NO324935B1 - Fibrinforseglingsmiddel avledet fra fiskeblod samt fremgangsmate for fremstilling av det samme. - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse er et fibrinforseglingsmiddel og en fremgangsmåte for å fremstille et fibrinforseglingsmiddel fra fiskeblod. Helblod tas fra donorfisken og sentrifugeres for å separere blodceller fra plasma. Protrombin og fibrinogen ekstraheres fra dette plasmaet og protrombinet aktiveres til trombin. Fibrinogen- og trombinbestanddelene kombineres deretter etter behov for å danne fibrinforseglingsmiddelet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et fibrinforseglingsmiddel avledet fra fiskeblod samt fremgangsmåte for fremstilling av det samme.

Fibrinforseglingsmidler er veletablerte som virksomme hemostatiske midler med tallrike anvendelser i hjerte-, bryst-, plastisk og neurokirurgi; hudtransplantering, reparasjon av knokkelskader og behandling magesår (Gibble and Ness, 1990). Felles nevneren for disse anvendelsene er behovet for et bionedbrytbart vevsforseglingsmiddel som tjener til å redusere blødning eller serøs lekkasje eller for å tilveiebringe ytterligere styrke for kirurgiske anastamoser. Vanlige fibrinforseglingsmidler består av menneskelig fibrinogen og Faktor VIII avledet fra menneskelig plasmacryoprecipitat og trombin fra bovint plasma (Martinowitz and Saltz, 1996). Utenfor USA er kommersielt fremstilte fibrin klebekits tilgjengelig som inneholder pasteurisert menneskelig fibrinogen, bovin trombin og andre bestanddeler. FDA har ikke godkjent anvendelse av disse kitene på grunn av bekymringer med hensyn til virksomheten og sikkerhet som omfatter mulige virussykdom-risikoer. Derfor fremstiller amerikanske kirurger ofte hjemmelagde "lim". Disse består av fibrinogen ekstrahert fra pasientens eget plasma (autologe plasma) kombinert med bovint trombin for å danne en klebemiddelblanding (Silver et al., 1995).

Problemer med fibrinforseglingsmidler som anvendes nå, baseres på muligheten av sykdomstransmisjon fra både det menneske-avledede fibrinogen fra ikke-autologe kilder og det bovine trombin. Nylig erfaring fra Storbritannia, som forbinder bovin spongiform encefalopati (BSE) og Creutzfelt-Jakob sykdom i mennesker, viser farene for smittsomme substanser som krysser barrieren mellom pattedyrene (cross-mammalian infectious agents) (Will et al., 1996). Farene for en virusinfeksjon fra ikke-autologe menneskelige blodprodukter er velkjent. Selv om forskjellige teknikker er tilgjengelige for å bestemme og inaktivere menneskelige og andre pattedyrviruser, gir de en relativ sikkerhet kun med hensyn til kjent risiko og lite, hvis i det hele tatt, beskyttelse i forhold til termoresistente viruser eller nye smittsomme midler som prioner (Murphy, 1996). Et kommende problem med bovin trombin er også utviklingen av antistoffer mot bovine blodproteiner hos noen pasienter (Nichols, 1994).

Den raske levringen av blod fra de fleste teleoster (benfisk) er velkjent. Mekanismen er en kaskade av levringsfaktorer som ender i omdannelsen av fibrinogen til fibrin ved hjelp av trombin, som ligner levringen hos mennesker (Doolittle and Surgenor, 1962). Likevel fant disse forfatterne og andre (Smit and Schoonbee, 1988; Kawatsu and Kondo, 1989) ut at mange av levringsproteinene hos fisk er arts-spesifikke. Levringsfaktorer hos fisk har fått lite oppmerksomhet for anvendelse hos mennesker av flere grunner. For det første pekte art-spesifisiteten av noen fiskeplasmaproteiner til en generell inkompatibilitet av fisk og menneske blodproteiner som virket nedslående for ytterligere undersøkelse. For det andre har kun i de siste årene, farene, både reelle og antatte, som angår menneskelige og bovine blodprodukter blitt publisert. For det tredje, at det ikke var tilgjengelig store mengder av aseptisk blod med konsistent sammensetning og kvalitet inntil den nylige opprettelsen av kommersiell akvakultur.

Det er i US5583114 beskrevet en sammensetning som er egnet ved forsegling av vev in vivo, hvor sammensetningen omfatter humant serum albumin og et middel som forårsaker kryssbinding.

Det er videre i, Trends in Biotechnology, vol. 8, 1990, side 53-57, beskrevet ulike adhesive proteiner fra Mytilus edulis samt adhesive sammensetninger basert på fibrin isolert fra menneske blod.

Det er derfor et formål med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe et fibrinforseglingsmiddel som reduserer muligheten for sykdomsoverføring.

Det er et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for å fremstille et fibrinforseglingsmiddel fra fiskeblod.

Foreliggende oppfinnelse er et fibrinforseglingsmiddel og en fremgangsmåte for fremstilling av et fibrinforseglingsmiddel fra fiskeblod. Helblod tas fra donorfisken og sentrifugeres for å skille blodceller fra plasma. Protrombin og fibrinogen ekstraheres fra dette plasmaet og protrombinet aktiveres til trombin. Fibrinogen- og trombinbestanddelene kombineres deretter etter behov for å danne fibrinforseglingsmiddelet.

Beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser belastningen som utvikles i løpet skjærdeformering av plasmaklumper som er adherent mellom to hudoverflater fra mus. Figur 2 viser en plott av lagringsskjærmodul mot deformasjon av fibrinogen renset fra frossen lakseplasma.

Figur 3 viser klumpeegenskaper av menneskelige og ørretfibrogener.

Figur 4 viser omdannelse av ørretfibrinogen til en tverrbundet fibrinklump ved hjelp av bovin trombin og endogen Faktor XHIa.

Det er funnet at blodet til domestiserte oppdrettsstammer av kaldtvann-fisker, spesielt salmonidene (laks og ørret), inneholder fibrinogen og trombinmengder som ligner det menneskelige blodet og disse levringsfaktorene kan ekstraheres fra blod fra laksefiskene ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Vi har vist at klonolater (fibrinforseglingsmidler) fremstilt fra polymerisering av laksefisk-ifbrinogen og trombin eller laksefiskifbrinogen og menneskelig trombin, har klonolatstyrke og elastisitet (figurene 1 og 2), leveringstider (figur 3), fibrinolytiske egenskaper og adhesjon til pattedyrvev som ligner de til klonolater fremstilt med i stor grad renset menneskelig fibrin.

Hele undersøkelsen ble utført med ørret ( Oncorhynchus mykiss) og/eller laks ( Salmo salar) plasma eller bestanddeler. Selv om det eneste rensede ørret- eller lakseproteinet som ble anvendt var fibrinogen, har vi vist effeten av endogen ørrettrombin og Faktor XHIa (figur 4). Bovin trombin ble anvendt for å bevise konseptet og for å vise kompatibiliteten av de fiske- og pattedyrslevirngsfaktorer.

En mengde på 2 mg/ml av ørretfibrinogen ble levret ved tilsats av 1 enhet/ml bovin trombin og 1 mMCa<2+> i overskudd av 5 mM EDTA tilsatt for å inhibere spontan plasmapolymerisering. De to banene til venstre viser høy (HMW, bane 1) og lav (LMW, bane 2) molekylvektstandard på en 10% SDS-polyakrylamidgel, sammen med molekylvektene (i 1000) av standardene. De tre båndene rundt 60 kDa i bane 4 er kjennetegnende for Aa, Bp og y-kjedede fibrogen. Et høyere molekylvektbånd tilsvarer fibronektin (FN) som er en forventet inneslutning av fibrinogenpreparater fremstilt ved ammoniumsulfat-presipitering.

Etter tilsats av trombin er flere egenskaper av forandringer som er typisk for fibrindannelse tydelig i bane 3. For det første øker mobiliteten av Aa- og Bp-kjeder ettersom A- og B-peptidene spaltes ved hjelp av trombin. For det andre forsvinner båndet som tilsvarer y-kjeden og et annet bånd med høyere molekylvekt som tilsvarer en kovalent ligert yr-dimer oppstår på grunn av aktiviteten av ørret-Faktor XHIa som korenses med fibrinogen og aktiveres ved hjelp av trombin. Polypeptider som ikke er del av fibrinogen, blir ikke forandret av trombin.

Styrken til fiskeforseglingsmiddelet ligner den til det menneskelig-bovine produktet som vist i figur 1. En viktig egenskap til fibringelet er at de deformasjonsherdes; dvs. de blir sterkere jo mer de deformeres opp til en grensedeformering som er typisk i størrelsesorden på 100%. Ved 100% deformering, det maksimale klinisk-realistiske nivået, viser fiske-, bovine og menneskelige geler lignende egenskaper når de undersøkes på musehud i en Rheometrics RFS-2 fluidspektrometer ved å anvende standard fremgangsmåter (Janmey et al., 1992). Adhesjon til musehuden var like sterk med alle tre geler.

Figur 2 viser at laksefiskefibrinogen polymerisert ved hjelp av bovin trombin danner koagulater (geler) med deformasjonsherding og nesten total elastisk gjenoppretting etter deformasjon som er karakteristisk for menneskelige fibringeler.

Den elastiske eller skjærmodulen GZ (forholdet mellom belastning og deformasjon) av koagulater (geler) fremstilt med ørretfibrinogen sammenlignes i figur 3 med disse fremstilt fra menneskelig fibrinogen. Begge viser lignende levringstider og resultatsmodulioverskudd av 10 Pa (100 dynes/cm<2>).

Fibrinolytiske egenskaper av den fiskeavledede gelen ble undersøkt ved tilsetning av menneskelig plasmin. Når det ble tilsatt 0,3 U/ml menneskelig plasmin til 2,5 mg/ml ørretfibrinogen, før tilsats av trombin, levret oppløsningen ikke, som vist ved hjelp av fraværet av en målbar elastisk modul. Når plasmin ble tilsatt øyeblikkelig etter trombin, skjedde polymerisering, men koagulatene ble mye svakere enn kontrollkoagulater fremstilt uten plasmin og oppløste seg kort etter geldannelse. Derfor er ørretfibrinogen et egnet substrat for menneskelig plasmin og bekymringer for at dens anvendelse kunne resultere i emboli- eller trombosekomplikasjoner elimineres.

Fordelene med de fiskeavledete substansene omfatter følgende:

A. Sikkerhet

Sikkerhetsfordelene ved å avlede bestanddelene av et fibrinforseglingsmiddel, fibrinogen og trombin, fra laksefiskeblod kan best forstås i sammenheng med evolusjonsbiologien til disse fiskene. Fiskene som en gruppe (phylum) er svært forskjellig fra pattedyr og som sådan har deres sykdomsorganismer utviklet seg i forskjellige retninger. Disse forskjellene eksemplifiseres i standard laboratoriefremgangsmåter i hvilke forskjellige fiskecellelinjer må anvendes for å rendyrke fiskevirus, som pattedyrcellelinje anvendes for pattedyrvirus (Wolfe, 1988). En annen forskjell er temperaturen. Hos kaldtvannsfisk, som laks eller ørret, er deres maksimale kroppstemperatur den samme som i vannet, i hvilket de lever - vanligvis mellom ca. 0°C og 18°C, en temperatur som befinner seg nesten 30°C under den til mennesker og de fleste andre pattedyr. Derfor har disse fiskene få, hvis noen som helst, smittsomme substanser som kan overleve hos mennesker. Disse er kun noen av manifestasjonene for den store evolusjonære avstanden mellom fisk og pattedyr som resulterer i sikkerhet med hensyn til smittsomme substanser.

B. Kildekontroll

Levringsfaktorer avledet fra menneskelig eller bovint blod kan være inkonsistent med hensyn til kvalitet på grunn av variasjoner i både genetikk og miljø hos giverne. I motsetning til dette er domestiserte oppdrettsfisk, som tjener som blodgivere, godt karakterisert med hensyn til kosthold, omgivelse, forplantningsstatus, livshistorie og genetisk bakgrunn. Graden av kontroll som akvakulturen formidler donordyrene, resulterer i forbedret enhetlighet av produktet. I motsetning til et autolog kryopresipitat, tilbyr pre-undersøkt laksefibrinogen konsistente konsentrasjoner og generelt større kvalitetskontroll.

C. Rask leveringstid

Levringstid (trombintid) for lakse- og ørretplasma ble målt ved hjelp av standard koagulering laboratorieteknikker ved å anvende bovin trombin. Sammenlignet med en "Human Reference Range" på 12 - 16 sekunder var den gjennomsnittlige laksetrombintiden 6,8 sekunder og ørrettrombintiden var 7,1 sekunder.

For anvendelser som trenger et fibrinforseglingsmiddel, kan den foreliggende oppfinnelsen, avledet fra fisk, anvendes med lignende virkning og fordeler med hensyn til sikkerhet, kvalitetskontroll og produktinnhold overfor de menneskelig/bovin-avledede fibrinforseglingsmidler som anvendes for tiden.

Prosessen begynner med de konsistente og reproduserbare betingelser i hvilke fisk oppdras. All fisk som anvendes som plasmakilder er fortrinnsvis 1) etterkommere av domestisert yngelstokk; 2) undersøkt med hensyn til fiskesykdommer under protokollene av den American Fisheries Society Blue Book; 3) 1 kg eller tyngre med hensyn til vekt; 4) foret med et kommersielt fremstilt pelletert for som er egnet for artene; og 5) holdt i vann som undersøkes og som er funnet fri for miljøforurensninger eller toksiner.

Kaldtvannsfiskene som anvendes som donorer er fortrinnsvis regnbueørret (0. mykiss) og atlantisk laks { S. salar). Disse artene er valgt på grunn av at de frembringes i stort antall og de enkle fiskene vokser seg store nok (over 1 kg) slik at man kan ta blod på en enkel måte. Andre kaldtvanns-oppdrettsfisk, som kveite eller torsk, kan anvendes som donorfisk og kan tilfredsstille alle de ovenfor nevnte kriteriene.

Fisken sultes fortrinnsvis i 24 timer for å redusere stressbehandling. Fisken anestiseres fortrinnsvis til et tap av refleksaktivitet i en oppløsning av "tricane" metansulfonat (MS-222) eller i karbondioksid som bobles gjennom vannet. Helblod tas deretter fra halevenen eller arterien fra fisken ved hjelp av kjente fremgangsmåter som anvendelse av nål og sprøyte, vakuumrør eller annet vakuumutstyr. Med alle disse utstyrene tilsettes en del av en IM oppløsning av natriumcitrat til ni deler av helblod som en antikoagulant.

Helblodet holdes ved ca. 1°C til 4°C i ikke lenger enn ca. 4 timer før sentrifugering. Separasjon av blodceller og plasma gjennomføres fortrinnsvis ved ca. 4°C og minst ca. 1000 g i ca. 10 minutter. Plasmaet kan deretter fryses, fortrinnsvis ved -20°C, eller ekstraheres øyeblikkelig.

Ekstraksjonsprosedyrer er fortrinnsvis kjente fremgangsmåter som vanligvis anvendes for bovin trombin og fibrinogen.

Ekstraksjon av protrombin utføres fortrinnsvis ved å først anvende en oppløsning av bariumklorid. 1 del av en 1 M oppløsning av kaldt (4°C) bariumklorid tilsettes til 11 deler plasma og røres i ca. 30 minutter. Blandingen sentrifugeres deretter ved ca. 3500 g i ca. 30 minutter og pelleten som inneholder protrombiner fryses, fortrinnsvis ved -20°C. Aktivering av protrombinet til trombin og etterfølgende ekstraksjonsrfemgangsmåte utføres fortrinnsvis med det tinte protrombin ifølge fremgangsmåtene av Ngai og Chang (1991).

Fibrinogen ekstraheres fra supernatanten ved å anvende arnmoniumsulfat-fremgangsmåtene beskrevet av Silver et al. (1995). En del av en mettet (4,5 M) oppløsning av ammoniumsulfat ved ca. 4°C tilsettes til 3 deler supernatant. Blandingen sentrifugeres, fortrinnsvis ved ca. 14.000 g ved ca. 4°C i ca. 8 minutter.

Fibrinogenet resuspenderes i Tris bufret saltoppløsning (pH 7,4) ved romtemperatur ved en konsentrasjon på 2,5 mg/ml. Trombinet reoppløses i 40 ml kalsiumklorid ved en konsentrasjon på 0,25 - 1 NIH enheter/ml. Kommersielt tilgjengelig bovint eller menneskelig trombin kan anvendes ved lignende konsentrasjoner med fiskefibirnogenet for å oppnå lignende resultater, men uten sikkerhetsgraden som tilveiebringes av fisketrombinet.

De to bestanddelene kan påføres såret eller lekkasjen simultant ved å anvende en kommersielt tilgjengelig dobbeltsprøyte eller sprøyte (spray) applikator.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et fibrinforseglingsmiddel, karakterisert ved at den innbefatter: å ta helblod fra donorfisk; å separere plasma fra helblodet; å ekstrahere fibrinogen fra plasmaet; å ekstrahere protrombin fra plasmaet; å aktivere protrombinet til trombin; og å kombinere trombinet og fibrinogenet for å danne fibrinforseglingsmiddelet.

2. Fibrinforseglingsmiddel, karakterisert ved at det innbefatter: trombin; og fibrinogen avledet fra fiskeblod.

3. Fibrinforseglingsmiddel ifølge krav 2, karakterisert v e d at trombinet avledes fra fiskeblod.