JPH09509183A - フィブリノーゲン、ｘｉｉｉ因子及びフィブロネクチンを含んで成る生物学的接着剤の獲得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は全ヒト又は動物血漿から出発して凝固性タンパク質の濃縮物を作製する方法に関する。この濃縮物はトロンビンと即時的に混合すると生物接着剤として使用される。この濃縮タンパク質は主としてフィブリノーゲン、フィブリン安定化因子（XIII因子）及びフィブロネクチンを含む。請求の範囲の方法は、優れた凝固性タンパク質収率を供しながらも、短時間での実施の利点を有する。この方法の際にプロテアーゼインヒビターは加えない。この方法は、所望の凝固性タンパク質によるプラスミノーゲンの同時沈殿を妨げるアミノ−６ ヘキサノン酸の存在下で「塩析」による分離工程を含む。このようにして得たタンパク質は、水の中での再構成を経て、室温又は体温で少なくとも24時間にわたり、非常に安定である。トロンビン及びカルシウムと混合すると、この接着剤は優れた強度及び生体適合性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】 フィブリノーゲン、XIII因子及びフィブロネクチンを含んで成る生物学的接着剤 の獲得方法 発明の分野 生物学的接着剤は、外科手術及び縫合への新たなアプローチを紹介する。外科 医は、縫合に代って又はそれに追加して使用されることができるであろう、有効 、使用し易く、そしてとりわけ容易に許容される接着剤を長い間探し求めてきた 。外科縫合は、今日、重要である。しかしながら、多くの問題、例えば、非許容 性又は毒性が生じている。 合成製品に基づく最初の組織接着剤は、60年代に現れた；それは、シアノアク リレート・ファミリーの接着剤であった。それは、強力な接着剤であり、数秒以 内に重合するが；その使用は、かなりの細胞毒性を提示した。より長い基をもつ 同一ファミリーの他の合成接着剤も、止血、静菌及び治瘉特性を有しているが、 それらも、未だかなりのものである炎症反応及び組織毒性を示す。1967年に、ゼ ラチン、レゾルシン及びホルマリンを含むホルムアルデヒド−ベースの接着剤が 紹介された。それらは、特別な改良−従来のものよりも低い毒性−をもたらした が、ホルマリンにより引き起こされるアレルギー反応及び組織毒性が記録された 。 炎症反応、組織毒性及びアレルギーは、まさに生物学的適合性の接着剤でない ものからの拒絶を導く。 これらのさまざまな理由のために、以下の特性を併せ持つ接着剤の開発のため の研究が進行中である： −十分な接着性 −良好な弾性 −隣接組織上での良好な保持 −毒性の非存在 −代識作用の非存在 −良好な許容性。 血液は、その凝固特性を通じて、常に、生物学的糊の理想的なモデルを外科医 に提示する。 その重合したフィブリンのネットワークによる血塊の接着力が、長年にわたり 知られてきた。フィブリンは、接着剤として今世紀の初頭以降使用されてきた。 199年に、Bergelは、生理学的糊物質としてそれを認識し、そしてその上その治 瘉特性を規定した。この発見は、直ちにGreyの研究に承継され、彼は、脳及び肝 臓の出血を止めるためにフィブリン・タンポンを使用した。しかしながら、1944 年において、Cronkite、次にTridrick及びWarnerが皮膚移植片を固定するために トロンビンと一緒にフィブリノーゲンを使用しただけである。これらの製品の低 い濃度は、良い品質の接着性を許容しないばかりか持続効果も許容しなかった。 1946年以降、血漿タンパク質の分画についてのE.J.Cohnによる重要な科学的研究 のために、特に血液凝固タンパク質が使用され、そして数年後、血液凝固のメカ ニズム及び主要な血液凝固タンパク質、特に第XIII因子が解明された。 1975年に、Matrasは、高濃度フィブリノーゲンを通じてのフィブリン接着剤を 最初に使用した。 説明 本発明は、ヒト又は動物全血漿のいずれかからフィブリン及びフィブリン安定 化因子（XIII因子）に富む濃縮物を調製することにあ る。この濃縮物は、トロンビンの存在中血液凝固を導くのに必要な特性の全てを 有している。以下に記載する方法は、治療目的のためのこの濃縮物の調製及び使 用方法である。 その血液凝固特性のために、この濃縮物は、臨床医に止血特性が高く必要とさ れる外科手術のための貴重かつ有効なツールを提供する。臨床適用の分野は：神 経外科、心臓血管手術、形成外科（皮膚移植）、ORL手術、口腔病学、整形外科 手術、一般外科手術及外傷学であることができる。 本濃縮物中の主要タンパク質は、トロンビンとカルシウム・イオンの存在中で の酵素反応を通じて、フィブリン・モノマーの形成を許容するフィブリノペプチ ドＡとＢを作り出すフィブリノーゲンである。これらのモノマーは、直ちに重合 し、そして可溶性フィブリンになる。次に、カルシウム・イオンの媒介によりフ ィブリン安定化因子がその溶解したフィブリンと共有結合を形成し、これが、そ れを、酸媒体又は尿素の存在中で安定、かつ、不溶性にする。 このように形成されたフィブリンは、不可逆、安定性であり、そして血液凝固 剤としてその役割を十分に演じる。その高い濃度のためにそれは、フィブリン溶 解現象に抵抗し、そして滲出の非存在の結果としてその形状を維持する。本濃縮 物は以下の特徴：水溶液中に再溶解された後の優れた安定性、数分間以内での室 温における溶解、良好な弾性、そして最後に、良好な接着性、をもつ。 これらの特徴は、血漿から調製方法にのみ依存する。これは、工業的生産に容 易に改良されることができる簡単、迅速な方法である。本濃縮物の生物学的及び 生物化学的特性の全ては、保存され、そしてその製品は、臨床医の要求を満たす 。 フィブリノーゲン及びXIII因子を含むカナダ特許第 1,128,859号及び第 1,245 ,154号中に生物学的接着剤が既に記載されている。こ れらの接着剤は、＋２℃における血漿の低温沈澱から作られる。次にこの低温沈 澱物は、その最終製品中に残存するプラスミノーゲン・アクチベーター−阻害剤 又はプラスミン阻害剤を含むバッファーにより処理される。これらの製品は、興 味深い特徴を示す。しかしながら、それらの製造方法は、製造の間、むしろ複雑 であり、そして阻害剤、例えば、動物源からのプロテアーゼ阻害剤、例えば、ア プロチニン、及びヒト源からの血漿タンパク質、例えば、アルブミンの随伴を必 要とする。 その上、上述の特許に従って製造された製品は、水性溶液中で不溶であるばか りでなく室温においても不溶である。それらは、凍結乾燥前にフラスコ内に導入 されたマグネット・バーによる機械的撹拌下、37℃において可溶である。しかし ながら、この高温及び余計な装置にも拘らず、それらの製品は、均質な溶液を得 るのに30分以上もかかる。 生物学的接着剤のための他の製造方法は、欧州特許第0,305,243B1中に記載さ れている。それは、全血漿から出発した希釈エチル・アルコール中での血液凝固 タンパク質の沈澱により調製される。この製品は、先行のものよりもかなり良好 な特性をもつ。この製品は、10分以内に室温において溶液中に戻され、これは、 臨床医の要求を満たす。この利点にも拘らず、その製品の製造は、あまりに長い ようである。なぜなら、血漿中へのエタノールの導入が、それらのタンパク質に ついての12〜24時間の沈降期間を導くからである。これは、本産業においてしば しば期待される連続基準に基づく加工を妨害する。ドイツにおいて開発された生 物学的接着剤の第３の製造方法は、特許 DE 3,622,642 A1中に記載されている。 上述の特許中に記載されたものと類似のこの接着剤は、室温において水性溶液中 に直ちに溶解されるという利点をもつが、その製造方法は、未だ、 プロテアーゼ、アルブミン、プロトロンビン及びアンチトロンビンの随伴を含む 。 本発明に従って、本濃縮物は、病原体ウィルス、例えば、肝炎及びAIDSウィル スを破壊するために溶媒及び洗剤と混合することによりウィルス失活化に供され なければならない。上記方法により得られた最終製品は、その構造又は生物学的 活性における変更を全く経験しない。 これらの製品の特徴は、それに広いレンジの用途を与える溶解度及び安定性に おけるその性能に関する。 本濃縮物は、特別な装置のいずれをも伴わずに室温において10分未満において 溶解する。それは、その溶解後数時間にわたり安定である。 本発明者は、単に僅かに塩基性のpHにおける２分“塩析”段階を通じて、トロ ンビンの存在中で凝固することができるタンパク質濃縮物を得るためのオリジナ ル、かつ、ひじょうに簡単な方法をも開発した。 本法は、本濃縮物中に存在する全タンパク質から85％を上廻る血液凝固フィブ リノーゲン、重要量のフィブリン可溶化因子（XIII因子）、満足量のフィブロネ クチンを産出し、そして、とりわけ、それは、プラスミノーゲン、すなわち、そ のフィブリン溶解現象特性について知られているプロ酵素、の削除を許容する。 プラスミノーゲンは、それが存在する場合、本製品に対し有害な効果を作り出す であろう。 本発明はトロンビンにより凝固性であるタンパク質の濃厚な濃縮物を調製する ことより成る。この濃縮物はヒト又は動物の血漿から出発して塩（例えば酢酸塩 ）による沈殿により得られる。この沈殿物は85重量％より多くの凝固性フィブリ ノーゲン及びフィブリノー ゲンと一緒に沈殿するXIII因子を含む。このXIII因子はタンパク質のグラム当り 少なくとも300〜400 IUの濃度（又は300〜350 IU／ｇフィブリノーゲン）で存在 する。この濃縮物は、現状市販されているものと異なり、10分以内で室温におい て水性溶液の中で迅速に溶解し、そて150mg／mlまでのタンパク質含有量を有す る。更に、それは再構成した後、４〜37℃の温度で少なくとも24時間安定であり 続ける。この濃縮物は、タンパク質のグラム当り0.06±0.02ｇの範囲におけるバ ランス量のフィブロネクチンも含む。この濃縮物は、本発明に従って、全血漿の 、塩析工程を成し遂げるのに十分な濃度で塩による、7.50〜8.50のpH、アミノ− ６ ヘキサノン酸の存在下及び０〜４℃の温度においての沈殿の工程を含んで成 る方法により得られる。特別な用心は必要なく、凝固性タンパク質は迅速、且つ 完全に沈殿し、従来の特許のように数時間又は数日かかることはない。アミノ− ６ ヘキサノン酸の添加はフィブリノーゲンに対するプラスミノーゲンの親和性 を失わせ、そしてこれら２種のタンパク質が溶易に分離できるようにする。 この方法はかなりの時間の節約を伴う工業的生産及び連続プロセスに適用でき る。 全血漿を50mMの最少濃度のアミノ−６ ヘキサノン酸の存在下で血漿１リット ル当り約0.5Ｍの最少濃度の塩と接触させる。凝固性タンパク質は撹拌のもとで 数分以内に沈殿する。沈殿時間は理想的には最高の回収のために少なくとも30分 とすべきである。残留溶液は遠心により分離し、そしてその他の血漿タンパク質 の調製に利用できうる。 遠心後、その沈殿物をトリス−クエン酸ナトリウムバッファーの溶液に入れも どす。タンパク質濃度は溶液１ml当り約20〜30mgとする。このpHをＬ−ヒスチジ ンの添加により調整する。この溶液を、 病原性ウィルス、例えばAIDS及び肝炎のそれの不活性化を狙いとするプロセスに 委ねる。そのプロセスは米国特許第 4,540,573、4,764,363及び4,820,805号に記 載されている。これはゆっくりとした撹拌のもとでの６時間にわたる28℃での溶 媒−界面活性剤処理に相当する。タンパク質濃度は10〜15mg／mlとなる。ウィル スを不活性化するのに用いる有機製品は塩及びアミノ−６ ヘキサン酸によるタ ンパク質沈殿の際に分離する。これらを遠心により排除する。上清液は有機製品 並びに夾雑タンパク質、例えばアルブミン及びイムノグロブリンを含む。この工 程を経て得られる沈殿物を若干酸性の純水により徹底的に洗う。 洗浄は残留化学品、夾雑タンパク質、及び塩、例えば凝固効率に有害な影響を 及ぼすクエン酸塩をも排除する。 最終沈殿物をトリス及びＬ−ヒスチジンを含むバッファー溶液に入れもどす。 最後に、このタンパク質溶液を濾過し、次いで濾過除菌する。その除菌溶液を完 全無菌条件下でフラスコに入れる。これらのフラスコを48時間の凍結乾燥にかけ る。 以下の実施例には本発明に係る濃縮物の調製のためのプロセスがより簡単に記 載してある。 実施例１ −35℃未満に凍結させた新しい血漿を37℃に迅速に解凍した後、最小限の濃度 の50mMのアミノ−６ ヘキサン酸の存在中で少くとも15分間、この温度でインキ ュベートし、その後、０°〜４℃に冷却する。酢酸ナトリウム又は酢酸カリウム を事前冷却された血漿に血漿のリッター当り１モルの割合で添加する。これを０ °〜４℃で１時間、継続的に撹拌し、20分間、４℃で3700RPMで遠心する（JS 4. 2 ロータータイプ：ベックマン J6-MC遠心機）。フィブリノーゲン及び因子XIII の豊富な得られた沈殿をpH7.30の１％トリス溶液及び 1.6％クエン酸ナトリウムを含む容器に移す。この沈殿物を磁気撹拌下において 室温で可溶化する。約20〜22mg／mlのタンパク質濃度を得るのに必要なだけ上述 の緩衝液を添加する。この時点において、タンパク質のグラム当り0.2〜0.3ｇの 割合でＬ−ヒスチジンを添加する。その後、このタンパク質溶液0.8ミクロンの 多孔度を有するフィルターに通す。このフィルターにかけられた溶液を、１％ び0.6％トリ−ｎ−ブチル−ホスフェート（TNBP）を含む等量の溶液と混合する ことにより、ウィルス不活性化処理する。 これは、約10mg／mlタンパク質、１％Tween 80及び0.3％TNBPの最終濃度とな る。この溶液を６時間、一定の撹拌下で28℃でインキュベートする。ウィルス不 活性化処理の後、タンパク質溶液を０°〜４℃に冷却し、その後最小限の撹拌下 において、50mMアミノ−６ ヘキサン酸を添加する。１モル当量の酢酸の量を添 加して、沈殿を瞬間時に発生させる。 撹拌を０°〜４℃で１時間、継続する。溶媒、界面活性剤及び汚染しているタ ンパク質を遠心により除去する。この沈殿物を回収して、中性pHとなるまで0.1 ％トリス溶液（pH4.50〜5.0）で数回洗浄する。0.5％トリス（pH7.30）の溶液に この沈殿物をもどした後に簡単な透析又は濾過を行うことにより洗浄ステップの 数を減らすことができる。 洗浄された沈殿物を0.5％トリス溶液中に溶解する。完全に可溶化した後、溶 液のpH及び浸透圧モル濃度を調節する。このpHは7.30〜7.50とする。最終的なタ ンパク質濃度は溶液の約30〜35mg／mlである。タンパク質のグラム当り0.2〜0.3 ｇに相当するＬ−ヒスチジンの量を添加して、タンパク質に対して50％（ｗ／ｗ ）と等量のサッカロースを添加する。最終的なタンパク質溶液を濾過して滅菌 条件下で包装する；その後48時間、凍結乾燥する。 実施例２ この方法により得られた凍結乾燥された産物を各々のガラス瓶について１mlの 蒸留水を加えて元に戻し、生化学的に分析する。これらの分析の結果により、生 化学的接着剤として、本発明に従う濃縮物の組成及び質を決定することが可能と なる。 Ａ．−生化学的分析（実施例１）： 濃縮タンパク質成分は以下の通りである： −凝固可能なフィブリノーゲン（重量測定により決定される）： 95〜105 mg／ml −内在性因子XIII：35〜40UI／ml −フィブロネクチン：４〜６mg／ml −プラスミノーゲン：0.010〜0.015mg／ml −アルブミン：0.10〜0.20mg／ml −イムノグロブリン：IgA：0.20〜0.30mg／ml IgG：0.50〜0.60mg／ml IgM：0.20〜0.30mg／ml 上述のように、本発明に従って調製された濃縮物は、その優れた可溶化性及び 安定性を特徴とする。それは、室温（20°〜25℃）で５分未満で、手動の撹拌の みで溶液中にもどる。それは、我々の生化学的分析のための明らかな利点を供す るので、我々の産物のための溶媒として純水を用いることを我々は選択した。し かしながら、他の現在市販されている製品のように、この濃縮物は、体の一部と 接触した時、接着の安定性を害する繊維素溶解を避けるためのアプロチニンの溶 液においてもどされるべきである。 24時間を超えて延長させることができる期間、４℃又は20℃で純水でもどされ た本製品は分解又は不安定化しないことに我々は気付 き、これはこの濃縮物がプロテアーゼを含まないことを示唆する。水でもどした 後、塩化カルシウムの存在中のトロンビンの溶液にこのフィブリノーゲンを混合 する。これにより形成されたフィブリンは、全く浸出しない。 Ｂ．−強度分析： マウスの皮膚の断片を接着することにより動物上で決定された接着力は、200 ｇ／cm³より上である。この接着力は、２つのガーゼの断片を接着することによ っても示されている；このテストは後に記載される。この製品は４℃又は20℃に 維持された温度において、好ましくは、24時間安定である。この技術により決定 された接着力は、0.050mlのタンパク質溶液、0.050mlのウシトロンビン（40mM塩 化カルシウム中に100IU／ml）の混合物において、１kgの圧力下での10分間の接 触の後、350±20ｇ／cm³である。24時間の維持期間後のテストは接着力が変わら ないで維持されることを示す。 Ｃ．−生体適合性の評価 本接着剤の生体適合性の評価を培養した細胞を用いて試験管内で行った。この 評価は、細胞毒性及び細胞適合性（細胞の増殖、DNA合成等）に関する。 培養細胞テストは、Balb 3T3細胞及び／又はヒト皮膚繊維芽細胞である。細胞 毒性を、ニュートラルレッドの組み込みにより測定した。生きている時、細胞に おいて、細胞のリポソームに固定化されたこの染料が含浸する。死んでいる時、 細胞はこの染料を吸収しない。この染料の投与は、細胞との接触の72時間後に行 う。細胞の生存可能性の評価は、（Canadian standard CAN 3-Z310.6-M84下の） 顕微鏡観察により、又は細胞計数によっても行うことができる。 この接着剤は、記載された条件下で細胞毒性がない。それは、細胞の密度（繊 維芽細胞が45％及びBalb 3T3細胞が124％）に対して 増加的な効果を与える。 迅速な可溶化性、溶液中での大きな安定性及び無浸出性は、本発明に従う濃縮 物の主な特徴である。 これらの特徴は、それに大きな融通性を与える：時間の節約、迅速な溶解、変 動可能な温度及び長期間にわたる使用。これらの能力は、手術室において外科医 が直面する制約に対する製品適合性を示す。 本発明に従って治療上の使用のために調製されたフィブリノーゲン及び因子XI IIの豊富なタンパク質のこれらの濃縮物は、ヒト又は動物の血漿から得ることが でき、従って医療的又は獣医学的実施のいずれかに使用可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ラボワール，リゼ カナダ国，ケベック ジェイ７アール ６ ケー２，セント ユースタチェ，ドゥ プ レイン 789 (72)発明者 ミヒャエル セント ピコ，ドミニク カナダ国，ケベック エイチ９エイチ ４ ワイ２，セント ジェネビーブ，オーマイ ストリート 14755

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．トロンビンにより凝固性であり、且つ主としてフィブリノーゲン、内因性 XIII因子及びフィブロネクチンを含むタンパク質濃縮物の調製のための方法であ って、以下の工程： ａ）前記タンパク質の塩析を達しめるのに十分な量の塩の添加及び7.5〜8.5の pHによる全血漿タンパク質の第１沈殿化、ここでこの沈殿化は０〜４℃で、50mM の最少濃度のアミノ−６ ヘキサノン酸の存在下で行う； ｂ）タンパク質のグラム当り0.2〜0.3ｇの最終濃度に至るＬ−ヒスチジンの存 在下での前記沈殿化タンパク質の第１可溶化； ｃ）溶媒−界面活性剤溶液中でのウィルス不活性化工程； ｄ）工程ａ）と同じ塩による、同じ温度での、同じ濃度のアミノ−６ ヘキサ ノン酸の存在下での第２沈殿化； ｅ）若干酸性の純水によるこの沈殿物の洗浄； ｆ）工程ｂ）の通りのＬ−ヒスチジンの存在下でのこの沈殿物の第２可溶化； ｇ）タンパク質の量に対する50％のサッカロースの添加； ｈ）除菌濾過； ｉ）無菌ボトルへのこの除菌濾過した濃縮物の分注；及び ｊ）凍結乾燥； を含んで成る方法。 ２．前記塩がクエン酸ナトリウム又はカリウムであることを特徴とする、請求 項１記載の方法。 ３．前記第１及び第２沈殿化工程を少なくとも30分行うことを特徴とする、請 求項１記載の方法。 ４．前記工程（ｅ）を、２℃に冷却した水により２℃で行うこと を特徴とする、請求項１記載の方法。 ５．前記工程（ａ），（ｄ）及び（ｅ）を室温で少なくとも30分行うことを特 徴とする、請求項１記載の方法。 ６．前記工程（ｅ）の次に、若干塩基性の純水中での沈殿物の可溶化、次いで 透析又はダイアフィルトレーションが続くことを特徴とする、請求項１記載の方 法。 ７．前記若干酸性の純水がpH4.50〜5.0の0.1％のトリス−HCl溶液であること を特徴とする、請求項１記載の方法。 ８．透析又はダイアフィルトレーションの前に沈殿物を可溶化するために用い る前記若干塩基性の純水がpH7.3の0.5％のトリスの溶液であることを特徴とする 、請求項６記載の方法。 ９．前記第１可溶化を１％のトリス及び1.6％のクエン酸ナトリウムpH7.30で 行い、Ｌ−ヒスチジンの添加の前にタンパク質濃度を20〜22mg／mlにすることを 特徴とする、請求項１記載の方法。 10．前記第２可溶化を0.5％のトリスpH7.30で行い、Ｌ−ヒスチジンの添加の 前にタンパク質濃度を30〜35mg／mlにすることを特徴とする、請求項１記載の方 法。 11．前記ウィルス不活性化を、10mg／mlの可溶化タンパク質、１％のTween 80 （登録商標）及び0.3％のトリ−ｎ−ブチル−ホスフェートより成る溶液中での 連続撹拌のもとで６時間にわたり28℃で行うことを特徴とする、請求項１記載の 方法。 12．前記凍結乾燥した濃縮物が、マニュアル撹拌のもとで、室温にて５分以内 で水に溶解することを特徴とする、請求項１記載の方法。 13．前記可溶化濃縮物が４℃〜20℃の温度で少なくとも24時間安定であること を特徴とする、請求項12記載の方法。 14．前記血漿がヒト又は動物を起源とする、請求項１記載の方法 。