatívne stanovenie homocysteínu alebo cystationínu alebo oboch týchto látok vo vzorke, vyznačujúce sa tým, že zahŕňa:

a) uvedenie vzorky obsahujúcej homocysteín alebo cystationín alebo obe tieto látky do kontaktu s redukčným činidlom a s cystationín-P-syntázou alebo jej derivátom, L-serínom a cystationín-P-lyázou alebo jej derivátom na vytvorenie reakčnej zmesi na čas potrebný na katalýzu cyklickej konverzie homocysteínu na cystationín a rekonverzie cystationínu na homocysteín za vzniku pyruvátu a amoniaku;

b) stanovenie množstva pyruvátu alebo amoniaku alebo oboch týchto látok prítomných v reakčnej zmesi; a

c) stanovenie množstva homocysteínu alebo cystationínu alebo oboch týchto látok prítomných vo vzorke na základe určenia množstva vzniknutého pyruvátu alebo amoniaku alebo oboch týchto látok, pričom uvedeným redukčným činidlom je tris-(karboxyetyl)fosfín hydrochlorid (TCEP) alebo jeho derivát.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa množstvo pyruvátu stanoví enzymatickou konverziou pyruvátu na laktát.

3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že konverzia pyruvátu na laktát sa uskutočňuje pridaním laktátdehydrogenázy alebo jej derivátu a NADH alebo jeho derivátu.

4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že celkový rozsah oxidácie NADH alebo jeho derivátu na NAD+ alebo jeho derivát sa stanoví reakciou NAD+ alebo jeho derivátu s farbivom, ktoré po oxidácii mení farbu.

SK 288189 Β6

5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa farbivo zvolí zo skupiny, ktorú tvorí 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoová kyselina), 2,6-dichlórfenolindofenol, tetrazóliová zlúčenina, fenazínmetosulfát, metylviologén alebo deriváty ktoréhokoľvek z nich.

6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci matičkou konverziou pyruvátu na peroxid vodíka.

7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci

8. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci že sa množstvo pyruvátu určuje enzyže enzýmom je pyruvátoxidáza. že ďalej zahŕňa stupeň reakcie vzorky s

s a tým, s a tým, s a tým,

16. Spôsob podľa nároku 14, vyznačuj ú c i s a tým, tvorí HEPES, TRIS a fosfát. 17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačuj ú c i s a tým, 18. Spôsob podľa nároku 14, vyznačuj ú c i s a tým, cerol. 19. Spôsob podľa nároku 18, vyznačuj ú c i s a tým, do asi 15,0 % obj./obj. 20. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujú I c i s a tým, nia vzorky. 21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačuj ú c i s a tým,

reagentom obsahujúcim cystationín-y-lyázu alebo jej derivát na čas postačujúci na konverziu cystationínu prítomného v roztoku na a-ketoglutarát.

9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že uvedený reakčný stupeň sa uskutoční ako prvý.

10. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa stupeň odstránenia v podstate všetkej aktivity cystationín-y-lyázy alebo jej derivátu po uskutočnení uvedeného reakčného stupňa.

11. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že cystationín-p-syntáza alebo jej derivát, alebo cystationín-p-lyáza alebo jej derivát sú vytvorené rekombinantnou expresiou génu kódujúceho cystationín-P-syntázu alebo jej derivát, alebo cystationín-P-lyázu alebo jej derivát.

12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že cystationín-p-syntáza alebo jej derivát, alebo cystationín-p-lyáza alebo jej derivát sú vytvorené ako fuzny protein.

13. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa cystationín-P-syntáza pridáva do konečnej koncentrácie od asi 0,1 KU/1 do asi 100 KU/1.

14. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že reakčná zmes obsahuje pufer.

15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že pufer je schopný udržať reakčnú zmes pri pH medzi asi 7 až asi 9.

že sa pufer vyberie zo skupiny, ktorú že TRIS je pri pH približne 8,4. že uvedený pufer ďalej obsahuje glyže pufer má koncentráciu od asi 0,5 % že ďalej zahŕňa stupeň zníženia zakaleže zakalenie sa zníži uvedením vzorky sa tým, že číridlo zahŕňa lipázu a a-cyklot ý m , že fosfát je prítomný v koncentrácii od do kontaktu s lipoproteínovým číridlom.

22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci dextrín.

23. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa asi 50 mM do asi 500 mM.

24. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že stanovenie nevyžaduje žiadny stupeň uskutočňovaný mimo prístroja.

25. Testovacia súprava na použitie pri zisťovaní množstva homocysteínu vo vzorke obsahujúca redukčné činidlo a cystationín-P-syntázu alebo jej derivát, L-serín a cystationín-p-lyázu alebo jej derivát, pričom uvedeným redukčným činidlom je tris-(karboxyetyl)fosfm hydrochlorid (TCEP) alebo jeho derivát.

26. Testovacia súprava podľa nároku 25, vyznačujúca sa tým, že ďalej zahŕňa nádobu na prechovávanie uvedenej vzorky.

27. Testovacia súprava podľa nároku 25, vyznačujúca konečnej koncentrácii od asi 1 μΜ do asi 50 mM.

28. Testovacia súprava podľa nároku 25, vyznačujúca dehydrogenázu alebo jej derivát a NADH alebo jeho derivát.

29. Testovacia súprava podľa nároku 28, vyznačujúca rogenáza je prítomná v konečnej koncentrácii od asi 30 U/l do asi 5000 U/l.

30. Testovacia súprava podľa nároku 28, vyznačujúca sa tým, konečnej koncentrácii od asi 0,1 mM do asi 2 mM.

31. Testovacia súprava podľa nároku 28, vyznačujúca sa tým, schopné zmeniť po oxidácii farbu.

32. Testovacia súprava podľa nároku 31, vyznačujúca sa tým skupiny, ktorú tvorí 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoová kyselina), 2,6-dichlórfenolindofenol, tetrazóliová zlúčení na, fenazínmetosulfát, metylviologén alebo derivát každého z nich.

33. Testovacia súprava podľa nároku 31 alebo spôsob podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že TCEP je prítomný v množstve od asi 6 mM do asi 53 mM.

tým, tým, tým, že L-serín je prítomný v že ďalej obsahuje laktátže uvedená laktátdehydže NADH je prítomný v že ďalej obsahuje farbivo , že sa farbivo zvolí zo

SK 288189 Β6

34. Testovacia súprava podľa nároku 31, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje cystationín-y-lyázu alebo jej derivát.

35. Testovacia súprava podľa nároku 31, vyznačujúca sa tým, že cystationín-p-syntáza alebo jej derivát, cystationín-P-lyáza alebo jej derivát, cystationín-y-lyáza alebo jej derivát a laktátdehydro5 genáza alebo jej derivát sú imobilizované vnútri uvedenej nádoby.

36. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa L-serín pridáva do reakčnej zmesi do konečnej koncentrácie od najmenej asi 1 μΜ do asi 50 mM.

37. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa laktátdehydrogenáza pridáva do reakčnej zmesi do konečnej koncentrácie od najmenej asi 30 U/l do asi 5000 U/l.

10 38. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa NADH pridáva do reakčnej zmesi do konečnej koncentrácie od najmenej asi 0,1 mM do asi 2 mM.