NO317699B1

NO317699B1 - Fremgangsmate for fremstilling av et proteinkonsentrat som er koagulerbar med trombin, og som inneholder for det meste fibrinogen, endogen faktor XIII og fibronektin.

Info

Publication number: NO317699B1
Application number: NO19963602A
Authority: NO
Inventors: Trung Bui-Khac; Lise Lavoie; Picq Dominique Michel St
Original assignee: Haemacure Corp
Priority date: 1993-02-23
Filing date: 1996-08-28
Publication date: 2004-12-06
Also published as: RU2130946C1; ES2135564T3; CA2113660A1; DK0748337T3; AU6151594A; NO963602D0; NO963602L; AU678439B2; ATE181738T1; DE69419324T2; WO1995023167A1; CA2113660C; EP0748337B1; JP3492694B2; JPH09509183A; US5395923A; EP0748337A1; DE69419324D1

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av. et proteinkonsentrat som er koagulerbar med trombin, og som inneholder for det meste fibrinogen, endogen faktor XIII og fibronektin.

Biologiske klebemidler representerer en ny tilnærmelse for kirurgier og suturer. Kirurger har lenge søkt etter et effektivt, lett anvendelig og fremfor alt lett tolererbart klebemiddel som kunne bli anvendt i tillegg til eller til erstatning for suturer. Kirurgiske suturer er for tiden viktige. Imidlertid opp-står en rekke problemer slik som intoleranse eller toksisitet.

Det første vevsklebemiddelet basert på syntetiske produkter fremkom i sekstiårene, og det var et klebemiddel av cyanoakrylatfamilien. Det er et . virkningsfullt klebemiddel, som polymeriserte i løpet av noen få sekunder, men dets anvendelse representerer én betydelig cellulær toksisitet. Andre syntetiske klebemidler av den samme familien med lengre radikaler innehar også hemostatiske, baktériostatiske og helende egenskaper, men de har også problemer med betennelsesreaksjoner, og vevstoksisitet er fremdeles betydelige. I 1967 ble formaldehyd-baserte klebemidler inneholdende gelatin, resorcin og formalin introdusert. De førte med seg visse forbedringer ved at de var mindre toksiske enn de tidligere klebemidler, men allergiske reaksjoner og vevstoksisitet forårsaket av formalin ble registrert.

Betennelsesreaksjoner, vevstoksisitet og allergier førte til avvisningen av disse klebemidler, som ikke var særlig biokompatible.

Av nevnte grunner er forskningen interessert i å utvikle et klebemiddel som kombinerer de følgende egenskapene: ' tilstrekkelig adhesivitet god elastisitet.

godt hold for tilstøtende vev

fravær av toksisitet

fravær av metabolisk virkning

god toleranse.

Blod, ved dets koagulerende egenskaper, har for kirurger alltid representert en ideell modell for biologisk liming.

Klebemiddeleffekten av blod som klumper seg, på grunn av dets nettverk av polymerisert fibrin, har vært kjent i lang tid. Fibrin har blitt anvendt siden begynnelsen av dette århundre som et klebemiddel. 1 1909 erkjente Bergel det som en fysiologisk limingssubstans og dessuten tilskrev den helende egenskaper. Denne oppdagelsen ble umiddelbart etterfulgt av Grey's arbeide som anvendte fibrintamponger for å stoppe hjerne- og leverblødninger. Allerede i 1944 anvendte Cronkite, og deretter Tidrick og Warner, fibrinogen sammen med trombin for å feste hudtransplantering. Men den lave konsentrasjonen av disse produkter gav ikke en god kvalitet på adhesjonen og heller ikke en varende effekt. Som et resultat av den viktige Vitenskapelige forskningen av E. J. Cohn på fraksjoneringen av plasmaproteiner, har koaguleringsproteiner særlig blitt anvendt siden 1946, og noen få år senere ble mekanismen ved koagulering og primære koaguleringsproteiner, især faktor XIII, belyst. 1 1975 var Matras den første til å anvende fibrinklebemiddelegenskaper gjennom høykonsentrert fibrinogen.

Den foreliggende oppfinnelsen angår fremstilling av et konsentrat som er rikt på fibrinogen og fibrinstabiliserende faktor (faktor XIII) enten fra humant eller animalsk hel plasma. Dette, konsentratet innehar alle de nødvendige egenskaper som kan føre til koagulering ved tilstedeværelse av trombin.

Som angitt i krav 1 angår den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et proteinkonsentrat som er koagulerbar med trombin, og som inneholder for det meste fibrinogen, endogen faktor XIII og fibronektin, som er kjennetegnet ved at den innbefatter følgende trinn: a) en første bunnfelling av hele plasmaproteiner ved tilsetningen av et salt i en tilstrekkelig mengde for å oppnå en utsaltning av proteinet og en pH mellom 7,5 og 8,5, idet bunnfellingen blir utført ved 0-4°C ved tilstedeværelse av en minimal konsentrasjon av 50 mM amino-6-heksansyre; b) en første oppløseliggj øring av de bunn felte proteinene ved tilstedeværelse av L-histidin til en sluttkonsentrasjon på mellom 0,2-0,3 g pr. gram proteiner; c) et viralt deaktiveringstrinn i en løsningsmiddel-vaskemiddel-oppløsning; d) en andre bunnfelling ved tilsetning av det samme saltet som i trinn a) ved den samme temperaturen ved tilstedeværelsen av den samme konsentrasjonen av amino-6-heksansyre; e) vasking av bunnfallet med svakt surt, rent vann; f) en andre oppløseliggjøring av bunnfallet ved tilstedeværelse av L-histidin som i trinn b); g) en tilsetning av 50% sakkarose med hensyn på mengden av proteiner; h) en steril filtrering;

i) en porsjonering av det sterile filtrerte konsentratet i sterile kolber; og

j) en lyofilisering.

På grunn av dets koagulerende egenskaper, får klinikere med dette konsentratet et verdifullt og effektivt verktøy for kirurgi, idet hemostatiské egenskaper i stor. grad er etterspurt. Områdene for kliniske anvendelser kan være: neurokirurgi, kardiovaskulær kirurgi, plastisk kirurgi (hudtransplantasjon), ORL-kirurgi, stomatologi, ortopediske kirurgi, generell kirurgi og traumato-logi.

Det primære proteinet i dette konsentratet er fibrinogen som gjennom en enzymatisk reaksjon ved tilstedeværelse av trombin og kalsiumioner produserer fibrinopeptider A og B som muliggjør dannelsen av fibrin-monomerer. Disse monomerer polymeriserer raskt og blir oppløselig fibrin. Den fibrinstabiliserende faktoren under virkningen av kalsiumioner danner så kovalente bindinger med det oppløste fibrinet som gjør det stabilt og uopp-løselig i et syremedium eller ved tilstedeværelse av urea.

Det således dannede fibrinet er irreversibelt, stabilt og utfører fullstendig sin rolle som koagulant. Den motstår fibrinolyse på grunn av dets høye konsentrasjon og beholder sin form som et resultat av fraværet av eksudasjon. Dette konsentratet har de følgende karakteristikkene: utmerket stabilitet etter at det har blitt oppløst igjen i en vandig oppløsning, oppløselighet ved romtemperatur innen noen minutter, god elastisitet og en god adhesjon.

Disse karakteirstikkene avhenger bare av fremgangsmåten for fremstilling fra plasma. Dette er en enkel, rask fremgangsmåte som lett kan tilpasses industriell produksjon. Alle de konsentratbiologiske og biokjemiske egenskapene bevares, og produktet imøtekommer klinikernes krav.

Det er allerede beskrevet biologiske klebemidler i CA patent 1 128 859 og

1 245 154 som inneholder fibrinogen og faktor XIII. Disse klebemidlene er laget fra et plasmakryobunnfall ved +2°C. Dette kryobunnfallet behandles så med en buffer som inneholder en plasminogen aktivator-inhibitor eller en plasmininhibitor som forblir i sluttproduktet. Disse produktene viser interes-sante karakteirstikker, men deres fremgangsmåte for produksjon er heller . kompleks og krever supplement av inhibitorer, slik som proteaseinhibitorer fra animalske kilder, f.eks. aprotinin, og plasmaproteiner fra human kilde,

f.eks. albumin, under fremstillingen.

Produktene som blir fremstilt ifølge disse ovennevnte patenter er dessuten oppløselige verken i vandig oppløsning eller ved romtemperatur. De er oppløselige ved 3 7°C under mekanisk røring med en trykkmagnet innført i kolben før lyofilisering. Til tross for den høye temperaturen og ekstra utstyr,

tar det imidlertid for disse produktene mer enn 30 min for oppnåelse av en homogen oppløsning.

En annen fremgangsmåte for fremstilling for biologisk klebemiddel er beskrevet i EP-Bl-0 305 243. Det fremstilles ved bunnfelling av koaguleringsproteiner i fortynnet etylalkohol ved å starte med helt plasma. Dette produktet har mye bedre karakteristikker enn de foregående

produktene. Dette produktet føres tilbake til oppløsningen ved romtemperatur i mindre enn 10 min, som imøtekommer ett av klinikernes krav. Til tross for denne fordelen, synes fremstillingen av produktet å være for lang fordi innføringen av etahol i plasma fører til en sedimenteringsperiode på 12-24 timer for proteinene. Dette hindrer prosessering på en kontinuerlig basis som ofte forventes i industrien. En tredje fremgangsmåte for fremstilling av biologisk klebemiddel som er utviklet i Tyskland, er beskrevet i DE Al 36 22 642. Dette klebemiddelet, som er lik det beskrevet i de ovennevnte patenter, har fordelen av å være raskt oppløselig i vandig oppløsning ved romtemperatur, men dets måte for fremstilling omfatter fremdeles supplementet av proteaseinhibitorer, albumin, protrombin og antitrombin.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen må konsentratet bli utsatt for virus-inaktivering ved blanding med løsningsmiddel og et vaskemiddel for å ødelegge patogeniske viruser slik som hepatitt- og AIDS-virus. Sluttproduktet oppnådd ved den beskrevne fremgangsmåten gjennomgår ingen modifikasjon i dets struktur eller biologiske aktivitet. Disse produkt-karakteristikkene er relatert til dets utførelse i oppløseliggjøring og stabilitet som gir den et stort anvendelsesområde.

Konsentratet oppløses i mindre enn 10 min ved romtemperatur uten bruk av noe spesielt utstyr. Den er stabil i flere timer etter dets oppløsning.

Det er også utviklet en prosess som både er original og veldig enkel for oppnåelse av et proteinkonsentrat som er koagulerbar ved tilstedeværelsen av trombin ved ganske enkelt et kaldt "utsaltnings"trinn ved en svak basisk pH.

Fremgangsmåten gir mer enn 85% av koagulerbar fibrinogen ut av det totale proteinet som er tilstede i konsentratet, en viktig kvantitet av fibrinstabiliseringsfaktor (faktor XIII), en tilfredsstillende mengde av fibronektin, og fremfor alt muliggjør det eliminering av plasminogen, et proenzym kjent for dets fibrinolytiske egenskaper. Plasminogen, hvis det er tilstede, vil ha en uheldig effekt på produktet.

Oppfinnelsen består i fremstilling av et konsentrat som er rikt på proteiner som er koagulerbare med trombin. Dette konsentratet oppnås ved bunnfelling med et salt (f.eks. et acetatsalt) ved å starte med human eller animalisk plasma. Bunnfallet inneholder mer enn 85 vektprosent av koagulerbar fibrinogen og også faktor XIII som bunnfelles sammen med fibrinogenet. Denne faktor XIII er tilstede ved en konsentrasjon på minst 300-400 IU pr. gram protein (eller 300-350 IU/g fibrinogen); Dette konsentratet, i motsetning til det som for tiden er kommersialisert, oppløses raskt i en vandig oppløsning ved romtemperatur i løpet av mindre enn 10 min og har et proteiniiinhold på opptil 150 mg/ml. Det forblir imidlertid stabilt i 24 timer etter dets rekonstitusjon ved en temperatur mellom 4 og 37°C. Konsentratet inneholder også en balansert mengde av fibronektin i området 0,06 ± 0,02 g pr. gram protein. Konsentratet ifølge oppfinnelsen oppnås ved en fremgangsmåte som innbefatter et trinn for bunnfelling av hel plasma av et salt ved en tilstrekkelig konsentrasjon for oppnåelse av utsaltningsprosessen ved en pH som ligger mellom 7.5 og 8.5, ved tilstedeværelse av amino-6-heksansyre og en temperatur i området 0-4°C. Ingen særlige forholdsregler er nødvendige, og koagulerbare proteiner bunnfeller raskt og fullstendig og ikke etter mange timer eller til og med noen dager, som er tilfelle for de eksisterende patenter. Tilsetningen av amino-6-heksansyre opphever affiniteten av plasminogen i forhold til fibrinogen og gjør at disse to proteinene lett kan separeres fra hverandre.

Denne fremgangsmåten kan tilpasses industriell produksjon med en betydelig tidsbesparelse og kontinuerlig prosessering. Hele plasmaet bringes i kontakt med saltet ved en minimal konsentrasjon på ca. 0,5 M pr. liter plasma ved tilstedeværelsen av en minimal konsentrasjon av 50 mM amino-6-heksansyre. Koagulerbare proteiner bunnfeller, under røring, på noen få minutter. Tiden for bunnfellingen bør ideelt sett være minst 30 min for å muliggjøre maksimal utvinning. Den resterende oppløsningen separeres ved sentrifugering og kan bli anvendt for å fremstille andre plasmaproteiner.

Etter sentrifugering føres bunnfallet tilbake til oppløsningen i en tris-natrium-citrat-buffer. Proteinkonsentrasjonen er da 20-30 mg pr. ml oppløsning. pH tilpasses ved tilsetningen av L-histidin. Denne oppløsningen utsettes så for en prosess ved hjelp av inaktiveringen av patogen virus slik som de fra AIDS og hepatitt, og en slik prosess er blitt beskrevet i US patenter 4 540 573, 4 764 363 og 4 820 805. Dette består i en løsnings-middel-vaskemiddelbehandling ved 28°C i løpet av 6 timer ved varsom røring. Proteinirtnholdet er da mellom 10 og 15 mg/ml. De organiske produktene som ble anvendt for å inaktivere virusene separeres under proteinbunnfelling av salter og amino-6-heksansyre. De elimineres så ved sentrifugering, og den supernatante oppløsningen inneholder organiske produkter samt kontaminerende proteiner slik som albumin og immunoglobuliner. Det oppnådde bunnfallet etter dette trinnet vaskes grundig med svakt surt, rent vann.

Vaskingene eliminerer også rester av kjemikalier, kontaminerende proteiner og salter, slik som citrat som uheldig innvirker på koaguleringseffektiviteten.

Sluttbunnfallet føres tilbake til oppløsningen i en buffer inneholdende tris og L-histidin. Til slutt filtreres proteinoppløsningen, og den steriliseres så ved filtrering. Den sterile oppløsningen føres til kolber ved betingelser for absolutt sterilitet. Disse kolbene utsettes for en 48-timérs lyofilisering.

De følgende eksemplene vil beskrive prosessen for fremstillingen av konsentratet ifølge oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Frisk plasma som er fryst til under -35°C avises raskt ved 37°C. og inkuberes så ved denne temperaturen i minst 15 min ved tilstedeværelse av en minimal konsentrasjon av 50 mM amino-6-heksansyre, og kjøles så til mellom 0 og 4°C. Natrium- eller kaliumacetat tilsettes den tidligere kjølte plasmaen ved hastigheten på 1 mol pr. liter plasma. Dette omrøres kontinuerlig i 1 time mellom 0 og 4°C og blir sentrifugert ved 3700 opm (JS 4,2 rotortypé;

Beckman J6-MC sentrifuge) ved 4°C i løpet av 20 min. Det oppnådde bunnfallet som er rikt på fibrinogen og faktor XIII, overføres til et kar som inneholder en 1% trisroppløsnmg og 1,6% natriumcitrat med pH på 7,30. Bunnfallet oppløses ved romtemperatur ved magnetisk røring. Bufferen som er beskrevet ovenfor tilsettes etter behov for å få en proteinkonsentrasjon på 20-22 mg/ml. Ved dette punktet tilsettes L-histidin ved hastighet på 0,2-0,3 g pr. gram protein. Proteinoppløsningen føres så gjennom filteret med en . porøsitet på 0,8 mikron. Oppløsningen som således blir filtrert utsettes for en virusinaktiveringsbehandling ved blanding med et likt volum av en oppløs-ning som inneholder 1% tris, 1,6% natriumcitrat (pH 7,3), 2% polyoksyetylen-sorbitan-monooleat (Tween 80®) og 0,6% tri-n-butyl-fosfat (TNBP).

Dette bringer sluttkonsentrasjonen til ca. 10 mg/ml proteiner, 1% polyoksyetylen-sorbitan-monooleat (Tween 80®) bg 0,3% TNBP. Oppløsningen inkuberes ved 28°C under konstant røring i et tidsrom på 6 timer. Etter virusinaktiveringsbehandlingen kjøles proteinoppløsningen mellom 0 og 4°C, og så, under minimal røring, tilsettes 50 mM amino-6-heksansyre. En mengde av acetatekvivalent til ett mol tilsettes, og bunnfallet kommer umiddelbart til syne. "

Omrøring fortsetter i 1 time mellom 0 og 4°C. Løsningsmiddelet, vaskemid-delet og de kontaminerende proteinene elimineres ved sentrifugering. Bunnfallet utvinnes og vaskes flere ganger med en 0,1% oppløsning (pH 4,5-5,0) inntil en nøytral pH oppnås. Antallet vasketrinn kan reduseres ved å utføre en enkel dialyse eller en diafiltrering etter at bunnfallet er ført tilbake til oppløsning i en 0,5% tris (pH 7,30).

Det vaskede bunnfallet oppløses i en 0,5% tris-oppløsning. Etter fullstendig oppløsning justeres oppløsningens pH og osmolaritet. pH bringes til 7,30-7,50. Sluttkonsentrasjonen for proteinet er 30-36 mg/ml av oppløsnin-gen. En mengde av L-histidin, som tilsvarer 0,2-0,3 g pr. gram proteiner, tilsettes og en mengde av sakkaroseekvivalent med 50% (w/w) med hensyn på protein. Sluttoppløsningen av proteinet filtreres og pakkes under sterile betingelser, og den lyofiliseres så i 48 timer.

EKSEMPEL 2

Det lyofiliserte produktet som ble oppnådd ved denne fremgangsmåten har blitt rekonstituert med 1 ml for hver ampulle destillert vann og analysert biokjemisk.

Resultatene for disse analysene.gjør det mulig å bestemme blandingen og kvaliteten av konsentratet ifølge den foreliggende oppfinnelsen som et biologisk klebemiddel.

A. - Biokjemisk analyse ( eksempel 1) :

Konsentratproteininnholdet er som følger:

koagulerbar fibrinogen (målt ved gravimetri): 95-105 mg/ml faktor XIII endogen: 35-40 Ul/ml

fibronektin: 4-6 rag/ml

plasminogen: 0,010-0,015 mg/ml albumin: 0,10-0,20 mg/ml

immunoglobuliner: lg A: 0,20-0,30 mg/ml

IgG: 0,50-0,60 mg/ml

lg M: 0,20-0,30 mg/ml

Som tidligere angitt karakteriseres konsentratet fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen ved dets utmerkede oppløsning og stabilitet. Den føres tilbake til oppløsning ved mindre enn 5 min ved romtemperatur (20-25°C) ved bare manuell røring.. Det velges å anvende rent vann-som et løsningsmid-. del for produktet, fordi det representerer åpenbare fordeler for den biokjemiske analysen. Ikke desto mindre er det lik de andre foreliggende kommersialiserte produktene, at det umiddelbare konsentratet bør bli rekonstituert i en oppløsning av aprotinin for å unngå fibrinolyse når det er i kontakt med legemsdeler, hvor slik fibrinolyse kompromitterer stabiliteten for klebemiddelet.

Det er ikke observert noen nedbrytning eller destabilisering av produktet rekonstituert i rent vann ved 4°C eller 20°C i et tidsrom som kunne bli strukket over 24 timer, og dette antyder at konsentratet er proteasefritt.

Etter rekonstitusjon i vann blandes fibrinogenet til en oppløsning av trombin ved tilstedeværelse av kalsiumklorid. Det således dannede fibrinet er fullstendig fritt for eksudasjon.

B. - Styrkeanalyse:

Klebemiddeleffekten bestemt på dyr ved liming av hudstykker av mus er over 200 g/cm<3>. Denne klebemiddeleffekten har også blitt vist ved liming av to stykker gas, og denne testen er beskrevet i det etterfølgende. Produktet er fullstendig stabilt i 24 timer ved en holdetemperatur på 4°C eller 20°C. Klebemiddeleffekten bestemt ved denne teknikken er 350 ± 20 g/cm3 etter 10 minutters kontakt ved et trykk på 1 kg for en blanding av 0,050 ml protein-oppløsning, 0,050 ml bovintrombin (100 IU/ml i 40 mM kalsiumklorid). En test etter en 24-timers holdeperiode viser at klebemiddeleffekten forblir uendret.

C. - Evaluering av biokompabilitet:

Evalueringen av biokompabiliteten av det umiddelbare klebemiddelet ble utført in vitro ved anvendelse av dyrkede celler. Denne evalueringen ble rettet mot cytotoksisitet og cytokompabilitet (cellulær proliferasjon, DNA-syntese, etc).

De dyrkede celletestene var Balb 3T3 celler og/eller humane hudfibroblaster. Cytotoksisiteten ble målt ved innarbeidelsen av nøytralt rødt. Når de er i live impregneres cellene med dette fargestoffet som festes til celleliposomer. Når de er døde, tar ikke cellene opp fargestoffet. Dosering av fargestoffet gjøres etter 72 timers kontakt med cellene. Evalueringen av cellenes levedyktighet kan også bli utført ved mikroskopisk observasjon (under canadisk standard CAN 3-Z310.6-M 84) eller ved celletellinger.

Klebemiddelet er ikke cytotoksisk under de beskrevne betingelsene. Det har en økende effekt på cellulær tetthet (45% for fibroblaster og 124% for Balb 3T3-celler).

Rask oppløseliggjøring, stor stabilitet i oppløsning og fravær av eksudasjon er de primære karakteristikkene for konsentratet ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Disse karakteirstikkene gir det stor fleksibilitet: tidsbesparelse, rask oppløs-ning, variable temperaturer og anvendelse over et forlenget tidsrom. Disse utførelsene viser produktets tilpasning til hindringer som kirurger støter på i operasjonssaler.

Disse konsentrater av protein som ér rik på fibrinogen og faktor XIII fremstilt for terapeutisk anvendelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen, kan bli oppnådd fra human eller animalsk plasma og vil derfor være anvendelig enten i medisinske eller veterinære praksiser.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et proteinkonsentrat som er koagulerbar med trombin, og som inneholder for det meste fibrinogen, endogen faktor XIII og fibronektin, karakterisert ved at den innbefatter følgende trinn: a) en første bunnfelling av hele plasmaproteiner ved tilsetningen av et salt i en tilstrekkelig mengde for å oppnå en utsaltning av proteinet og en pH mellom 7,5 og 8,5, idet bunnfellingen blir utført ved 0-4°C ved tilstedeværelse av en minimal konsentrasjon av 50 mM amino-6-hek-sansyre; b) en første oppløseliggjøring av de bunnfelte proteinene ved tilstedeværelse av L-histidin til en sluttkonsentrasjon på mellom 0,2-0,3 g pr. gram proteiner; c) et viralt deåktiveringstrinn i en løsningsmiddel-vaskemiddeloppløs-ning; d) en andre bunnfelling ved tilsetning av det samme saltet som i trinn a) ved den samme temperaturen ved tilstedeværelsen av den samme konsentrasjonen av amino-6-heksansyre; e) vasking av bunnfallet med svakt surt, rent vann; f) en andre oppløseliggj øring av bunnfallet ved tilstedeværelse av L-histidin som i trinn b); g) en tilsetning av 50% sakkarose med hensyn på mengden av proteiner; h) en steril filtrering; i) en porsjonering av det sterile filtrerte konsentratet i sterile kolber; og j) en lyofilisering.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at saltet er natrium- eller kaliumacetat.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de første og andre bunnfellingstrinnené ut-føres i et tidsrom på minst 30 minutter.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinn e) utføres ved 2°C med vann kjølt ned , til2°C.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved trinnene a), d) og e) utføres i minst 30 minutter.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinn e) etterfølges av en oppløseliggj øring av bunnfallet i et svakt basisk, rent vann, og en dialyse eller en diafiltrering. ■

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det svakt sure, rene vannet er en oppløsning av tris-HCl 0,1% med pH 4,50-5,0.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det svakt basiske, rene vannet anvendt for oppløseliggj øring av bunnfallet før dialyse eller diafiltrering er en oppløsning av tris 0,5% med pH 7,3.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den første oppløseliggj øringen gjøres i 1% tris og 1,6% natriumcitrat med pH 7,30 for å bringe proteinkonsentrasjonen til 20-22 mg/ml før tilsetning av L-histidin.

10. Fremgangsmåte ifølge .krav 1, karakterisert ved at den andre oppløseliggj øringen gjøres i tris 0,5% med pH 7,30 for å bringe proteinkonsentrasjonen til 30-35 mg/ml før tilsetning av L-histidin.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den virale deaktiveringen utføres ved 28°C i løpet av 6 timer under kontinuerlig røring i en oppløsning som består av 10 mg/ml oppløseliggjorte proteiner, 1% polyoksyetylen-sorbitan-monooleat og 0,3% tri-n-butyl-fosfat.

12. ' Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det lyofiliserte konsentratet oppløselig-gj øres i vann ved mindre enn 5 min ved romtemperatur under manuell røring.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at det oppløste konsentratet er stabilt ved en temperatur på 4-20°C i minst 24 timer.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at plasmaet er av human eller animalisk opp-rinnelse.