CZ38094A3

CZ38094A3 - Novel isosteric peptides

Info

Publication number: CZ38094A3
Application number: CS94380A
Authority: CZ
Inventors: Butrus Atrash; David Michael Jones; Michael Szelke
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1991-08-28
Filing date: 1992-08-25
Publication date: 1994-08-17
Also published as: BG98583A; EP0605462A1; MX9204767A; HU9400589D0; JPH06510059A; CN1069736A; AU2499092A; SI9200193A; MA22632A1; TNSN92076A1; AP313A; TW221816B; ATE212643T1; DZ1613A1; FI940945A; AP9200418A0; IL102840A0; CA2116527A1; WO1993005069A1; EP0605462B1

Description

Tento vynález se týká nových kompetitivních inhibitorů thrombinu, způsobu jejich syntézy, farmaceutických prostředků obsahujících tyto sloučeniny jako účinné látky a použití sloučenin jako antikoagulantů pro profylaxi a ošetřování tromboebolických omenocnění, jako je trombóza žil, plicní embolie, arteriální trombóza, zvláště infarkt myokardu a mozková trombóza, obecné hyperkoagulovatelné stavy a místní hyperkoagulovatelné stavy, například po angioplastických operacích a koronárních operacích přemostěním.

Dosavadní stav techniky

Koagulace krve je klíčovým procesem zahrnujícím jak hemostázu (to znamená prevenci ztráty krve z poškozené cévy), tak trombózu (to znamená patologické uzavření krevní cévy krevní sraženinou). Koagulace je výsledkem komplexní řady enzymatických reakcí naznačených ve schématu 1 dále, kde různé faktory srážení jsou označeny římskými čísly.

Thrombin hraje středovou úlohu při koagulaci, pokud se proces iniciuje vnitřní nebo vnější cestou: tato látka aktivuje krevní destičky, převádí fibrinogen na monomerní fibrin, který spontánně polymeruje na vlákna a aktivuje koagulační faktor XIII, který naopak zesítuje polymer na nerozpustný fibrin. Thrombin dále aktivuje koagulační faktory V a VIII v reakci s pozitivní zpětnou vazbou.

Proto se očekává, že inhibitory thrombinu budou účinnými antikoagulanty.

VNITŘNÍ

SYSTÉM

Schéma 1

Ftl

První inhibitory thrombinu založené na elektrofilních ketonech byly vyvinuty jak popsal M. Szelke a D. M. Jones v EP-Al-0 118 280 AI, s britským datem priority 4. března 1983. Tyto dřívější sloučeniny jsou odvozeny od P₃ - P₂' pentapeptidové sekvence fibrinogenového Aa. řetězce, ve kterém lehce štépitelná Ρ_χ - Ρ_χ’ peptidová vazba je nahrazena zbytkem -CO-CH₂-, který tvoří keto isoster k odpovídajícím peptidům.

Jiné známé příklady serin proteinázových inhibitorů, založených na elektrofilních ketonech, jsou uvedeny v těchto pracech:

a) M. Kolb a kol. (Merrel-Dow), EP-A2-0 195 212 (datum priority 4, února 1986), popisující peptickě α-ketoestery a a-ketoamidy,

b) B. Imperiali a R. H. Ábeles, Biochemistry 25, 3760 /1986/ (peptidylfluoralkylketony),

c) Ueda a kol., Biochem. J. 265, 539 /1990/ (peptidylfluoralkylketony) ,

d) D. Schirlin a kol. (Merrel-Dow) EP-A1-0 362 002 (datum priority 1. září 1988), popisující fluoralkylamidketony,

e) P. Bey a kol. (Merrel-Dow), EP-A2-0 364 344 (datum priority 7. října 1988), popisující α,β,δ-triketosloučeniny a

f) Ε. N. Shaw a kol. (Research Corporation), US 4 318 904 (datum priority 25. dubna 1980), popisující peptidchlormethylketony, například H-DPhe-Pro-Arg-CH₂Cl.

Inhibitory thrombinu založené na peptidaldehydech uvádí S. Bajusz a kol. v J. Med. Chem. 33 , 1729 /1990/ a Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar R T v EP-A2-0 185 390 (datum priority 21. prosince 1984). Thrombinové inhibitory jako peptidy zahrnující C-terminální deriváty kyseliny orthoborité odvozené od argininových a isothiouroniových analogů popisuje A. D. Kettner a kol. (Du.Pont), EP A2-0 293 881 (data priority 5. června 1987 a 6. dubna 1988).

Příklady thrombinového inhibitoru na bázi argininových derivátů nebo analogů, které neobsahují elektrofilní ketony, zmiňuje například:

a) S. Okamoto a kol. (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) v EP Al-0 008 746 (datum priority 31. srpna 1978), kde se popisují arylsulfonylargininamidy, například argatroban, a

b) J. Sturzbecher a kol., Pharmazie 36, 639 /1981/ (arylsulfonyl-p-amidinofenylalaninamidy).

Předmět tohoto vynálezu se týká nových a účinných trombinových inhibitorů s kompetitivnín inhibitorovým účinkem proti svému emzymu, to znamená, že je způsobena reversibilni inhibice. Dalším znakem je získání inhibitorů, které jsou orálně biologicky dostupné a selektivní při inhibici thrombinu více než jiné serinové proteázy. Stabilita, trváni účinku a nízká toxicita při terapeutických dávkách jsou ještě další znaky tohoto vynálezu.

Podstata vynálezu

Sloučeniny

Bylo nalezeno, že sloučeniny obecného vzorce 1,. bud' jako takové nebo ve formě fyziologicky přijatelných solí a včetně stereomerú, jsou účinnými inhibitory thrombinu.

V obecném vzorci 1 a také v případě výskytu v dalším textu, pokud dále nebude uvedeno jinak, platí následující významy:

A představuje skupinu vzorce -CH₂-, -CH=CH-, -Cř^-C^nebo -CH2-CH2-CH2-,

12·«

R a R“ jsou stejné nebo rozdílné a každý z nich představuje atom vodíku nebo skupinu vzorce X-B-, kde B znamená přímou nebo rozvětvenou alkylenovou skupinu obsahující 1 až 3 atomy uhlíku a X znamená atom vodíku, methyl, ethyl, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 atomů uhlíku nebo skupinu vzorce R'CO-, kde R’ znamená hydroxyskupinu, přímou nebo rozvětvenou alkoxyskupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupinu nebo skupinu vzorce NHR, kde R znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou .skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo

X znamená zbytek karboxylové kyseliny známý jako takový, zvolený z -PO(OR·^, -SO^H nebo 5-(1H)-tetrazolyl a

R' znamená atom vodíku, methyl nebo ethyl nebo

B představuje skupinu vzorce -S0₂- a X znamená methyl nebo ethyl, ro představuje číslo 0, 1 nebo 2,

R³ znamená cyklohexylovou skupinu a r3A představuje atom vodíku nebo ro představuje číslo 1,

R³ znamená cyklohexylovou nebo fenylovou skupinu a

R^3A tvoří ethylenový můstek dohromady s R¹,

Y znamená atom kyslíku nebo skupinu vzorce S(O)p, kde p představuje číslo 0, 1 nebo 2 a

R₄ znamená atom vodíku, přímou nebo rozvětvenou alkylovou nebo cykloalkylovou skupinu obsahující od 1 do 6 atomů uhlíku, nesubstituovanou nebo substituovanou jedním nebo větším počtem atomů fluoru a/nebo substituovanou fenylovou skupinou, substituovaný nebo nesubstituovaný aromatický kruh zvolený z fenylu, 4-methoxyfenylu, 4-terc.-butylfenylu, 4-methylfenylu, 2-, 3- nebo 4-trifluormethylfenylu a fenylu substituovaného 1 až 5 atomy uhlíku, nebo znamená -CH(CF₃)-fenyl.

Sloučeniny obecného vzorce 1 se vztahuji k peptidové sekvenci lidského fibrinogenového Aa řetězce, představujícího modifikované podpolohy P₃ - :

H-Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly1 5 10

P₃ P₂ Pi ί Ρχ' P₂' P₃*

-Gly-Val-Arg - Gly-Pro-Arg-Val14 15 16 17 20

Tato sekvence souhlasí se SEQ ID čís. 1 v souhrnu sekvencí.

Podle výhodného provedení se tento vynález týká sloučenin obecného vzorce l, ve kterém

A znamená skupinu vzorce -CíÍ2~^c^2~ ^ne^° ,

R¹ značí představuje atom vodíku,

R² představuje skupinu vzorce HOCO(CH₂)_n- nebo ch₃ch₂oco(ch₂)_n-, n je 1 nebo 2,

Y znamená atom kyslíku, m značí číslo 1,

R představuje cyklohexylovou skupinu a

R^3A představuje atom vodíku.

Zvláště výhodná provedení vynálezu představují sloučeniny vzorců:

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃, HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃, HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-nBu,

H00C-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu, H00C-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃ a

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu.

Lékařské a farmaceutické použití

Podle dalšího ztělesnění se tento vynález týká ošetřování lidského nebo zvířecího organizmu při stavech, které vyžadují inhibici thrombinu. Předpokládá se, že sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou vhodné zvláště u živočichů včetně člověka pro ošetřování nebo profylaxi trombózy a hyperkoagulovatelnosti v krvi a tkáních. Chrobné stavy, u kterých sloučeniny mají potenciální použitelnost při ošetřování a/nebo profylaxi, zahrnuji trombózu žil, plicní embolií, arteriální trombózu, jako při infarktu myokardu, nestabilní angíně, mrtvici na základě trombózy a periferní arteriální trombóze. Dále se očekává použití v profylaxi arterosklerotických omenocněni, jako jsou koronární arteriální choroby, cerebrální arteriální choroby a periferní arteriální choroby. Dále se u sloučenin očekává, že jsou použitelné dohromady s trombolytiky při infarktu myokadru. Kromě toho se u sloučenin předpokládá, že jsou použitelné při profylaxi pro reokluzi po trombolýze, perkutánní transluminální angioplastice (PTCA) a koronárních operačních přemostěních. Dále se u sloučenin očekává jejich použitelnost při prevenci retrombózy po drobných chirurgických zákrocích. Ještě dále se předpokládá, že sloučeniny jsou vhodné při antikoagulačním ošetřování v souvislosti s umělými náhradami orgánů a srdečních chlopní. U sloučenin se dále očekává, že jsou použitelné při antikoagulačním ošetřování při hemodialýze a při roztoroušené intravaskulární koagulaci. Denní dávka účinné látky bude obvykle v rozmezí od 0,1 do 10 g. Intravenózní roztoky výhodně obsahují od 0,1 do 100 mg/ml účinné látky, zatímco dávkové jednotky s výhodou obsahují od 1 do 1000 mg účinné látky a výhodně se podávají jednou až čtyřikrát denně.

Další očekávané použití je při proplachování cévek a mechanických zařízení používaných u pacientů in vivo, a jako antikoagulačniho prostředku pro ochranu krve, plasmy a jiných krevních produktů in vitro.

Způsob výroby sloučenin

Dalším předmětem tohoto vynálezu je způsob výroby sloučenin podle vynálezu. Tak se vynález dále týká způsobu výroby sloučenin obecného vzorce 1, přičemž tento způsob spočívá v tom, že (způsob I) atom halogenu se nahradí skupinou R^Y (kde Y představuje atom kyslíku nebo síry) v halogenmethylketonu

ve kterém

W¹ znamená koncovou chránící skupinu aminoskupiny, jako je terč.-butoxykarbonyl a

W² znamená chránící skupinu, jako je benzyloxykarbonyl, (jak je ilustrováno na způsobech A, D a F) , keton se redukuj na alkohol, odstraní se koncová chránící skupina aminoskupiny, provede obvyklá peptidová kopulace, poté se alkohol oxiduje a dostane se chráněný tripeptidketon, odstraní se koncová chránící skupina aminoskupiny, poté se provede N-alkylace (jak je ilustrování způsoby A, B, G a H) a odstra ní chránící skupiny nebo se náhradí chráněný dipeptid při kopulační reakci uvedené výše a ilustrované (například způsobem A iii)) amino-koncovým N-alkylováným N-trifluoracylem chráněným dipeptidem (způsob K) , poté se·, provede oxidace a odstranění chránící skupiny, nebo (způsob II) provede se alkylace R⁴-halogenidem a-ketolu obecného vzorce

ve kterém

W¹ a W² mají významy uvedené výše, (jak je ilustrováno ve způsobu E)) a potom se provedou další reakce jako u způsobu I, nebo (způsob III) za použití modifikované Dakin-Westovy reakce (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 8, 981 /1969/), která se aplikuje na tripetidy (J. Org. Chem. 50, 1112 /1985/), se nechá reagovat sloučenina (nebo při jiném provedení se přímo použije amino-koncový N-alkylováný N-trifluoracylem chráněný dipeptid) obecného vzorce

ve kterém

Ί 9 ..,

W^x a W mají významy uvedene výše, se sloučeninou obecného vzorce (T-CH₂CO)₂O, ve kterém

T představuje atom halogenu, skupinu vzorce R⁴0 nebo ,R⁴S, a 4-dimethylaminopyridinem a potom se nechá reagovat jak je popsáno u způsobu I.

V těch případech, kdy reakce má za výsledek směs stereomerů, tyto stereomery se popřípadě dělí obvyklými chromatograf ickými nebo rekrystalizačními technickými postupy, a pokud je to žádoucí, izoluje se jediný stereomer.

Nyní se uvádí podrobný popis vynálezu.

Další popis je ilustrací znaků vynálezu.

Způsob syntézy a farmacie

Chemické postupy používané pro výrobu inhibitorů v tomto patentu nárokovaných je naznačena na schématech syntézy (způsoby A až H) a v postupech I a K. Potřebné alkoxymethylketony nebo fenoxymethylketony argininu se hlavně vyrábějí

I) náhradou atomu bromu v brommethylketonech skupinou vzorce R⁴0~, bud' za použití sloučeniny vzorce NaOR⁴ (způsob A) nebo za použití fluoridu draselného (způsoby D a F) nebo

Ix) alkylací argininu α-ketolem za použití oxidu stříbrného a sloučeniny vzorce R⁴I (viz způsob E).

Obvyklé peptidové kopulační reakce se používají pro zavedení DCha, Pro a jejich analogů. Karboxyalkylová skupina na koncovém atomu dusíku se zavádí bud alkylací za použití bromacetátů, Michaelovou adicí na terciární butylakrylát (způsoby A a B) nebo za použití preinkorporace karboxyalkylu do dipeptidové části (viz způsob K). Všechny chránící skupiny se potom odstraní (viz způsoby odstraňováni chránící skupiny a) až c) uvedené dále).

Všeobecné experimentální způsoby

Obvyklé zpracování se vztahuje k extrakcím provedeným ethylacetátem, běžnému promývání 0,3-molárním roztokem hydrogensíranu sodného, 1-molárním roztokem kydrogenuhličitanu draselného, vodou a roztokem chloridu sodného, poté filtraci přes filtrační papír Whatman Phase Separatory Paper a vysušení azeotropickou destilací s toluenem. Chromatografie na tenké vrstvě se provádí na obchodně dostupných povlečených skleněných destičkách Merck Silicagel 60F254. Vizualizace se dosahuje kombinací ultrafialového záření, zahřátí s následujícím postřikem fluoreskaminem nebo zahřátím s následující chlorací (zásobník chloru) a postříkáním 1% škrobovým roztokem jodidu draselného. Velmi rychlá chromatografie se provádí na silikagelu (Merck Silicagel 60; 40 až 63 μπι) za tlaku dusíku. Analýza aminokyselin se provádí za použití systému Beckman Gold. Peptidy se hydrolýzují (6-normální kyselinou chlorovodíkovou a fenolem za teploty 110 °C po dobu 22 hodin), poté injekčně zavedou a kvantitativně se stanoví prolinový pík. Středotlaká kapalinová chromatografie se provádí ve skleněné koloně (Anachem) naplněné oxidem křemičitým (Vydac C18; 15 až 25 μπι), za použití gradientu od 1% kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu do 1% kyseliny trifluoroctová ve vodě, s kontrolou při vlnové délce 226 nm. Frakce se analyzují vysokotlakou kapalinovou chromatografií a čisté frakce se spoji a lyofilizují. Vysokotlaká kapalinová chromatografie se provádí za použití chromatografického zařízení Spectra-Physics 8700 Series. Rozpoustědlový systém, jako pro středotlakou kapalinovou chromatografií, se podrobuje detekci při vlnové délce 210 nm a průtoku 1,5 ml/min na koloně naplněné Novapak C18 (4 μπι, patrona 8 x 100 mm, Waters). Veškeré meziprodukty jsou charakterizovány NMR (zařízení Hitachi-Perkin Elmer R 24 60 MHz nebo Jeol 270 MHz). Všechny konečné peptidy jsou charakterizovány svými FAB hmotnostními spektry (na zařízení M-Scan Ascot, Berks., Velká Británie).

Způsob výroby výchozích sloučenin

Boc-Arg(Z 2)^_CH2^Br

i) 10 mmol Boc-Arg(Z₂)-OH v 50 ml suchého tetrahydrofuranu a 10 mmol N-methylmorf olinu se ochladí na teplotu -10 ’C a přikape se 10 mmol isobutyl-chloroformiátu při udržování teploty -10 'C po dobu 45 minut. Po dalších 10 minutách se za teploty -10 °C směsný anhydridu vylije na směs 25 mmol CH₂N₂ ve 150 ml etheru. Po 3 hodinách se přebytek CH₂N₂ rozloží kyselinou octovou a roztok se třikrát promyje vodou a poté roztokem chloridu sodného. Vysušením a odpařením se dostane diazoketon ve formě žlutého oleje. IČ spektrum 2100 cm“¹ (COCHN₂).

ii) 10 mmol diazoketonu ve 200 ml suchého ethylacetátu se ochladí na teplotu -15 *C a poté přikape přibližně 11 ml l~molární kyseliny bromovodíkové v ethylacetátu. Když žlutá barvě zmizí, chromatografie na tenké vrstvě (směs ethylacetátu a hexanu) ukáže na úplnou konverzi diazoketonu na brommethylketon. Roztok se rychle přenese do dělicí nálevky a prómyje 1-molárním roztokem hydrogenuhličitanu sodného, roztokem chloridu sodného, vysuší a odpaří, čímž poskytne tuhou látku. Rozpuštěním v horkém ethanolu a ochlazením se dostane brommethylketon, který tvoří amorfní bílý prášek.

NMR spektrum (CDC1₃): S 1,3 (5, 9H), 1,5 až 1,85 (m, 4H), 3,75 až 3,95 (m + s, 4H), 4,3 (m, 1H), 5,05 (s, 2H),

5,15 (s, 2H), 5,65 (d, 2H), 7,30 (m, 10H), 9,2 (široký singlet, 1H) , 9,3 (široký singlet, 1H) ppm. Teplota tání: měknutí při 50 °C, potom pomalý rozklad při teplotě >70 C.

Boc-DCha-X-ONSu (X = Pro, Pie nebo Aze)

i) 10 mmol Boc-DCha-OH v 50 ml směsi methylenchloridu a dimethylformamidu v poměru 1:5 se zpracuje s 11 mmol N-hydroxysukcinimidu, ochladí na 0 ’C a přidá 13 mmol karbodiimidu rozpustného ve vodě. Po 30 minutách se reakční směs ohřeje na teplotu místnosti. Po dalších 3 hodinách chromatografie na tenké vrstvě ukáže na kvantitativní vznik Boc-DCha—ONSu. K reakční směsi se přidá 200 ml diethyletheru a vše se prómyje třikrát vodou, roztokem chloridu sodného a vysuší. Získá se ester ve formě bezbarvé pěny.

ii) 10 mmol N-hydroxysukcinimidoesteru v 50 ml methylenchloridu se zpracuje s 11 mmol H-Pró-OBzl.HCI,

H-Pic-OBzl.HCI nebo H-Aze-OBzl a 20 mmol diisopropylethylaminu. Vše se míchá po dobu 3 hodin a poté zpracuje obvyklým způsobem s ethylacetátem a 0,3-molárním hydrogensíranem draselným. Dostane se dipeptidester, který je dostatečně čistý k použití v následujícím stupni.

iii) Boc-DCha-X-OBzl v tetrahydrofuranu se hydrogenuje na 5% palladiu na uhlí při teplotě místnosti a tlaku okolí po dobu 4 hodin. Filtrací a odpařením se dostane kyselina, jako tuhá látka nebo pěna. Rekrystalizací z diisopropyletheru nebo směsi diethyletheru a hexanu se dostanou čisté sloučeniny.

Boc-DCha-Pro-OH (tuhá látka, teplota tání 163 až 166 °C): NMR spektrum (CDClg) δ 0,8 až 2,05 (m + s při 1,4, 26H), 3,4 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 4,5 (m, 2H), 5,2 (m, 1H) ppm.

Boc-DCha-Pic-OH (tuhá látka, teplota tání 121 až 122 ’C): NMR spektrum (CDC1₃): δ 0,8 až 2,05 (m + s při 1,45, 28H), 3,35 (m, 1H), 3,95 (m, 1H), 4,6 až 4,9 (m, 1H) , 5,4 (m, 1H), 5,6 (m, 1H), 8,8 (široký singlet, 1H) ppm.

Boc-(Me)DCha-Pro-ONSu

Boc-(Me)DPhe-OH se hydrogenuje na 5% rhodiu na uhlí v 90% vodné kyselině octové za tlaku 410 kPa po dobu 3 dnů.

V kvantitativním výtěžku se dostane Boc-(Me )DCha-OH. 10 mmol Boc-(Me)DCha-OH a 10 mmol N-methylmorfolinu v 50 ml methylenchloridu se ochladí na teplotu -15 °C a přidá se 10 mmol Ph₂PO-Cl. Po 20 minutách se přidá 11 mmol H-Pro-OBzl.HCI a 20 mmol N-methylmorfolinu. Po jedné hodině se reakční směs nechá ohřát na teplotu místnosti a po dvouhodinovém stání se reakční směs zpracuje obvyklým způsobem. Velmi rychlou chromatografii (při eluování směsí 40% ethylacetátu v hexanu) se dostane Boc-(Me)DCha-Pro-Obzl jako bezbarvý olej (80 % teorie).

NMR spektrum (CDC1₃): δ 0,5 až 2,2 (m + s při 1,4, 26H), 2,65 (s, 3H), 3,5 (m, 2H), 4,3 až 5,0 (m, 2H), 5,1 (s, 2H) , 7,30 (s, 5H) ppm.

Tato sloučenina se převede na N-hydroxysukcinimidoester jako je popsáno pro Boc-DCha-X-ONSu dále.

Schéma syntézy

Způsob A (i)

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br 'OR⁴ -► Boc-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

-20 ’C například R⁴ = CH₂CF₃ , CH(Ph)CF₃, Aryl

Boc-DCha-X

R* (Ni)

1) HCI-dioxan (ii)

NaBH₄

MeOH, O °C

H OH

OR⁴ --- Boc-N^^V^OR⁴

2) Boc-DCha-X-ONSu nebo q_H |Boc-(Me)DCha-X-ONSu] (iv)

Dess-Martinův perjodistan

1) HCI-dioxan

2) RO₂CCH₂Br

Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴ .·. ' nebo iPr₂NEt,MeCN, δ

IBoc-(Me)DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴] _nebo vynecháno nebo způsob G

X · Pro, Pie, Aze nebo způsob H

R*- (CH₂)₃-NZ-C(NH)-NHZ

Y-DCha-X-Arg(Z₂)-CH_;C~'

Y-H, ROzCCHz (RO₂CCH₂)₂ (R-Bzl,tBu nebo Et:

Způsob B

1) HCI-dioxan ·

2) EtOAc/

M KHCOa

Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴ -—tBuO₂CCH₂CH₂-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR' tBu-akrylát _Δ

ΜβΟΗ,Δ například R =nBu,CH₂F₃

Způsob C

Boc-Arg(Z₂)-CHN₂ + HOR⁴ Boc-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

Potom se pokračuje jako u způsobu A například R⁴ = CH₂CF₃, CH(Ph)CF₃, CH(CF₃)₂

Způsob D

CI₃CCH_rOH

CH₂CH

Boc-Arg(Z₂)-OH -·»- Boc-Arg(Z₂)-OTce

WSCDí

4-DMAP (Π)

1) HCI-dioxan

2) Boc-DCha-X-CNSu

3) Zn-HOAc (iii)

1) NMM.iBC.THF

2) CH₂N₂-ethe'r

Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-OH -^:► Boc-DCha-X-Arg(Z₂ůCH₂= ·

3) NBr-EtOCa, -10 ^CC (iv)

DMF rVí

-Boc-DChá-X-Arg(Z₂)-CH₂YR⁴

KF, teplota místnosti, 24 h ^se pokračuje jako u způsobu A

Y-O.S

R⁴· nBu,Aryl pro příklad 1: R⁴YH = H0₂CC0Ph

Způsob Ε

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br + HC^CCOPh (ϋ)

THF

IMKHCO3

-*- Boc-Arg(Z₂)-CH₂OH

24h _Boc-Arg(Z₂)-CH₂0₂CCOPh

DMF

3h (ϋί)

AgzO

CH₂CI₂

-- Boc-Arg(Z₂)-CH₂OR

R*l například

R⁴ '= Me, Et, nPr, nBu Potom se pokračuje jako u způsobu A

Způsob F

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br ♦ F^CH například r⁴ = ch₂cf₃, ch₂(cf₂)₂cf₃,

Ph(4-0Me) —-►· Boc-Arg(Z₂)-CH₂0R⁴

DMF^4h

Potom se pokračuje jako u způsobu A

Způsob G

Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

1) HCl-dioxan

-> Me-SO₂-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

2) MeSO₂Cl například R⁴ = CH₂CF₃

Způsob H

Boc-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

1) HCl-dioxan

-> ChCH₂-DCha-X-Arg(Z₂)-CH₂OR⁴

2) ChCHO/NaCNBH₃ například R⁴ = ch₂cf₃

Způsob výroby konečných sloučenin

Dále uvedené způsoby výroby ilustrují svrchu popsané způsoby I až III stejně jako následující stupně až do získání konečných sloučenin.

Způsob A mmol Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br se přidá jako tuhá látka k předem připravenému roztoku alkoxidu nebo fenoxidu (10 mmol alkoholu nebo fenolu a 10 mmol 80% natriumhydridu v oleji) ve 40 ml dimethylformamidu za teploty -20 °C pod dusíkovou atmosférou. O 2 hodiny později se k reakční směsi přidá 0,3-molární roztok hydrogensíranu draselného k netralizaci popřípadě zbývající části alkoxidu a poté se dimethylformamid odpaří za sníženého tlaku. Surová látka se rozdělí mezi ethylacetát a vodu, ethylacetátová vrstva se promyje roztokem chloridu sodného, vysuší a odpaří. Velmi rychlou chromatografií nebo krystalizací se dosáhne čistých alkoxyketonů.

Boc-Arg(Z₂)-CH₂0Ph (tuhá látka): NMR spektrum (CDC1₃): δ 1,41 (s, 10H), 1,64 až 1,68 (m, 3H), 3,92 (dd, 2H), 4,5 (m, ÍH), 4,62 (q, 2H) , 5,1 (s, 2H), 5,2 (S, 2H), 5,5 (d, 1Ή) ,

6,8 (d, 2H), 6,95 (t, ÍH), 7,2 až 7, 45 (m, 12H), 9,2 (široký singlet, ÍH) , 9,3 (široký singlet, 1H) ppm. Teplota táni:

115 až 118 °C.

Boc-Arg( Z₂ )-CH₂OCH₂CF₃ (tuhá látka): NMR spektrum (CDCl-j): δ 1,35 (s, 10H), 1,55 až 1,75 (m, 3H), 3,7 (q, 2H), 3,85 (m, 2H), 4,2 (q + m, 3H), 5,05 (s, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,7 (d, ÍH), 7,15 až 7,35 (m, 10H), 9,15 (široký singlet, ÍH), 9,3 (široký singlet, ÍH). Teplota tání: 87 až 90 °C.

ii) Alkoxymethylketon nebo fenoxymethylketon ve směsi methanolu a tetrahydrofuranu v poměru 1:1 se za teploty 0 °C zpracuje s 1 ekvivalentem natriumborhydridu. Po 10 minutách se k reakční směsi přidává 0,3-molární roztok hydrogensíranu draselného až do hodnoty pH 7 a směs se odpaří k odstranění methanolu a tetrahydrofuranu. K odparku se přidá ethylacetát a po obvyklém zpracováni (s ethylacetátem a 0,3-molárním roztokem hydrogensíranu draselného) se izoluje alkohol jako směs diastereomerů.

iii) Alkohol se zpracuje s 4-molární kyselinou chlorovodíkovou v dioxanu během 15 minut za teploty místnosti a rozpouštědlo se odpaří. 1 mmol odparku se rozpustí v 5 ml methylenchloridu a zpracuje s 1 ekvivalentem Boc-DCha-X-ONSu a diisopropylethylaminem (do hodnoty pH 9 podle vlhkého indikátorového papírku). Po 3 hodinách stání se obvyklým zpracováním dostane modifikovaný tripeptid, který se čistí velmi rychlou chromatografií (při eluováni směsí ethylacetátu a hexanu, která obsahuje 1 % kyseliny octové). Výtěžek odpovídá 50 až 85 % teorie.

iv) Tripeptidalkohol v methylenchloridu se zpracuje se 3 ekvivalenty Dess-Martinova perjodátu (D. B. Dess a J. C. Martin, J. Org. Chem £8, 4155-4156 /1983/). Reakční směs se nechá stát za teploty místnosti po dobu 2 hodin a po obvyklém zpracování (s ethanolem, 1-molárním roztokem hydrogenuhličitanu draselného a thiosiřičitanem sodným) se dostanou surové tripeptidketony, které se čistí velmi rychlou chromatografií (při eluováni směsí ethylacetátu a hexanu).

v) Keton se zpracuje se 4-molérní dioxanovým roztokem chlorovodíku během 15 minut za teploty místnosti a odpaří.

mmol odparku v 5 ml acetonitrilu se zpracuje s 1,2 ekvivalentu benzylbromacetétu nebo terč.-butylbromacetátu a 3 ekvivatenry diisopropylethylaminu. Vše se vaří pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin, roztok se odpaří a podrobí velmi rychlé chromatografií (eluování směsi ethylacetátu a hexanu). Dostanou se benzyloxykarbonylmethylpeptidy nebo terč.-butoxykarbonylmethylpeptidy ve formě oleje. Výtěžek odpovídá 40 až 50 % teorie.

V příkladech 30 a 31 se používá 2,5 ekvivalentů bromacetátu k dosažení bis-alkylace.

Způsob B

Peptid-alkoxymethylketon se zpracuje s přebytkem 4-molárního dioxanového roztoku chlorovodíku během 15 minut za teploty místnosti. Odpařením se dostane hydrochlorid a tato sůl se rozdělí mezi ethylacetát a 1-molární roztok hydrogenuhličitanu draselného. Ethylacetátová fáze se oddělí, vysuší a odpařením poskytne volný amin, který se výjme methanolem a přidá se 1,5 ekvivalentu čerstvě destilovaného terč.-butylakrylátu. Vše se vaří pod zpětným chladičem po dobu 4 hodin a dostane se terč.-butoxykarbonylethylpeptid, který se čistí velmi rychlou chromatografií za použití směsi ethylacetátu a hexanu k eluování.

Způsob C mmol Boc-Arg(Z₂)-CHN₂ se rozpustí v 5 ml alkoholu obecného vzorce R⁴0H a zpracuje s octanem rhodičitým jako katalyzátorem. Po několika hodinách za teploty místnosti se podle analytického stanovení chromatografií na tenké vrstvě ukazuje, že není přítomen žádný diazoketon. Alkohol se odpaří za sníženého tlaku a sloučenina se izoluje velmi rychlou chromatografií za použití směsí ethylacetátu a hexanu k eluování.

Způsob D mmol Boc-Arg(Z₂)-OH v 50 ml suchého methylenchloridu se zpracuje s 11 mmol 2,2,2-trichlorethanolu a 1 mmol 4-dimethylaminopyridinu, ochladí na teplotu 0 °C a přidá se 13 mmol karbodiimidu rozpustného ve vodě. Po 30 minutách se reakční smés nechá ohřát na teplotu místnosti a míchá po dobu 24 hodin. Odpařením, rozdělením odparku mezi ethylacetát a 0,3-molární roztok hydrogensíranu draselného, poté trojnásobným promytím 0,3-molární hydrogensíranem draselným, jediným promytím vodou a jediným promytím roztokem chloridu sodného, vysušením a odpařením se dostane 2,2,2-trichlorethylester, který se použije jako takový.

ii) 10 mmol 2,2,2-trichlorethylesteru se zpracuje s 50 ml 4-molárního dioxanového roztoku chlorovodíku za teploty místnosti během 20 minut a poté odpaří. Po vysušení se odparek v 50 ml methylenchloridu zpracuje postupně s 10 mmol Boc-DCha-X-ONSu (X znamená Pro, Pie) a diisopropylethylaminu (do hodnoty pH 9 podle vhlkého indikátorového papírku). Vše se nechá stát po dobu 3 hodin, poté zpracuje obvyklým způsobem (ethylacetát, 0,3-molární roztok hydrogensíranu draselného) a dostane se tripeptidester jako olej. 10 mmol

2,2,2-trichlorethylesteru v 50 ml 90% vodné kyseliny octové se zpracovává v 5 minutových intervalech s malými podíly čerstvě aktivovaného zinku po dobu 1 hodiny. Za další hodinu se směs filtruje a filtrát se odpaří. Obvyklým zpracováním (s ethylacetátem a 0,3-molárním roztokem hydrogensíranu draselného) se dostane tripeptid a tato kyselina se čistí velmi rychlou chromatografií na oxid křermičitém (eluování směsí 2% kyseliny octové v ethylacetátu). Dostane se tripeptid-kyselina jako bezbarvá pěna (výtěžek 80 % teorie ve 3 stupních).

iii) Tripeptid-kyselina se konverguje v brommethylketonu za použití stejného způsobu, jako je popsán pro

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br. Tripeptid-brommethylketon se dostane jako bezbarvý olej velmi rychlou chromatografií za použiti smési ethylacetátu a hexanu k eluování.

NMR spektrum (CDC1₃): δ 0,9 (m), 1,15 (m), 1,25 (m), 1,35 (s), 1,6 (m), 1,85 (ro), 2,1 (m) (celkem 30 Η), 3,3 (m, IH), 3,7 (m, IH), 3,95 (m, 2H), 4,15 (s, 2H), 4,25 (m, IH) ,

4,4 (m, IH), 4,5 (m, IH), 5,0 (d, IH), 5,1 (dd, 2H), 5,2 (s, 2H), 7,2 až 7,4 (s, m, 10H), 9,2 až 9,5 (2 široké singlety, 2H) ppm.

iv) 1 mmol tripetidbrommethylketonu v 5 ml suchého dimethylformamidu se zpracuje ε 1,2 mmol fluorovaného alkoholu, fenolu nebo thiolu a 1,5 mmol bezvodého fluoridu draselného a míchá za teploty místnosti po dobu 24 hodin. Odpařením, poté obvyklým zpracováním a velmi rychlou chromatografií se dostanou tripeptidketony.

Boc-DCha-Pro-Arg(Z₂)-CH2O-Ph(4-Me): NMR spektrum (CDC1₃).: δ 0,9 (ro), 1,15 (m), 1,25 (m), 1,35 (s), 1,6 (m) , 1,85 (m) , 2,1 (m) (celkem 30H), 2,38 (s, 3H), 3,4 (m, IH) , 3,9 (m, IH), 4,1 (široký singlet, 2H), 4,4 (m, IH), 4,6 (m, IH), 4,7 (ro, IH), 4,9 (q, 2H), 6,9 (d, IH), 7,15 (d, IH) ,

7,4 až 7,5 (m, 2H), 7,45 (s, 10H), 9,4 (široký singlet, IH), 9,6 (široký singlet, IH) ppm.

V příkladu 37 se chráněný sulfid oxiduje na sulfon za použití kyseliny m-chlorperbenzoové v methylenchloridu za teploty místnosti.

Způsob E

i) 10 mmol Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br a 12 mmol kyseliny benzoylmravenčí ve 40 ml dimethylformamidu se uvede do styku se 14 mmol fluoridu draselného. Vše se míchá po dobu 3 hodin, dimethy1formamid se odpaří a produkt se rozdělí mezi ethylacetát a vodu. Vysušením a odpařením se dostane surový ester, benzoylformiát, který se čistí krystalizací ze směsi methylenchloridu a hexanu. Získá se připravovaná sloučenina jako bílá tuhá látka. Výtěžek odpovídá 86 % teorie.

NMR spektrum (CDClg): S 1,4 (s, 9H), 1,65 až 1,9 (m, 4H), 3,95 (m, 2H), 4,3 (m, ÍH), 4,95 (q, 2H) , 5,15 (ABq,

2H), 5,25 (s, 2H), 5,9 (d, ÍH), 7,35 (m, 10H), 7,5 (t, 2H),

7,65 (t, ÍH), 8,15 (t, 2H), 9,25 (široký singlet, ÍH), 9,45 (široký singlet, ÍH) ppm. Teplota tání: 130 až 132 ’C.

ii) 5 mmol benzoylformiátu ve 220 ml tetrahydrofuranu a 200 ml 1-molárního roztoku hydrogenuhličitanu draselného se intenzivně míchá za teploty místnosti po dobu 24 hodin. Tetrahydrofuranová fáze se oddělí a odpaří a vodná fáze se extrahuje ethylacetátem. Extrakt se spojí s látku získanou po odpaření tetrahydrofuranu. Krystalizací ze směsi methylenchloridu a hexanu se dostane α-ketol ve formě bílé tuhé látky. Výtěžek odpovídá 90 % teorie.

NMR spektrum (CDC1₃): δ 1,4 (s, 9H), 1,7 (m, 4H),

2,95 (t, ÍH), 3,95 (m, 2H), 4,25 (m, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,25 (s, 2H), 5,6 (d, 1Ή), 7,35 (m, 10H), 9,25 (široký singlet, ÍH), 9,4 (široký singlet, ÍH) ppm. Teplota tání 101 až 103 •C.

iii) 1 mmol α-ketolu v 5 ml suchého methylenchloridu se zpracuje s 5 až 10 mmol alkyljodidu a 2 mmol oxidu stříbrného. Směs se vaří pod zpětným chladičem ve tmě po dobu 2 až 17 hodin (například v případě methyljodidu, ethyljodidu a n-propyljodidu po dobu 2 hodin a v případě n-butyljodidu po dobu 5 hodin). Odpařením a potom velmi rychlou chromatografií (při eluování směsí ethylacetátu a hexanu) se dostanou alkoxymerhylketony, jako bezbarvý olej. Výtěžek odpovídá 50 až 85 % teorie.

Boc-Arg(Z₂)-CH₂OEt (olej): NMR spektrum (CDC1₃): 5

1,15 (t, 3H), 1,4 (s, 9H), 1,5 až 1,8 (m, 4H), 3,4 (q, 2H) ,

3,95 (t, 2H), 4,1 (q, 2H), 4,45 (m, 1H), 5,15 (s, 2H), 5,25 (s, 2H), 5,4 (d, 1H), 7,35 (m, 10H), 9,25 (široký singlet,

ΙΗ) , 9,4 (široký singlet, 1H) ppm.

Boc-Arg(Z₂)-CH₂NBu (olej): NMR spektrum (CDC1₃): 5 0,9 (t, 3H), 1,25 až 1,8 (m) + 1,4 (s) (17H), 3,3 (dd, 2H) , 3,95 (t, 2H), 4,05 (q, 2H), 4,45 (m, 1H), 5,1 (s, 2H), 5,2 (s, 2H), 5,35 (d, 1H), 7,35 (m, 10H), 9,25 (široký singlet, 1H) , 9,4 (široký singlet, 1H) ppm.

Způsob F

Boc-Arg(Z₂)-CH₂Br se zpracuje s CF₃CH₂OH,

CF₃(CF₂)₂CH₂OH nebo Ar-OH a fluoridem draselným v dimethylformamidu za použití postupu naznačeného ve způsobu D iv) .

Způsob G

Peptidy chráněné Boc se zpracují s 4-molárním dioxanovým roztokem chlorovodíku za teploty místnosti během 15 minut a odpaří. Odparek se rozpustí v methylenchloridu a uvede do styku s 1 ekvivalentem methylsulfonylchloridu a 2,5 ekvivalenty diisopropylethylaminu. Reakční směs se nechá stát po dobu 1 hodiny, zpracuje obvyklým způsobem a podrobí velmi rychlé chromatografii. Odstranění chránící skupiny se provede jak je popsáno u způsobu odstranění chránící skupiny a).

Způsob H

Peptidy se zbaví chránící skupiny Boc jako je uvedeno výše, promyjí kyselinou chlorovodíkovou a nato se rozdělí mezi ethylacetát a 1-molární roztok hydrogenuhličitanu draselného. Volné aminy ve studeném methanolu se ochladí na teplotu 0 °C a zpracuji s 1,5 ekvivalentu aldehydu obecného vzorce Ch-CHO a 1 ekvivalentem natriumkyanborhydridu. Po jedné hodině se reakční směs odpaří za studená a podrobí velmi rychlé chromatografií, aby se dostal N-alkylovaný peptid. Odstranění chránící skupiny se provede za použití způsobu odstranění chránící skupiny a).

Způsob I

Boc-(3-trans-fenyl)-D,L-prolin se vyrobí jak popsal Chung a kol. v J. Org. Chem. 55, 270 /1990/ a kopuluje s H-Pró-OBzl, jak je popsáno výše pro Boc-(Me)DCha-Pro-OBzl Dipeptid se potom převede na -ONSu ester jak se popisuje dále „

Boc-(3-trans-cyklohexyl)-D,L-prolin se vyrobí z fenylového analogu hydrogenací na 5% rhodiu na uhlí v 90% vodné kyselině octové za tlaku 410 kPa během 3 dnů.

Způsob K

Způsob syntézy meziproduktu

N- ( BzlO₂C-CH₂- ) , N- ( CF₃CO )-DCha-Pro~ONSu (i) H₂ - Pd/C (ii) BzlO₂C-CHO NaCNBH₃

Z-DCha-Pro-OtBu -> N-(BzlO₂C-CH₂-) ,N-( CF₃CO)DCha-Pro-ONSu (iii) (CF₃CO)₂O (iv) TFA (v) HONSu, WSCDI

i) Z-DCha-Pro-OtBu (vyroben obvyklou kopulační reakci pro výrobu peptidů) se hydrogenuje v tetrahydrofuranu v přítomnosti 5% palladia na uhlí za obvyklé teploty a normálního tlaku po dobu 24 hodin. Filtrací a odpařením se ve výtěžku 100 % teorie dostane požadovaný H-DCha-Pro-OtBu, který tvoří olej.

ii) Směs 2 mmol výše uvedené sloučeniny a 1 ekvivalent benzylglyoxylátu v benzenu se k odstranění vody podrobí trojnásobnému odpařování, přičemž pokaždé se přidá čerstvý benzen. 2 mmol výsledného iminu v 8 ml 1% kyseliny octové v methanolu se zpracuji s 2 mmol natriumkyanborhydridu. Po jedné hodině se reakční směs odpaří a odparek podrobí velmi rychlé chromatografií na oxidu křemičitém, při eluování 60% ethylacetátem v hexanu. Dostane se 385 mg

BzlO₂C-CH₂-DCha-ProOtBu. Výtěžek odpovídá 41 % teorie.

iii) 380 mg výše uvedené sloučeniny v 8 ml suchého methylenchloridu se zpracuje se 2 ekvivalenty triethylaminu a 1,2 ekvivalentem anhydridu kyseliny trifluoroctové. Po 40 minutách se reakční směs odpaří a odparek podrobí velmi rychlé chromatografií. Ve formě oleje se dostane 390 mg N-(BzlO₂C-CH₂-),N-(CF₃CO)-DCha-Pro-OtBu. Výtěžek odpovídá 86 % teorie.

^H-NMR spektrum (CDC1₃) - komplex v důsledku přítomnosti 4 rotamerů - například terč.-butylové skupiny při S

1,4 až 1,5 se čtyřikrát štěpí v poměru 1:0,25:0,8:0,4; 0,9 (m), 1,1 (m), 1,65 (ro), 1,95 (m), 2,2 (m) (17H), 1,4 až 1,5 (4xs, 9H), 3,1 (ro) , 3,5 (m), 3,7 (ro) (2H), 4,3 až 4,6 (ro,

3H), 5,05 až 5,4 (m, 3H), 7,35 (s, 5H) ppm.

iv) 335 mg výše uvedené sloučeniny se zpracuje s 8 ml směsi methylenchloridu a kyseliny trifluoroctové v poměru

1:1 za teploty místnosti během 2,5 hodiny. Reakční směs se odpaří a poté ještě třikrát odpaří s toluenem. Dostane se volná kyseliny ve výtěžku odpovídajícím 100 % teorie.

v) Svrchu uvedená kyselina se převede na svůj -ONSu ester ve výtěžku 100 % teorie za použití N-hydroxysukcinimidu, jak je popsáno svrchu pro Boc-DCha-OH.

Meziprodukt se může kopulovat na H-Arg(Z₂)-CH₂-Y-R⁴ za použití obecných způsobů, které již byly uvedeny. Způsob odstranění chránících skupin poskytne peptid chráněný skupinou vzorce -N-CF^-CO-. Tato skupina se odstraní způsobem popsaným pod d).

Způsoby odstranění chránící skupiny

a) Chráněný peptid ve směsi methanolu a vody v poměru 3:1, která obsahuje 2 ekvivalenty 1-molární kyseliny chlorovodíkové, se hydrogenuje za přítomnosti 5% palladia na uhlí za obvyklých teplotních a tlakových podmínek po dobu 40 minut. Filtrací (0,2 μη) a odpařením s následující lyofilizací z vody se dostanou peptidy jako načechrané tuhé látky. Čištění, pokud je.zapotřebí, se provádí středotlakou kapalinovou chromatografií (viz obecné způsoby).

b) Chráněný peptid se nejprve uvádí do styku se směsí kyseliny trifluoroctové a methylenchloridu v poměru 1:1 po dobu 1 hodiny a odpaří. Poté se provede hydrogenace, jak je popsáno pod a).

c) Skupina vzorce COCOPh se nejprve hydrolyzuje, jak je popsáno pod E ii), a poté hydrogenuje vodíkem v přítomnosti palladia na uhlí jak je popsáno pod a).

d) Odstranění N-CF^-CO-(N-trifluoracetylu)

N-Trifluoracetylpeptid se rozpustí ve směsi acetonitrilu, vody a amoniaku o hustotě 0,880 v poměru 1:1:1 a udržuje za teploty místnosti po dobu 24 hodin. Odpařením a poté čištěním, pokud je to zapotřebí, se dostane požadovaný peptid.

Příklady provedeni vynálezu

Příklady uvedené dále ilustrují podrobněji podstatu tohoto vynálezu.

Příklady sloučenin jsou uvedeny v tabulce 1. Tabulka 2 uvádí způsoby použité při jejich výrobě v části označené nadpisem způsob výroby. Tabulka 3 obsahuje charakterizující hodnoty shrnutých sloučenin.

Příklady 1 až 37

Tabulka 1

Příklad č. Vzorec

9

21 22

H-DCha-Pro-D,LArg-CH₂~OH H-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Me

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃H-DCha-Pro-Arg-CH₂“0-CH(CF₃)₂H-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-C*H(Ph)-CF₃

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃Et-OOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₂-CF₂-CF H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂~O-Ph(4-OMe) H00C-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-Ph(4-tBu) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂~O-Ph(4-Me ) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(4-F) H00C-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-Ph(3-F) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(2-F) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(3-CF₃ ) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(4-CF₃ ) HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(2-CF₃ ) H00C-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-C₆H₅HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Et

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nPr

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-iBu

HOOC-CH₂-DCha-Aze-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃

HOOC-CH₂-DCha-Píc-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃

HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-nBu

Me-DCha-Pro-D, LArg-CH₂-O-CH₂--CF ₃

Me-S0₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃Ch-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃ (HOOC-CH₂)₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-CH₂-CF₃

Tabulka 1 (pokračování)

Příklad č. Vzorec (HOOC-CH₂)₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-íBu

2 HOOC-CH₂-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂~O-nBu

3 H00C-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃

4 H-D,LPro(3-trans-Ph)-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃

5 H-D,LPro(3-trans-Ch)-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃

6 HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-S-nBu

H00C-CH₂-DCha-Pro-D_zLArg-CH₂-S0₂-nBu absolutní konfigurace R nebo S

Tabulka 2

Způsob

Příklad č. výroby

Způsob odstranění chránící skupiny

9

21

D c

E b

A nebo C b

A a

F a

A nebo D a

F a

D a

E a

A a

E a

A a F a

A a G a

A a H a

A a

Tabulka 2 (pokračováni)

Způsob

Příklad č. výroby

Způsob odstranění chránící skupiny

31	E			a
32	E	a	B	b
33	A	a	B	b
34	I	a	A	b
35	I	a	A	b
36	D			a
37	D			a

Tabulka 3

Mol.hmot.

Příklad č.	retence (min)/systém	FAB MS (M + 1)	AAA: peptid Obsah (%)*	HPLC doba
1	438,57	439	56/Pro	10,3 /E
2	452,60	453	65/Pro	9,9 /E
3	520,6	521	59/Pro	8,6 /A
4	588,6	589	60/Pro	10,7 /A
5	596,7	597	61/Pro	12,2 /A
6	578,64	579	72/Pro	14,8 /C
7	606,69	607,7	65/Pro	22,0 /B
8	678,65	679,8	76/Pro	18,2 /G
9	572,71	573,3	73/Pro	19,9 /B
10	602,74	603,8	76/Pro	13,4 /G
11	628,82	629,5	77/Pro	22,0 /G
12	586,74	587,2	75/Pro	16,0 /G
13	590,70	591,4	76/Pro	15,2 /G
14	590,70	591,4	63/Pro	15,0 /G
15	590,70	591,4	54/Pro	14,0 /G
16	640,71	641,5	68/Pro	19,0 /G
17	640,71	641,6	70/Pro	20,0 /G
18	640,71	641,4	65/Pro	18,4 /G
19	662,66	663	49/Pro	21,0 /G
20	524,67	525,4	79/Pro	15,5 /B
21	538,69	539	67/Pro	9,2 /F
22	552,72	553	69/Pro	19,3 /B
23	552,72	553,4	56/Pro	9,2 /F
24	564,61	565	67/Aze	13,6 /D
25	592,66	593	90/Pic	8,4 /D
26	566,75	567,4	86/Pic	17,0 /G
27	534,63	535,6	70/Pro	18,8 /B
28	598,69	599	71/Pro	11,2 /D

Tabulka 3 (pokračování)

Mol.hmot.

retence ** FAB MS AAA: peptid HPLC

Příklad č. (min)/systém (M+1) Obsah (%)* doba

29	616,77	617	64/Pro	14,5	/c
30	636,67	637,6	70/Pro	12,0	/A
31	610,76	611,2	67/Pro	10,0	/F
32	566,75	567,5	65/Pro	19,7	/B
33	592,66	593	46/Pro	10,6	/F
34	540,59	541	56/Pro	14,3	/c
35	546,64	547	49/Pro	15,9	/c
36	568,78	569,4	45/Pro	17,4	/G
37	600,78	601,3	62/Pro	14,6	/G
*	Vztaženo na	aminokyselinu, jak uvedeno.
**	Viz obecné	experimentální postupy. Časy	jsou uvedeny
	pro epimery	L-Arg. D-epimery	(minoritní	složky)
	obvykle protékají přibližně o	30 sekund	dříve.
Systém	A: 20 - 80	%, 25 min (z 20 %	se zvyšuje	na 80 %,	1%

kyselina trifluoroctová/acetonitrii v 1% kyselině trifluoroctové/voda, během 25 minut),

Systém	B:	10	- 60	%,	30	min
Systém	C:	10	- 90	%,	30	min
Systém	D:	30	- 100	%,	30	min
Systém	E:	10	- 90	%,	20	min
Systém	F:	20	- 100	%,	20	min
Systém	G:	20	- 70	%,	30	min

Příklad 38

Roztok pro kontinuální intravenózní podáni

Roztok se připraví z těchto složek:

Inhibitor thrombinu 50 mg

Chlorid sodný pro injekce 4,5 g

Voda pro injekce do 500 ml

Účinná látka a chlorid sodný se rozpustí ve vodě a poté se roztok filtruje, nato sterilizuje autoklávováním nebo filtrací přes sterilní filtr 0,2 μη a plní za aseptic kých podmínek do sterilních láhví pro infuzi.

Příklad 39

Roztok pro injekce

Roztok se připraví z těchto složek:

Inhibitor thrombinu 5 g

Chlorid sodný pro injekce 9 g

Voda pro injekce do 1000 ml

Účinná látka a chlorid sodný se rozpustí ve vodě a poté se roztok filtruje., nato sterilizuje autoklávováním nebo filtrací přes sterilní filtr 0,2 um a plní za aseptic kých podmínek do sterilních ampulí o objemu 5 ml.

Přiklad 40

Roztok pro nasální podání

Roztok se připraví z těchto složek:

Inhibitor thrombinu 10 g

Glycerol 200 g

Methyl-p-hydroxybenzoát 1 g

Propyl-p-hydroxybenzoát 0,2 g

Voda pro injekce do 1000 ml

Účinná látka a konzervační prostředky se rozpustí v glycerolu a hlavní části vody. Poté se objem upraví na 1000 ml a roztok se plní do sterilních polyethylenových zásobníčků.

Příklad 41

Tablety pro orální podání

1000 tablet se připraví z těchto složek:

Inhibitor thrombinu	100 g
Laktóza	200 g
Polyvinylpyrrolidon	30 g
Mikrokrystalická celulóza	30 g
Stearát hořečnatý	6 g

Účinná látka a laktóza se smíchají s vodným roztokem polyvinylpyrrolidonu. Směs se suší a mele za vzniku granulí Ke směsi se potom přimíchá mikrokrystalická celulóza a poté stearát hořečnatý. Nato se směs slisuje na tabletovacím stroji a dostane se 1000 tablet, z nichž každá obsahuje 100 mg účinné látky.

Příklad 42

Želatinové kapsle pro orální podání

Želatinové kapsle se naplní směsí, která sestává z těchto složek:

Inhibitor thrombinu	50	mg
Stearát hořečnatý	3	mg
Laktoza	100	mg

Biologické hodnocení

Stanovení srážlivosti thrombinu a IC_5QTT

Lidský thrombin (T 6769, Sigma Chem. Co.) v 100 μΐ roztoku pufru o hodnotě pH 7,4 a 100 μΐ inhibitorového roztoku se inkubuje po dobu 1 minuty. K roztoku se potom přidá 100 μΐ zásobní normální lidské plasmy zpracované s citrátem a srážlivost se měří na automatickém přístroji KC 10 (Amelung).

Srážlivost vyjádřená v sekundách se vynese proti koncentraci inhibitoru a hodnoty IC_5QTT se stanoví interpolací .

IC_5QTT představuje koncentraci inhibitoru, která vede k dvojnásobné thrombinové srážlivosti pro lidskou plasmu. pIC₅₀TT je -log 10 z IC_5QTT v mol/1. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Příklad č. pIC_5QTT

1	7,71
2	7,81
3	7,92
4	7,38
5	7,77
6	8,04
7	7,70
8	7,64
9	8,45
10	7,90
11	7,86
12	8,25
13	8,22
14	8,15
15	8,12
16	7,77
17	8,68
18	7,30
19	8,27
20	8,17
21	8,14
22	8,69
23	7,64
24	8,01
25	8,00
26	7,89
27	7,52
28	6,85
29	6,47
30	7,38

Tabulka 4 (pokračování)

Příklad č. pIC_5QTT

31	6,88
	32	7,63
	33	7,78
	34	7,03
v	35	7,25
	36	7,57
*	37	7,72

Vysvětlení zkratek

V popisné části, patentových nárocích a zejména ve schématech a tabulkách jsou používány zkratky, které mají

tyto významy:
4-DMAP =	4-dimethylaminopyridin
AAA =	analýza aminokyseliny
Arg = Arg(Z₂) = Aze =	L-arginin ÚN, N-dibenzyloxykarbonyl-L-arginin kyselina L-azetidin-2-karboxylová
Boc =	terč.-butoxykarbonyl
Bu =	butyl
Bzl =	benzyl
Ch =	cyklohexyl
Cha =	L-3-cyklohexylalanin
DMF =	dime thylf ormami d
Et =	ethyl
EtOAc =	ethylacetát
FAB =	bombardování rychlými atomy
Fl až FXIII =	koagulační faktor I až XIII
FII_a až FXIII_a =	aktivovaná forma koagulačních faktorů II až XIII
Gly = HMW-K =	glycin kininogen o vysoké molekulové hmotnosti
HOAc =	kyselina octová
HONSu =	N-hydroxysukcinimid
ÍBC =	isobutylchloroformiát
Kalí =	kallikrein
Me =	methyl
NMM =	N-methyImorfo1in
Nph = Ph =	naftyl fenyl
Pie =	kyselina L-pipekolinová

PL =	fosfolipidy
Pr =	propyl
Prekall =	prekallikrein
Pro ~	L-prolin
Tce =	2,2,2-trichlorethyl
TFA =	kyselina trifluoroctová
THF =	tetrahydrofuran
Val =	L-valin
WSCDí =	karbodiimid rozpustný ve vodě
Z =	benzyloxykarbonyl

Prefixy n, iso a terč. mají své obvyklé významy a znamenají normální, iso a terciární.

Přehled sekvencí

Počet sekvencí: 1 (1) Informace pro SEQ ID čís.: 1 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 20 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (iii) Hypotheticky: ne (vi) Původ zdroje:

(A) Organizmus: Homo sapiens (ix) Znaky:

(A) Název/klíč: peptid (B) Poloha: 1..20 (D) Další informace: /poznámka = Peptidová sekvence obsahující místo štěpení thrombinu v lidském fibrinogenovém Α-α-řetězci.

(ix) Znaky:

(A) Název/klíč: štěpící místo (B) Poloha: 16..17 (xi) Popis sekvence: SEQ ID čís. 1 =

Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly 1 5

Val Arg Gly Pro Arg Val

Claims

1. Sloučenina obecného vzorce 1

NH

R

Y ,R^X (i) ve kterém

A představuje skupinu vzorce -CH₂ ^-z -CH=CH-, -CH₂-CH₂nebo -CH₂-CH₂-CH₂-,

R² a R² jsou stejné nebo rozdílné a každý z nich představuje atom vodíku nebo skupinu vzorce X-B-, kde B znamená přímou nebo rozvětvenou alkylenovou skupinu obsahující 1 až 3 atomy uhlíku a X znamená atom vodíku, methyl, ethyl, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 atomů uhlíku nebo skupinu vzorce R'CO-, kde R' znamená hydroxyskupinu, přímou nebo rozvětvenou alkoxyskupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupinu nebo skupinu vzorce NHR, kde R znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku nebo

X znamená zbytek karboxylové kyseliny známý jako takový, zvolený z -PO(OR')₂, -SO₃H nebo 5-(ÍH)-tetrazolyl a

R' znamená atom vodíku, methyl nebo ethyl nebo

B představuje skupinu vzorce -S0₂- a X znamená methyl nebo ethyl, m představuje číslo 0, 1 nebo

2,

O

R znamená cyklohexylovou skupinu a

R^3A představuje atom vodíku nebo m představuje číslo 1,

O

R znamená cyklohexylovou nebo fenylovou skupinu a

R^3A tvoří ethylenový můstek dohromady s R¹,

Y znamená atom kyslíku nebo skupinu vzorce S(O) , £~ kde p představuje číslo 0, 1 nebo 2 a

R₄ znamená atom vodíku, přímou nebo rozvětvenou alkylovou nebo cykloalkylovou skupinu obsahující od 1 do 6 atomů uhlíku, nesubstituovanou nebo substituovanou jedním nebo větším počtem atomů fluoru a/nebo substituovanou fenylovou skupinou, substituovaný nebo nesubstituovaný aromatický kruh zvolený z fenylu, 4-methoxyfenylu, 4-terc.-butylfenylu, 4-methylfenylu, 2-, 3- nebo 4-trifluormethylfenylu a fenylu substituovaného 1 až 5 atomy uhlíku, nebo znamená -CH(CF₃)-fenyl, buď jako taková nebo ve formě fyziologicky přijatelné soli a zahrnující stereomery.

- 47 2. Sloučenina podle nároku 1, kde

A znamená skupinu vzorce -CH₂-CH₂~ nebo -CH₂-CH₂-CH₂

R² značí představuje atom vodíku,

R² představuje skupinu vzorce HOCO(CH₂)_n~ nebo ch₃ch₂oco(ch₂)_n-, n je 1 nebo 2,

Y znamená atom kyslíku, m značí číslo 1,

R³ představuje cyklohexylovou skupinu a r3A představuje atom vodíku.

3. Sloučenina podle nároku 1, která je zvolena z

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-OH,

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Me,

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂“CF₃,

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-C>-CH( CF₃ ) ₂ ,

H-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-(R nebo S)CH(Ph)-CF₃,

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃ , Et-00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃ , HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₂-CF₂-CF₃ , H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph, H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph( 4-OMe) , H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph( 4-tBu) , H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph( 4-Me) , H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(4-F) ,

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(3-F),

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(2-F) ,

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(3-CF₃),

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(4-CF₃) ,

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Ph(2-CF₃) ,

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-C₆H₅,

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-Et,

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nPr,

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu,

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-iBu,

HOOC-CH₂-DCha-Aze-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃ ,

HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃,

HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-nBu,

Me-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃,

Me-S0₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃,

Ch-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃, (HOOC-CH₂ ) ₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃ , (HOOC-CH₂)₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-iBu, HOOC-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Ařg-CH₂-0-nBu, HOOC-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃,

H-DPro (3-trans-Ph )-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃ ,

H-DPro(3-trans-ch)-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂~CF₃,

H-(3-trans-Ph)-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂~CF₃,

H-(3-trans-Ch)-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃, HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-S-nBu a H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-S0₂-nBu, bud' jako taková nebo ve formě fyziologicky přijatelné soli včetně stereomerú.

4. Sloučenina podle nároku 1, která je zvolena z

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃ ,

HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-O-CH₂-CF₃,

HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH₂-0-nBu,

H00C-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu,

H00C-CH₂-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-CH₂-CF₃ a

H00C-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nBu, bud' jako taková nebo ve formě fyziologicky přijatelné soli včetně stereomerů.

5. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 4 k použiti v terapii.

6. Způsob výroby sloučeniny podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že (způsob I) atom halogenu se nahradí skupinou R^Y^- (kde Y představuje atom kyslíku nebo síry) v halogenmethylketonu obecného vzorce ve kterém

W¹ znamená koncovou chránící skupinu aminoskupiny a

W znamená chrámci skupinu, keton se redukuje na alkohol, odstraní se koncová chránící skupina aminoskupiny, provede obvyklá peptidové kopulace, poté se alkohol oxiduje a dostane se chráněný tripeptidketon, odstraní se koncová ohraničí skupina aminoskupiny, pote se provede N-alkylace a odstraní chránící skupiny nebo se náhradí chráněný dipeptid při kopulačni reakci uvedene výše dipeptidem chráněným amino-koncovým N-alkylovaným N-trifluoracylem, poté se provede oxidace a odstraněni chránící skupiny, nebo (způsob II) provede se alkylace R⁴-halogenidem a-ketolu obecného vzorce ve kterém

W¹ a W² mají významy uvedené výše, a potom se provedou další reakce jako u způsobu I, nebo (způsob III) nechá se reagovat sloučenina obecného vzorce ve kterém

W¹ a W² mají významy uvedené výše, se sloučeninou obecného vzorce (T-CH₂CO)₂o, ve kterém

T představuje atom halogenu, skupinu vzorce R⁴0 nebo

R⁴S, a 4-dimethylaminopyridinem a potom se provedou reakce jak je popsáno u způsobu I a pokud je žádoucí, vyrobí se fyziologicky přijatelná sůl a v těch případech, kdy reakce má za výsledek směs stereomerů, tyto stereomery se popřípadě dělí obvyklými chromatografický mi nebo rekrystalizačními technickými postupy, a pokud je to žádoucí, izoluje se jediný stereomer.

7. Farmaceutický prostředek, vyznačuj íci se t í m, že obsahuje účinné množství některé sloučeniny podle nároků 1 až 4 a kromě toho alespoň jednu farmaceuticky přijatelnou nosnou látku.

8. Použití sloučeniny podle některého z nároků 1 až 4 jako účinné složky pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici thrombinu v lidském nebo zvířecím organizmu.

9. Sloučenina, způsob, farmaceutický prostředek, použití a způsob použiti, jak jsou nárokovány v některém z nároků 1 až 8 a jak jsou v podstatě popsány.