KR100501843B1

KR100501843B1 - 새로운 항암성 비타민 ｄ₃유도체

Info

Publication number: KR100501843B1
Application number: KR10-2003-0019527A
Authority: KR
Inventors: 조천규; 이영열; 김형진
Original assignee: 학교법인 한양학원
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2005-07-20
Also published as: KR20040084441A

Abstract

본 발명은 항암 활성을 가지는 신규 비타민 D₃ 유도체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 공지되어 있는 비타민 D₃ 유도체가 항암 활성과 동시에 칼슘흡수촉진 활성을 가지고 있어 항암제로 사용되어서는 세포의 고칼슘화라는 부작용을 초래하였으나, 본 발명에서는 공지의 비타민 D₃의 구조 변경을 통하여 높은 항암 활성과 세포의 고칼슘화를 최대로 억제하므로써 항암제로 사용되어 부작용을 최소화하도록 하는 신규 비타민 D₃ 유도체에 관한 것이다.

Description

새로운 항암성 비타민 Ｄ₃유도체{New Anti-carcinogenic Vitamin D3 Analogs}

비타민 D₃는 칼슘흡수촉진 활성과, 세포변이 촉진 및 세포분열 억제에 의한 항암 활성을 동시에 가지고 있다[Feldman, et al., 비타민 D, Academic Press: New York, 1997]. 따라서, 비타민 D₃를 항암제로 사용하게 되면 항암 활성 이외에도 칼슘흡수촉진으로 인한 세포의 고칼슘화라는 부작용을 초래하므로 비타민 D₃의 항암제로 사용하는데는 많은 제약이 따른다.

비타민 D₃의 정확한 약리학적 기전은 아직 알려져 있지 않으나 비타민 D₃ 수용체에 결합한 후 일련의 세포내 신호전달 과정을 통해 세포의 전이촉진 및 분열억제 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 비타민 D₃ 수용체-비타민 D 결합체의 결정구조[Moras, et al., PNAS 2001, 98, 5491; Norman et al., Steroids 2002, 67, 457]가 밝혀져 있음에도 불구하고 현재까지 비타민 D₃의 항암 활성과 칼슘흡수촉진 작용의 분리가 어려운 것은 칼슘흡수촉진 작용이 동일한 비타민 D₃ 수용체에 의해 매개되기 때문이다.

따라서 좋은 약리학적 특성을 가진 비타민 D₃ 유도체의 개발은 전형적인 "합성-활성 측정"을 통해 시도되고 있다.

현재까지 공지되어 있는 비타민 D₃ 유도체들의 구조-활성 상관관계는 개괄적으로 다음의 두 가지로 요약된다. 첫째는, 비타민 D₃의 A-고리 구조에 대한 변경이다. 예를 들어 C2 위치에 알킬기를 도입하거나, 혹은 C1과 C3 위치에 존재하는 하이드록시기(OH)를 제거하는 것 등이다. 그러나, 상기한 A-고리 구조가 변경된 화합물들은 대부분 칼슘흡수작용을 증가시키는 결과를 나타내었다. 두 번째는, 비타민 D₃의 CD-고리 구조에 대한 변경이다. 특히 D-고리에 연결된 곁사슬(side chain)이 변화된 다수의 유도체가 보고되어 있다[Posner et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 9, 1691; Posner et al., J. Med. Chem. 1999, 42, 3425].

비타민 D₃의 구조변경을 통해 칼슘흡수촉진 작용을 낮추려는 노력이 시도되어 왔고 현재 몇몇 화합물들은 비교적 우수한 약리학적 특성을 가지고 있는 것으로 보고되어 있으며, 특히 백혈병, 유방암 및 고환암 및 면역결핍증에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 낮은 칼슘흡수촉진 작용과 높은 항암 활성을 가지는 것으로 알려져 있는 보고 된 공지의 비타민 D₃유도체들은 A-고리에 두 개의 하이드록시기(-OH)와 엑소-메틸렌기(=CH₂)가 존재하고 있어 그 합성이 매우 까다롭고 복잡하여 20∼30단계의 합성과정을 거쳐 제조되므로, 이들 화합물의 대량생산이 불가능하여 의약품으로 개발될 가능성이 매우 낮다. 따라서, 공업적으로 생산하기에는 엑소-메틸렌 그룹이 없는 비타민 D₃유도체의 개발이 매우 유용할 것으로 기대되나, 현재까지 보고된 바에 의하면 항암 활성을 가지고 있으면서 엑소-메틸렌 그룹이 없는 비타민 D₃유도체는 아직 합성된 바가 없다.

본 발명의 발명자들은 의약품으로서의 개발을 위해 A-고리의 엑소-메틸렌기와 하이드록시기가 제거된 신규 구조의 비타민 D₃ 유도체들을 합성하여 활성 검색한 결과, 이 화합물들이 비교적 높은 항암 활성(LD₅₀5×10^-6 M)을 가지고 있음과 동시에 고칼슘화를 일으키지 않는다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 항암제로 유용한 신규 비타민 D₃유도체와 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 신규 비타민 D₃유도체가 유효성분으로 함유되어 있는 항암제를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 항암 활성을 가지는 다음 화학식 1로 표시되는 비타민 D₃유도체와 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 그 특징으로 한다.

상기 화학식 1에서, R은 이중결합을 포함하고 있는 탄소수 4 내지 20의 치환 또는 비치환된 탄소기이며, 이때 치환기는 하이드록시기이다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 기존 비타민 D₃ 화합물에서의 C2 위치의 엑소-메틸렌기와 C1과 C3 위치의 하이드록시기가 결합되어 있지 않는 구조적인 신규성을 가지고 있고, 이들 치환기의 부재로 인하여 이의 합성이 보다 용이해질 수 있었으며, 약효상으로도 우수한 항암 활성을 가짐과 동시에 고칼슘화 현상dl 일어나지 않아 항암제로 사용되어서 부작용을 최소화할 수 있는 우수성을 가지고 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 있어 특히 바람직하기로는, 다음 화학식 1a로 표시되는 화합물의 경우이다:

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 산(acid) 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 푸마르산, 락트산, 말레산, 숙신산 및 타르타르산 등의 유기 또는 무기산과 함께 약제학적으로 허용 가능한 이들의 염을 형성할 수도 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속이온이나 암모늄 이온과 반응하여 약제학적으로 허용가능한 염을 형성할 수도 있다.

한편, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 비타민 D₃유도체의 제조방법을 포함한다.

상기 화학식 1로 표시되는 비타민 D₃유도체는, A-고리 구조가 포함된 포스핀 옥사이드와 CD-고리의 케톤기를 연결하는 리쓰고(Lithgoe) 제법으로 합성된다. 그 제조과정을 간략히 요약하면 다음 반응식 1과 같다.

상기 반응식 1에서, R은 상기에서 정의한 바와 같고, Pro.는 아민보호기를 나타낸다.

상기 반응식 1에 나타낸 방법에 의하면, 상기 화학식 2로 표시되는 포스핀 옥사이드 화합물을 유기용매에 용해시킨 후, -90 ℃ 내지 -40 ℃의 온도로 유지한 상태에서 염기를 가한 후에 상기 화학식 3으로 표시되는 케톤 화합물을 첨가하고 빛이 차단된 조건에서 2 내지 5시간 정도 유지시켜 상기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조한다. 그런 다음, 보호기(Pro.)를 제거하여 본 발명이 목적하는 상기 화학식 1로 표시되는 비타민 D₃ 유도체를 제조한다. 본 발명에 따른 제조방법에 이용되는 보호기 도입반응 및 보호기 제거반응은 당 분야에서 널리 공지되어 있는 것으로서, 아민보호기로서는 예를 들면, N-tert-부톡시카보닐기(Boc) 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 제조방법에서 출발물질로 사용되는 상기 화학식 2로 표시되는 포스핀 옥사이드 화합물은 다음 반응식 2에 나타낸 바와 같은 방법으로 제조하여 사용할 수 있다.

상기 반응식 2에서, Pro.는 아민보호기를 나타낸다

상기 반응식 1에 나타낸 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다. 먼저, ⅰ)상기 화학식 2-1로 표시되는 싸이클로헥사논 화합물에 아민보호기(Pro.)를 도입하여 상기 화학식 2-2로 표시되는 보호된 싸이클로헥사논 화합물을 제조한다. 그리고, ⅱ) 상기 화학식 2-2로 표시되는 화합물에 염기(NaH)를 가한 후에, 트리에틸 포스포노아세테이트와 -20 ℃ 내지 0 ℃ 온도로 반응시켜 상기 화학식 2-3으로 표시되는 에스테르 화합물을 제조한다. 그리고, ⅲ) 상기 화학식 2-3으로 표시되는 화합물에 디이소부틸알루미늄 하이드라이드(DIBAL-H)를 가하고 -90 ℃ 내지 60 ℃ 온도로 교반 반응시켜 상기 화학식 2-4로 표시되는 알콜 화합물을 제조한다. 그리고, ⅳ) 상기 화학식 2-4로 표시되는 화합물을 N-클로로숙신이미드(NCS), 디메틸설파이드(DMS) 및 칼륨 디페닐포스파이드(KPPh₂)로 반응시켜 상기 화학식 2로 표시되는 포스핀 옥사이드 화합물을 제조한다.

또한, 본 발명의 제조방법에서 또 다른 출발물질로 사용되는 상기 화학식 3으로 표시되는 케톤 화합물은 문헌[Posner et. al., J. Org. Chem. 1997, 62, 3299]에 공지되어 있는 방법에 의하여 쉽게 합성하여 사용할 수 있다.

이상의 제조방법으로 합성한 각 중간체 화합물 및 목적 화합물은 추출, 재결정, 칼럼 크로마토그래피 등과 같은 통상의 방법에 의하여 분리 및 정제할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 화합물은 적절한 방법으로 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 경구투여에 적합한 제제는 정제, 분말제, 그래뉼제, 캡슐제 등의 고체형 제제; 용액제; 오일성 현탁제; 시럽, 엘릭시르 등과 같은 액제 등이다. 비경구 투여에 적합한 제제는 본 발명의 화합물을 수용성 또는 오일성 현탁액으로 제조하여 주사에 적합하도록 제제화한 것이다. 제제화함에 있어서는, 통상의 부형제, 결합제, 담체, 수용성 용매, 오일성 용매, 유화제, 현탁제 등이 사용될 수 있고, 그 밖에도 기타 첨가제 예를 들면 보존제, 안정제 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 전술한 바와 같은 질병의 치료 또는 예방을 목적으로 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 실제적으로 투여량은 환자의 나이, 몸무게 및 기타 환자의 상태를 고려하여 결정하는 바, 일반적으로 성인남자를 기준으로 경구투여시에는 0.05 ∼ 1,000 ㎎/일(바람직하기로는 10 ∼ 1,000 ㎎/일)을 투여하고, 비경구 투여시에는 0.01 ∼ 300 ㎎/일(바람직하기로는 0.05 ∼ 100 ㎎/일)을 투여한다. 또한, 투여는 하루에 한 번 또는 여러 회에 걸쳐서, 1회의 투여 량 또는 여러 번의 투여 량으로 복용된다.

이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 비타민 D3 유도체(화학식 1a)의 합성

(1) 화학식 2-2의 중간체 합성:

문헌[Houssin, R. et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 533-536]에 공지된 방법으로 합성하였다. 즉, 50 mL의 둥근 플라스크에 0.10 g(0.65 mmol)의 4-피페리돈 염산염(화학식 2-1)을 넣은 후 0.17 g의 Boc₂O, 0.12 g의 NaHCO₃, 4 mL의 디옥산 및 2 mL의 물을 순차적으로 부가하였다. 이 혼합물을 상온에서 15시간 반응시킨 후 에틸 아세테이트로 추출하고, MgSO₄로 수분을 제거한 후 용매를 증발시키고 실리카-겔 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 목적 화합물 0.13 g(100% 수율)을 얻었다.

(2) 화학식 2-3의 중간체 합성

문헌[Ashwood, M. S. et al. J. Chem. Soc. 1995, 6, 641-4]에 공지된 방법으로 합성하였다. 즉, 50 mL의 둥근 플라스크에 3 mL의 무수 디메톡시에탄(DME)을 넣은 후 65 mg(2.7 mmol)의 NaH를 상온에서 천천히 부가하였다. 이 혼합물에 5 mL의 DME에 용해시킨 321 mg의 트리에틸 포스포노아세테이트를 0 ℃에서 천천히 부가하였다. 1시간 교반 후 이 용액에, DME에 용해시킨 130 mg(0.65 mmol)의 케톤 화합물(화학식 2-2)을 0 ℃에서 천천히 적하시켰다. 1시간 교반 후 5 mL의 물을 부가하고 에테르로 추출하였다. 추출된 유기용액을 MgSO₄로 건조시킨 후 실리카-겔 크로마토그래피(hexanes:EtOAc = 8:1)로 분리, 정제하여 목적물 150 mg(86% 수율)을 얻었다.

(3) 화학식 2-4의 중간체 합성

140 mg(0.52 mmol)의 에스테르 화합물(화학식 2-3)을 3 mL의 무수 톨루엔에 용해시킨 후 1.3 mL의 DIBAL-H(1M in toluene)를 -78 ℃에서 천천히 부가하였다. 이 혼합용액을 30분 동안 교반시킨 다음, 0.5 mL의 포화 칼륨 나트륨 타르트레이트 수용액을 부가하였다. 용액의 온도를 상온으로 올리고 6시간 동안 교반 후 CH₂Cl₂로 추출하고, 건조 및 용매증발 과정을 거친 다음 실리카-겔 크로마토그래피(hexanes:EtOAc = 2:1)로 분리, 정제하여 목적 화합물 120 mg(99% 수율)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃/TMS) δ5.48(t, J=10.5 Hz, 1H), 4.17(d, J=10.5 Hz, 2H), 3.45-3.37(m, 4H), 2.38-2.14(m, 4H), 1.48(s, 9H).

(4) 화학식 2의 화합물 합성

2 mL의 무수 CH₂Cl₂에 155 mg의 N-클로로숙신이미드(NCS, 1.1 mmol)를 부가한 용액에 0.15 mL(1.1 mmol)의 Me₂S를 0 ℃에서 천천히 부가하였다. 30분 동안 교반한 후 2 mL의 CH₂Cl₂ 에 용해시킨 120 mg(0.52 mmol)의 알콜 화합물(화학식 2-4)을 0 ℃에서 천천히 부가하였다. 30분 동안 교반 후 1 mL의 물을 적하하고 생성물을 CH₂Cl₂로 추출하였다. MgSO₄로 건조, 용매 증발 과정을 거친 후 실리카겔을 얇게 깐 필터 플라스크에 부어 넣고 에틸아세테이트/헥산(1:3) 혼합용매로 신속히 씻어 내린 후 용매를 증발시켰다. 이 화합물을 1 mL의 무수 THF 에 용해시킨 후 -78 ℃에서 2.2 mL의 KPPh₂(0.5 M in THF)를 이 용액에 부가하였다. 10 분 후 1 mL의 물을 넣고 상온으로 온도를 올린 후 용매를 증발시켰다. 잔존물에 2 mL의 CH₂Cl₂를 넣은 후 연속해서 1 mL의 H₂O₂ 수용액(30%)을 부가하고 1시간 동안 교반하였다. 생성물을 CH₂Cl₂로 추출한 후 MgSO₄를 사용한 건조, 용매증발 과정을 거쳐 실리카-겔 크로마토그래피(hexanes:EtOAc = 4:1 → 100% EtOAc)를 사용하여 분리, 정제하여 목적 화합물 72 mg(총수율 16%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃/TMS) δ7.75-7.71(m, 4H), 7.53-7.48(m, 2H), 7.44-7.42(m, 4H), 5.27 (bs, 1H), 3.23-3.21(m, 2H), 3.12-3.08(m, 2H), 3.04-3.01(m, 2H), 2.09(bs, 2H), 1.98-1.97(m, 2H), 1.42(s, 9H).

(5) 화학식 1a의 화합물 합성

50 mg(0.12 mmol)의 포스핀 옥사이드 화합물(화학식 2)을 1 mL에 무수 THF에 용해시킨 후 -78 ℃로 온도를 낮추었다. 이 용액에 0.09 mL의 nBuLi(1.6 M in hexane)을 천천히 부가시키고 10분 동안 교반하였다. 40 mg(0.10 mmol)의 케톤 화합물(화학식 3)을 1 mL의 무수 THF에 용해시키고 -78 ℃로 온도를 낮춘 후 위의 용액에 천천히 부가하였다. 이 용액을 동일한 온도(-78 ℃)에서 빛을 차단한 후 3시간 동안 교반한 후 상온으로 온도를 천천히 올리고 물을 부가하여 반응을 종료하였다. 생성물은 에틸 아세테이트로 추출하고, 건조(MgSO₄), 용매증발 과정을 거친 후 실리카-겔 크로마토그래피(hexanes:EtOAc = 5:1)로 분리, 정제하였다.

상기 제조된 화합물(화학식 4)을 2 mL의 EtOAc에 용해시킨 후 진한 염산 5 방울을 부가하였다. 상온에서 5시간 교반 후 에틸 아세테이트로 추출하고 건조, 용매제거 과정을 거쳐 실리카-겔 크로마토그래피(100% MeOH)로 분리, 정제하여 목적 화합물 16 mg(35% 수율)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz) δ 6.40-6.37(m, 2H), 6.10(d, 1H, J=11.2 Hz), 5.97(d, 1H, J=11.2 Hz), 5.87-5.80(m, 2H), 2.93-2.80(m, 4H), 2.42-2.20(m, 8H), 2.12-1.98(m,5H), 1.76-1.64(m,6H), 1.36-1.26(m, 2H), 1,25(d, 3H, J=2.4 Hz), 1.03(t, 6H, J=7.5 Hz), 0.98(s, 3H).

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 다음은 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제제 1 : 정제의 생산(직접 가압)

활성성분	5.0 ㎎/정제
락토스	14.1 ㎎/정제
Crospovidone USNF	0.8 ㎎/정제
마그네슘 스테아레이트	0.1 ㎎/정제
총 무 게	20.0 ㎎/정제

상기 활성성분을 체로 친 후 부형제와 함께 섞었다. 이 혼합물을 가압하여 정제로 만들었다.

다른 방법으로, 활성성분과 락토스를 물에 녹여 동결건조시켰다. 건조 혼합물을 부형제와 함께 섞은 후 가압하여 정제로 만들었다.

제제 2 : 정제의 생산(습식 조립)

활성성분	5.0 ㎎/정제
폴리솔베이트 80	0.3 ㎎/정제
락토스	16.0 ㎎/정제
녹말	4.0 ㎎/정제
콜로이달 실리콘 디옥사이드	2.7 ㎎/정제
마그네슘 스테아레이트	2.0 ㎎/정제
총 무 게	30.0 ㎎/정제

활성성분을 체로 친 후 락토스, 녹말과 섞었다. 폴리솔베이트 80을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음 분말을 미립화하였다. 건조 후에, 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드, 마그네슘 스테아레이트와 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 만들었다.

제제 3 : 분말과 캡슐 약제의 생산

활성성분	5.0 ㎎/캡슐
락토스	14.8 ㎎/캡슐
폴리비닐 피롤리돈	10.0 ㎎/캡슐
마그네슘 스테아레이트	0.2 ㎎/캡슐
총 무 게	30.0 ㎎/캡슐

활성성분을 체로 친 다음 부형제와 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

실험예 1: 급성 골수성 백혈병 세포에서의 체외 항백혈병 효과

세포주로는 인간 급성 골수성 백혈병 세포주인 HL-60으로 10% 소태아혈청(FBS, Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA)이 포함된 RPMI 1640으로 배양하였으며, 배양액에는 100 unit/mL의 페니실린 G와 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신 설페이트(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)를 첨가하여 37 ℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양하고 매 3 ∼ 4일마다 교체해 주었다.

HL-60 세포주를 조직배양등급의 35 mm 페트리 디쉬에 10% 소태아혈청(FBS), 10% 소태아알부민(BSA, Sigma), 1.2% 메틸셀룰로오스(Eastman Kodak Co., Rochester, NY, USA), 100 unit/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 포함한 RPMI 1640 1 mL에 페트리 디쉬당 2×10³의 농도로 심고, 비타민 D₃ 유도체를 첨가한 후 배양하여 세포집락을 검사하였다. 세포집락은 40개 이상의 세포가 집락을 형성한 것만을 계산하며 배양시작 6 ∼ 10일 후에 측정하였다. 실험은 이중으로 세 번 반복 시행하였다.

시험 화합물의 농도(M)		세포집락 수	억제율(%)
화학식 1a 화합물	0	433	100
	1×10^-6	249	57.5
	5×10^-6	0	0
	1×10^-5	0	0

실험예 2: 비타민 D ₃ 유도체 투여 후 HL-60 세포에서의 세포고사의(Apoptosis) 확인

세포고사 상태의 세포 인지질 포스파티딜 세린을 원형질 막 안쪽에서 막 바깥쪽으로 전위시키는데, 칼슘-의존적 인지질 결합 단백질인 Annexin V-FITC는 포스파티딜 세린에 대해 높은 친화력을 띈다. 그리고 요오드화 프로피디움(PI) 염색을 통해서는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별할 수 있기 때문에, 비타민 D₃ 유도체 조사 후 Annexin V-FITC와 PI 염색을 통해서 유세포 분석기(flowcytometer)로 세포고사를 분석하였다.

첨부도면 도 1과 도 2는 화학식 1a로 표시되는 비타민 D₃ 유도체에 노출된 시간과 농도에 따른 HL-60 세포에서 유세포 분석기를 이용한 세포 고사 분석 결과로서, 노출된 시간과 농도에 비례하여 초기 고사 상태의 세포들(Annexin V-양성, PI-음성)과 죽은 세포들(Annexin V-양성, PI-양성)이 모두가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 비타민 D ₃ 유도체 투여 후 HL-60 세포에서의 세포주기(Cell cycle) 억제의 확인

유세포 분석기는 개개의 세포 입자를 유체 역학적으로 일정한 속도로 흐르게 한 상태에서 빛을 조사하여 형광 물질에 부딪혀 굴절되는 광량을 측정하도록 제작된 기기이다. 비타민 D₃ 유도체가 세포 주기에 미치는 영향을 분석하기 위해 실온에서 요오드화 프로피디움(PI) 염색을 하고 1시간 배양 후, 유세포 분석기로 세포주기를 분석하였다.

도 3은 화학식 1a로 표시되는 비타민 D₃ 유도체 5×10^-6M을 처리한 후 HL-60 세포에서 유세포 분석기를 이용한 세포 주기 분석 결과이다. 세포는 PI로 15분 동안 배양한 후 0, 6,12, 18, 24, 30, 36, 48, 72시간에 각각 세포 주기를 분석하였다. 시간이 지남에 따라서 G1 arrest가 유도되었으며 subG1(G0) 상태의 세포들이 HY-C에 투여된 시간에 비례하여 증가한다. 이 결과를 요약하면 다음 표 2와 같다.

구 분	0 시간	6 시간	12 시간	18 시간	24 시간	30 시간	36 시간	48 시간
G0-G1	46.39	48.77	52.23	50.81	47.08	51.84	58.85	95.58
G2-M	11.74	18.67	20.64	22.99	20.51	25.36	41.15	3.88
S	41.87	32.56	27.13	26.2	32.42	22.81	0	0.54
Debris	3.54	11.8	30.43	44.01	48.81	56.35	57.42	84.30

실험예 4: 비타민 D ₃ 유도체 투여 후 HL-60 세포에서의 세포고사 및 세포주기에 관련된 유전자들의 발현 변화 관찰

유세포 분석의 결과를 토대로 비타민 D₃ 유도체의 농도를 5×10^-6M로 고정한 뒤, 대조군과, 12h, 24h, 48h의 네 그룹으로 나눈 뒤 각각의 그룹에서 단백질을 분리 및 정량한 뒤 단백질을 50 ㎍으로 맞춘 뒤 전기영동을 하고 웨스턴(western) 분석 방법으로 세포주기와 세포고사에 중요하게 관여하는 여러 가지 대표적인 단백질들(cdk2, cdk4, cdk6, B치-2, caspase-3, p27)의 발현 정도를 검사하였다.

도 4는 화학식 1a로 표시되는 비타민 D₃ 유도체 5×10^-6M 투여 후 HL-60 세포에서 세포고사 및 세포주기 관련 물질들의 변화를 나타낸 것이다. 시간이 지남에 따라서 bcl-2가 감소하였으며, caspase-3의 활성화된 형태와 p27이 증가하였다. cdk2는 변화가 없었으며, cdk4는 감소, cdk6가 증가되는 것이 단백질 수준에서 탐지되었다.

실험예 5: 비타민 D ₃ 유도체의 급성 골수성 백혈병 세포에서의 체내 항백혈병 효과

6 주령의 Balb/c 마이스(mice)를 구입하여 무균 상태에서 사육, 1 주일동안의 순화 기간을 거친 후 실험에 들어갔다. 비타민 D₃ 유도체의 대조군으로 1,25(OH)₂D₃을 선택하였고, 실험군은 그룹 당 5 마리씩 1) Control, 2) 비타민 D₃ 유도체 10^-5M, 3) 비타민 D₃ 유도체 10^-6M, 4) 비타민 D₃ 유도체 10^-7M, 5) 1,25(OH)₂D₃ 10^-7M의 5군으로 나누었다. 각각은 인산완충용액(PBS)에 희석하여 이틀에 한번씩 5주 동안 복강 내 투여를 하였다. Control은 동량(0.1 m)의 인산완충용액(PBS)을 같은 방법, 같은 실험 스케줄에 따라 투여하였다. 혈청 내 칼슘 농도는 투여 3일 후부터 4일 간격으로 EL-ISE을 이용해 측정하여 변화를 분석하였다.

도 5는 1,25(OH)₂D₃와 화학식 1a의 비타민 D₃ 유도체가 마이스(mice) 혈청 내 칼슘 변화에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 도 5의 결과에 따르면, 1,25(OH)₂D₃의 주 부작용인 고칼슘혈증은 비타민 D₃ 유도체에서는 유발되지 않음을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 독성 확인

비타민 D₃ 유도체의 독성을 검증하기 위해서 전신 상태, 체모 상태, 체중 변화 및 사망 등을 관찰하였으나 대조군과 차이가 없음을 알 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 비타민 D₃ 유도체는 세포의 고칼슘화를 초래하지 않으면서 높은 항암 활성을 나타내므로 차세대 항암제로서 유효하다.

도 1은 화학식 1a의 화합물 1×10^-5M을 처리한 후 HL-60 세포에서 유세포 분석기를 이용한 세포 고사 분석 결과이다.

도 2는 화학식 1a의 화합물 5×10^-6M을 처리한 후 HL-60 세포에서 유세포 분석기를 이용한 세포 고사 분석결과이다.

도 3은 화학식 1a의 화합물 5×10^-6M을 처리한 후 HL-60 세포에서 유세포 분석기를 이용한 세포 주기 분석 결과이다.

도 4는 화학식 1a의 화합물 투여 후 HL-60 세포에서 세포고사 및 세포주기 관련 물질들의 변화를 나타낸 것이다.

도 5는 1,25(OH)₂D₃와 화학식 1a의 화합물이 마이스(mice) 혈청 내 칼슘 변화에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 비타민 D₃ 유도체.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 이중결합을 포함하고 있는 탄소수 4 내지 20의 치환 또는 비치환된 탄소기이며, 이때 치환기는 하이드록시기이다.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 다음 화학식 1a로 표시되는 것임을 특징으로 하는 비타민 D₃ 유도체 :
다음 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 유효약물로 함유된 것임을 특징으로 하는 항암제.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 이중결합을 포함하고 있는 탄소수 4 내지 20의 치환 또는 비치환된 탄소기이며, 이때 치환기는 하이드록시기이다.
다음 화학식 2로 표시되는 포스핀 옥사이드 화합물과 다음 화학식 3으로 표시되는 케톤 화합물을 반응시켜 다음 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조한 후에, 보호기를 제거하여 다음 화학식 1로 표시되는 비타민 D₃ 유도체를 제조하는 것을 특징으로 하는 제조방법:

[화학식 1]

상기에서, R은 이중결합을 포함하고 있는 탄소수 4 내지 20의 치환 또는 비치환된 탄소기이며, 이때 치환기는 하이드록시기이고, Pro.는 아민보호기로서 N-tert-부톡시카보닐기(Boc)를 나타낸다.