SK279277B6

SK279277B6 - Farmaceutický prostriedok proti aterosklerotickému

Info

Publication number: SK279277B6
Application number: SK3027-92A
Authority: SK
Inventors: Yasushi Saito; Masaki Kitahara; Mitsuaki Sakashita; Kyomi Toyoda; Tashie Shibazaki
Original assignee: Nissan Chemical Industries Ltd.; Kowa Company
Priority date: 1991-10-04
Filing date: 1992-10-02
Publication date: 1998-09-09
Also published as: NO302452B1; JP3130342B2; KR100264543B1; CZ302792A3; RU2114620C1; EP0535548B1; DE69232217T2; AU2601292A; ATE209035T1; TW238300B; CA2079706C; DE69232217D1; HUT62794A; CA2079706A1; JPH06329540A; EP0535548A1; UA39095C2; NZ244555A; SK302792A3; US6162798A

Description

Vynález sa týka farmaceutického prostriedku proti aterosklerotickému zhrubnutiu intimy, t. j. vnútornej vrstvy cievnej steny. Prostriedok obsahuje pyridínový derivát so silným inhibičným účinkom proti HMG-CoA reduktáze a silným inhibičným účinkom proti proliferácii buniek hladkého svalstva aortovej intimy (I-SMC) v procese aterosklerotického zhrubnutia intimy, s účinkom proti migrácii buniek hladkého svalstva aortovej médie (M-SMC) a proti adhézii krvných buniek, ako sú lymfocyty, leukocyty a makrofágy k endotelovým bunkám.

Doterajší stav techniky

Zhrubnutie intimy koronárnej artérie sa ako spúšťací mechanizmus považuje za jednu z hlavných príčin infarktu myokardu a angíny pektoris. Predpokladá sa, že toto aterosklerotické zhrubnutie intimy začína adhéziou monocytov alebo krvných doštičiek k endotelovým bunkám so súčasnou sekréciou cytokinínov a hromadením lipidov a že postupuje cestou migrácie M-SMC z médie do intimy a proliferáciou buniek hladkého svalstva v intime a nárastom mimobunkovej matrice spôsobeným patologickou a proliferativnou aktiváciou alebo moduláciou buniek hladkého svalstva. Týmto aktiváciám buniek napomáhajú rizikové faktory ako je hyperlipidémia. Bolo publikované, že v modelových pokusoch na zvieratách inhibítory HMG-CoA reduktázy potláčajú aterosklerotické zhrubnutie intimy vďaka svojmu silnému pôsobeniu, ktoré vedie k zníženiu sérového cholesterolu (Biochim. Bipophys. Acta, 960, 294 - 302, (1988)), ale toto pôsobenie nebolo adekvátne v klinických pokusoch.

Z týchto dôvodov je žiaduce hľadať ako inhibítor aterosklerotického zhrubnutia intimy liek schopný pôsobiť priamo na aterosklerotické lezie. Až doteraz boli opísané inhibičné účinky, ktoré na bunky hladkého svalstva má liek na báze rastového faktora odvodeného od krvných doštičiek (FGF) (Life Science, 28, 1641-1646, (1981); J. Pharm. Exp. Ther., 248, 1167-1174, (1989)), inhibičné účinky antagonistov vápnika na migráciu buniek hladkého svalstva pôsobením PDGF, tromboxánu B4 a interleukínu-1 (Atherosclerosis, 72, 213-219, (1988)), inhibičné účinky RGD peptidov na adhéziu buniek (J. Celí. Biol., 112, 335-344, (1991)) a inhibičné účinky inhibítora syntézy tromboxánu na reatenózu po PTCA (Atherosclerosis, 18, 661-665, (1990)). Tieto účinky sa však obmedzujú na krvné doštičky alebo stimulačné faktory, ako sú cytokiníny, ale zatiaľ sa nenašiel liek, ktorý priamo pôsobí na aterosklerotické patologické bunky hladkého svalstva.

Migračný faktor odvodený od buniek hladkého svalstva a vylučovaný bunkami hladkého svalstva stimuluje migráciu silnejšie ako PDGF a predpokladá sa, že je v úzkej súvislosti so začiatkom a postupom aterosklerózy (Atherosclerosis, 72, 213-226, (1991)); zatiaľ sa však nenašiel žiadny liek, ktorý by inhiboval migráciu buniek hladkého svalstva. Ďalej sa predpokladá, že proliferatívny charakter I-SMC, ktorý nie je možné potlačiť prostaglandínom (2 (Atherosclerosis, 73, 67-69 (1988)), hrá dôležitú úlohu v ateroskleróze. Doteraz sa však nenašiel žiadny liek, ktorý by inhiboval tento proliferatívny charakter.

Bolo opísané, že inhibítory HMG-CoA reduktázy majú inhibičný účinok na proliferáciu buniek pokiaľ ide o fibroplasty, bunky hladkého svalstva a lymfocyty (J. Biol. Chem., 259, 1546-1551 (1984); ibid. 255, 5134-5140; Biochim. Biophys. Acta, 1051, 138-143, (1990)), a že tiež potláčajú aktiváciu lymfocytov (Int. J. Immunopharmac., 11, 863-869, (1989)). Ale tieto inhibičné účinky nie sú úplne uspokojujúce a je žiaduce nájsť liek, ktorý· by bol účinnejší a selektívne pôsobil na cieľové bunky, najmä na I-SMC, makrofágy a monocyty.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je farmaceutický prostriedok proti aterosklerotickému zhrubnutiu intimy, ktorý ako účinnú látku obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (I)

R¹

v ktorom kruh X znamená skupinu vzorcov

r’ v ktorých

R4aj_e vodík, C]-C4alkyl, fluór, chlór a bróm;

R^bje C1-C4 alkyl a fenyl; R^b je C]-Cg alkyl; r4c a r5^c sú vodík a C1-C4 alkyl,

Rl je vodík alebo fluór,

R 3 je C3-C5 alkyl alebo C3-C5 cykloalkyl;

Y je -CH2CH2-, -CH=CH-, a

Z je -CH(OH)-CH2-CH(OH)-CH₂-CO₂R¹²;

kde Rl² je vodík, NH4, sodík, draslík alebo monovalentný ekvivalent vápenatého iónu, alebo skupina

v spojení s farmaceutický prijateľným nosičom a/alebo inou farmaceutickou pomocnou látkou.

Jedno výhodné uskutočnenie farmaceutického prostriedku podľa tohto vynálezu obsahuje ako účinnú látku zlúčeninu všeobecného vzorca (la)

v ktorom všetky substituenty majú uvedené významy.

Iné výhodné uskutočnenie farmaceutického prostriedku podľa vynálezu obsahuje ako účinnú látku zlúčeninu všeobecného vzorca (Ib)

v ktorom všetky substituenty majú uvedené významy.

Ďalšie výhodné uskutočnenie farmaceutického prostriedku podľa vynálezu obsahuje ako účinnú látku zlúčeninu všeobecného vzorca (Ic)

v ktorom všetky substituenty majú uvedené významy.

Výhodné sú zlúčeniny všeobecného vzorca (la), v ktorom R² je cyklopropyl, Y je -CH=CH- a ostatné substituenty majú uvedené významy.

Ďalšie výhodné zlúčeniny sú zlúčeniny všeobecného vzorca (lb), v ktorom R² je cyklopropyl, R^b a R²b sú metyly, Y je -CH=CH- a ostatné substituenty majú uvedené významy.

K výhodným patria aj zlúčeniny všeobecného vzorca (Ic), v ktorom R² je cyklopropyl, R^4c je etyl, R^2c je metyl, Y je -CH=CH- a ostatné substituenty majú uvedené významy.

Výhodné sú tiež zlúčeniny všeobecného vzorca (la), v ktorom Z je skupina -CH(OH)-CH2-CH(OH)-CH2-CO2 . 1/2 Ca, t. j. monovalentným ekvivalentom vápenatého iónu.

Farmaceutický prostriedok podľa vynálezu obsahuje účinnú látku v dávke aspoň 0,03 mg/kg/deň.

Farmaceutický prostriedok podľa vynálezu obsahuje obyčajne 0,01 až 20,0 mg účinnej látky a 50 až 99,9999 % hmotn. pomocnej látky alebo vody.

Tablety farmaceutického prostriedku obsahujú 0,05 až 40,0 % hmotn. účinnej látky, 42,5 až 95,95 % hmotn. pomocnej látky, 2,5 až 10,0 % hmotn. spojiva, 1,0 až 5,0 % hmotn. dezintegrátora a 0,5 až 2,5 % hmotn. maziva.

Tuhé kapsuly farmaceutického prostriedku podľa tohto vynálezu obsahujú 0,05 až 40,0 % hmotn. účinnej látky, 57,5 až 99,45 % hmotn. pomocnej látky a 0,5 až

12.5 % hmotn. maziva.

Elastické kapsuly farmaceutického prostriedku podľa vynálezu obsahujú 0,05 až 40,0 % hmotn. účinnej látky, 59,0 až 99,85 % hmotn. pomocnej látky a 0,1 až 1,0 % hmotn. rozpúšťadla.

Farmaceutický prostriedok vo forme čapíkov obsahuje 0,01 až 40 % hmotn. účinnej látky, 59,0 až 99,89 % hmotn. pomocnej látky a 0,1 až 1,0 % hmotn. rozpúšťadla.

Farmaceutický prostriedok vo forme injekcie obsahuje 0,0001 až 5 % hmotn. účinnej látky a 95,0 až 99,9999 % hmotn. destilovanej vody pre injekcie.

Granulovaná forma prostriedku obsahuje 0,05 až 40,0 % hmotn. účinnej látky, 47,5 až 96,95 % hmotn. pomocnej látky, 2,5 až 10,0 % hmotn. spojiva a 0,5 až

2.5 % hmotn. maziva.

Pyridínové zlúčeniny, ktoré tvoria účinnú látku vo farmaceutickom prostriedku podľa vynálezu, môžu mať aspoň jeden alebo dva asymetrické uhlíkové atómy a teda majú dva alebo viac optických izomérov. Zlúčeniny uvedeného všeobecného vzorca (I) teda zahŕňajú všetky takéto izoméry a ich zmesi.

Zlúčenina podľa tohto vynálezu môže byť silným inhibítorom adhczie krvných buniek, akými sú monocyty, makrofágy k endotelovým bunkám a môže potláčať od poveď na skorú fázu zhrubnutia intimy. Navyše môže inhibovať migráciu buniek hladkého svalstva aortovej médie PDGF a upraveným médiom buniek hladkého svalstva (SMC-CM), ktoré môže obsahovať migračný faktor autokrinného stimulačného systému odvodený od buniek hladkého svalstva. Navyše zlúčenina podľa tohto vynálezu inhibuje spotrebu ²H-tymidinu v bunkách hladkého svalstva a tak replikáciu DNA, čím je zrejme inhibovaná proliferácia buniek. Tieto účinky sú silnejšie v I-SMC ako v M-SMC. Ako vyplýva z predchádzajúceho, predpokladá sa, že zlúčenina podľa tohto vynálezu inhibuje proliferáciu buniek hladkého svalstva v aortovej intime, čo je najdôležitejšia fáza aterosklerotického zhrubnutia intimy. Tento vynález je založený na zistení, že zlúčenina podľa tohto vynálezu má tieto účinky na aterosklerotické zhrubnutie intimy.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu, teda mevalonolaktónv, všeobecného vzorca (I) sa môžu pripraviť týmito reakciami.

V reakčných vzorcoch Rl, R² a kruh X sú definované ako je uvedené podľa vzorca (I) a R^² je vodík, R¹⁴je alkyl chemicky alebo fyziologickými procesmi hydrolyzovateľného alkylesteru, NHR²²R²⁴r25j kde R²², r24 a r25 j_e vždy vodík alebo C]-C4alkyl, sodík, draslík alebo monovalentný ekvivalent vápnika a R*⁷ jc nižší C]-C4alkyl, ako je metyl, etyl, n-propyl, i-propyl alebo n-butyl.

Zo zlúčenín vzorca (I) tie, ktoré zodpovedajú vzorcom (Vila), (Vllb) a (Vile) sa môžu pripraviť metódami uvedenými v zverejnenej japonskej prihláške č. 279866/1989 (zodpovedajúcej EP 304063 a USP 5011930), v zverejnenej japonskej patentovej prihláške č. 275878/1990 (zodpovedajúcej EP 339358 a USP 5024999) a v zverejnenej japonskej patentovej prihláške č. 7290/1991 (zodpovedajúcej EP 367235 a USP 5026698).

[Vile]

OH OH

(V) (vr:i|

OH

Stupeň A jc redukcia esteru na primárny alkohol, ktorá sa najlepšie uskutoční pomocou rôznych kovových hydridov, výhodne pomocou hydridu diizobutylhlinitého, v rozpúšťadle akým je tetrahydrofurán, toluén alebo metylénchlorid pri teplote od -20 °C do 20 °C, najlepšie od-10 °C do 10 °C.

Stupeň B je oxidácia primárneho alkoholu na aldehyd, ktorá sa môže uskutočniť pomocou rôznych oxidačných činidiel. Výhodne sa použije metóda, pri ktorej sa reakcia uskutoční s použitím chlorochromanu pyridínu v metylénchloride pri teplote od 0 °C do 25 °C, v ktorej sa reakcia (Swemova oxidácia) uskutoční oxalylchloridom, dimetylsulfoxidom a terciámym aminom (ako je trietylamín) a metódy, podľa ktorej sa reakcia uskutoční s použitím komplexu oxid sírový-pyridín.

Stupeň C je syntéza 3-etoxy-l-hydroxy-2-propénového derivátu, ktorý sa môže získať reakciou látky (V) na lítiovú zlúčeninu vopred pripravenú pôsobením butyllítia v tetrahydrofuráne na cis-l-etoxy-2-(tri-n-butylcínjetylén. Pokiaľ ide o reakčnú teplotu je výhodné použiť nízku teplotu od -60 °C do -78 °C.

Stupeň D je syntéza enalu hydrolýzou kyselinou. S použitím kyslého katalyzátora, najlepšie kyseliny p-toluénsulfónovej, kyseliny chlorovodíkovej alebo kyseliny sírovej, sa môže reakcia uskutočniť v zmesi vody s tetrahydrofuránom alebo etanolom pri teplote od 10 °C do 25 °C.

3-Etoxy-l-hydroxy-2-propén získaný v stupni C sa môže použiť v stupni D bez prečistenia jednoducho tak, že sa odstráni tetra-n-butylcín vzniknutý súčasne s derivátom.

Stupeň E je adičná reakcia medzi enalom (III) a esterom kyseliny acetoctovej. Reakcia sa najlepšie uskutoční s použitím hydridu sodného a n-butyllítia vo forme zásady v tetrahydrofuráne pri teplote od -80 °C do 0 °C, najlepšie od -30 °C do-10°C.

Stupeň F je reakcia, v ktorej je ester kyseliny ketokarboxylovej (II) redukovaný rôznymi činidlami.

Existuje reakcia, ktorou sa karbonylová skupina redukuje s použitím napríklad borohydridu sodného, kya4 noborohydridu sodného, borohydridu zinočnatého, disiamylboránu, diboránu, terc.-butylaminoboránu, komplexu pyridíu s boránom, dicyklohexylboránu, texylboránu, 9-borabixyklo[3,3,l]nonánu, diizokamfenylboránu alebo tri-sek.-butylborohydridu lítneho na zodpovedajúci ester kyseliny dihydroxykarboxylovej (I-1).

Táto reakcia sa môže uskutočniť v jednom z rozpúšťadiel akými sú uhľovodík, halogenovaný uhľovodík, C1-C4 alkohol, éter a jeho zmesi, pri teplote od -100 °C do 50 °C, najlepšie pri teplote od -78 °C do 30 °C.

Inak, ako je zverejnené v J. Am. Chem. Soc., 105, 593, (1983), trialkylborán, ako napríklad tri-n-butylborán alebo trietylborán a borohydrid sodný sa môžu použiť pri nízkej teplote.

Ďalej, ako je uvedené v Tetrahedron Letters, 28, 155, (1987), je možné prednostne získať erytroprodukt s vyššou biologickou aktivitou s použitím alkoxydialkylboránu akými sú metoxydietylborán alebo etoxydietylborán.

Táto reakcia sa môže uskutočniť v zmesi Ci-C4alkoholu a tetrahydrofúránu pri teplote od -80 °C do -50 °C, najlepšie od -72 °C do -68 °C.

Stupeň G je hydrolýza esteru a táto reakcia sa môže uskutočniť s použitím ekvimolámeho množstva zásady, najlepšie hydroxidu draselného alebo hydroxidu sodného, v zmesi vody s metanolom alebo etanolom pri teplote od 10 °C do 25 °C.

Takto získaná voľná kyselina sa potom nechá reagovať s vhodnou zásadou, aby vznikla soľ.

V stupni H sa voľná hydroxykyselina (1-2) podrobí dehydratačnej reakcii na mevalolaktón; táto reakcia sa môže uskutočniť refluxovaním s benzénom alebo toluénom za súčasného odstraňovania vody prídavkom vhodného dehydratačného činidla akým je napríklad molekulárne sito.

Inak sa reakcia môže uskutočniť s použitím laktonotvomých činidiel akými sú karbodiimid, najlepšie vo vode rozpustný karbodiimid, akým je napríklad N-cyklohexyl-N'-[2’-(metylmorfolínium)etyl]karbodiimid p-toluénsulfonát v suchom metylénchloride pri teplote od 10 °C do 35 °C, najlepšie od 20 °C do 25 °C.

Stupeň J je hydrogenácia dvojitej väzby spájajúcej mevalolakónovú časť s heterojadrom, ktorú je možné uskutočniť s použitím katalytického množstva paládiumuhlíka alebo ródiumuhlíka v rozpúšťadle akým je metanol, etanol, tetrahydrofurán alebo acetonitril pri teplote od 5 °C do 50 °C, najlepšie od 10 °C do 25 °C.

Stupeň K je reakcia na získanie δ,β-nenasýteného ketónu selektívnou oxidáciou esteru kyseliny dihydroxykarboxylovej, ktorá sa môže uskutočniť aktivovaným oxidom manganičitým v rozpúšťadle akým je etyléter, tetrahydrofurán, benzén alebo toluén pri teplote od 20 °C do 80 °C, najlepšie od 40 °C do 80 °C.

Inak sa môže zlúčenina vzorca (1-6) syntetizovať z aldehydu vzorca (V) Wadsworth-Emmonsovou kopulačnou reakciou (J. Am. Chem. Soc., 107, 3731, (1985)).

Látka sa môže ďalej syntetizovať z enalu vzorca (III) (Tetrahedron Letters, 26, 2951, (1985)). Tiež sa môže zlúčenina vzorca (1-7) získať adíciou dvojitého aniónu acetoctového esteru rovnakým spôsobom ako je opísaný v stupni E na aldehyd (VIII), syntetizavaný z aldehydu vzorca (V) kontinuálnou Wittigovou reakciou (WO-8402131), aby sa získal ester ketokarbxylovej kyseliny (IX), v ktorom sa karbonylová skupina redukuje spôsobom opísaným v stupni F.

Zlúčeniny uvedené v tabuľkách 1 až 4 vrátane tých, ktoré sú uvedené v nasledujúcich príkladoch, sú skôr špecifickými príkladmi látky podľa tohto vynálezu. Vo vzorcoch je substituent -Y-Z uvedený v tabuľke 1 a ostatné substituenty v tabuľkách 2 až 4.

V nasledujúcej prezentácii substituentov sú na ich znázornenie použité rôzne symboly. Tak n- znamená normálny, i- znamená izo, sek.- znamená sekundárny, terc.- znamená terciámy, c- znamená cyklo, Me znamená metyl, Et znamená etyl, Pr znamená propyl, Bu znamená butyl, Pent znamená pentyl, Hex predstavuje hexyl a Ph predstavuje fenyl.

Látka

I rc)

-Y-Z

1-3

1-4

1-5 (R¹²=Na)

T-B (R¹²=H)

1-9 (R^]2-Na)

Tabuľka 2

lla)

R^Sa n' »2 r3 _Róa

6-BrH

6-C1H

HH

6-C1H

6-NeH

6-i-PrH

6-BrH

6-i-PrH

HH

6-NeH

6-MeH

6-NeH «-ClH

6-C1H

6-ĎLH

HH

IB

HH

NH

6-FH

4-FH

4-1·H

4-FH

4-1··H

4-FM

4-FH

HH

4-FH

HH

IIH

4-FH

HH

4-FH

HH

HIi

HH

4-FH i-PrH c-Prli sek Bu H i-BuH c-PentH c*PentH c-PrH i-PrH c-Pr>1

C-PrH c-BuH i-PrH c-PrH c-PrII i-PrH c-PrH

C-PrH i-PrH

C-PrH c-PrH

C-PrH n-PrII n-PentH c-PrH laliuľku 3

Tabuľka 3 - pokračovanie _R4b _K5b

[lb I

R¹

R³

Me

Mc

Et

Et Et i-Pr i-Pr i-Pr i-Pr terc.-Bu terc.-Bu terc.-Bu terc.-Bu Ph

Ph

Ph Me Me Me Me

Et

E t

Hl i-Pr i-Pr i-Pr i-Pr terc.-ílu terc.-Bu terc. -Bu Terc.-Bu Ph

Ph

Ne Ne Et Et Ft i-Pr i-Pr i-Pr i-Pr terc.-Bu tcrc.-Bu terc.-Bu terc.-Bu Ph Ph Me

1-Et4-F t-i-Pr4-F

I -4 - F 1-Et4-F

1-i-Pr4-F

1-Me4-F

1-Ec4-F

J-í-Pr4-F l-terc.-Bu4-F

1-Ne4-F

1-Et4-F

1-i-Pr4-F l-terc.-Bu4-F

1-Et4-F

1-i-Pr4-F

1-terc.-Bu4-F

1-McH l-EtH

1-j-PrII

I - terc.-BuH

I -MeH l-EtII

1-i-PrH

1-MeH

I -EtH

1-i-PrH

- Lcrc -BuB

1-MeH

1-EtH

1-i-PrH l-tcrc.-DuH

1-EtH

1-i-PrH

1-tcre.-BuH

1-PhH

1-Et4-F

1-i-Pr4-F

1-Me4-1· l-Et4-F

1-i-Pr4-F

1-Me4-F

1-Et4-F

1-i-Pr4-F

- terc.-Bu4-F

1-Me4-F

1-Et4-F

1-i-Pr4-F l-cerc.-Bu4-F

1-Et4-F

1-i-Pr4-F

1-Me4-Cl

H H H H H H M H H H H

H

H H H H H H H H

H

II H

H

H H II H H

II

H

H H H

H

H H

H

H H

H H H H H H H

H H i-Pr i-Pr i-Pr i-Pr i -Pr i-Pr i-Pr i -Pr t-Pr i -Pr i-Pr i -Pr i -Pr i-Pr i-Pr i - Pr i-Pr i-Pr i-Pr

Me Me Me Et Et Et í - Pr i-Pr i-Pr i-Pr terc.-Bu terc.-Bu terc.-Bu terc.-Bu Fh

Ph

Ph Me Me Me Et Et Et i-Pr i-Pr i-Pr

-E<

l->-Pr

I - terc.-Bu

1-Me

1-Et

1-i-Pr

1-Me

1-Et.

i-Pr

- terc -Bu

1-Me l Et l-i-Pr

1-terc.-Bu

1-Et

1-i-Pr

- terc.-Bu

1-Me

1-Et l-i-Pr

1-Me l -Et

1-i-Pr

1-Me

-Et

1-i-Pr

4-CIH

4-ClH

4-CIH

4-CJH

4-ClH

4-Ľ1H

4-CIH

HH

HIi i -Pr i -Pr i-Pr í -Pr i -Pr i-Pr i-Pr i-Pr i-Pr i-Pr i-Pr i Pr i-Pr i-Pr c-Pr c-Pr u-Pr Ľ-Pr c-Pr Ľ-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr Ľ-Pr c-Pr Ľ-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr C-Pr c-Pr c- Pr C-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c- Pr c-Pr c-Pr C- Pr c-Pr C-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr c-Pr

R*^b	H ^v’	R'	R²	R³
i-Pr	l - terc.-Bu	H	H	c-Pr
terc.-Bu	l-Me	H	H	C-Pr
terc.-Bu	1 -Et	II	H	c-Pr
terc.-Bu	1-i-Pr	H	H	c-Pr
terc.-Bu	1-terc.-Bu	Ii	H	C-Pr
Ph	1 -Et	H	H	Ľ-Pr
Ph	1-i-Pr	K	H	C-Pr
Ph	1 - terc.-Bu	H	H	c-Pr
Me	1-n-Hex	4-F	H	c-Pr
Tabuľka 4
	Rí	R²
		V v
		í T
		LA ,

		[lc\|
_R4c		R¹	R²	R³
H	H	H	H	i-Pr
H	H	4-F	H	i-Pr
M	H	H	H	c-Pr
H	H	4-F	H	c-Pr
Me	H	H	H	i-Pr
Me	H	4-F	H	i-Pr
Me	H	H	H	c-Pr
Me	H	4-F	H	c-Pr
Et	H	H	H	i-Pr
Ex	H	4-F	H	i -Pr
Et	H	H	H	c-Pr
Et	H	4-F	H	c-Pr
Et	Me	H	K	i-Pr
Et	Me	4-F	H	i-Pr
Et	Me	H	H	C-Pr
Et	Me	4-F	H	C-Pr
n-Pr	H	H	H	i-Pr
n-Pr	H	4-F	H	i-Pr
n-Pr	H	II	H	c-Pr
n-Pr	H	4-F	H	c-Pr
i-Pr	M	H	H	i-Pr
i -Pr	II	4-F	H	i-Pr
i -Pr	H	H	Ii	c-Pr
i-Pr	H	4-F	H	c-Pr
n-Bu	H	H	H	i-Pr
n-Eu	H	4-F	H	i - Pr
n-Bu	H	H	H	C-Pr
n-Bu	H	4-F	H	c-Pr
•:-Bu	H	H	H	i-Pr
i-Bu	H	4-F	H	i-Pr
i-Bu	H	H	H	c-Pr
i-Bu	H	4-F	H	c-Pr
H	Me	H	H	i-Pr
H	Me	4-F	H	i-Pr
H	ne	H	H	c-Pr
H	Me	4-F	H	C-Pr
H	i-Pr	H	H	i -Pr
H	i-Pr	*-F	H	i-Pr
H	i-Pr	H	H	c-Pr
H	i-Pr	4-F	H	c-Pr
H	Et	H	H	i-Pr
H	Et	4-F	H	i-Pr
H	Et	H	H	c-Pr
H	Et	4-F	H	c-Pr
H	n-Pr	H	H	i-Pr
H	n-Pr	4-F	H	i - Pr
H	n-Pr	H	H	c-Pr
H	n-Pr	4-F	H	c-Pr
H	n-Bu	H	H	i -Pr
H	n-Bu	4-F	H	i -Pr
H	n-Bu	H	H	c-Pr

Tabuľku 4 - pokračovanéH Mc Me Mu Me n-Pr n-Pr n-Pr n-Pr n-Bu n-Bu n-Bu n-Bu H

H H H M H H H

Me Me Me Me Et Ec

Et Et n-Pr n-Pr n-Pr n-Pr H H H H H H H H c-Pr i-Pií-Pr Ľ-Pr Ľ-Pr í Pr f - H r c - Pr e-Pr i -Pr < - Pr c-Pr c-Pr H H Me Me Et Ετ n-Pr π-p.zelíny, vyššieho alkoholu, Macrogolovej masti, hydrofilnej masti alebo hydrogélu, ako injekčný preparát formulovaný na báze jedného alebo viacerých materiálov vybraných zo skupiny, ktorá zahŕňa polyetylénglykol, hydrogélový základ, destilovanú vodu, destilovanú vodu pre injekcie a vehikulum akým je laktóza alebo kukuričný škrob, ako formuláciu určenú na aplikáciu cestou sliznicových membrán, ako sú membrána očnej sliznice, membrána nosnej sliznice a membrána ústnej sliznice.

Ďalej sa môžu zlúčeniny podľa tohto vynálezu kombinovať so zásaditými ionomeničovými živicami, ktoré sú schopné viazať žlčové kyseliny a pritom nie sú absorbované v gastrointestinálnom trakte.

Denná dávka zlúčeniny vzorca (1) je od 0,05 do 500 mg, najlepšie od 0,5 do 50 mg, pre dospelých. Podáva sa jeden až trikrát denne. Dávka sa môže samozrejme meniť podľa veku, váhy a štádia choroby pacienta.

Ďalej sa môžu podobným spôsobom pripraviť farmakologicky prijateľné soli, ako napríklad draselné soli či polosoli vápnika, estery, ako napríklad metylestery, n-propylestery, i-propylestery, c-propylestery, n-butylestery, i-butylestery, sek.-butylestery, terc.-butylestery, n-pentylestery, i-pentylestery alebo n-hexylestery a amónne soli, trimetylamónne soli, dietylamónne soli, piperazínové soli, morfolínové soli, piperidínové soli, auramínové soli, diauraminové soli alebo trometamínové soli týchto látok.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu nielen že majú vysoké inhibičné aktivity na biosyntézu cholesterolu, kde HMG-CoA reduktáza pôsobí ako enzým, ktorý ovplyvňuje rýchlosť reakcie, ale majú aj inhibičné účinky na migráciu M-SMC, proliferáciu I-SMC a adhéziu krvných buniek na endotelové bunky, ako ukázali výsledky testov tu uvedené. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú teda užitočnými liekmi na hyperlipidémiu, hyperlipoproteinémiu a aterosklerózu.

Lieky sa môžu upraviť do rôznych formulácií podľa toho, ako sa majú podávať. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa môžu podávať vo forme voľných kyselín alebo vo forme esterov a laktónov, fyziologicky hydrolyzovateľných a prijateľných, a vo forme farmaceutický prijateľných solí.

Lieková forma zlúčenín podľa tohto vynálezu sa podáva najlepšie orálne ako látka samotná podľa tohto vynálezu alebo vo forme práškov, granúl, tabliet alebo kapsúl pripravených zmiešaním látky podľa tohto vynálezu s vhodným, farmaceutický prijateľným nosičom, akým je napríklad hydroxypropylcelóza, sirup, arabská guma, želatína, sorbitol, tragakantová guma, polyvinylpyrolidón alebo CMC-Ca, vehikulum ako je laktóza, cukor, kukuričný škrob, fosfát vápenatý', sorbitol, glycín alebo celulózový prášok v kryštalickej forme, masťový základ ako je stearát horečnatý, mastenec, polyetylénglykol a silika, a dezintegrátor ako je napríklad zemiakový škrob.

Lieková forma podľa tohto vynálezu nie je však obmedzená na orálne podávanie a látka je vhodná aj na parenterálnu aplikáciu. Tak napríklad je možné ju podať vo forme čapíkov sformulovaných z olejového základu, akým je kakaové maslo, polyetylénglykol, lanolín alebo triglycerid mastnej kyseliny, ako transdermálna terapeutická formulácia na báze kvapalného parafínu, bielej vaPríklady uskutočnenia vynálezu

Vynález bude teraz opísaný detailne s odvolaním na príklady, ktoré ukazujú inhibičné účinky látok podľa tohto vynálezu na aterosklerotické zhrubnutie intimy. Chemické štruktúry testovaných látok podľa tohto vynálezu (testovacie látky 1 až 10) a porovnávacej látky (Pravastatin, ako je uvedený vo zverejnenej japonskej patentovej prihláške č. 185275/1982 pred overovaním alebo v EP 65835 a Simvastatin ako je uvedený v japonskej zverejnenej patentovej prihláške č. 122373/1981 pred overovaním alebo v EP 33536) sú tieto:

Referenčný príklad (E) -Trans-6-(2'-[4-(4'-(ŕluórfenyl)-l ,3-dimetyl-6-(l’-metyletyl)pyrazol[3,4-b]pyridín-5-yl]etenyl)-4-hydroxy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-2-ón (látka I-3b-1)·

Táto látka sa pripravila s použitím metyl-2-cyklopropyl-5-etyl-3-(4'-fluórfenyl)-6-metyltienol[2,3-b]pyridín-3-karboxylátu (látka VIIb-1) ako východiskového materiálu pomocou nasledujúcich postupov A až H.

Rovnakým spôsobom sa testovacie látky 1, 2 a 3 pripravili z nasledujúcich medziproduktov (VIIa-1, VIIb-2 a Vile-1):

Látka VIIa-1

Metyl 2-cyklopropyl-4-(4'-fluórfenyl)chinolín-3-yl-karboxylát

Látka VIIb-2

Metyl 6-cyklopropy 1-1,3-dimetyl-4-(4'-fluórfenyl)pyrazol[3,4-b]pyridín-5-yl-karboxylát

Látka VIIc-1

Metyl 6-cyklopropyl-3 -etyl-4-(4'-fluórfenyl)-2-metyltién[2,3-b]pyridín-5-yl-karboxylát

teplota topenia ('C)

Me

M e'

El

Μγ</~ϊΓ

S-s

Testovacia látka 1 (I-3a-l) (E)-Trans-6-(²'-[2-cyklopropyl-4-(4'-fluórfenyl)chinolín-3”-yl]etenyl)4-hydroxy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-2-ón

Testovacia látka 2 (I-3b-2) (E) -Trans-6-(2'-[6-cyklopropyl-l,3-dimetyl-4-(4'-fluórfenyl)pyrazol[3,4-b]pyridín-5-yl]etenyl)-4-hydroxy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-2-ón Testovacia látka 3 (I-3c-1) (E)-Trans-6-(2'-[2-cyklopropyl-5-etyl-3-(4’-fluórfenyl)-6''-metyltienol[2,3-b]pyridín-3-yl]etenyl-4-hydroxy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-2-ón

Stupeň A

4-(4'-fluórfenyl)-5 -hydroxymetyl-1,3 -dimetyl-6-( 1 '-metyletyl)pyrazol[3,4-b]pyridín (látka VI-b-1)

Pod dusíkom sa 5,0 g (0,014 mol) látky VIIb-1 rozpustí v suchom toluéne a schladí na 0 °C v ľadovom kúpeli. K tomuto roztoku sa pridá po kvapkách 35 ml toluénového roztoku s obsahom 16 % hmotn. hydridu diizobutylhlinitého a zmes sa mieša 2 h pri 0 °C. Potom ako sa overí chromatografíou na tenkej vrstve, že látka Vllb-1 úplne zmizla, pridá sa nasýtený roztok chloridu amónneho pri 0 °C, aby sa reakcia ukončila. K reakčnej zmesi sa pridá etyléter a oddelí sa organická fáza. K vzniknutému gélu sa pridá vodný roztok hydroxidu sodného, aby sa gél rozpustil a roztok sa potom vytrepe etyléterom. EtyléteTové extrakty sa spoja, vysušia sa nad síranom horečnatým a prefiltrujú. Po odstránení rozpúšťadla destiláciou sa získa 3,9 g nažltlého žiadaného produktu. Výťažok je 88 %, teplota topenia 174 až 175 °C.

Podobným spôsobom sa pripravia nasledujúce látky.

F

fvj ]

Stupeň B [4-(4'-fluórfenyl)-1,3-dimetyl-6-( l'-metyletyljpyrazol[3,4-b]pyridín-5-yl]karboxyaldehyd (látka Vb-1)

Chlorochroman pyridínu (4,2 g, 19 mmol), 0,69 g bezvodého octanu sodného a 3,8 g (12 mmol) látky Vlb-1 sa suspenduje v 50 ml suchého dichlórmetánu pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes sa mieša jednu hodinu, potom sa pridá 100 ml etyléteru a dôkladne sa premieša. Potom sa reakčná zmes prefiltruje za zníženého tlaku vrstvou ceritu a filtrát sa odparí do sucha za zníženého tlaku. Zvyšok sa prečistí stĺpcovou chromatografíou na silikagéli (elúcia chloroformom) a získa sa 2,9 g nažltlého žiadaného produktu. Výťažok 78 %, teplota topenia 144-146 °C.

Podobným spôsobom sa pripravia nasledujúce látky.

F

x	teplota topenia Cc;
a	150.1-151.«
Me

vb-j N J\|	149-151
Me
El
	174-176

Stupeň C a D (E)-3 -[4'-(4-fluórfenyl)-1 ',3 '-dimetyl-6'-( 1 -metyletyl)pyrazol[3,4-b]pyridín-5'-yl]propénaldehyd (látka IIlb-1)

Stupeň C

Cis-l-etoxy-2-(tri-n-butylcín)etylén (1,45 g, 40 mmol) sa rozpustí v 50 ml suchého tetrahydrofuránu a roztok sa ochladí na -78 °C v prúde dusíka. Potom sa k tomuto roztoku pridá po kvapkách 26 ml (40 mmol) roztoku s obsahom 15 % hmotn. n-butyllítia v n-hexáne. Potom sa k reakčnej zmesi prikvapkáva roztok 2,5 g (8 mmol) látky Vb-1 v 20 ml tetrahydrofuránu. Reakčná zmes sa mieša jednu hodinu pri -78 °C a potom sa na ukončenie reakcie pridá 26 ml nasýteného roztoku chloridu amónneho. Organická fáza sa vytrepe do etyléteru a éterový extrakt sa premyje nasýteným vodným roztokom chloridu sodného a vysuší nad bezvodým síranom horečnatým. Rozpúšťadlo sa oddestiluje za zníženého tlaku a zvyšok sa roztrepe medzi n-hexán a acetonitril. Acetonitrilová vrstva sa destiluje za vákua, aby sa odstránilo rozpúšťadlo a aby sa získala v podstate čistá látka IVb-1.

Stupeň D

Látka IVb-1 získaná v stupni C sa rozpustila v 70 ml tetrahydrofuránu a potom sa pridalo 20 ml vody a 3 g kyseliny p-toluénsulfónovej. Zmes sa miešala pri laboratórnej teplote 2 h. Potom sa reakčná zmes opatrne zneutralizovala vodným roztokom hydroxidu sodného a potom sa vytrepala päťkrát éterom. Extrakt sa premyl nasýteným roztokom chloridu sodného a vysušil sa na bezvodom sírane horečnatom. Rozpúšťadlo sa potom oddestilovalo za zníženého tlaku. Zvyšok sa prečistil

SK 279277 Β6 stĺpcovou chromatografiou na silikagéli (eluent etylacetát/n-hexán = 1/9 (obj./obj.)) a získal sa žltý žiadaný produkt. Množstvo 2,2 g (výťažok 79 %), teplota topenia 133 až 134 °C.

Rovnakým spôsobom sa pripravili nasledujúce látky.

teplota topenia (‘C)

M e

Me

141.i

-.25-137

Et mc-1 M,/'.ý 13É-1J6

Stupeň E

Etylester kyseliny (E)-7-[4'-(4-fluórfenyl)-ľ,3'-dimetyl-6'-(l-metyletyl)pyrazol[3,4-b]pyridin-5-yl]-5-hydroxy-3-oxohept-6-énovej (látka Ilb-1)

Hydrid sodný (60 % hmotn., 1,25 g) sa premyl suchým petroléterom, vysušil v prúde dusíka a potom sa suspendoval v 200 ml suchého tetrahydrofuránu. Suspenzia sa ochladila na -15 °C v prúde dusíka a potom sa prikvapkalo 3,9 ml (30 mmol) acetoctanu etylnatého. Zmes sa miešala 15 min. Potom sa k nej pridalo po kvapkách 20 ml (30 mmol) roztoku s obsahom 15 % hmotn. n-butyllítia v n-hexáne a zmes sa miešala 30 min. Potom sa do zmesi prikvapkal roztok 2,1 g (6,1 mol) látky IIIb-1 v suchom tetrahydrofuráne a zmes sa miešala jednu hodinu. Po pridaní 10 ml nasýteného vodného roztoku chloridu amónneho pri -15 °C sa zmes vytrepala trikrát dietyléterom. Éterová vrstva sa premyla nasýteným vodným roztokom chloridu sodného, vysušila sa nad síranom horečnatým a potom sa odparila do sucha za zníženého tlaku. Zvyšok sa prečistil stĺpcovou chromatografiou na silikagéli (eluent etylacctát/chloroform = = 1/9 (obj./obj.)) a získalo sa 2,5 g (výťažok 89 %) bieleho žiadaného produktu. Teplota topenia 95 až 98 °C.

Rovnakým spôsobom sa pripravili nasledujúce zlúStupeň F

Etylester kyseliny (E)-7-[4'-(4-fluórfenyl)-ľ,3'-dimetyl-6'-(l-metyletyl)pyrazol[3,4-b]pyridín-5'-yl]-3,5-dihydroxy-3-hept-6-énovej (látka I-lb-1)

Látka ΙΙΐ>-1 (2,32 g, 4,96 mmol) sa rozpustila v 20 ml etanolu pod dusíkom a roztok sa ochladil na 0 °C. Potom sa pridalo 740 mg (20 mmol) borohydridu sodného a zmes sa miešala jednu hodinu. Zmes sa opatrne zneutralizovala 10 % hmotn. roztokom kyseliny chlorovodíkovej. Reakčná zmes sa potom trikrát vytrepala éterom. Éterový extrakt sa premyl vodným roztokom chloridu sodného a vysušil sa nad síranom horečnatým. Potom sa roztok odparil do sucha za zníženého tlaku. Olejovitý zvyšok sa prečistil stĺpcovou chromatografiou na silikagéli (eluent etanol/chloroform = 3/97 (obj./obj.)) a získal sa čistý žiadaný produkt vo forme bezfarebného viskózneho oleja. Množstvo 1,81 g (výťažok 78 %).

NMR (δρρπι CDCI3)

1,28 (t, J - 8 Hz, 3H), 1,32 (d, J - 8 Hz, 6H), 1,4-1,8 (m, 1H), 1,92 (s, 3H), 2,2-2,6 (m, 3H), 2,9-3,8 (m, 2H), 3,42 (7 heptalet, J = 8 Hz), 4,06 (s, 3H), 4,1-4,6 (m, 4H), 5,1-5,5 (m, 1H), 6,4-6,7 (m, 1H), 6,9-7,3 (m, 4H).

Rovnakým spôsobom sa pripravili nasledujúce zlú-

Et '“i

105-108

olejovitá látka

Stupeň G

Sodná soľ kyseliny (E)-7-[4^,-(4-fluórfenyl)-ľ,3'-dimetyl-6'-(l-metyletyl)pyrazol[3,4-b)pyridín-5'-yl]-3,5-dihydroxyhept-6-énovej (látka I-5b-l)

Látka I-lb-1 (200 mg, 0,43 mmol) sa rozpustila v 2 ml etanolu a potom sa po kvapkách pridalo 0,85 ml vodného roztoku 0,5 N hydroxidu sodného. Zmes sa miešala jednu hodinu pri laboratórnej teplote. Potom sa etanol oddestiloval za zníženého tlaku a k zvyšku sa pridali 2 ml vody. Zmes sa potom vytrepala etyléterom. Vodná vrstva sa lyofilizovala a získalo sa 180 mg (91 %) hygroskopického nažltlého prášku. Teplota topenia 258-264 °C (za rozkladu).

Rovnakým spôsobom sa pripravili nasledujúce zlúčeniny.

Me

^M<C teplota topenia Í'C) •197-199 (za rozkLadu}

2311-217

212-216

I za rozkladu|

Rovnakým spôsobom sa pripravili nasledujúce zlúčeniny.

Mc

N Me

Me

Kyselina (E)-7-[4'-(4-fluórfenyl)-1 ’,3'-dimetyl-6'-(l-metyletyl)pyrazol[3,4-b]pyridín-5'-yl]-3,5-dihydroxyhept-6-énová (látka I-2b-l).

K látke I-lb-1 v množstve 0,25 g (0,53 mmol), rozpustenej v 3 ml etanolu, sa pridalo po kvapkách 1,06 ml vodného 0,5 N roztoku hydroxidu sodného. Etanol sa oddestiloval za zníženého tlaku a potom sa pridali k zvyšku 3 ml destilovanej vody. Zmes sa vytrepala etyléterom. Vodná vrstva sa opatrne neutralizovala 1 % hmotn. kyselinou chlorovodíkovou a potom sa vytrepala etyléterom. Éterová vrstva sa vysušila nad bezvodým síranom horečnatým a potom sa destilovala za zníženého tlaku, aby sa získal požadovaný produkt. Množstvo 0,21 g (výťažok 90 %).

P-NMR (DMSO-dg) Óppm:

I, 29 (d, J = 7 Hz, 6H), 1,83 (s, 3H), 2,1-2,3 (m, 2H), 2,4-2,6 (m, 1H), 3,0-3,6 (m, 4H), 3,96 (s, 3H), 4,3-4,8 (m, 2H), 5,2-5,6 (m, 1H), 6,3-6,6 (m, 1H), 7,2-7,4 (m, 4H),

II, 5-12 (bs, 1H)

Stupeň H (E)-Trans-6-(2'-[4-(4’.(fluórfenyl)-l,3-dimetyl-6-1 '-metyletyl)pyrazol[3,4-b]pyTÍdin-5-yl]etenyl)-4-hydroxy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-2-ón (látka I-3b-1)

Látka I-2b-l v množstve 130 mg (0,29 mmol) sa rozpustila v 6 ml dichlórmetánu a potom sa k tomuto roztoku pridalo 125 mg (0,29 mmol) N-cyklohexyl-N'-(2-metylmorfolinoetyl)karbodiimid p-toluénsulfonátu. Zmes sa miešala pri laboratórnej teplote 2 h, potom sa rozpúšťadlo oddestilovalo za zníženého tlaku do sucha. Olejovitý zvyšok sa prečistil chromatografiou na tentej vrstve (eluent hexán/etylacetát = 9/1 (obj./obj.)) a získal sa žiadaný produkt vo forme bezfarebného viskózneho oleja. Množstvo 48 mg (výťažok 39 %).

P-NMR (CDCI3) Sppm:

1,33 (d, J = 6,8 Hz), 1,4-1,5 (m, 1H), 1,6-1,7 (m, 2H), 1,93 (s, 3H), 2,5-2,6 (m, 1H), 2,68 (dd, J = 18 Hz, J = 5 Hz, 1H), 3,39 (heptalet, J = 6,8 Hz, 1H), 4,07 (s, 3H), 4,1 - 4,2 (m, 1H), 5,1 - 5,2 (m, 1H), 5,31 (dd, J = 16 Hz, 1H), 6,61 (dd, J = 16 Hz, J = 1,5 Hz, 1H), 7,1 - 7,3 (m, 4H)

Príklad 1

Inhibičné účinky na migráciu buniek hladkého svalstva médie aorty (M-SMC)

Inhibičné účinky látok podľa tohto vynálezu na migráciu M-SMC sa merali nasledujúcimi metódami.

Rezy aortovej médie pripravené z hrudnej (thorakálnej) aorty samcov krýs kmeňa Sprague Dawley sa kultivovali v Eaglovom médiu modifikovanom Dulbeccom (DME) s obsahom 10 % fetálneho hovädzieho séra (FBS) pri 37 °C v atmosfére s obsahom 95 % obj. vzduchu a 5 % obj. oxidu uhličitého počas 3 až 4 týždňov. Bunky hladkého svalstva aortovej médie vyrastené z rezov aortovej médie sa subkultivovali po nariedení bunkovej hustoty 1 : 2 tak, aby sa získala stabilná podkultúra. Po troch až štyroch subkultiváciách sa bunky v konfluentnom stave trypsinizovali a potom suspendovali v uvedenom médiu pri hustote buniek 500 000 buniek na ml. Testovaná látka rozpustená v dimetylsulfoxide (DMSO) sa potom pridala k suspenzii buniek tak, aby výsledná koncentrácia DMSO bola 0,2 % obj. a suspenzia buniek sa preinkubovala pri 37 °C počas 30 min. DMSO v rovnakej koncentrácii sa použil ako kontrola. Do dolného oddielu Boydenovej komôrky oddelenej nitrocelulózovou membránou sa naplnilo 10 ng/ml rastového faktora odvodeného z krvných doštičiek (PDGF) alebo DME médium s obsahom 10 % obj. SMC-kondiciovaného DME média (SMC-CM) získaného 48 h kondicionáciou ako migračný faktor. Do hornej komôrky sa naplnil 1 ml bunkovej suspenzie a potom sa inkubovalo pri 37 °C počas 4 h za podmienok kultivácie. V slepom pokuse sa do dolnej komôrky naplnilo DME médium bez migračného faktora. Po štyroch hodinách inkubácie bunky, ktoré prilipli na hornú stranu nitrocelulózovej membrány sa odstránili a bunky, ktoré odmigrovali na spodnú stranu membrány sa fixovali a zafarbili roztokom Diff Quik. Počet odmigrovaných buniek sa počítal v 10 poliach pod optickým mikroskopom pri 400 x HPF.

Získané výsledky sa vyjadrili ako priemerná hodnota počtu buniek v troch komôrkach a % inhibície sa počítalo s použitím nasledujúceho vzťahu:

Inhibicia (%) = 100 - {(T-B)/(C-B) x 100}, kde B jc počet buniek v slepom pokuse, C počet buniek v kontrolnej vzorke a T počet buniek nájdených v pokuse s testovanou látkou.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 5. Látky podľa tohto vynálezu mali silné inhibičné účinky na migráciu M-SMC v porovnaní s porovnávacou zlúčeninou.

Tabuľka 5

	Inhi b i c i a (%)
PDGF	SMC-CH
Látka Koncentrácia (M)	L0'⁵	10-’
Testovacia látka 1	77, a	28.4
Testovacia látka 2	98,2	32.8
Testovaciu látka 3	100	41.7
Pravastati n	61, 8	26, Z

Príklad 2

Inhibičné účinky na proliferáciu buniek hladkého svalstva aortovej intimy a médie (I-SMC a M-SMC)

Inhibičné účinky látok podľa tohto vynálezu na proliferáciu I-SMC a M-SMC sa merali nasledujúcimi metódami.

Rezy aortovej médie pripravenej zo zdravého japonského králika a rezy aortovej intimy z intimových lézií izolovaných z médie aorty aterosklerotického japonského králika chovaného na 1 % hmotn. cholesterolovej diéte počas 3 mesiacov sa kultivovali v DME médiu s obsahom 10 % obj. FBS a antibiotika spôsobom opísaným v príklade 1. Po dvojitej či trojitej subkultivácii sa konfluentné bunky trypsinizovali a suspendovali v uvedenom médiu tak, aby hustota buniek bola 20 000 buniek/ml. Potom sa 10 000 buniek vysialo a kultivovalo na doštičke s 24 jamkami. Po 6 h inkubácii sa médium nahradilo 0,5 ml kontrolného média alebo média s obsahom testovanej látky. Pritom sa spočítali aj bunky pôvodne prichytené k doštičke a ich počet sa považuje za východiskový počet buniek (I). Testovacia látka sa pridala do média spôsobom opísaným v príklade 1. Ako kontrola sa použil DMSO vo výslednej koncentrácii 0,2 % obj. Médium sa menilo každé 2 dni a 1., 2., 3., 5. a 7. deň sa bunky trypsinizovali, rozpustili v Isotone a počet buniek sa stanovil s pomocou Coulterovho počítača.

Získané výsledky sa vyjadrili ako priemerný počet buniek v troch jamkách a % inhibície ako násobok počtu buniek od 2. do 5. dňa sa počítalo s použitím nasledujúceho vzťahu:

Inhibícia (%)= 100- {(T₅/T₂y(C5/C2) x 100}, kde T₂ a T5 je počet buniek druhý resp, piaty deň v médiu s obsahom testovacej látky, a C₂ a C5 počet buniek druhý resp. piaty deň v kontrolnom médiu.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 6. Látky podľa tohto vynálezu mali silné inhibičné účinky na proliferáciu tak I-SMC ako aj M-SMC v porovnaní s porovnávacou zlúčeninou. Navyše inhibičný účinok na proliferáciu I-SMC bol vyšší ako na proliferáciu M-SMC.

Tabuľka 6

	1nh i bi t Intitna	:ia (%) Nédiu
l.útku	r,....-..,..	:iu (M)	1Π-6		10’°	_](J-5
Testovacia	látku 1		36.4	98, l	6.3	91,5
Testovac ía	látka 2		84,6	98,2	4.7	86,5
Testovaciu	látka 3		100	100	31.5	100
Pcavustat ir			1.3	1.3	8.7	-11.7

Príklad 3

Inhibičný účinok na spotrebu ³H-tymidínu v bunkách hladkého svalstva aortovej intimy a médie (I-SMC a M-SMC)

Inhibičné účinky látky podľa tohto vynálezu na spotrebu ³H-tymidinu v I-SMC a M-SMC sa merali nasledujúcimi metódami.

M-SMC a I-SMC sa získali z aortovej médie zdravého japonského králika a z aortovej intimy aterosklerotického japonského králika, ako je uvedené v príklade 2. Po troch alebo štyroch subkultiváciách sa konfluentné bunky trypsinizovali a suspendovali v DME médiu s obsahom 10 % obj. FBS a antibiotika tak, aby hustota buniek bola 40 000 buniek na ml. Po 4 dňoch kultivácie sa médium nahradilo kontrolným médiom alebo médiom s obsahom testovacej látky opísanej v príklade 2 a v kultivácii sa pokračovalo 24 h. Potom sa pridalo 1 pCi (37 MBq) ³H-tymidínu a v kultivácii sa pokračovalo 3 h. Bunky sa premyli trikrát fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS) a opracovali vychladenou 5 % obj. kyselinou trihlóroctovou (TCA). Nerozpustná frakcia sa premyla vychladenou TCA a potom sa rozpustila vo vodnom 0,5 M roztoku hydroxidu draselného. Rádioaktivita ³H sa merala na kvapalnom scintilátore a stanovil sa obsah bielkovín.

Získané výsledky sa počítali ako rádioaktivita na 1 mg bielkoviny a vyjadrili priemernou hodnotou pre 3 jamky. Inhibícia (%) sa počítala podľa nasledujúceho vzťahu.

Inhibícia (%) = 100 - T/C x 100

Výsledky sú uvedené v tabuľke 7. Látky podľa tohto vynálezu mali silný inhibičný účinok na spotrebu ³H-tymidínu vo frakcii v DNA v bunkách hladkého svalstva intimy a médie v porovnaní s porovnávacou látkou.

Tabuľka 7

	Inhibícia Intima	(*>
Méd	i“
Látka	Koncentrácia (N)	10’®	ΙΟ'⁵	10’⁶	ICk ⁵
Testtivacia	látka 1	32.2	83.1	46,7	90.8
Testovac i a	látka 2	11.7	91.5	36.4	88.4
Testovaciu	látka 3	69.9	94.1	53,6	92,2
		-7.0	-7.2	8,7	-34.3

Príklad 4

Inhibícia adhézie leukemických buniek (HL-60)

Inhibičné účinky látok podľa tohto vynálezu na adhéziu HL-60 buniek sa merali nasledujúcimi metódami. HL-60 bunky sa pestovali v RPMI médiu s obsahom 10 % obj. FBS a antibiotika pri 37 °C v atmosfére s obsahom 95 % obj. vzduchu a 5 % obj. oxidu uhličitého a potom sa vysiali do 6 jamiek viacjamkovej doštičky v množstve 2 ml na jamku pri hustote buniek 1 000 000 buniek na ml. Testovacia látka rozpustená v DMSO sa pridala tak, aby výsledná koncentrácia DMSO bola 0,2 % obj. a potom sa uskutočnila 48 h preinkubácia. Potom sa vysialo 500 000 buniek do 24 jamiek viacjamkovej doštičky a pridal sa 0,02 M etanolový roztok forbol myristát-acetátu v množstve 1/250 (obj./obj.) do kultivačného média. V kultivácii sa potom pokračovalo 12 h. Po tomto čase sa bunky premyli PBS a bunky prichytené k stenám bunky sa zoškrabli, trypsinizovali a suspendovali v Isotone. Počet buniek sa spočítal s pomocou Coulterovho počítača. V kontrolnom pokuse sa pridal len DMSO.

SK 279277 Β6

Získané výsledky sa vyjadrili ako priemerná hodnota počtu buniek v troch jamkách v čase preinkubácie a inhibícia (%) sa vypočítala podľa nasledujúceho vzťahu.

Inhibícia adhézie (%) = 100 - T/C x 100, kde T je počet buniek v médiu s obsahom testovacej látky a C počet buniek v kontrolnom médiu. Výsledky sú uvedené v tabuľke 8. Látky podľa tohto vynálezu mali zreteľne silný inhibičný účinok na adhéziu HL-60 buniek indukovanú v porovnaní s porovnávacou zlúčeninou.

Tabuľka 8

F

Inliibiciu (%)

Látka Koncentrácia (K)	10'⁷	10’⁶	1O’^S
Testovacia látku 1	1,0	12, 3	<;a, 7
Testovacia látka 3	4.8	92, 2	96.4
Pruvas m t i n			-2,8

Testovacia látka 5

Príklad 5

Inhibícia adhézie J774 makrofágov (J774-Moo)

Inhibičné účinky látok podľa tohto vynálezu na adhéziu J774-Moo sa merali nasledujúcimi metódami.

Bunky v počte 1 000 000 sa vysiali do 6 jamiek viacjamkovej doštičky a kultivovali v 1 ml média s obsahom 10 % obj. FBS a antibiotika pri 37 °C v atmosfére s obsahom 95 % obj. vzduchu a 5 % obj. oxidu uhličitého 2 dni. Kultivácia potom pokračovala v kontrolnom médiu s obsahom 0,2 % DMSO alebo s médiom s obsahom testovacej látky (48 h preinkubácia). Bunky sa potom zoškrabli s pomocou gumovej tyčinky a suspendovali sa v uvedenom médiu. Bunky v počte 200 000 sa vysiali do 24 jamiek viacjamkovej doštičky a kultivovali 12 h. Potom sa bunky prichytené na stenách zoškrabli s pomocou gumovej tyčinky a ich počet sa stanovil s pomocou Coulterovho počítača.

Získané výsledky sa vyjadrili ako priemerná hodnota počtu buniek v troch jamkách v čase preinkubácie pre každý prípad a inhibícia (%) adhézie sa vypočítala s pomocou nasledujúceho vzťahu.

Inhibícia (%) adhézie = 100 - T/C x 100, kde T je počet buniek v médiu s obsahom testovacej látky a C počet buniek v kontrolnom médiu. Výsledky sú uvedené v tabuľke 9. Látky podľa tohto vynálezu mali silné inhibičné účinky na adhéziu J774-Mco.

Tabuľka 9

F

Z

F

Testovacia látka 7

Testovacia látka 8

1=

011 I

-CH

OH

I

-Cll₂-CH-CH_z-COONa

Testovacia látka 9

OH OH

I I ’í~-.....CH-CE_z-CII-CII₂-CIX)Na

Testovacia látka 10

Príklad 6

Ten istý test ako v príklade 1 sa vykonal s uvedenými zlúčeninami a výsledky testu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 10.

InMtoicta (¾)

Latka Koncentrácia (M) ΙΟ^-610*

Testovacia latka 1 53,C74,5

Testovacia látka 2 92,292,4

Pravastatir. 40,041,3

Siarvastatin 4B,548,G

Testovacie látky 4 až 10

F

OH OH

Z=—CH-CI^-CH-CI^-COO - !/íCa

Testovacia látka 4

Tabuľka 10

	Inhibícia (96)
PDGF	SMC-C1
Látka	Kont	cntricia (M)	IĎ’	m-⁵
Testovacia	látka	4	90.9	67. s
Testovacia	látka	5	98,3	24,4
Testovacia	látka	Ď	100	56.3
Testovaciu	látku	7	89,7	45.2
Testovacia	látka	8	JOO	46.2
Testovacia	látka	9	95,6	«5.3
Testovacia	látka	10	ioo	ď6.9
Pravú*tuti r			67,2	14,3

Príklad 7

Ten istý test ako v príklade 2 sa vykonal s uvedenými zlúčeninami 4 až 8 a výsledky testu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 11.

Tabuľka 11

1nhi b í c intimei	Médiu
Látka	Koncenlrúc i a (M)	iir⁶	1ΙΓ⁵	nr^ft	10 *⁵
Testovucía	latku	4	u .6	55 . 1	15.3	52 7
Testovacia	látka	5	9 3, a	81.0	-20,2	37 .5
Testovacia	látku	6	93,3	90,6	-11 ,6	41,9
Testovacia	látku	7	3.4	RR.O	12. 1	13.8
Testovaci u	liitka	R	18.4	91,2	24.2	S 1.6
Pravustu t i 1			0.9	14.2	-13.4	-4.0

Príklad 8

Ten istý test ako v príklade 3 sa vykonal s uvedenými zlúčeninami 4 až 8 a výsledky testu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 12.

Tabuľka 12

	Inhibicia (%)
Inti na	Médiu
Látka	Koncentrácia (M)	10'⁶	10·⁵	10’⁶	10'⁵
Testovací	a látka 4	31.2	80,0
Testovací	a láLka 5	68.D	93,5	36.2	84.2
Testovací	a látka 6	48.»	88.0	42.3	88,7
Testovací	h látka 7	33.6	50,8	37.0	44.9
Testovac i	u látku 8	25.4	64.5	36,5	67.5
Pravustat	In	4,8	23.7	1 f) .0	15.S

Príklady prípravy liekových foriem

Príklady prípravy tablety, tuhého kapsulového činidla, elastického kapsulového činidla, čapíka, injekčného činidla a granulovaného činidla sú uvedené.

1. Tableta obsahuje 5 % hmotn. zlúčeniny č. 4, 60 % hmotn. laktózy, 20 % hmotn. kukuričného škrobu, 5 % hmotn. hydroxypropylmetylcelulózy, 9 % hmotn. CMC-Ca soli a 1 % hmotn. stearátu horečnatého.

2. Tuhé kapsulové činidlo obsahuje 10 % hmotn. zlúčeniny č. 4, 30 % hmotn. laktózy, 59 % hmotn. mikrokryštalickej celulózy a 1 % hmotn. stearátu horečnatého.

3. Elastické kapsulové činidlo obsahuje 6,7 % hmotn. zlúčeniny č. 4, 92,6 % hmotn. C4-C10 alifatického kyslého triglyceridu a 0,7 % hmotn. polysorbátu 80 (t. j. polyoxyetylén 20 monooleátu sorbitolu, ktorý je definovaný vo Pharmacopoeia of Japan).

4. Čapík obsahuje 1,0 % hmotn. zlúčeniny č. 4, 98,5 % hmotn. ťažkého tuku a 0,5 % hmotn. polysorbátu 80 (ťažký tuk je Cg-C] 8 alifatický kyslý triglycerid, ktorý je definovaný vo Pharmacopoeia of Japan).

5. Injekčné činidlo obsahuje 0,01 % hmotn. zlúčeniny č. 4 a 99,99 % hmotn. destilovanej vody na injekcie.

6. Granulované činidlo obsahuje 5 % hmotn. zlúčeniny č.4, 60 % hmotn. laktózy, 20 % hmotn. kukuričného škrobu, 5 % hmotn. hydroxypropylmetylcelulózy a 10 % hmotn. CMC-Ca soli.

Podávacie dávky

Podávané množstvo (definované v nároku 9) zlúčeniny podľa vynálezu bolo stanovené nasledujúcim pokusom, klinickým testom na cholesterolové sérum a jeho vyhodnotením.

1. Pokus (1) Inhibičné účinky na zhrubnutie intimy a cholesterolové sérum v modeli balónového katetrového endoteliálneho poškodenia v králikoch.

Použili sa japonské biele králiky s hmotnosťou 2,5 až 2,9 kg, ktorým sa podávalo 100 g normálnej potravy a 250 ml vody.

Testovacia zlúčenina č. 4 sa suspendovala v 0,5 % vodnom roztoku karboxymetylcelulózy a podávala sa králikom o 9. hod. jedenkrát denne.

Kontrolným králikom sa podal 0,5 % vodný roztok karboxymetylcelulózy.

Po 8 dňoch podávania sa do ľavej hlavnej karotidovej aorty králika zaviedol 3F Fogarty kateter a endotérium sa trikrát opláchlo pri konštantnom balónovom tlaku.

Podávanie pokračovalo ďalšie tri týždne a potom sa králiky usmrtili, pričom sa vybrala karotidová aorta. Karotidová aorta sa bezprostredne fixovala v 10 % formaldehydovom neutrálnom tlmivom roztoku.

Kúsky vzorky karotidovej aorty, ktoré sa vybrali zo štyroch časti karotidovej aorty, sa patologicky zafarbili s elastica van gison (EVG).

Oblasť zhrubnutia intimy sa merala počítačovou zobrazovacou analýzou a výsledky sú znázornené na priloženom obr. 1.

Na druhej strane cholesterolové sérum sa meralo s použitím komerčne dostupnej enzýmovej techniky a výsledky po 11 dňoch sú znázornené na priloženom obr. 2.

(2) Zlúčenina č. 4 sa tiež podávala 7 dospelým mužom, ktorí mali najmenej 220 mg/dl cholesterolového séra, v množstve 1 mg jedenkrát denne počas 2 týždňov a výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

Cholesterolové sérum na počiatku podávania	Cholesterolové sérum po 2 týždňoch podávania	Rýchlosť poklesu cholesterolového séra
220.9 ng/dl	170,0 ng/dl	23 «

2. Vyhodnotenie (1) Z výsledkov na priloženom obr. 1, ktoré sa týkajú králikov, je zrejmé, že zlúčenina podľa tohto vynálezu pôsobí efektívne ako inhibítor ateroskerotického zhrubnutia intimy pri podávaní v množstve najmenej 0,3 mg/kg/deň.

(2) Tiež je zrejmé z výsledkov na obr. 2, ktoré sa týkajú králikov, že zlúčenina podľa tohto vynálezu opísaná v EP 304063 (2. február 1989) pôsobí efektívne ako inhibítor HMG-CoA reduktázy pri podaní v množstve najmenej 0,3 mg/kg/deň.

(3) Na druhej strane je zrejmé z výsledkov testov, ktoré sa týkajú ľudského jedinca, že zlúčenina podľa tohto vynálezu pôsobí efektívne ako inhibítor HMG-CoA reduktázy pri podaní v množstve najmenej 0,02 mg/kg/deň (výpočet vychádza z predpokladu, že priemerná hmotnosť ľudského jedincaje 60 kg).

(4) Tiež sa zistilo, že efektívne podané množstvo zlúčeniny podľa vynálezu, ktoré pôsobí ako inhibítor aterosklerotického zhrubnutia intimy u ľudského jedinca, je najmenej 0,03 mg/kg/deň.

on OH z= CH-CHj-ČH-CHj COO · l/2Ca

Testovacia látka 4

Priemyselná využiteľnosť

Látky podľa tohto vynálezu majú inhibičné účinky na HMG-CoA reduktázu a inhibujú aterosklerotické zhrubnutie intimy a tak sa stávajú užitočnými liekmi na prevenciu koronárnych srdcových chorôb, akými sú angína pectoris, infarkt myokardu, reathenoza po PTCA, cerebrovaskuláme kontrakcie po sabarachnoidnom krvácaní a uzatvárací sklerotizujúci arteritis.

Claims

1. Farmaceutický prostriedok proti aterosklerotickému zhrubnutiu intimy, vyznačujúci sa t ý m , že ako účinnú látku obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (I) v ktorom kruh X znamená skupiny vzorcov

K^5b v ktorých

R^4aje vodík, Cj-C4alkyl, fluór, chlór a bróm;

R⁴b je Cj-C4alkyl a fenyl; R^bje Cj-Cgalkyl;

R^4c a R5c sú vodík a Ci-C4alkyl,

R' jc vodík, fluór;

r3 je C^-Csalkyl, Cs-Cscykloalkyl;

Y je -CH2CH2-, -CH=CH-; a

Z je -CH(OH)-CH2-CH(OH)-CH2-CO2R¹², kde RÍ2 je vodík, NH4, sodík, draslík alebo monovalentný ekvivalent vápenatého iónu, alebo skupina v spojení s farmaceutický prijateľným nosičom a/alebo s inými farmaceutickými pomocnými látkami.

2. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú látku obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (la) v ktorom všetky substituenty majú význam uvedený v nároku L

3. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , žc ako účinnú látku obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (lb) v ktorom všetky substituenty majú význam uvedený v nároku 1.

4. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú látku obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (Ic) v ktorom všetky substituenty majú význam uvedený v nároku 1.

5. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú látku obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (la), v ktorom R² je cyklopropyl, Y je -CH=CH- a ostatné substituenty majú významy uvedené v nároku 1.

6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú látku obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (lb), v ktorom r3 je cyklopropyl, R⁴^ a R^b sú metyl, Y je -CH=CH- a ostatné substituenty majú významy uvedené v nároku 1.

7. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú látku obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (Ic), v ktorom R² je cyklopropyl, R^4c je etyl, R^^c je metyl, Y je -CH=CH- a ostatné substituenty majú významy uvedené v nároku 1.

8. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú látku obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (la), v ktorom Z je skupina -CH(OH)-CH2-CH(OH)-CH₂-CO2 monovalentný ekvivalent vápenatého iónu.

9. Farmaceutický prostriedok podľa nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinnú látku v dávke aspoň 0,03 mg/kg/deň.

10. Farmaceutický prostriedok podľa nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 0,01 až 100,0 mg účinnej látky a 50 až 99,9999 % hmotn. pomocnej látky alebo vody vzhľadom na celkovú hmotnosť prostriedku.

11. Farmaceutický prostriedok podľa nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že je vo forme tablety obsahujúcej 0,05 až 40,0 % hmotn. účinnej látky, 42,5 až 95,95 % hmotn. pomocnej látky, 2,5 až 10 % hmotn. spojiva, 1,0 až 5,0 % hmotn. dezintegrátora a 0,5 až 2,5 % hmotn. maziva.

12. Farmaceutický prostriedok podľa nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že je vo forme tuhej kapsuly obsahujúcej 0,05 až 40,0 % hmotn. účinnej látky, 57,5 až 99,45 % hmotn. pomocnej látky a 0,5 až 12,5 % hmotn. maziva.

13. Farmaceutický prostriedok podľa nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že je vo forme elastickej kapsuly obsahujúcej 0,05 až 40,0 % hmotn. účinnej látky, 59,0 až 99,85 % hmotn. pomocnej látky a 0,1 až 1 % hmotn. rozpúšťadla.

14. Farmaceutický prostriedok podľa nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že je vo forme čapíku obsahujúceho 0,01 až 40,0 % hmotn. účinnej látky, 59,0 až 99,89 % hmotn. pomocnej látky a 0,1 až 1 % hmotn. rozpúšťadla.

15. Farmaceutický prostriedok podľa nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že je vo forme injekcie obsahujúcej 0,0001 až 5,0 % hmotn. účinnej látky a 95,0 až 99,9999 % hmotn. destilovanej vody pre injekcie.

16. Farmaceutický prostriedok podľa nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že je vo forme granuly obsahujúcej 0,05 až 40,0 % hmotn. účinnej látky, 47,5 až 96,95 % hmotn. pomocnej látky, 2,5 až 10,0 % hmotn. spojiva a 0,5 až 2,5 % hmotn. maziva.