NO302452B1

NO302452B1 - Anvendelse av kondenserte pyridinderivater for fremstilling av farmasöytisk preparat

Info

Publication number: NO302452B1
Application number: NO923858A
Authority: NO
Inventors: Yasushi Saito; Masaki Kitahara; Mitsuaki Sakashita; Kyomi Toyoda; Toshie Shibazaki
Original assignee: Nissan Chemical Ind Ltd; Kowa Co
Priority date: 1991-10-04
Filing date: 1992-10-02
Publication date: 1998-03-09
Also published as: CZ302792A3; KR100264543B1; NO923858L; CA2079706C; HU214624B; AU2601292A; UA39095C2; JP3130342B2; NZ244555A; CZ281786B6; DE69232217T2; SK302792A3; US6162798A; AU652669B2; HUT62794A; TW238300B; DK0535548T3; DE69232217D1; EP0535548B1; JPH06329540A

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en forbindelse med formel (I)

(hvori R<4a>er hydrogen, C-L-Cg-alkyl, fluor, klor og brom;

R4ber Cj-Cg-alkyl og fenyl; R5b er d -C8- alkyl ;

R<4C>og R<5c>er hydrogen og Cx-C8-alkyl)

R<1>er hydrogen, fluor, klor og brom;

R<3>er Ci-Cg-alkyl, C3-C7-cykloalkyl;

Y er -CH=CH-;

Z er -CH(OH) -CH2-CH(OH) -CH2-COOH, eventuelt et natrium-, kalium- eller 1/2 kalsiumsalt derav, eller

for fremstilling av et farmasøytisk preparat med inhibering av formering av glatte aorta-muskelceller, migrering av glatte aorta-muskelceller som vender innover, inn i tunica intima vasourum, eller adhesjon av blodceller til endothelium.

Som utløsningsmekanisme antas den aterosklerotiske intimale fortykning av koronar-arterien å være en av hoved-årsakene til myokardialt infarkt og angina pectoris. Denne aterosklerose-intemalfortykning blir antatt å være initiert ved adhesjon av lymfocytter eller blodplater til endotele celler med sekresjon av cytokiner og lipidakkumulering, og å bli befordret ved migrering av M-SMC fra media til intima og formering av de glatte muskelceller i intima og økning av den ekstracellulære matriks på grunn av patologisk og proliferativ aktivering eller modulering av glatte muskelceller. Denne aktivering av cellene befordres ved riskofaktorer såsom hyper lipidemia. Tidligere er det blitt rapportert at HMG-CoA reduktaseinhibitorer undertrykker den aterosklerotiske intimalfortykning ved sterk reduksjon av serumkolesterol i dyremodell (Biochim. Biophis. Acta, 960, 294-302, (1988)), men virkningen i kliniske forsøk er blitt funnet utilstrekkelig.

Følgelig ønskes det en sterkere inhibitor for aterosklerotisk intimalfortykning, et medikament som er i stand til å virke på slik aterosklerose-skade. Tidligere har det vært rapporter om inhiberende virkninger på glatte muskelceller ved et antiblodplate-avledet vekstfaktor-medikament (PDGF) eller et anti-fibroblast vektsfaktor-medikament (FGF) (Life Science, 28, 1641-1646, (1981); J. Pharm. Exp. Ther., 248, 1167-1174,

(1989)), inhiberende virkninger av kalsiumantagonister på migrering av glatte muskelceller ved PDGF, tromboksan B4og interleukin-1 (aterosklerosis, 72, 213-219, (1988)), Inhiberende virkninger av RGD peptider på celleadhesjon (J. Cell Biol., 112, 335-344, (1991)), inhiberende virkninger av en tromboksan synteseinhibitor på re-atenose etter PTCA (ateroskleroses, 18, 661-665, (1990)). Dette er imidlertid virkningene av medikamenter mot blodplater eller stimuleringsfaktorer såsom cytokiner, og intet medikament er blitt funnet som virker direkte på aterosklerotiske patologiske glatte muskelceller. En glattmuskelcelle avledet migreringsfaktor sekretert fra glatte muskelceller gir sterkere stimulering av migrering enn PDGF, og blir antatt å ha nær sammenheng med initiering og progresjon av ateroskle rose (Atherosclerosis, 72, 213-226, (1991)), men det er ikke blitt funnet noe medikament som inhiberer slik migrering av glatte muskelceller. Den proliferative karakter av I-SMC, som ikke kan undertrykkes av prostaglandin I2 (Atherosclerosis, 73, 67-69, (1988)), blir dessuten antatt å være et viktig fenomen ved aterosklerose. Det er imidlertid ikke funnet noe medikament som inhiberer slik proliferativ karakter.

Det er blitt rapportert at HMG-CoA reduktaseinhibitorer har en inhibitorisk virkning på celleformering i fibroblaster, glatte muskelceller og lymfocytter (J. Biol. Chem., 259, 1546-1551 (1984); ibid 255, 5134-5140; Biochim. Biophys. Acta., 1051, 138-143, (1990)) og også undertrykker aktivering av lymfocytter (Int. J. Immunopharmac., 11, 863-869, (1989)). Slike inhiberende virkninger er imidlertid ikke fullstendig tilfredsstillende, og det ønskes et medikament som er mere effektivt og selektivt mot målceller, spesielt mot I-SMC, makrophager og monocytter.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en inhibitor for aterosklerose-intimalfortykning, som inneholder en effektiv mengde av en forbindelse med formelen (I):

(hvori R<4a>er hydrogen, C-L-Cg-alkyl, fluor, klor og brom;

R4ber d-C6-alkyl og fenyl; R<5b>er Cx-C8-alkyl;

R4CogR5c er hydrogen og Ci-Cg-alkyl)

R<1>er hydrogen, fluor, klor og brom;

R<3>er d-Cg-alkyl, C3 -C7- cykloalkyl ;

Y er -CH=CH-;

Z er -CH(OH)-CH2-CH(OH)-CH2-COOH, eventuelt et natrium-, kalium- eller 1/2 kalsiumsalt derav, eller

En slik forbindelse kan ha minst 1 eller to asymmetriske karbonatomer og har således minst 2 eller flere isomerer. Forbindelsen med formelen (I) ovenfor omfatter således alle slike optiske isomerer og blandinger derav.

Videre, av de forbindelser hvori karboksylsyre-derivatgruppen (-C02R<12>) av substituenten Z i forbindelsen med formel (I) er en karboksylsyre-derivatgruppe som er forskjellig fra den som er definert ved C02R<12>, blir de som er i stand til å omdannes til karboksylsyren (en forbindelse hvori -C02R<12>gruppen er -C02H) ved fysiologisk hydrolyse etter inntak, ansett for å være ekvivalente med forbindelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Forbindelsen er en kraftig inhibitor for adhesjon av blodceller (såsom monocytter, makrophager) til endotelceller, og undertrykker responsen i en tidlig fase av aterosklerose-intimalfortykning. Dessuten kan de være i stand til å inhibere migrering av mediale glattmuskelceller i aorta ved PDGF og ved det kondensjonerte medium av glatte muskelceller (SMC-CM) som kan inneholde glattmuskelcelle avledet migreringsfaktor for det autocrine stimuleringssystem. Dessuten vil forbindelsen inhibere opptak av<3>H-tymidin i glatte muskelceller og således inhibere DNA replikasjon, hvorved formering av cellene antas å bli effektivt inhibert. Disse virkninger er kraftigere i I-SMC enn virkningene i M-SMC. Ut i fra det foregående vil forbindelsen inhibere formering av glatte muskelceller i intima i aorta, som er i det viktigste trinn i den aterosklerotiske-intimalfortykning. På basis av den oppdagelse at forbindelsen har slike inhiberende virkninger mot aterosklerotisk-intimalfortykning, har man kommet fram til foreliggende oppfinnelse.

Forbindelsene, det vil si med mevalonolaktoner med formelen (I) kan fremstilles ved følgende reaksjoner.

I reaksjonsformlene erR<1>,R<2>,R3,R12,R14 og ring X som definert ovenfor med hensyn til formelen (I), og R<17>er C^_^lavere alkyl, såsom metyl, etyl n-propyl, i-propyl eller n-butyl.

Blant forbindelsene med formel (I), kan de med formlene (Vila), (Vllb) og (VIIc) fremstilles ifølge de metoder som er beskrevet i japansk patentsøknad nr. 279866/1989 (svarende til EP304063 og USP 5011930), japansk patentsøknad nr. 275878/1990 (svarende til EP339358 og USP 5024999) og japansk patentsøknad nr. 7290/1991 (svarende til EP367235 og USP 5026698).

Trinn A er en reduksjon av esteren til en primær alkohol, som kan gjennomføres ved hjelp av forskjellige metallhydrider, fortrinnsvis diisobutylaluminiumhydrid, i et løsningsmiddel som tetrahydrofuran, toluen eller metylenklorid ved en temperatur fra -20°C til 20°C, fortrinnsvis fra -10°C til 10°C.

Trinn B er en oksidasjon av den primære alkohol til et aldehyd, som kan gjennomføres ved hjelp av forskjellige oksidasjonsmidler. Det foretrekkes en fremgangsmåte hvori reaksjoner gjennomføres ved anvendelse av pyridiniumklorkromat i metylenklorid ved en temperatur fra 0°C til 25°C, en fremgangsmåte hvori reaksjonen (Swern oksidasjonen) gjennomføres ved anvendelse av oksalylklorid, dimetylsulfoksid og et tertiært amin (såsom trietylamin), og en fremgangsmåte hvori reaksjonen gjennomføres ved anvendelse av et svovel trioksyd-pyridinklompleks.

Trinn C er syntesen av et 3-etoksy-l-hydroksy-2-propylen-derivat, som kan oppnås ved omsetning av en forbindelse (V) med en litiumforbindelse dannet ved foreløpig behandling av cis-l-etoksy-2-(tri-n-butylstanhyl)etylen med butyl-litium i tetrahydrofuran. Som reaksjonstemperatur foretrekkes anvendelse av en lav temperatur ved et nivå fra -60°C til -78°C.

Trinn D er syntesen av enal ved hydrolyse med en syre. Ved anvendelse som syrekatalysator av fortrinnsvis p-toluensulfonsyre, saltsyre eller svovelsyre, kan omsetningen gjennomføres i en løsningsmiddelblanding av vann med tetrahydrof uran eller metanol ved en temperatur på 10°C til 25°C.

3-Etoksy-l-hydroksy-2-propylenderivatet nådd i trinn C kan anvendes i trinn D uten rensing, ganske enkelt ved å fjerne det samtidig dannede tetra-n-butyltinn.

Trinn E er en addisjonsreaksjon av enal (III) og en acetoeddiksyre-ester. Omsetningen gjennomføres fortrinnsvis ved anvendelse av natriumhydroksyd og n-butyl-litium som base i tetrahydrofuran ved en temperatur på -80°C til 0°C fortrinnsvis fra -30°C til -10°C.

Trinn F er en reaksjon hvori ketokarboksylsyre esteren (II) reduseres med forskjellige reduksjonsmidler.

Dette er en reaksjon hvor en karbonylgruppe blir redusert ved anvendelse av f.eks. natriumborhydrid,

natriumcyanoborhydrid, sinkborhydrid, disiamylboran, diboran, tert-butylaminoboran, et pyridinborankompleks, dicykloheksylboran, teksylboran, 9-borabicyklo[3.3.1]nonan, diisopinokamfenylboran eller litiumtri-sec-butylborhydrid, for å oppnå den tilsvarende dihydro-oksykarboksylsyreester (I-l) .

Denne reaksjon kan gjennomføres i et løsningsmiddel valgt fra et hydrokarbon, et halogenert hydrokarbon, en C-j__4alkohol, en eter og løsningsmiddelblandinger derav ved en temperatur på -100°C til 50°C, fortrinnsvis fra -78°C til 30°C.

Ellers kan det, som beskrevet i J. Amer. Chem. Soc., 105, 593, (1983), anvendes et trialkylboran såsom tri-n-butylboran eller trietylboran og natriumborhydrid ved lav temperatur.

Videre, som beskrevet i Tetrahedron Letters, 28, 155,

(1987), er det mulig fortrinnsvis å oppnå et erytroprodukt som har en biologisk sterkere aktivitet ved anvendelse av et alkoksydialkylboran såsom metoksydietylboran eller etoksy-dietylboran.

Denne reaksjon kan gjennomføres ved anvendelse av en løsningsmiddelblanding av en C-[__4alkohol og tetrahydrof uran ved en temperatur på -80°C til -50°C, fortrinnsvis fra -72°C til -68°C.

Trinn G er et trinn for hydrolyse for esteren, og reaksjonen kan gjennomføres ved anvendelse av en ekvimolar mengde av en base, fortrinnsvis kaliumhydroksyd eller natriumhydroksyd, i en løsningsmiddelblanding av vann og metanol, eller etanol ved en temperatur på 10°C til 25°C.

Den frie syre oppnådd her kan omsettes med en egnet base slik at det dannes et salt.

Trinn H er et trinn for å underkaste den frie hydroksysyre (1-2) en dehydreringreaksjon slik at det dannes et mevalonolakton, og reaksjonen kan gjennomføres ved oppvarming under tilbakeløp i benzen eller toluen under fjerning av det resulterende vann, eller ved tilsetning av et egnet dehydreringsmiddel, såsom en molekylsikt.

Ellers kan reaksjonen gjennomføres ved anvendelse av et laktondannende middel såsom et karbodiimid, fortrinnsvis et vannløslig karbodiimid såsom N-cykloheksyl-N'-[2 ' -(metyl-morfolinium)etyl]karbodiimid p-toluensulfonat i tørr metylenklorid ved temperatur fra10°C til 35°C, fortrinnsvis fra 20°C til 25°C.

Ellers kan forbindelsen med formelen (1-6), syntetiseres ut i fra et aldehyd med formelen (V) ved Wadsworth-Emmons coupling reaksjonen (J. Amer. Chem. Soc,107, 3731, (1985)).

Dessuten kan den syntetiseres ut i fra et enal med formelen (III) (Tetrahedron Letters, 26, 2951, (1985)).

Forbindelser som anvendes ifølge den foreliggende opprinnelse har inhiberende virkning på migrering av M-SMC, formering av I-SMC og celleadhesjon av blodceller til en endotelcelle, som vist ved testresultater som er gitt i det følgende. Forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan således anvendes som helbredelsesmidler mot aterosklerose.

De kan formuleres i egnede formuleringer avhengig av administrasjonsmåten. Forbindelsene som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse kan administreres i form av frie syrer eller i form av fysiologisk hydrolyserbare og akseptable estere eller laktoner eller farmasøytisk akseptable salter.

Den farmasøytiske blanding administreres fortrinnsvis oralt i form av selve forbindelsen eller i form av pulver, granuler, tabletter eller kapsler formulert ved å blande forbindelsen med en egnet farmasøytisk akseptabel bærer omfattende et bindemiddel såsom hydroksy-propylcellulose, sirup, gummiarabikum, gelatin, sorbitol, tragakantgummi, polyvinylpyrrolidon eller CMC-Ca, en eksipient såsom laktose, sukkermais-stivelse, kalsiumfosfat, sorbitol, glysin eller krystallinsk-cellulosepulver, et smøremiddel såsom magnesiumstearat, talk, polyetylenglykol eller silisiumdioksyd, og en disintegrator såsom potetstivelse.

Den farmasøytiske blanding er imidlertid ikke begrenset til slik oral administrasjon, og den kan anvendes for parenteral administrasjon. F.eks. kan den administreres i form av f.eks. en stikkpille formulert ved anvendelse av et oljeaktig basismateriale såsom kakaosmør, polyetylenglykol lanolin eller fettsyre triglyserin, en transdermal terapeutisk base formulert ved anvendelse av flytende parafin, hvit vaselin, en høyere alkohol, Macrogol salve, hydrofil salve, eller hydrogel basismateriale, en injeksjonsformulering formulert ved anvendelse av ett eller flere materialer valgt fra gruppen bestående av polyetylenglykol, hydrogel basismateriale, destillert vann, destillert vann for injeksjon og en eksipient såsom laktose eller mais-stivelse, eller en formulering for administrasjon gjennom slim-membraner såsom en øyeslim-membran, en neseslim-membran og en oralslim-membran.

Videre kan forbindelsene kombineres med basiske ionebytteharpikser som er i stand til å binde gallesyrer og allikevel ikke absorberes i magetarm-kanalen.

Den daglige dose av forbindelsen med formel I er fra 0,05 til 500 mg, fortrinnsvis fra 0,5 til 50 mg for en voksen. Den administreres fra en gang til tre ganger pr døgn. Dosen kan naturligvis varieres avhengig av pasientens alder, vekt og sykdommens tilstand.

Den foreliggende oppfinnelse skal nå beskrives i ytterligere detalj med referanse til eksempler som viser de inhiberende virkninger av forbindelsene på aterosklerose-intimalfortykning. Den kjemiske struktur av de testede forbindelser (testforbindelsene 1 til 3) og sammenlignings-forbindelser (Pravastatin som beskrevet i japansk ikke undersøkt patentsøknad nr. 185275/1982 eller EP65835, og Simvastatin som beskrevet i japansk ikke undersøkt patentsøknad nr. 122373/1981 eller EP33536) er som følger:

Testforbindelsel Testforbindelse 2 Testforbindelse 3

Referanseeksempel

(E)-trans-t-(2 ' -[4' ' - (4 ' ' ' (fluorfenyl)-1'',3''-dimetyl-6 ' ' -(1'' ' -metyletyl)pyrazolo[3,4-b]pyridin-5''-yl)etenyl)4-hydroksy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-2-on (forbindelse I-3b-l)

Denne forbindelse ble fremstilt ved anvendelse av metyl-2-cyklopropyl-5-etyl-3-(4'-fluorfenyl)-6-metyltieno[2,3-b]pyridin-3-ylkarboksylat (forbindelse VIIb-1) som utgangs-materiale ved de følgende trinn A til H.

På lignende måte ble testforbindelsene 1, 2 og 3 fremstilt ut i fra følgende mellomprodukter (VIIa-1, VIIb-2 og Vllc-l): Forbindelse VIIa-1

Metyl 2-cyklopropyl-4-(4'-fluorfenyl)kinolin-3-ylkarboksylat

Forbindelse VIIb-2

Metyl 6-cyklopropyl-3-etyl-4-[4'-fluorfenyl)pyrazolo [3,4-b]pyridin-5-ylkarboksylat

Forbindelse VIIc-1

Metyl 6-cyklopropyl-3-etyl-4-[4'-fluorfenyl)-2-metyltieno[2,3-b]pyridin-5-ylkarboksylat.

Testforbindelse 1 (I-3a-l) (E)-trans-6-(2'-[2''-cyklopropyl-4''-(4'''-fluorfenyl)-kinolin-3''-yl]etenyl)4-hydroksy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-2-on Testforbindelse 1 (I-3b-2) (E)-trans-6-(2'[6''-cyklopropyl-1'',3''-dimetyl-4''-(4 ' ''-fluorfenyl)pyrazolo[3,4-b] pyridin-5''-yl]etenyl)-4-hydroksy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-2-on Testforbindelse 3 (I-3c-l) (E)-trans-6-(2'-[2''-cyklopropyl-5''-etyl-3''-(4'''-fluorfenyl)-6''-metyltieno[2,3-b]pyridin-3''-yl]etenyl)-4-hydroksy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-2-on.

Trinn A

4-(4'-fluorfenyl)-5-hydroksymetyl-l,3-dimetyl-6-(1'-metyletyl)pyrazolo[3,4-b]pyridin (forbindelse VI-b-1)

Under nitrogenatmosfære ble 5,0 g (0,014 mol) av forbindelse VIIb-1 løst i tørr toluen og avkjølt til 0°C i isbad. Til denne løsning ble dråpevis tilsatt 35 ml av en toluenløsning inneholdende 16 vekt-% diisobutylaluminiumhydrid, og blandingen ble omrørt ved 0°C i 2 timer. Etter bekreftelse ved tynnsjiktkromatografi at forbindelse VIIb-1 var fullstendig forsvunnet, tilsattes en mettet ammonium-kloridløsning ved 0°C for å avbryte reaksjonen. Etyleter ble tilsatt reaksjonsblandingen, og det organiske sjikt ble fraskilt. Til den gelsubstans, tilsattes en vandig natriumhydroksydløsning for å løse denne, og løsningen ble ekstrahert med etyleter. Etyleterekstraktene ble samlet, tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert, og løsningsmidlet ble destillert av, hvilket ga 3,9 g av et svakt gult ønsket produkt. Utbytte: 88%, smeltepunkt: 174°C - 175°C.

På lignende måte fremstiltes følgende forbindelser.

Trinn B

[4-(4 '-fluorfenyl)-1,3-dimetyl-6-(1'-metyletyl)-pyrazolo [3,4-b]pyridin-5-yl)karboksyaldehyd (forbindelse Vb-1)

4,2 g (19 mmol) pyridiniumklorkromat, 0,69 g vannfritt natriumacetat og 3,8 g (12 mmol) av forbindelse VIb-1 ble slemmet opp i 50 ml tørt diklormetan ved romtemperatur. Reaksjonsløsningen ble omrørt i 1 time, og 100 ml etyleter ble tilsatt hertil og kraftig omrørt. Reaksjonsblandingen ble filtrert med vakuum, gjennom et cerit-sjikt, og filtratet ble inndampet til tørrhet under redusert trykk. Resten ble renset ved silikagelkolonne kromatografi (elueringsmiddel: kloroform) hvilket ga 2,9 g av et svakt gult ønsket produkt.

Utbytte: 78%, smeltepunkt: 144-146°C.

På lignende måte fremstiltes følgende forbindelse.

Trinn C og D

(E)-3-[4 '-(4 ' '-fluorfenyl)-1',3'-dimetyl-6'-(1''-metyl-etyl) pyrazolo [3,4-b)pyradin-5'-yl]propenaldehyd (forbindelse

IIIb-1)

Trinn C

1,45 g (40 mmol) av cis-l-etoksy-2-(tri-n-butylstannyl)etylen ble løst i 50 ml tørr tetrahydrofuran, og løsningen ble avkjølt til -78°C under nitrogenstrøm. Til denne løsning ble dråpevis tilsatt, 26 ml (40 mmol) av en løsning av 15 vekt-% av en n-butyl-litium i n-heksan. Blandingen ble omørt i 20 minutter. Deretter ble dråpevis tilsatt en løsning med 2,5 g (8 mmol) av forbindelse Vb-1 løst i 20 ml tørr tetrahydrofuran. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -78°C i 1 time, og deretter tilsattes 26 ml av mettet ammoniumklorid-løsning for å avbryte reaksjonen. Det organiske sjikt ble ekstrahert med dietyleter, og eterekstraktet ble vasket med en mettet vandig natriumkloridløsning og tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble destillert av under redusert trykk, og resten ble underkastet væskeseparasjon mellom n-heksan og acetonitril, og acetonitrilsjiktet ble destillert under redusert trykk for å destillere av løsningsmidlet, hvilket ga i alt vesentlig ren forbindelse IVb-1.

Trinn D

Forbindelse IVb-1 oppnådd i trinn C ble løst i 70 ml tetrahydrofuran, og 20 ml vann og 3 g av p-toluen sulfonsyre ble tilsatt dertil. Blandingen ble omrørt til romtemperatur i to timer. Reaksjonsløsningen ble forsiktig nøytralisert med en vandig natriumhydroksydløsning og deretter ekstrahert et par ganger med dietyleter. Ekstraktet ble vasket med en mettet vandig natriumkloridløsning og tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Deretter ble løsningsmidlet destillert av under redusert trykk. Resten ble renset ved silikagelkolonne-kromatografi (elueringsmiddel: etylacetat/n-heksan = 1/9 (v/v)), hvilket ga et gult ønsket produkt. Mengde: 2,2 g (utbytte: 79%), smeltepunkt: 133 - 134°C.

På samme måte fremstiltes følgende forbindelser.

Trinn E

Etyl (E)-7-[4'-(4''-fluorfenyl)-1',3 '-diemtyl-6 '-(1 ' '-metyletyl)pyrazolo[3,4-b]pyridin-5-yl]-5-hydroksy-3-oksohept-6-enoat (forbindelser IIb-1)

1,25 g av 60% natriumhydrid ble vasket med tørket petroliumeter, tørket under nitrogen og deretter slemmet opp i 200 ml tørr tetrahydrofuran. Oppslemmingen ble avkjølt til -15°C i nitrogenatmosfære, og 3,9 ml (30 mmol) av etylacetoacetonat ble dråpevis tilsatt dertil. Blandingen ble omrørt i 15 minutter. Deretter tilsattes dråpevis 20 ml (30 mmol) av en løsning av 15 vekt-% av n-butyl-litium i n-heksan, og blandingen ble omrørt i 3 0 minutter. Videre ble det dråpevis tilsatt en løsning med 2,1 g (6,1 mmol) av forbindelser IIIb-1 løst i tørr cetrahydrofuran, og blandingen ble omrørt i 1 time. Til reaksjonsblandingen ble tilsatt 10 rn; mettet vandig ammoniumkloridløsning ved -15°C og blandingen ble ekstrahert tre ganger med dietyleter. Eterløsningen ble vasket med en mettet vandig natriumkloridløsning og tørket over vannfritt magnesiumsulfat, og deretter ble den inndampet til tørrhet under redusert trykk. Resten ble renset ved silikagelkolonne-kromatografi (elueringsmiddel: etyl-acetat/kloroform = 1/9 (v/v)), hvilket ga 2,5 g (utbytte: 98%) av et hvitt ønsket produkt. Smeltepunkt: 95-98°C.

På samme måte fremstiltes følgende forbindelser.

Trinn F

Etyl (E)-7- [4 '-(4 ' '-fluorfenyl)-1',3'-dimetyl-6'-(1 ' '-metyletyl)pyrazolo[3,4-b]pyridin-5 ' -yl]-3,5-dihyroksyhept-6-enoat (forbindelse I-lb-1)

Under nitrogenatmosfære ble 2,32 g (4,95 mmol) av forbindelser IIb-1 løst i 20 ml etanol, og løsningen ble avkjølt til 0°C. Deretter tilsattes 740 mg (20 mmol) natriumborhydrid, og blandingen ble omrørt i 1 time. En 10% vandig saltsyreløsning ble tilsatt dertil for omhyggelig å nøytralisere blandingen. Deretter ble blandingen ekstrahert 3 ganger med metyleter. Eterløsningen ble vasket med en mettet vandig natriumkloridløsning og tørket over vannfritt magnesiumsulfat, og deretter ble den inndampet til tørrhet under redusert trykk. Restoljen ble renset ved silikagelkolonne-kromatografi (elueringsmiddel: etanol/kloroform = 3/97 (v/v)), hvilket ga det rene ønskede produkt som en fargeløs viskøs olje. Mengder: 1,81 g (utbytte: 78%)

NMR(6ppm CDC13)

1,28 (t,J=8Hz,3H) , 1, 32 (d, J='8Hz, 6H) , 1, 4 -1, 8 (m, 1H) , l,92(s,3H), 2, 2-2, 6 (m, 3H) , 2 , 9-3 , 8.(m, 2H) ,

3,42 (7 heptalat, J=8Hz,lH), 4 , 06 (s , 3H) , 4 , 1-

4,6(m,4H), 5,1-5,5(m,1H), 6 , 4-6,7(m,1H) ,6,9-

7,3(m,4H)

På samme måte fremstiltes følgende forbindelser

Trinn G

Natriumsaltet av (E)-7-[4'-(4''-fluorfenyl)1',3'-dimetyl-6'-(1''-metyletyl)pyrazolo)[3,4-b]pyridin-5'-yl]-3,5-dihydroksy-hept-6-ensyre (forbindelser I-5b-l)

200 mg (0,43 mmol) av forbindelse I-lb-1 ble løst i 2 ml etanol, og 0,85 ml av en 0,5 N vandig natriumhydroksidløsning ble dråpevis tilsatt dertil. Blandingen ble videre omrørt ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble etanol destillert av

s under redusert trykk, og 2 ml vann tilsatt til resten. Deretter ble blandingen ekstrahert med etyleter. Det vandige sjikt ble frysetørket, hvilket ga 180 mg (91%) av et hygroskopisk svakt gulfarget pulver. Smeltepunkt: 258 - 264°C (spaltet) på samme måte fremstiltes følgende forbindelser.

(E)-7-[4'-(4 ' '-fluorfenyl)-1',3'-dimetyl-6'-(1''-metyletyl)pyrazolo [3,4-b]pyridin-5'-yl]-3,5-dihydroksyhept-6-ensyre (forbindelser I-2b-l) 0,25 g (0,53 mmol) av (forbindelser I-lb-1) ble løst 3 ml av etanol, og 1,06 ml, av en 0,5 N vandig natriumhydroksyd-løsning ble dråpevis tilsatt dertil. Etanol ble destillert av under redusert trykk, og deretter tilsattes 3 ml destillert vann til resten. Denne blanding ble ekstrahert med etyleter. Det vandige sjikt ble omhyggelig nøytralisert med 1% saltsyre og deretter ekstrahert med etyleter. Etersjiktet ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat, og deretter destillert under redusert trykk, hvilket ga det ønskede produkt. Mengde: 0,21 g (utbytte 90%) P-NMR(DMSO-d<6>) 6ppm:1,29(d,J=7Hz,6H), l,83(s,3H), 2,1-2,3(m,2H),2,4-2,6(m,lH), 3,0-3,6(m,4H), 3,96(s,3H), 4,3-4,8(m,2H), 5,2-5,6(m,1H), 6,3-6,6(m,1H), 7,2-7,4(m,4H), 11,5-12, 0 (bs, 1H) . Trinn H (E)-trans-6- (2 ' - [4 ' ' -(4'''-fluorfenyl)-1'',3''-dimetyl-6 ' ' -1 ' ' '-metyletyl)pyrazolo[3,4-b]pyridin-5''-yl]etenyl)-4-hydroksy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-2-on (forbindelse I-3b-l) 13 0 mg (0,29 mmol) av forbindelser I-2b-l ble løst i 6 ml i diklormetan, og 125 mg (0,29 mmol) av N-cykloheksyl-N'-(2''-metylmorfolinoetyl)karbodiimid p-toluensulfonat ble tilsatt dertil. Blandingen ble omrørt til romtemperatur i 2 timer, og løsningsmidlet destillert av under redusert trykk til tørrhet. Restoljen ble renset ved silikagel tynnsjiktkromatografi (elueringsmiddel: heksan/etylacetat = 9/1 (v/v)), hvilket ga et rent ønsket produkt som en fargeløs viskøs olje. Mengde 48 mg (utbytte: 3 9%) P-NMR(CCDC13) 6ppm: 1,33(d,J=6,8HZ,6H) , 1,4-1,5(m,1H) , 1,6-1,7(m,2H) ,l,93(s,3H), 2,5-2,6(m,lH), 2,68(dd,J=18Hz,J=5Hz,1H), 3,39 (7 heptalet,J=6,8Hz,1H) , 4,07(s,3H), 4,1-

4,2(m,lH), 5,1-5,2(m,1H), 5,31(dd,J=16Hz,J=6Hz,1H),

6, 61(dd, J=16H2,J=l,5Hz,lH) , 7,1-7,3(m,4H)

På samme måte fremstiltes følgende forbindelser

På samme måte ble fremstilt følgende forbindelser

Eksempel 1

De inhiberende virkninger på migrering av mediale glattmuskelceller (M-SMC) i aorta.

De inhiberende virkninger av forbindelsene som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse på migrering av M-SMC ble målt ved følgende metode

Mediale arterieskiver fra toraksaorta hos en Sprague Dawley hannrotte ble dyrket ved anvendelse av et medium av Dulbecco's Modifies Eagle (DME) inneholdende 10% fetalt bovint serum (FBS) ved 37°C i en atmosfære omfattende 95% luft og 5% karbondioksid i 3 eller 4 uker. De mediale glattmuskelceller fra aorta dyrket fra de mediale arterieskiver ble sub-dyrket ved 1:2 splitting av celletettheten for stabil sub-kultur. Etter 3 eller 4 timers sub-kultur ble cellene i konfluenstilstanden underkastet trypsinisering og deretter oppslemmet i ovennevnte medium ved en celletetthet på 500,000 celler pr ml. Til denne cellesuspensjon ble det tilsatt en testforbindelse løst i dimetylsulfoksid (DMSO) slik at den endelige DMSO konsentrasjon ble 0,2%, og cellesuspensjonen ble for-inkubert ved 37°C i 30 minutter. Som kontroll ble DMSO tilsatt alene ved samme konsentrasjon. I den nedre avdeling av Boydens kammer avdelt med en nitrocellulosemembran ble fylt 10 ng/ml av en blodplate avledet vekstfaktor (platelet-derived growth factor (PDGF)) eller DME medium inneholdende et 10% SMC-kondensert medium (SMC-CM) oppnådd ved 4 8 timers kondisjonering, som migreringsfaktor. I den øvre avdeling derav ble fylt1ml av cellesuspensjonen, og inkuberingen ble gjennomført ved 37°C i 4 timer under dyrkingsbetingelser. Som blindprøve ble DME medium uten migreringsfaktor fylt i den nedre avdeling. Etter 4 timers inkubering ble cellene som festet seg til den øvre side av nitrocellulosemembranen fjernet, og cellene som migrerte til den undre side av membranen ble fiksert og farget med Diff Quik. Antallet migrerte celler ble tellet i de 10 felter med et lysmikroskop ved 4 00 x HPF.

De oppnådde resultater ble fremstilt ved en gjennomsnittlig verdi for celletallet fra tre kamre i hvert tilfelle, og inhiberingen (%) ble beregnet ifølge formelen:

Inhibering(%) = 100 - {(T-B)/(C-B) x 100}

hvor B: lik celletallet i blindprøven, C: lik celletallet i kontrollen, og T: lik celletallet hvor det inneholdes en testforbindelse.

Resultatene er vist i tabell 5. Forbindelsene viste sterke inhiberende virkninger mot migrering av M-SMC sammenlignet med referanseforbindelsen.

Eksempel 2

De inhiberende virkninger på formeringen av intimale og reale glattmuskelceller (I-SMC og M-SMC) i aorta.

De inhiberende virkninger av forbindelsene som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse på formeringen av I-SMC og M-SMC ble målt ved følgende metode.

Ved anvendelse av DME medium inneholdende 10% av FBS og et antibiotikum ble det dyrket skiver av aortamediet, oppnådd fra en frisk japansk hvit kanin, og skiver av aorta intimal-lesjon utskilt fra aortamediet, oppnådd av en aterosklerotisk japansk hvit kanin som hadde fått en 1% kolesteroldiett i 3 måneder på samme måte som i eksempel 1. Etter to eller tre gangers sub-kultur av cellene ble disse trypsinisert i konfluenstilstanden og oppslemmet i mediet ovenfor slik at celletettheten ble 20,000 celler/ml. Deretter ble 10,000 celler utsådd og dyrket på en 24 brønners plate. Etter inkubering i 6 timer, ble mediet erstattet med 0,5 ml av et kontrollmedium eller et medium inneholdende en testforbindelse. Samtidig tellet man antallet celler som til å begynne med festet seg til platen, og dette ble tatt som det initiale celletall (I). Testforbindelsen ble tilsatt til mediet som beskrevet i eksempel 1. Som kontroll ble DMSO tilsatt alene slik at sluttkonsentrasjonen ble 0,2%. Mediumforandringen ble utført hver andre dag, og på den første, andre, tredje, femte og syvende dag ble cellene trypsinisert og oppslemmet i Isoton og celletallet tellet med en Coulter-teller.

De oppnådde resultater ble fremstilt ved et gjennomsnittlig celletall fra tre brønner i hvert tilfelle, og inhiberingen (%) av foldøkningen av celletallet fra den andre dag til den femte dag ble beregnet ifølge formelen:

Inhibering (%) = 100 - {(T5/<T>2)/(C5/<C>2) x 100}

hvor T2og T5er celletallet på henholdsvis den andre og femte dag, i mediet inneholdende testforbindelsen og C2og C5er celletallet på henholdsvis den andre dag og den femte dag i kontrollmediet.

Resultatene er vist i tabell 6, hvor forbindelsene viste sterke inhiberende virkninger på formeringen av både I-SMC og M-SMC sammenlignet med referanseforbindelsen. Dessuten var den inhiberende virkning på I-SMC formeringen høyere i sine virkninger enn på M-SMC formeringen

Eksempel 3

Den inhiberende virkning på<3>H-tyminidinopptaket i intimale og mediale glattmuskelceller (I-SMC og M-SMC) i aorta.

De inhiberende virkninger av forbindelsen som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse på<3>H-tymidinopptaket i

I-SMC og M-SMC ble målt ved følgende metoder.

M-SMC og I-SMC oppnås fra aortamedia fra en frisk japansk hvit kanin og fra aortaintima fra en aterosklerotisk japansk hvit kanin som nevnt i eksempel 2. Etter 3 eller 4 gangers subkultur ble cellene i konfluenstilstanden trypsinisert og oppslemmet i det DME medium inneholdende 10% FBS og et antibiotikum, slik at celletettheten 40,000 celler/ml. 10,000 celler ble utsådd på en 48 brønners plate. Etter 4 dagers dyrking ble mediet erstattet av kontrollmediet eller av medium inneholdende en testforbindelse som anvendt i eksempel 2, og dyrkingen ble fortsatt i 24 timer. Deretter ble tilsatt dertil 1 / xCi (37 MBq) av<3>H-tymidin, og dyrkingen ble fortsatt i 3 timer. Cellene ble vasket tre ganger med en fosfatbuffret fysiologisk saltløsning (PBS) og behandlet med avkjølt 5% trikloreddiksyre (TCA). Den uløslige fraksjon ble vasket med avkjølet TCA og deretter løst i en 0,5 N vandig kalim-hydroksydløsning.<3>H radioaktiviteten ble målt med en væskesintillasjonsteller og proteininnholdet ble målt.

De oppnådde resultater ble beregnet som radioaktiviteten pr 1 mg protein og fremstilt som en gjennomsnittlig verdi av 3 brønner. Inhiberingen (%) ble beregnet ifølge formelen:

Inhibering(%) = 100 -T/C x 100

Resultatene er vist i tabell 7. Forbindelsene som anvendes ifølge den forleliggende oppfinnelse viste sterke inhiberende virkninger på<3>H-tymidininntaket i DNA fraksjonen i intimale og mediale glatte muskelceller, sammenlignet med referanseforbindelsen.

Eksempel 4

De inhiberende virkninger mot adhesjon av leukemiceller

(HL-60)

De inhiberende virkniger av forbindelsene på celleadhesjonen for HL-6 0 ble målt ved følgende metoder. HL-6 0

celler ble dyrket i et RPMI 164 0 medium innholdende 10% av FBS og et antibiotikum ved 37°C i en atmosfære omfattende 95% luft og 5% karbondioksyd og deretter utsådd på en 6 brønners plate i en mengde av 2 ml pr brønn ved en celletetthet på 1,000,000/ml. En testforbindelse løst i DMSO ble tilsatt slik at den endelige DMSO konsentrasjonen ble 0,2% og inkubering ble utført i 4 8 timer for forbehandling.

Deretter ble 500,000 celler utsådd på en 24 brønners plate, og 0,02 ml forbolmyristatacetat (TPA) løst i etanol, ble tilsatt i en mengde på 1/250 (v/v) av kulturmediet, og deretter ble dyrkningen fortsatt i 12 timer. Deretter ble cellene vasket med PBS, og cellene som var festet til brønnplatene, ble skrapet av ved trypsinisering og oppslemmet i Isoton, og antallet celler ble tellet i en Coulter-teller. En kontrolltest ble utført ved tilsetning av DMSO alene.

De oppnådde resultater fremstår som en gjennomsnittlig verdi av antallet celler i 3 brønner på tidspunktet for forbehandlingen, og inhiberingen (%) ble beregnet ifølge formelen:

Inhibering (%) mot adhesjon = 100 - T/C x 100

hvor T: lik antall celler i mediet inneholdende en testforbindelse,

C: lik antallet celler i kontrollmediet.

Resultatene er vist i tabell 8. Forbindelsene viste klart sterke inhiberende virkninger på celleadhesjonen for HL-60 indusert med TPA, sammenlignet med referanseforbindelsen.

Eksempel 5

De inhiberende virkninger mot adhesjon av J774 makrophager (J774-Mu).

De inhiberende virkninger av forbindelsene på celleadhesjonen av J774-Mu ble målt ved følgende metoder.

1,000,000 celler ble utsådd på en 6 brønners plate og dyrket 1 ml av en DME medium innholdende 10% FBS og et antibiotikum ved 37°C i en atmosfære omfattende 95% luft og 5% karbondioksyd i 2 døgn. Deretter ble dyrkingen fortsatt med et kontrollmedium innholdende 0,2% DMSO eller med et medium innholdende en testforbindelse i 48 timer som forbehandling. Deretter ble cellene skrapet av ved hjelp av en gummistav og oppslemmet i mediet ovenfor. 200,000 celler ble utsådd på en 24 brønners plate og dyrket i 12 timer. Deretter ble cellene festet til brønnplatene, skrapet av med en gummistav, og antallet celler ble tellet med en Coulter-teller.

De oppnådde resultater fremstår som en gjennomsnittlig verdi av antallet celler i 3 brønner på tidspunktet for forbehandlingen, i hvert tilfelle, og inhiberingen (%) av adhesjonen ble beregnet ifølge formelen:

Inhibering (%) mot adhesjon = 100 - T/C x 100

hvor T: lik antallet celler i mediet inneholdende en testforbindelse,

C: lik antallet celler i kontrollmediet.

Resultatene er vist i tabell 9. Forbindelsene viste sterke inhiberende virkninger mot celleadhesjon av J774-Mii.

Det samme forsøk som i Eksempel 1 ble utført med forbindelsene ovenfor, og forsøksresultatene er vist i den følgende tabell 10.

Det samme forsøk som i Eksempel 2 ble utført med forbindelsene nr. 4 til 8 ovenfor, og forsøksresultatene er vist i den følgende tabell 11.

Det samme forsøk som i Eksempel 3 ble utført med forbindelsene 4 til 8 ovenfor, og forsøksresultatene er vist i den følgende tabell 12.

Forbindelsene har inhiberende virkninger på HMG-CoA reduktase og inhiberer ateroskleroseintimalfortykning, og kan således anvendes som prevantive medikamenter for koronare hjertesykdommer såsom anginapektoris, myokardialinfarkt, reatenose etter PTCA, cerebrovaskulær kontrakjson etter sub-araknoidal blødning og til å fjerne skleroserende arteritt.

Claims

1. Anvendelse av en forbindelse med formel (I)

hvori ring X er

(hvori R<4a>er hydrogen, C^-Cg-alkyl, fluor, klor og brom; R<4b>er d-Ce-alkyl og fenyl; R<5b>er C±-C8alkyl; R4c og Rsc er hydrogen og C^-Cg-alkyl)R<1>er hydrogen, fluor, klor og brom; R<3>er C1-C8-alkyl, C3-C7-cykloalkyl; Y er -CH=CH-; Z er -CH(OH) -CH2-CH(OH) -CH2-COOH, eventuelt et natrium-, kalium- eller M kalsiumsalt derav, eller

for fremstilling av et farmasøytisk preparat med inhibering av formering av glatte aorta-muskelceller, migrering av glatte aorta-muskelceller som vender innover, inn i tunica intima vasourum, eller adhesjon av blodceller til endothe1ium.

2. Anvendelse ifølge krav1, hvori forbindelsen anvendes for fremstilling av et farmasøytisk preparat med en inhibering av formering av glatte aorta-muskel-celler.

3. Anvendelse ifølge krav1, hvori forbindelsen anvendes for fremstilling av et farmasøytisk preparat med inhibering av migrering av glatte aorta-muskelceller, inn i tunica intima vasourum.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvori forbindelsen anvendes for fremstilling av et farmasøytisk preparat med inhibering av adhesjon av blodceller til endothelium.

5. Anvendelse ifølge krav 1-4, hvori forbindelsen har formelen

6. Anvendelse ifølge krav 1-4, hvori forbindelsen har formelen (Ib) :

7. Anvendelse ifølge krav 1-4, hvori forbindelsen har formel (Ic) :

8. Anvendelse ifølge krav 5, hvori forbindelsen har formel (Ia), R<1>er fluor, R<3>er cyklopropyl.

9. Anvendelse ifølge krav 5, hvor R1 i formel (Ib) er fluor, R<3>er cyklopropyl, R<4b>og R<5b>er metyl.

10. Anvendelse ifølge krav 5, hvori R<1>i formel (Ic) er fluor, R<3>er cyklopropyl, R<4c>er etyl og R<5c>er metyl.

11. Anvendelse ifølge krav 8, hvori Z i formelen (Ia) er -CH(OH)-CH2-CH(OH) -CH2-C02• MCa .