SE453800B - Vevnadsbindemedel innefattande fibrinogen och faktor xiii samt forfarande for dess framstellning - Google Patents

Description

15 20 25 4531800 b) reglerbar hållbarhet av klistringarna i kroppen, c) fullständig resorberbarhet av bindmedlet under sàr~ läkningsprocessen, d) sårläkningsbefrämjande egenskaper.

Att tidigare preparat icke uppfyller ovannämnda fordringar i tillräcklig utsträckning kan delvis bero på att de för blodstillningen nödvändiga koagulationsfaktorerna icke före- finnes i ett optimalt förhållande hos dessa kända preparat och kan också bero därpå, att den fibrinolytiska aktiviteten icke har kunnat tillräckligt behärskas inom klistringsområdet.

Man erhöll ofta genom enzymatisk inverkan en för tidig upplös- ning av dessa vävnadshopklistringar.

Uppfinningen avser att undvika dessa nackdelar och svårigheter och ändamålet med uppfinningen äratt åstadkomma ett vävnads- bindmedel av humant eller animaliskt ursprung, vilket uppfyller ovannämnda förutsättningar.

Uppfinningen är baserad på den insikten, att man måste inne- hålla ett bestämt förhållande mellan fibrinogen och faktorn XIII och att den fibrinolytiska aktiviteten hämmas genom en bestämd mängd av en inhibitor.

I enlighet härmed består uppfinningen i en kombination av följande kännetecken: a) att faktor XIII förefinns i en mängd av åtminstone 7 enheter/ml och fibrinogen i en mängd av åtminstone 70 mg/ml, varvid förhållandet av fakümn1XIII till fibrinogen - uttryckt i enheter av faktorn XIII per gram fibrinogen - uppgår till åtminstone 80, 10 15 20 25 453 800 b) att bindmedlet innehåller en plasminogen-aktivator-in- hibitor eller plasmin-inhibitor i en mängd av 20 - 2000 KIE per ml.

Enligt en utföringsform är plasminogen-aktivator-inhibitorn eller plasmin-inhibitorn aprotinin.

Enligt en föredragen utföringsform innehåller vävnadsmedlet i kyla olösligt globulin, som, vilket har kunnat visas ökar effekten.

Enligt ett ytterligare kännetecken hos uppfinningen innehåller vävnadsbindmedlet dessutom albumin, vilket utövar en stabili- serande effekt på bindmedlets komponenter.

Enligt en föredragen utföringsform föreligger fibrinogenet, det i kyla olösliga globulinet och albuminet i ett förhållande av mellan 60 till 98 : 0,5 till 20 :_0 till 15 och faktorn XIII förefinnes i en mängd av åtminstone 7 enheter per ml.

För att säkerställadaxönskade effekten bör fibrinogenet föreligga i en mängd av åtminstone 70 mg per ml.

Vävnadsbindmedlet enligt uppfinningen uppvisar karaktäristiska förnätningsegenskaper, vilka kunna bestämmas enligt natrium- laurylsulfat (SDS)~polyakrylamid-gelelektrofores-metoden.

Denna test utföres på sådant sätt, att blandningen efter hopblandning av vävnadsbindmedlet med samma volym av en lös- ning innehàllande 40 pMol CaCl2 och 15 NIH-enheter (US National Institute of Health-Enheter) trombin per ml, inkuberas vid 37°C. Förnätningsgraden bestämmes efter att reaktionen stoppas och efter en reduktiv spaltning av de i proteinerna förefintliga disulfitbroarna genom tillsats av en bland- ning av urinämne, natriumdodecylsulfat och P-merkaptoetanol 10 15 20 25 30 453 gon genom gelelektrofores. Karaktäristiskt för det enligt uppfinningen föreslagna bindmedlet är en fullständig efter 3 till 5 mi- nuter och en åtminstone 35 procentig förnätning av förnätning av fibrin-K-kedjorna fibrin-o<-kedjorna efter två timmar.

Uppfinningen omfattar dessutom ett förfarande för fram- ställning av det ovan beskrivna vävnadsbindmedlet, var- vid man utgår från humant eller animalt plasmakryopreci- pitat. Förfarandet kännetecknas av att i kyla lösligt plasmaprotein avlägsnas ur kryoprecipitatet genom en eller flera behandlingar med en buffertlösning som innehåller om- kring 6A5gNa3-citrat - 2H2O, omkring 3,4 g NaCl, omkring 10,0 g glycin, omkring 13,0 g glukos - lH2O och eventuellt omkring 50 000 KIE aprotinin per liter och har ett pH- värde på omkring 6,5, varefter den renade fällningen görs flytande (genom uppvärmning).

Med fördel framställes kryoprecipitatet ur humant eller ani- malt färsk plasma, vilken djupfrystes vid -20°C. Vid en ökning av temperaturen till mellan 0 - 2°C utvinnes kryo- precipitatet och avskiljes genom centrifugering. Buffert- lösningen med vilken kryporecipitatet behandlades, upp- visade ett pH-värde av mellan 6 till 8,0. Det i kyla lös- liga plasmaproteinet avskildes genom centrifugering under innehållande av en temperatur av mellan 0 - 4°C. Den renade fällningen tvättas därefter så länge med buffert- lösningen tills man har uppnått de önskade förhållanden av faktorn XIII till fibrinogenet respektive det efter- strävade förhållandet mellan fibrinogenet, det i kyla olösliga globulinet och albuminet. 5 453 sno Den lösta renade fällningen kan göras hållbar genom en djup- frysning.

Vävnadsbindmedlet enligt uppfinningen visar en universell användbarhet. Bindmedlet kan användas för en sömlös hopbind- ning av humana eller animaliska vävnads- eller organdelar, för sårförsegling och blodstillning samt för att befrämja sårläkningar.

Föredragna användningsområden, där det enligt uppfinningen föreslagna vävnadsbindmedlet kan användas med god effekt äro: Indikationer inom området av hals-,näs-,öron- och käk- kirurgin, inom tandvården, inom neurokirurgin, inom den plastiska kirurgin, allmän kirurgi, abdominalkirurgi, torax- och kärlkirurgi, ortopedi, olyckskirurgi, urologi, ophtalmologi och gynekologi.

Med fördel försättes bindmedlet före applikationen av det- samma pâ den för hopbindning avsedda vävnaden med en bland- ning av trombin och kalciumklorid eller också kan denna blandning appliceras på vävnaden.

Det enligt uppfinningen föreslagna förfarandet beskrives närmare genom ett följande exempel l: 178,5 l humant, vid -20°C djupfryst färskplasma uppvärmdes till +2OC. Det erhållna kryoprecipitatet avskildes genom centrifugering och behandlades vid +2OC med 8 l av en buf- fertlösning innehållande 6,6 g Na3-citrat-2H2O, 3,4 g NaCl, 10,0 g glycin, 13,0 g glykos-lH2O och 50000 KIE aprotinin per liter, och ett pH-värde av 6,5 och Centrifu- gerades än en gång vid +2°C. Behandlingen med nämnda buffert- lösning och den anslutande centrifugeringen upprepades än en gång. Den avskilda fällningen gjordes flytande genom uppvärm- ning till 37°c. 453 800 I den så erhållna produkten förefanns aprotinin i en koncentra- tion av 50 KIE per ml. Förhållandet fibrinogen till det i kyla olösliga globulinet och albuminet bestämdes i produkten med 86,2 : 6,7 : 2,2. Denna bestämning utfördes likaledes enligt SDS-polyakrylamid-gelelektrofores-metoden, nämligen a) med ett icke reducerat och b) med ett med -merkaptoeta- nol reducerat prov av vävnadsklistret. Av faktorn XIII fast- ställdes 13,3 enheter per mg respektive förhållandet av faktorn XIII till fibrinogenet, uttryckt i enheter av faktorn XIII per gram fibrinogen uppgick till 152. Fibrinogenet förefanns i en mängd av 90,6 mg/ml.

Bestämningarna gjordes på följande sätt: bestämningen av faktor XIII-enheterna genomfördes medelst en förnätningstest, vid vilken faktor XIII-fritt fibrinogen användes som substrat och den genom tillsatsen av det okända förtunnade provet åstad- komna fibrinförnätningen tjänade såsom mått för den däri förefintliga mängden av faktorn XIII. En motsvarande kali- breringskurva erhölls med polad humant citratplasma, varvid 1 ml plasma innehåller l enhet faktor XIII. Den kvantitativa proteinbestämningen erhölls medelst Kjeldahl-metoden.

Förnätningstesten enligt SDS-polyakrylamid-gelelektrofores- metoden gav en fullständig fibrin- K -förnätning efter fem minuter och en 68 procentig fibrin-lD<-förnätning efter två timmar- Slutpredukten fylldes på slutbchållare och djup- frystes i och för lagring vid -ZOOC.

Enligt ett ändrat förfarande är det också möjligt att till- sätta plasminogen-aktivator-inhibitorn respektive plasmin- -inhibitorn i ett senare stadium, såsom närmare framgår av det följande exemplet 2: 112,5 l humant, vid -2000 djupfryst färskplasma uppvärmdes till +2°C. Det erhållna kryoprecipitatet avskildes genom centrifugering och tvättades vid +2°C med 10 l av en buffert- lösning innehållande 6,6 g Na3-citrat-ZHZO, 3,4 g NaCl, 7 453 800 10,0 g glycin, 13,0 g glukos~lH20 per liter och ett pH-värde av 6,5 och centrifugerades än en gång vid +2°C. Den avskilda fällningen gjordes flytande genom uppvärmning till 37°C.

Den så erhållna lösningen försattes med 50 KIE aprotinin per ml.

I den så erhållna produkten fastställdes förhållandet fibrino- gen till i kyla olösligt globulin och albumin med 91,0 : 5,3 : : 1,1. Denna bestämning genomfördes likaledes enligt SDS-poly- akrylamid-gelelektrofores-metoden, nämligen a) med ett icke reducerat och b) med ett med få-merkaptoetanolreducerat prov av vävnadsklister. Faktorn XIII fastställdes till 15,7 en- heter per ml,förhållandet av faktorn XIII till fibrinogenet, uttryckt i enheter av faktorn XIII per gram fibrinogen upp- gick till 170. Fibrinogenet förelåg i en mängd av 92,1 mg/ml.

Bestämningarna gjordes på följande sätt: Bestämningen av faktor XIII-enheterna genomfördes medelst en förnätningstest, vid vilken faktor XIII-fritt fibrinogen användes såsom substrat och den genom tillsats av det okända utspädda provet åstad- komna fibrinförnätningen tjänade såsom mått för den däri före- fintliga mängden av faktorn XIII. En motsvarande kalibrerings- kurva erhölls med polad humant citratplasma, varvid l ml plasma innehåller l enhet faktor XIII. Proteinbestämningen företogs medelst Kjeldahls-metoden.

Förnätningstesten enligt SDS-polyakrylamid-gelelektrofores- metoden gav en fullständig fibrin- Å'-förnätning efter 5 minuter och en 87 procentig fibrin-CX_-förnätning efter 2 timmar. Slutprodukten avfylldes i engångsinjektionsspru- tor och djupfrystes i och för lagring vid -20oC.

Claims (6)

453 800 »i P a t e n t k r a v

1. Vävnadsbindmedel framställt av human eller animal plasma med en halt av faktor XIII och fibrinogen, k ä n - n e t e c k n a t av a) att faktor XIII förefinnes i en mängd av åtminstone 7 enheter/ml och fibrinogen i en mängd av åtminstone åo mg/ml, varvid förhållandet av faktorn xxx: till fibrinogen - uttryckt i enheter av faktorn XIII per gram fibrinogen - uppgår till åtminstone 80, b) att bindmedlet innehåller en plasminogen-aktivator-in- hibitor eller plasmin-inhibitor 1 en mängd av 20 - 2000 KIE per ml.

2. Vävnadsbindmedel enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a t av att plasminogen-aktivator-inhibitorn eller plasmin-inhibitorn är aprotínin.

3. Vävnadsbindmedel enligt krav 1 eller 2, k ä n n e - t e c k n a t av att det dessutom innehåller i kyla olös- ligt globulin.

4. Vävnadsbindmedel enligt kraven 1 - 3, k ä n n e - t e c k n a t av att det härutöver innehåller albumin, varvid viktsförhâllandet av fibrinogen, i kyla olösligt globulin och albumin uppgår till 60 till 98:0,5 till 20:0 till 15.

5. Förfarande för framställning av ett vävnadsbindmedel av plasmakryoprecitat av human eller animal plasma med en halt av faktor XIII och fibrinogen enligt krav 1, k ä n - n e t e c k n a t av att i kyla lösligt plasmaprotein av- lägsnas ur kryoprecipitatet genom en eller flera behand- 453 800 lingar med en buffertlösning, som innehåller omkring 6,6 g Na3-citrat-2H20, omkring 3,4 g NaCl, omkring 10,0 g glycin, omkring 13,0 g glukos-lH2O och eventuellt omkring 50 000 KIE aprotinin per liter och har ett pH-värde pá omkring 6,5, varefter den renade fällningen görs flytande (genom uppvärmning).

6. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att den lösta renade fällningen göres hållbar genom djupfrysning.