HU228343B1 - Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine - Google Patents

Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine Download PDF

Info

Publication number
HU228343B1
HU228343B1 HU0500095A HUP0500095A HU228343B1 HU 228343 B1 HU228343 B1 HU 228343B1 HU 0500095 A HU0500095 A HU 0500095A HU P0500095 A HUP0500095 A HU P0500095A HU 228343 B1 HU228343 B1 HU 228343B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
derivative
assay
reaction mixture
reagent
amount
Prior art date
Application number
HU0500095A
Other languages
English (en)
Inventor
Heather Kay Webb
Jeffrey Owens
Raymond Liedtke
Doreen Forest
Mark Legaz
Glen Kawasaki
Sobomabo Lawson
Original Assignee
Axis Shield Diagnostics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21756556&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU228343(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Axis Shield Diagnostics filed Critical Axis Shield Diagnostics
Publication of HUP0500095A2 publication Critical patent/HUP0500095A2/hu
Publication of HUP0500095A3 publication Critical patent/HUP0500095A3/hu
Publication of HU228343B1 publication Critical patent/HU228343B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

íxszmes, ciklusos homocisztdn- és clsztationinvizsgákstol tluioátipiszmában a hotnoelszíehí magas szlreje koronám szívbetegség, szélütés. aneriosclcro-sis es sás betegségek magasabb kockázatával áll kapósuk! tban, Kívánatos lenne tehát az általános népességet ebnek az anunosavnak a magasabb szintjére vizsgálni, A hsnnocisztelnre történő széleskörű vizsgál;·!: létrehozásához könnyen elvégezhető. új és kevésbé drága vizsgálatokat kell kifejleszteni.
A plazma hcnnocisageireszárííje rutinszerűen nagy nyomású íblyadékkromatognlltávai (HPhC) és gazkromsrográínktötrregspekíroinetriávaí (GCAMS) mérhető v izsgálatonként több. mint 100 S költséggel, amely ezeket a. fizika; elválasztási eljárásokat túlságosan költségessé teszi népesség méretű vizsgálatra. Λ vizelet- és vérminták például aminosavkromatográfiára készíthetők elő, és az: L-homocisztein HFLC-elválasztással és kimutatással merhető, ÍAskctsírand és mankatátsai ífiskerstranő és mtsai.. Chn. Cherre .3.¾. 26.3-27 i (tékáit leírnak egy eitárást l. -honxreisztein vizsgálatára a szertanban lévő iiolok fluoreszcens jelölésével, amelyet flPLC-elválaszíás követ, majd az L-bsreoejszíahreszá<'!nazék kimutatása a különböző, egyéb, kéntartalmú vegyi; letek közül. Az: ilyen eljárások azonban jellemzően Időigényesek, drágák és sok. laboratóriumban nem nl15 kahnazhatok.
llomocíszieirire közvetett immunológiai vizsgálatokat ss kifejlesztettek. essek az ellenanyagon alapuló eljárások azonban még viszony lag költségesek, mintegy 240-ba kerülnek vizsgálatonként. Egy konkrét közvetett immunológiai vizsgálatban a hornoeisztemt enzimesen ademzil-homocisztelntté alakítják,, és az adenoziíhomiXfisztein mennyiségét kotspeihiv BLISA-vai (enzyme tekéd itsmunoassay”,.enzimmel kapcsok immuno20 lögisi vizsgálat! határozzák meg adenozd-hernríciszmiis elleni ellenanyaggal (lásd például OS 5.827:64$ számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot, aatelynek tartalma a leírás részét képezi).
Közvetett enzimes vizsgálatot tejlesztetfek lei L-homoeiszrein mennyiségi meghatározására. Például a vizsgálati mintához S-adenozil-hotnm;iszSehj-hidreiázf és· adenozínt adnak. A reakéióksvcréfcben levő ndefiozlo igy kialakuló koncemrúcmja vagy a koítcentráeityában történő változások használhatók léi a mintában lévő homooiszteln kezded koncentrációjának jelzésére.
flouKíoisztem mérésére liözveden enzimvizsgáSaiokui is leírtak, ezeknél a módszereknél a homocíszteint jellco-zöet; irreverzibdhon más, mérhető vegyuletekké alakítják.. Λ homocisztein-dehldratáz enzim például homosisztoinlxil a szuttedrií-csopert eltávolítására alkalmazható, majd «sután a leemésztett szulihtání-resz koncentrációjú mérhető. A bomecisziein vizsgálatára szolgáló ezen és más enzimes vizsgálatok egy -jelentős .hátránya, hogy az alkalmazott enzimek egyéb kéntartalmú amínosav&kkal és homoctszteinneí rokon wgyüleiekkel is reagálnak, ami magas és nem reprodukálható háttereríéke· eredményez, és a plazmából történő hooiociszíem-ruéíés nem pontos,
Enzime;;Avagy enzunszerűi, ciklusos vizsgálatokat csak -nagyon kis számú an-ai-izála-cdö vegyületre írtak le. Enzimes, ciklusos vizsgálatban két vagy több unzhuokővhást alkalmaznák, amelyek visszaállítják, a
55' szufesztráí-ot, és nem irreverzíbilisen alakidák át a mért vegyöietet. Ehelyett a vegyületet katalitikusát) alkalmazzák a vizsgálatban fiiért vegyüktié történi) átalakulás sebességének eh ért őrzésé re. kunok eredményeképpen a kérdéses, aaabzáktadó végsőiét az ellentétes -folyamatok eredőiekén; állandó, úgynevezett Ateaöy -xaíxü konvesíráosón marad, aírsely elegendően alacsony ahhoz, hogy kuszokígos elsőrendű seakeavrebességet hozzon karé. Az analizálandó vegyület áhae-dez, ''s-eady-siatt;'’ kan<reoSrácjó;a így líneárkan arányos a teljes vizsgálat
-A -ebesseeevei. Λ reakeiesebevsegok «teresével az analizálandó vegyidet mennyisége idifinyen niegkatározható.
Az enzimes, ciklusos vizsgálatokat néha ampíiílkáciős vizsgálatnak. nevezik, mivel ezek az eljárások a mérésnek az -analizálandó vegyidéire való érzékenységét jellemzően lÖö-KXM-sxexesére növelik. Homoeiszíeiti mérésére eddig még nem inak. le enzimes, dkkssös vizsgálatot.
Á iaiáítsány tárgyát képezi enzimes, ciklusos vizsgálat homocisztemre és/vagy cisztatloninra, amely ölesebb, és nagyobb míntaszámot tesz lehetővé, mint a jelenleg alkalmazott diagnosztikus vizsgálatok. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások és vektorok olyan enzimek rekombináns termelésére, amelyek mintában lévő homocisztein és cisztádon® mennyiségének értékelésére szolgáló vizsgálati reagensek és· vizsgálati reagenskészletek előállítására alkalmazhatók;
A következőkben röviden összefoglaljak a találmányt. A -találmány tárgyát képezi enzimes, ciklusos vizsgálati eljárás oldatban lévő homocisztein és/vagy cssztaöonin mennyiségének értékelésére. A vizsgálatban homocisztein és L-szerin reakcióját használjuk fel, amely során clsAatlördn-d-színtáz (CBS) enzim vagy származéka segítségévei ciszmtfonin képezödifc, és a cisztádon® asztalionin-β-ház (CBL) közreműködésével enzimesen homociszteiané, pirováttá és ammóniával akikul át. A vizsgálatban a homocisztein és/vagy a cisztahoniu koncentrációja állandó, steady-state-' jeíiegá, és lineáris kapcsolatban áll a teljes reakció sebességével. A homocisztein és/vagy & -cisztatlonm mintába® léve mennyisége a képződött phnvát és/vagy ammónia mennyiségéből vagy a reakclőkeverékhől eltávozó- szerfn mennyiségéből határozható meg. A találmány szerinti vizsgálattal mérhető oldatok például laboratóriumi vér-, szérum-, plazma-, vizelet- és egyéb biológiai minták. Továbbá egyéb más folyékony minták is vizsgálhatók.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a homocisztein és/vagy cisztationin oldatban lévő mennyiségének meghatározására .szolgáló eljárás során a kővetkező lépéseket hajtjuk végre:
(aj a homociszteínt és/vagy eisztatiőnint tartalmazó oldatot kapcsolatba hozzuk (akár dlszulfidredakciós lépés végrehajtása előtt ós/v&gy titán) reakciókeverék formájában CBS-sel vagy származékával, Lszerinnei és CBL-lel vagy származékával elegendő ideig althoz, hogy az bomoeiszte-kmek cisztationinná, és cisztafioninnak homociszteinná történő ciklusos- átalakulását és visszaalakulását katalizálja, amelyet piruvát és ammónia termelődése kísér, (b) meghatározzuk a reakciókeverékbe® lévő piruvát és/vagy -ammónia mennyiségét, és (c) kiértékeljük az oldatban léve homöeiszte-in -és/vagy cisztatienin mennyiségéi a képződött piruvát és/vagy ammónia mennyisége alapján, ahol az a) lépést kevesebb, mint 15 per-ólait hajtjuk végre.
Előnyösen, az. -eljárás szerint homoeiszteín mennyiségét az olcsó L-szerin aminosav hozzáadásával ériékeljük, A reakciókeverékbe® lévő piruvát metmy&ége kétféle módon mérhető, A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a reakciókeverékbes foktát-dehidrögenáz (I..DH) vagy származéka és NADR (redukált nikotinamid-kofoktor) vagy származéka található. Az LDH ΝΑΓΑΗ jelenlétében a phuvátot laktatta alakítja. NADH-oak NAD+ formává (oxidált rdkotmamid-kefuktöíj történő oxidációjával. A NADH-uak NAIH-azá történő oxidációja számos, a technika állása szeriül: ismert eljárással mérhető, például a reakció-keveréknek 340 nm-nél történő vizsgálatával. A NAD-t termelődése egy olyan festék oxidációjával is nyomon követhető, amely kimutatható színváltozást okoz. A találmány szerint előnyösen, alkalmazható festékek például, de nem kizárólag S,5'-dítiöbisz-(2~nítrobenzoes£ívX 2,6-dikiórieml-índofonol, tetrazóliamvegyöletek, fenazin-metoszölfát, metilvsoiogen vagy ezen festékek bárcailveu származéka. Az oldatban lévő homocisztein és/vagy eisztatioain menyoylsége a megfigyelt sziníntenzitáson alapul a vizsgálandó vegyidet ismert koncentrációit tartalmazó mintákkal készíteti starídardgörhévél összehasonlítva.
* « » χ X « ψ
Egy másik megvalósítási mód szerint piravát-oxidáz; alkalmazunk torma-peroxKlázzai, hidrogénperosid és <-.?. ki-omcgán jeíeti létében a miidaban lévő piravát mennyiségének. meghatározására. Ebben a koiornnonias reakcióban előnyős kromogének a .rsáírh.an-'N-eti{-N'2-hiároxi'3-sznlíőpropií>-m-íolüidí'n <TOOS) és egyéb NoidN’d2'hid!O\i--3-szaii<ájr<spi;}-ad!Í!a-szárn;azékok. Mint az előzőekben, is. a rátáidban lévő homüelszteis és/vagy cisztationin nrennyisége a megfigyeli szíj'lotenziiáson alapul a vizsgálandó vegyület ismert koncentrációit tealm-aző mintákkal készített standaídge-hévet összchíísonliiva.
Az oldatban lévő homöciszteip és/vagy císzímíenin mennyisége a reafcciókeverékben lévő ammónia mennyisége alapján is mérhető. Óidéiban lévő ammónia koncentrációidnak meghatározására nagy számban állnak rendelkezésre eljárások. A találmány egyik előnyős megvalósítást módja szerint az ammónia mennyisége könnyen beszerezhető, hagyományos ammónl&szenzotraf mérhető.
figy további megvalósítást mód szerint a találmány tárgyát képezi eljárás mmtábítn lévő homocisztein és··vagy cisztsfitmm mennyiségének megállapítására. amely során az. oldatot kapcsolatba hozzuk egy redukálószerrei elegendő ideig abhoz. hogy lényegében valamennyi' hofnociszteiní és rttás, az oklatban lévő díszít Ifidet homocisztejnaé' rcdokáljuk. A red'ukálószerrel törtée« kezelés iéiszabadithatja azt a homoeiszíemi is, amely az oldatban lévő fehérjéhez és/vagy más tnolekttlákboz kapcsolódik diszulfid-kötésseken kérésztől. Λ redukció után az oldatot CBS-sel vagy származékával, L-szerianel és CSE-leí vagy származékával hozzuk kapcsolatba elegendő ideig ahhoz, ixtgy ez bomocsszíemuek clsztaílommiá és císztationinnak hotnociszieinné történő ciklusos átalakulását és vlsszaalakulását katalizálja,, amelyet pirttváí és ammónia: termelődése kísér. Az oldatban levő bomoetszteln és/vagy dszíafiortirt menny bégének 'megállapítása érdekében a reakciökeverókben lévő píruvát és/vagy ammónia mennyisége· határozható meg az előzőekben ismertetettek szerint. A taláhnány szerint előnyösen alkalmazható redókáföszerek példáid bőrbiőridsök és tíolrednkáió anyagok. Ezen megvalósítási mód szerint alkalmazható, jellemző doíredukáló tmyagok például a dihoerítriíoi (ΌΤΕ), a dbiotreiioi <Γ>ΤΤ), a β-rneftetpíoetsnoi (I5ME), a trisz-jkarboxietiíMüszfin-tódrokioü-ö .(TCEP) vagy tloecetsav vagy ezek bármilyen származéka és hasonlók..
ágy további megvalósítást mód szerint az oldatban lévő hontociszteln esvsgy cisztationin mennyiségének megállapítása során az oklatot ctsztadonin-y-líázzal (CGLj vagy származékával előkezeljük elegendő tdeig. ahhoz, hogy a reakelókeverékből minden eismíaiiorsint eitávoihsunk a cisztationinnafc ix-keíoglutaráttá történő átalakításával, Λ eiszttitiortiit eltávolítása után a eiszsátionin-y-líáz? kivonjuk a reaketökeverékből, vagy tönkretesszük.. Egy jellemző· megválöxílásl mód szerint s cásztatlonin-y-liázt az oldatnak elegendő ideig történő
5ö melegítésével tesszük tönkre, hogy lényegében minden enzánaktivitást. megszüntessünk. A cisztationm-y-ltáz egy oldhatatlan szubsztráton vagy íélü-lekm immohőizálható, például mikrorészecskéken vagy gyöngyökön, amolyek könnyen eltávoörhatófe.
.A találmány további megvalósítási r szerint eljárás oldatba·? levő homocózíeio es-Azgy elszíauonm ioenttyiségétíck megállapítására,. a;ne,_, se oldatot reagábatjak L-szerinnel év CB-S-sci vagy származékával és CSL-íet rogy származékával, amelyeket: szilárd íéiületen hyuno'bihzá'hunk. Λ szilárd midiéi teher peidáui papír, szSrönopi·', rtulioo, üveg. kerámia, kova. aluminiarnoxld, dhítomröUl. coljttfóz, polimetakriláí:, polipropilén, 'poliszik-ce. polietilén, poiivmil-k.looil es származékaik. A szilárd télidet tehet a vizsgálati edény oldata vagy apu. vagy a vízsgáiatiedéoyhez átkát arc,;;g. Előnyős megvalósítási mód szériát a sznard tol Ifiét gyeogy tettei, amelyet a vizsgalati edényhez lelratk.
» χ« #*«♦ Φ* ♦ φ * X φ « * « ♦ Φ Φ XA
A találmány szériát alkalmazható -CBS vagy származéka. C3L vagy származéka és essztKiiouítt-y-líáz vajiy származéka ssjíbői nyerhető ki nyers kivonatként, A találntáríy egyik megvalósítási módja szerint a cirztaiioski-h-szírnáz! (CBS) vagy származékát, a cisztotiomurp-l'lázt -(C3L) és vagy a .ctsztatioma-y-l'iúzt (CGL) b-umánereddii, élesztő- vagy bakteriális sejtekből tisztitek. A találmány -előnyös megvalósítási utódja szerint az enzimeket kódoló géneket izoláljuk vagy szintetizáljuk, és az enzimeket rekombináns teheneként expresszijük egy gazdasejtben, Előnyösebb, ha alfinhási címkét kódoló DNS-szekveneíái adunk a géúkonstrukcióhoz, hogy·' segítsen a rekofnhiítónsan előállítod enzimek tisztításában és/vagy ktmuratásában·, Rekombináns eljárások is alkalmazhatók olyan fúziós fehérjék előállítására, amelyek CBS és CB-E enzimaktíví•ásait egyesítik egyetlen Idítériében. Affinitás! eiinke a fúziós fehérjébe is beépíthető, hogy segítse a fúziós, feli} hérie tisztítását.
A találmány tárgyát képezi tnlíttábsit lévő homocisztein mennyiségének m-egáifápnására szolgáló eljárásként olyan vizsgálati forma,, amely konszenzus, polínukleobd-lkőtö· szekvenciához kötódö homociszséitótrajtsricripelősfaktor-kompíéx mennyiségével ál) kapcsolatban. Előnyös megvalósítási mód szerint •az eljárás során a mintát red«kál«szer?el hozzunk kapcsolatba elégendő ideig ahhoz, hogy a homociszteint fellő szabadítsa minden kapcsolt fehérjéből, majd a redukált homociszteint kapcsolatba hozzuk homo•eísz-.e.tn.m.etaboht-kotö transzkripciós faktórt&i kompiexképzésre sikaimas körülmények közön, a mituút homoclszieűvinmsztepciösfaktor-kompfoxet specifikusan felismerő, konszenzus prriirmkfeotíd-szekveaerával keverjük. .és a konszenzus poiiwkleoúá-szekvencrához kötődött bomocisztein/transzk.ripc.iósfaktor-komplex mennyiségéből kiértékeljük a mintában lévő homocisztein mennyiségét Az eljárásban alkalmazható redukálőszerek például bdrhídrídső vagy tioiredukátó anyagok, például diíioeriírito! íDTEs, ditiotteikd (DAT), •p-merkaptoeíanol, bís-z-ikarboxietdj-tbsszítn (TCEF) vagy doeceíxav vagy ezek bármilyen sója. Homocíszíeinmetabolft-kötó transzkripciós! faktor például £. óvd M:etR« amely konszenzus poliaukleoiidszekvenciát, például all. azonosítószámú szekvencia szerinti polinukiétnid-szekveneiát |Marconi és mtsai., Öiochetn. Biophys, Rés. Cammes. .175, 1057-11)63 11391 >] vagy származékát ismert fel.
.25 A találmány egy további megvalósítási módja szerint vizsgálati reagenskésziet, amely 'tartalmaz egy edényt az oldat számára, amelyben a homocisztein· és/vagy cisztatíonm mennyiségét értékeljük, az L-szcriat. a· CBS-t vagy származékát, a CB1I.A vagy származékát, és valamennyi pufiért, segédanyagot ős oldatot, amely a magas enzimakrivítás eléréséhez .szükséges körülményeket, biztosítja. A vizsgálati reagenskésziet tartalmazhat továbbá laktát-dehidrogenázt vagy származékát és NADH-t vagy származékát A NADH 340 nm-nél mérhető .50 közvetlenül, vagy olyan lesték, aratóiy oxidáció· esetén szátt’áltozásra képes, szintén a reagenskészlet részét képezheti. A horaodsztsin és/vagy cisztationin mennyisége kapcsolatba hozható az abszorbancia idő folyamán •«én változásával,
Eidisyős megvalósitási mód szerint az t.-j';z?;-íck -A.id hordozóhoz kötve, ímmohilizsít formában találhatók, A szilárd hordozó lehet -a vizsgálati mim® tartására szolgáló edény felülete, vagy lehet gyöngy vagy más tárgy, amelyet az edényhez adunk. A találmány további megvalósítási módja szerint a vizsgálati reagenskösztet része cisztattonin-y-dáz is. 1 a>gy a vizsgálati oldatból .minden eixztatiomtrt eteriol hsunk az enzimes,. ciklusos vizsgálat előtt, A eisztattórtirí-y-liáz vagy '.zám-azclda-ak akti vitását lényegéixm. teljesen el kell távolítani a reakciókeverékböli. vagy főnkre keli tenni, mfeföR a homoelszteia enzimes .ciklusának további komponensei t n>a/zeaof ok.
4b Azt tapasztaltak, hogy a találmány szerinti, eiöríybs vizsgálat viszonylag rövid idő alatt elvégezhető,
«.♦♦·♦· iiszonylag kis enzínuneno.yi;$éggei. amely mi:;tt a vizsgálat kereskedehnl szempontból lény eg.es előnyökkel bír. blöijíís vizsgálatban példás.;! a reakciókeverék bemociszteiR-íartálmú mintát, szerint. C3S-h CBl-r. íaktátdekidrogenázt. NADH-t és redukálószert. példáid DTE-t vagy DITd tarttthtraz, 3 keverékben a CBS C8L arány «uotegy i:H-tiki 25:l-íy terjedhet, előnyösebben mintegy I:IC-íg, és előnyösebben· mintegy 2:1-töt 5:1-ig. Elö5 nybs módon azt •apasztahuk, hogy a redukálószer a kimutatási rendszene; együtt jelen lehet (azaz a lakót·· dehidíogenázza! és a NADR-val) .anélkül, hogy káros hatása tenne a vizsgálatra.. Λ találmány szerinti vizsgálat ezek szerint -végrehajtható egy külön redukálást lépés nélkül, igy 3 teljes vizsgálati idő rövidehb. Abban az esetben, orrúkor nagy számú mintát keli egymás után mérni egy edényben (ok spektrofotometriás kűvettában) min•íából, szériából'. CSS-bői. CBL-ből, laktát-dehidrogenázbői, NAOH-bói és a nedukáiószerböl álló reakciőkeve10 reá kialakításával és a feakciőkeverékben lévé ptruvát mennyiségének uiegáliítpitásava? az Idő folyamán keletkéz·^ NAD- termelődésének nyomon követésével, az adott reakeioÁIalakitási lépések közötti időintervallum akár 10-50 sec rövidségé Is lehet, a. teljes reakcióidő pedig akár mintegy 2(1 perc is lehet egy adott mintánál. Előnyösebben egy adott .mintánál a teljes reakcióidő akár mintegy IS pere lehet, és előnyösebben akár mintegy 13 perc. Az óránként megvizsgált minták teljes szánttá mintegy 15 -30 lelttel lassabb készülékekkel. de. akár 20015 dOö gyorsabb készülékekkel. Az előnyös vizsgálatban a mintát, a szénát a iáktáf-dehidrogenázt, a NADH-t és: a rednkálőszert tartalmazó első reakciókeveréket készítjük el' elegendő ídejő inkubációs periódussal ahhoz, hogy a mintában lévő, kötött, oxidált és/vagy szabad bomocisztem Cteljes homochzteín) túlnyomó részét (és előnyösen lényegében az egészet! felszabadítsuk. .Ezután CBS-t és CBi..-ί: adnak, hogy teljessé tegyük a reaketókevetékeí és 3 bomöcisztem és/vagy a etsztatiotain enzimes- ciklusát -elindítsuk.
Egy további előnyős megvalósítási mód szerint cfe&tftonm Wibsátortokjként alkalmazható az eazimvizsgálathoz (mivel az enzimes, ciklusos vizsgálat egymásba alakítja a bomocisztemt és a cisztauoomt}. Más szavakkal, cjszjanonin ismert, változó mennyiségei alkalmazhatók a vizsgáltad rendszerben a vizsgálat és/vagy a készülék kalibrálására vagy staadardízálására, amely a mintaeredmények mennyiségi értékelését teszt lehetővé. Ezen megvalósítási mód .szennt cisztationin ismert koncentrációját adjak a biológiai mintához,.majd vizsgáljak valamelyik másik megvalósítási mód .szerint Az eredmények aktján kalibrációs egyenest veszünk fok amely azután homoersztein egyeneseitek megái lap kására alkalmazható .a két vonal közötti korreláció magas foka miatt. Egy másik lehetőségként cisztationin ismert mennyiségei alkalmazhatók minőségi kontrolimérésnéí, hogy biztosak legyönk benne, begy a vizsgálat megfelelően működik. Ezen minőségi kontroll megvalósítási mód szerint a cisztarionin ismert mennyiségeit ágy métjük, mintha, ismeretlen minták lennének, és az eredményeket az is3ő mert (vártj értékeikhez hason Ilijük, hogy biztosítsuk, hogy a vizsgálati rendszer megfelelően működik.
Előnyősén a vizsgálatokat izolált (íiszthottl C8-L- és CBS-enzimekkel végezzük, amelyeknek xzekvenciaazonossága a lő. vagy a 20, trzonositószántá szekvencia szerinti enzimekkel· legalább mintegy dö% ( év előnyösebben legalább mintegy A/hp. A leírás szerinti: értelemben a s-zekveneíaazonossáfi kifejezést,- ο-y ,t feehnika állása szerint ismeretes,. két vagy több fehérje- vagy polipeptid-szekvencia vagy két vagy több poiimtkieoíiő-szekveneia, konkrétan egy reférenclaszekvenci® és a rciéreneíaszekvencíávai összehasonlítandó, tsdot; szekveneta közötti viszonyra értjük. A szekvenciaszonosságot ttz adott szekvenciának a oeferenciaszetevvnc iával törtünő összehasonlításával hmátozzuk meg. miután a .szekvenciákat optimálisan egymás mellé renliazrák oly suodon. hogy a legnagyobb mértékű szekvenciahasonlöségot kapj·/, amelyet az dyen szekvenciák ,vátai közerő oárosedásstö hmározunk- meg. 1 Iveit egyórás arelié rendezés <serers ;· :v::ekvonaío;z<ax;5ságo· ez éti adott helyzetek ahayao határozzak meg; poklául a szekvenciák egy bizonyos hoíyzetbea azonosak”,.ha az adott helyzetben, a nukleotidoh vagy az nrofoosavak azonosak. Az ilyen azonos helyzetek teljes szánját azután- osztjuk a leiéi-síjciííszekveneiába!?. iev ö ít uk leot idők vagy atáiaosavak tejes számával. és így kapjuk meg a százalékos szekveaeiaazonasságot A xzeisveaelaazonosxág ismert eljárásokkal könnyen kiszámolható, példánk de nem kizárólag a kővetkező publikáclókban ismertetett eljárásokkal: €o tapéta bonni Ivloleeular Bioiogy, szerk.: l..csk,
A. N. Oxford Univershy Press, New Vo-rk: (1988), ihlocötapatiíre: hj.fornianés und Geuome Project-s,. szerk.: Snath. D. W.,Academlc Press, New York (1993). Computer Analysis of Sequeaee Data. I. rész. szerk.: Griíltn, A. M, és öriffin. H. G., Humana Press, New Jersey (19941, Sequeaee Analysis in Molecular B-iology, szerk..: ven Heinge. G., Aetiiiemíe Press (1987), Sequeaee Analyós Pntner, szerkó Gribskov, M. és Devereux, ί., Ml. S-tookton Press, New York (1991) és Carilio, H. és Liptnap, D.„ SlAM .1, Applied Matb, 48, 1973 (1998}, ame19 lyeknek kitanitássa a leírás -részét képezi. A szekveueiaazonosság meghatározására szolgáló előnyös eljárásokat úgy tervezték, hegy a vizsgált szekvenciák között a legnagyobb párosodási eredményezzék, A szekvenciaazonosság .meghatározására szolgáló eljárásokat széles körben hozzáférhető, számítógépes programokba írták, ame-ivek meghatározzák a.szekveaciaazoo-asságot az adott szekvenciák között, ilyen programok példánk de nem kizárólag a GCG-programcsonsag [Deveteux, j. és mtsak, Noeieic Acids Research 12(1), 387 (1984)], a
BÍASTP. a Bi.ASTN és a fÁSTA{Alfcsehul, S, F és mtsak, 5. Molec. Biot. 215, 403-4 lö-(1999 jk A 8LASYXprogram az NCfoi-nél és más egyéb forrásokból hozzáférhető jOLAS? Maouai, Altsebul, S. és mísai.., NCVl NÍ.M Mll-t Bethesőa, MD 2(18-94, Altschsd.· S. P. és mísfo,, 5. Móleö. Biól. 215, 493-410 (1999). amelyeknek kitasilása a leírás részét képezi!. Ezek a programok optijnáfem egymás mellé rendezik a szekvenciákat alapértelmezési iyaksdlyozással, hogy az adott szekvencia és a referenstaszekveacia közötti legnagyobb szekvenciáéi) azonosságot hozzák létre. Szemléltess kedvéért például egy polmukieobáuái, amelynek nukleotldszekvenefoja legalább például 9554-os szekvenctaazo-sosságoí. mutat a referencia-nukleotidszckvenciávak azt érijük ez alatt, hogy az adott poii-sukleoild mkleotidszekvessciája azonos a refeteucias-zekvenctávaí, azzal a kivétellel, hogy az adott pounukíetfod-szekveuela maximálisan 5 pontnjuíáclót bvtahnazhat a refemncia-nu-klesnidszekvencia 190 nukleotldjára vonatkoztatva. Mas szavakkal egy olyan pölínukleotidban, amelynek nukleotidszekvenciája fog25 alább 95%-bsm azonos a reforericta-muideoódxreSiveneiával, a reiérenciaszekvenekihan lévő nukleotidok akár 5%-a. (foleíálbííió vagy ssubszíituálbstó más nukleotidáal, vagy a re tereire luszekvene la teljes nukleotidmennyiségének maximálisan 5%-át kitevő számú nuk lentid építhető be a referenciaszekvenctába. A referenciaszekvencia mutációi a reierencia-oukleotidszekveaeia 5'- vagy 3:-végi helyzeteiben fordulhatnak elő, vagy bárhol ezen- végheiyzotek között, vagy szétszórtan akár egyedileg a refereneiaszekvenciában: lévé nukleotidok között, tikár egy vagy több összefüggő csoportba»- a reíereoemszekvencián belül. Hasonló- módon •egy pohpepíionéi, amelynek adott amiuosavszekveactája legalább- például 95%~o« szekvenciaazonosságot mutat a reféreoda-ammosavszekvenciával, azt érőnk ez alatt, hogy a pclipepud adott wmnosavsxekvenelája azonos a reforeneiaszekvoneiával, azzal a kivétellel, hogy az adott poiipeptkl-szekvonfoa maximálisam 5 tmiioosíivválíozítdásí: tanalmazhat a reforerseswummoxavssrekvcncla 199 .omnosavára vonatkoztatva. Más xza33 vakkal egy -otyan polípeptíd-szckveaetaban·,. amely legalább 95%-bin· azonos a. relbfencia-anjtno.savszekvenelávai, a re Ferenc taszek véne iában lévő amfoosovak akár 5;>9-;i déletálbató vagy szubsztüuáíható más ammosavakkal, vagy a reforenciaxzekvenoia töltés aíjriBOsavfmmnylségének maximálisa» Ófo-őt k itevő szőorn renmosav épkbető be a reforenekisxekvóncÍába. A reforeneíaszekvencia ezen változtatásai :s referenciaammssavszdkvenm annno- vagy kazboMfoztíTináí kí helyzeíelhet? forda Ihatnak elő, vagy bárhol ezen két végié l-ieiyzét kozott, ózetxzőífon New egyedileg a reíererteKtszekvenektbao ievó .itfonosevak között, aksr egy vagy *-♦· «
« · több összefüggő csoportban a refereadsszekvenckm beiül· Előnyösen a nem azonos amttxdsavafe. konzervatív anjinnsavszubxzjjütaök. A tenzervuőv szabsztitóciók azonban nóta számítanak· par-u-odám-ak, kittikor a szekvenciaazonosMgot határozzuk meg.
Λ találmány -szerint alkalmazható tepgensek például a CBS. a·CBL, az L-szerin. az LDH, a NADH, a 5 DTE. a βΜΕ. a DTT, a TGEP. a -titteeetsav és a COL. A találmány szerinti CBS-enzim koncentrációi mintegy 0.1 KÚT és ••ni-ntejgy löö KU?'I tartományba eshetnek. Előnyösebben a CBS koncentrációja mintegy Ö..5 KÚT és mintegy 75 K.U/1 közöd van. elönyősebfeeő mintegy 1 KU/1 és mintegy 50 KÚT közölt. Előnyösebbért a CBS koncentrációja mintegy ί KÚT és mintegy 30 KÚT közöd van. A találmány szerinti CBL-enzim alkalmas koncentrációja mintegy 0,01 és mintegy 100 KÚT közötti tartoimlnybars van. Előnyöseidben a CBS koncentrációja mintegy 0.05 és mintegy 50 KÚT között vart, -előnyösebben mintegy 0,1 és mintegy 30 KÚT között. A CBS koncentrációja legelőnyösebben- mintegy OT es mintegy 15 KU. i között van. Az ί,-szerin mintegy i pM és mintegy 50 mM közötti végkoncentráetőfean alkateazható. Az L-szerint előnyösebben mintegy' 10 y;M és mintegy 40 mM közötti végkoncehéőácíőbstd söjiik, előnyösebben mintegy 100 μΜ és mintegy 20 mM közötti végkoncentrációban. Az L-szeriní legelőnyösebben mintegy 0,2 mM és mintegy 10 mM közötti végk<:-nce.otráctóI5 hars adjuk. Bármelyik megvalósítási módot is aíkateazzok. az LDH a reakcióké verőkbe a mintegy 30 Ul. és mintegy 5000 LEL közötti végkoncentróciőban van. Előnyösebben az LDH a reakctókeverékben mintegy 30 UT. és mintegy 3000 U/L közötti végkoneentrációban található, előnyösebben mintegy 50 LEI, és. mintegy 2500 U/L között. Az CDIT a reaketókeverékben legelőnyösebben mintegy 100 LEL és mintegy 2000 U/L közötti végkoncentrációban található. Továbbá, amikor NAöH-t is alkalmazunk bármelyik meg valósítási mód szerint, a
NADH tnennyisége a zeakelökeverékben mintegy ÖT mM és mintegy 2 mM között változhat. -Előnyösebben a NADH a. reakciókevetékbsn mintegy 0,1 mM és mintegy 1,5 mM közötti végkoneentrációban lehet, előnyösebben mtntegy OT mM és mintegy I ®M között. A NADH a reakciókeverékben legelőnyösebben mintegy 0,2 snM és mintegy 0,S nvM közötti végkoncentráciőbatd lehet. Amikor a teláíttrány szerint DTE-I is alkalmazunk a végköncenőációja mintegy 0,01 mM és mintegy 100 tnM között lehet. Előnyösebben a DTE koncentrációja mintegy 0.01 m-M és mintegy 50 mM között van, előnyösebben mintegy 0,1 m'M és mintegy 25 mM között. Előnyösebben a DTE végkencen-uációja· mintegy 0.1 mM és mintegy 10 mM közötti tartományban lehet. Hasonló módon, amikor DTT-i alkalmazunk a találmány szerint, a végkoncentrációja mintegy 0,01 mM és mintegy :0ö m.M között lehet. Előnyösebben a DTT koncentrációja mintegy 0,01 mM és mintegy 50 mM közötti tartományba;'! tehet, és előnyösebben mintegy 0,1 mM és mintegy 25 mM között. A DTT végkoncentrációja· legelőnyösebben mintegy 0.1 mM és mintegy 10 mM köz® lehet. Cégül pedig, amikor CGL-t alkalmazunk a találmány szerint a végköfieeMráctőja mintegy 0,1 KÚT és mintegy 100 KÚT között tehet. Előnyösebben a (AT. mintegy 0.5 KÚT és mintegy 75 KÚT közöd tehet, előnyösebben mintegy 1 KÚT és mintegy 50 KL I között lehet. A CGI, végkoncefitcációja tegelönyösebbea mnnrgy 1 KÚT és mintegy 30 KÚT között tehet.
Egyes előnyös megvalósítási módok szerint az I-es reagensben lévő pnl'fer 250 mM TÍUS, -pH 8,4.
Amtor azonban TRIS-t uikalltnazank pefferként a pH 7.0 és 0,0 értékek közön változhat. Előnyösebben a pH T5 és 8,5 közöt? változhat, előnyösebben 8.1 és S.5 között.
Λ 1 TUS magasefeb koncentrációban tőrte/tö alkalmazása levitte a vizsgálat tentetelhetösécét. növel ete-mal; 1 a pH állandó szinten tartását. mivel kom?e:ai:ráí;abb porié·'. Λ CBS es a ULU, továbbá Sényettesen aktívabb ebben az előnyős pH taríomanyhan, előnyösen mintegy Sri ésTi.3 között
4ö A találmány tárgyát képez: clyat; vizsgálat, amely zavarna mintákkal ia ugyanolyan jól működik. A zavarossággal íturbiditáseai) kapesobtös problémák bpáznak -Is ct-cikfodextrinoek Ki-hoz töíténö hozzáadásával csökkenthetők. A zév«ro.s$ág csőkkenése a trigiicerldeknek iíp-ázokkai glicerinnéős szabad zsírsavakká történ-ö hidrolízise és a szakad zsírsavaknak íí-ciklorleztriíiítel: történő komplexképzése· útján történik, Ezen kát komponensnek a 3-as .reagens előtt történ© hozzáadása segíti a reakctókeverék kítíszitöésát. A iípáz és az <».clkíedestrin helyeit EDTA hozzáadása egy másik lehetséges módszer zavaros minták, pontos átérésére.
A találmány egy másik változásában különböző mennyiségö reagens hatását vizsgáltuk. ilyen váltöztatásoknak nincs lényeges hatásuk a vizsgálat pontosságára..
A találmány; leírásban különböző detsrgensék és: koncentrációik hatásának vizsgálatát is ismertetjük. Λ Genapo! X-SO például mintegy -0,05-0.5%-közötti ko-neentiüc-ióban lehet az l-es reagensben. Előnyösebbet; a koncentráció mintegy ö,l:-Ö,5As között, előnyösebben mitstögy b,2-d.4% között vart. Ezek köziül három koncentrációt vizsgáltunk 10,1%. 0,3% és 0.5%;, ős a 0,5% koncentráció biztosította a legpontosabb eredményeket. A találmány szeri rá az Rl-ben Brit-55 alkalmazható mintegy 0,01-0,5¾ között; koncentrációban. Előnyösebben a koaee-ntrációtartonsátty mintegy 0,015-0,0% előnyösebben mintegy 0,020-0,030%, A vizsgált koncentrációk közül -::.025¾. (5,05%, 0,1 hé és 0,5¾} a legpontosabb és legkövetkezetesebb ered mért veket » 0,025% ko;tcentrációvai kaptuk.
A találmányi leírásiján vizsgáltuk, hogy a DTE redukáió*zer trisz-<2-kncboxi«tüfoszfin>hidfőkióriddal (TCEF) belyehesithetö-e, amely tisztítóit vízben hosszabb ideig stabil. Ez a helyettesítés a reagens vonatkoztatási f'hlaíüéj reakcióját mintegy 12-15 tjtiA/irsin értékről mintegy 4-5 nvVmin értókte csökkenti, amely pontosabb vizsgálatot tesz lehetővé. Amiket a találmány szerint TCEP-t alkalmazunk, a kaneéntnidója. mintegy 6-53 mM közötti tartományban lehet. Előnyösebben a koncentráció mintegy 10-45 ®M között lehet, előnyösebben mintegy 20-30 ®M között A leírásban vizsgált koncentrációk közül a 26,44 mbí biztosította a legpontosabb eredményeket
A 3-as reagenst -alkotó keverék összetételéi is változtattuk. Például, a Tris-putíért fosz-fá-tpufteael helyettesítettük. és glicerint adtunk a pariérhez. A töszíát mintegy 50 ntM és mintegy 500 tnM közötti koncentráeiókbaa hatékony plí 7.ó-nál. A glicerin mintegy 0.5% és i r?' .' ftbri) közöld koncentrációban lehet. Eoszratot és glicerint alkaítna-zttmfc. hogy az enzimnek hosszabb legyen a eltarthatósági ideje, amely 'íRiS-ρο bőrrel nem veit lehetséges.
Λ találmány egyik előnye, hogy számos készülék bármelyikével elvégezhető. A vizsgálatot például lsét küíőithözó készülékért, líitöubi 01 i-ca és Bcckuian CX5 -ön történő vizsgálathoz: adaptáltuk. Pontos es következetes eredményeket kaptunk mindkét készülékkel Λ vizsgálat továbbá csak kei reagenssel is elvégezhetik az. d 1- és Rl’-korapcmemekfiék a készülék szükségletének megfelelő, helyes aranyban történő összekeverésével.
v égül pedig a találmány egyetlen kalibrációs pont használatára is adaptálható. Fontos megjegyezni, hogy az -egyetlen, pontos .kalibrációból származó eredmények éppen olyan pontosaik, mint. a többpontos kalibrációs görbe.
A kővetkezőkben az ábrák rövid leírását Í$t??eríctjük.
Az I. ábrán abszorhmtelát ábrázoljuk az idővel: szemben, amely grafikont piruvat |5-iOö pAli vizes oldatával kaptuk, és amely p-irová! mennyiségi átérésé; szemlélteti, A reagenske-topoaen-suk azok, «melyeket az 1. -áblázatbao ismeríc'ttunk, a készülék beállításait pedig a. 2. táblázatban írtuk le.
A 2. ábrán Ismert mennyiségű plraváttaí (0- 04) μΜ) arabén ábrázol·, abszorbanciiíértékek Mán* V Φ «, * Φ * φ φ ' »>
d;srd§'<s-rbéj:é-t ábrázoljuk, A vizsgálat időtartama 5 pere.
A 3. ábrán abszorbaedát ábrázoljuk az idővel szemben, amely grafikcii? cisztsfionm (O-IOO μΜ) vizes oldatával kapok. A cisztái inak;!: C8L közreműködésével c isztationsnnak homociszteinné, pirovát-á és ®móniáv'á íöríénö enzimes áíakibtöáss vö ; mértük.
Λ 4. ábrán eisziMKmmvtzsgáfet staaílacdgbrbbiét ábrázoljak, amelyet cisztatiomm ió-löO μΜ) vizes öiparával nyertünk. A reakcióidő vagy 5 pere vagy 29 pere.
Az 5. ábrán sbszorbanekii ábrázoljuk az idővel szemben, amely grófikon a CSS/CBiipiravátoxídaz/perorádáz ciklusos és kimatiüási -rendszert szeojiéheb, Císztattönim vízbe» oldottunk, hogy I és iOö pM közötti: koacemrációiú standardokat készítsünk.
A 6. ábrán sbszorbimeiáí: ábrázoljuk az idővel szemben, amely grafikon a CBSiCBbín-ruvátoxidfepexoxid&z mkiusos és kimutatás! rendszer? szemlélteti, Homoeisztemt vízben oldottunk, hogy 0 és ifid μΜ közötti koncentráoiójd standardokat készítsünk,
A. 7. ábrán a CBS/CSlzPOHRk ciklusos és kimeintási rendszer alkalmazásával, homocíszteis vizes s 5 oldatával 10·áOö pM) kapott, jellemző kalibrációs görbét ábrázoljuk.
Λ 8. ábrán Pősotrettoi nélküli CBS/ÜöláLDH rendszer alkalmazásával, homocisztem vizes oldatával <0-100 iiM ; kapott, jellemző .abszorpció-idő-görbét ábrázoljuk.
A 9. ábrán CÖS/CBL/LÖH ciklusos rendszer ditieíreitollaí történő alkalmazásával, homocisztein vizes oldásává! (0- hlő μΜ) kapott abszoriX-dó-idŐ-görbéi ábrázoljuk.
A lő. ábrást: hotnoci-szteín koncentrációjának iO-bk) μΜ) atsszorbanciávai. szemben -ábrázolt kalibrációs- görbéjét moráljuk be dístötreisollal vagy néikíile. A reakcióidő 5 pere.
A ii, ábrán a humúneredeiü plazmatn-ns-tákban hemoeisztem mérésére szolgáló, redukáló anyagkéné ráTT-t alkalmazó, üüS/'CBLéLDB enzimes, eíklazas rendszerrel kapott mennyiségi eredmények és az Abbott l'Mx bomociszteia-e járással kapott mennyiségi eredmények közötti korrelációt mutatjuk be.
A 1?.. ábrán a korrelációs graSkont mutatjuk be, amely a találmány szerinti vizsgálat (yj és a kereskedelmi· forgalomba» beszerezhető IMx-v-ízsgálat (x> közötti korrelációt szemlélteti, mint a 7, példában ismerteti ük.
A 15. ábrán a korrelációs grafikont matatjuk be, amely a találmány -szerint? vizsgálat ty) és a hagyományos R'PLC-vizsgáiat. tx) közötti korrelációt szemlélted, randa 7. példában ismertetjük..
A 14. ábrán a korrelációs grafikont inuráijuk be, amely az ÍMx-vizsgáint töi; és a HPLC-vizsgálat ty) közötti korrelációt szemlélteti, mint a 7. példában ismertetjük.
Λ 15-, ábrán az abszorbancía-tdö-görhe grafikonját· ábrázoljuk Γ7ΓΤ sióikiill pt-ra'vátvizsgálat cselén, mita példában ísracrtcfiiík.
A hé ábrán ez abszotbancia-idöygörbe grafikoráá· ábrázoljuk OTT-i alkalmazó púuvá· vizsgálat esc55 -éfi. öü;-!· a V. példában ismertetjük,
A kővetkezőkben a találmány konkrét megvalósítási- módjait ismerteifiik.
A találmány tárgyat .képezi homogén, enzimes, ciklusos vizsgálat mintába·) levő iiomocisztcin meayaylsezcack m.egáilapüásttra fi'asscss'': becslést is beleértve?, Az enzimes eskbísok áíbmdő {'sready-state-} szírivé tört;;:k a üeíuoc’sztörá!, ós ráhellk a hömráőszícíri-vrxsgpiaí iirzekcöyséaet. tölaiísary tárgyát képezik ¢0 továbbá a találmány szerűn alkaltnazhat-ö enzimei, t?ekombmsns oföálíitására szolgáié gének és expressziét; vektorok. A találmány tárgyát képezik továbbá oldatban lévő homocisztein és/vagy cisztatkarin mennyiségének megáll ap i i ászra s zo Igáid reagen-skesz letek.
Λ setékben lévő hí’mocisztöío tntennedfer atainssáv, amely rnátioírinnak ciszternáé történő átaiaku5 fásakor képződik. Általába!! a testben képződött homocisztein gyorsan továbbalakuí a két útvonal valamelyikén:
{I) szertanéi történő- kottdenzáclövgS, amely eísztabomm: exedtnényez, vagy f'2; snetíoniíirsá történő úiaiaktíiássm, és igy a testben lévő · koncentrációja (és oxidált fortttájáftak a homocisztmnek a -koncentrációja) normál körülmények közön alacsony. A plazma átlagos feomcsúszte-ín-sz-intje egészséges -felnőttben fért lakná f- mintegy 12 μΜ, mintegy 8,0μΜ és snintegy 17,1 μΜ tartományban. és nőknél !ö μΜ,.mintegy 3,9 pMés lő,8 μΜ közötti ií) tartományban [Vesíer és nász;., bar. 3. Cbn. Cten. fíioehem. 29, 549-554 11991}; Jacobson és mtsai,, Cím.
Ckem. 4ö. 873-98i (.199411.
Nemrégiben kkwratták. begy biológiai srrintákbmi a homocisztesn-szini mennyisége számos esetben kimskai jelentőséggel bír. A vérijén a h.omocCTein magasabb -szintje atherosclerosfe kialakulásával áll kapcsolatban (Clarké és mtsak, New fo;g. 1 Me-d. 824. Π 49-1. {55 I1991). Továbbá, mérsékelt bomooíszieiném-iát jelenleg nzikóiákiorrsak tekintik keringést és érrendszeri betegségekre. Az egészséges felnőtteknél tapasztalt homecisztem normál tattomtktyában a pontosság nagyon- fontos, mivél a szívbetegségek veszélye jelentősen nő akár csak 3ö?ó-kal a normál koncenriác-ió léiéit, amely a kapcsolt ríziköíaktort 5,4-xzeresével növeli {Stampfer és oxtsai.,. JAMA 268, 877-881 (1992)1,
A leírás szerinti értelemben a megállapítás kifejezési a vizsgálati oldatban lévő hennoefeztem és/vagy dsztadnnfo mennyiségének mind kvaatita-sv, mind kvalitatív meghatározására értjük. A leírás szerinti értelembe! -az okim. vagy ''vizsgálati oldat” kifejezéseket klinikai vagy biológiai, folyékony mintákra vagy •szövetkivonatokra értidk. példáéi vénre, vérszánttazékokra, -például plazmára, vagy emeletre és hasonlókra.
llomoclsztefet tartalmazó minta reagál L-szentmel, és eisztationint képez CBS-enzim jelenlétében. A cisztationin azután ho?»oci!>zteinné, pirováttá és ammóniává .alakítható egy második enzimmel, CBL-lel. tízek25 nek az egyidejűleg működő, anabofikus es katabolikus enzimeknek az alkalmazása hatástalan ciklust” eredményez, amelyben (1.1 cisztatíonin. és bomoo-isztein folyamatosan átalakul, (2) szerin iebomlik, és |3| piruvát és ammónia keletkezik.
Szeriének ho-mocis-zteínhez képest viszonylag magas koncentrációinak alkalmazása összességébe!?
olyan reakciósebességet alakit ki, amely látszólag elsőrendű kinetika szerinti, es kőzvetlemö a reakcióban lévő homocisztein és cisztatkmin nteonyi-ségétöl iugg. Ha a císztat-looin koncentrációja a bontöciszfein koncentrációjóhoz képest nagyon alacsony, a teljes «akció sebessége a homocisztein mennyiségével változik lineárisan. Λ szerin csökkenésének vagy akar a pirsvát, akár az ammónia mennyisége nóvekeöésé-x:k mérésével a immoeiszteín mennyisége meghatározható egy ismeretlen oldatban vagy mintában ismert koncentrációjú komociszteií-t tartalmazó, azonos cnzítnrcakctokon keívvztnlmenö kont-mllreakciókkaf történő összehasonlításokkal. A feiáimány szerinti enzimes, ciklusos eljárás egy felerősítő folyamatot tartalmaz, amely sokkal nagyobb menny kégli végterméket álíh elő, minta vizsgálati oldatban, példáid vér, vaíöszimiieg levő homociszte-in mennyisége. Λ reakció során képződön plrnox vagy anmxmia mennyiségei mogbatátozó vizsgálatoknak tehát nem kell különösképpen érzékenynek tembük. e;< szakember számár;? ismer;, lőte/ő módszerekkel mérhető.
4ö fernvur lezfernzöco iaklátiá vagy származékává torfenö enz-mes aüöak-dbsávm mérhető lakta·-
♦ ♦ •khidtOgenáz kSzrereükeöésévd. Az enzimes áralakulást reakció NADH kofáktort (redukált sarkotmamidkofektor) vagy származékát tgéisyeii, amely N'AÖ-t-szá alakúi (oxidált nörednrenid-keísktórl:, Λ reakció a 349 nm-néi lévő ab szóéban cin sncfésévei követhető nyomon. A ie írás szerinti érte lemben a ''származékok kifejezést a koiakiorok vcawkozásábaö sókra, szobátokra és más. kémiailag módosított tormákra értjük, atnelyek megtartják a teljes koikktoraksivitást, de jobb leltei a stabilitásuk vtzes oidatokhau. Származékok például. de nem kizárólag M.AÍ5.H aceniszátmazékai, például 3-psirithmtdehid-NADH, Ő-acetiipiridín-NADH. H-íiomkotinamiáΝΛΟΗ és- hasonlók (lásd például. CS 5.804.096).
Egyéb alkalmas vizsgálatok NADH vagy származéka oxidációjának meghatározására, például fiuorsszcencia mérése., anreiynek leírása megtalálható: Fassottoau és mtsa-i.. Eu2vmatic Attaiysis, A Fracticai Gaíde, 219-222 (1993), amely a leírás részét képezi. Egy másik megvalósítási tnód szerint NADH vagy származéka piruváttaí reagál laktát-dehldrogenáz joiexdétébeo, és SÍAÜ—ol képez, amely tovább reagál olyas festékkel, amely oxidációja esdén megváltoztatja a színét. előnyösen a iátbiíto tartomány bar.. A festék színváltozása alkalmazható NA.OH-oak NADv-szs történő oxidációja telié» mennyiségének meghatározására, amely az enzimes, ciklusos reakcióban képződött giruvát mennyiségének felel meg. A találmány szerint alkalmazható· teste·· kék például, de nem kizárólag: á.5’-diliobiszi2-ni;robenzocsav>, 2.,ö-djkíőriésolmdofe«eí.. •etrazóíiutnvegyületok, fénazm-stetoszuiláb motíl-vioktgen és ezek származékai,
Pííuvá· piravát-oxidázzsí vagy származékával törtéttó reakcióban is mérhető peroxidáz, azaz tormaperoxídáz és hasonlók jelenlétében. A hi&togén-persxiddá alakult pixovát mennyisége például egy vlzoldható htdmgéndonor oxldatlv koodonzibióigvai határozható tncg, amely színes vegyüietet hoz létre a peroxid koncentrációjának lotometriás meghatározásához. Előnyös hidrogéndónorok. amelyek stabil, színes reukciótermcket hoznak létre, például az •N'-aikíl-'N-szulfopropilandin-származékok vízben oldható származékai, pl. N-etü-N-f2hsdroxi“ő-sxaböpreptlj-;n-tc>iuidís nátriutnsójá (TöOSí jTatsssokc és mt.$ai., Chern. Fhann. Buli- 30. 2492-2497 (i 982ii. A hidrogén-peroxid mennyisége- elektrometrlásan is· mérhető, amperometriás és potencioraetriás mérésekkel. A homociszíem és/vagy a eisztatibom umnyiségének meghatározása a piravátnak pamvát-oxidáz által meghatározod idő alatt történő átalakulása során képződött peroxid menny bégével való kapcsolatból ál lapítható meg.
Ammónia szintén különböző eljárásrökal mérhető, például ammóaiaszettzorral 1 Willems és sasai,. C'iia. Ültem. 54, 2372 i 1987)1, Ammónia- ismert kohmmetoás· technológiákkal is könnyen kimutatható. A mintában képződött ammónia például reagáitatharó·, hogy színes termék képződjön, amelynek termelődése spektrestbfomeíriasaH. kimutatható. Az -egyik ilyen eljárás, amelyet a íyíethods of Enzymatic Analysis Í Bergmeyer}· (, i 049-1056 (197(9 című kiadvány bárt Írnak le. és amely a leírás részét képezi, ammóniának fenollal történő reakcióján slapul, hipoklorit jelenlétében, lúgos- körülmények között, araikor színes indofénoi-lesték képződsk. Katalizátorként aátrinat-mtraprussid alkalmazható. A-z eljárás módosított változatai, például különböző .szánttá/diókkal, szintén alkalmazhatók. A szirtes végtermék az ammónia és így a itotnocisztem koncenttációjávai •..gyenes arányban képződik. öcycb eljárásuk például a nfikrtxJtifúziós vizsgálat (Seligson és mísai.., .1 bab. Clire Med, 49, 962-9741195731 es az ioncserélő technológia j.fonnám l.’fin Chere, io, 497-508 (1964; j ős a különböző enzimes eljárások jiásd például., Meudzíio és remi., 3. i..uh Cbn. Med. 66, 326-531 (1 -dog
A !x,moci.sztcin és, vagy dsztatbrein tnemtyiségéaek megállapítására szolgáló, enzimes. Ciklusos ddds csőid;eníi az eddigi egyéb vizsgálatoknál tapasztalt nehézségeket, ahol a háttérvcgyületek és hátrérreakciók tiö-dik a zzujsz.luíei”. A hőáöaány szerinti Ytxsgádsbré egy dezu amw&savbói, pl. í. -s/errebös nagy reennyísv;?:
adható, hogy az h-szerinnek ph-yvártá és ttmmóntává törteik), tejes átalakulását biztosítsa. Előnyős megvaíós ftásí mód szenet 250 uM vagy magasabb szcriRkoncentráció alkalmazható, és ezt követően .pim-v áttá és ammóniává sí akti ható. Λ plazma jellemzően mintegy 100 öM szermt tartalmaz. Az endogén szem mennyisége a vizsgálat szempontjából lényegtelen. mivel a vizsgálat sz átalakulás sebességét méri, amelyet a honrocisztein raannyi5 sége határoz meg, és nem a szent) mennyisége. Az L-szerin mintegy fel mM és 10 mM közötti koncentrációban várhatóan nem befolyásolja a tóanításbart leírt vizsgálat érzékenységét vagy pontosságát
Λ találmány szerinti, enzimes, ciklusos reakcióban továbbá az L-szerin átalakulásának sebessége, at-neiy a homoeis-ztem koncentrációjától íllgg. látszólagos elsőrendű kinetikát követ. Normál esetben a vér piravátszhitje jellemzően mintegy 0.4 és 2,5 mg/IÖÖ ml (Lelmutger, Λ. L., Prrocipfa of Biochestústry, 707, iö Worthirtgton Publishers, Inc (iáké}, amely a leírás részé; képezi}, amely mintegy 45-284 μΜ-nak felei meg. Ilyen koueeatfáeiójú piruvát kis mértékű höttórnferést jelent, de a találmány szerinti vizsgálat .az időbeli változást méri, és könnyen az oldafbao lévő piraváf kiindulási szintjéhez állítható. A p'iruvát továbbá eltávolítható laktát-debidrogcnászai vagy más enzimekkel történő- előzetes inkubációval. Sokkal fontosabb, hogy például a vérben levő ősziéin és más, kéntartalmú vegyületek. sszigaiSkánsan nem Járulnak .hozzá az enzimes,, ciklusos reakcióhoz, és ezért nem szignifikáns zajnak szátniíanak a rendszerben..
A találmány egy másik lehetséges megvalósítási módja szerint a minta .oly módon kezelhető, hogy a ci'SZtalionmt eltávolítjuk, hogy a Immocisetein-mérés pontosságai növeljük. Konkrét. példaként a kezelés során az oldatot eisztattontn-y-ltázzal hozzuk kapcsolatba,, hogy a cisztatiónint «-.ketogíotaráttá alakítsuk (olyan vegyületté, amely nem vesz részt az előzőekben ismertetett, enzimes ciklusban), A homocísziein nreanyiségének megállapítására szolgáló, enzimes, ciklusos vizsgálat végrehajtása élőt; a císziationin-v-líáz aktivitást el kell távolítani a mintából, vagy -tőnkre kell tenni, pl. bővel vagy hasonló irtodon.
A tsiólmány ezen konkrét .megvalósítási módja a cisztatíouia mennyiségének megállapítására, olymódon is alkalmazható, hogy ősszel)asonihjhk a piruvát és/vagy az .ammónia termelődésének sebességében lévőkülönbségeket a ciszfatioKm-y-ilázzal az enzimes. ciklusos vizsgálatot megelőzően kezeit vagy nem 'kezelt -min25 iákban, A találmány szeríulá módszer tehát ismeretlen mintában lévő cisztádon in mennyiségének meghatározására alkalmazható, még ha a mióta tartalmaz is hontociszle.int
Egyes biológiai nrintákban, például vér, a homocísziein gyakran díszül ííd-kötésen keresztül fehérjékhez, tiolokhoz és más, sejtes k-otnponen-sekhez· kötődik. A minta jellemzően redtókáiószerref kezelhető, példánl nátrium- vagy káliant-bórtiidriddel, egy tiolkd. például ditioerhrítotlal, β-merkaptoeianoílal, dhfetrertoiíai, öh tiogökoísavval vagy glutatiorinaí, vagy egy tószltanaí vagy trialfcil-feszfínnal, például tributii-fosaimnál és irisz-í2d<arix)xiebihöszfífma! {TCEP) ős hasonlókkal, hogy felszabadítsuk a kötőit és dfszaihdosii kapcsolt homoclsztcmi. Olyan vizsgálatok előtt, amelyek ellenanyagot igényelnek a kimutatási lépésbe!), a reakciókeverék redoxkörühaényeít meg kell változtatni (az ellenanyagok (többségét tíiszuidd-kőtés tartja össze), A találmány szerűid eljárás: során azonban nem szükséges mosni, zagy a redox. körű Imán veket megváltoztatni, mivel .55 az · alkalmazott CBS és CBL redukáló körühsfenyek között Is aktív. Kevesebb lépés szükséges tehát a raláimásy szerinn vizsgálathoz, mint sok, a toehmka állása, szerűd eddig alkalmazott immunológiai vizsgálathoz, hay jellemző megvalósítási utód szerűd a vért. verifakciókat, szérumot, plazmát vagy vizeletet tar· kdmuzo mintát redukalószerrei kezeljük, ás közvetlenül vizsgáljak a homociszleím. A Vizsgálat előtt a minta meieg’íése előnyös, mivel felgyorsítja a: honmtasztem: lölszabaösilásat. es imfedvalja a lóboruő enzimeket és egyéb tényezőét amelyek befog úsoihagák a vizsgálatot H'omocísztein-vizsgálatokhoz a vérminták álialános kezelési módja szakember szá-múta jói ismert· más eíjárifeíokbóí, például HELC-vizsgálatból.
A CBS es a C'BL a természetben áítalánosa-n megtalálható enzimek. Emberben és élesztőben a CBS metionin szintezőiéhez keli. a CBS humán-eDNS-o helyettesiíheti a söréleszíőben lévő CBS-gént {Kruger és mtsal.. Hűm. Molee. Génét. 4. t 155-1 íőí 1 1995}] A CBL sok baktériumba» megtalálható, például £. co/íbms (I. a bér és mísai., FEBS Lett. 3??, 94-96 í1996}]. A CBS- és a. CBL-gések teljes DNS-szekveneiája ismert ezekben a szervezetekben és más íajokban,. atmdy molekuláris biológiában járatos szakember számára módot ad ezeknek a- géneknek vagy származékaiknak klónozására vagy szintetizálására.
A leírás 'szerinti érteíe-mben a szármázok kiiéjezést enzimek vonatkozásában olyan mutánsokra ért10 íük, amelyeket amirtosavatkifeióval, -deléírióvaí. -helyettesítéssel és/vagy módosításokkal állítottunk elő, továbbá a rekombtnám és.· vagy UNS-kovotősi shuKKtig módszerrel előállított mutánsokra, és sókra, szobátokra és az enzim más, kémiailag: módosított formáira, amelyek megtartják az izolált, natív enzim eozimaktivifását. A találmány szenntl, származékenzim -előállítására a-ikal-mas' DNS-keverési shufőiftg” eljárást; az US 5.605.793 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetik (amely a leírás részét képezi). Klónozás nőikéi is számos különbőzé· szervezetből tisztították a két enzimet. Lásd például, Oao és mísai.. Ycast, K3, 333 339 (1994); Bwivedi és rntsai., B-ioch&méstry 2k 3064-3959 {1962), amelyek a leírás részét képezik. A. találmány előnyös megvalósítási módja .szerint genetikailag módosított szervezeteket ál ittunk elő CBS vagy származéka és CBL vagy származéka előállítása céljából, amelyek az enzimes, ciklusos vizsgálatban alkalmazhatók, hogy kis költséggel reagenst biztosítsanak, és hogy megkönnyítsék az enzimek tisztítását.
Hasonló módon a származók kifejezést ntrkíeotiászekvenciák vonatkozásában olyan variánsokra és mutánsokra értjük, anrelyekot nuiríooririaddíCíóvid, -delécióval, -helyettesítéssel és/vagy módosítással, és/vagy kombinatorikus kémiával álKtotturík. elő. továbbá a rckotnbtaáas és/vagy DNS-keverési sbuftling módszerrel •előállított mutánsokra, és sókra, szobátokra és a. szekvencia más·, kémiailag módosított tormáira, amelyek megtartják a szekvencia kívánt aktivitását, például a .MetR kötési jellemzőket. Előnyösen, amikor módosított szár25 mazékszekvenciákat alkalmazunk, a szekvencia legalább mintegy 6ö%-fean azonos az eredeti szekvenciával.
Előnyösebben az azonosság legalább mintegy 7ő%, és előnyösebben legalább mintegy 85%. Előnyösebben dyen szekvenciák legalább mintegy 95%-os «zekvenclaasonosságot mutatnak az eredeti szekvetxdával,
A CBS-gént és őocc/mromyraíA· ctremíűse teljes geaomját szekveaálták, Hasonlóképpen a CBL-géa és £. «Az többi, génje is ismert. A molekuláris biológiában általánosan ismert technológiák alkalmazásával a
CBS-t cs a CBL-t kódoló-gének klónozhatok, és nnodkét szervezetben, espresszálhatók. A két enzim tisztítására közzétett eljárások ismertek, amelyekben hagyományos fohérietisztitási eljárásokat alkalmaznak. Mindkét enzim azonban fúziós fohérieként is ekkti&baló. amely például egy másik iéhérlc egy részét .tartalmazza, amelyrész segít az aktív enzim oldhatóvá tételében és/vagy íéígomboiyodásábsm vagy a tisztítás elősegítése érdekében hozzáadott ammosavszekvenciákat untalmaz. A tisztítás érdekében hozzáadott mninosavszekvenciák péidá35 ói az aftnútási címkék, például poK-Hís, vagy gluterioR-S-tr$nszferáz íGSTj adható, hogy a fehérjék még gyorsabb tisztítását tegye lehetővé egyetlen oíőttiíáss oszlopon. Kabar az eo/kneke· nem keli homogenitásig tisztítani a találmány szerinti diagnosztikus vizsgálathoz, proteázok és más. a szerint piruváttá nlakitó aktivitásokat a ósztitás során eíhanyagoihato .szintre kell csökkenteni.
Az. enzimek koaeerarhcmia általában az enzimaktivitás jobb stabilitását eredményezi a reakció alatt •b'· ,;s ivisszé távú tárolás sotan, ,A A. ζ;ο;ζο·;.γκίοη es A. eo/á) k ivid eyycb szervezetek hol, íöteg terrttefo tökből szta« 4>
λ·Λ >» *«<·» *<.
« * * * ΐ ί , tor' * * ** »« utazó CBS és. CBL várhatóan rnég stablkibd enzimek. forrását lehetnek. Az izolált enzimek .s-zéíektálhatók a bomöefezfefe irártyáte magasabb affinitást mutatókra. Továbbá, az éíesztö-CBS és a bakteriális CBL. fehérjetechnológiai- úton íörferfe ejöáihtá&ávai jobb kereskedelmi falajdonságú, példáid magasabb affinitása. gyombb re-akciósebességil könnyebben tixztóhaíó és támlás során hosszabb féléletidejű enzimek nyerhetők,
Hasonló módon a eiszafooforí-v-liázi (CGL) sok. fajban részletesen leírták [lásd példáid Yamagata és mísai., j. Bacteriol. 175. 480l)-9Sífe (1993). amely a leírás részét képezi). A CGL-r kódoló .gének manipulációja genetikailag tovább -folytatható, és szokásos, rekombináns eljárásokkal módosíthatók, és gazdasejtbe építhetők, hogy magasabb szinten íermelö törzseket állítsunk elő.
A CBS-, CSL- és CG'L-gének retombmáas e-xpresszíőja jellemző. Ezekkel az eljárásokkal nagy ló mennyiségű, tisztított enzim áiliíiuííö elő, és a gének módosíthatók. például egy meghatározott, -affinitási íiszíiíáshnz használható peptidszckvencia feffishiási címke) adható az expresszáií enzimekhez. Λ rekombináns enzimek cxpresszíőjáná} az ai'óniíási címke afkaimazása nagy mértékben egyszerűsíti az enzimek tisztítását és ím(nobUizáiásá·, amely csökkenti a költségeket. Affinitás! címkék a -teebni-ka állása szerint jól ismertek, például, de nem kizárólag, pohhiszddin, GST (gfolatíon-S-tmuszfeíáz). sírep-cimke, ’Tlag”. c-.myc-szekvenciák, és hasoa15 lók.. A címkéket rekombináns módon expresszáit fehérjék affinitási tisztításához széles körben alkalmazzák, és közülük sok kereskedelmi .forgalmában kapható.
Egy előnyős megvalósítási- mód szerint-a CBS-t és a C.BL-! szilárd telüleíen ImmobiíizSljuk oly módon, hogy az enzimek aktivitása megmaradjon., és· oly módon, hogy a homoeísztóin szabadon maradjon, hogy közvetlenül a fehérjékkel kapcsolatba lépjen, Az enzimek nagy sűrűségben történő immobilizáiásával a különül) hözö fehérjék közötti diffúziós távolságok csökkennek az oldalban lévő enzimekhez képest. Ennek eredményeképpen a vizsgálat leijei; reakciósebessége nagymértékben nő. mivel az: egyik enzim terméke a másik enzimmel reagálhat, és.'fordítva. A reakciósebességek fel gyorsulása az: intermedierek koncentrációja helyi növekedésének köszönhető, amelyek szoros közelségben állnak a következő enzimmel az immobilizáció- eredményeképpen. A homociszteia-vizs-gálat seöességétwk növelése fontos tényező a diagnosztikus termék piacképessegében, mivei: a 'CBS és a CBL K...-értéke, mlllímól nagyságrendben v-an, míg a bomocisztein- vérben lévő koncentrációja .mintegy ii) μ ki. A diffifetó által korlátozott reakciókról: ismert, hogy az enzim magas koncentrációját igénylik a .gyors reakciósebességhez. A ciklusos vizsgálatban részt vevő enzimek immobilizáiása légy Őzheti azokat a nehézségeket is, amelyeket a két enzimnek a szubsztrátjaik irányába matatott gyenge affinitása felem.
.30 Egy további előnyős megvalösitási «sód szerint a CBS-l és a €31.-1 fúziós- fehérjeként smmobiiizá'ljuk. Λ kél különböző fehérjéitek egymáshoz viszonyított távolsága és orientációja ellenőrizhető a lőziós gén expressziós vektorának kialakításakor. A fúziós fehérjében a két aktivitás megfelelő elhelyezésével a hoosocisztein, ci-sztatfon-io egymásba alakulása rendkívül gyorsan végbemegy, gyako-rlaiifag a fehérjén belül, mivel a diffúziós távolságok a két aktív közéit minimalizálhatók. A ix-mocisztein tehát koíáktórkéot viselkedik a íei s mes. ciklusos; reakcióban, amely 1.-szériából piravát-ot és ammóniát áfh't elő.
Λ találmány szerinti, enzimest, ciklusos vizsgálat számos vizsgálati formában végezhető. A vizsgálat fegegyszerúbb ttó-mában egy reagens-oíkist, arndy L-szeriot. CBS-: vagy származékát, CBL-t vagy származékát, és az enzimreakciók optimalizálásához szükséges: .különböző- poi'ferekct és segédanyagokat larraimazza, A találmány előnyős megvalósítás:! otóifet szarrsi: a CBS-t vagy szdrinazélöü: és a €ΒΙ..··ι: vaay származékát szilárd tó ietofeícn loooetoőzaííuk.
»* * » » V ·*
Az enzimeknek szilárd felületeit történő immobiíizáiása az enzim aktivitásánál, fenyegcben teljes· megtartása melleit a tcchuik:·-állásaszerint j-öl ismer?.. Az immob-ihzálásra -számos eljárás alkalmazható. például kovaiensköíés. fizikai ísbszerpció. esapdázásás f’eatrapnaenf} és elektrokémiai elhelyezés. Például glutáratóehtóet al'kateazzák kreatímn-deammámtk és glutamát-osidázaak propriarntn-szórmazékos, ellenőrzött pórusos üveggyöngyre- történő immobliizalásápi {Ruí és mtsai.. Aon. NY Acad.. Sói. 672, 264-271 (1992/. További példák például, de nem kizárólag, fcatbodrirttídek alkalmazása enzimeknek .szukeinát-származékos üveggyöngyökhöz történő kovalens kapcsolására I Rul és mtsai,, lásd fent}, és hetero- vagy homobs&mkcionálís, keresztkötet kialakító reagenseknek [pl, SPDP, N-szukcfntmixlíl“3-(2epi-ridilditio}propionáí. SMPT, szukeisimídd-oxikarhonil-a-ínetif-u -(2-pjriaíld(tio)-tciÍuéí?, I3SP, dtítobisz-lszukcinimidilproptonát). OT'SSP.,
3,3’-ditioblsz-{sz-ulfoszukcimmiddpr-optönát}, DSS, díszukciuimidil-vzoberát és hasonlóki az enzimnek kovalen* sen például egy amin· vagy szxdlhidril-esoporto.R keresztül a származékot képezett, szilárd foiuiethcz: történő kapcsolására való alkalmazása (Alison és msei.. Stosens·. öioelectro. H, 395-S ÍO (1996)1.
A leírás szerinti értelemben a szilárd fehifet: porózus vagy nem porózus, vízben oldhatatlan anyag, amelynek .formája számos· alak bármelyike lehet, például esik, pálca·, részecske, például gyöngy vagy hasonló.
Alkalmas anyagok .a technika állása .szerint jól ismertek, például papír, szűrőpapír, nejlon, üveg, kerámia, kovatotó, timföld, diaíomíöld, -ceifalóz, pchraetakriláí, polipropilén, poiisztiréo, polietilén, pobvnni-kioriö, és ezek szártnasskai, A szilárd (élőiét lehet a vizsgálati -edény oldala vagy alja, vagy lehet a vizsgálati edényhez adott anyag. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a szilárd felölő·: gyöngy, amelyet a vizsgálati edényhez adunk.
Mind élesztőben, mind baktériumban vannak. enzimek, amelyek L-szerínt pintváttá alakítják, olyan aktivitások, amelyeket szerm-de&nwíáznak. vagy szerin-dehidra-táznak neveznek. Alaposan kidolgozott, mutsgén eljárások alkalmazhatók özén aktivitások nagymértékű csökkentésére vagy megszüntetésére, amelyek a hotnocisztedn ciklusos vizsgálatban .szignifikánsan hozzájáíufettótak a háttérhez. Saccharotnyces eerevisiae előnyösen genetikailag ügy aIttkiíható egyszerű, úgy nevezett génroaesolási eljárással, hogy megszüntethető a .szerin-deamlnáz-akrivnás. aroely ( I) az izo-leucm szintéziséhez szükséges, és (2) a szerinen, mint szén- vagy aítrogénfortáson történő növekedéshez szükséges, Élesztőben 3 chai-gén kivágásával a szerin-deaminázakriviíás túlnyomó része eltávolítható, így a ciklusos vizsgálat egy lehetséges háltérprobiémája megszőni-ethető, A chaT-deléeió továbbá a CBS-CBLIuriösíehéíjék szelektálására is alkalmazható és ezeknek a fúziós fohéqékaek a génmérnöki úton történő -alakítására. A eha 1-deléeios -törzs nem képes · szerinen, mint egyedüli szén- vagy nitrogénforráson növekedtu. A CBSA'áBL-faáősgén komplementálni tudja a deíéciót, amennyiben homocíszteia “kofaktorként rendelkezésre áll, π·ο,,.·( a ciklusos rendszer ugyanazt.a nett·:? eredményt hozza létre, mm· a sze.rín-deamináz.. A ebal-d&lécíö tehát kedvezőbb CBS-CBL-fúziók kiválasztására és fenntartására alkalmazható, előnyösen ha fúziós gének populációja matúltatva vau és egyetlen kópíaszámú vektorba vagy az élesztő kromoszómájába vau cpilve. Azok a sedek, amelyek szerin iartuliuú tápközegen gyorsabban nőnek, vagy kisebb· a homoeixztein·szükségletük. vaiószinüleg olyan mutációkat tartalmaznak, amelyek -gyorsabb enzimeket vagy
Sioi-Ksoísztcin és císzistioma irányába magasabb aIrh;itust mutató fehérjéket kódolnak.
Λ találmány tárgyát képezi, egy másik fehérségei; eljárásként mintában levő homoclszteín mermviségének íuegállapitásártú íucísbofttköto transzkripciós Piktor afkalíuszásu. Amikor egy nmíaboíiikótő transzkripciós faktor -a metábofejához kötődik, a ósktofkompícz specifikus receptor-poknekleoíidzzckversciáhez kötődik. Ά íranszkrlpclős Sdktorlvomplöz kötődése n receptorának ke<eizefízm.$zekvcnelá:ához óvómén kövcibetö, és a tó mintában lévő meínbolit mensty(vegével Rápesolsa&t ituzhatd.
» *
A technika áliásn «ácséit számos olyan transzkripciós -faktor ismeri, amely specifikus DNSkötöhéíyekhez kötődik kis s-vofekufávííi vagy tnetafeodííall történő kapcsolódás esetén. Például, .£. oo/tban -van olyan opewn-reguláció* elem, a MefR transzkripciós' fekte?, amely a Met-operont szabályozza Itotnociszfesn kötődése eseten (Cai és mtsai, Biochem. Bióphys, Rés Commtm. S63, 79-83 (1989)]. A Me-R vagy származékai géneket szabályoznák, például Met£-t (kokdamm-föggetfén metioain-szintáz), MetH-t (ftobolamin-főggő mettociu-sziatáz) és GivA-t .(szerin-hídrogenáz). A MefR és származékai elsősorban a konszenzas-ÍJNSszekvenelgrikhoz kötődnek .hömocisziem jelen létében, és hiányába?: szabadon fordulnak elő a sejt citópiazmá·· iában,. A MeíR homoc-iszt-eín jelenlétében történő- kötődése felhasználható homocisztelnt íeffétefezhetö-ieg tarraim&zö mintában lévő hoooeisztein mennyiségének megállapítására.
Λ taiábnány egy előnyős tnegvalósitási módja szerint a vizsgálatban MeíR szántára roceptorpoiinukleotid konszenzasszekvenctáplt kóiioió pohnukíeond-s-zekvencfát immobihzálunk szilárd lólülcten oly •ttodon., hogy lehetővé. tegye a kötozerrtus-racepforszokvencfe hozzáférését MetR-hez történő kötődéshez. Λ nukleotidszekvencía például a következő lehet::
GTr.AATCéfTöAAC.,fekATCTC,AT6TlG<X}TG (11. azonosítószámú szekvencia)
A mintát, például pfeznra. vér vagy vizelő··, kezeljük, hogy minden, fehérjéhez kötött boatocíszteint felszabadítsunk a mintának a reagenso-ldattal történő összekeverése előtt, amely reagensoldat MetR-t tartalmaz pufferoió anyagban, inwöbifezált konszenzus-receptorszekveoeia jelenlétében, komplexképzésre· alkalmas körölmények között, Inkubációs :ióőí: kővetően a. szilárd hordozót mossak, hogy eiíávolllsxik a nem kötött reagenseket, és a szilárd hordozón kötve maradt MetR mennyiségét értékeljük. A szilárd felületen kötve maradt MetR mennyiségének meghatározása jellemzőn bUSA-vtó történhet, felületi plaznion rezonanciával, azaz BíACORB-val vagy egyszerűen hagyományos lekérje vizsgálatiul, és ez a mennyiség kapcsolatban töt a mintában lévő homocis'Zíein mennyiségével.
A minta kezelése a bom-ocisztoin felszabadítása érdekében redukáfószerrel végezhető. Mint az előzőekben ismertettük, számos anyag ismert a technika állása szerint,. Jellemzően a mintát elegendő mennyiségűi rednká-iószert tartalmazó puf&roldartal keverjük, hogy· lényegében valamennyi homocísz-eint felszabadítsuk •minden, a iróniában lévő kapcsolt fehérjéből. Általánosan alkalmazott- redukálószerek például, de nem kizárólag nátrium- és káliMi-hórkídríd, a i)-toerkaptoetanol, a dhiotreitol, a. átiioeritritoí, a tioglíkolsav vagy a giusatíon, vagy fesztit· vagy •hfelkrl-foszi'in, például a tributil-foszfia és a íriszé2-karboxietilifoszfit: (TCEP) és hasonlók.
A MetR-féhérjo is t-tó-fesúhíiíö oly módon, begy egy kimutatható- jelei: építünk bele, például krómokat, ílaor-ofórt és hasonlókat,. hogy a vizsga Sat sebességét és -érzékenységét Javítsuk. Λ kisntttaife-afó jel hozzáadása csökkentheti a vizsgálat lefutásához szükséges Idői, mivel egyes mintatezeiési lépések feleslegessé -íái-mk, például további mosási lépések. A komzenzuskötö szekvenciába olyan ftuotolőr beépítése, amely oiigwu-kfeeís-fek idüií elnyelt hoílánshosszáségá feoyí emittál, fluoreszcens energiatranszter mérését teszi lehetővé.. ««-οilye! a fehérjének íí konszenznsszekvcnciához történő kötődése mérhető. A fluoreszcens transzfer mérésére aikafsnas eljárások példáid ti duoteszcens rezonancia energia-ranszfer (FRFQ vagy közelségi szci-feifáeiós vizsgált!?. Λ MetR-kötb konszenzusszekveneia további módosításai a kötő dofnőnen belül egy további, kImutatható fel btízzáadzsáfesl szintén -«vbbfejísk a vlzsgóítií seve; irtását.
továbbá, egy ínegbatározotí. pepndszekvenem feiftóiiási címkét adható a MetR-.febéqcitez, hogy seylfec ti tisztítást és u kimnt-ifest. Az uiií-h-ásl efefeék a -eufesikí! álbisa szerint ismertek. és Ily<;?-vk pfefeiui, de tfeós fezfe-fesg ζ poiü-isz-idin, a sífep-feií-kí:, ;· feifeb ti c-iróc-székveáclák és basoníók. Címkék szék:;; körben alkahsazhatók rekombináíusa» expresszslt fehérjék affinitást tisztítására, es közülük sok kereskedelmi forgalmában kapható- Λ rekoitíbiaáns utódon expresszált MetR kötési affinitásának javítására mutációs változtatások is alkalmazhatók, amelyek további vizsgálati reagenseket· szolgáltathatnák.
A találmány egy külön ntegvalóslíási íiibála szermi .a-mintában lévő homocisztem mennyisége a min5 iában lévő homoeiszteín enzimes felhasználásával is meghatározható. Λ hömocísztein sejtes anyagesereutakon keresztül történő átalakulása jellemzően protont szabadit fel a homoeiszteín szullhidril-csoportjából. A proton felszabadulása alkalmazható a homoelsztsin £. eo/i kobolarsin-iöggo metítmm-szmiázához történő kötési affinitása mérésére. [Jenet és mtsai., Slochetnfctry, tété IS7AM574& (1997)1. A fehérjék,.például metlonisi-szmtáz által katalizált enzimreakciók általába® koiákíorokat vagy további szubsztrátokat: igényelnek a reakció- végbevíiö teléhez. Ha ezek a knfaktóroík és sznbsztrátok nincsenek .jelen, a homociszteia az enzimhez kötve marad. A találmány szerinti eljárásban a iélszabadaít profon átérése eltávolítja -.az enzimreakció által felszabadított protont, így a mintában lévő hmnocísztein fsíhasznáitlsa irányába hajtja a reakciót A ídszsbniih: protonokkal kapcsolatos pH-vákozás mérése a mintában lévő honmc-iszteln mennyiségének meghatározását teszi lehetővé. Egy előnyös megvalósítási akid szerint például koboiamindnggetlen atetionia-sziniáz alkalmazható a vizsgáíatI 5 bán.
A könnyebb kezelhetőség érdekében a -találtsány szerinti alkalmazásra szolgáló reagensek vizsgálati •reagenskészíet formájában- lehetnék a vizsgálad eljárásba?} törtétté alkalmazásra:. Jellemző reagenskcszlet csomagolt összeállításban tartalmazza az edényt a vizsgálati oldat, az L-szerin. a CBS vagy származéka, és a CBI.. vagy származéka és a segéíipuftérsk és az optimális reaketőkótülményekhez szükséges anyagok rartásám. Fortéd fos. hogy sokféle konzerváló és/vagy stabilizáló anyagot is tartalmazhat bámtelytköttindegyik reagens a reagenskészletben és/vagy enzimeket, hogy meghosszabbítsák. a eíísíthatósági, valamint, a vizsgálat alatti aktív ideijét. A reagettskészlet- tartalmazhat továbbá redukálószereket vagy CGL-t a mimának a ciklusos vizsgálat elölt törtésté kezeléséhez. .A reagemkészlet tartalmazhat továbbá faktát-dehídrogená-zt. NADH-t és oxidáció esetén észlelhető színváltozásra képes festéket.
Megfelelő körülmények között. a reagenskészfetbea lévő -egy vagy több reagens oldat formájában lehet (konzerváló és/vagy stabilizáló .anyagokkal .együk vagy nélkülük), vagy száraz por formájában lehet, általában rioííiszáli formáiban, kötőanyagokkal. konzerváló és/vagy stabilizáló anyagokkal, amelyek feloldás után a találmány szerinti vizsgálat végrehajtására megfelelő koncenintciójá reagensoldatot eredményeznek. A találmány sokoldalú Teiha«znátetóságá«ak növelése érdekében a reagensek csomagolt összeáll kasban is· biztosítha?G tök, ugyanabban vagy küllő» edétryakbes oly módén, hogy a. reagensek aránya az eljárás és -a vizsgálat lényegében optimális végre hajtását b iztosítsa. A. reagensek kölsirs edényekben lehetnek, vagy különböző reagensek cgyesúbetők egy vagy töph edényben a reagensek stabilitásától foggöen. .A könnyebb kezelhetőség érdekében a találmány szerinti vizsgálati eljárásötm tétéőmazötí reagenseket elére meghatározott menoyí-tégben szereljük ki. Λ vizsgálati reagersskészlef: tartalmazhat továbbá Írott utasításokat a .reagensek kezelésére vso-aey egy bizonyos·
ÖS vizsgálat végre!:Eiítésárl·!, példáid a csomagolásban téve meiíéktéí fonnájábatt.
Λ kővetkező példák a szetnléhetést szolgálják, és aeta korlátozzak a találmány t, i. példa
z....yráőffiá<bs;sygp:,;tégz.stéu;xek.ktéí:.sr;p.M;se5ptesszy;y!
Ebben a példában bagyoínáityos l-T'R-istédszeteket alkalmaztunk fé <'3!..-génié:;ek klónozására.
-is? Az. jzolait· yent s;zp«-ssziös wktorba építettük atrirmási eímfeeszekvennávai télálSh es az vxpresszáít téhéríé?
Φ W
X φ Φ aíYtóitási oszlopon íiszluottuk. Az -expressziós vektorkészítnsénn-yel transzformált gazdasejtekben ovo, teks-ntélyes mennyiségű CBL-enzimaktivhást dsztóosítik a seplizátumokbol.
Az £AE-íAö írTGH F/öEÍETT PCR-rendszstmcl (Roche Bioehemicaís) hagyományos PCR-módszert alkalmaztunk £. <o(i CBE-gédjének amphfikáiúsára genomi DNS forrásaként GAIC 57/<?Γ Z'ÖR/# kompetens £. «.'<>// sejteket tlnvíttögeit) hasztsaltónk. a CBL. kilórmzásához a lánc indító PCR-szekveneiák a következők voltak: (CBL N-lerm-máiís lóndndiio; .f~€öA£GOAT€;CCATCG£O0ÁCAÁAAÁö€TTö~3’, 1. azonosítószámú szekvencia) és (C81. C-?etminá!i8· íáncittdíto: f-CGCAGCAGdOTTATACAA TTCGCGCAAA-ak 2., azonosítószámú szekvencia). A PCR-rol awliflkáíí CBL-géwetméket: agaróz-gélelektrofoté-zíssel tisztítottuk.
i 0 és /A i/Π restrikciós endonukleázokkal emésztettük, és· agaröz^gélelekfroforézissel újra liszfitoítrik. A tiszctotf: £'. coíí CBL-gént ezníáö a gélen megtisztított. t'kv7fHl;/-\'ííH-ve.í emésztett pRSETSjelö fehérjeexpresszíós vektorba (Invittogen) ligáitok, A képződő konstrukcióban a CBL-géa a 17 transzkripciós promőtor ellenőrzése altót áll, és az amínotenninális hat hiszttdín (óHISi vezeiöszokvenesávai keretben van {a továbbiakban óHÍSCBL-nek nevezzük), amely £. tav/i sejtekből a rekotnőtnáns 6B19CB, «. ro ie egyszerű expresszióját. afttóitód tisztítását és immunológiai festési vizsgálatát teszi lehetővé. Az £. eoii oísztationín-jB-liáz (CBL) DNS-szekvenciáját bemottójuk (21. azonosítószámú szekvencia). A klónozott & eo-A cisztationín-p-liáz· (CBL) pmíe-ínszekvenciáját, amelyben •amixtoHNHO-termlnális öh-isztidin (ól-f is) affinitást címke található, és -a CBL-gémrek pRSETB bakteriális expresszíós pllazmldba történő klónozásából .származik, szántén bemutatjuk (19. -azonositós-zámá szekvencia).
A pRSETB(6HlSCBl.) plazmídkonsúmkctőt BL2l(DE3)pLysS £ ct/fi törzsbe (ínvítrogen) transzformáltok, 100 pg/ihi asnpieühnt, 35 pgfmt kloramfeaíkolt tartalmazó tB/agaríeinezekre terítettük, majd egy éjszakán keresztül 3? 'C~on inkuháltak. Egyedi baktéri-umtelepeke-t 100 ml, ampicillint és kloramfenikolt tartalmazó LB-tápkozeget tartalmazó lombikokba vittünk ág és «raporítotnmk egy éjszakán keresztül. A 100 ml-es, egy éjszakán keresztül szapórodotl tenyészetet több. 1 lltej'. friss, ampicillint tartalma»} LB-lápközeget tartalmazó lombikhoz adtak, és 9,6 Af,so -érték eléréséig hagytak szaporodni a sejteket (mintegy 2,5 óra). A CBLfohéd-eexpressztö indukálása. érdekében- ('amelyet a T?-p-romőter irányú) ízoproptl-p-D-tíogalaktopiranoztdot GPTG; adtunk a tenyésztő- tápközeghez 0,1-1- toM végkoncmtractőhan. -A CBL-enzim kofaktorát, a piridoxál5!-foszfátot (ELE; is hozzáadtak 190 p-M végkoncentráoíóban a tenyésztő sápközegbez az Inkubáció során. A sej-szaporodás és a éHlSCBL-fohétjeexprcsszió 5 órás nyomon követése után az £ w/i sejteket centet lugálássai összegyűjtöttük, újra szoszpendáltek, és £UG£L£i££ tehétjeextrakciós reagens-(Nova-gen íné.) hozzáadásával hzáhuk EDTA-mentes. teljes proteázinhibitor jelenlétébenA'Roche Bioehemtcais) a gyártó útmutatása szerint·. A se; iiizátumot szólító DNasel-gye! kezeltük, centrifugáiéba! íisztüotínk és A?ró-«A fohérjettsztítási gyantát í Roehe ötóehemsetós) fartabnazó affeitási oszlopra icítótóik. Az oszlopot azután lő égyíérfbga-oy· ekvilibrálő pufferreí mostuk (59 mM KPi, pH '7.9, 9,5 M NaC'l), amelyet 5 ágytérfogatnyi I -es elácíős pufferre-s történő dótóé követett í59 mM Kló. pH 7,9, 9,5 M NaCI., ;9 :A n-ridazoL EBI}, majd 5 tórtógaú-yi 2-es elúciös puflErrei (59 -nM KR-i, all 7,9, 0,5 M hktCi. 59 uiM mridazo!.. LB2). és vágd 5 íérfogamyi 3-as dúciós ptóíérrol történt az eiáciő (59 nrM KP;. pl í 7,9, 9,5 M .Nat.lL 599 tnM utndazol, EB3}. A tiszltó-ss folyamai minden egyes idrosítóer! vr-í romiakat óziíaísizató íéíiéna-géóifekíri'ílbrézissd íSOS-BAGE) rozuyatóA. és roigy Ciromassi·.· « φ
Srilliant Blue-vsl festettük, vagy Western-őlot vizsgálatot végeztünk mortokkmálss., polthtsztídin elleni, peroxldázzal kóajugált egér-lmaimxgleöu fonal történő kímutatássai agyár-tó ütnsutaíása szerint CSigma).
ügy tapasztaltok, hogy a tisztított .őHISCSL-febétje elsősorban a 2-es és 3-as elúcrós pu-líerben (EB2 és .EB3) eítiálódik. A CBL-r tartalmazó eluátemot centrifugális szürőkamrában (Anncotri koncentráltuk, és egy éjszakán keresztül dializáíJuk 4cC-on a tárolási pufierrei szeszben (50 sül TrAHCí, pH 8, iöü mM NsCl. 5 mM OL.Í·’), kis térfogatokra osztottuk, és -WcC-on -fagyasztva tároltak. A tisztítót· homogén CBt-enzim koscentsációját 230 nrn-néí az extiítkciós keefScterts és a 43.312 Da alegységsúiy alapján számoltuk [Clamsen és mtsai., Bfochsm. 36, 12633-42 (1007);. A tisztított 6H1SCBL hozatna jellemzően 20-30 mg ötUSCSL. per 1 gramm /s. <.·<>» i sejtpaszts.
Λ .i>:R.SET8(6H.tsC8I.}-piaznsklkonstntkcióval expresszálí, rekombináns, affinitással tisztított óHi-sÜBL-íehérje CB-L-akttvitási vizsgálatát lényegében a korábban ismertetettek szerint végeztük (Clausen és mtsai.. öiochem. 36, 12633-42 (1097). amely a leírás részét, képezi'!. Rövidem s reakciókeverékek 100 tnM Tris/HCi-t f pH 8,5), 5 nxk-í L-císztatroaint, 1 ntM 5,5*-<h:tksbisz(2-niá<^enzoesas'at><'.DTNB, Elbnan-reagsns) és óKísCBl-eazimet tartalmaztak 1 ml végié ( fogatban, A reakciót a 412 nm-nél mért abszorbancíában történő növekedéssel követtük -nyomon az idő -során. Ugyanezen -enzimreakciót végeztük ei a szubsztrát ismert koncentrációit tartalmazó mmíáfcon, hogy stanáardgőrbet készítsünk. lényegében az összes, a telje-s- sejtlizátrnnban kimutatott· ÜBL-akúvhást visszanyertük,. és a pRS£T8{6.HísCBl.}-p.í&zmidkonstruke3óval előállítóit, rekomblnáss őHisCSt-enzim kísérletesen tisztítóit míntáibaa ís megtaláltuk.
í^^éMa
Ebben a póklábán PCR-eijárásókaí .alkalmaztunk élesztőből C8S-gén klónozására. A CBS-gént tartalmazó RCR-iragmen-st exptessziós vektorba építettük aifizifosi címkével vagy at-éikúl, amelyet azért adtunk hozzá, hogy segítse az e.xpresszált góntermék tisztítását.
A CBS-göo forrásaként áwe<Áíí'<>fí;t-'<o.s rermcíM’ [5153-1 t-Hhísd iueí:2)t laberotórsurrtí törzset alkalmaztuk. A sejteket yEREbtápt-ahtjon szaporítottuk 32%'-on, majd centrifugáltuk, vízzel mostuk, és 200 pl élesztő piaztnid ptdlérbe vittük át G60 m.M NaCk, 10 eM Tris (pH fo, I tn.M ED; A, 0.2% SDS], A sejiszuszpenziőt azonos térfogatú 6,45· mm-es üveggyönggyel vegyítettük, és nagy sebességgel kevertük 3 x 30 másodpercen keresztül. A folyadékot pipettával leszívtuk, és két percen keresztül miktOcentrifugaesőhen eerstri30 ingáitok, hogy a scjítőrmefokcl eltávolitsuk, A feSüSüszöt PCi-vei (fettimkiorofetm; izoamiiaikobol, 25:24:;) és kloroformmal extrabáltuk. Nátrium-kforidot adtunk hozzá (5 Aí) (kb. 30 ah,, és a DNS-t azonos térfogatú izopropanollíií csaptuk ki.
Λ genotni éieszio-DAS-t PCE-rd amplitíkaltuk CÍ-OŰl iCGGCiGAfC-CTGA'ÍXXöVÍDCATOá'FAAGCíA. 3. azonoxítősz.ámó. szekvencia) és C1-012 kfocfoödókkai ;CG<;CAn.ACCG7TTCACTAA ΓΠ.Λ'ΠΪ;,. 4. .tzonusltószátnű szekvencia), amelyek közzétett nuklee-fidszekvenciák és az éíesztö-CBS sirukí ürgéméi szegélyezik Λ 03001 íáneinditó 63. azonosítószámú szekvenciái tarft-ítnaz egy zú«»HI-belyei a EBS-gét; nem transzíatált T-vegen. A P'CR-fragmeas 5:-végcbez. ZíiWíHlrszekveneia hozzáadása érdekében a gént PCR-rcl tovább titRpiihkdtíok ChOOl <3. azonosítószámú ::,s;kvencis; és 0-602 láocuxd'itökkal tGTTGGATCGGt ív Ad ÍAGCG Γ'Π'νΛν. 5, nxortositószarnú szekveo40 ina), A képződő RCR-termék DNS-sxekvcoctája mintegy 1937 bázispár, ;;it;eíy a 6 13 S-teher jót kódoló 1521 «φ * ♦ * V ♦ » * * Λ Φ « V Φ «
Φφ * * Φ * φ < Φ ♦*» bázispárt tartalmazza. Λ kódoló szekvenciát. szegélyező to-váhbí DNS ;tz élesztő CBS-genjének természetes promötere és transzkripciós te rmi náciős .szekvenciája.
A -CBS-géníöl a’-irányba egy erősebb prométen építettünk be, hogy a íehétjeexpressztó magasabb szintjét elősegítse. Az élesztő- TPlLpromó-tert ugyanabból a -genotni élesztő-DNS-bői klóíioztok a CÍ-öOA (GGTGGA'fCCA'K’Á.ATAGATACG 'FACGTCCT, 6. azonosItószámú szekvencia) és a CÍ-öiO iánciadítok (TTTTAö T'FTATGTATGTGTTTTTTG, ?. azonosítószámú szekvencia) alkalmazásával hagyományos PCRreakcióbao. A CBS kódoló szakaszának a IBII -proroótcrhez kapcsolásához aáapter-kmemditét alkalmaztunk, Ci-01 i (AA.ÜACATACATAAÁCTAAAAATOACT AÁATCTGACCAöüAA, 5. azonosítószámú szekvencia), amely a TPH-promóíerből 2ő bázist és a CBS-génbői az első 21 bázist tartalmazza. Az előzőek szerint lő nyert CBS-szekvenciát PCR-rel. srepiiiíkáituk a CI-öOI (2. -azonosítószámú .szekvencia) és a Ci-011 (S. azonosítószámú szekvencia) jelű lánoindltekkal. Λ képződő K'R-terméket az előzőek szériái) ΊΨ11-promé-iettermékkel kevertük, és a keveréket RCR-rül amplifikáhuka Cí-öOl (3. azonosítószámú szekvencia) és a Ci-0ö9 (b. azonosítószámú szekvencia) jelű tánc indítókkal, a;aeílye! egy TPICBS jelű fúziós gént kaptunk, amely a
T?i 1 'promóíert, a CBS kódoló -szekvenciáját és a CBS hánszkripciós termi-nátort tartalmazza.
Λ CBS- és a TRlCöS PCR-teroíékek mindegyike- üc<»dil-heÍyct tartalmaz a kódoló .szakasznak mind a2 5!-, mind a 3’-végén. A PCR-termékeket PCT? líTZ-LW ő'AíiP (Promega) reagenskészlettel tisztítottuk a gyártó útmutatásai alapján,. és üosdií-gye! hasifottuk, A képződő nnkleotl-áfragmenseket !%-«>«· agarózTB£~gélen íntia-ttuk, és NA45-papfocál (SASj risztitottuk. Az élesztő, co/t sbuttlc vetet Cl-í-ne.k van egy egyedi Tfoml-ll-heíye a CBS-gén expressziőjáhox. használt tetraeiklinrozíszísncia-génhea. A C-l-l-vektort
SreaHi-gyel hasítottuk, és rák alkaíikus· roszfatázával kezeltük a gyártó útmutatásai alapján: (Rocké Biochemicais). A CBS és a TRICBS .tfomí-H-fragmenseket a iiaearizált Ci-i-vektorba ligáitok. A ligákén reakciót TCP 10-sejtekbe (invt-öogen.) transz tormái tok, amelyeket: ampicillin tartalmú LB-iemezekre terítettünk.. Az amp-rezisztens transzformánsokat i.B-.amp és LB-teí: lemezekre terítettek, hogy meghatározzuk a teíraei-klmszen-zitiv kiónokat. Az LB-amp lemezeken egy éjszakán keresztel szaporodott. L:B-amp lemezekről számos let25 szenzitiv telepet választottnak ki, és használtuk léi alkshkus lizis módszerhez a piazmid-DNS kinyerésére, A DNS-t BnmHí-gyel hasítottuk, 1'% agatózgéien elválasztottuk, hogy meghatározzuk' melyik plnzmid tartalmaz CBS- vagy TPICBS-inszertet.
Az ihszerteket hordozó C1 -1 -piazmídokat az INVSe-i élesztötőrzsbe transzformáltuk, amely az invítrogentoí beszerezhető, dipioid törzs. Az iNVSc.-1-ben a kBOd- gé» mindkét kópiájában van egy mutáció·, és íeuci-amentes tápküzegea történő szelektív szaporodásához a C1 -1 -plazmidon lévő L£,ti2-génre van szükség·. Az iNVSe-1-et Cl-l-gye-í rokon ptazrnídokkal transzformáltuk az iri-viteogeatöl származó élesztő transzformációs reagenskészleítel ( Yeast Traasformahoo Kif} a gyártó útmutatásai szerint. Λ reagenskésziet az élesztőseitekből Zymoiyase segítségével történő szforopiassztképzést és a DNS-transzformációhoz a kak'iumos kezelést íogkílja magában. A transzformán sokat I M sxorbifóp élesztö-nltrogénbázist és élesztőhöz szükséges Crererrere anyagokat tartalmazó. de leucin nélküli szintetikus tápközegre terítettek. A iranszforntánsok a teiültetegzteí agatban három napos, 32'ü-on történő Inkiibáelót követően váltak láthatóvá,
ÖJJGíÓmí?. Á teAteteATŐ ·Λ(2ρ.;..Λ^;Ζρ<^;/ρ;Τλ:0;χ;0;ς^;Τ<:-;Α·ν.·;.;;;.^ν;:0ό:ς
Hiít iuszíídlni kódoló DNS-szekvenciát kapcsohunk a CBS-t koáolö sxakasz 3'-végó;rez reted a CBS-, reted a j .(•‘iCBS'V-okíorkönstrukeiéíkbsí?, A pobiréreteiirii so-iok) ../-kv,rere;d<.·) az eredeti CBS-kiőn-hoz az Cő40 C\A szerinti C BS- PC R~ termék ampiílíkáctójávai- adtuk hozza a Cl-C'?' TGáTGa FGa TGAÍGA CG A * A « ♦ **
CCTGCÍAAGTAGCTCAGTAá, 9. azonositószámú szekvencia) és a Ci-992 ·($. azonosítószámú szekvencia) jehi láncindítókkal. Λ képződő PGR-tertnék a természetes CBS-promóterszakaszt. a CBS-t kódoló szakaszt és egy további, gkenk és hat hbztldint kódoló· szakaszt artaknaz, A gl leint azért kapcsoltuk hozzá, hogy a transzláció után a polite-peptid térbeli kadékeíivságát növeljük. a poii-hisCBS-PGR-ierméket gélén tisztítottuk meg az eredeti CBS-DNS-szekvenciától, és ECR-rel ampliíikákuk egymás után kétszer a €1-092 (5. azonosítószámú szekvencia) és C'í-917 jeli! (9, azonosítószámú szekvencia) íánesndiíékkal, hogy láthatólag megszüntessük az eredeti GBS-DNS-t.
Hasonló triódon az előzőek szerinti rplCBS-PCR-terméket a €1-009 (6. azonosítószámú szekvencia) és a Cl-017 jelű 19. azonosítószámú szekvencia) láncindítókkal amplsfikáimk. A PCR-terméket gélen tssztíioi19 tu'k, és kétszer újra amplifíkátrak a €1-999 (6. azonosítószámú szekvencia) és a Cí-017 jciő (9, azonosító-számú szekvencia) láncindítókkaí, hogy jelentősen csökkentsük a TPtCBS-DNS-szekvencia bevitelét.
A CBS-gént a €1-001 (2. azonosítószámú szekvencia) és a €99 18 jelű (€A?CÁT€AT€AyCArCÁTTAAATAAö.AAC€ÜA€G€T, 10. azonosítószámú szekvencia) láaeináitókkal Is klónoztuk PCR-rek hogy potíhisztidin-szekvenídáí állítsunk elő a ΤΆΑ stopkodonnal, amelyet a transzkripciós terminátorszekvencla követ. Ezt a rövid, mintegy· 190 bázispárbóí áilő PCR-tennéket (“tercnórátor')· gélen tisztítottuk. és PGR-reí klónoztuk, ugyanezekkel a láncindítókkaí,. A pob-his-CBS és a terminátor fragmeaseket a €€901 (3. azonosítószámú szekvencia) és a €1-002 jelé Í5. azonositőszámú szekvencia) iáncinditókka·! végzett egye!len PCR-reakcíóbao egyesítettük.. A képződő nntplllikációs tennék a CB'SH-nak jelölt ouKleinsavmolekula, amely a természetes CBS-prosnőtert, a teljes CBS-kódoló szakaszt, egy további gíiciat, hat hisztidia arninosavat tartalmaz a stopkodoomd, valamint a CBS transzkripciós termínátort.
Hasonló módon a polihis-TPlCBS-t és a temútótorfrugntenseket egyetlen PCR reakcióban egyesítettük a €1-091 93, azonosítószámú .szekvencia) és -a €1-999 jelű (ő. azonosítószámú szekvencia) lánc indítókkal. A képződó. TPfCBSH-nak jelölt oukleinsuvtertaék. ugyanaz, mint a CBSHrszekvencia, azzal a kivétellel, hogy a FRH-protnótert a természetes CBS-proomterrel helyettesítettük. A CBSH-t és a TPIC8SH-t '{amelyek míad25 egytke tartalmazza a pohiőszbdin affinitás* cúnkeszekvenciát) BresHi-gyel hasítottuk, és Gl-l-be iigálbrk, az előzőekben a CBS- és a TPÍCSS-szekvencíáknál ismerteiének szerint. A ligálást keveréket íNVSc-l-be transzformáltuk. A tei-szenzitlv k Iónokat a tneaíéíe-iö klónozod génnek a Cl-l-be történő beépülésére vizsgáltuk rest-nkciós enzimes vizsgálattal.
3, példa
PjddCtőAhiiOsréyCíizÜAzfoi^^
Ebbe» a példában hagyományos PCR. és atolekulárts biológiai technológiákat alkalmaztunk RfccfíiVYíífírcí·.; i'cre-i’íAíiv <íNVScl) eiszürtfoiréi-jh-szmíáz (CBS) génjének klónozására az ammoíenninálts giutation-S-ttanszlerázzal (GSl“) ihziös foí-érjekéiit. A .gíutation-'S-transzfetáz. ezen szakaszának hozzáadásával a CBS-lchésje egyetlen aifinitási lépéssel tisztítható A, céh tópközegbol, és hozzájárul az enzim oldhatóvá téte35 Cher cr vagy elósegöí ez. enzim helyes, a kí 1 v formába történő Íelgombolyodítsát. hremreC
Λ CBb-géíi forrósaként όίή-.ο/ηίίοηϊ .·.<;«$ «vrcvsáí;? GNVScl) íinvítrc-g.en) luboratórinnú törzsét alkalmaztuk. Az IN VScl -élesztő egyetlen telepét 199 yí ionmentes vízben lotrahuk. 5 percen keresztül, maid gyorsan megkevertük czoöös rerfogatth 9.45 rBm-cscdveygydngijyei 2 percen keresztül. Λ s<gthz;ismi 1 ebé· •19 hasznaitok eztfem !.)N S-forráské®: az élesrtő-t.'BS-gén PCR-ampliúkálásához €1-024 «« ·>
X ** ♦ 8 íGCGGG'í'CGaCTA'í'öáGTAAA TCTGAöCAGCAAGCC. I 2. azonosítószámú szekvencia) és €1-025 jelű (GCGTGCGGGXG-CGITATGCTAAGTAGCTCaG. U- azonosítószámú szekvencia) íáncíndítökkaí, amelyek a közzétett éiesztö-CBS-génhez szegélyező szekvenciákat tartalmaznak és restrikciós helyeket a pGEX-éP-2 exprcssziós vektorba - (Amersham Rhartnaelaj -történő klónozáshoz. A képződő PCR-serraéket (mintegy 154$: bp) azután izoláltuk, és .aga-rözgéi-ö'NS-exúafcciőval tisztítottuk a kereskedelmi forgaloarban kapható reagenskésziettei (Roche). Λ őo/l <5’-vég)· és Mxl (IG-vég) restrikciós enzimbelyekkei .szegélyezett CBS-géat tartalmazó, tisztított PCR-terméket azután emésztettük (Sml és Afod), gélen tisztítottuk, és pGEXőP-2 .exprcssztós vektorba ligáitok (Atnersfeans Pharmacia)-. Restrikciós- enzimes térképezéssel igazoltuk, hogy a RCR-reí ampliítkáSí Ö'NS az élesztő CBS-génje. A klónozott SociAaj'owreees eerevtsiw cÍ8zta-tíonia-0'-szintóz (CBS) génjének. DNS-szekvenciáját bemutatjuk (14. azonosítószámú szekvencia). A klónozott fctenwsw «•revfs/oe CBS léhérjeszekvcnrciáját szőttén bemutatjuk, amelynek ammot-NHi-lícrminális végén GST fúziós fehérré van kapcsolva a pGBXőP-2 bakteriális expresszió-s vektorba történő klónozás eredmények éppen (20. 3-zonoshőszámú szekvencia).
A klónozott CBS-géat tartalmazó pGEX6P-2' exprsssziős vektort (ismertetése az előzőekben) TGPiO jetiéi A. íréi sejtekbe transzformáltak (Invltrogea). Egyedi, telepeket szedtünk lei, és .sejttenyészeteket alakítottnnk ki 100 ugAtó ampicilUnt tartalmazó LB-tápkőzegben 3öEC-nél smig a 600 nm-nél -mért abszorbancia elérte a mintegy 0,5 OO-értéket. A GST-CBS-föziősfehérfe e&pressztöjának indafeálása érdekében (amelyet a tacpromóf&t irányít:) izopj'opil-B'-D-ttögalaktopjraítozfeot (1PTG) adtunk a szaporító tápközegbez ö, I ®M végkonc.extós lóban. A CBS kolakferát, a pmdesáM-fosztatet is hozzáadtuk a tápközeghez 100 μΜ srégkonoentrációbán az indukció alatt. Az indukált .sejteket 3SCC-on szaporítottuk további 21 órán keresztül, amikor eenírithgáiássai összegyűjtöttük a sejteket.
Ezután a GST-GBS-fehége afBntíásí tisztítását -végeztük el G/am?/ao«e óepóam.se -ZB sifíniiásí gyantával, lényegében a gyártó útmutatása alapján (Amersham Rbarmaeia). Röviden, a sejteket foszfáttal pufférelt .sóoidatbttn (PBS) szuSzpendáltuk, és jégen szotúkálással szétzúztak. Triton X-lOO-aí adtunk hozzá 0,1 % (tőit) végkoncentrációbsu. és a -szoutkálí elegyet szobahőmérsékleten, 3Ö-4S percen keresztül rázattnk. A sejtiizátumból az oldhatatlan törmeléket' eeotrifogálássaí eltávoiilonuk, BNáz í-gyel kezeltük, és G/réuzánme Aí-pfeí'-uso 4# affinitási gyantára töltöttük, A nem specifikusan kötődött febériéks- 1-0 oszioptérfogatnyi RBS-sel mostuk le, és a kívánt GST-CBS-tébétjét az si'feitási -gyantáról 5 oszioptérfogatnyi elúciős púderrel duá'it-ük 1X0-mM Tris, pH A L4 mM. 0-morkaptoetanol (BME), !0ü mM .náíriam-kiörid, ö,iX.(t£'tf) Triton X-lŐö. 50 mM redukált glulsuen). A GST-CBS-'háztósíehérje tisztit-ását Goomas-xie Blue-vai festett SDS-RAGE (n-ásriúmdodec'síszu-llát, pohukriiamid-gófeiektroátrézis) vizsgálattal igazoltuk. Az élűéit GS'T-CBS-í tárolási púderbe üiaííZéhtik iái) uAi TrisHCi, pH A Hé) -uM náíriurn-kioriri, 5 b.M í’LP). k;s térfogatokra osztottuk, és -A'C-oo tároltuk. A tisztított GST-C8S konceruráelóját G/é'/ife BC.; féhérievizsgálaii íeagenskésziettel (Pferce Chemical) határoztak meg, A tisztítóit GST -CBS jellemző hozatna egy gramm £. eréz sejmtaxszából 5-10 mg GS4 -é BS títriomársybo esik.
. í '!. Á A;. í A .íffetvá ttíf .flyí A,; s/
Jf «♦»!« » * « « * « X « «*
A tisztítod élesztő-CíST-GBS-fúzlósfelteíje' CBS'aktivitását Kashiwamata és Greenbcrg (Kasltíwamíita és Greenbers, Bioóhim, Slophy, Acta 212, 488-500 (1970)] leírása szerint mértük. Λ vizsgálat a CBS azon képességén alapúi, begy szeriéből és honmciszieinbö-i cisztetionlríl szintetizál. A CBS által előállított etsztstkiniít mennyiségét speklrotótomeinásan határoztuk meg ; -ninhldrin-reakdiót adó kromogén kimutatásával 455 nn--nél.és ismert eiszteíioísiekdoeetrtréciéjú mintákkal nieghöíározott stendardgörbével történő összehasonlítással. A. CRS-aktívitús- az előzőekben Ismertetett enzimes vizsgálattal is megbatározható, vagy más, szakember· számára ismert vizsgálatokkal.
4. példa
WG-ÖiS^ édPég;ks3SAOd%:kó.zÓAlÁ'ófegőóC::é2sAizzíA:Ai.zz.A<:ÁÁi;..<:é:yAg%v?
kében a példában egy erős promótert, az ADH2-Jépítettük be a CYS4~géntől é'-isánybtg és készítettük el ;;z élesztő ÜBS -gepjévei etilé íüzkgát a magasabb tehétjeexpresszió érdekében. Az ADH2-promói.ert az Adrlp szabályozza, és represszáh -állapotban van, amikor az élesztőseitek glökóztartalmú tápközegen szaporodnak, és derepresszákxlik, .amikor a sejtek nem fermentálható szénforráson szaporodnak. Ez szabályozott expressziét tesz lehetővé, ha a fehérje fokozott mértékben történő termelése letét is a sej: számára.
<.g2gíöi^^
Élesztő genom! DNS-í arapliftóltak Ci-029 .{CTATATCGTAATAATGACT AAATC'TGAGCAGCáAGCCGA’H'CA, 15. azoesositsW-áníü szekvencia) és €1-017 jelű (ATGÁIGAÍGAIGATGATGACCTCGTAAGTAGCTCAGTAA, 9. azssnosítószátnú szekvencia) láncsaditókkai, hogy előállítsák a teljes €YS4~gént stopkoóon és transzkripciós termmátor nélkül. A CI-029-láacindítő (15, azonosítószámú szekvencia) az ADH2-premóiersaakasz utolsó 13 bázisát tartalmazza a CYS4-gén első 10 kodonjáboz. klónozva. A Cl-öl 74áneinditő (9. azonosítószámú szekvencia) szekvenciája a CYS4-géú utolsó hat kodonja a stopkoden kivételével és egy glicln és hat hiszíidtn kodonja. A képződő FCR.-termék a CYS4 kódoló szakaszát és egy további kódoló szakaszt tartalmaz: gl.te.in és hat hisziidin számára. A glícínt a transzlációi.· kővetően a. polihis-peptid térbelit htgíékonyságánttk rtöveiése érdékéhen adtuk hozzá. A terrniuásor ftagmenst ugyanannak a gennmr DNS-nak Cl-öl 8 (€ATCAT€ATCAECATCATrAAATAAGAACCCACöCT, 10, azonosítószámú szekvencia) és Q-ó-lö ielíí (AGGGCTCG.AGGATCCCGÖGGGT GCTATTATGAATGCACGG, 16. azonosítószámú -szekvencia) iíincinddókhíil iörtéoő ampliftkálá-sávaí állítottuk elő, hogy TAA.-stopkodonnal pobhi-sztídrn-szekvenci-át hozzunk tétre, amelyet a transzkripciós terminátor kővet. A €1-029.:0-01 ? PCRreakcióban mintegy 1530 bp nagyságú fra-gmens keletkezett, ínig tt Cl-C15/'CiO4ő reakcióban minísgy 3 31 bp tsagyságú íragmens jött létre. Ezt a két fragnrenst a FCR-temtékek összekeverésévé! kapcsoltuk, és a 0-02930(140 : iártemditókk.al senplíískáltiík. A képződő terméket €¥.$4H-nak neveztük, és mintegy 1561 bp hosszú.
Az ADBC-proruő-erríek a C.'¥S4l-l-génfrttgmensh«z történő kapcsolása érdekében először BC'Ríerméket állítottunk elő a.0-027 íCGOGGATCCGACGTTn' G€CCGCAGGCGGGA?\ACC, 17. azonositőszáfiiú szekvencia) és G1-Ö2-8 kló (AGAT!) AG’iT AE'iA'nACGATATAGTTA ATAGTEGAÍAG. 18, uzottosiíőszámt; szekvenciái fáne-inőítökksi ugyanabból a genom i cieszlö-DNS-ből, hogy előállítsak az A13H2· pre-móterszekvencíát A -0-4)28 116. azooosítószámá szekvencia) a CYSá-gón kódoló szakaszának első 12 ookteodiháí tartalmazza, A €1-1)28- GS. azottositószátuó szekvencia) és a Ο-029-lánetnditók 115. azonositőszámu szekvencia! között tehát 35 ítukleoiid hosszú komplementer DNS van a. termékeikben. Az Alzílz í'CRíertnekét összekevertük a GYS4H-í-mv.meí:Xsei, vs a C1-IG7 117. azo:X.-»tiő.szainú. -/-.-4verset:: · es a. C1-04Ö ^iii
9X9
9 9 X «ί 9 9 9 9 t * * 9 99 :♦ Μ .9-9 9- 9 ♦ * 9 9 9 9 9
9 X * 9 9 9-Μ 9 |Ι6. azonosítószámú szekvencia) íá-odonitökkat ampiiőkáltuk, hogy egy mintegy 220'í bp nagyságú,. ADI12CYS4H-nak jelölt terurékfragntemt hozzunk létre. Valamennyi PÜR-ferrnéket restrikciós enzimes vizsgálattal dfenöriztök.,
AZ ADB:2€YS4H-íenaéket YEp24-be klónoztuk olyutódon, hogy mindkét DbiS-s zkmdlí-gyeí hasí5 fostuk és Ύ4 O'NS-Ügázzai hgáttek. A ligáit terméket is.. co-ii sejtekbe (TOP 10,- mviírogea) tmuszfbrmáli-uk, és an.ipic.iUin.aei kiegészített LB-agariemezekre terítettük. A feltételezett reko-mbínánsokból B7«.smá( Brepo/nnoa resgenskészlcftel (Roebe) a gyártó útmutatásai szerint pfezmidot áoláltuak, és restrikciós «ad-orntkleázzal vizsgáltuk. Azokból a klóitokból származó plazmidokst, amelyek a helyes .tnszeríef hordozták, A. eeremmebe IB154ÓS) transzioraíáfeik, és 2% glükózzal kiegészített, aradi nélküli, szintetikus, teljes tápközegre terítettük (SC-ara). Két nap múlva a feltételezett rekömbuiássokat ugyanilyen lemezekre kikentük, hogy telepeket izoláljunk. A veiteket 2% etanol és 1% pepton tartalmú SC-ara tápközegen, történő szaporítással indukáltuk, amelyet általában 0,1 % glükózzal egészítettünk ki, hogy a sejtek 24 órán belül kinőjenek... Egy éjszakán keresztül történő szaporítást követően a sejteket centrifngátesal összegyűjtöttük, és a sejtüledéket -/(k'C-on tároltuk a lízisíg. A sejteket a sejtüledéknek az eredeti térfogat AŐS-szörös térfogatának megfelelő mennyiségű lízis pufferben törte15- nő szuszpendálásávai bzáituk. Üveggyöngyöket adtunk a puifer meniszsusxáig.
A teljes vzaszpeíiziét négyszer 1-t percen keresztül vortexszel megkevertük. A sejteket a keverések között ·! percig jégen bütötíűk. A foátumot friss csőbe vittük át, és 10 percen keresztül iOOöö x g-vei centrifugáltuk. A tiszte lizáíu-riot őök-&UÍ;k oszlopra (Rockéi rétegeztük, és a fehérjét it gyártó útmutatásai szerbit tisztitőitek. A részlegesen tisztított foké:jót a hármas elúciőba» nyertük vissza.
5. példa .y5áatö£^ÉíLM^g^L^mák^saksittisís^éi«^^<.s^ái
Ebben a példában piruvátra és eisztatlomnra a vizsgálat nem ciklusos részét mutatjuk be, Aötetefeaöbte&A
Piruvát: A teiálmánv tárgyát képezi aomoeísztein mérése CBS és CBL enzimekkel annak alapján, hogy bömoeisztem ciklusos átalakulása közben piruvát és nmmotna keletkezik. A piruvát és az ammónia termelődésének sebessége előre láthatólag arányos a martában lévő eredeti homodsztein-koncemrációval. Ennek a sebességnek megfelelő enzimmebenzimekkei történő mérése lehetőséget nyújt homogén homodsAmn-eljárásra.
A találmány egyik szempontja szerint piruvát mennyiségi mérésére nagyon érzékeny eljárást fejlesztettünk ki. Az eljárás során piruvát-oxidáz píruvátot aeeíibfosziátte, szén-dioxiddá és peroxiddá alakítja. Ezt követően a peroxtdáz a peroxtdoi, TQöS-t és 4-ummoateipsrim ktomogénné alakítja, amelynek abszorpciós maximuma 550 m közelében van. A kromogén. moláris abszorpciója elég nagy. mintegy 3ő L mértem'1.
Az 1. táblázatban bemutatott reagenskomponensek és a Cobas FARA készülék (Roehe, Basel. Svritzerinnd) 2. táblázatban felsorolt paramétereinek alkalmazásával a piruvát könnyen mérhető üM nagyságrendben a korai szakaszban leolvasott vonatkoztatási porti t'Wuk) és a végponti reakció között eltelt 5-10 pete alatt. Az idővel Szemben ábrázolt abszorbnueiaértókekuí a vizes kalihrátorokra az I. ábrán matatjuk be. Az aktuáiis kalibrációs görbét a 2. ábrán mutatjuk be.
1, táblázat
E ijáfás piraváíra; Reagens komponensek
Vegyület
Koí-eentráCíö * '♦ * ♦ « « * * · «* * * * ♦ * * ♦
X* ΦΦ χ«
i -es reagens
HEÍ’ES, !·;;·;·) ina· o tn ·!ν<· 2L5mM i
HEPES, sav 28.6 tói i
EDI A M\;0 5.0 βίΜ
Magnézium-szulfát x 7H>0 49 A mM
Náíium-lzidfogénfoszíát, oíbázisos 7,5 tót
roos i ,4 tói
ΠΠΛ 8,8 mM
IIP 8,2 r»M
4-A tiíioosiitspú’ir· i ,0 ntM
BSA íf g/|
KáHui»dE«':x:inn.id 8,07 tói
Tomiapefoxidúz 3,8 KU i
(O'UVá·-töádáz 2 0 Keid
pH - AO
2, iáid ázat Eljárás pímvátra; Ο?ό<«· A4RT paraméterek
Paraméter Beáiíísás
általános
Mérési mód ÁSS
Reakeiónsód PA
Kalibrációs- mód SLORE A VG (Meredekségátiag)
Reagensvonatkoztatás ÍIEAGTEL (Reag/hlg.)
Hudámhossz 558 nm
Hőmérséklet 37Ύ3
VIZSGÁLAT
Minta térfogain 48 ;á
Hígboszer térfogata : .,, .......1.........................1.............................. i8 pl
Higltöszer neve Víz
Reagens térfogata 258 p.i
inkubációs kló 00 s
Ründulási reagensíérfogat na
{fedőszer neve víz
Hígbészer térfogata ............................................................................................................ na ...................................................................................................
inkubációs idő
Κiindniasí 2-v.s reagens térfogata Higifoszer neve na i sta
-4......................................................................................................
: víz *
Üigüószer térfogata na
Hőn; érsekied késés na
ABS ZU KB AACÍAEKTÉKEK
Első 0.5 s
Szám : .................................... .....................................................w-------------------------’
időköz 30$
SZÁMOLÁS
Lépések száma I
Számolási lépés .A K1NETIC í Kinetikus}
Első 1
Utolsó i-i
KALIBRÁCIÓ
Standardok száma 1
Standard 1 50 pM
ismétlés 2
Cisztetjüniiií C'SL-nek-az előzőek szerinti piravátreagéftsbsz.történő hozzáadásával mértük. A CBL a claztationinl: homoeisztemné, pizuvártá és ammóniává alakítja. Λ piravátö? az előzőekben ismertetettek szériát mértük. A .cisztatkmxn mérésére aíkalmtszott reagens összetételét & 3. táblázatban mutatjuk be, A mérés bármilyen alkalmas készülékkel végezhető. Ebben a példában é'cőns készüléket alkalmaztunk (Roebe. Basel, Switzeríand). A jellemző reakciós paramétereket a 4. táblázatban mutatják be. A 3, ábrán cisztatfonin. vtzes oldatával nyert grafikont mutatják be, ahol az abszotbartelát az idővel szemben ábrázoltük. A reakció kevesebb, mint tíz perc alatt éri el a végpontot.
3, táblázat Eljárás cúsztationinsa·; Reagenskortiponensek
Veeyaiet Koncentráció
1 -es reagens
liílPLS, hcmmáírintnső 203 mM
11 EBES, sav 27,0 raM
EDTÁ(4Na) 4,7 mM
Magnézium- szol lat x 71-UO 47.1 mM
Káliuín-hidrogénfoszfát, dlbázAos 7,1 mM
IOOS 13 mM ........................................................
_________________________i.....................................
Mi 1A · 03 mM
TPP I 0.2 mM
:Í r..................... d-.Mnínoattiipirm 1 0,0 m-M
BSA ? 1 A g/i .................. -··—<
Kóbor n - ferroeüsíi id
0,07 mM *
*94« X
Torcnaperoxkláz 2,8 KUÁ
Piraváí<JXí4áz 23 Kid
CB·, 1.9 gd
pH - 7.0 ............................ . ...............................
··>. táblázat Eljárás dsztaítoninnt.; Co/w/ví&i paraméterek
paraméter Beállítás
ÁLTALÁNOS
Mérési mód ABS
Keakciómód P-A
Kalibráeiös nsód LÍN 1NTER íLisseáns kitér.}
Reagens vonatkoztatás REAG/D1L {Reagens/htg.}
Hullámhossz 550 nm
Hőmérséklet ;??~C
VIZSGÁLAT
Minta térfogata 50 μ .1
Higítószer térfogata 10 pl
H igit ószer ne ve Via
Reagens térfogata 260 pi
inkubációs idő iiö s
Kiindulási reagenstérfogaí na
Hígító-szer neve Víz
Hígitészsr térfogata na
Inkttbáeiős idő na
Kiindulási 2-es reagens térfogata na
Hígító-szer neve Víz
Hígítószer térfogata na
Hőmérsékleti késés na
zWSZORBAxNClÁÉRTÉKEK
Lisö 5s
Szám 21
i Időköz. 60 s
i SZÁMOLÁS
L epetek ,v mm 1
; Számolási lépés A iAOPOivr: Yégpvm)
1..................................... J A ........................................ 1
| Lrotső 10
X φ
X Λ Φ
X * >s? A Ο φφ »·♦«« « X φ Φ Φ
KALIBRÁCIÓ i
Standardok .száma i i
Standard I 1 5ö uM
{sniétk^ ; 2 ....................................................—................................................~.....
Λ 4. ábrán císztatfonin vizes oldataival nyert sían'dítrdgötbékel ábrázoljuk, A görbék lineárisak legalábbis dsztationia 0-1ÖŐ uM 'koue-ernntciéíartományáhatt, A képződött krotnofór mintegy 15-20 percért keresztül siabil. Antikor azonban i:0-20-xzor magasabb ciszfauc-ninkoneentrációkat tartalmazó mintákat mértünk, a kromofór némi instabil itáxa megfigyelhető volt.
Egyes kísérletekben a reakciókeverék szerint is tartalmazott. Szertn 25(1 .uM szintéit nem· mutatott szigniftkáns Itatást. A vizsgálatot szeri® magasabb szintjei sem befolyásolták. Fontos megfigyelés, hogy széria uem befolyásolja a vizsgálatot, mivel szerín jelenléte szükséges homocisztei® méréséhez.
ló ÍÓlÓpeseikfesps. yíZSg.éatJieíucetHztcggc
Ebben a példában hemocisztok· koneeutráciőjánttk meghatározására szolgáló, enzimes, ciklusos rendszereket. írunk le akár oirtivát-oxidázfeeroxidáz jelzőrendszerrel, akár 'laktát-dehidrogenáz jelzőrendszerrel.
Ciklusos rendszert mutatnnk be, amelyben a reakciót akár bomociszteinnel·, akár ctsztationimsal hxiítIS juk. Az ezekben a kísérletekben álltalmazotf reagemkomponettseket' az. 5. táblázatban mulatjuk be. A CBS··!: és a szériát külön adtok, miután a mintát összekevertük az 1-es reagenssel, amely az összes többi komponenst tartalmazza. Az ide vonatkozó Cbáos fe-iRd paramétereket: a §. táblázatban mutatjuk be. A cisztatíoninl vagy a homoclszteirn vízben oldottuk, hogy standardoldatokat állásunk elő megfelelő koncentrációkban. Az idővel szemben- ábrázolt abszorbaBeiaérfekekeí az 5. és <$. ábrákon mutatjuk be. A görbék 3-6 perces késést f’lag peri2ö Adóst)-kővetően lineárisak. Jellemző hotooeisztein kalibrációs görbe {?. ábra), amely bár nem teljesen lineáris, felhasználható alkalmas mintákban lévő bomodszte-io.-kmi«wtrációk mennyiségi mérésére megfelelő görbeillesztést ueeiutoiógiókkai.
5. tábláz;»
CBS/CBL-clldus, PÖ/HPR-eljárás
Reagensfe. impotensek
V Koncentráció
l -es reagens
HEPES, hemínátnumsó- 20.3 mM
KERES, sav 27.0 raM
ΕΒΓΑ (-4 Na) 4,7 mM
Alagnezümt-szulíát χ 711 -<> 47,1 mM
Kálium-hidrogéntoszfát, dibáz.isos 77 tnM ..................................
i(A)S 1.3 mM
ΓΗΪΛ ŐA mM
ŐA ; et A1 » * « ♦ *♦ #. * « «»*
TPP ........ : 0,2 :v.M
4~A«foíoausií>iHn 0,9 tsM
HSA 1 lÁgu > :
Kelíuut-forröcianíd : 0,07 m.\í
Tustttaperuxidáz 2,0 KU/i
Eiruvát-osidzz 3,0 KU/l
COL,
pH - 7,0
S K · · ívííS ί
S.-íx-i 3,1 5uM
SAz-nxsgees
CBS 1,22 gi
6. táblázat: CBSzCBL/PG/HPR ciklusos· rendszer;: CBóuz KCRT paraméterek
Paraméter Beállítás
ALJALÁNOS
Mérési nfod ABS
Reakcrörncd P-CSRÍ-1-SR2-A
Kalibrációs rnód UN INTER (Lia. ínter,.)·
Reagensvonatkoztafos· REAGANI. (Reag/hig.)
Huílátnbossz 550 ntn
Höiiiérsélí.fot 27Á;
VIZSGÁLAT
Mima fot-fogata 30 μ)
Higiiószer lót fogata 10 μΐ
Hígítószer neve Víz
Reagens térfogata 260 el
inkubációs kló 6 0 s;
Krímlnlás i reagenstérfogat 20 μί (szerűt)
I Higítószer neve Víz
Hsgítószer térfogam μί inkubációs lelő s
Kiindulási 2-es reegens térfogata
Higítószer neve ült CBS)
Víz í ilgífozzcr tér lógat a w Λ
Hőmérséklet! késés na
ASSZÖRBANClAEíCLEKES
Első 0,5 s
Színű 14
Időköz 36 s
SZÁMOLÁS
tépések száma 1
Számolási lépés A ENDPOINT vagy KINETIC (Végpont vagy kinetikus.)
Első I
Utolsó 14
KALIBRÁCIÓ
Standardok száma 1
Starfeard 1 56 pM
Ismétlés 2.
Nagyon kevés homoc-ísztel-n van jelen a huoránplaztnában redukált,, nem dlszuíSddal kötött állapotban. A homociszte'm többsége diszulfid-bídakka-1 fehérjékhez vagy kis moleknlákhoz kötődik. Ezekne k a vegyületekaek a díszalfid-re&kciója -szükséges a hornocisztem felszabadításához, bármilyen. a teljes homociszteín meghatározására szolgáló eljárással történő mérésnél. Ebben a péidában -azt -mutatjuk be, hogy redukálöszer alkalmazása összefér laktát-dehrdrogenázt és NADH-i alkalmazó rendszered. Redukálőszerként lehetséges jelöltek például a DTE, a OTT, az n-ac-etil-cisztein, a tiogllkeísav, a TCE? és hasonlók. A találmány szerinti eljárásbaí! ilyen vegyületek alkalmazása esetén a redukálószer koncentrációjának és a készülék paramétereinek: pontos beállítása szükséges. Azok a korábbi jelzések, hogy bizonyos redukálószerek .«^akadályozhatják piruvát-ox'idáz és vagy tonnaperwdáz működését, a vizsgálatokat az alábbiakban- ismertetett, másik pirtsvátkimutatási rendszer felé terelte.
A piruyáí: laktát-tlel-íöregenáz enzim jelenlétében reagál NADH-val, és tejsav és NAD keletkezik. Λ píruvát 340 nm-néf az abszorbanein. csökkenésének mérésével határozható meg mennyiségileg, A NADH moláris abszospcióia mintegy hatszor kisebb, oüat a peroxid által létrehozod kmmogéné. Ez azonban nem befolyásolja a találmány szerint; rendszert, mivel a CBE/CBS hom-ociszfesn ci-klns viszonylag nagy mennyiségűpiruvátot képes előállítani.
Ab,. 9., iií. és 11. ábrákon bemutatott adatok előállítására alkalmazott: reagensrendszer első reagensként szem·!:. CBE-i: és lak.tát-dehidrogenázt tarkdnaiz I1EEES pufferben tpl-l 7.2). Ezután sorban N-ADH-t TRIS pyfíerben {p-íl 3,5) és CBS-t adunk a rendszerhez. Valamennyi komponens azonban eltérő módon is kombit-éib Hő ok ér két, akár bátort· reagensből ülk; hon:tocísz!ei« mérési rendszert.alkotva. Λ reagensek koncentrációit a ?. táblázatban mutatjuk he, a: Cc.Aví.s 0.4,6.4 paramétereket .pedig, a 3. táblázatban. A NADH ko-neernrációját ágy átütöttek be, hogy megt’eíclóen lineáíls legyen, rniközhea lehetővé tegye a piazmaminta abszorpcióját 340 ntr;ael.
X ♦♦
7, tábíázst
CBSlC8l.rí..rírí CIKLUSOS RENDSZER: reagenskoixtponensek
Vegyület Koncentráció
.1 -es reagens
HEPES, temííátrtuíHsó 39,4 «Μ
HEPES, sav I2,6 híM
Szerín 0,73 jaM
Lakfat-déhűirogenáz 330.00 U/í
CBl 6,05 μ?·:
prí - 7,3
S'Ri -reagens
NADH 4,16 mM.
TE IS 50 mM
prí 8,5
SR2.-reagens
CBS 996 tng/i
ERIS 50 tnM
Nátrium-kloríd söOmM
PirláoxálAbszDl 5 nM
Mmta-lngitószer
i rí vr 13 tnM
i HEPES, kemíriátriunrsó 56,7 mM
1 HE PES, sav HÍJ ísM
i orí rí?
8, táblázat ί UBS/CBL/LDH ciklusos rendszer: Cofyas Ε-ίΧ,ίί paraméterek
: Paraméter 1 i.............................................................................i............................... Beállítás
i Al.i'Al.ANDS
ί Mérési m<ki i ABS
; Pteakektmód 1 . .. ........................................„..... P-í-íAPirí-SPE-A
: Kalibrációs ί:)ώά ΐ <...........................................................................................1............................. L1N INTEK t Lin. intet·.)
: Reaeensvonatkoztatás j :..............................7..........................................................t.............................. REAGlDi;.. Rea-pkig.)
; EluilámiKissz: ; 340 nm
Hőmérséklet ·««
VIZSGÁLAT ....................................................................... .... ~ :
Minta fér fonata 30 te
Higívószer íérfegaía 10 pl i
Híg írószer -reve Víz (vagy S'edokáiószet'i
Reagens térfogata 250 pl
Inkubációs kló 60 s
Kiindulási resgenstéríogat 15 pl (ΑΛΟΗ.;
Higítószer neve Víz
Híg&ősser térfogata 1 ....... 5 pl
. I sskobác sós idő 10 s
i Kiindulási 2-es reagens térfogata í .... ......................................................... 30 pí (CBS}
1 kfigitószer neve Víz
í&ltószer térfogata ifi te
Hőmérsékleti késés ! na
ABSZ.ORSANCÍAÉRf&KEK.
Első 5»
Szára te
időköz 30 s
SZÁMO. fo
Lépések száma I
Számolási lépés A ENDiPölNT vagy KJNETÍC {Végpors; vagy kinetikus}
Alsó 6
Utolsó 20
KA.LÍÖRÁC1Ö
Standardok száma 1
Srmdard i 25 vagy 50 μΜ
ismétlés ·>. Λ-
f 7r rs ofiforofi yfo vefifozo
A rendszer jói működik vizes oldatban lévő botRoaisztein kitnutatására. sleiiesnző idö-abszorbanc-ia grafikon· a 8. és 9. ábrákon mutatónk be. Ezek a görbék lineárisak kis késéssel (iag fázissal): vagy késés néikte. A NA OH eltűnésének sebessége viszonylag nagy. Továbbá a bom.octsztein-korssxmttóciÖRak az abszorbanciával szemben ábrázok kalibrációs .görbéje lineáris a mintában levő ifi 100 μΜ iatto-rnányban 119. ábra.}, Ily módon a kalibrációhoz elég egyetlen, kalibrátor, pl. 25 pM a reagenskonhOlial együtt.
Kdios-fodzókoneesufoeiikiű homociszteiR-oidatokat készítettünk. hogy szemléltessük az eljárás teljesítőképességét 2-20 pM Immoérszíxím keneentrtkiótartotóá-Ryban. Az eredményeket a 9. táblázatban mutatjuk be rmod OTT jelenlétében,, nőtte se lkaié. Mint az előzőekben esfiitettok, a OTT redirkáiia a múltában (pl, szőtatn·. plazma, sfo.) lévő diszufiül-kötéseket, A. OTT szignifikánsán nem befolyásosra a lakta! -rtehterogeeáz által katalizált reakciót.
* ♦ * **
9. táblázz!. Lmesritás szeoíiéitetéso:' CBStCÖLLDH erkiusos módszer
rlonxjctszteífi konc. (μΜ.) Megfigyelt ériek tpól)
• ••OTT C-ADTT
n ó. ·> 1,2
5 5.2 4,3
s? 5.2 7,4
10 10,4 9.9
12.5 12,7 12,5
io,/ s fc,« i O ,_’
: '>{·)
Aiipffíé, vfaggte .Á CBS'/CBL I.DH ciklusos rendszer ponto-&ságát. szemléltetjük Bio-Rad Co. áttol gyártott,. bumánplazmá# alapuló homocisztein-konírolltemtékekkel. Különböző honcentráctőjö DTT-t alkalmaztunk, változtattuk .az inkubációs időket,.hogy a bemodsztein visszanyerésének optimumát «fejők, A különböző más eljárások tartományán belül jő hojaocisztein-méréseket kaptunk 5-15 perces, 1,6-.3,2 nsM koncentfámójá ÖTT-vel történő inkubációs idővel ííiÁAí.6feZ:As;;;-í?;yígó:
A hőmóeísztéin ciklusos vizsgálat jő teljesítményt matatott .hutnánplaztoa-miniákkai, redukálőszerkéot DTT-vei, Az eredmények jól egyeznek egy független ialxautóriumban kapott eredményekkel,, ahol az Aóbe/t Mfx homociszteia-eljátást alkalmazták (11. ábra). Az ebben a'kísérletben alkalmazott Coóos paramétereket .a. 10; táblázatban, a reagenskomponeaseket pedig a 7. táblázatban mutatjuk he. Ebben a vizsgálatba# vizes hooiociaztein-kalibrátort (25 pM) alkalmaitok. A vizes ciapú minták abszorb&neia-ixlő grafikonja lineáris· volt DTT hiányában, és közel lineáris D'IT jelenlétében. A pfaztsamístáksai kapott grafikonoknál azonban más volt a helyzet, azaz az első bárót# pere után nem vök lineáris. A 7. és 10. táblázatban felvázolt körülmények között a ciklus, ágy tűn ik, idő folyamán fokozatosan lelassul,. All. ábrán bemutatott korrelációs vizsgálatok mindazonáltal azt mutatják,, hogy viszonylag jó egyezés tapasztalható a találmány szerinti eljárás (ismertetve a 7. és lő. táblázatokban) és ÍMx szerinti mérés között humánszérum-minták vizsgálata esetén.
Só. táblázat
HííÍ lámhossz 340 run
Hőmérséklet )7 C
VIZSGÁLAT ................................. .................
Minta térfogata 30 pl
Higiíószer térfogata Iö M
Hígííószer neve Víz (vagy redukáló anyag)
l-lomérsékteíi késés 90(1 a
Reagens térfogata 250 pi
inkubációs ifié 60 s
Ktinánlási reagensterfogat 15 pl t.N M)IH
Hssítószer neve Víz
Hígífoszer térfogata 5 pl
Inkubációs ide iös
Kiindulási 2-es reagens térfogata 30 pl (CBS)
Hígböszer neve Víz
Hígífoszer térfogata 10 pi
Hőmérsékleti késés na
ABSZöRSANCIA E RTÉR.EK
Első 5 s
Szám 24
Időköz 30 s
SZÁMOLÁS
Lépések szám a 1
Számolási lépés A ENDPOÍNT vagy KINETIC (Végpont vagy kinetikus·
Első I
Utolsó fi
KALIBRÁCIÓ
Standardok száma I .............................................. .... ................... 1
1 S;aodard I 25 vagy 50 μ,Μ :...............
í ismétlés
Előnyös megvalósítási -nőé széf ifit a sebességeket a reakció ifiditáza. utáni első három percben mértük, Λ rendszer további optimalizálása, például a só- és defargerskoneeaffociók változtatása valószínűleg még megbízhatóbb teljosítsnényi eredményez vizes és píazínaminták esetében. Λ vizsgálat ugyanolyan pontos, amikor a komponenseket két vagy három roagcnskeverókheo egyesítjük.
7. példa ngííXfcbztem-yízsgákíKúoössmebyxiiktása
Ebben a példában egy, a -találmány szerint előnyös bumocisztem··vizsgálatot teszteltünk, és hasoo-iitoíttmk össze két létező vizsgálattá!, nevezetesen a hagyományos K'PiX-teehaoiogiával és a kereskedelmi forgalomban kaptató 1 Mx-vrssgálattal
A találmány szerinti vizsgálatot károm. reagenssel fen tettek végre, mint all. táblázatban látható, A2 első reagens, RÍ, por tonnában áll rendelkezésre, és 1,5 2 pori löö nő vízben oldottunk fel. A teljes vizsgálati reageuskészlet kalibrátomkat is tartalmaz, amelyek tamáapiazrna-alapba különböző mennyiségben kevert LeisztahooMií tartalmaznak,· valamin? két kontroílmmta is található, aatelyeket feldolgozott hnonánpiszma-aiapban áiikottak össze.
í 1. táblázat CBSéCBL/LDH CIKLUSOS RENDSZER: rengenskomponensek
Vegyüli;· Koaoentráeiő
i-es reagens
Hepes, beminátriumsó 45,5 mM
Hepes sav 12,7 mM
Szerin 1,295 mM
Laktál-dehidtogenáz > soo uh
NADH 1,06 mM
Triton X-5.09 t'1,-05% ?EH
Náirami-szid 7.7 mM
pH 3,0
SRt-reagens
DTE 6,75 mM
Uítromsav 20 ;A;
pH - 2,0
SRZ-reagens
CHS ISA KLi/i
CBt. 5,9 reC/ l
Szórtat ! ,65 M
i N-álrium-klorid í 00 trév;
Plridexáí-fösztát. 5 μΜ
i Náwiura-aztd 7,7 mM
i TRIS/HCI ί 5t> mM
j pH -3.0 ϊ
bérentett:
12. táblázat
C HSCBl.. I.DH eíkhisos rendszer; CíAí/·, .0'· paratnererek
Beülik.ív
Beállítás l-afaínéíCí ♦ X
ÁLTALÁNOS
Mérési mód Afesorb íÁbszofb.) Covers. faktor fofo
, ................... Reakctóntod R-S-SPJ-SR2 Offset 0.00
Kalibrációs mód Lin Regre LLia. regressz.)
Reagens -vonatkoztatás Rcag/iöil (Reag.átig.) Teszíiartoittájty alacsony Se
Tisztító Nincs Magas öe
Htálátiihossz 346 e Normál tartomány alacsony Nem.
Decimális helyzet N X. Magas Néni
Egység μ»·οϊ7!
Lépések száma 1
VIZSGAÍ..A1
Postái!, faktor Nem Kaik. lépés A Kinetie (Kinetikus)
Konc. faktor Nem Leolvasás első 18
Utolsó 32
Mintaciktos s Reakoiókorlát Nem
Mintatérfogat 30,0 μΐ
Higitóazer neve Víz: KALIBRÁCIÓ
Hígitószer .térfogata .25,0 μΐ .Kafibt időköz: Mindegyik fotiatás
Reagensei ktos 1 Vonatkoztatás
Reageostérfogat NŐ μ! Reag. tartomány alacsony Nem
Magas Nem
Start RÍ eíkics ·.· Vonatkoztatási tartomány .alacsony Nem
Térfogat 25 μ; Magas Nem
Hígító szer neve Víz
Térfogata 25 μ; Standard helyzet 5
:.............................................. 1 3,5 pmotl
1 Start R2 cikitís i 17 ......................................... '7,0' ^ííKjLO
1 Térfogé? :..................................................... 35 pl 3 17 emel i
i iiígítószer neve Víz 4 27 nmet i
Térfog.!?;· fo................................................... 15 μ! : 47 uniot’l
i 5 ; Nem
i kalibráció r i........................................ 7 Nem
; M'intzkorfót i-foake. :s:e i \?!!· .............................................. : t. Cikkem; : Ismétlés 1 átérés Eavetíen í..............'.:..................
4. * 9ΦΦ « * «ί «9 Φ * Φ ♦
V V * » ΧΦ* β χ > ö Φ Φ » * «
Κ* * » * *» ** Φ·
Ellenőrzés Ki
Araí'gérí&leskg ..................... Nem Korrekciós síd. Nem
Kontroll
CS1-helyzet Nem
!........................................... CS'2-helyzet Nem
CS3-heÍyzei Nem
A vizsgálat végrehajtásában a kereslsedelmi forgalomban beszerezhető- Coóí»· Λ//&4 készüléket alkalmaztuk. A -CWvtó MÍRÁ szoftver 5b programozható, 25 másodperces ciklust -tesz lehetővé. A készüléket előnyösen a 12. táteíázstbau bemutatott paraméterek szerint programoztuk. Az ;.. ciklusban- 3ö pi mintái adtunk a küveüába, maid 25 pl öbiitö vizet és % pl folyékony RÍ-reagenst adtunk. A 2. ciklus- elején 25 pi S'RIreagenst adtunk további 25 pi öbiitö vízzel. A keveréket 15'-cikluson keresztül í'akubáltak {6,25 tuti?}, hogy a redokálószer felszabadítson minden kötött hemocAzreint, és tönkretegyen minden endogén módon jelenlévő piruvátók Ekkor .35 pi CBS/C8E unzimreageast adtunk további. 15 p.i öbiitö vízzel. A 34ti nm-nél lévő abszorbaneia csökkenését trtértök 18 és 32: ciklus között a te-intában· lévő homoclsztein mértékeként. A. teljes vizsgálati kló a minta hozzáadása és a- végső -afeszorbancíaleolvasás között 52 ciklus volt, vagy 13 perc és 20 másodperc. Mivel több «rimát futtattunk egy időben, a A72R4 készülék további mi-ntaeredményeket állított elő, mintegy 3Ö-9Ö másodpercenként egyet a .fettaíás hosszától és az alkalmazott készülékkabb-rátorok számától függően. Hasonló programozást paraméterek alkalmazásával ez a vizsgálat még gyorsabb készülékekre is adaptálható (pl.. Roebe INTEGRA, Mi-add, ?\.CEV stb·.), amelyek még nagyobb áteresztőképességgel rendelkeznek.
Összesen 24 mintát vizsgáltunk a találmány szerinti vizsgálattal és .a ismert. összehasonlítási vizsgálatokkal. Az alábbi 13. táblázatban muiaíjuk be a három eljárással kapott homoeiszíein-koncentrációkat, A 1214 ábrák, a megfelelő korrelációs grafikonok, amelyek a 13. táblázat eredményeit grafikusan szemléltetik. Mint látható, a találmány szerinti eljárás jól korrelál mind az IMx, mind a HPLC eredményekkel, szorosabb egyezés jeiícmzően az IMxrszel tapasztalható. Λ találmány szerinti eljárás azonban lényegesen- olcsóbb, gyorsabban :0 futtatható. és széles körben hozzáférhető kémiai analizátoréi- ha-íhatö végre.
Λ találmány szerinti eljárással nagyon jó futtatások közötti pontosságét lehet elérni, mint ez a 14. tábiázaiöan látható, .lefertzö futtatáson betolj CV 4%-«ái kisebb mintegy 7-2Ö pmol/i homoeísztein-koncentrádóknál,
I 13, -ábláztö í-losnoctsziein-vi zsgálatok összehasonlírása flomoetsztc-stt-koncenttácró -(pM}
ί Minta a i HPLC | Találmány szerinti j IMx i
i .!.............................................. 1 eljárás i
ί 1 ί A5 ..2...............11,5 11.7 ;
; 2 14.3- Á........................... i BJ 1 ....:................................. { 12A 1
I 3 j 3 A i 1 ? ,5 ;
4 1 löd : <; 4 ;
***
3β
X*
Λ» < *
X » * ♦ ♦ * >·*♦ *·» ~'ί *
* * <»»
5 10, 5 50,1 ί 9,9
___ . .............................r 6 8,6 9 ' 5 7 2 :
.................................................... 7 7,6 5.8 ; 6,2 ί
3 i 5,2 3,5 2,1 {
0 | 9.6 9,3 9.7
16 7,7 8.7 7,5
11 15,2 5 1,1 9,4
52 10,5 8,3 ,8,1
ή 51,9 3,4 8,3
14 10.8 0,2 ............................. 8,9
IS 14,5 12,3 12.5
56 24.5 16,3 17,9
17 20,9 17.7 1 7,8
18 24,2 22,7 22,1
59 32,6 26,4 26.4
20 25,0 20,7 13,9
21 ··}·> 1 19,6 58,1
22 20,5 17,3 16,6
23 25,6 23,3 22,0
24 20,5 17,6 15,2
Átlag 55.2 13,3 12,8
Ordinála-metszéspönt <5501.00 1.4 0,9
Meredekség (KPLC) 5.2 1,2
R (HPLC) 0,957 6,974
I Ordináta-ntetszéspont (5Ms) -6.3 0,5
J .Meredekség ί ίΜχ) j 0,8 00
; : 4 ,. i^bhizaf
futtatások közöd! pontosság
i........................................... Hoftiocisztets (úrnőid) i
Minta Futtatás 1 I futtatás 2 Átlag %cv
I ! 6.35 5 56,46 16,4 5 f;--7
; -y 12.13 i 12.58 52.36 2.38
* Φ » ** *··
3 19,45 21,6 20,53 7,41
4 10.29 16,79 16,54 2,14
5 11.13 10,01 10,57 7.40
6 A33 7,56 7,45 2,18
7 0.3 i 724 6.78 9.71
8 7,13 5,54 6,34 17,75
9 14,87 14,5 14,69 1,78
10 12,81 13,41 13,61 2,08
11 2,6,86 28,66 27,76 4.58
12 12,45 13,05 12,75 3,33
13 10,15 10,74 10,45 5,99
14 9,6 10,59 10,00 5,59
15 12,53 13,67 13,10 6,15
lő 14,60 15,20 14,90 2,85
17 25,03 25,55 25,34 1,73
18 20,77 20,03 20.40 2,56
18 31,83 33,10 31,97 0,60
20 36,86 36,43 36,65 0,83
21 11,55 i 1,48 11,5? 1,04
-<> 40,22 38,25 30,24 3,55
23 31,58 32,62 32.15 2J)7
24 7,58 6,38 7,03 13,08
25 i 7,68 6,38 7,03 13,08
Átlagos CV(%) 4.22
8. példa
Ebben a példában a ?.. példában ismertetett, találmány szerinti előnyös vizsgálatot hajtottuk végre a reageiistesntxjnensíík némelyikének, nevezetesen LDH, NA DK és szerin változtatásával. A •vagcaskoaipoaeKsck optimális mennyiségét kívántuk ily módon meghatározni. Λ vizsgálatokat az előzőekben leírtak szerűit végeztük, csak sz Ölelő komponens koncentrációját változtattuk. A 15. táblázatban matatjuk be ezeknek a vizsgálatoknak az eredményét.
15. táblázat Reageaskoinpoíránsek ksiticeartáclőiit megváltoztatásának hatású i
Lidii ?17 ')> Végső reakciókeverék Meredekség ΙϊηΑ/ίΐΟζΟμΜ} .................................... Metszéspont. ÍU)Á/0’.ÍRÍ i Vonatkoztatási i reakció (mArtniai i......................................... Kantrollm-snta célzott 1 homőct szte in-tartománya 1 25-35 «5-1 i
1 14,5 1,21 6,14 i -102 25,8 >
**
4(
458,7 07 0,54 -11,3 26,6
91.7,3' 08 i V89 01,8 .v .·
- ...............
íN'ADKKroM)
0,130 0.77 4,23 00,7 32,9
0,250 LA 0,05 -11 25,2
0,389 ; oó 0,45 -10,7 26,8
0,519 i. 13 0,49 -11,1 26,0
Szenn (stM)
0.125 0,64 2,23 -6,7 30,9
0,25 0,92 5 .26 -9,0 28,1
0,5 1,13 0,63 -10,8 27,1
5 1,16 0,15 -13,6 28,3
-Ϊ c. 123 0,33 -15,4 28.2
A !5. táblázatban bemutatott -eredmények alapján, ki tudtuk választani azt a végső reageaskoinponeas-ayeníiyiségeí, amely meglelek) érzékenységei: biztosít, ugyanakkor a kontroll sebessége minimális, és a reagensek költsége is lehetőleg, alacsony,
9, példa ' s iögálSÖS
Ebben a péktábaa a pH megváltoztatásának hatását határozöds meg oly módon, hogy a puffért TR1Sre cseréltük, 250 raM, pH 8,4, és lípázt és· α-ciklodexmnt adtunk az Ί-es reagenshez. Ezen kiszerelési változta:· tások után meghatároztuk a-vizsgálat teljesítményét. A 16, táblázatban részletezzük a kísérletekben alkalmazott reagettskomponeuseköt.
í6, iáblázsl.
CBS.CSL'Wlí ciklusos rendszer: mageasko-mpenensek
Vegyület Koncentráció
1 -es reagens
TR1.S 250 mM
•«-Cíklodex-trís 0.5%
Lípíiz :·: 200 kV· 1
Széria 1,295 arM
Laktát-dehidrogenáz : ·· XOO u/'l
NÁDI; ....................................... ,
ΙΟΌοί· X-100 <«*'« « ..............................
Níiírium-azid 7,7’ ·η'ν· .................~.......................................................................................
X *
SRl-reagens
TCE? 26.3 mfoí
SR2-reagerts
CBS ............ 28.5 KG i
CBL 9.4 foifoi
Glicerin 10%.
Szorhi· í%
Piridaxál-reszíat 5 pM
foátrfum-azld 7,7 tnM
Káliu-nt-fosztát r 109 utót
i plíGÓ
Áz ί-esreagensben a pnOér TRIS-re cserélése, 259 mM, pH 8,4, javította a vizsgálat 'megbízhatóságát. Bz annak köszönhető, hogy a CBS és a €81 lényegesen aktívabb pH 8,4-néi, és a ciklus sebessége mintegy hármas iákforrid nőtt.
A íifoizt és az a-eiklodextrint azért adtuk. hogy a zavaros (íipidémifoó mintákkal járó problémákat leküzdjük, amelyekkel klinikai laboraíóriunsban néha szentbe keü nézni. Ilyen minták akkor keletkeznek, amikor a páciens, akiből a mintát vették, röviddel a vérminta levétele előtt evett, vagy ha a páciensben bizonyos betegségi folyamatok zajlanak. A zavarosvág befolyásolhatja a vizsgálat eredményét, naveí olyast magas •íbszorbaneiát okoz 340 am-nél, hogy a készülék netn képes preeszen mérni azt a kis abszofbtmciaváhozásí, amelyet a NADH fo AD-dá történő átalakulása: okoz; A zavarcsság a vizsgálat eredményét oly ts.ó<k»n is befolyásolhatja, hogy dinár»ikusan változik az: alatt az íviÖ alatt, átfog a NADH NAÖ-dá történő átalakulását mérjük. Amikor például a zavarosság mértéke csökken, a 340 ma-«cl mért tíbszorbancia is csökken, mivel a fényszórás kisebb. Ez a itatás hozzáadódik a piro.vát redukciója által okozott abszorbanciacsőkkenéshez, és a képződő homocisziein meghatározása lényegesen magasabb fokét, Lipáz és o.-cikhxfoxsrsn hozzáadása az R'l-hez csökkentem: a minták zsvsrosságát. feltehetőleg tt trigíieertdeknek iipáz közreműködésével glicerinné és szabad zsírsavakká történd hidrolízisével és a szabad zsírsavaknak α-eikiedextnnnei fortén» kompíexképzésévék ily módon a. zavaros reakciókeverék foldsztul mire az $R2-t <R3-> hozzáadjuk, így a píntvábermeíödbs sebességének precíz mérését teszi lehetővé. Sok zavaros reakeiókeverék 549 ntn-nél mért ahszoxbaneiáps csökkent fogyom», és vált egyenletessé néhány percen bdűL Λ homoclsztein-ercdményck pontosak voltak. Néhány zavaros mintánál azonban a íéhlszítilás nem ment végbe tökéletesen az SR2 (R3) hozzáadása előtt, igy egyes minták eredményei valamelyest pontatlanok. Mindazonáltal Iipáz és tz-cikledextrin alkalmazása ígéretes megközelítési .:nádnak íüfok zavaros rfofoáoél pontos eredmények elérésében.
Λ reagensaíkotókhan történt változtatásokon kívül a térfogatukat is változtattuk, hogy kiértékeljük tt vizsgálat teljesítményére gyakorolt hatásukat. Ezeket a változtatásokat a 17. táblázatban tűntetjük fel. amely Gfoos A/Zfo-i készüléken egy jellemző, ciklusos paramétert mutat be. Λ változtatásokat kove-őex; korrelációs vizsgálatot hajtóműik végre 8ő hymánmintán, amelyek eredményét a 18. táblázatban mulattuk be.
!·' Ρ·Λ··,! <. ι,: ύ •..... 1. í ; jCmyíJJ·..: t
VPromi Cg ..............~~—.........................- !-íi?G :
Vpmtó: ρ')) ........................—---------------------- i ί
ί ~----------· sz/Tpp μίφΒΐ·$ tó 92 aróro: :
g Λ aaau aazapp?jp-í :
UK'\; s»se$-v θ'1' ίΐ
mag Aisosag y wkü -OWj mpm?aoq«í«»g 7 j snopA i>? i.n«s I
λθ\: SKoSjyi ί
«mg Á«osa -bív Λ«;:«·<.'··.;!?'; tóím-g tó 06 teSejiössas^co^
yqmojgBísog Ϊ snpnosuoÜBoyi
sg«:p:« smp«;|y zosapt '.íppny tó (fSá SB3§OP<\5.
pnwnvTí
tó Λ 3Λ» .íaz«oiíS?H
pl 0tó2 «áropaismqy
tasjg jppKSjöp^»·^ I SBp|í38}8fp$
í€ tóWI
02 Qsp syseA-|osq aaoys m«oy
(sngsmuí-^j apa«:y v «?<M ->ao mag x>S>pp -fipízsG^
1V7VOSZJA
1 B«!«KS jpsacfeg
ypmtó SasAAsa
mag: ssWH z magas; $sros;«:»0
mag AUOSO -njv p?«n«g W 0ú£ zsssropmapag
B sv«qg S.U3*s· ««oy.
ag AWHAgy Xamoyej yspsíisztg ('íinptóaayi) ísay/asjay: ί ΐ SVÍVrZÖjpsWASnol&Ö^: :
(syzsssaS'3.í suí:au;p liosssaasay; .saasp η — ' ............; poiu sopiuq
OO'Ő i W?O édS-ldS-S-Ή ppmosaapmg
tón josgy: kjavt) ('«.ssazsyy) «.sósav ppm isprajg
1 a SONVlVilY
spípimg Ϊ .sma«mmq 1 tótóHnG .......... .mg«;a.;a^
ipmmtmmtó yygy >?«)«□ amzymm sasspqsa HQTIHO/SSD
y ξ
«♦ »» * * +
φ φ « φ « e * v ♦ »» · • « · ♦ * » «« X Μ· Φ* ♦ **
w *
ί 2-26 i 15,9 ί Í4aSv
; 7/*>7 8,8 9,30
0 ? 0 JÓ
ΐ 2-29 I 5,2 5,40
j 2-38 ί 8,2 8,10
1 2-3 1 ί 4,7 5,40
; -Λ -ί -γ ; 6,6 6,80
ίί ?~ν* ί 7,8 8,10
ί 7 0 7 ί)
/ 7_Λ\ : 6 9 7 ”»
. .
4 4? ϊ 7 ? 7 7
Ι 4-02 7 η 9.1 ‘Ί
4-03 6,2 53
ί 4-04 ί 9.5 9\5
I 4-05 •7 .£
• >
1 4-06 8.2 8,0
ι 4-07 6,6 6,7
: 4-68 8,1 Λ
1 4-09 63 '7,9
ί 4-10 35 8,5
: ·+- ί 1 6 ,5-
1 4-12 6,1 5 7
ί 43 5 ί 6,19 ; } 6,20
; 4 : 2Í 5,31 5,90 ....
1 435 7,17 6,30
ι 43 6 5.0? 7,00
ί 4~17 1 5,90 7,80
[ 4-18 8,57 8,10
; 4- ϊ 9 4. $7
ί 4-24 19,37 19,50
: ,<{„7 7 8,61 9,50
ί 4-23 Η,02 52,50
: 4-24 12,75 13,30
| 4-25 12,28 12,00
ί 4-26 :-363 ! - J 36
,·} ·γ.·/} 0 π ' 11.30
4-99 18,39 19 69
4-30 14,18 19,20
4-31 8.6? 8,60
4-82 o PA 0,80
4-33 3,OS 10,20
4-34 12,34 12,00
4-35 í 2 16 13,10
4-36 15,75 16,30
4-37 14,37 14,30
4-38 14,72 15,20
4-89 10,26 1 i .20
4-44 12,26 14,00
4-41 24.62 25,00
4-43 >7 7 </ 29,50
4-46 21,26 19,60
4 -47 22,08 23,30
4-50 15,14 1.5,50
El 4,74 4,90
E2 8,24 8,00
E3 5.10 5,30
E6 13,79 14,50
1·.$ 8,79 10,00
Eh 10,57 11,50
Eli 7,10 7,40
E13 7,65 7,30
E14 12,19 12,30
E15 6,47 6,14
E16 5.28 4,70
120 7,98 7,80
Adag 12,6 12,9
Meredekség 0,957
Ordtjáía-melszésptmí 0.84 35
í R 0,9927
Mim ebből az Osszehanonluási töblázatből látható., a megváRo/tatot· kiszereléssel a vizsgálat eredményei nagyon pontosak a kereskedelmi .forgalomban kapható íMx-vizsgálaíial óss-zeh-asonlítva.
lő, példa
Mfo.ítejéíiSSŐfikyik.tinmzaví ÓS byx nraractéikgúteíZtaAsa l-.böen a példában különböző detergensekeí íilkalmszümk EDlA-val együtt az Rí ko-mnonensekén.t Az EDI'A-rjí istneré hogy stabihxáéin ,· lipiárcsaecsknket. Λ óéinak onnét az. vált, hogy pontos eredményeket kapjunk zavaros minták esetón. Konkrétan a Srij-35 -és a Gettapol X-89 detergenseksi vizsgáltuk. Azt tapasztaltak, hogy ED'Fa 2.5 mM koncentrációban különösen hatékonyon csökkenti a zavarosságt változásoknak. kbszOnhísö, netrs specifikus ábszorbanoiacsökkenést, amikor Ifpétt:iás mintát vizsgálunk. A detcrgens koncentrációit is változtattuk. mint a 19. és 29. táblázatokban bemutatják. Az R I egy előnyős összetétele a 21. táblázatban látható. A Brij-55-őt 0,025%-han (Biti) adtak,, az EDTA koncentrációja 2.5 mM. Lipázt és «-eiklodextrinx nem adtunk a reagenshez, mível úgy fúrók ezek nem szükségesek a pontossághoz zavaros «tinták esetén, ha EÖTA van jelen, A Brii-aő-ö; (0,025%) az SR2-hoz (R3) is hozzáadtuk Triton X-ÍOÖ helyett. Ez kedvező csere lehet, mivel Triton XMOO-ai. egyes országokban környezetre ártalmasnak tekintik. A 22. táblázatban mutatjuk be sz előnyös, reageasktwpmtemekkei· végzett korreiáetós vizsgálat eredményeit.
19 táblázat Gcnapol X
Minta IMx (pmcd/l) Eredmények (pmoi/l): öeonpol X-89 koncentrációjának változása az RÍ-ben
0,1% 9.3% 0,5%
Alacsony 7,(19 6,31 6,19 5.94
Közepes 12.59 1 i ,96 11,48 19,5?
Magas 25,99 23,98 22,96 22,86
D919 14,3(5 14,38 14,59 14,11
Dúl 2 9,49 9,4) 19.60 9,50
D913 5,09 5,58 6,47 4,53
G9IS 2),29 23,85 25,93 29,92
PBI27 7.46 7,69 7,70 6,82
BB12.8 6,80 734 ·'· .· 7,19 5,96
PBI29 7,19 7,83 7,59 6,85
PB: 19 8,99 9,64 9,97 7,67
MAS! 5,90 4,63 4.45 4,15
MAS2 14,59 14,46 15,33 14,47
i ΜΛ83 L ™ - 23,19 22,69 23,67 23,65
i D913X2 2,59 2,45 2.46 2,17
i Átlag H ,37 ........................... 1 1.4: 11,39 ......;.................. 19.64
Minták
29. iáb lázat
Brtj-35 koncentrációjának változtatása Ri-ően
Ca-tcő eredményekígmobb Rí-ben .levő Boj-35 koncentrációjának iúggvónyéban
......%G>5%
..........
:Y%.........]...............!%46.........T 16%9..........i..............i 5A2.........*.............5 A.YíT
9,95%’ R 9.1% I 9,5%
.......................á................................I......................—
5.35 ; 5.2ó ; 5,99
♦ A
3 25.52 24,66 24.89 23,67 24.02
’J 6,-49 6,30 7,04 3,44 10.74
13 10,15 30,72 i 1.29 9,95 10,4.2
.21 4.62 -1-,36 5,04 5.73 4,96
.72 8.90 3,17 8.38 8,67 8.43
Átlag 10,59 30.81 31.28 11,09 11,32
2L táblázat
ÜBS/CS17LDH ciklusos rendszer: Reagenskoatpo-nensek
Vegyület Koncentráció
1-es reagens
TRÍS 250 rtfol
ADTA 2,5 mM
Szerm 1,295 tnM
L akláí-áe h iároge náz > 300 Ud
NADH 1,06 snM
Brij 35 0,025% ft/tí)
Nátn'mn-azid 7,7 raM
pH - 8,2
SR I -reagens
TCEP 26,3 tnM
$ R2 .-reagens
CBS 28,5 KUil
CB1. 9,4 K3J73
Glicerin 1036
Szűrőit 174
Ptrídoxiil-fc-szbit 5 pM
Nátrium-azíd 7,7mM
Kálium-foszfát i 00 raM
;dl - 7,6
22. táblázat
Korrelációs- adatok a lep jobb módosítással
: VliíiíS t i Ma. {tíiHol/Tl . ! . „ - -.................................... : Catch eredmény tpntolO) J -....... .......................
| ί : 5.90 ; 5J5
i 9 i 34,57 I 15,36
23,52.................. Γ..............................23?52 * φ *
701 17,95 17.03
702 11,51 11,55
j 703 11,8? 12,97
704 10,13 10.64
705 22.77 31,87
706 16,97 16,79
707 7 70 7,76
703 9,35 9.90
709 7.3.3 6,60
71 (ϊ 7,24 6,90
1 711 i 8,50 ί 1.......................... 8,54
i 712 19,93 19,00
-,5 0,82 6,04
715 6,91 6,93
716 7,35 7,05
717 9,44 9,26
7; 3 14,16 15,61
719 5,73 5.25
720 6,32 6,00
72: • 11,30 12,75
1 '22 16,23 17,55
723 11,77 12.11
724 5,59 9.72
1 725 10,17 11,48
t 726 6.69 6,14
i 727 1 8,01 Ϊ ............ ............................... 7,50
i 725 1 10,45 10,64
776 j 11,73 11,27
730 1 14,39 i.................................................................. J...... ..................................... 14,57
'731 í 8,61 8.76
732 i 7,50 7,67 .............
j 733 ; 7,35 i 7,56
i 734 í j 04 ;............................................'............................................................. i
i 735 1 8,39 1 7,91 .............................. 1
i Adag 10,79 : 10 9?
; Meredekség i 1,0035
i Ordínáía-ínetsiíésponí i L ...................................................................Á— -------- — ................................... 0,0195
0.0573
-h·'
» «
Amikor öríj-SS-tel és £ÖTA-vaf helyettesneiíuk Triton Χ-100-aí és 1ípázt és a-cüdodextrint, a zavaros minták ki» mértékben íeítUzáthak..-azonban.netn annyira, mint amikor lipázt és-a-eikiodextrint is alkahaaztunk. Fontos, hogy a 349 nm-néi mért .ahszorbaacia gyorsan stabilizálódott zéró változási sebességgel. így amikor sz SR2-t íE3) séfek, a plruvátlermeiédessebessége pontosan mérhető vc-k. és poe-os eredményeket kaptunk még oíyao minták esetében is. amikor a tnimák úgy néztek ki, mint a tej- Ez abban az esetben is így történi,, amikor az RÍ és SR2 ÍR3 i hozzáadása- közötti időt 2-4 percre csökkentettük, amely szükséges leket, ha a találmány szerin-i homocisztein-vtzsgáteim. más, automatizált készülékekre is alkalmazni kívánjuk.
11. példa
Reduímfoszgfeigk.jTCbPfee történő vákozfetásábéí és .a. TCbP koncentrátorának változtatásából νΑΑΑΜΑ eredmények
Ebben a példában a redukátószert, a DTE-t trísz-12-karbosietilfoszíini-hidrokforidáal (TCEP) helyettesítettük. A i'CEb-nek az az előnye, hogy hewa-bb ideig stabil irsz-úött vízben. A DTE-nek TCEP-vd történő, helyettesítése csökkentette a koatroílreaikctót 12-15 tnA/mimröl mintegy 4-5 mA/min-re, Az alacsonyabb reagenskoiitroíl a hnnwciaztéin-vizsgáktt precizitását fokozza. A boinociszteih-vizsgáia-tfeöz az optimális TCEPkoncentráci-ó eléréséhez egy konceatócRrtartotnányt vizsgáltunk. A kísérletből származó eredményeket a 23. táblázatban foglaljuk össze.
23, táblázat Változó TCEF-koncentrácíók az. SRb-ben
Homoeísztdn-eredményekfpmokl)
ISA 'Círteh vizsgálat.
SRI A 13 e Ώ E F
K (szerelés
MAS! 5,88 6,37 6,48 5,48 5,51 4,42 4,17
M.AS2 14,57 16,49 15,67 I 5,95 16,03 15,80 14,77
MAS3 23,52 23,19 21,98 25,33 25,11 24.62 23,09
161130 *? ó 1 s——' 5,31 6,24 7,81 8,00 6,95 8,53
P8Í22 7,8 7,61 7,66 8.38 8.69 -5,44- 8,23
013136 .5,1 4,16 4,6! 4,71 5.65 5,18 4,71
?8J39 1.6 5,11 4,25 4,18 4,47 7,i A 4.69
Doreet-70 v 7,33 évié 6.64 6,7! i 6,23 0,43
i Át híg 9,50 9,17 9,15 9.58 10,02 9.34 9.22 ......................
T-CEF koncentrációk:, A 6.3 saM, 13 ··· 13.35 roM, C ··· 26,44· -uM, 1)32,74 isM. £ - 39,03 mM, F : 52.88 írM
12. példa
6.Ak5.:;Xb.A:gk:vSlgpLtörfenbgjj;<:Agrbegusxg3mgm4fomvzgm:erpAuy/;Mfeb!b!,AJ;s-ás;i Ahhoz, kegy az enzimkeverék i-oss/séb ideig stabil maradjon és a vizsgálattal összeforhető legyeit az emőmkiszerelest égy változtattuk meg, hogy szignifikánsan hosszabb legyen a eltarthatósági ide-e, mint az előzi- kiszerelésnek. A szigeuikáiis változások ;t írA-pebérnek foszíáttal történő helyettesítése és glicerin hoz.50 «Μ *
Átadása a pulfetbez. A kálium-foszfátot 50 mM és 500 ®M közötti koncenteációtartornányban alkalmaztuk .pH 7,ö~nái, a glicerin koncentrációja pedig 0,5%-töl 15,Ö%-ig frf’tf) terjedt. A változásoknak köszönhetően a eltarthatósági idd szignifikánsan nőtt hetekről több, mini egy évre. 4c€-e«. Előnyös esetben a kál'iure-fbszfáíot mintegy 50 ·ΐίΜ és mintegy 250 mM közötti .tartományban sójuk. Előnyösebben a kálium-foszfát mintegy 75 ntM és mintegy 15b mM közötti tartományba esik. A kálíam-fosztát hatékonyabb koncentrációja ebben a kísérletben 100 mM. A glicerin kooeentrációja mintegy 1-155¾ között tehet. Előnyösebben. 5-3 37¾ között. A glicerin hatékonyabb koncéotrációja ebben a kísérteiben 10%.
53. példa
Kölötibözö.keyzinekekkeLgyert eredmények
A vizsgálatban történt vaianrerrnyi változtatás átfogó javító hatásának vizsgálata érdekében pontossági értékelést végeztünk különböző készülékeken az adott készülékre jellemző kiírási módon. A 24. táblázetöatt ί·η·!:;ι·_ίη1< be a találmány szerin! alkalmazott paramétereket és beállításokat Rocké Hitachi 9í í készülék esőiében, és a 2:5.. táblázatban pedig ugyanezen paramétereket és beállításokat, amikor Seckmatl·. CX-5 készüléket aikahnaztünfc. A következő táblázatban pedig a pontossági vizsgálat eredményeit· matatjuk be. Az eredmények.
szignifikánsan jobbak, mini amelyeket a vizsgálat korábbi kiszereléseivel kaptunk. A Hifachi 9! i <26. táblázat) és a Bcckman CXS (27. táblázat) készülékeken mindegyik tafotát 20X futtattunk, és-a futtatáson- belüli pontosságot is meghatároztuk. Az 3,92 (tracfo) koncenttáciöjá minták esetében· a százalékos CV 3,31% volt és 23,01 μχηοΙ'Ί és 25,4 pmol/l közötti tartományban lévő· minták esetében 1,9-2,03%. Cobas MíRA Bhis készüléken 4,6 pmoVl és 27,0 ameí/í bomociszteln-értékő mfotákkaí 7,3% és 2,6% közötti teljes pontosságot kaptunk (28.
táblázat}. Mindegyik mintái két ismétlésben mértük, naponta kétszer, összesen 20 .napon keresztül.
24. táblázat
CatclC bomodsztern-eljárási paraméterek Roebe /«íwcóí 9/ 7 készülékre
Vizsgálat THCY
Vizsgálati kód Rate-A, 15
ΐ kdiéítews-.z (Másíxkk/dsö) 3 76/340
Vizsga lesi pont 3 5-49 -í)~Ü
Szérum
V; téri; <S. Vol.j (Normái) 28
VI íért' (Csökkenő) 20
M. tért. -(Növekvő}· 30
!
Vize lei i
XI. téri < Normái) 10 i
%, téri' 1 Csökkenő} '-·:. tőrt {Növekvő) •.BS Limit
Prozonc for; ··
Í0
......... ÍF..............
ö-ö-Csőkkenés
O-O.-Atocsimyifob ♦ X ♦ ♦
....
Reagens
TI 200 ^1-0-0-00222-0
U. 25μ|-0-0-00322-0
k> 0-0-0-002 2 2-0
Kalibrációs típus Lmeárss-2-2-0
.AuKíFíms Out :...........................................................................
ΐ If Vo-nateztatás ( B'bn&Íy> k .............. 0
| SpmY 0
Poiöf -0
Teljes 0
Autó Change
Vő;'· Nem
Bostle Nem
Vszsgála; kiválasztása a kktviatárátt ENÍi-R
SD limit •00
Kétszeres limit 1000
Érzékenységi limit 0
SÍ ABS limit (-22000)(22000)
Kompenzált Ιί-πΟ Voaaíkoztatás (”blank”)
ÜAKAMETEROÍ..DA1,2
Vizsgálat THCY-00322
Vizsgálat ne ve THCY egység: úrnőid
Adairrtód On Board
Jelentés neve «össecísztein
Kontroli táötöz 0
Készülék faktora ( Y:: aX-t-b)
a 1
b 0
! Vért értékek
Technikai ihtt.it
Szerűm
Vizelet
STO
O-iOOOO
(..iipogií) jgOOOpU)
Ko.ftc.-?dz--Mhste-Pre,-Híg.-.Kai-ib.
0.0- Ϊ 3-25-6-0-501
25.2· 26-25-0-0--026 tíAJ φ»
XX * * * ♦ **
X * Φ X * φ » * X * » Φ * φφφ XX ΦΦ XX
3 0
4 0
$ 0
6 c>
Ennél a kisérlemé! a Ti-et Rl-nek és somnentesített víznek 9:8, i .arányban történő keverésével készítettük. Λ12- és Tő-reagensek az SR1 - és S-RS-reaget^etesk letelnek meg.
25. táblázat
“CatcSC homocísztein-eljárási. paraméterek jRecáms CEO készülékre
Kémiai név HomocíszK-íxi ’
Vizsgái»:. neve Homo
Számolási faktor ő
Reakciót tpns RATiG
Matematikai modell Lineáris
Számolási idő korláüa 24 óra
Reakció iránya Csökkenő
Kafibrátorek száma ·>
Egységek: pmoid
T izedes· pontosság X.XX
E Hőd leges hali ámhossz .54(1 ntn
Másodlagos dollámhossz CIO ntn
Málta térfogata 25 pl
Elsődleges injekt. rgs.
A 179 μ|
8 22 pi
Másodlagos intetet, rgs
C 14 pl
Hozzáadod idő 592 sec
NÁLÍBEÁLÓK
dl O.GŐ
42 24,8
TÖBBPONTOD DEAN'
• -2: E.OE
REAGENSHEZ VONATKOZTATÁSI PONT
COLÁNK”) ......................
Kiindulási leolvasás· Í CÖ se c
: Végső leolvasás 200 sec
Alsó ABS kodig -1.5 •r-x ***'♦ χ χ Φ
Feüö A SS korlát 1,5
ALKALM.ÍZHAí^kÁR'rOMÁNY
Alsó korlát 0.00
Felső korlat 99990,0
SZUSSZTRAI KIÜRÜLÉS
Kezdeti sebesség -09,999
Delta ABS 1,5
Ebben a példában a Reagens-A-t Rl-oek ionntentesiíett vízzel arányban történő keverésével állítottuk elő. A Reagens-B és ·€ a Λ/ΖΑΑ SRÍ - és SR2-te.ageosnek felei meg.
26. táblázat Futtatáson belüli pontosság/·/&<« 7« 9//-®él
Futtatáson belül
Alacs-uty Átlag ··· 3,3 ntnobl Stá. Dev. 0,224
%e.v. 2.17
Közepes Átlag -- 11,9 gmokl Síd. Dev. 0,324
AÜ.V. 2,7!
Magas Átlag 25,4 untok! Síd Dev. 0,516
%C.V. 2,0.5
2?', táblázat
Futtatáson belüli pontosság &?<.'átwon Aád-né!
burtatásoí: belül
Alacsony Átlag 5,92 úrnőid Síd. dev. 0.196
%c.v. 3,21
Közepes Atltsg 11,12 íiítKtS/í Síd. Dev. 0,195
%CX 1,70
: Magas Átlag · 23.014 ptnokl Std. Dev, 0.437
í 7::C.V. ........................... ... ...........................................L ................... ........... 5.90
23. táblázat i Teiies pontosság Roche· A/ZKÍ 1
1 Futtatáson 1 Futtatás kő- Egy nap múl- 1 Felles 1
1 beiül 1 zőtt ....................................I..................................t..................... tán I
Aktesttny Oib.öev. j 0,31 t 0,14 0,04 1 0,34 1
Μ» «
Adag - 4.6 tűnőid
%c.v. 6,6 3.1 0.8 7.3
Közepes Átlag:: 5 1 .6 rouoiI Std, dev. 0 40 0,0$ 0,23 0,47
... ~................... %c.v. .. 3,5 0,7 2,0 4,0
Magas Átlag 27.0 ymold Siö. dev. 0,44 0,39 0,39 0,71
: ...... A.C.V. 1,6 ;.5 1,4 Xö ........................
£4. példa
A találmány szerinti módszer olyan rendszerhez -is alkalmazható, amelynél csak két reagenst használjak. A találmány tehát készülékek széles körére adaptálható·. olyanokra is, amelyeknél csak. két. reagens használható, A 29, táblázatban a kétreagemes rendszer reagenshirtalmát mutatjuk be, és a 30, táblázatban pedig azokat a MZ&tl plus paramé'tereket matatjuk be, ahogyan a vizsgálatot végrehajtottuk ezen .a kémiai analizátoron. A 31. táblázatban mutatjuk be az összehasonlítási adatokat, amelyeket a 3-reagertses rendszernek a 2reagemes. rendszerrel történő szembeállításával kaptunk.
29. táblázat CSS/Ü8L/1.DH ciklusos rendszer: Reageus&otnponenssk 2-teagenses rendszerre
Vegyület Koncentráció
1-es reagetts
IR IS .............................. ................. 250 uiM
EDTA 2,5 mM
Szerin 1,295 mM
Laktát-dehidrogenáz .'·· 800 U 1
NADll 1 .06 mM
Brij35 0,025% pf ;C
Násrktuí-azjd 7,7 iaM
TÜEP 4,05 mM
pH - 8,2
: SRÍ-mtgens ..............................................—............................... ........................................................................ „
CBS 28.5 KUi
: CBL. 9,4 KU/I
? Glicerin 10%
; Szerbit 1...................................................................................................... i -2/
Piridosál-foszfát 5 . M .....................................................'................................................ ..
NákhíUi-azid
7,7 ü)M * >
Kálium-tesztet lói) m.M pH -- 7,6
30, táblázat CBfoCRLLDH ciklusos rendszer 2 reagensre: -Gáza· .μ'ΛΑ.) paraméterek
Paraméter Beállítás Paraméter Beállítás
ÁLTALÁNOS
Mérési mód Absorb ( Ahszorb,) Covets faktor Lót)
Keake törnéd E-S-SRí Ofíset 0,00
Kalibrációs mód Linear regressten (Lineáris regresszió)
Reagensvonafkoztetás Reag/Soi (Reaganig.) Vizsgálati «adomány Alacsony Be
Fiszíiíó Nem Magas Be
Hullámhossz 340 zun Normál tartomány Alacsony Nem
Tizedes helyzet 2 Magas Nem
Egység úrnők l
Lépések száma 1
VíZS’ŐÁLAT
PosztdiL faktor Nem Kaik. lépes Á Kinewc LKinetifcus):
Konc, lüktor Néni Kis» leolvasás ló
Utolsó leolvasás 20
Mintaciklus i Reakció-kúriát Nem ................—
Mintatérfogat 20,0 td
Hlgitószer neve Víz
KALIBRÁCIÓ
térfogata 45 td Kulié. Idököz Minden futtatás
Reagensctklus L-............................................... Vonatkoztatás Sol- Pos I
i Reagens térfogata 137») _________________ Reag, tartomány ala-1 Nem esony 1 . ......................’...................i...........
i ; Magas Nem
1 Start RI eikUts : G Votestkeztatás) tartomány alacsony Nem ..................
; íerfogal 13 ul Magas Nem
II ígifoszer neve Víz
Rrfoí’im • Í Ö td Standard helyzet 1
5é
i 0,0 utno.bl
SZÁMOLÁS ....... ......... > Sp μηιοίί .....ί
Mintáké rUí. Nem Λ 17.2 uraol/l
....................................................H Reake. irány Csökkenő 4 25,2 umol.'l
uikttérzés Ki 5 43,0 ttmol/l
Atttigéat&isüly Nem 6 Nem
,· Nem
Ismétlés Kettős·
Eltérés
-
Korrekciós síd. Nem
Kontrol:
CS1 -helyzet Nertt
£S2-hel'yzet Nem
CSa-beiyzel: Nem
31. táblázat
2-teagenses rendszer összehasonlítása 3-reagettses rendszerrel
M imák !Mx (úrnőid} Qtteh iné. Honioe iszt, vizsgálat {UittOÍ/í}
2-reagenses rendszer 3-reagsnses· rendszer
M.Abl 5,88 8,55 5,1.7
MAS2 14,57 16,14 15,70
MAS3 23,52 21.99 23,47
P 10 8,9(1 9,32 9,65
p u 7,60: 7,45 *7 7?
P 33 7,30 8,11 t 8,29 1
j P 34 5,93 5,21 5,69
1 754+343 16.00 t5,68 16,15
ΐ Átlag 11.28 11,43 11,42
13, példa
\.59kdomm..Acrpk;j;o:rt!v3er^dp;p:alCiüy3ma+myppeK+jp;réb;;á;mré;mjór:eíu>.aika;n)::zasrp
Ά taiáhnány szerinti homociszíetn-vizsgáíatot egycíiet; kalibrációs pont alkalmazását; is adaptáltuk, sbo; a seré kalibrátor szolgái keretre íiként. Az aiábin 32. táblázatban mutatjuk be az egyetlen kaisbráetömmtos mérés ps-mmétereií .17761.4 készülékem Λζ alábbi adatok :(33. táblázat) mutatják, hogy egyetfen kalibrációs perei Nkalmazásával 'Alapé average1* üzemmódban íMerrdcksógátktg üzemmód) a íöbbpemos kalibrációs görbével lényegében azonos credményéket kaptunk.
33. táblázat BNCSL/EDH eikhísös rendszer: Coréí.? 3/írM paraméterek egyetlen pontos kalibrációhoz
Paraméter 1 öeáfofo» i : Paraméter .................................1 Beállítás
ÁLTALÁNOS i ; i
Mérési mód Absóré (Ahszorb.) Covers faktor 1 ,00
Reakció-mód R-S-SRI Olíset 0.00
Kalibrációs mód Slope average í Meredekségátbg
Reagens vonatkoztat ás i Reag/Sol (ReagTblg.) Vizsgálati tartomány Alacsony Be
; Őszutó Nfoes Magas. Be
Hullámhossz 340 nm Normái taftoniáí-y Alacsony Nem
Tizedes helyzet 2 Magas Nem
Egység guioiéi
Lépések .száma 1
VíZSOALAT
Posztdii. iaktor Nem Kaik,, lépés A. Ki-netse (Kinetikus)
Kófic, Okmr Nem Első leolvasás 19
Utolsó leolvasás 30
Mmíarékliis 1 .Reakciókorlát Nem
.M'íntstóriógat 20.9 μ;
Higítoszcr neve Víz
KALIBRÁCIÓ
Térfogata 45 μί Kfilib. időköz Minden juttatás
Reagenscikltzs 1 Vonatkoztatás Soi-Pos 1
Reagens térfogata ré7:í>! Reag, tartomány alacsony Nem
i Magas Nem
ΐ Start RÍ ciklus 16 Vonatkoztatási tartomány alacsony Nem
Térfogat 13. ul Magas Nem
Hígitószer neve Víz .........................
; térfogata 10 Á Standard helyzete 4
ί Í 1 y 4 25,2 Í.Linoí/i
SZÁMOLÁS X................................................ 7 ... Nem
i..................................................... : :'Ν<7ϊΠ :................................................. 3 Ne.m.
1 Reuke. irány ; Csökkenő ismétlés Kettős
« ♦ ♦ ♦•♦•Μ
Ellenőrzés Ki Eltérés
Aaögért-úlsúly Nem
. Korrekciós std. Nem
..................
Kontroli
CS)-helyzet ..... ................. Nem
CS2beíyzet Nem
CS3-heiyzeí Nem
3.3. táblázat
Egyetlen pontos kabbráció- öaszebaso-nl-ítása többpontos kalibrációval
Minták IMx : :.irs:<>l. I) Catch''* Inc. Homoc-iszt vizsgálat {utnol/i}
Egypontos kalibráció Tőbbpontos kalibráció
MAS! 5.88 5.0.) 5,17
MAS2 14,57 15,18 15,70
MAS.) 23,52 22,07 23,47
PBslO 8,0(5 8,82 0,65
EBI 11 .60 8,26 7,27
ESŐ 3 7,80 8,05 8,20
ES134 5,03 5,80 5.60
754-:-848 16,00 15,1? 16,15
Átlag 11,28 11,16 11,42
16, példa rsyozása·
Λ WO 00/28071 számú nemzetközt közzétételi iratban részletesen ismertetnek két homociszteinvízsgáiatot. Az első megvalósítást mód szerint a vizsgálatot redukálás! lépés nélkül hajtják végre. Ennek az eljárásnak hismánptena homoci-szteinAartalmának mérésére alkalmas eljárássá fejlesztéséhez vagy egy külön, készüléken kívüli C’öfElimA}, vagy -egy homogén redukciós lépést kell beépíteni·, Λ Wö 00/28071 számú nem10 zeiközi közzététel! iratban egy knlöm készüléken kívüli CAfOlme”) redukciós lépést írnak le. valószínűleg azért, mivel pimvst-oxidáz ciklusos rendszert alkalmaznak. Ez a lépés 20 perces inkubációt jelent a redukált minta vizsgálata előtt, amely jelentősen .megnöveli a teljes vizsgálati idd: és a íahnrköhségeket. 'Továbbá, ha a mintát egynél több vagyületre is vizsgálni ki varrjuk a klinikai laborstórtnmban. az elsődleges szérum- vagy píazmamintát két részre kell osztani, egy a femocisztem-vizsgálatboz és egy a másik elrendelt laboratóriumi teszthez.
! 5 Ezzel szemben: a találmány szerinti vixsgákésal homogén..redukcióra ttyiiik leh-etöség, mi vei LÍ3M cikiu-ios rend·.szert alkalmazunk (7. példa),
A i:>. példában Ü4, táblázat) kimutatjuk, hogy DTT gyakorlatikig befolyásolj a pirnvat-osidáz kimuta-ást rendszeré amelyet a WO 0(328071 számú aet-rzetközi közzétételi irat második meuvalósitási módjában * * ♦ ismerteinek. Konkrétan a második megvalósítási módban ismertetett reagenst és DTT készítményeket alkalmaztuk. és a vizsgálatot DTT-vel és DTT nélkül hajtóműi végre Ismert piruvát standardokkal (12,5.. 25 és 50 tűnőid) Cíd’íís Adód készülékkel, Λ DTT vizsgálat esetében mindegyik standardból 40 μί-t 30 pl DTT-oldattai kevertünk össze, majd 109 másodpercig inkubáltak. Ezután 90 p.{ piruvát-oxidáz reagenst adtv-nk hozzá, és további 30 másodpercig inkubáltnk. Az abssorbanciát 30, 99, 09, 120, 150, ISO és 210 másodpercenként olvastok le. A DTT nélküli vizsgálatban ugyanezt a módszert követtük, -csak DTT nem adtunk hozzá. A 34. táblázatban mutatjuk be ennek a kísérletnek az eredményeit 2 lő see-es leolvasásnál. A vizsgálat eredményét a 15. és lő. ábrákon ts szemléltetjük.
34. táblázat
DTT Íratása PO/HRP piraváí kifimutási rendszerre
............................................... ........... DTT nélkül DTT-vei
K.oniroil 0,992 i -9,992!
Faktor 2212 -11705
59 ptnol/l Standard. 5L5 35.5
25 pmolZl Standard 24,1 9.9
í 2.,5 omold Standard 9,7 -21.2
Λ változás 39 see-séí (50 ptnö-l síd.! 0,9943 »0,09ö.2
A változás 09 sec-nél |50 púról síd.) 9,0809 -0,9103
Δ változás 120 sec-nél (59 ömöl Ad.) 0,0903 -0,0-113
A váhozás 219 see-nél (59 prnól siti.) 0,0999 -0,0113
Az adatok nyilvánvaló»;} bizonyítják, hogy a WÖ 09/28071 számú nemzetközi közzétételi írat második megvalósítás} módjában leírt, külön redukálást. lépés valóban szükséges. A redukálószer jelenléte befolyásolja a pttuvát vizsgálatára alkalmazott piruváé-oxidáz kimutatási rendszert. Az itt bemutatod adatok bizonyítják, hogy az időigényes, külön, készüléket! kívüli oiTline redukció» tépés lényeges a második megvalósítási módban. A WG 90/2397 i számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett készüléken kívüli otT-líW redukciós lépés továbbá valószínűleg szigniilkánssin növelt a vizsgálat összetettségét és a költséget a találmány szerinti vizsgálathoz képest.
Az előzőekben Diri találmányt részletesen ismertettük ábrák és pékiák segítségéve! a jobb érthetőség kedvéért, azonban ayilvánvaló. hogy bizonyos változtatások és módosítások végrehajthatók a mellékeit igénypontok oltalmi körén belül, Λ találmány Oltalmi köréi tehát nem az előző leírás határozza meg. hartem a mellékeit igénypontokkal határozzuk meg az ekvivalensek íeljes körével egyetemben.
A szabadalmi bejelentésben idézett valamennyi publikáció -és szabadalmi irat a leírás részét képezi teljes tetíedelmébea ugyanúgy. mintha tninden egyes publikációnál vagy szabadalmi íratnál egyedileg jeleztük volna.
SZEKVENCIAUSTA
Λ szekverrcialis-tában szereplő kötetlen szövegrészek (223-as kód) fordítása:· <2tÖ.> ;
<223> OCR iá-rcmdifo <223> A mesterséges szekvencia leírása: OCR láncíxtdító <2tö> 2 <223> OCR tá-rcteáííö <223> Λ mesterséges szekvencia leírása: PCR láncindító
1Ö <2tö< 3 <223 ·' OCR láncírtditö
3> A mesterséges szekvencia leírása: OCR láncíadító <2 tÖ> 4 <223> FCR tánemdító <223> A mesterséges -szekvencia leírása: OCR íáncísdító •A: 10- · 5 <223> P€E íáaemdkö <22 3 > A. mesterséges szekvencia leírása: K?R. iánemditó <2i0> 6 <223'-' PCR láneiádító <223> A .mesterséges -szekvencia leírása: RCR. iáííejsidkö <2:Ö> 7 <223> ?CR láaeiixilt-ö <223-' A mesterséges szekvnttcra tóítása: FCR íáncisdító25 <21 ·.> 8 <223> FCR skseóxirtó <223> A mesterséges- szekvencia imrástt: PCR láncindítö<2iO> 9 <223> OCR íáncinditö <223> Λ mesterséges szekvencia leírása:: OCR láncindító <2IO< 10 .223- OCR Íáncínditő '235'- mesterséges szekvencia-leírása: PCR íáncínditó <21ö< 1i
-22--- Kcmsxetizas MetR receptor szckvertcm <223> Λ mesterséges szekvencia leírása. konszenzus MetR receptor szekvencia <2 IC» 12
223< PCR kmcíiidité <223< Λ mesterséges szekvencia leírttsa: <2 lánc-indító ♦ * <21ϋ> 13 <222> PCR teBcitidiíő <223> Λ mesterséges' szekveaön leírása: PCR láridadkó <!·<·· 15 <2B> i?-CR lánc indító <223> A mesterséges szekvencia leírása: PCR íánsóiiáitö <2lO> ló <223> FCR iáíteiífeitó <223> A mesterséges szekvencia leírása; PCR láaeindsló 10 -210:- 17 <223;· POR iáíteirensó <223> A mesterséges szekvencia leírása; PCR láacíríiído <2H> 18 ;223> PCP. láacíiKíííó <223> A mesterséges szekvencia leírása; FCR lánc indító

Claims (5)

  1. SZABADALMI! IGÉNYPON TOK
    I. Enzimes, ciklusos vizsgálati eljárás homocisztein és/vagy cisziatioom oldatban lévő mennyiségének megállapítására, oerré><mezve. hogy:
    5 a) boraoéisztemt és/vagy c (sztárén? int tartalmazó oldatot érintkeztotünk, reakciókeveréket létrehozva, eisztatioíiiréő-szmtázzal vagy származékával, E-szerisne! és clsztaíioam-p-házzsl vagy származékával elegendő ideig ahhoz, hogy ^homociszteinnek ciszta&oninná és cisztatórisnak homociszteinné történő ciklusos átabkniását és visszaalakulását kataüzáltassuk, amelyet piruvát és ammónia termelődése kísért
    b) meghatározzak a piruvát és/vagy az ammónia mennyiségét areakciőkeverékben; és lő e) megáiiapitíak az oldíttbtm lévő homoesszteín és/vagy ciszístfenifi mennyiségét -a termelődött piruvát és/vagy ammónia mennyisége alapján, aszré je/feí/avve. hogy a hcmoeiszíeiní és/vagy ersatationint tarJaimazó oldatot foszfát rednkátószetref, előnyösen tríalkil-feszfin tedukálószerrej kezeljük az (apie) lépesek-előtt elegendő ideig, -miáltal a rsdukálőszerrel redukáljuk az oldalban taláiható temociszhrin lényegében teljes mennyiségét.
    15 2. ?kz 1. igénypont szerinti eljárás, azzalfe/feföesve, hogy redukálősze-fként tributiLfoszfint vagy írisz(2-karboxietiBíósznuí (TCEP) alkalmazunk.
    3. Az 1, vagy 2, igény gont szerinti eljárás,. oEsré/e/temesw, hogy csuk két reagenst alkalmazunk.
    4. A 3, igénypont szerinti eljárás, nsea/ye/fewsve. hogy egy első svakéIókeveréket állítunk elő, amely tartalmazza a mintái és egy első reagenst, amely tartalmaz L-szertoí, lakíátréehidfogenázi (LDH-í) vagy annak
    20 származékát, NADH-t vagy annak származékát és a redukálásáért.
    5. A 4, igénypont szerinti eljárás, azzal jettewtzvé, hogy az első reakciókeveréket adott Ideig inkubáijuk, miáltal lehetővé tesszük a m-m-tábaa. levő, kötőit, oxidált és/vagy szabad állapotban levő homocisztein túlnyomó részének, előnyösen lényegében egészének a felszabadulását.
    6. A 3-5. igénypontok bármelyike szerintii eljárás, cserré /réfemezve, hogy az első reakciókéverékhez .25 eisztarionín-p-srintázt és ctszíatítmin-b-liází adunk, előnyösen egy második: reagens tormájában, miáltal teljessé tesszük a reakciókeveréket és eriniditjnk .a tonocisztein és/vagy a ciszterien enzimes ciklusát.
    7. Az Lő. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, aeeré .iré/cfaervc hogy az :E-szerint a reakdökeveréfchez legalább mintegy ί μΜ és legfeljebb mintegy 59 mM, előnyösen legalább mintegy 19 μΜ és legfeljebb mintegy 40 mM végkooceatráclőbtas adjuk hozzá,
    30 8. Az 1-4. igény porsíok bármelyike szerinti eljárás, térré Jdfeíuezvo hogy a piruvát mennyiségét plruvátnak laktátiá történő enzimes átalakításával határozzuk meg, előnyösen.
    a plruvátnak laktátiá történő átalakitásáí iaktát-dehidragenáz vagy származékának és NA.OH vagy származékának hozzáadásával végezzük., ahol előnyösen: a iaktát-debscirogeeazt a reakojőkeverékbez legalább mintegy 30 U/l és legfeljebb mintegy SŐOÖ U/l koneentrációban, előnyösebben legalább mintegy 3G Ll/I és legfel 35 jebb mintegy 3009 U/l végkoncentráclóban adjuk hozzá.
    9. A 8. igénypont szerinti eljárás, hogy a NADH-t -a reakelőkeverekhez legalább mintegy 0,1 mM és legfeljebb mintegy 2 mM végkoncmráoióban, előnyösen legalább mintegy 0,1 mM és legfeljebb mintegy 1,5 mM vegkoncerérácíóbsn adjak hozzá.
    W. A 8. vagy 9. igénypont szerinti, eljárás, azzal Jelteixezve, hogy a N'AÖH' vagy származéka NAD->-vá 49 vagy származékává történő oxidáció társak teljes mennyiségét a NAD+ vagy származékának olyan festékkel törtéI no reagáhatásával határozzuk meg, amelynél ox i dáció esőén szín változás történik.
    II. A ÍO. -igénypont szerinti eljárás, ozzed ye/femerve, hogy festékként az alábbiak bármelyikét aikaímazzuk: 5,5Mttí{i»sz(2-sitfobe»zoesav), 2 .ő-dikiőrfcnol-haló fenol, tetrszóimmvegyűíei:, iénazin-fn.eiöszulfák metii-vioiogm vagy ezek .származékai.
    5 12. Az l-ö. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azza! jeilemezve, hogy a piruvát mennyiségét piravátnak hídrogén-perosidsá történő enzimes átalakításával határozzak: meg, ahol előnyösen enzimként plruvál-ovidází alkalmazunk, és/vagy előnyösen a vizsgalatban peroxidázi és. vízben oldható bidrogéndonoó: is alkalmaznak, amely hidrogén leadása esetén stabil, spektroíbiometriásan kümnathafó-. színes- terméket hoz léire.
    10 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, or-rá/íAeme-ve, hogy az eljárás során vízben oldható hídrogéndonorkeai N-aikil-N-sznlfenropilsnilm-szárínazékot alkainiazsnk, amely előnyösen N-eíil-N-í2~hidroxl-3sza ifbpropt i)~ro-tolasd in.
    14, A 2. igénypont szerinti eljárás, asstül- jeüemezvg. hogy a TCEP-t legalább mintegy ó és legfeljebb mintegy 53 mM koncentrációban alkalmazzuk.
    15 15. Az l-ö. igénypontok bármelyike szerinti: eljárás, azso/jefosme. hogy az ammónia mennyiségét amméníaszenzorrak oiiteodífíoziós vizsgálattal, kolorimetriás vizsgálattal vagy enzimes vizsgálattal határozzuk meg.
    ló. Az 1 -ő. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, erem.ré/tömaeva, hogy további lépésként az oldatot eísztationín-y-iiázt vagy származékát tartalmazó reagenssel kezeljük. elegendő ideig ahhoz, hogy minden, az oí20 dalban lévő císztotionint a-ketoglutaráttá alakítsunk, ahol előnyösen- a kezelési lépési az (ai-(e} lépések -előtt végezzük.
    17. A 16. igénypont szerinti eljárás, a~~o/ yetenew, hogy további lépésként a cisztaíionin-y-liáz. vagy származékának lényegében teljes aktivitását megszűntetjük a kezelési lépés «ián és az (a)-(el lépések, előtt, ahól előnyösen a ciszíafionin-y-liáz aktivitását hőközfés álján szüntetjük meg.
    25 IS. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, orra/ jettemezve, hogy a clsztaíionln-p-szintází vagy származékát, vagy a eisztatioRin-^-líázt vagy származékát eukarióta vagy prokaríőta sebből izolált kivonat: formájában adjuk, ahol előnyösen amennyiben kivonatot eaksriőta sejtekből izoláljak, az eufearióía sejtek élesztőseiteket tartalmaznak, és előnyösen az élesztőseitek .Saceáoroímvxte earevAhiet tartalmaznak, vagy
    3 b amennyiben a kivonatot pfokarióta sejtekből izoláltuk, a prokarióta sejtek hakiériu mseiteket tartalmaznak, és előnyösen baktóriuínsajtskkéní Esekerichfa cott, ffenKfjp&ifas /n/ferenrae, Abwzoóbnfí fegwnínasűra»?,. vagy bonive/m avitití! sejteket alkalmazunk, ahol előnyöseit a eiszíaíiordn-iS-szinrází vagy származékét vagy a eisKístioösn-lAliází vagy származékát lényegében izoláljuk a kivonatból.
    19, Az 1-1.7. igenypoatok bármelyike szerinti eljárás, özzu/ feífemecve, hogy a eisztstíonin-R-szintázt
    35 vagy származékát, vagy a cisztatiomn-b-Házt vagy származékát a eiszíatirsnin-iJ-szintázt vagy származékát, vagy a ciszts-íonin- ő-líázt vagy származékát kódoló gén rekombináns expresszíójávai állít jak e.lő, ahol előnyösen a eisztationimb-sziniází vagy származékát, vagy a eisztatíomn-ji-liázt vagy származékát fúziós fehérjékéi!· állítjuk elő, ás ahol előnyösen a fúziós febéíjéi olyan rekombinánsnn előállított génből expresszáljuk, amely csszaalionin-fj-színíáz·. vagy származékát kódoló szakaszt tartalmaz: ciszóationin-p-Iiázt vagy származékát kódoló * « 4 * « A
    «. A Φ ♦ X « « »
    4 4* 4 4 * * * Jf * *
    «.♦. ***» «·< * »* gént tartalmazó szakaszhoz működőképesen kapcsolt módos.
    20. A 19. igénypont szeriud eljárás, űssöZ fet/emezve, hogy a fúziós fehérét szilárd hordozón immobi llzúlj uk.
    21. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, az~<«'yeífewzve, hogy a eisziadmbn-jS-szmiázÍ 5 legalább mi.niegy ö,l KU/I és legfeljebb mintegy löd KU/I, előnyösen legalább mintegy 0,5 Kl.l/1 és legfeljebb mintegy 75 KTöl közötti végfetneettbsfejóbasr adjuk, és/vagy a císzlatíomsr-;3-tíázé legalább mintegy 0,01 KIVI és legfeljebb mintegy 11)0 KU/I, előnyösen legalább mintegy 9,05 KU/1 és legfeljebb mintegy 50 KIVI végkonceutrációban adjuk,
    22. Az 1-21, Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ííízííí jellemezve. hogy- a reakeiókeverékben nuf10 fen. is alkalmazunk, ahol előnyöset!
    pallérként olyan ptriJérí alkalmazunk, amely a reakeiőkeverék pH-ját mintegy 7 és mintegy 9 értékek közöst tartja, és/vagy pnfferként HEPES-k TfelS-t vagy foszfátot alkalmazunk.
    23. A 22. igénypont szerinti eljárás, ahol púderként TRIS-í alkalmazunk, előnyösen TSJS-pnlfert pH
    15 8,4 értéknél.
    24. A 22. vagy 23, igény pont szerinti eljárás, ..mafjefasesve. hogy egy további lépést is alkalmaztmk, amely sósán glicerint adunk a pufiérhez., ahol előnyösen a puffért legalább mintegy 0,5% (tf/tí) és legfeljebb mintegy 15.0% (tföí) koncentráciőbas! alkalmazzuk.
    25. Az 1-24. Igénypontok bármelyike szerinti szerinti eljárás, özzn/yfefemezve. hogy további lépésként 20 az oldat szavatosságát csökkentjük, előnyösen azáltal, hogy az oldatot íipopreteioí feltisztító anyaggal érintkeztetjük, ahol előnyösen
    Ilyen anyagként lipázt és/vagy a-cikiodextrint tartalmazó anyagot alkalmazunk, és/vagy a lipoprotemeket feitisztiió anyagot a reakeiokevsfekben alkalmazzuk.
    26. Az 1-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, öeső/ jellemezve. hogy a reakeiókeverékben 25 detergenst ís alkalmazunk, ahol előnyösen olyan detergenst atkalmazmrk, amely csökkenti az oldat zavarosságáí, és/vagy detergensként Triton X/ I ÖÖ-at, Rrij-35-öí vagy öenapol X -§Ö-a· alkalmazunk.
    27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy detergensként Oenapol X-kŐ-sí alkalmazunk, előnyösen legalább mintegy 0,055··« es legfeljebb mintegy 30 0,5% pmöí/1 közötti koncentrációban, és/vagy detergensként Brij-35--öi alkalmazunk, előnyösen legalább mintegy 04113¾ és legfeljebb mintegy 11,5% umol/i közöst! koncentrációban.
    23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzizljellemezve, hogy a reakciökeveréklxm foszfátot is alkalmaznak, előnyösen legalább mintegy 50 mM és legfeljebb mint35 egy 500 isM koncentrációban, és/vagy a reakeiókeverékben EÖ'TA-t is. alkalmazunk, előnyösen legalább mintegy 0.5 mh4 és legfeljebb mintegy 10 ssM közötti, előnyösebben legalább mintegy 2 mM és legfeljebb· mintegy 3 roM közötti koncentrációban.
    29. Az 1 vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan reakcíókeveréket alkalmazunk, amely legalább két reagenskészltményi tartalmaz.
    4G 30. Az 1-29, igénypontok bármelyik szerinti eljárt», azzal jellemezve, hogy az oldat térfogata legalább ·>
    Φ * Λ φ mintegy 10 pl és legfeljebb mintegy 48 μί.
    31, Az t-30, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 0220/yé/kwssve, hogy a vizsgálatot klinikai kémiai analizátoron bajtjak végre.
    32, .Az 1-31. igénypontok bármelyike szerinti eljárás,. assaijslfewsve, hogy a vizsgálati eljárás keszüS léken kívüli lépést nem igényel, .33. Vizsgálstí reagenskészlet enzimes, ciklusos vizsgálati, eljárásban ntintaoldatban lévő homoáxziein és/vagy dsziatíois mennyiségének megállapítására,, amely reagenskészlet tartalmaz
    - cisztatioam-p-szintází vagy származékát, L-szerint,
    10 · maziaiionin-íMiázt vagy szár mazékát,
    - foszSn seánkálóezest, előnyösen triatkíl-foszbn-reáíikálószer;, amely alkalmas az oldalban található homociszteirs lényegében teljes mennyiségének redskálássra, és
    - amely vizsgálati reágenskészlet előnyösen edényt is tartalmaz a minta tartására.
    34, A 33. igénypont szerinti vizsgálati rsagenskészfet, amelyben a redakálószer trión üt-foszt m vagy 15 triszsí2-karbosíet:it)fcszSn (TCEP).
    35, A 33. vagy 34, igénypont szerinti vizsgálati reagenskésziat, .amelyben csak két reagenst alkalmazunk.
    36, A 33-35. igénypontok bármelyike szerinti vizsgálati reagenskészlet, amely tartalmaz egy első reagenst amely tartalmaz L-szerint iaktát-debldrogenázt iLDli-t) vagy annak származékát NADH-t vagy amsek
    28 .származékát és a reshikálószert.
    37, A 33-36. igénypontok bármelyike szerinti vizsgálati reagenskészlet amelyben a. eiszstóionín-βsziníáz vagy származéka és a cisztaíionm-Ö-liáz vagy származéka egy, a reakcióké verek teljessé tételére és a homoelszlem és/vagy a eiszfeíion enzimes eiklasának elindítására szolgáló második reagensben van jelen.
    38, A 33-37, Igénypontok bármelyike szerimi vizsgálati reágenskészlet, amelyben
    25 a cisztatiordn-ő-szlmáz legalább mintegy 0,1 és legfeljebb mintegy 100 KU/I, előnyösen legalább mintegy 0,5 és legfeljebb mintegy 75 KU/1 végkoneentrációban van jelen, és/vagy az L-szerin legalább mintegy I μΜ és legfeljebb mintegy 58 tnM, előnyösen legalább mintegy 18 pM és legfeljebb mintegy 48 mM: végkoscentráe löban van jelen, és/vagy a ciszíabonm-p-liáz legalább mintegy 0,81 és legfeljebb mintegy· 100 KU/I, előnyösen legalább mint38 egy 6,05 és legfeljebb mintegy 50 KU/i vegkeneeníráeiöban van jelen.
    39, A 36. igénypont szerinti vizsgálati reagenskészlet, amelyben a lakíát-dehiárogenáz legalább mintegy 38 l.i/1 és legfeljebb mintegy 5000 U/l, előnyösen legalább mintegy 30 U/l és legfeljebb mintegy 3808 U/l végkoneeníráeiöban van jelen, és/vagy a NADH legalább mintegy 0,1 mM és legfeljebb mintegy 2 mM, előnyösen legalább mintegy 0,1 mM: 35 és legfeljebb mintegy 1,5 mM végkonceutrádoban van jelen,
    40, A 33-39. igénypontok bármelyike szerinti vizsgálati reágenskészlet, amely oxidációja esetén színét megváltoztatni képes festéket is tartalmaz, ahol előnyösen a festék az alábbiak bármelyike; 5(S’-d:ftiobisz.(2-aitrabenzöes;5v), 2,S-áik!órfeno!-índofe«ol, teirazóümnyegyölet fenazin-metoszalfát, nteíii-vlologen vagy ezek származékai.
    40 41. A 34. ígényftont szerinti vizsgálati reágenskészlet, amelyben a TCEP mintegy ő aW és mintegy 53 közötti ntentiyiségben van jelen.
    42. A 33-4 I. igésypomok bármelyike szerimi vizsgálati reagenskésziek amelyben továbbá cssztationinγ-liáz vagy származéka is jeles van,
    43. A 42. igénypont szerinti vizsgálati reagenskészlet, amelybe» a cisz.tófionim.ő-sz.mtáz vagy szárroa5 zéka. a eiszlatio-uo-d-fiáz vagy származéka, a eisztad<miu-y-liáz vagy származéka, a kikiát-dehidrogenáz, vagy származéka immobílízáSva van az edényben.
    44. Eljárás mintában lévő hontoeisztelu mennyiségének megállapítására, asaa/ úk/eraem-v, hogy;
    iái a mintái koszira rsdukálószerref, előnyösen írialkiif>szi;n radnkálőszerret érmikezte-jök, miáltal a homodszteint kötő fehériéboi felszabadít jak a redukált honsocisztéínt,
    10 i'b) a redukált hootoclsztetóí hontcci-smeln metabolitíát kötő transzkripciós faktorral a redukált homoaszteín és a homocíszteiuntetaboiit-kötö transzkripciós faktor közötti komplex képzésére alkalmas körülmények között érintkeztetjak, tej a mintát olyan konszenzus poiinukleotid-szekvenciával vagy származékával keverjük, amelyet a hoKtocssztem/traRSzkripolósfáktor-komplox vagy származéka -specifikusan felismer, miáltal a Immoeiszteín/tran-sz15 kripciósfaktoi-komplex a konszenzus poltnnkleotid-székvenetáboa kötődik, (ö) meghatározzuk a kaoszeazas poímakteodd-szekveneia által kelőit temocisztetnferanszkripviósfiiiitor-li.emniex mennyiségét, és
    Ce) a mintába» lévő bomoctsztein menny iségét megfeleltetjük a meghatározott mennyiségnek,
    45. A 44. igénypont szerinti eljárás, «retdfefteweore, hogy a he-moeiszteintnetöbolií-kötő transzkripciós
  2. 2Ö- faktorként MetR. vagy származékát alkalmazzuk.
    46. A. 44. igénypont szerinti eljáró», ct-.-ró /e/fömszre. hogy konszenzus poihmkleotid-szekvenciaként a 1.1. azonosítószámú szekvenciát vagy származékát alkalmazzuk.
    47. A 44, igénypont szerinti eljárás, jeifemezw, hogy a homoeisztein/transsdcripciós faktor komplex megbatározott mennyiségét fluoreszcenciával határozzuk meg, és/vagy
    25 a vizsgálatot az adott jel kimutatásához adaptált analizátoron végezzük, és/vagy az eljárást egyetlen készüléken hajtjuk végre,
    48. A 6. igénypont szerinti vizsgálati eljárás mintában lévő bomociszteiu mennyiségének megállapítására, ííszaf/e/femezre, hogy;
    - az első reakciókeverék elegendő ideig inkui’áljuk, miáltal a fehérjéhez kötött homocisztein túlnyomó
    30 részé· redukáljuk,
    - a reakoiőkeverékbez cisztatiorón-d-szlMázf és cisztaíionin -p-liázt vagy ezek bármelyikének származékát tartalmazó enzhnkevetéket adunk, miáltal teljessé tesszük a reakeiokeveréket, «háltál ciklusosán átalakítjuk a homociszíeini cisztatiouiutsá és visszztalakítjuk a císztationlni horoociszíemné piruvát termelődése mellett, és
    - Kiérjük a NAD-i- időbeli termelődéséi vagy a N'ADH fogyását, mint a mintában lévő homocisztein
    35 mértekét.
    49. A 49, igénypont szerinti -eljárás, ahol
    -az L-szerínt a reakciókeverekhez legalább mintegy 1 pM és legfeljebb mintegy 50 mM, előnyösen legalább mintegy 10 gM és legfeljebb mintegy 40 mM végkoneeutróeiöhan adjuk, és/vagy a lakíái-debidrogenázt a reakciókeverékbez fegalább mintegy 3ö U/l és legfeljebb mintegy 5ÖÖ0 U/l. 40 előnyösen legalább mintegy 30 U/l és legföljebb mintegy 3ŐÖÍ113/Í végkoneentráeióbarí -adjuk, és/vagy a N ADH-t a reakciókeverékhez legalább mintegy Ö,1 mM és legfeljebb mintegy 2 mM, előnyösen legalább mintegy 0,1 mM és legfeljebb mintegy I ..5 mM végkonceotráeiőban adjuk, és/vagy a císzíabonin-iS-ssiniáz legalább mintegy ÖU ss legfeljebb mintegy 50Ö KIM, előnyösen legalább mintegy 0,5 és legfeljebb mintegy 75 KU/1 végkoncentráeítrban vas? jeleit, és/vagy
  3. 5 a eisziaftonm-p-liáz legalább mintegy Ö.Ö1 és legfeljebb mintegy Ϊ80 K1J. I, előnyőse» legalább mintegy 0,05 és legfeljebb mintegy 5 b fefe/l végfconcentráoiöbaa w.
    50. A 48:. Igénypont szerinti vizsgálati eljárás, ahol a vizsgálatot legfeljebb mintegy 20 perc alaíl.végezzük el, előnyösen legfeljebb mintegy 15 pete alatt, előnyösebben mintegy 5-12 perc alatt végezzük el.
    51. Az 1-32. és 48-51. igénypontok bármelyike szerinti' eljárás több, folyékony , homocssztein tartalmú
  4. 10 minta egymást követő vizsgálatára,.-ássa/fe/feírterve, hogy:
    több iőlyékeny, •bömocbztdn-tartalmö mintái készítünk, és az 1. Igénypont szerint nregbatámzett (a)-(ej lépéseket ismételjük mindegyik, folyékony, hostecíszteiotarialmá minta esetébe®, ahol a mintáknál a reakciókeverék-készitesi lépés közötti időintervallum mintegy 15 percnél nem Jobb.
  5. 15 52. Az 51. igénypont szerinti eljárás, .oszoí’/eZfeíaíSW, hogy az időintervallum mintegy 13 percnél nem több.
    53. Az 5:1. igénypont szerinti eljárás, íczííí’ feífevvezrv. begy először egy első reakeiőkeverékss készítünk, amely tartalmazza a mmíáp a szerint, a laktáí-dehidrogenőzt, a NADH~t és a redukálőszert, az első reakciókeveréket elegendő Ideig hagyjuk hrktteátedni, miáltal a redukálószerrei a fehérjéhez kötök homocisztei® tál28 nyomó részét felszabadítjuk, majd ezután adjuk hozza a eisztationis-jJ-szlntázt és a eisztatfonin-p-bází,
    54. Az 51, igénypont szerinti eljárás, /Awetzve, bogy a cisztalíonin-já-sziteáz ciszteífonin-βllázhoz viszonyított arányát mintegy 1:1 és 25:1 közé, előnyösen mintegy El és 10:1 közé állítjuk be,
    55. A 4g. 58. vagy 5ő. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, hogy klinikai kémiai analizátoron hajtjuk végre, és/vagy egyetlen készüléken hijjíjuk végre.
HU0500095A 2001-11-06 2002-11-06 Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine HU228343B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/012,762 US6635438B2 (en) 1999-11-02 2001-11-06 Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine
PCT/US2002/035777 WO2003040694A2 (en) 2001-11-06 2002-11-06 Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0500095A2 HUP0500095A2 (hu) 2005-05-30
HUP0500095A3 HUP0500095A3 (en) 2010-03-29
HU228343B1 true HU228343B1 (en) 2013-03-28

Family

ID=21756556

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0500095A HU228343B1 (en) 2001-11-06 2002-11-06 Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine

Country Status (12)

Country Link
US (2) US6635438B2 (hu)
EP (1) EP1470242B1 (hu)
CN (1) CN1612937B (hu)
AU (1) AU2002352538A1 (hu)
BR (1) BRPI0213936B8 (hu)
DK (1) DK1470242T3 (hu)
HU (1) HU228343B1 (hu)
NO (1) NO20042144L (hu)
RU (1) RU2344176C2 (hu)
SK (1) SK288189B6 (hu)
WO (1) WO2003040694A2 (hu)
ZA (1) ZA200403395B (hu)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6635438B2 (en) * 1999-11-02 2003-10-21 Catch, Inc. Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine
GB0008784D0 (en) * 2000-04-10 2000-05-31 Axis Shield Plc Assay
GB0311804D0 (en) * 2003-05-22 2003-06-25 Univ Glasgow Improved homocysteine assay
US7097968B2 (en) * 2003-07-10 2006-08-29 General Atomics Methods and compositions for assaying homocysteine
US8476034B2 (en) * 2003-07-10 2013-07-02 General Atomics Methods and compositions for assaying homocysteine
DE10342264C5 (de) 2003-09-12 2012-10-31 Leica Biosystems Nussloch Gmbh System zum eindeutigen Zuordnen von histologischen Kassetten und Objektträgern
GB0428130D0 (en) * 2004-12-22 2005-01-26 Oxford Biosensors Ltd Selective HDL cholesterol assay
US7723077B2 (en) 2005-08-11 2010-05-25 Synthetic Genomics, Inc. In vitro recombination method
CA2634495A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Conjuchem Biotechnologies Inc. Process for the production of preformed conjugates of albumin and a therapeutic agent
WO2009039298A2 (en) 2007-09-18 2009-03-26 University Of Florida Research Foundation, Inc. Sensors using aigan/gan high electron mobility transistors
US20090186370A1 (en) * 2008-01-18 2009-07-23 Ogle Matthew F Diagnostic biomarkers for vascular aneurysm
WO2010054159A2 (en) * 2008-11-06 2010-05-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for detecting toxins, pathogens and other biological materials
EP2574193A4 (en) * 2009-12-30 2013-12-25 Oregon State DETECTION OF A THIOL
US9216209B1 (en) 2011-06-06 2015-12-22 Kilmer S. McCully Compositions and method for utilization of thioretinamide in therapy of degenerative diseases of aging
RU2471181C1 (ru) * 2011-06-20 2012-12-27 Открытое акционерное общество Научно-производственное объединение "Химавтоматика" Способ определения суммарного содержания антиоксидантов и суммарного содержания антоцианов в пищевых продуктах и напитках
US9034318B2 (en) * 2011-08-30 2015-05-19 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Chemically modified cystathionine beta-synthase enzyme for treatment of homocystinuria
JP5914019B2 (ja) * 2012-02-03 2016-05-11 旭化成ファーマ株式会社 酵素サイクリング反応によるメバロン酸の測定方法およびその校正試料
US9512464B2 (en) 2012-08-24 2016-12-06 Case Western Reserve University System and method for detecting of alpha-methylacyl-CoA racemase (AMACR) and prostate cancer
CN103674873B (zh) * 2013-11-22 2015-05-20 杭州利安生物科技有限公司 一种定量检测丝氨酸的方法
CN104111338B (zh) * 2014-05-07 2016-03-02 山东博科生物产业有限公司 一种抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒
US11009479B2 (en) 2014-05-27 2021-05-18 Case Western Reserve University Systems and methods for the detection of HbA1c
US10883956B2 (en) 2014-05-27 2021-01-05 Case Western Reserve University Electrochemical sensor for analyte detection
EP3149466B1 (en) * 2014-05-27 2019-11-20 Case Western Reserve University System and method for detecting neural injury
CN104198726B (zh) * 2014-08-14 2016-07-06 上海睿康生物科技有限公司 一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒
CN105039368A (zh) * 2015-07-08 2015-11-11 北京嘉万生物技术有限公司 一种重组酵母胱硫醚beta合酶催化中心的表达及放大生产
CN105181970B (zh) * 2015-08-28 2017-05-03 宁波瑞源生物科技有限公司 一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒
CN106970230B (zh) * 2017-03-29 2019-06-11 广州市伊川生物科技有限公司 一种同型半胱氨酸测定试剂盒
CN110346572A (zh) * 2018-04-04 2019-10-18 浙江力耐得传动科技有限公司 偶联丙酮酸氧化酶测定同型半胱氨酸（Hcy）的方法及测定试剂盒
CN108802125B (zh) * 2018-08-28 2023-09-15 长沙理工大学 基于七(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的L-半胱氨酸的检测方法及传感器
CN109975279B (zh) * 2019-03-07 2021-05-28 广州悦蜂生物防治科技有限公司 一种检测脂肪酶活性的方法、试剂盒及速测卡
US11697807B2 (en) 2019-09-30 2023-07-11 Case Western Reserve University Electrochemical biosensor
CN110954581A (zh) * 2019-12-19 2020-04-03 湖南海源医疗科技股份有限公司 一种快速检测同型半胱氨酸的电化学方法
CN114689415A (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 桂林优利特医疗电子有限公司 一种稳定性好的同型半胱氨酸检测试剂盒及制备方法
CN114277021B (zh) * 2021-11-19 2022-09-20 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 胱硫醚-β-裂解酶及其制备方法和应用
CN114807199A (zh) * 2022-02-22 2022-07-29 三诺生物传感股份有限公司 重组胱硫醚β-裂解酶的制备方法及其应用
CN115725556B (zh) * 2022-09-20 2024-05-03 青岛硕景生物科技有限公司 一种稳定性提高的突变胱硫醚β裂解酶及其制备方法和应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6063581A (en) 1992-01-22 2000-05-16 Axis-Shield Asa Immunoassay for homocysteine
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5563036A (en) 1994-04-29 1996-10-08 Tularik, Inc. Transcription factor-DNA binding assay
US5627645A (en) 1994-09-30 1997-05-06 New Oji Paper Co., Ltd. Method of and apparatus for measuring retardation of composite layer
US5635375A (en) 1995-01-09 1997-06-03 Regents Of The University Of Colorado Method of increasing the yield and heme saturation of cystathione β-synthase
GB9617683D0 (en) * 1996-08-23 1996-10-02 Univ Glasgow Homocysteine desulphurase
US6066467A (en) * 1997-07-24 2000-05-23 Anticancer, Inc. High specificity homocysteine assays for biological samples
US5985540A (en) 1997-07-24 1999-11-16 Anticancer, Inc. High specificity homocysteine assays for biological samples
US5885767A (en) 1998-05-22 1999-03-23 Biocatalytics, Inc. Methods and compositions for quantitating L-homocysteine and/or l-methionine in a solution
WO2000028071A2 (en) 1998-11-12 2000-05-18 Genzyme Corporation A method for the determination of homocysteine
US6174696B1 (en) * 1999-11-12 2001-01-16 Genzyme Corporation Method for the determination of homocysteine
US6046017A (en) 1999-06-14 2000-04-04 Virginia Commonwealth University Rapid and sensitive assay for homocysteine
US6635438B2 (en) * 1999-11-02 2003-10-21 Catch, Inc. Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine
US6664073B1 (en) * 1999-11-02 2003-12-16 Catch Inc. Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine
US6305597B1 (en) 2000-07-20 2001-10-23 Impac Group, Inc. One-piece folding carton with integrally formed sliding display hang tab

Also Published As

Publication number Publication date
RU2344176C2 (ru) 2009-01-20
CN1612937B (zh) 2010-05-05
BRPI0213936B1 (pt) 2015-08-25
RU2004117087A (ru) 2005-04-27
BR0213936A (pt) 2004-08-31
EP1470242B1 (en) 2013-08-14
US6867014B2 (en) 2005-03-15
HUP0500095A3 (en) 2010-03-29
NO20042144L (no) 2004-08-06
SK288189B6 (sk) 2014-05-06
BRPI0213936B8 (pt) 2021-07-27
HUP0500095A2 (hu) 2005-05-30
SK2042004A3 (en) 2004-10-05
US6635438B2 (en) 2003-10-21
CN1612937A (zh) 2005-05-04
US20030138872A1 (en) 2003-07-24
US20040096929A1 (en) 2004-05-20
WO2003040694A2 (en) 2003-05-15
AU2002352538A1 (en) 2003-05-19
DK1470242T3 (da) 2013-11-11
EP1470242A4 (en) 2007-01-03
WO2003040694A3 (en) 2004-08-19
EP1470242A2 (en) 2004-10-27
ZA200403395B (en) 2006-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228343B1 (en) Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine
CN100404688C (zh) 用于生物样品的高特异性同型半胱氨酸分析法
Biswas et al. Mapping RNA-protein interactions in ribonuclease P from Escherichia coli using disulfide-linked EDTA-Fe
JP2011224025A (ja) 糖化タンパク質の測定のための方法および組成物
JPH08507686A (ja) 遺伝子操作酵素及びそれらの診断アッセイ用結合体
Yang et al. Assembly and full functionality of recombinantly expressed dihydrolipoyl acetyltransferase component of the human pyruvate dehydrogenase complex
EP1230381B1 (en) Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine
Duncan et al. Probing interactions of the Escherichia coli FoFI ATP synthase β and γ subunits with disulphide cross-links
EP1210443B1 (en) Method to determine the level of hydrogen sulfide in a sample and method to identify a sequence encoding a homocysteinase with a desired degree of specificity
EP1595950A1 (en) Method of measuring homocysteine
CN111484560A (zh) 冠状病毒模型及其应用
Uno et al. Nuclear localization of brain-type glycogen phosphorylase in some gastrointestinal carcinoma
ES2369979T3 (es) Ensayos de ciclación enzimática para la homocisteína y la cistationina.
CN110777188B (zh) 一种酶法检测谷氨酸含量的方法及其应用
Shanley DIVERGENT REGULATION IN PYRIMIDINE BIOSYNTHESIS: ENZYMATIC CHARACTERIZATION OF HYBRID ASPARTATE TRANSCARBAMOYLASES AND THEIR PHYSIOLOGICAL CONSEQUENCES
Hisabori et al. Asymmetry of the three catalytic sites on β subunits of TF1 from a thermophilic Bacillus strain PS3
JP2008082917A (ja) 被験物の測定方法
JP3715736B2 (ja) 抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法及び抗トレポネーマ抗体測定試薬
JPH07258299A (ja) Ｐｇａｍアイソザイムに対する抗体
CA2451588A1 (en) Protein having active sulfate transporter activity and method for detecting canceration of tissue
JP2000146963A (ja) ＥＬＩＳＡ−ヒトＩｇＥ測定キット

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: AXIS-SHIELD DIAGNOSTICS, LTD., GB

Free format text: FORMER OWNER(S): CATCH, INC., US