DE3002933A1 - Gewebeklebstoff - Google Patents

Gewebeklebstoff

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DE3002933A1 DE19803002933 DE3002933A DE3002933A1 DE 3002933 A1 DE3002933 A1 DE 3002933A1 DE 19803002933 DE19803002933 DE 19803002933 DE 3002933 A DE3002933 A DE 3002933A DE 3002933 A1 DE3002933 A1 DE 3002933A1
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tissue
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Description

IMMUNO Aktiengesellschaft für chemisch-medizinische Produkte Wien, Österreich
Gewebeklebstoff
030035/0649
Gewebeklebstoff
Die Erfindung betrifft einen Gewebeklebstoff auf Basis von menschlichen oder tierischen Proteinen mit einem Gehalt an Faktor XIII und Fibrinogen.
Es ist seit langem bekannt, Blutgerinnungssubstanzen zur Stillung von Blutungen bzw. für Wundversiegelungen heranzuziehen. Nach den ersten derartigen Vorschlägen wurden Fibrintampons bzw. Fibrinplättchen verwendet. Während des Zweiten Weltkrieges wurden Gewebeklebungen mit Hilfe von Blutplasma vorgeschlagen.
In letzter Zeit wurde von H.'Matras u.a. in der "Wiener Medizinischen Wochenschrift", 1972, Seite 517, ein Gewebeklebstoff auf Basis von Fibrinogen und Faktor XIII zur nahtlosen interfaszikulären Nerventransplantation im Tierexperiment beschrieben.
Eine weitere Studie stammt von Spängier u.a. in der "Wiener Klinischen Wochenschrift", 1973, Seiten 1 bis 7. Auch hier wurde in Tierversuchen die Möglichkeit aufgezeigt, mit Hilfe von Fibrinogen als Kryopräzipitat und Thrombin eine Gewebeklebung vorzunehmen. .
Die bekannten Präparate haben sich noch nicht als zu-
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friedenstellend erwiesen, weil sie die an einen Gewebeklebstoff zu stellenden Forderungen, welche die folgenden sind:
a) hohe Belastbarkeit der Klebungen bzw. Wundversiegelungen sowie sichere und anhaltende Blutstillung, d.h. gute Haftfähigkeit des Klebers an den Wund- bzw. Gewebsflächen, sowie hohe innere Festigkeit desselben,
b) regelbare Haltbarkeit der Klebungen im Körper
c) vollkommene Resorbierbarkeit des Klebstoffes im Verlauf des Wundheilungsprozesses
d) wundheilungsfördernde Eigenschaften,
noch nicht in ausreichendem Maße erfüllen. Dies mag teilweise darauf zurückzuführen sein, daß die für die Blut-• Stillung notwendigen Gerinnungsfaktoren in den bekannten Präparaten nicht in einem optimalen Verhältnis zueinander vorhanden waren und auch daran, daß die fibrinolytische Aktivität im Klebebereich nur ungenügend beherrscht wurde. Es kam häufig durch enzymatische Einwirkung zu einer vorzeitigen Auflösung der Gewebeklebungen.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung dieser Nachteile und Schwierigkeiten, und stellt sich die Aufgabe, einen Gewebeklebstoff auf Basis von Fibrinogen und Faktor XIII menschlichen oder tierischen Ursprungs zu schaffen, der die eingangs angeführten Voraussetzungen erfüllt.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß es erforderlich ist, ein bestimmtes Verhältnis von Fibrinogen zu Faktor.XIII einzuhalten und daß durch eine bestimmte Menge eines Inhibitors die fibrinolytische Aktivität gehemmt wird.
Dementsprechend besteht die Erfindung in der Kombination der folgenden Merkmale:
a) daß das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fi-
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brinogen, mindestens 80 beträgt,
b) daß ein Plasininogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor, vorzugsweise Aprotinin, in einer Menge von 20 bis 2000 Kal.likrein-Inaktivator-Einheiten (KIE) pro ml enthalten ist.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Gewebeklebstoff kälteunlösliches Globulin, welches, wie festgestellt werden konnte, die Wirksamkeit fördert.
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung enthält der Gewebeklebstoff zusätzlich Albumin, welches eine stabilisierende Wirkung auf die Komponenten des Gewebeklebstoffes ausübt.
.Nach einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fibrinogen, das kälteunlösliche Globulin und das Albumin in einem Verhältnis von 60 bis 98 : 0,5 bis 20 : 0 bis -15 enthalten und ist Faktor XIII. in einer· Menge von mindestens 7 Einheiten/ ml enthalten.
Um die gewünschte -Wirkung sicherzustellen, soll das Fibrinogen in einer Menge von mindestens 70 mg/ml enthalten sein.
Der Gewebeklebstoff gemäß der Erfindung besitzt charakteristische Vernetzbarkeitseigenschaften, welche nach der Natriumlaurylsulfat-(SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode bestimmbar sind. Der Test wird derart durchgeführt, daß nach dem Vermischen des Gewebeklebstoffes mit dem gleichen Volumen einer Lösung, enthaltend 40 yuMol CaCl2 und.15 NIH-Einheiten (US National Institute of Health-Einheiten) Thrombin pro ml, die Mischung bei 37°C inkubiert wird. Der Vernetzungsgrad wird nach Stoppen der Reaktion und reduktiver Spaltung der in den Proteinen enthaltenen Disulfidbrücken durch Zugabe eines Gemisches von Harnstoff, Natriumdodecylsulfat und /S-Mercaptoäthanol durch GeI-
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elektrophorese bestimmt. Charakteristisch für den erfindungsgemäßen Gewebeklebstoff ist eine vollständige Vernetzung der Fibrin-y-Ketten nach 3 bis 5 Minuten und eine mindestens 35 %ige Vernetzung der Fibrin-ot-Ketten nach 2 Stunden.
Die Erfindung umfaßt weiters ein Verfahren zur Herstellung des beschriebenen Gewebeklebstoffes, wobei man von menschlichem bzw. tierischem Plasmakryopräzipitat ausgeht. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Kryopräzipitat durch ein- oder mehrfache Behandlung mit einer Pufferlösung, welche Natriumzitrat, Natriumchlorid, Glycin, Glucose und einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor enthält, kältelösliches Plasmaprotein entfernt und der gereinigte Niederschlag gelöst wird.
Vorteilhaft wird das Kryopräzipitat aus humanem oder tierischem.Frischplasma hergestellt, welches bei -20 C eingefroren wurde. Bei Erhöhung der Temperatur auf 0 bis 2 C wird das Kryopräzipitat gewonnen und durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Pufferlösung, mit der das Kryopräzipitat behandelt wird, soll einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0 aufweisen. Das kältelösliche Plaanaprotein wird durch Zentrifugieren unter Einhaltung einer Temperatur von 0 bis 4 C abgetrennt. Der gereinigte Niederschlag wird sodann mit der Pufferlösung so lange gewaschen, bis die gewünschten Verhältnisse von Faktor XIII zu Fibrinogen bzw. das angestrebte Verhältnis des Fibrinogens, des kälteunlöslichen Globulins und des Albumins erreicht ist..
Der gelöste gereinigte Niederschlag kann durch Tieffrieren haltbar gemacht werden.
Der Gewebeklebstoff gemäß der Erfindung weist eine universelle Anwendbarkeit auf. Er kann zum nahtlosen Ver-
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binden von menschlichen oder tierischen Gewebe- oder Organteilen, zur Wundversiegelung und Blutstillung sowie zur Förderung von Wundheilungen verwendet werden.
Bevorzugte Anwendungsgebiete, auf welchen der erfindungsgemäße Gewebeklebstoff erfolgreich eingesetzt werden kann, sind: Indikationen im Bereich der Hals-,Nasen-,Ohren- und Kieferchirurgie, Zahnheilkunde, Neurochirurgie, plastischen Chirurgie, allgemeinen Chirurgie, Abdominalchirurgie, Thorax- und Gefäßchirurgie, Orthopädie, Unfallchirurgie, Urologie, Ophthamologie und Gynäkologie.
Vorteilhaft wird vor der Applikation des erfindungsgemäßen Gewebeklebstoffes auf das zu verbindende Gewebe eine Mischung Von Thrombin und Calciumchlorid dem Klebstoff zugefügt oder auf das Gewebe -aufgebracht.
Das erf indungsgemäß'e Verfahren "wird durch das folgende Beispiel 1 näher erläutert:
178,5.1 humanes, bei -2O. C tiefgefrorenes Frischplasma wurden auf +2 C erwärmt. Das erhaltene Kryopräzipitat wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und bei +2 C mit 8 1 einer Pufferlösung, enthaltend 6,6 g Na3-Citrat-2H2O, 3,4 g NaCl, 10,0 g Glycin, "13,0 g Glucose.IH3O und 50.000 KIE Aprotinin pro Liter, und einem pH-Wert von 6,5 behandelt und nochmals bei +2°C zentrifugiert. Die Behandlung mit der erwähnten Pufferlösung und das anschließende Zentrifugieren wurden einmal wiederholt. Der abgetrennte Niederschlag wurde durch Erwärmen auf 37°C verflüssigt.
In dem so erhaltenen Produkt war Aprotinin in einer Konzentration von 50 KIE pro ml vorhanden. Das Verhältnis Fibrinogen zu kälteunlöslichem Globulin zu Albumin wurde in dem Produkt mit 86,2 : 6,7 : 2,2 bestimmt. Diese Be-
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Stimmung wurde ebenfalls nach der SDS-PoIyacrylamld-Gelelektrophorese-Methode, u. zw. a) mit einer nicht reduzierten und b) mit einer iit/3-Mercaptoäthanol reduzierten Probe des Gewebeklebers durchgeführt. An Faktor XIII wurden : 5 13,8 Einheiten/ml gefunden bzw. betrug das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen,, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, 152. Fibrinogen war in einer Menge von 90,6 mg/ml enthalten.
Die Bestimmungen erfolgten.in folgender Weise: Die Bestimmung der Faktor XIII-Einheiten'erfolgte mittels eines Vernetzungstests, bei dem Faktor· Xlll-freies Fibrinogen als Substrat verwendet und die durch die Zugabe der unbekannten verdünnten Probe bewirkte Fibririvernetzung als Maß für die darin enthaltene Menge an Faktor XIII diente. Eine entsprechende Eichkurve wurde mit gepooltem humanem Citratplasma erhalten, wobei per definitionem 1 ml Plasma 1 Einheit Faktor XIII enthält. Die Proteinbestimmungen erfolgten mittels der Methode nach Kjeldahl.
Der Vernetzungstest nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode ergab eine vollständige Fibrin-Cf-Vernetzung nach 5 Minuten und eine 68 %ige Fibrin-c6-Vernetzung nach 2 Stunden. Das Endprodukt wurde in Endbehalter abgefüllt μηα zur Lagerung bei' -20 C tiefgefroren.
Nach einer abgewandelten Verfahrensweise ist es auch möglich, den Plasminogen-Aktivätor-Inhibitor bzw. den Plasmin-Inhibitor in einem späteren Stadium zuzufügen, wie durch das folgende Beispiel 2 erläutert wird:
112,5 1 humanes, bei -200C tiefgefrorenes Frischplasma wurden auf +20C erwärmt. Das entstandene Kryopräzipitat wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und bei +2 C mit 35> to 1 einer Pufferlösung, enthaltend 6,6 g Na3~Citrat-2H2O, 3,4 g NaCl, 10,0 g Glycin, 13,0 g Glucose·1H2O pro Liter, und einem pH-Wert von 6,5, gewaschen und nochmals bei
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+2°C zentrifugiert. Der abgetrennte Niederschlag wurde durch Erwärmen auf 37°C verflüssigt. Die so erhaltene Lösung wurde mit 50 KIE Aprotinin pro ml versetzt.
In dem so erhaltenen Produkt wurde das Verhältnis Fibrinogen zu kälteunlöslichem Globulin zu Albumin mit 91,0 : 5,3 :1/1 bestimmt. Diese Bestimmung wurde ebenfalls nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode, u.zw. a) mit einer nicht reduzierten und b) mit einer mit/3-Mercaptoäthanol reduzierten Probe des Gewebeklebers durchgeführt. An Faktor XIII wurden 15,7 Einheiten/ml gefunden bzw. betrug das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, 170. Fibrinogen war in einer Menge von 92,1 mg/ml enthalten.
Die Bestimmungen erfolgten in folgender Weise: Die Bestimmung der Faktor XIII-Einheiten erfolgte mittels eines Vernetzungstests, bei dem Faktor XHI-freies Fibrinogen als Substrat verwendet und die durch die Zugabe der unbekannten verdünnten Probe bewirkte Fibrinvernetzung als Maß für die darin enthaltene .Menge an Faktor XIII diente. Eine entsprechende Eichkurve wurde mit gepooltem humanem Ci'tratplasma erhalten, wobei per definitionem.
1 ml Plasma 1 Einheit Faktor XIII enthält. Die Proteinbestimmungen erfolgten mittels der Methode nach Kjeldahl.
Der Vernetzungstest nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode ergab eine vollständige Fibrin-y-Vernetzung nach 5 Minuten und eine 87 %ige Fibrin-^-Vernetzung nach 2 Stunden. Das Endprodukt wurde in Einweg-Injektionsspritzen abgefüllt und zur Lagerung bei -20°C tiefgefroren.
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Claims (10)

Patentansprüche:
1. Gewebeklebstoff auf Basis von menschlichen oder tierischen Proteinen mit einem Gehalt an Faktor XIII und Fibrinogen, gekennzeichnet durch die Kombination der folgenden Merkmale:
a) daß das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, mindestens 80 beträgt,
b) daß ein Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor, vorzugsweise Aprotinin, in einer Menge von 20 bis 2000 KIE pro ml enthalten ist.
2. Gewebeklebstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich kälteunlösliches Globulin enthält.
3. Gewebeklebstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich Albumin enthält.
4. Gewebeklebstoff nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Fibrinogen, kälteunlösliches Globulin und Albumin in einem Verhältnis von 60 bis 98 : 0,5 bis 20 : 0 bis 15 enthalten sind und Faktor XIII in einer Menge von mindestens 7 Einheiten/ml enthalten ist.
5. Gewebeklebstoff nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Fibrinogen in einer Menge von mindestens 70 mg/ml enthalten ist.
6. Gewebeklebstoff nach den Ansprüchen 1 bis 5, gekennzeichnet durch eine vollständige Vernetzbarkeit der Fibrin-tf-Ketten durch Inkubation nach 3 bis 5 Minuten und eine mindestens 35 %ige Vernetzbarkeit der FibrinnCC" Ketten nach zweistündiger Inkubation, bestimmt nach der
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SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode.
7. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeklebstoffes nach den Ansprüchen 1 bis 6 aus Plasmakryopräzipitat, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Kryopräzipitat durch ein- oder'mehrfache Behandlung mit einer Pufferlösung, welche Natriumzitrat, Natriumchlorid, Glycin, Glucose und einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor enthält, kältelösliches Plasmaprotein, entfernt und der gereinigte Niederschlag gelöst wird.
·
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der gelöste gereinigte Niederschlag durch Tieffrieren haltbar gemacht wird.
9. Anwendung des Gewebeklebstoffes nach den Ansprüchen . 1 bis 5 zum nahtlosen Verbinden von menschlichen oder
tierischen Gewebe- oder Organteilen, zur Wundversiegelung und Blutstillung sowie zur Förderung von Wundheilungen. 20
10. Anwendung des Gewebeklebstoffes nach Anspruch 9 mit der Maßgabe, daß vor seiner Applikation auf das zu verbindende Gewebe eine Mischung von Thrombin und Calciumchlorid dem Klebstoff zugefügt oder auf das Gewebe aufgebracht wird.
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