NO173501B

NO173501B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive pyrazolopyridinforbindelser

Info

Publication number: NO173501B
Application number: NO89895165A
Authority: NO
Inventors: Yoshihiro Fujikawa; Mikio Suzuki; Hiroshi Iwasaki; Mitsuaki Sakashita; Masaki Kitahara
Original assignee: Nissan Chemical Ind Ltd
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1989-12-21
Publication date: 1993-09-13
Also published as: FI90870C; DK659089A; HU892751D0; NO895165D0; DK659089D0; JP2890448B2; FI90870B; EP0339358A1; KR900700480A; KR970009222B1; EP0339358B1; WO1989010365A1; DE68916685D1; HU203888B; ATE108450T1; FI896251A0; NO173501C; NO895165L; DE68916685T2; JPH02275878A

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte ved fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser med formelen: hvor R<1> er hydrogen, C1-C4-alkyl, cyklopropyl eller

(hvor RA er hydrogen eller klor, R2 er bundet til nitrogen i 1- eller 2-stillingen av pyrazolopyridinringen og er C1-C4^ alkyl, 2-pyridyl, eller benzyl eller fenyl, eventuelt substituert med C-^- C^ -alkoksy,

R<3> er isopropyl eller cyklopropyl,

Y er -CH=CH-, og

Z er

-CH(OH)-CH2C(0)CH2<C>02R<12> eller -CH(OH)CH2-CH(OH)C<H>2C02R<12> (hvori R1<2> er hydrogen, C±- C4 alkyl, Na, K eller 1/2 Ca).

De er spesielt anvendelige som anti-hyperlipidemiske, hypolipoproteinemiske og anti-aterosklerotiske midler.

Noen metabolske fermenteringsprodukter såsom compactin, CS-514, mevinolin eller halv-syntetiske derivater eller fullstendig syntetiske derivater derav er kjent for å være inhibitorer mot HMG-CoA-reduktase som er et hastighetsbegrensende enzym for kolesterolbiosyntese. (A. Endo J. Med Chem., 28(4) 401 (1985)).

CS-514 og mevelin er blitt klinisk bevist å være potensielt anvendelig som hyperlipoproteinemiske midler, og de anses å være effektive for kurering eller forebyggelse av koronar arteriosklerose-sykdommer eller aterosklerosesykdommer. (IXth Int. Symp. Drugs Affect. Lipid Metab., 1986, p30, p31, p66) .

Med hensyn til fullstendige syntetiske derivater imidlertid, er spesielt heteroaromatiske derivater av inhibitorer mot HMG-CoA-reduktase er begrenset informasjon beskrevet i den følgende litteratur: WPI ACC nr. 84-157675, 86-028274, 86-098816, 86-332070, 87-124519, 87-220987, 88-07781, 88-008460, 88-091798, 88-112505, 88-182950, 88-205067, 88-234828, 88-258359 og 88-300969.

De foreliggende oppfinnere har funnet at mevalonolakton-derivater med en pyrazolopyridinring, de tilsvarende dihydroksykarboksylsyrer og salter og estere derav har høye inhiberende aktiviteter mot kolesterolbiosyntese, hvori HMG-CoA-reduktase virker som et hastighetsbegrensende enzym. Den foreliggende oppfinnelse er blitt utført på grunnlag av denne oppdagelse.

Videre kan disse forbindelser ha minst ett eller to asymmetriske karbonatomer, og.kan ha minst 2-4 optiske isomere. Forbindelsene med formel I innbefatter alle disse optiske isomere og alle blandinger derav.

Særlig foretrukne forbindelser er angitt i ingressen til krav 2-4.

Forbindelsene med formel I kan fremstilles ved at man

a) for fremstilling av en forbindelse med formelen:

hvori R<1>, R2 og R3 er som definert ovenfor i forbindelse med formel I, og R<12> er C1-C4-alkyl, omsetter en forbindelse med formelen

hvor R<1>, R<2> og R3 er som definert ovenfor, med et dobbeltanion av R<12->ester av acetoeddiksyre (hvori R<12> er som definert ovenfor) ,

b) for fremstilling av en forbindelse med formelen:

ringslutter en forbindelse med formel

med et N,N'-disubstituert karbodiimid som sykliseringsmiddel, idet R<1>, R2 og R<3> er som forut definert, og om ønsket

c) forbindelsen med formel II hydrolyseres,

d) forbindelsen med formel II reduseres.

I det følgende beskrives fremstilling av mellomprodukter

som anvendes forut for og i foreliggende oppfinnelse, samt reaksjonsbetingelser for disse reaksjoner og i foreliggende oppfinnelse.

Forbindelsen med formel X kan fremstilles ved en fremgangsmåte som er beskrevet i J. Prakt. Chem., 79, 1,

(1909) eller japansk ikke-gransket patentsøknad nr. 65089/1984, eller den kan fremstilles fra 3,3-dikloracrylo-nitril (J. Org. Chem., 34, 3410 (1969), ibid., 36, 3386

(1971)) som utgangsmateriale gjennom cyanoketonacetal oppnådd ved en fremgangsmåte beskrevet i J. Org. Chem., 35, 828 (1970)

(japansk gransket patentsøknad nr. 2541/1973).

Forbindelsen med formel VII kan fremstilles fra forbindelsen med formel X (Chem. Pharm. Bull., 35, 3235 (1987) og japansk ikke-gransket patentsøknad nr. 65089/1984).

Enalet III kan også fremstilles ved fremgangsmåtetrinn K, L og M.

Videre kan den primære alkohol VI også fremstilles ved fremgangsmåtetrinnene P, S og T.

I reaksjonsskjemaet ovenfor er R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R5 og R<12 >som definert forut i forbindelse med formel I, og R<21> og R22 er uavhengig C^.^-laverealkyl såsom metyl, etyl, n-propyl, i-propyl eller n-butyl.

Trinn A representerer en reduksjonsreaksjon av esteren til en primæralkohol. En slik reduksjonsreaksjon kan utføres ved å bruke forskjellige metallhydrider, fortrinnsvis diisobutylaluminiumhydrid, i et løsningsmiddel såsom tetrahydrofuran, toluen eller metylenklorid ved en temperatur fra -2 0 til 20°C, fortrinnsvis fra -10 til 10°C.

Trinn B representerer en oksydasjonsreaksjon av den primære alkohol til et aldehyd, som kan utføres ved å anvende forskjellige oksydasjonsmidler. Fortrinnsvis kan reaksjonen utføres ved å bruke pyridiniumklorkromat i metylenklorid ved en temperatur fra 0 til 25°C, eller ved å anvende oksalylklorid, dimetylsulfoksyd og et tertiært amin såsom trietylamin (Swern oksydasjon), eller ved å bruke et svoveltrioksyd-pyridinkompleks.

Trinn C representerer en syntese av et 3-etoksy-l-hydroksy-2-propenderivat, som kan fremstilles ved å omsette en forbindelse V med en litiumforbindelse som forut er blitt dannet ved å behandle cis-l-etoksy-2-(tri-n-butylstannyl)-etylen med butyllitium i tetrahydrofuran.

Som reaksjonstemperatur foretrekkes det å anvende en lav temperatur på et nivå på fra -60 til -78°C.

Trinn D er en syntese av en enal ved sur hydrolyse. Som sur katalysator anvendes fortrinnsvis p-toluensulfonsyre, saltsyre eller svovelsyre, og reaksjonen kan utføres i en løsningsmiddelblanding av vann og tetrahydrofuran eller alkohol ved en temperatur fra 10 til 25°C. Det oppnådde 3-etoksy-l-hydroksy-2-propenderivat i trinn C kan brukes i trinn D uten rensning, dvs. ved enkelt å fjerne tetra-n-butyltinn dannet samtidig.

Trinn E er en dobbel anionaddisjonsreaksjon mellom enalet III og et acetoacetat. En slik addisjonsreaksjon utføres fortrinnsvis ved å anvende natriumhydrid og n-butyllitium som base i tetrahydrofuran ved en temperatur fra

-78 til 0°C, fortrinnsvis fra -30 til -10°C.

Trinn F er en reduksjonsreaksjon av ketokarboksylatet med formel II med forskjellige reduksjonsmidler. Denne reaksjonen ofatter reduksjon av karbonyl med f.eks. natriumborhydrid, natriumcyanoborhydrid, zinkborhydrid, disiamylboran, diboran, t-butylaminoboran, pyridinborankompleks, dicykloheksylboran, texylboran, 9-borbicyklo[3,3,l]nonan, diisopinokamfenylboran eller litiumtri-sec-butylborhydrid til det tilsvarende dihydroksykarboksylat med formel I-l.

Denne reaksjonen kan utføres i et løsningsmiddel valgt fra hydrokarboner, halogenerte hydrokarboner, C^^-alkoholer, etere og løsningsmiddelblandinger derav, ved en temperatur fra

-100 til 50°C, fortrinnsvis fra -78 til 30°C.

Videre anvendes som beskrevet i J. Amer. Chem. Soc., 105, 593 (1983) et trialkylboran, såsom tri-n-burylboran eller trietylboran og natriumborhydrid ved en lav temperatur. Videre kan som beskrevet i Tetrahedron Letters, 28, 155 (1987) erytroformen med biologisk fremragende aktiviteter med fordel fremstilles ved å anvende et alkoksydialkylboran såsom metoksydietylboran eller etoksydietylboran og natriumborhydrid.

Denne reaksjonen kan utføres ved å anvende en løsnings-middelblanding av Ci-c^-alkohol og tetrahydrofuran ved en temperatur fra -80 til -50"C, fortrinnsvis fra -72 til -68°C.

Trinn G er et trinn for hydrolyse av esteren. Hydrolysen kan utføres ved å anvende en ekvimolar mengde av en base, fortrinnsvis kaliumhydroksyd eller natriumhydroksyd i en løs-ningsmiddelblanding av vann og metanol eller etanol ved en temperatur fra 10 til 25°C. Den herved oppnådde fri syre kan overføres i et salt med en velegnet base.

Trinn H er et trinn for dannelse av et mevalonblakton ved dehydratiseringsreaksjonen av den fri syre 1-2. Dehydratiseringsreaksjonen kan utføres i benzen eller toluen under tilbakeløp, mens det resulterende vann fjernes, eller ved å tilsette et velegnet dehydratiseringsmiddel, såsom en molekylar sil.

Videre kan dehydratiseringsreaksjonen utføres i tørr metylenklorid ved å anvende et laktondannende middel såsom karbodiimid, fortrinnsvis et vannløselig karbodiimid såsom N-cykloheksyl-N'-[2'-(metylmorfolinium)etyl]karbodiimid-p-toluensulfonat ved en temperatur fra 10 til 35<0>C,.fortrinnsvis fra 20 til 25°C.

Trinn J representerer en hydrogeneringsreaksjon for dobbeltbindingen som forbinder mevalonolaktonresten og pyrazolopyridinringen. Denne hydrogeneringsreaksjonen kan utføres ved å bruke en katalytisk mengde palladiumkarbon eller rhodiumkarbon i et løsningsmiddel såsom metanol, etanol, tetrahydrofuran eller acetonitril ved en temperatur fra 0 til 50°C, fortrinnsvis fra 10 til 25°C.

Trinn K representerer en reaksjon for syntesen av en a,/3-umettet karboksylsyreester, hvorved en transform a,/3-umettet karboksylsyreester kan fremstilles ved en såkalt Horner-Wittig-reaksjon ved å anvende et alkoksykarbonylmetyl-fosfonat. Reaksjonen utføres ved å anvende natriumhydrid eller kalium t-butoksyd som base i tørr tetrahydrofuran ved en temperatur fra -30 til 0°C, fortrinnsvis fra -20 til -15°C.

Trinn L er en reduksjonsreaksjon for den a,/3-umettede karboksylsyreester til en allylalkohol. Denne reduksjonsreaksjon kan utføres ved å anvende forskjellige metallhydrider, fortrinnsvis diisobutylaluminiumhydrid, i et løsningsmiddel såsom tørr tetrahydrofuran eller toluen ved en temperatur fra -10 til 10°C, fortrinnsvis fra -10 til 0°C.

Trinn M er en oksydasjonsreaksjon for allylalkoholen til en enal. Denne oksydasjonsreaksjonen kan utføres ved å bruke forskjellige oksydasjonsmidler, spesielt aktivert mangandioksyd, i et løsningsmiddel såsom tetrahydrofuran, aceton, etyleter eller etylacetet ved en temperatur fra 0 til 100°C, fortrinnsvis fra 15 til 50°C, eller ifølge Swern-oksydasjon ved å anvende oksalylklorid, dimetylsulfoksyd og et tertiært amin såsom trietylamin.

Trinn N representerer en reaksjon for syntesen av et a,/3-umettet keton ved selektiv oksydasj on av dihydroksykar-boksylsyreesteren. Denne reaksjon kan utføres ved å bruke aktivert mangandioksyd i et løsningsmiddel såsom etyleter, tetrahydrofuran, benzen eller toluen ved en temperatur fra 20 til 80°C, fortrinnsvis fra 40 til 80°C.

Trinn P representerer en hydrolysereaksjon av en ester. Hydrolysen kan utføres under forskjellige sure eller basiske betingelser. Det foretrekkes å anvende en fremgangsmåte, hvori oppvarmingen eller tilbakeløpskokingen utføres ved bruk av natriumhydroksyd eller kaliumhydroksyd i en løsningsmiddel-blanding av vann og etylalkohol eller etylenglykol, en fremgangsmåte hvori tilbakeløpskokingen utføres ved å anvende natriumetoksyd i etylalkohol, eller en fremgangsmåte hvori hydrolysen utføres ved å anvende trifluoreddiksyre ved en temperatur fra 0 til 7 0°C.

Trinn S er en reaksjon for syntesen av et syreklorid fra den fri karboksylsyre. Reaksjonen kan utføres ved å anvende tionylklorid eller oksalylklorid i et løsningsmiddel såsom benzen, tetrahydrofuran eller metylenklorid ved en temperatur fra 0 til 80°C. Syrekloridet XIV som derved oppnås, kan anvendes i det etterfølgende trinn uten rensning, dvs. ved ganske enkelt å fjerne løsningsmiddelet.

Trinn T er en reduksjonsreaksjon av syrekloridet til en primæralkohol. En slik reduksjonsreaksjon kan utføres ved å bruke forskjellige metallhydrider i et temperaturområde som ikke påvirker andre substituenter.

F.eks. kan reduksjonsreaksjonen utføres ved å bruke litiumaluminiumhydrid i et eterløsningsmiddel såsom dietyleter ved en temperatur fra 0 til ca. 36°C, ved å anvende natriumborhydrid i et eterløsningsmiddel såsom dioksyd ved en temperatur fra 0 til ca. 100°C, ved å anvende natrium bis(2-metoksyetoksy)aluminiumhydrid i et aromatisk hydrokarbon-løsningsmiddel såsom benzen, toluen eller xylen ved en temperatur fra 0 til løsningsmiddelets kokepunkt, fortrinnsvis fra 25 til 80°C, eller ved å anvende diisobutylaluminiumhydrid i et løsningsmiddel såsom tetrahydrofuran, toluen eller metylenklorid ved en temperatur fra -20 til 20°C, fortrinnsvis fra -10 til 10°C.

Videre kan forbindelsen med formel 1-6 fremstilles fra aldehydet med formel V ved Wadsworth-Emmons koblingsreaksjon

(J. Amer. Chem. Soc, 107, 3731 (1985)). Den kan også fremstilles fra enalet med formelen III (Tetrahedron Letters, 26, 2951 (1985)) .

Trinn AA er en reduksjonsreaksjon av ketokarboksylatet med formel 1-6 eller XV med forskjellige reduksjonsmidler. Denne reaksjonen omfatter reduksjon av karbonyl med f.eks. natriumborhydrid, natriumcyanborhydrid, zinkborhydrid, disiamylboran, diboran, t-butylaminoboran, pyridinborankompleks, dicykloheksylboran, teksylboran, 0-borbicyklo-[3,3,l]nonan, diisopinokamfenylboran eller litium-tri-sec-butylforhydrid til det tilsvarende dihydroksykarboksylat med formelen I-l eller 1-7.

Denne reaksjonen kan utføres i et løsningsmiddel valgt fra hydrokarboner, halogenerte hydrokarboner, C^^-alkoholer, etere eller løsningsmiddelblandinger derav, ved en temperatur fra -100 til 50°C, fortrinnsvis fra -78 til 30°C.

Videre anvendes som beskrevet i J. Amer. Chem. Soc., 105, 593 (1983) et trialkylboran såsom tri-n-butylboran eller trietylboran og natriumborhydrid ved en lav temperatur. Videre kan som beskrevet i Tetrahedron Letters, 28, 155 (1987) erytroformen med biologisk fremragende aktiviteter med fordel fremstilles ved å anvende et alkoksydialkylboran såsom metoksydietylboran eller etoksydietylboran og natriumborhydrid.

Denne reaksjonen kan utføres ved å bruke en løsnings-middelblanding av C-^^-alkohol og tetrahydrofuran ved en temperatur fra -80 til -50°C, fortrinnsvis fra -72 til -68°C.

Forbindelsen med formel XV kan fremstilles ved konti-nuerlig Wittig-reaksjon av aldehydet med formel V (W0-84/02131), etterfulgt av dobbeltanionkondensasjonsreaksjonen av det resulterende aldehyd med et acetoacetat på samme måte som i trinn E.

I den følgende beskrivelse betyr i- iso, sek-sekundær, t- betyr tertiær og c- betyr cyklo. Likeledes betyr Me metyl, Et betyr etyl, Pr betyr propyl, Bu betyr butyl, Pent betyr pentyl, Hex betyr heksyl og Ph betyr fenyl.

Videre kan farmasøytiske akseptable salter såsom natriumsalter eller kaliumsalter eller estere såsom etylestere eller metylestere av disse forbindelser fremstilles på den samme måte.

Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse viser sterke inhiberende virkninger på kolesterolbiosyntesen hvori HMG-CoA-reduktase virker som et hastighetsbegrensende enzym, som vist ved de etterfølgende forsøksresultater, og er således istand til å undertrykke eller redusere mengden av kolesterol i blodet som lipoprotein. Således er forbindelsene i foreliggende oppfinnelse anvendelige som kureringsmidler mot hyper-lipidemi, hyperlipoproteinemi og aterosklerose.

De kan formuleres i forskjellige hensiktsmessige formuleringer avhengig av administreringsformen. Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse kan gis i form av fri syrer eller i form av fysiologisk hydrolyserbare og akseptable estere eller laktoner eller farmasøytisk akseptable salter.

Den farmasøytiske blanding i den foreliggende oppfinnelse gis fortrinnsvis oral i form av forbindelsen i foreliggende oppfinnelse som sådan eller i form av pulvere, granulater, tabletter eller kapsler formulert ved å blande forbindelsen i foreliggende oppfinnelse med en velegnet farmasøytisk akseptabel bærer inneholdende et bindemiddel såsom hydroksypropylcellulose, sirup, gummi arabicum, gelatin, sorbitol, tragakantgummi, polyvinylpyrrolidon eller CMC-Ca, en eksipient såsom laktose, sukker, maisstivelse, kalsiumfosfat, sorbitol, glycin eller krystallinsk cellulosepulver, et smøremiddel såsom magnesiumstearat, talkum, polyetylenglykol eller silisiumdioksyd, og et sprengningsmiddel såsom potetstivelse.

Imidlertid er den farmasøytiske blanding i den foreliggende oppfinnelse ikke begrenset til slik oral administrering, og den er anvendelig for parenteral administrering. F.eks. kan den gis i form av f.eks. et suppositorium formulert ved å anvende oljeaktige basematerialer såsom kakaosmør, polyetylenglykol, lanolin eller fettsyretrigl.ycerid, en transdermal terapeutisk base formulert ved å anvende flytende parafin, hvit vaselin, en høyere alkohol, Makrogolsalve, hydrofil salve eller hydrogelbasemateriale, en injeksjons-formulering formulert ved å bruke ett eller flere materialer valgt fra gruppen bestående av polyetylenglykol, hydrogelbasemateriale, destillert vann, destillert vann for injeksjon og en eksipient såsom laktose eller maisstivelse, eller en formulering for administrering gjennom slimmembraner, såsom en okular slimmembran, en neseslimmembran og en oralslimmembran.

Videre kan forbindelsen i foreliggende oppfinnelse kombineres med basiske ionebytterharpikser som er istand til å binde gallesyrer og likevel ikke absorberes av fordøyelses-kanalen.

Den daglige dose av forbindelsen med formel I er fra 0,05 til 500 mg, fortrinnsvis fra 0,5 til 50 mg, for en voksen. Den gis fra 1-3 ganger pr. dag. Dosen kan selvfølgelig variere avhengig av pasientens alder, vekt og sykdomstilstand.

Forbindelsene med formlene II-VII er nye, og de er viktige mellomprodukter for fremstillingen av forbindelsene med formel I. Følgelig vedrører den foreliggende oppfinnelse også forbindelsene med formlene II-VII og fremgangsmåten for deres fremstilling.

Nå skal foreliggende oppfinnelse beskrives i nærmere detalj under henvisning til forsøkseksempler for de farmakologiske aktivitetene til forbindelsene i den foreliggende oppfinnelse, deres fremstillingseksempler og formulerings-eksempler. Imidlertid bør det være klart at foreliggende oppfinnelse på ingen måte er begrenset av slike spesifikke eksempler.

FARMAKOLOGISKE FORSØKSEKSEMPLER

Forsøk A: Inhibering av kolesterolbiosyntese fra acetat in vitro

Enzymløsning ble fremstilt fra leveren til Wistar hannrotter med kanyle i gallen og galle tømt i 24 timer. Leveren ble skåret ut ved midtmerket og mikrosom og supernatant-fraksjon som var hellbar med 40-80% løsning av ammoniumsulfat (sup-fraksjon) ble fremstilt fra leverhomogenisat ifølge den modifiserte fremgangsmåten til Knauss et al.; Kuroda, M. et al., Biochim. Biophys. Acta, 489, 119 (1977). For å måle kolesterolbiosyntese ble mikrosom (0,1 mg protein) og sup-fraksjon (1,0 mg protein) inkubert i 2 timer ved 37°C i 200 <1 av reaksjonsblandingen inneholdende ATP; 1 mM glutation; 6 mM glukose-l-fosfat, 10 mM NAD, 0,25 mM NADP, 0,25 mM CoA, 0,04 mM og 0,2 mM [2-<14>C]natriumacetat (0,2 <Ci) med 4 <1 forsøks-forbindelseløsning oppløst i vann eller dimetylsulfoksyd. For å stoppe reaksjonen og forsåpning ble 1 ml 15% EtOH-KOH satt til reaksjonsblandingen og oppvarmet ved 75°C i 1 time. Ikke-forsåpbare lipider ble ekstrahert med petroleter og iboende "C radioaktivitet ble tellet. Inhiberende aktivitet av forbindelser ble angitt med IC50.

Forsøk B: Inhibering av kolesterolbiosyntese i dvrkninqsceller

Hep G2-celler ved over 5. passasje ble sådd på 12 brønn-plater og inkubert med Dulbeccos modifiserte Eagle (DME) medium inneholdende 10% kalvefosterserum (FBS) ved 37°C, 5% C02 inntil celler var sammenflytende i ca. 7 dager.. Cellene ble utsatt for DME-mediet inneholdende 5% lipoprotein-manglende serum (LpDS) fremstilt ved ultrasentrifugeringsmetoden i over 24 timer. Mediet ble forandret til 0,5 ml friskt 5% LpDS inneholdende DME før måling, og 10 <1 forsøksforbindelses-løsning oppløst i vann eller DMSO ble tilsatt. 0,2 <Ci [2-"C]natriumacetat (20 <1) ble tilsatt ved 0 timer (B-l) eller 4 timer (b-2) etter tilsetning av forbindelser. Etter 4 timers videre inkubering med [2-<1A>C]natriumacetat ble medium fjernet og cellene vasket med fosfatbuffret saltvann (PBS) avkjølt til 4°C. Cellene ble skrapt med gummiskrape og samlet i rør med PBS og gnidd med 0,2 ml 0,5 N KOH ved 37°C. Alikvot av gnidningsprodukt ble brukt for proteinanalyse, og det gjenværende ble forsåpet med 1 ml 15% EtOH-KOH ved 75°C i 1 time. Ikke-forsåpbare lipider ble ekstrahert med petroleter og <1<I>C radioaktiviteten ble tellet. Tellinger ble revidert med celleprotein og indikert ved DPM/mg protein. Inhiberingsaktivitet av forbindelsene ble angitt med IC50.

Forsøk C: Inhibering av kolesterolbiosyntese in vivo

Sprague-Dawley hannrotter som veide ca. 150 g ble foret med normalt purina chow-diett og vann ad libitum og utsatt for 12 timers lys/12 timers mørke lysrytme (2:00 PM - 2:00 AM mørke) før bruk for in vivo inhiberingsforsøk på kolesterolbiosyntese. Dyrene ble adskilt i grupper bestående av 5 rotter for å få gjennomsnittlig kroppsvekt i hver gruppe. Forsøks-forbindelser i doser på 0,02-0,2 mg/kg kroppsvekt (0,4 ml/100 g kroppsvekt) ble oppløst i vann eller oppslemmet i 0,5% metylcellulose og gitt oralt ved 2-3 timer før midt-mørket (8:00 PM), da kolesterolbiosyntese nådde maksimum i rottene. Som kontroll ble rotter gitt oralt bare vann eller bærer. 90 minutter etter prøveadministrering ble rottene injisert intraperitonealt med 10 <Ci [2-lifC]Na-acetat i volum på 0,2 ml pr. stk. 2 timer senere ble blodprøver tatt, og serum ble adskilt øyeblikkelig. Totallipider ble ekstrahert ifølge fremgangsmåten til Folch et al. og forsåpet med EtOH-KOH. Ikke-forsåpbare lipider ble ekstrahert med petroleter, og radioaktivitet som satt i ikke-forsåpbare lipider ble tellet.

Inhiberingsaktivitet ble angitt som prosent reduksjon av tellinger i forsøksgrupper (DPM/2 ml serum/2 timer) fra kontrollgruppens.

Med hensyn til forbindelsene i den foreliggende oppfinnelse ble de inhiberende aktiviteter på kolesterolbiosyntesen, hvori HMG-CoA-reduktase tjener som et hastighetsbegrensende enzym, målt med det ovennevnte forsøk A og B. Resultatene er vist i tabell 2, 2-2, 3-2 og 3-3. Videre er resultatene av målingene med forsøk C også oppført.

I tabell 2-2 er de relative aktiviteter vist basert på aktivitetene av CS-514 med forsøk A evaluert til å være 1.

Strukturer av referanseforbindelser:

(1) CS-514

I tabell 3-2 er de relative aktiviteter vist basert på aktivitetene av CS-514 med forsøk B-l evaluert til å være 1.

Videre er forsøk B-l de inhiberende aktiviteter av forbindelsen av foreliggende oppfinnelse ved en konsentrasjon på 1,0 x 10"<7> mol/a vist i tabell 3-3.

Resultater av målingene av de inhiberende aktiviteter med forsøk C

De prosentuelle reduksjoner av teller etter oral administrering av 0,2 mg/kg av forbindelsen 1-5-4, 1-5-5 og I-5-7 var henholdsvis 53%, 49% og 52% i forhold til den målte verdi av kontrollgruppen. Den prosentuelle reduksjon av tellinger etter den orale administrering av 0,2 mg/kg CS-514 var 39% under de samme betingelser.

Forbindelsene i den foreliggende oppfinnelse viste bedre aktiviteter enn referanseforbindelsen CS-514 i forsøkene A, B og C.

Forsøk D: Akutt toksisitet

En 0,5% CMC-suspensjon av en forsøksforbindelse ble gitt oralt til ICR hannmus (gruppe på tre mus) . Den akutte toksisitet ble målt basert på dødeligheten etter syv dager. Med forbindelse 1-5-1, 1-5-2, 1-5-4, 1-5-7, 1-5-10, 1-5-11, I-5-12, 1-5-14 og 1-5-15 i foreliggende oppfinnelse var dødeligheten 0% selv når de ble gitt oralt i en mengde på 1000 mg/kg henholdsvis.

EKSEMPEL 1

Etvl- m- 7- 4'-( 4' '- fluorfenvl)- 1' . 3 ' - dimetvl- 6' - ( 1 • metvletyl) pyrazolo [ 3 , 4- blpyridin- 5 ' - yl 1 3 . 5- dihydroksyhept- 6-enoat ( forbindelse 1- 1- 1)

Denne forbindelsen ble fremstilt ved syntesen som omfatter de følgende reaksjonstrinn eksempel l-a til eksempel 1-g.

Eksempel l- a

Etvl- 4- ( 4 ' - fluorfenvl) - 1, 3- dimetvl- 6- ( 1' - metyletyl) pyrazolor3, 4- b1pyridin- 51- vlkarboksvlat ( forbindelse VII- 1^

Svntese av dih<y>droforbindelse

2,22 g (0,02 mol) 5-amino-l,3-dimetylpyrazol og 5,3 g (0,02 mol) etyl-2-(4'-fluorbenzyliden)-4-metyl-3-okso-pentanoat ble blandet og oppvarmet ved ca. 130°C i 1 time. Substanser med lavt kokepunkt ble destillert av under redusert trykk på en rotasjonsfordamper. Så ble reaksjonsblandingen oppløst i kloroform, vasket med vandig natriumkarbonatløsning og med vann og tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Kloroformen ble avdampet og den gjenværende olje ble renset ved kiselgelkolonnekromatograf i og ga dihydropyrazolo [ 3 , 4-b] -

pyridin (XI-1).

PNMR (CDCI3) Sppm:

0,81 (d, J = 7Jz, 3H), 1,0-1,3 (m, 6H), 1,97 (s, 3H), 2,64 (m, 1H), 3,44 (d,J=3Hz, 1H), 3,81 (s, 3H),

4,06 (q, J=7Hz, 2H), 4,48 (d,J=3Hz, 1H), 6,84 (m, 4H)

Oksydasj onsmetode- 1

7,54 g av dihydroforbindelsen oppnådd i det ovennevnte trinn ble oppløst i 15 ml iseddik og 2,2 g kromsyreanhydrid ble tilsatt dette. Blandingen ble rørt ved romtemperatur (15-20°C). Etter bekreftelse på at utgangsmaterialene var forsvunnet på tynnskiktkromatografi ble 100 ml vann tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med kloroform. Kloroformskiktet ble ristet sammen med en metttet, vandig natriumkarbonatløsning og med vann og deretter tørket over vannfritt magnesiumsulfat.

Kloroformen ble destillert vekk. Den gjenværende olje ble renset ved kiselgelkromatografi (eluent: 1% metanol/kloroform) og ga den ønskede forbindelse som hvite krystaller.

Smeltepunkt: 60-64°C, utbytte: 52% (basert på aminopyrazol).

Oksydasj onsmetode- 2

1 g av den oppnådde dihydroforbindelse i trinnet ovenfor ble oppløst i aceton som inneholdt en liten mengde etanol, og kaliumpermanganat (ganger 1,5 mol) ble satt til dette. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 1 dag. Etter å ha bekreftet at den ikke-omsatte dihydroforbindelse var fullstendig forsvunnet på tynnskiktkromatografi, ble magnesiumdioksyd fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert, og den gjenværende olje ble behandlet på samme måte som i oksydasjonsmetode-1 og ga den ønskede forbindelse.

Utbytte: 60% (basert på aminopyrazol)

EK SEMPEL 1- b

4-( 4'- fluorfenvl)- 5- hvdroksymetyl- l, 3- dimetyl- 6-( 1'- metyl-etyl ) pyrazolor3, 4- blpyridin ( forbindelse VI- 1)

5,0 g (0,014 mol) av forbindelsen VII-1 ble oppløst i

tørt toluen under en nitrogenatmosfære og avkjølt til 0°C i et isbad. Til denne løsningen satte man dråpevis 35 ml av en 15 vektprosent diisobutylaluminiumhydrid-toluenløsning, og deretter ble blandingen rørt ved 0°C i 2 timer. Etter å ha bekreftet at forbindelsen VII-l var fullstendig forsvunnet på tynnskiktkromatografi, ble en mettet vandig ammoniumklorid-løsning tilsatt ved 0°C for å stoppe reaksjonen. Dietyleter ble satt til reaksjonsblandingen, og det organiske skikt ble skilt fra. Den gelede substans ble oppløst ved tilsetning av en vandig natriumhydroksydløsning og på nytt ekstrahert med etyleter. Etyleterekstraktene ble slått sammen og tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Ekstraktet ble skilt fra ved filtrering, og løsningsmiddelet ble destillert av og ga 3,9 g av den lys, gule ønskede forbindelse.

Utbytte: 88%, smeltepunkt: 174-175 °C

EKSEMPEL 1- c

r 4-( 4'- fluorfenvl)- 1, 3- dimetvl- 6-( 1 '- metvletvl) pyrazolor3, 4-blpyridin- 5'- yl1karboksyaldehvd ( forbindelse V- l)

4,2 g (19 mmol) pyridiniumklorkromat, 0,69 g vannfritt natriumacetat og 3,8 g (12 mmol) forbindelse VI-1 ble oppslemmet i 50 ml tørr diklormetan ved romtemperatur. Reaksjons-løsningen ble rørt i 1 time, og deretter ble 100 ml dietyleter tilsatt. Blandingen ble rørt grundig. Reaksjonsblandingen ble vakuumfiltrert gjennom celittskikt, og ekstraktet ble inndampet under redusert trykk til tørrhet. Resten ble kromatografert på kiselgelkolonne (eluent: kloroform) og ga 2,9 g (utbytte: 78%) av den ønskede forbindelse som lys, gul substans.

Smeltepunkt: 144-146°C.

EKSEMPLER 1- d og l- e

fE)- 3- f4'-( 4''- fluorfenvl)- 1', 3'- dimetvl- 6'-(!''- metvletvl)-pyrazolof 3 , 4- blpyridin- 5 ' - yl") propenaldehvd ( forbindelse 111- 11

14,5 g (40 mmol) cis-l-etoksy-2-(tri-n-butylstannyl)-etylen ble oppløst i 50 ml tørr tetrahydrofuran, og løsningen ble avkjølt til -78°C under en nitrogenatmosfære. 26 ml (40

mmol) av en 15 vektprosent n-butyllitium-n-heksan-løsning ble satt dråpevis til denne løsning. Blandingen ble rørt i 20 minutter og deretter ble en løsning av 2,5 g (8 mmol) forbindelse V-l oppløst i 20 ml tørr tetrahydrofuran tilsatt dråpevis. Reaksjonsblandingen ble rørt ved -78°C i 1 time, og deretter ble 2 6 ml av en mettet ammoniumkloridløsning tilsatt for å stoppe reaksjonen. Det organiske skilt ble ekstrahert med dietyleter. Eterekstraktet ble vasket med en mettet, vandig natriumkloridløsning og tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Løsningsmiddelet ble destillert vekk under redusert trykk, og resten ble væskeseparert mellom n-heksan og acetonitril. Acetonitrilskiktet ble destillert under redusert trykk og ga hovedsakelig ren forbindelse IV-l.

EKSEMPEL l- e

Forbindelse IV-1 fremstilt i eksempel 1-d ble oppløst i 70 ml tetrahydrofuran, og 20 ml vann og 3 g p-toluensulfonsyre ble satt til dette. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 2 timer. Reaksjonsløsningen ble nøytralisert forsiktig med en vandig natriumhydroksydløsning. Så ble dietyleter tilsatt, og ekstraksjonen ble utført noen få ganger. Ekstraktet ble vasket med en mettet, vandig natriumkloridløsning og tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Så ble løsningsmiddelet destillert vekk under redusert trykk. Resten ble kromatografert på kiselgelkolonne (eluent: etylacetat/n-heksan = 1/9 (v/v)) og ga den ønskede forbindelse som en gul substans.

Mengde: 2,2 g (utbytte: 79%)

Smeltepunkt: 133-134°C.

EKSEMPEL 1- f

Etyl-( E)- 7- T4'-( 4''- fluorfenvl)- 1'. 3'- dimetvl- 6'-( 1 '' metvletyl) pyrazolof 3, 4- blpvridin- 5'- yl]- 5- hvdroksy- 3- oksohepto- 6-enoat ( forbindelse II- l)

1,2 5 g 60% natriumhydrid ble vasket med tørr petroleter, tørket under en nitrogenstrøm og så oppslemmet i 200 ml tørr tetrahydrofuran. Suspensjonen ble avkjølt til -15°C under en nitrogenatmosfære, og 3,9 ml (30 mmol) etylacetoacetat ble

satt dråpevis til dette. Blandingen ble rørt i 15 minutter. Så ble 20 ml (30 mmol) av en 15 vektprosent n-butyllitium-n-heksan-løsning tilsatt dråpevis, og blandingen ble rørt i 30 minutter. Deretter ble en løsning av 2,1 g (6,1 mmol) forbindelse III-l oppløst i tørr tetrahydrofuran tilsatt, og blandingen ble rørt i 1 time. 10 ml av en vandig, mettet ammoniumkloridløsning ble satt til reaksjonsblandingen ved -15°C, og blandingen ble ekstrahert tre ganger med dietyleter. Eterløsningen ble vasket med en mettet, vandig natriumklorid-løsning, tørket over vannfritt magnesiumsulfat og så inndampet under redusert trykk til tørrhet. Resten ble kolonnekromatografert på kiselgel (eluent: etylacetat/kloroform = 1/9 (v/v)) som ga 2,5 g (utbytte: 89%) av den ønskede forbindelse som hvit substans.

Smeltepunkt: 95-98°C.

EKSEMPEL 1-q

Reduksjonsmetode 1

Etyl-( E1- 7- T4'-( 4''- fluorfenvl)- 1', 3'- dimetvl- 6'-( 1'' metvletvl) pyrazolo\ 3. 4- b] pyridin- 5'- yl1- 3. 5- dihydroksyhept- 6- enoat

( forbindelse 1- 1- 1)

2,32 g (4,96 mmol) forbindelse II-l ble oppløst i 20 ml etanol under en nitrogenatmosfære, og blandingen ble avkjølt til 0°C. Så ble 74 0 mg (20 mmol) natriumborhydrid tilsatt, og blandingen ble rørt i 1 time. Blandingen ble nøytralisert forsiktig ved tilsetning av en 10% vandig saltsyreløsning og deretter ekstrahert tre ganger med dietyleter. Dietyleter-løsningen ble vasket med en vandig, mettet natriumklorid-løsning, tørket over vannfritt magnesiumsulfat og så fordampet til tørrhet under redusert trykk. Den gjenværende olje ble renset ved kiselgelkolonnekromatografi (eluent: etanol/kloroform = 3/97 (v/v)) som ga det rene, ønskede produkt som fargeløs viskøs oljeaktig substans.

Mengde: 1,81 g (utbytte: 78%)

NMR (Sppm i CDC13)

1,28 (t,J=8Hz,3H), 1,32 (d ;J=8Hz,6H), 1,4-1,8 (m,lH) 1,92 (s,3H), 2,2-2,6 (m,3H), 2,9-3,8 (m,2H),

3,42 (heptalet,J=8Hz,1H), 4,06 (s,3H), 4,1-4,6 (m,4H), 5,1-5,5 (m,lH), 6,4-6,7 (m,lH), 6,9-7,3 (m,4H)

Reduksjonsmetode 2

Etvl- ( E) - 7- r 6 - cvklopropvl- 4 ' - ( 4 ' ' - fluorf envl) - 1' - metvl- 3 ' - fenylpyrazolor3, 4- blpyridin- 5'- yl1- 3. 5- dihvdroksyhept- 6- enoat

( forbindelse 1- 1- 14)

200 ml av en dietyleterløsning på ca. 0,15 mol/a zinkborhydrid ble rørt under en nitrogenatmosfære under kjøling av løsningen ved -70°C. En løsning av 3,75 g (7,12 x 10"<3> mol) forbindelse 11-14 løst i 40 ml tørr dietyleter ble gradvis satt til dette langs reaktorens vegg. Videre ble reaksjons-løsningen rørt ved -70°C i 6 timer. Etter å ha bekreftet at utgangsmaterialet var hovedsakelig forsvunnet på tynnskiktkromatograf i , ble 4 0 ml metanol og deretter 100 ml vann tilsatt ved -70°C for å stoppe reaksjonen. Dietyleter og fortynnet eddiksyre ble satt til reaksjonsblandingen for å justere pH til 4, og produktet ble ekstrahert med dietyleter.

Dietyleterskiktet ble vasket med vann inntil dietyleterskiktet ble nøytralt, vasket videre med en vandig, mettet natriumkloridløsning. Dietyleterskiktet ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat, og deretter ble løsningsmiddelet fordampet på en fordamper. Resten ble kolonnekromatografert på kiselgel (eluent: benzen/etylacetat) som ga 3,09 g (82,0%) av den ønskede forbindelse som lysegult pulver.

EKSEMPEL 2

Natrium ( E)- 7- r4'-( 4''- fluorfenvl)- 1'. 3'- dimetvl- 6'-( 1' metyl-etyl) pyrazolo f 3. 4- blpyridin- 5'- yl13. 5- dihydroksyhept-6- enoat ( forbindelse 1- 5- 1)

200 mg (0,43 mmol) forbindelse 1-1-1 ble oppløst i 2 ml etanol, og 0,85 ml av en vandig 0,5 N natriumhydroksydløsning ble satt dråpevis til dette. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 1 time. Så ble etanol destillert fra under redusert trykk, 2 ml vann ble tilsatt og ekstrahert med dietyleter. Det vandige skikt ble frysetørket og ga 180 mg (utbytte: 91%) hygroskopisk lys gult pulver.

Smeltepunkt: 258-264°C (spaltet).

På samme måte som i eksempel l-a ble forbindelser VII-2 til VII-18 fremstilt. De derved oppnådde forbindelsers fysikalske egenskaper er vist i den følgende tabell.

PNMR for forbindelse VII-4 (CDC13) Eppm:

0,96 (t,J=8HZ,3H), 1,42 (d,J=7Hz,6H),

3,27 (heptalet,J=7Hz,1H), 4,02 (q,J=8H,2H), 4,18 (s,3H),

6,6-7,3 (m,9H).

PNMR for forbindelse VII-8 (CDC13) Eppm:

1,07 (t,J=8Hz,3H), 1,42 (d,J=7Hz,6H), 1,59 (t,J=8Hz,3H), 3,41 (heptalet, J=7Hz,lH), 4,20 (q,J=8Hz,2H), 4,70 (q,J=8Hz,2H), 7,1-8,0 (m,5H).

På samme måte som i eksempel 1-b ble forbindelsene VI-2 til VI-17 fremstilt. De derved oppnådde forbindelsenes fysikalske egenskaper er vist i den følgende tabell.

På samme måte som i eksempel 1-c ble forbindelsene V-2 til V-18 fremstilt. De derved fremstilte forbindelsers fysikalske egenskaper er vist i den følgende tabell.

På samme måte som i eksempel 1-d og I-e ble forbindelsene III-2 til 111-18 fremstilt. De derved fremstilte forbindelsers fysikalske egenskaper er vist i den følgende tabell.

På samme måte som i eksempel 1-f ble forbindelsene II-2 til 11-18 fremstilt. De derved fremstilte forbindelsers fysikalske egenskaper er vist i den følgende tabell.

PNMR for forbindelse II-4 (CDC13) Eppm:

1,24 (t,J=9Hz,3H), 1,32(d,J=8Hz,6H), 2,1-2,5 (m,2H), 2,6-2,9 (m,lH), 3,2-3,7 (m,3H), 3,9-4,7 (m,3H), 4.11 (s,3H), 4,9-5,4 (m,lH), 6,3-7,2 (m,10H), PNMR for forbindelse II-5 (CDC13) Eppm: 0,8-1,5 (m,4H), 1,27 (t,J=7Hz,3H),

1,89 (S,3H), 2,1-2,4 (m,lH),

2.51 (d,J=6Hz,2H), 2 , 6-3 , 1 (m, 1H) ,

3,40 (s,2H), 3,94 (s,3H), 4,17 (q,J=7Hz,2H), 4,4-4,8 (m,lH), 5,3-5,7 (m,lH),

6,4-6,8 (m,lH), 7,0-7,4 (m,4H),

PNMR for forbindelse 11-10 (CDC13) Eppm:

1,26 (t,J=7Hz,3H), 1,33 (d,J=7Hz,6H), 1,92 (s,3H), 2.2- 2,6 (m,lH), 2,45 (d,J=6Hz,2H), 3,41 (s,2H), 3,43 (heptalet,J=7Hz,1H), 4,22 (q,J=7Hz,2H), 4,4-4,8 (m,lH), 4,8-5,6 (m,lH), 5,65 (s,2H),

6.4- 6,8 (m,lH), 7,0-7,7 (m,9H),

PNMR for forbindelse 11-14 (CDC13) Sppm:

0,9-l,5 (m,4H), 1,24(t,J=8Hz,3H), 2,1-2,5(m,1H), 2.5- 2,7 (m,2H), 3,31 (s,2H), 4,05 (s,3H), 4.12 (q,J=8Hz,2H), 4,4-4,8 (m,1H), 5,35 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,1H), 6,4-7,2(m,10H) PNMR for forbindelse 11-15 (CDC13) Eppm: 0,9-1,4 (m,4H), 1,26 (t,J=8Hz,3H),

1,74 (s,9H), 1,88 (s,3H), 2,2-2,4 (m,1H), 2,4-2,6 (m,2H), 3,35 (s,2H), 4,14 (q,J=8Hz,2H), 4.3- 4,7 (m,lH), 5,40 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,1H),

6,50 (d,J=17Hz,1H), 6,9-7,4 (m,4H),

PNMR for forbindelse 11-16 (CDC13) Eppm:

0,4-1,4 (m,8Hz), 1,28 (t,J=8Hz,3H), 1,75 (s,9H), 2,1-2,5 (m,2H), 2,4-2,6 (m,2H), 3,43 (S,2H), 4,23 (q,J=8HZ,2H), 4,4-4,7 (m,lH),

5.52 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,1H), 6,64 (d,1H,J=6Hz), 6,9-7,6 (m,4H),

PNMR for forbindelse 11-17 (CDC13) Sppm:

0,8-1,5 (m,4H), 1,20 (t,J=8Hz,3H), 1,80 (s,9H),

2,0-2,7 (m,lH), 2,3-2,5 (m,2H), 3,30 (s,2H),

4,10 (q,J=8Hz,2H), 4,3-4,7 (m,lH),

5,35 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,lH), 6,3-7,3 (m,10H).

På samme måte som i eksempel 1-g ble forbindelsene 1-1-2 til 1-1-18 fremstilt. De derved fremstilte forbindelsers fysikalske egenskaper er vist i den følgende tabell.

PNMR for forbindelse 11-10 (CDC13) Eppm:

1,29 (t,J=8Hz,3H), 1,36 (d,J=8Hz,6H), 1,5-1,8 (m,lH), 1,98 (s,3H), 2,2-2,7 (m,3H), 2,9-3,7 (m,2H), 3,47 (heptalet,J=8Hz,1H), 3,8-4,6 (m,2H),

4,20 (q,J=8Hz,2H), 5,1-5,6 (m,lH), 6,3-6,7 (m,lH)

6,9-7,7 (m,7H), 8,3-8,6 (m,2H),

PNMR for forbindelse 1-1-3 (CDC13) Eppm:

1.1- 1,5 (m,9H), 1,6-1,7 (m,lH), 1,9-2,0 (m,3H), 2,3-2,5 (m,2H), 2,8-3,2 (m,1H), 3,3-3,7 (m,3H), 3.8- 4,5 (m,4H), 5,2-5,6 (m,1H), 6,4-6,7 (m,lH),

7,0-7,6 (m,7H), 8,3-8,5 (m,2H),

PNMR for forbindelse 1-1-4 (CDC13) Eppm:

1,25 (t,J=8Hz,3H), 1,33 (d,J=8Hz,6H), 1,7-2,0 (m,lH), 2.2- 2,6 (m,3H), 2,9-3,8 (m,3H), 3,8-4,6 (m,2H), 4,10 (q,J=8Hz,2H), 4,12 (s,3H), 4,9-5,4 (m,lH),

6.3- 7,2 (m,10H),

PNMR for forbindelse 1-1-5 (CDC13) Eppm:

0,8-1,1 (m,4H), 1,28 (t,J=7Hz,3H), 1,4-1,8 (m,2H),

1,89 (S,3H), 2,1-2,6 (m,4H), 3,0-3,8 (m,2H), 3,98 (S,3H),

4.18 (q,J=7Hz,2H), 4,3-4,6 (m,lH), 5,3-5,7 (m,lH),

6.4- 6,8 (m,lH), 6,9-7,3 (m,4H),

PNMR for forbindelse 1-1-6 (CDC13) Sppm:

1,29 (t,J=7Hz,3H), 1,37 (d,J=7Hz,6H), 1,4-1,9 (m,2H), 2,2-4,7 (m,2H), 3,0-3,9 (m,3H), 3,9-4,7 (m,2H), 4.19 (q,J=7Hz,2H), 5,1-5,5 (m,lH), 6,6-6,9 (m,1H),

7,0-8,6 (m,10H)

PNMR for forbindelse 1-1-7 (CDC13) Sppm:

1.28 (t,J=7Hz,3H), 1,32 (d,J=7Hz,6H), 1,4-1,8 (m,2H),

1,84 (s,9H), 1,89 (s,3H), 2,3-2,6 (m,3H), 3,1-3,7 (m,lH),

3,41 (heptalet,J=7Hz,2H), 5,1-5,5 (m,lH), 6,4-6,7 (m,lH),

6.9- 7,3 (m,4H)

PNMR for forbindelse 1-1-10 (CDC13) Eppm:

1.29 (t,J=7Hz,3H), 1,33 (d,J=7Hz,6H), 1,4-1,9 (m,2H), 1,90 (s,3H), 2,2-2,6 (m,3H), 3,1-3,7 (m,lH),

3,43 (heptalet,J07HZ,1H), 3,8-4,5 (m,2H),

4,19 (q,J=7Hz,2H), 5,1-5,5 (m,lH), 5,62 (s, 2H),

7,3-7,7 (m,lH), 6,9-7,6 (m,9H)

PNMR for forbindelse 1-1-14 (CDC13) Sppm:

0,9-1,3 (m,4H), 1,4-1,8 (m,2H), 1,28 (t,J=8Hz,3H), 2,3-2,5 (m,3H), 4,1-4,2 (m,1H), 4,3-4,5 (m,lH),

4,18 (q,J=8Hz,2H), 4,13 (s,3H),

5,45 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,1H), 6,6-7,3 (m,10H)

PNMR for forbindelse 1-1-15 (CDC13) Sppm:

0,9-1,4 (m,4H), 1,29 .(t,J=8Hz,3H) , 1,4-1,8 (m,2H),

1,78 (s,9H), 1,87 (s,3H), 2,3-2,5 (m,lH), 2,4-2,5 (m,2H),

4,0-4,1 (m,lH), 4,18 (q-J=8Hz,2H) , 4,3-4,4 (m,lH),

5,50 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,1H), 6,55 (d,J=17Hz,1H),

7,0-7,3 (m,4H)

PNMR for forbindelse 1-1-16 (CDC13) Sppm:

0,4-0,9 (m,4H), 0,9-1,5 (m,6H), 1,29 (t,J=8Hz,3H),

1,74 (s,9H), 2,2-2,5 (m,2H), 2,4-2,5 (m,2H),

3,9-4,5 (m,2H), 4,19 (q,J=8Hz,2H),

5,50 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,lH), 6,58 (d,J=17Hz,1H),

6,9-7,4 (m,4H)

PNMR for forbindelse 1-1-17 (CDC13) Sppm:

0,9-1,5 (m,6H), 1,28 (t,J=8Hz,3H), 1,86 (s,9H),

2,2-2,6 (m,lH), 2,3-2,5 (m,2H), 3,9-4,5 (m,2H),

4,18 (q,J=8Hz,2H), 5,45 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,1H),

6,63 (d,J=17Hz,1H), 6,8-7,3 (m,9H).

På samme måte som i eksempel 2 ble forbindelsene 1-5-2 til 1-5-18 fremstilt. De derved fremstilte forbindelsers fysikalske egenskaper er vist i den følgende tabell.

PNMR for forbindelse 1-5-8 (CDC13) Sppm:

1,0-1,7 (m,2H), 1,29 (d,J=7Hz,6H), 1,47 (t,J=7Hz,3H), 1,7-2,3 (m,3H), 3,1-3,3 (m,1H), 3,3-3,9 (m,1H),

3,53 (heptalet,J=7Hz,1H), 4,0-4,3 (m,lH),

4,49 (q,J=7Hz,2H), 5,2-5,5 (m,lH), 6,4-6,7 (m,lH),

7.0- 7,7 (m,5H)

PNMR for forbindelse 1-5-14 (CDC13) Sppm:

0,9-1,3 (m,4H), 1,3-1,8 (m,2H), 1,9-2,0 (m,lH),

2,4-2,6 (m,2H), 3,5-3,7 (m,1H), 4,04 (s,3H),

4.1- 4,2 (m,lH), 5,51 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,1H),

6,44 (d,J=17Hz,lH), 6,8-7,2 (m,9H)

PNMR for forbindelse 1-5-15 (CDC13) Sppm:

1.0- 1,2 (m,4H), 1,3-1,8 (m,2H), 1,71 (s,9H), 1,77 (s,3H),

1,9-2,1 (m,lH), 2,4-2,5 (m,2H), 3,5-3,6 (m,lH),

4.1- 4,2 (m,lH), 5,52 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,1H),

6,38 (d,J=17Hz,1H), 7,1-7,3 (m,4H)

PNMR for forbindelse 1-5-16 (CDC13) Sppm:

0,4-0,7 (m,4H), 0,9-1,2 (m,4H), 1,3-1,7 (m,2H),

1,68 (s,9H), 1,7-1,8 (m,lH), 1,9-2,0 (m,lH),

' 2,4-2,5 (m,2H), 3,5-3,6 (m,lH), 4,1-4,2 (m,lH),

5,52 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,1H), 6,40 (d,J=17Hz,1H),

7.2- 7,4 (m,4H)

PNMR for forbindelse 1-5-17 (CDC13) Sppm:

1.0- 1,2 (m,4H), 1,3-1,8 (m,2H), 1,80 (s, 9H),

1,9-2,1 (m,lH), 2,5-2,6 (m,2H), 3,5-3,6 (m,lH),

4.1- 4,2 (m,lH), 5,51 (d,d,J=17Hz,J=6Hz,1H),

6,42 (d,J=17Hz,1H), 6,8-7,2 (m,9H)

EKSEMPEL 3

( E )- 7 -[ 4 '-( 4 ''- fluorfenvl)- 1'. 3'- dimetvl- 6'-( 1''- metvletyl) pyrazolo[ 3, 4- blpyridin- 5'- yl1- 3, 5- dihydroksyhept- 6- ensyre

( forbindelse 1- 2- 1)

0,25 g (0,53 mmol) forbindelse 1-1-1 ble oppløst i 3 ml etanol, og 1,06 ml av en vandig 0,5 N natriumhydroksydløsning ble satt dråpevis til dette. Etanol ble destillert vekk under

redusert trykk, og deretter ble 3 ml destillert vann tilsatt. Løsningen ble vasket med dietyleter. Det vandige skikt ble nøytralisert forsiktig med 1% saltsyre og ekstrahert med dietyleter. Eterskiktet ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat og inndampet under redusert trykk og ga den ønskede forbindelse.

Mengde: 0,21 g (utbytte: 90%)

PNMR (DMSO-d<6>) Sppm:

1,29 (d,J=7Hz,6H), 1,83 (s,3H), 2,1-2,3 (m,2H), 2,4-2,6 (m,lH), 3,0-3,6 (m,4H), 3,96 (s,3H),

4,3-4,8 (m,2H), 5,2-5,6 (m,lH), 6,3-6,6 (m,lH), 7,2-7,4 (m,4H), 11,5-12,0 (bs,lH)

EKSEMPEL 4

( E)- trans- 6-( 2'- r4''- C4''- fluorfenyl)- 1'', 3''- dimetvl- 6''-( 1 '''- metyletyl) pyrazolof 3, 4- b] pyridin- 5'- yl1etenyl)- 4-hydroksy- 3, 4, 5, 6- tetrahvdro- 2H- pyran- 2- on ( forbindelse 1- 3- 1)

13 0 mg (0,29 mmol forbindelse 1-2-1 med formel

ble oppløst i 6 ml diklormetan, og 125 mg (0,29 mmol) N-cykloheksyl-N'-(2'-metylmorfolinoetyl)karbodiimid-p-toluen-sulfonat ble satt til dette. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 2 timer og så destillert under redusert trykk for å fjerne løsningsmiddelet til tørrhet. Den gjenværende olje ble renset ved tynnskiktkromatografi på kiselgel (eluent: heksan/etylacetat = 9/1 (v/v)) som ga den rene, ønskede forbindelse som fargeløs, viskøs, oljeaktig substans.

Mengde: 48 mg (utbytte: 3 9%)

P-NMR (CDC13) Sppm:

1,33 (d,J=6,8Hz,6H), 1,4-1,5 (m,lH), 1,6-1,7 (m,2H), 1,93 (s,3H), 2,5-2,6 (m, 1H) , 2,68 (dd,J=18Hz,J=5Hz,1H), 3,39 (heptalet, J=6,8Hz,lH), 4,07 (s,3H),

4,1-4,2 (m,lH), 5,1-5,2 (m,lH),

5,31 (dd,J=16Hz,J=6Hz,1H), 6,61 (dd,J=16Hz,J=l,5Hz,1H), 7,1-7,3 (m,4H)

EKSEMPEL 5 (Mellomprodukt)

6- cyklopropyl- 4-( 4'- fluorfenvl)- 5- hvdroksymetyl- 3- metyl- l- ( 2 ' - pyridvDpyrazolof3, 4- b] pyridin ( forbindelse VI- 18) ( Trinn P, S og T)

5,04 g (1,25 x 10"<2> mol) forbindelse VII-18 ble oppløst i 50 ml etylenglykol, og 15 ml (1,5 x 10"<2> mol) av en 1 mol/a vandig natriumhydroksydløsning ble satt til dette. Reaksjons-løsningen ble rørt ved 220°C i tre dager. Etter å ha bekreftet at utgangsmaterialet var forsvunnet på tynnskiktkromatograf i, ble reaksjonsløsningen avkjølt til romtemperatur. Kloroform, en vandig natriumkloridløsning og fortynnet saltsyre ble satt til reaksjonsløsningen for å justere pH til 2. Produktet ble ekstrahert med kloroform. Kloroformskiktet ble vasket med vann og tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Løsningsmiddelet ble destillert vekk og ga fargeløse, pulveraktige krystaller. De pulveraktige krystaller ble vasket grundig med n-heksan og ga 4,60 g (utbygge: 94,8%) forbindelse XIII-18.

Smeltepunkt: 235-245"C.

4,24 g (1,09 x IO"<2> mol) forbindelse XIII-18 ble oppslemmet i 90 ml tørr benzen. 6,92 g (5,45 x IO"<2> mol) oksalyldiklorid ble satt til dette, og blandingen ble varmet og rørt ved 60°C. Fire timer senere ble ytterligere 3 g oksalyldiklorid tilsatt, og oppvarmingen og røringen ble videreført i fire timer. Etter å ha bekreftet at utgangsmaterialet var forsvunnet på tynnskiktkromatografi, ble løsningsmiddelet destillert vekk på en fordamper og ga forbindelse XIV-18 som lyst gult pulver. Forbindelsen XIV-18 man derved fikk ble oppløst i 90 ml tørr dietyleter uten rensing. 0,78 g (2,06 x IO"<2> mol) litiumaluminiumhydrid ble satt til dette, og blandingen ble rørt ved romtemperatur i 5 timer. Etter å ha bekreftet at utgangsmaterialet var forsvunnet på

tynnskiktkromatografi, ble kloroform, is og en vandig ammoniumkloridløsning satt til for å stoppe reaksjonen. Produktet ble ekstrahert med kloroform. Kloroformskiktet ble vasket med en fortynnet, vandig natriumhydroksydløsning og med en vandig natriumkloridløsning og tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Så ble løsningsmiddelet fordampet. Den derved oppnådde rest ble renset ved kolonnekromatografi på kiselgel (eluent: benzen/etylacetat) som ga 3,27 g (utbytte: 80,2% basert på forbindelse XIII-18) av den ønskede forbindelse VI-18 som et lys gult pulver.

Smeltepunkt: 75-82°C.

Claims

1. Analogifremgangsmåte ved fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser med formelen: hvor R<1> er hydrogen, C1-C4-alkyl, cyklopropyl eller (hvor R'' er hydrogen eller klor, R<2> er bundet til nitrogen i 1- eller 2-stillingen av pyrazolopyridinringen og er C-^- C^-alkyl, 2-pyridyl, eller benzyl eller fenyl, eventuelt substituert med C-[_-C4-alkoksy, R<3> er isopropyl eller cyklopropyl, Y er -CH=CH-, og Z er -CH(OH)-CH2C(0)CH2C02R<12> eller -CH(OH)CH2-CH(OH)C<H>2C02R<12> (hvori R<12> er hydrogen, C1- C4 alkyl, Na, K eller 1/2 Ca), karakterisert ved at man a) for fremstilling av en forbindelse med formelen: hvori R<1>, R<2> og R3 er som definert ovenfor i forbindelse med formel I, og R<12> er C1-C4-alkyl, omsetter en forbindelse med formelen hvor R<1>, R<2> og R<3> er som definert ovenfor, med et dobbeltanion av R12-ester av acetoeddiksyre (hvori R<12> er som definert ovenfor), b) for fremstilling av en forbindelse med formelen: ringslutter en forbindelse med formel med et N,N'-disubstituert karbodiimid som sykliseringsmiddel, idet R<1>, R2 og R3 er som forut definert, og om ønsket c) forbindelsen med formel II hydrolyseres, d) forbindelsen med formel II reduseres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av (E)-3,5-dihydroksy-7-[6'-cyklopropyl-4'-(4''-fluorfenyl)-1',3'-dimetylpyrazolo[3,4-b]pyridin-5'-yl]hept-6-ensyre-natriumsalt, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av (E)-3,5-dihydroksy-7-[1'-t-butyl-6'-cyklopropyl-4'-(4''-fluorfenyl)-3'-metylpyrazolo[3,4-b]pyridin-5'-yl]hept-6-ensyre-natrium-salt, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av (E)-3,5-dihydroksy-7-[6'-cyklopropyl-4'-(4''-fluorfenyl)-1'metyl-3'-fenylpyrazolo[3,4-b]pyridin-5'-yl]hept-6-ensyre-natriumsalt, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.