SI9200193A

SI9200193A - New isosteric peptides

Info

Publication number: SI9200193A
Application number: SI19929200193A
Authority: SI
Inventors: Butrus Atrash; David Michael Jones; Michael Szelke
Original assignee: Aktiebolaget Astra
Priority date: 1991-08-28
Filing date: 1992-08-27
Publication date: 1993-06-30
Also published as: US5424291A; ATE212643T1; AP9200418A0; EP0530167A1; EP0605462B1; IS3906A; CA2116527A1; NO940669L; MA22632A1; NO940669D0; SE9102462D0; BG98583A; SK23394A3; ZA925737B; DE69232394D1; CN1069736A; JP3353297B2; FI940945A; CZ38094A3; TW221816B

Description

NOVI IZOSTERIČNI PEPTIDI

OPIS

Ta izum se nanaša na nove kompetitivne inhibitorje trombina, na njihovo sintezo, na farmacevtske sestavke, ki vsebujejo te spojine kot aktivne sestavine in na uporabo teh spojin kot antikoagulantov v profilaksi in zdravljenju tromboemboličnih bolezni, takih kot so: venska tromboza, pljučna embolija, arterijska tromboza, posebej srčni infarkt in cerebralna tromboza, splošna stanja hiperkoagulabilnosti in lokalna stanja hiperkoagulabilnosti, npr. taka, ki sledijo plastični kirurgiji ožilja in operacijam koronarnih bajpasov.

OSNOVA

Koagulacija krvi je ključni proces vklujučen tako v hemostazo (tj. preprečitev izgube krvi iz poškodovane žile ) kakor tudi v trombozo (tj. patološko okluzijo krvne žile s krvnim strdkom). Strjevanje je rezultat kompleksne serije encimatskih reakcij naznačenih v Shemi 1 pod katero so različni faktori strjevanja krvi označeni z rimskimi številkami.

Trombin ima centralno vlogo v koagulaciji, tako v primeru, da je proces sprožen po notranji poti, kakor tudi če je sprožen po zunanji poti: on aktivira krvne ploščice, pretvarja fibrinogen v monomere fibrina, ki spontano polimerizirajo v filamente, in aktivira FXIII, ki prečno

Η 1 292 veže polimer do netopnega fibrina.Trombin dalje aktivira FV in FVIII v reakciji pozitivne povratne inhibicije.

Zato pričakujemo, da bodo inhibitorji trombina učinkoviti antikoagulanti.

NOTRANJI

SISTEM

Protrombin

Trombin

F II

F Ha

Fibrinogen

Fl

Fibrin (topen)

F Ha

F XIIIa-<F XIII

Fibrin (netopen)

Shema 1

1412S2

PREJŠNJE TEHNIKE

Prve inhibitorje trombina, ki so temeljili na elektrofilnih ketonih, so razvili kot so opisali M. Szelke in D.M. Jones v EP-A1-0,118,280, prednostna pravica GB z datumom 4. marec 1983. Te spojine so izvedene iz P₃ - P2' pentapeptidne sekvence A verige fibrinogena, v kateri je peptidna vez Ρχ - Ρχ', ki se cepi, zamenjana z skupino -CO-CH2, tako da nastane keto izoster odgovarjajočih peptidov.

Drugi znani primeri inhibitorjev serin proteinaz, ki temeljijo na elektrofilnih ketonih, vključujejo sledeče:

(a) M. Kolb et al. (Merrel-Dow) EP-A2-0,195,212 (Datum prednostne pravice 4.2.86), ki opisuje peptidne -keto estre in amide.

(b) B. Imperiali in R.H. Abeles, Biochemistry 1986, 25, 3760 (peptidil fluoroalkil ketoni).

(c) Ueda et al. , Biochem, J. 1990, 265, 539 (peptidil fluoroalkil ketoni).

(d) D. Schirlin et al. (Merrel-Dow) EP-A1-0,362,002 (datum prednostne pravice 1.9.88), ki opisuje fluoroalkilamidne ketone.

(e) P. Bey et al. (Merrel-Dow) EP-A2-0,364,344 (datum prednostne pravice 7.10.99), ki opisuje , , -triketo spojine.

(f) E.N. Shaw et al. (Research Corporation) US-4,318,904 (datum prednostne pravice 25.04.800, ki opisujejo peptidne kloro-metil ketone, npr. H-DPhe-Pro-Arg-CH2Cl.

Inhibitorje trombina, ki temeljijo na peptidnih aldehidih so prijavili S. Bajusz et al. v J. Med. Chem. 1990, 33, 1729, in v (Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar R T) EP-A2141202

0,185,390 (datum prednostne pravice 21.12.84). Inhibitorje trombina kot peptide, ki vsebujejo C-terminalne derivate arginina in borne kisline, ter njihove izotiouroniumske analoge so prijavili A.D. Kettner et al. (Du Pont) EP-A20293,881 (datum prioritete 5.6.87 in 6.4.88).

So tudi primeri argininskih derivatov ali analogov, ki inhibirajo trombin, ne vsebujejo pa elektrofilnega ketona, na primer:

(a) S. Okamoto et al. (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) EP-A1-0,008,746 (datum prednostne pravice 31.08.78), ki opisujejo arilsulfonil arginin amide npr. argatroban.

(b) J. Sturzebecher et al., Pharmazie 1981, 36, 639 (arilsulfonil p-amidofenilalanin amidi).

Eden cilj tega izuma je, da omogoči nove in učinkovite inhibitorje trombina, ki so aktivni kot kompetitivni inhibitorji njihovega encima tj. da povzročajo reverzibilno inhibicijo. Nadaljni cilj je, da se dobijo inhibitorji, ki so oralno biokoristni in selektivni v inhibiciji trombina, v odnosu na druge serin proteaze. Stabilnost, trajanje delovanja in niška toksičnost v obsegu terapevtskih doz, so še nadaljni cilji izuma.

ODKRITJE IZUMA

Spojine

Odkrili smo, da so spojine splošne formule 1., ali kot take ali v obliki fiziološko sprejemljivih soli, vključujoč stereoizomere, učinkoviti inhibitorji trombina:

141292

V formuli i, kakor tudi v sledečem besedilu, razen če ni drugače opisano, velja sledeče:

A je -CH2-, -CH=CH-, -CH2-CH2- ali -CH2-CH2-CH2Rl in sta ista ali različna in vsak je H ali Χ-Β-, kjer je B nerazvejena ali razvejena alkilenska skupina, ki ima 1-3 ogljikova atoma, X je pa H, metilna, etilna, cikloalkilna skupina, ki ima 3-6 ogljikovih atomov ali R'CO-, kjer je R' OH, nerazvejena ali razvejena alkoksilna skupina , ki ima 1-4 ogljikova atoma, NH2 ali NHR'', kjer je R' ' nerazvejena ali razvejena alkilna skupina, ki ima 1-4 ogljikova atoma, ali pa je X mimetik karboksilne kisline, znan per se. izbran izmed -PO(OR''')2,“SO3H in 5(IH)-tetrazolila, in R' ' ' je H, metil ali etil, ali pa je B -SO2- in X je metil ali etil;

1412S2 m je Ο, 1 ali 2, r3 je cikloheksilna skupina in r3A j_e h; ali pa je m 1 in R^ cikloheksilna ali fenilna skupina in r3A gradi etilenski most skupaj z Rl;

Y je 0 ali S(O)p, kjer je p 0, 1 ali 2;

R⁴ je H; nerazvejen ali razvejen alkil ali cikloalkil, ki ima 1 do 6 ogljikovih atomov nesubstituiranih ali pa substituiranih z enim ali več atomi fluora in/ali substituiranih s fenilno skupino; substisuiran ali nesubstituiran aromatski obroč izbran med fenilom, 4-metoksi-fenilom, 4-terc-butil-fenilom, 4-metil-fenilom, 2-, 3- ali 4-trifluoro-metil-fenilom, fenilom substituiranem z 1-5 atomi fluora; ali -CH(CF3)-fenil.

Spojine formule _1/ sorodne peptidni sekvenci Acb verige človeškega fibrinogena, predstavljajo modificirane podpoložaje P3 - Pi':

H-Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala15 10 p₃ p_{2 Pl} j pp p₂' p₃,

-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg-------Gly-Pro-Arg-Val14 15 16 17 20

V skladu z realizacijo, ki se ji daje prednost, se izum nanaša na spojine formule i, kjer je:

A -CH2-CH2- ali -CH2-CH2-CH2-;

12S2

Rl je H in R² H0C0(CH2)_n- ali CH3CH2OCO(CH2)_n- , n je pa 1 ali 2;

Y je O m je 1, R² je cikloheksilna skupina in R²·^ H;

Realizacije izuma, ki imajo posebne prednosti, so predstavljene s spojinami;

H00C-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-0-CH2-CF3

HOOC-CH2-DCha-Pic-Arg-CH2-0-CH2-CF3

HOOC-CH2-DCha-Pic-Arg-CH2-O-nBu

HOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-0-nBu

H00C-CH2-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-0-CH2-CF3

H00C-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-0-nBu

Medicinska in farmacevtska uporaba

Naslednja realizacija izuma se nanaša na zdravljenje stanj človeškega ali živalskega organizma, ki zahtevajo inhibicijo trombina. Pričakujemo, da bodo spojine iz izuma posebej koristne za zdravljenje ali profilakso tromboze in hiperkoagulabilnosti v krvi in tkivih živali, vključno človeka. Bolezenska stanja pri katerih so spojine potencijalno koristne, v zdravljenju in/ali profilaksi, vključujejo vensko trombozo in embolijo pljuč, arterijsko trombozo kot v primeru srčnega infarkta , nestabilno angino, udar povzročen s trombozo in periferno arterijsko trombozo. Nadalje pričakujemo, da bodo spojine koristne v profilaksi aterosklerotičnih bolezni kot so bolezni koronarnih arterij, cerebralnih arterij in perifernih arterij. Nadalje pričakujemo, da bodo spojine koristne, skupaj s

141202 trombolitiki, pri infarktu miokarda. Dalje, spustance so pričakovano koristne v profilaksi reokluzije po trombozi, pri perkutani transluminalni plastični kirurgiji ožilja (PTCA) in operacijah koronarnih bajpasov. Dalje, spojine so pričakovano koristne za preprečitev retromboze po mikrokirurgiji. Dalje, pričakujemo, da bodo spojine koristne za preprečitev strjevanja krvi v zvezi s umetnimi organi in srčnimi zaklopkami. Dalje, spojine so pričakovano koristne v tretmanu za preprečitev strjevanja krvi pri hemodijalizi in pri razširjeni intravaskularni koaguiaciji. Dnevna doza bo normalno med 0,1 mg do 10 g aktivne sestavine. V primeru intravenoznih raztopin se daje prednost tistim, ki vsebujejo 0,1-100 mg/ml, medtem ko dozirna enota vsebuje 1-1000 mg, in dajanju 1-4 krat na dan.

Nadaljna pričakovana korist je pri splakovanju kateterjev in mehaničnih pripomočkov, ki se uporabljajo pri pacijentih in vivo, in za preprečitev koegulacije pri ohranitvi krvi, plazme in drugih krvnih produktov in vitro.

Priprava

Nadaljni cilj izuma je način priprave spojin iz izuma. Tako se izum dalje nanaša na postopek priprave spojin v skladu s formulo 1, postopek, ki obsega (metoda I) zamenjavo halogena iz halometilketona formule (W²)HNN H .N(W²)

H

O

Haiid

1412S2 z R⁴Y- (Y=O,S) - Wl je amino terminalna zaščitna skupina kot je terciarni butoksikarbonil in w2 zaščitna skupina kot je benziloksi karbonil (kot je ilustrirano v postopkih (A), (D) in (F)), redukcijo ketona do alkohola, odstranitev amino terminalne zaščitne skupine, standardno združevanje peptida, ki mu sledi oksidacija alkohola kar daje zaščiteni tripeptid keton, odstranitev amino terminalne zaščitne skupine, ki ji sledi N-alkiliranje (kot je ilustrirano v postopkih (A), (B), (G) in (H), in deprotekcijo ali zamenjavo zaščitenega dipeptida v reakciji združitve, na katero smo se prej sklicevali in jo ilustrirali (npr. postopek (A) (iii)), z nekim aminoterminalno-N-alkiliranim-N-trifluoroacil-zaščitenim dipeptidom (postopek (K>, ki mu sledi oksidacija in deprotekcija, ali (metoda II) alkiliranje, z nekim R⁴-halidom, cf-ketola formule

kjer so wl in kot je prej definirano (kakor je ilustrirano v postopku (E)), in potem dalje reagiranje kot v metodi I, ali (metoda III) uporabo modificirane Dakin-West-ove rekcije, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 8 ( 1969) 981, kot je uporabljena za tripeptide, J. Org. Chem., 50 (1985) 1112: z reakcijo spojine formule (ali alternativno za neposredno uporabo amino-terminal-N141202 alkiliranega-N-trifluoroacil-zaščitenega tripeptida)

kjer so wl in w2 kot je prej definirano, z (T-CH2CO)2O/ kjer je T halogen, R^O ali R^S in 4-DMAP, in nato z nadaljnim reagiranjem kot v metodi I.

V tistih slučajih kjer je rezultat reakcije zmes stereoizomerov, se oni po izbiri ločujejo s standardnimi kromatografskimi tehnikami ali pa s tehnikami rekristalizacije in se izolira, če je želeno, en sam stereoizomer.

PODROBEN OPIS IZUMA

Sledeči opis pojasnjuje vidike izuma.

Sinteza in farmacija

Kemija, ki smo je uporabili za pripravo inhibitorjev, ki so predmet pričujočih patentnih zahtevkov, je očrtana v shemah sintez (postopki A do H) ter postopkih I in K. Potrebne alkoksi- ali fenoksi-metil ketone arginina smo v

4 1 202 glavnem pripravili z (I) zamenjavo Br iz bromometilketonov z R^O-, ali s uporabo prethodno pripravljenega NaOR^ (postopek A), ali s uporabo KF (postopki D in F), ali (II) z alkiliranjem arginin -ketola z Ag2O/R4l (videti postopek E) .

Za vpeljevanje DCha, Pro in njihovih analogov smo uporabili standardne reakcije združevanja peptidov. Karboksialkilno skupino na N-terminalu smo vpeljali ali z alkiliranjem uporabljajoč bromo-acetate, ali z Michaelovo adicijo do terciarnega butil-akrilata (postopki A,B) ali s prethodnim vgrajevanjem karboksi-alkila v dipeptidno polovico (videti postopek K). Vse zaščitne skupine smo potem odstranili (videti postopke za deprotekcijo a-c zatem).

Splošni eksperimentalni postopki

Standardni protokol se sklicuje na ekstrakcije z etilacetatom, običajno izpiranje s 0,3M KHSO4, IM KHCO3 in slano vodo, ki mu sledi filtriranje skozi Whatmanov papir za ločevanje faz in sušenje s toluenskim azeotropom. TSH smo izvajali na trgovskih ploščah prevlečenih z Merckovim Silicagelom 60F254. Vizualizacijo smo izvedli s kombinacijo UV svetlobe, segrevanja, ki mu je sledilo pršenje s fluoreskaminom ali segrevanja, ki mu je sledilo kloriniranje (CI2 posoda) in pršenje s 1% raztopino škrob/KI. Naglo kromatografijo smo izvedli na Merckovem Silicagelu 60 (40-63 jim) pod pritiskom N2 · Aminokislinsko analizo smo napravili s pomočjo Beckmanovega Gold Sistema. Peptide smo hidrolizirali (6M HCI + fenol na ΙΙΟθΟ 22 ur) potem injektirali in kvantificirali prolinov vrh. MPLC smo izpeljali v steklenih kolonah (Anachem) napolnjenih z Vydac C18 15-25 jum silika, s pomočjo gradientov 1% TFAMeCN v 1% TFA-H2O in kontroliranjem na 226 nm.

141282

Frakcije smo analizirali s pomočjo HPLC in čiste združili ter liofilizirali. HPLC smo izvedli s kromatografsko aparaturo Spectra-Physics 8700 Serije. Sistem topil je bil kot v slučaju MPLC, z detekcijo na 210 nm. Pretok 1,5 ml/min. Kolona: Novapak C18, 4 pm (kolona 8 x 100 mm, Waters). vse vmesne spojine smo karakterizirali z NMR (aparati Hitachi-Perkin Elmer R24 60 MHz ali Jeol 270 MHz). Vse končne peptide smo karakterizirali s pomočjo njihovih FAB masnih spektrov (M-Scan Ascot, Berks., U.K.).

Priprava začetnih materijalov:

Boc-Arg(Z2)-CH2Br:

(i) Boc-Arg(Z2) -OH (10 mmol) v suhem THF (50 ml) in NMM (10 mmol) smo ohladili do -100c in po kapljicah dodali iBC (10 mmol) vzdržujoč temperaturo 3/4 -100c. Po 10 minut na - 100c smo mešani anhidrid izlili v CH2N2-eter (25 mmol v 150 ml). Po 3 urah smo presežek CH2N2 uničili z ocetno kislino in raztopino oprali s H2O (3 x) in slano vodo. Sušenje in uparevanje daje diazoketon kot rumeno olje. IR 2100 cm-1 (COCHN2).

(ii) Diazoketon (10 mmol) v suhem etil acetatu (200 ml) smo ohladili do -15θΰ in po kapljicah dodali 1 M HBr/etilacetat (približno 11 ml) Ko smo odločili rumeno barvo je TSK (etil acetat/heksan) pokazala popolno konverzijo diazoketona v bromometil keton. Raztopino smo hitro prenesli v lijak za ločevanje in oprali s 1 M KHCO3, slano vodo, posušili in uparili do sušnine. Raztopitev v vročem EtOH in ohladitev je dala bromometil keton kot amorfen beli prašek.

NMR (CDCI3): S 1,3 (5, 9H), 1,5-1,85 (m, 4H), 3,75-3,95 (m

1412S2 + s, 4H), 4,3 (m, IH), 5,05 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,65 (d, 2H), 7,30 (m, 10H), 9,2 (br, s, IH), 9,3 (br, s, IH). Tališče: Mehča se na 50θ0 nato počasi razkroji >>70θ<2.

Boc-DCha-X-ONSu (X = Pro, Pic ali Aze):

(i) Boc-DCha-OH (10 mmol) v CH2CI2/DMF (1:5 50 ml) smo tretirali s HONSu (11 mmol), ohladili do ΟθΟ in dodali VTKDI (13 mmol). Po 30 minutah smo segreli na sobno temperaturo. TSK je po 3 urah pokazala popolno formiranje Boc-DCha-ONSu. Z dodajanjem Et2O (200 ml) in izpiranjem s H2O (3 x), slano vodo in sušenjem smo dobili ester kot brezbarvno peno.

(ii) N-hidroksisukcinimido ester (10 mmol) v CH2CI2 (50 ml) smo tretirali s H-Pro-OBzl.HC1 ali H-Pic-Obzl.HC1 ali H-Aze-OBzl (11 mmol) in iPr2NEt (20 mmol). Po mešanju v času 3 ur smo s standardnim postopkom z etiiacetatom/0,3 M KHSO4 dobili dipeptidni ester, ki je bil zadosti čist, da smo ga lahko uporabili v naslednji fazi.

(iii) Boc-DCha-X-OBzl v THF smo hidrogenizirali nad 5% Pd/C na STP 4 ure. S filtriranjem in uparevanjem smo dobili kislino kot trdno substanco ali kot peno. S rekristalizacijo (iPr2O ali Et2O/heksan) smo dobili čiste produkte.

Boc-DCha-Pro-OH (trdna substanca tal. 163-166θΟ): NMR (CDCI3) 6 0,8-2,05 (m, + s na 1,4, 26H), 3,4 (m, IH) , 3,85 (m,IH), 4,5 (m, 2H), 5,2 (m, IH).

Boc-DCha-Pic-OH (trdna substanca tal. 121-122θΟ): NMR (CDCI3) S 0,8-2,05 (m, + s na 1,45, 28H), 3,35 (m, IH), 3,95 (m, IH), 4,6-4,9 (m, IH), 5,4 (m, IH), 5,6 (m, IH) , 8,8 (br, s, IH).

4 1 2C2

Boc-(Me)DCha-Pro-ONSu:

Boc-(Me) DPhe-OH smo hidrogenizirali nad 5% Rh-C v 90% ocetni kislini-H2O na 0,41 MPa 3 dni in dobili kvantitativni dobitek Boc-(Me)DCha-OH. Boc-(Me)DCha-OH (10 mmol) in NMM (10 mmol) v CH2CI2 (50 ml) smo ohladili na -15θΟ in dodali Ph2PO-Cl (10 mmol). Po 20 minutah smo dodali H-ProOBzl.HCl (11 mmol) in NMM (20 mmol). Po 1 uri smo pustili, da se segreje na sobno temperaturo. Po 2 urah smo s standardnim postopkom in naglo kromatografijo (40% etil acetat/heksan) dobili čist Boc-(Me)DCha-Pro-OBzl kot brezbarvno olje (80%).

NMR (CDCI3): S 0,5-2,2 (m, + s na 1,4, 26H), 2,65 (s, 3H), 3,5 (m, 2H), 4,35-5,0 (m, 2H), 5,1 (s, 2H), 7,30 (s, 5H). To spojino smo pretvorili v N-hidroksisukcinimido ester kot je prej opisano za Boc-DCha-X-ONSu.

141202

SHEME SINTEZ: Postopek (A) (')

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br + 'OR⁴ 20°Boc-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴ n-Pr. R⁴« CH₂CF₃, CH(Ph)CF₃ Ar i 1

NaBH₄MeOH, 0°

R’ (iii)

1) HCl-dioksan

Boc-DCha-X-N

H

OR⁴

OH

2) 8oc-DCha-X-ONSu ali [Boc-(Me)DCha-X-ONSu]

Boc-N

H

OR⁴

OH

Dess-Martinov perjadi nan

Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴ or [Boc-(Me)DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

X - Pro, Pic, Aze (v)

1) HCl-dioksan

2) RO₂CCH₂Br

-Y-DCha-X-Arg(Z₂)-CH,OR⁴ iPr₂NEt,MeCN, Δ ali izpustiti ali postopek G ali postopek H

YiH, RO^CH;, (RO₂CCH₂)₂(R=Bzl,l8u ali El)

R ’ (CH₂)₃-NZ-C(NH)-NHZ

Postopek (B)

1) HCl-dioksan

2) ElOAc/

M KHCO_{3 λ} λ

Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴ —·-tBuO₂CCH₂CH₂-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR

3) tBu-akrilat

MeOH,Δ n.pr.R - nBu,CH2CF₃

U 1 222

Postopek (C)

Boc-Arg(Z₂)-CHN₂ + HOR⁴ -22^2⁴.^ Boc-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

Potem se nadaljuje kot v postopku (A)

e.g. R⁴= CH₂CF₃,CH(Ph)CF_3lCH(CF₃)₂

Postopek (D) (i)

CI₃CCH₂-OH ch₂ci₂

Boc-Arg(Z₂)-OH -»

VTKDI

4-DMAP (ii)

1) HCl-dioksan

2) Boc-DCha-X-ONSu

Boc-Arg(Z₂)-OTce -►

3) Zn-HOAc (iii)

1) NMM.iBC.THF

2) CH₂N₂-eter

Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-OH -Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-CH2C·

3) HBr-EtOAc.-10° (iv)

CMF rSh

-Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂YR⁴

KF,RT,24h Potem se nadaljuje kot v postopku (A)

Y= O.S

R nBu, Ar i 1

Na pri mer 1; R⁴YH=HO₂CCOPh

1412S2

Postopek (E)

KF

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br + HO₂CCOPh CMF

3h

Boc-Arg(Z₂)-CH₂O₂CCOPh (ii)

THF

IMKHCO3

-*- Boc-Arg(Z₂)-CH₂OH

24h (i i')

Ag₂O

CH₂CI₂

-Boc-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

R⁴1 d

n.pr. R =Me.Ei,nPr,nBu

Potem se nadaljuje kot v postopku (A)

Postopek (F)

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Bf + R⁴CH

n. pr .R⁴= CH₂CF_3i CH₂(CF₂)₂CF_3iPh(4-OMe)

KF

-►- Boc-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

DMF,24h

Potem se nadaljuje kot v postopku (A)

4 1 2S2

Postopek (6)

1) HCl-dioksan

Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴ -Me-SO₂-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR~

2) MeSO₂C1

n. pr. R⁴» CH₂CF₃

Postopek (H)

1) HCl-dioksan

Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴ -ChCH₂-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR

n. pr. R⁴= CH₂CF₃

2) ChCHO/NaCNBH₃

1412S2

Postopki za pripravo:

Sledeči postopki za pripravo ilustrirajo prej omenjene metode I-III kakor tudi sledeče stopnje do končnih spojin.

Postopek (A):

(i) Boc-Arg(Z2)-CH2Br (10 mmol) smo v trdnem stanju dodali prej pripravljeni raztopini alkoksida ali fenoksida (alkohol ali fenol 10 mmol in 80% NaH-olje, 10 mmol) v DMF (40 ml) na -20θΩ pod N2 · Po izteku 30 minut smo raztopino segreli na sobno temperaturo. 2 ure kasneje smo dodali 0,3 M KHSO4, da bi nevtralizirali ves zaostali alkoksid in odstranili DMF pod vakuumom. Surovi produkt smo podelili med etilacetatom in H2O, sloj etilacetata oprali s slano vodo, posušili in uparili. S naglo kromatografijo ali kristalizacijo smo dobili čiste alkoksiketone.

Boc-Arg(Z2)-CH2OPh (trdna substanca): NMR (CDCI3): o	1,41
(s, 10H), 1,64-1,68 (m, 3H), 3,92 (dd, 2H), 4,5 (m,	IH),
4,62 (q, 2H),
5,1 (s, 2H), 5,2 (s, 2H), 5,5 (d, IH), 6,8 (d, 2H),	6,95
(t, IH), 7,2-7,45 (m, 12H), 9,2 (br,s IH), 9,3 (br,s,	IH).

Tališče 115-118θΟ.

Boc-Arg(Z2)-CH2OCH2CF3 (trdna substanca): NMR CDCI3:

^1,35 (s, 10H), 1,55-1,75 (m, 3H), 3,7 (q, 2H), 3,85 (m,

2H), 4,2 (q+m, 3H), 5,05 (s,2H), 5,15 (s, 2H), 5,7 (d,lH), 7,15-7,35 (m, 10H), 9,15 (br,s, IH), 9,3 (br,s, IH).

Tališče 87-90θΩ.

(ii) Na alkoksimetil ali fenoksimetil ketone v MeOH/THF (1:1) na ΟθΟ smo delovali z NaBH4 (1 ekv.). Po 10 minutah

141202 smo dodali 0,3 M KHSO4 do pH 7 in zmes uparili, da bi odstranili MeOH/THF. Dodali smo etilacetat in po standardnem predpisu (etilacetat/0,3 M KHSO4) izolirali alkohol kot diastereoizomerno zmes.

(iii) Na alkohol smo delovali z 4M HCl v dioksanu v teku 15 minut pri sobni temperaturi in nato uparili. Ostanek v CH2CI2 (1 mmol v 5 ml) smo tretirali z Boc-DCha-X-ONSu ( 1 ekv.) in iPr2NEt (do pH 9 na mokrem pH papirju). Po 3 urah smo s pomočjo standardnega postopka dobili modificiran tripeptid, ki smo ga prečistili s naglo kromatografijo (zmes etil acetat-heksan, ki je vsebovala 1% ocetno kislino). Dobitek: 50-85%.

(iv) Na tripeptid alkohol v CH2CI2 smo delovali z DessMartinovim perjodinanom (3 ekv.) (Dess, D.B. in Martin, J.C. J. Org. Chem. 1983, 48, 4155-4156). Po 2 urah mešanja pri sobni temperaturi smo s pomočjo standardnega postopka (Et2O/l M KHCO3/Na2S2O3) dobili surove tripeptid ketone, ki smo ih prečistili s naglo kromatografijo (etilacetatheksan).

(v) Na keton smo delovali s 4 M HCl-dioksanom 15 minut pri sobni temperaturi in uparili. Ostanek v suhem MeCN (1 mmol v 5 ml) smo tretirali z benzilbromoacetatom ali terciarnim butil bromoacetatom (1,2 ekv.) in iPr2NEt (3 ekv.). Po refluktiranju v času 2 ur smo raztopino uparili in izpeljali naglo kromatografijo (etilacetat-heksan) in tako dobili benziloksikarbonilmetil ali terciarni butiloksikarbonilmetil peptide kot olja (40-50%).

V primerih 30 in 31 smo uporabili 2,5 ekv. bromoacetata, da bi dosegli bis-alkiliranje.

141222

Postopek (B)

Pepetid alkoksimetilketon smo tretirali z presežkom 4 M HCl-dioksana 15 minut pri sobni temperaturi. Po uparevanju smo dobili HCl sol, ki smo je ločili med etilacetatom in 1 M KHCO3. Etilacetat smo odločili, posušili in uparili in tako dobili proste amine, ki smo jih ekstrahirali z MeOH in dodali sveže destilirani terciarni butilakrilat (1,5 ekv.). Z refluktiranjem v času 4 ur smo dobili terciarni butoksikarboniletil peptid, ki smo ga prečistili z naglo kromatografijo v zmesi etilacetat/heksan.

Postopek (C)

Boc-Arg(Z2)-CHN2 (1 mmol) smo raztopili v alkoholu R^OH (5 ml) in na njega delovali z Rh2(OAc)4 (kat.). Po nekaj urah pri sobni temperaturi TSK ni pokazala ostanke diazoketona. Alkohol smo odstranili pod vakuumom in izolirali produkt z naglo kromatografijo s pomočjo zmesi etilacetat/heksan.

Postopek (D) (i) Boc-Arg(Z2)-OH (10 mmol) v suhem CH2CI2 (50 ml) smo tretirali z 2,2,2-trikloroetanolom (11 mmol) in 4-DMAP (1 mmol), ohladili na ΟθΩ in dodali VTKDI (13 mmol). Po izteku 30 minut smo pustili, da se je segrelo na sobno temperaturo in mešali 24 ur. S uparevanjem in delitvijo med etilacetat/0,3 M KHSO4, katerim je sledilo 3 x pranje z 0,3 M KHSO4, 1 x H2O, 1 x slano vodo, sušenje in uparevanje, smo dobili Tee ester, ki smo ga uporabljali kot takega.

(ii) Tee ester (10 mmol) smo tretirali s 4 M HCl-dioksanom

L· f*.·.

1412S2 (50 ml) 20 minut na sobni temperaturi in nato uparili. Po sušenju smo na ostanek v CH2CI2 (50 ml) zapovrstjo delovali z Boc-DCha-X-ONSu (10 mmol) (X = Pro, Pic) in iPr2NEt (do pH 9 na mokrem pH papirju). Po 3 urah smo s standardnim postopkom (etilacetat/0,3 M KHSO4) dobili tripeptid ester kot olje. Tee ester (10 mmol) v 90% ocetni kislini-H2O (50 ml) smo tretirali v intervalih od 5 minut z malimi porcijami sveže aktiviranega Zn nad 1 uro. Po izteku nadaljne ure smo zmes filtrirali in raztopino uparili. S standardnim postopkom (etilacetat/0,3 M KHSO4) smo dobili tripeptidno kislino, ki smo je prečistili z naglo kromatografijo na silikagelu (2% ocetna kislinaetilacetat)tako, da smo dobili tripeptidno kislino kot brezbarvno peno (80% po 3 stopnjah).

(iii) Tripeptidno kislino smo pretvorili v bromometil keton z istim postopkom kakor je tisti, ki smo ga opisali za Boc-Arg(Z2)-CH2Br. Tripeptid bromometil keton smo dobili kot brezbarvno olje s pomočjo nagle kromatografije, uporabljajoč zmesi etilacetat/heksan.

NMR (CDCI3):

0,9 (m),1,15 (m),1,25 (m) , 1,35(s),1,6(m),1,85 (m),2,1 (m) skupaj 3OH,3,3

(iv) Na tripeptid bromometil keton (1 mmol) v suhem DMF (5 ml) smo delovali s fluoriniranim alkoholom, fenolom ali tiolom (1,2 mmol) in anhidriranim kalijevim fluoridom (1,5 mmol) in mešali na sobni temperaturi 24 ur. S uparevanjem, kateremu je sledil standardni postopek in nagla kromatografija, smo dobili tripeptid ketone.

Boc-DCha-Pro-Arg-(Z2)-CH2)-Ph(4-Me): NMR (CDCI3): (S 0,9

4 1 2S2

(br,3,IH),9, 6 (br,s,lH).

V primeru 37 smo zaščiteni sulfid z m-kloroperbenzojsko kislino v diklorometanu pri sobni temperaturi oksidirali do sulfona.

Postopek (E) (i) Boc-Arg(Z2)-CH2Br (10 mmol) in benzoilmravljinčno kislino (12 mmol) v DMF (40 ml) smo tretirali s KF (14 mmol). Po mešanju v času 3 ur smo DMF izparili in produkt podelili med etilacetatom/H20. Nato smo sušili ter uparili, in dobili surovi benzoilformiat ester, ki smo ga prečistili s kristalizacijo (CH2Cl2-heksan) in tako dobili produkt kot belo trdno substanco (86%).

NMR (CDCI3) (m,IH),4,95 (d,IH),7,35

1,4 (s,9H),1,65-1,9 (m,4H),3,95 (m,2H),4,3 (q,2H),5,15 (ABq,2H),5,25 (s,2H),5,9 (m,10H),7,5 (t,2H),7,65 (t,IH),8,15 (t,2H),9,25 (br,s, IH) ,9.,45 (br,s,IH).Tališče 130-132θΟ.

(ii) Benzoilf ormiat ester (5 mmol) v THF (200 ml) in 1 M KHCO3 (200 ml) smo močno mešali na sobni temperaturi 24 ur. THF smo ločili in izparili, ter vodno fazo ekstrahirali z etilacetatom, ki je bil kombiniran z materijalom iz THF. S kristalizacijo iz CH2Cl2-heksana smo dobili ol -ketol kot belo trdno substanco (90%).

4 1 202 (d,IH),7,35 (m,10H),9,25 (br,s,IH),9,4 (br, s,IH).Tališče

101-103θσ.

(iii) Na oC- -ketol (1 mmol) v suhem CH2CI2 (5 ml) smo delovali z alkil jodidom (5 do 10 mmol) in srebrovim oksidom (2 mmol). Zmes smo v temi refluktirali 2 do 17 ur (npr. Mel, Eti, nPrl: 2 uri; nBul; 5 ur). S uparevanjem, ki mu je sledila nagla kromatografija (etilacetat-heksan) smo dobili alkoksimetil ketone kot brezbarvna olja (5085%) .

Boc-Arg(Z2)-CH2OEt (olje): NMR (CDCI3): Λ 1,15 (t,3H),l,4 (s,9H),1,5-1,8 (m,4H),3,4 (q,2H),3,95 (t,2H),4,l (q,2H),4,45 (m,lH),5,15 (s,2H),5,25 (s,2H),5,4 (d,IH),7,35 (m,10H),9,25 (br,s,IH),9,4 (br,s,lH).

Boc-Arg(Z2)-CH2NBu (olje): NMR (CDCI3):

0,9(t,3H),1,25-1,8 (m)+l,4 (s), 17H ,3,3 (dd,2H),3,95 (t,2H),4,05 (q,2H),4,45 (m,lH),5,l (s,2H),5,2 (s,2H),5,35 (d,IH),7,35 (m,10H),9,25 (br,s,IH),9,4 (br,s,lH).

Postopek (F)

Boc-Arg(Z2)-CH2Br smo tretirali s CF3CH2OH, CF3(CF2)2^CH2^OHali Ar-OH in KF v DMF uporabljajoč postopek očrtan v postopku (D) (iv).

Postopek (G)

Na peptide zaščitene z Boc smo delovali s 4 M HCl-dioksanom 15 minut na sobni temperaturi in uparili. Ostanek v CH2CI2 smo tretirali z MeSO2Cl (1,1 ekv.) in iPr2NEt (2,5 ekv.). S standardnim postopkom in naglo kromatografijo

1202 smo dobili metilsulfonilpeptide pri katerih smo odstranili zaščito, kot je naznačeno v postopkih za deprotekcijo (a).

Postopek (H)

Pepetidom smo odstranili zaščitno skupino Boc, kot je že opisano in odstranili HC1 s pomočjo delitve v etilacetat/1 M KHCO3. Proste amine v MeOH, ohlajene do ΟθΟ, smo tretirali z aldehidom CH-CHO (1,5 ekv.) in NaCNBH3 (1 ekv.). Po 1 uri smo uparili na hladnem in izpeljali naglo kromatografijo ter dobili N-alkilirani peptid. Odstranjevanje zaščitnih skupin je izpeljano po postopkih deprotekcije (a).

Postopek (I)

Boc-(3-trans-fenil)-D,Lprolin smo pripravili kot so opisali Chung et al. J. Org. Chem. 1990, 55, 270, in ga združili s H-Pro-OBzl kot je prej opisano za Boc-(Me)DChaPro-Obzl. Dipeptid smo potem spremenili v njegov ONSu ester kot bo kasneje opisano.

Boc-(3-trans-cikloheksil)-D,Lprolin smo pripravili iz fenilnega analoga s hidrogenizaci jo nad 5% Rh-C v 90% HOAC-H2O na 0,41 Mpa v času 3 dni.

Postopek (K)

Sinteza vmesnega produkta N-(BzlO2C-CH2-), N-(CF3CO)-DChaPro-ONSu

1 2C2 (i) H₂ -Pd/C (ii) BzlO₂C-CHO,

NaCNBH₃

Z-DCha-Pro-OtBu -> N-(BzlO₂C-CH₂-),N-(CF₃CO)DCha-Pro-ONSu (iii) (CF₃CO)₂O (iv) TFA (v) HONSu, WSCDI (i) Z-DCha-Pro-OtBu (ki smo ga pripravili s standardnimi reakcijami združevanja peptidov) smo hidrogenizirali v THF nad 5% Pd-C pri standardni temperaturi in pritisku v času 24 ur. S pomočjo filtriranja in uparevanja smo dobili HDCha-Pro-OtBu (olje, 100%).

(ii) Predhodni produkt (2 mmol) in benzil glioksilat (1 ekvivalent) v benzenu smo trikrat uparevali (vsakokrat smo dodali svež benzen), da bi odstranili vodo. Zaostali imin (2 mmol) v 1% ocetni kislini/metanolu (8 ml) smo tretirali z NaCNBH3 (2 mmol). Po izteku 1 ure smo uparevali in potem izpeljali naglo kromatografijo na silikagelu (60% EtOAcheksan) ter tako dobili Bzl02C-CH2-DCha-Pro-0tBu, 385 mg (41%).

(iii) Zgoraj omenjeni produkt (380 mg) v suhem CH2CI2 (8 ml) smo tretirali z Et3N (2 ekvivalenta) in (CF3CO)2O (1,2 ekvivalenta). Po 40 minutah smo uparevali in izpeljali naglo kromatografijo (silikagel, 30% EtOAC-heksan) in dobili N-(BzlO2C-CH2-), N-(CF3CO)-DCha-Pro-OtBu kot olje, 390 mg (86%).

lHNmr(COCl3) - kompleks zahvaljujoč prisotnosti 4 rotamerjev - npr. signal tBu skupine na <5 1,4-1,5 je štirikrat razcepljen v odnosu 1:0,25:0,8:0,4. U 0,9(m), l,l(m), l,65(m), l,95(m), 2,2(m) 17H : 1,4-1,5 4xs, 9H ;

3,l(m), 3,5(m), 3,7(m) 2H ; 4,3-4,6 m,3H); 5,055,4(m,3H); 7,35 s,5H.

141202 (iv) Zgoraj omenjeni produkt (335 mg) smo tretirali s CH2CI2-TFA (1:1,8 ml) 2,5 ure pri sobni temperaturi. S uparevanjem, ki so mu sledila tri uparevanja iz toluena, smo dobili prosto kislino, 100%.

(v) Predhodno kislino smo spremenili v njen -ONSu ester (100%) s pomočjo HONSu, kot smo prej opisali za Boc-DChaOH.

Vmesni produkt se lahko združi s H-Arg(Z j2^-CH2-Y-R4 s uporabo že očrtanih splošnih postopkov.

Postopek deprotekcije a omogoča peptid zaščiten z N-CF3-CO-. N-CF3-CO smo odstranili s postopkom za deprotekcijo d.

Postopki deprotekcije:

(a) Zaščiten peptid v MeOH/H2O (3;1), ki je vseboval IM HCI (2 ekvivalenta) smo hidrogenizirali nad 5% Pd/C na STP 40 minut. Po filtriranju (0,2 jum) in uparevanju smo izpeljali liofilizacijo iz vode in dobili peptide kot puhaste bele trdne substance. Prečiščevanje smo, če je bilo potrebno, izpeljali s MPLC (videti splošne postopke).

(b) Zaščiteni peptid smo najprej tretirali s TFA/CH2CI2 (1:) 1 uro in zatem uparili, nato pa hidrogenizirali kot je to prej opisano pod (a).

(c) COCOPh skupino smo najprej hidrolizirali kot v (E) (ii) in nato hidrogenizirali nad H2~Pd/C kot v (a).

(d) Odstranitev N-CF3-CO (N-trifluoroacetil):

N-trifluoroacetil peptid smo raztopili v MeCN-H2O-0>880

I 14 12 22 amoniaku (1:1:1) in pustili pri sobni temperaturi 24 ur. Po uparevanju smo peptid prečistili, če je to bilo potrebno.

Primeri

Sledeči primeri podrobneje ilustrirajo načela izuma.

Primeri spojin iz izuma so citirani v Tabeli 1, Tabela 2 očrtuje postopke, ki smo jih uporabili v njihovi pripravi in jih opisali v odstavku pod naslovom Postopki priprave in Tabela 3 predstavlja karakteristične podatke za citirane spojine.

Primeri 1-37

L f^c

12 02

Tabela 1

Primer Formula številka

11 12

21 22

H-DCha-Pro-D,LArg-CH₂H-DCha-Pro-D,LArg-CH₂

H-DCha-Pro-Arg-CH₂

.. HOOC-CH₂ -DCha-Pro-D, LArg-CH₂Et-OOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂KOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂

-OH

-O-Me

-o-ch₂-cf₃

-O-CH(CF₃)₂

-O-C*H(Ph)-CF₃

-o-ch₂-cf₃

-O-CH₂-CF2-CF2-CF₃

-O-Ph

-O-Ph(4-OMe)

-O-Ph(4-tBu)

-O-Ph(4-Me)

-O-Ph(4-F)

-O-Ph(3-F)

-O-Ph(2-F)

-O-Ph(3-CF₃)

-O-Ph(4-CF₃)

-O-Ph(2-CF₃)

-o-c₆f₅

-O-Et

-O-nPr

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-n,Bu

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-iBu

HOOC-CH₂-DCha-Aze-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃HOOC-CH₂-DCha-Pic-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃

HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-nBu

Me-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃

Me-SO2-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃Ch-CH₂-DCha.-Pro-D,LArg-CH₂~0-CH₂-CF₃ (HOOC-CH₂)₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-CH₂-CF₃

141202

Tabela 1 (nadaljevanje)

Primer Formula številka (HOOC-CH₂)₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-iBu

HOOC-CH₂-CH₂-DCha-Pro-D, LArg-CH₂~O-nBu

HOOC-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃

H-(3-trans-Ph)-D, LPro-D, LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃

H-(3-trans-Ch)-D,LPro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-S-nBu

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-SO2-nBu absolutna konfiguracija R ali S

4 1 202

Postopek Postopek priprave deprotekcije

D

E

A ali C A ali C Aali C

A

F

A ali D

F

D

E

A

E

A in F A in G

A in. H A c

b b

a a

a ¹4 1 2 02

Tabela 2 (nadaljevanje)

Primer Postopek številka priprave

Postopek deprotekcije

31	E	a
32	E in B	• b
33	A in B	b
34	I in A	b
35	I in A	b
36	D	a
37	D	a

4 1 2 92

Tabela 3

Primer Mol.masa FAB MS tetencija**	AAA: Peptid vsebnost (%)*	HPLC čas
številka (min)/sistem	(M + 1)
1	438.57	439	. 56/Pro	10.3 /E
2	452.60	453	65/Pro	9.9 /E
3	520.6	521	59/Pro	8.6 /A
4	588.6	589	60/Pro	10.7 /A
5	596.7	597	61/Pro	12.2 /A
6	578.64	579	72/Pro	14.8 /C
7	606.69	607.7	65/Pro	22.0 /B
8	678.65	679.8	76/Pro	18.2 /G
9	572.71	573.3	73/Pro	19.9 /B
10	602.74	603.8	76/Pro	13.4 /G
11	628.82	629.5	77/Pro	22.0 /G
12	586.74	587.2	75/Pro	16.0 /G
13	590.70	591.4	76/Pro	15.2 /G
14	590.70	591.4	63/Pro	15.0 /G
15	590.70	591.4	54/Pro	14.0 /G
16	640.71	641.5	68/Pro	19.0 /G
17	640.71	641.6	70/Pro	20.0 /G
18	640.71	641.4	65/Pro	18.4 /G
19	662.66	663	49/Pro	21.0 /G
20	524.67	525.4	79/Pro	15.5 /B
21	538.69	539	67/Pro	9.2,./F
22	552.72	553	69/Pro	19.3 /B
23	552.72	553.4	56/Pro	9.2 /F
24	564.61	565	67/Aze	13.6 /D
25	592.66	593	90/Pic	8.4 /D
26	566.75	567.4	86/Pic	17.0 /G
27	534.63	535.6 .	70/Pro	18.8 /B
28	598.69	599	71/Pro	11.2 /D

141222

Tabela 3 (nadaljevanje)

Primer Mol.masa FAB MS retencija** številka (M + 1) (min)/sistem

AAA: Pepetid vsebnost (%)*

HPLC čas

29	616.77	617	64/Pro	14.5 /C
30	636.67	637.6	70/Pro	12.0 /A
31	610.76	611.2	67/Pro	10.0 /F
32	566.75	567.5	65/Pro	19.7 /B
33	592.66	593	46/Pro	10.6 /F
34	540.59	541	56/Pro	14.3 /C
35	546.64	547	49/Pro	15.9 /C
36	568.78	569.4	45/Pro	17.4 /G
37	600.78	'601.3	62/Pro	14.6 /G

* Bazirano na aminokislinah, kot je naznačeno.

**Videti Splošne eksperimentalne postopke. Dati so časi za L-Arg epimere. D-epimeri (manjši del) običajno gredo približno 0,5 minut prej.

Sistem A: 20% povečano do 80% 1% TFA-MeCN v 1% TFA-H2O v teku 25 minut.

Sistem	B:	10-60%,	30	minut
Sistem	C:	10-90%,	30	minut
Sistem	D:	30-100%,	30	minut
Sistem	E:	10-90%,	20	minut
Sistem	F:	20-100%,	20	minut
Sistem	G:	20-70%,	30	minut

1412S2

Primer 38

Raztopino za kontinualno intravenozno dajanje smo pripravili iz sledečih sestavin:

Inhibitor trombina

Natrijev klorid za injekcije mg 4,5 mg

Voda za injekcije do 500 ml.

Aktivni konstituent in natrijev klorid smo raztopili v vodi potem raztopino filtrirali in nato sterilizirali v autoklavu ali pa s filtriranjem skozi sterilni filter 0,2 um, in z njo aseptično polnili sterilne flaše za infuzijo.

Primer 39

Raztopina za injekcije.

Raztopino pripravimo iz sledečih sestavin:

Inhibitor trombina 5 g

Natrijev klorid za injekcije 9 g

Voda za injekcije do 1000 ml

Učinkoviti konstituent in natrijev klorid raztopimo v vodi in potem raztopino filtriramo in nato steriliziramo v autoklavu ali s filtriranjem skozi 0,2 um sterilni filter in z njo aseptično polnimo sterilne ampule (5 ml).

Primer 40

Raztopina za nazalno dajanje.

Raztopino pripravimo iz sledečih sestavin:

Inhibitor trombina 10 g

Glicerol 200 g

Metil p-hidroksibenzoat 1 g

4 1 222

Propil p-hidroksibenzoat 0,2 g

Voda za injekcije do 1000 ml

Učinkoviti konstituent in prezervative smo raztopili v glicerolu in večjem delu vode. Nato smo volumen uravnali do 1000 ml in z raztopino polnili sterilne polietilenske kontejnere.

Primer 41

Tablete za oralno dajanje.

1000 tablet pripravimo iz sledečih sestavin:

Inhibitor trombina 100 g Laktoza 200 g Polivinil pirolidon 30 g Mikrokristalinična celuloza 30 g Magnezijev stearat 6 g

Učinkoviti konstituent in laktozo pomešamo z vodno raztopino polivinil pirolidona. Zmes posušimo in zmeljemo, da oblikujemo granule. Nato primešamo mikrokristalinično celulozo in magnezijev stearat. Zmes nato stisnemo v stroju za izdelavo tablet, da dobimo 1000 tablet, ki vsaka vsebuje 100 mg učinkovitega konstituenta.

Primer 42

Želatinske kapsule za oralno dajanje.

Želatinske kapsule napolnimo s zmesjo sledečih sestavin:

Inhibitor trombina	50	mg
Magnezijev stearat	3	mg
Laktoza	100	mg

141202

Biologija

Določanje časa strjevanja trombina in IC50TT:

Človeški trombin (T 6769, SIGMA Chem Co) v puferski raztopini, pH 7,4, 100 jul, in raztopino inhibitorja, 100 jul, inkubiramo eno minuto. Nato dodamo pool normalno citrirane človeške plazme, 100 jul, in merimo čas strjevanja krvi v avtomatskem aparatu (KC 10, Amelung).

IC50TT določimo z interpolacijo s krivulje odvisnosti časa strjevanja krvi od koncentracije inhibitorja.

IC50TT je koncentracija inhibitorja , ki podvoji trombinski čas strjevanja krvi za človeško plazmo. PIC50TT je -log 10 od IC50TT v mol/1. Rezultati so prikazani v tabeli 4.

PIC50TT

7.71

7.81

7.92

7.38

7.77

8.04

7.70

7.64

8.45

7.90

7.86

8.25

8.22

8.15

8.12

7.77

8.68

7.30

8.27

8.17

8.14

8.69

7.64

8.01

8.00

7.89

7.52

6.85

6.47

7.38

12 02

Tabela 4 (nadaljevanje)

Primer PIC50TT številka

31	6.88
32	7.63
33	7.78
34	7.03
35	7.25
36	7.57
37	7.72

	141222 40 KRATICE
4-DMAP =	4-dimetilaminopiridin
AAA =	aminokislinska analiza
Arg =	L-arginin
Arg(Z2) =	UN, N-dibenziloksikarbonil-L-arginin
Aze =	L-azetidin-2-karboksilna kislina
Boc =	terciarni butoksikarbonil
Bu =	butil
Bzl =	benzil
Ch =	cikloheksil
Cha =	L- -cikloheksilalanin
DMF =	dimetil formamid
Et =	etil
EtoAc =	etil acetat
FAB =	hitro bombardiranje atomov
FI do FXIII =	faktori koagulacije I do XIII
FII_a do FXIII_a =	= aktivirana oblika faktorjev koagulacije II do XII
Gly =	glicin
VMM-K =	kininogen visoke molske mase
HOAc =	ocetna kislina
HONSu =	N-hidroksisukcinimid
HPLC =	high performance tekočinska kromatogra f i ja
iBC =	izobutil kloroformiat
Kal =	kalikrein
Me =	metil
MPLC =	tekočinska kromatografija na srednjem pritisku
NMM =	N-metil morfolin
Nph = Ph =	naftil fenil

12 02

Pic =

PL =

Pr =

Prekal = Pro =

STP =

Tee =

TFA =

THF =

Val = VTKDI =

Z =

L-pipekolinska kislina fosfolipidi propil prekalikrein

L-prolin standardni temperatura in tlak

2,2,2-trikloroetil trifluoroocetna kislina tetrahidrofuran

L-valin karbodiimid topen v vodi benzoil karbonil

Prefiksi n, terciarni.

i in t imajo običajen pomen: normalni, izo in

Claims

1. Spojina splošne formule

O N'd,L kjer je:

A -CH2-, -CH=CH-, -CH2-CH2- ali -CH2-CH2-CH2R¹ in r2 sta ista ali različna in vsak je H ali Χ-Β-, kjer je B nerazvejena ali razvejena alkilenska skupina, ki ima 1-3 ogljikova atoma, X je pa H, metilna, etilna, cikloalkilna skupina, ki ima 3-6 ogljikovih atomov ali R'CO-, kjer je R' OH, nerazvejena ali razvejena alkoksilna skupina, ki ima 1-4 ogljikova atoma, NH2 ali NHR'', kjer je R'' nerazvejena ali razvejena alkilna skupina, ki ima 1-4 ogljikova atoma, ali pa je X mimetik karboksilne kisline, znan per se, izbran med -PO(OR''')2/ -SO3H in

141292

5-(lH)-tetrazolilom, in R''' je H, metil ali etil, ali pa je B -SO2- in X je metil ali etil;

m je O, 1 ali 2, R3 je cikloheksilna skupina in R^3A j_e H; ali m je 1 in R³ cikloheksilna ali fenilna skupina in R^3Agradi etilenski most skupaj z Rl;

Y je O ali S(O)p, kjer je p 0, 1 ali 2;

R⁴ je H; nerazvejen ali razvejen alkil ali cikloalkil, ki ima 1 do 6 ogljikovih atomov nesubstituiranih ali pa substituiranih z enim ali več atomi fluora in/ali substituiranih s fenilno skupino; substituiran ali nesubstituiran aromatski obroč izbran med fenilom, 4-metoksi-fenilom, 4-terc-butil-fenilom, 4-metil-fenilom, 2-, 3- ali 4trifluoro-metil-fenilom, fenilom substituiranem z 1-5 atomi fluora; ali -CH(CF3)-fenil, ali kot tak ali v obliki fiziološko sprejemljive soli in vključno s stereoizomeri.

2. Spojina v skladu s zahtevkom 1, označena s tem, da je

A -CH2-CH2- ali -CH2-CH2-CH2-;

R¹ je H in R² HOCO(CH2)_n- ali CH3CH2OCO(CH2)_n~ , n je pa 1 ali 2;

Y je 0 m je 1, R³ je cikloheksilna skupina in R^3A je H.

3. Spojina v skladu s zahtevkom 1, označena s tem, da je

U 1 2 02 izbrana med

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-OH,

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-Me, H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃, H-DCha-Pro-Arg-CH₂~0-CH(CF₃)₂, H-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-(R or S)CH(Ph)-CF₃, H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃, Et-00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃, H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF2-CF2-CF₃HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-Ph,

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-Ph(4-OMe), H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(4-tBu), H00C-CH₂.-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(4-Me) , H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(4-F), HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-Ph(3-F), H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(2-F), H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(3-CF₃), HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-Ph(4-CF₃), H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(2-CF₃), HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-C6F5, HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-Et,

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-nPr,

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-nBu, H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-iBu,

HOOC^CH₂-DCha-Aze-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃, HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃, HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-nBu, Me-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃,

Me-S02-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃,

Ch-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃, (HOOC-CH₂)₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃, , (HOOC-CH₂)₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-iBu,

HOOC-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-nBu,

HOOC-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃,

H-(3-trans-Ph)-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃,

H-(3-trans-Ch)-Pro-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃, HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-S-nBu and HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-SO2-nBu,

14 12 ali kot taka, ali v obliki fiziološko sprejemljive soli in vključujoč stereoizomere.

4. Spojina v skladu s zahtevkom 1, označena s tem, da je izbrana med

HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-0-CH2-CF3

HOOC-CH2-DCha-Pic-Arg-CH2-O-CH2-CF3

HOOC-CH2-DCha-Pic-Arg-CH2-O-nBu

HOOC-CH2“CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-0-nBu

HOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-0-CH2-CF3

H00C-CH2-DCha-Pro-Arg-CH2-0-nBu ali kot taka, ali v obliki fiziološko sprejemljive soli, vključujoč stereoizomere.

5. Spojina po enem od zahtevkov 1-4, označena s tem, da se uporabi za pripravo sredstva, koristnega v terapiji.

6. Postopek za pripravo spojine v skladu s katerimkoli zahtevkom 1-4, označen s tem, da obsega (metoda I) zamenjavo halogena iz halometilketona formule (W²)HN^NH

Nf/V²)

Haiide

141232 z r4y- (Y=O,S), pri tem je Vfl amino terminalna zaščitna skupina in w2 zaščitna skupina, redukcijo ketona do alkohola, odstranitev amino terminalne zaščitne skupine, standardno združevanje peptida, ki mu sledi oksidacija alkohola, kar daje zaščiteni tripeptid keton, odstranitev amino terminalne zaščitne skupine, ki ji sledi N-alkiliranje in deprotekcijo ali zamenjavo zaščitenega dipeptida v reakciji združitve, katero smo prej navedli, z nekim amino-terminal-N-alkiliranim-N-trifluoroacil-zaščitenim dipeptidom, ki mu sledi oksidacija in deprotekcija, ali (metoda II) alkiliranje, z nekim R^- halidom, dj -ketola formule kjer so in w2 kot je prej definirano in potem dalje reagiranje kot v metodi I, ali (metoda III) z reakcijo spojine formule

141222 kjer so ^w2 kot je prej definirano, s (T-CH2CO)2, kjer je T halogen, R^O ali R^S in 4-DMAP, in nato nadaljno reagiranje kot v metodi I in, če je želeno, formiranje fiziološki sprejemljive soli in, v tistih slučajih kjer je rezultat reakcije zmes stereoizomerov, se oni po izbiri ločujejo s standardnimi kromatografskimi tehnikami ali pa tehnikami rekristalizacije in se izolira, če je želeno, en sam stereoizomer.

7. Farmacevtski pripravek, označen s tem, da vsebuje učinkovito količino katere koli spojin navedenih v zahtevkih 1-4, in da nadalje obsega enega ali več farmacevtskih nosilcev.

8. Uporaba spojine v skladu s katerim koli od zahtevkov 1-4, označena s tem, da se ta spojina uporablja kot učinkovita sestavina za izdelavo farmacevtskega pripravka za inhibicijo trombina v človeškem ali živalskem organiz48 mu.

9. Uporaba spojine po enem od zahtevkov 1-4, za sredstva proti strjevanju krvi.

10. Spojina, postopek, farmacevtski pripravek in označeni s tem, da je za njih zahtevano varstvo v koli od zahtevkov 1-9 in v obsegu kot je opisano.