RS67639B1 - Anti il-36r antitela - Google Patents

Anti il-36r antitela

Info

Publication number
RS67639B1
RS67639B1 RS20260044A RSP20260044A RS67639B1 RS 67639 B1 RS67639 B1 RS 67639B1 RS 20260044 A RS20260044 A RS 20260044A RS P20260044 A RSP20260044 A RS P20260044A RS 67639 B1 RS67639 B1 RS 67639B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
antigen
antibodies
binding fragment
Prior art date
Application number
RS20260044A
Other languages
English (en)
Inventor
Su-Ellen Brown
Keith Canada
Lukasz Chlewicki
Michael Howell
Detlev Mennerich
Jr Joseph Robert Woska
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47215803&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS67639(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of RS67639B1 publication Critical patent/RS67639B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7155—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/205—Scaling palpular diseases, e.g. psoriasis, pytiriasis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] Oblast tehnike pronalaska
[0005] Ovaj pronalazak se generalno odnosi na anti-IL-36R antitela za dijagnostičku i terapijsku upotrebu. Antitela se mogu koristiti u farmaceutskim sastavima i kompletima koji sadrže takva jedinjenja. Antitela su korisna u lečenju različitih bolesti ili poremećaja, na primer imunoloških, inflamatornih, autoimunih, fibrotičkih i respiratornih bolesti kod ljudi.
[0007] Stanje tehnike pronalaska
[0008] IL-1 porodica citokina se sastoji od 11 različitih liganda, naime, IL-1α (takođe nazvan IL-1F1), IL-1β (IL-1F2), antagonista IL-1 receptora (IL-1Ra ili IL-1F3), IL-18 (IL-1F4), IL-1F5 do IL-1F10 i IL-1F11 (ili IL-33). Poznato je da IL-1α i IL-1β indukuju proinflamatorne aktivnosti na vezivanje za IL-1 receptor tipa I (IL-1RI) i regrutovanje zajedničkog pomoćnog proteina koreceptora IL-1 receptora (IL-1RAcP), dok IL-1Ra deluje kao kompetitivni inhibitor vezivanja IL-1 za IL-1RI, čime vrši antiinflamatornu aktivnost. Brojne studije su izvestile da je IL-18 proinflamatorni citokin koji je induktor IFN-γ, dok je IL-33 opisan kao imunoregulacioni citokin koji je posebno uključen u kontrolu Th2 odgovora. Novi članovi porodice IL-1, uključujući IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8 i IL-1F9, identifikovani su pretragama u DNK bazama podataka za homologe IL-1. Kod ljudi i miševa, svi geni koji kodiraju ove citokine mapiraju se na manje od 300 kb hromozoma 2q, gde su okruženi sa IL1A, IL1B i IL1RN genima. IL-1F6, IL-1F8 i IL-1F9 dele homologiju aminokiselinske sekvence od 21% do 37% sa IL-1 i IL-1Ra, dok IL-1F5 prikazuje homologiju aminokiselinske sekvence od 52% sa IL-1Ra, što ukazuje na to da IL-1F5 može predstavljati antagonist endogenog receptora.
[0010] [0003] IL-1F6, IL-1 F8 i IL-1F9 se vezuju za IL-1Rrp2, receptor iz porodice IL-1R, i koriste IL-1RAcP kao koreceptor za stimulaciju intracelularnih signala sličnih onima koje indukuje IL-1, dok se pokazalo da IL-1F5 inhibira aktivaciju NF-κB indukovanu sa IL-1F9 u Jurkat T ćelijama koje prekomerno eksprimiraju IL-1Rrp2. Kao i IL-1β, svim ovim IL-1 homolozima nedostaje vodeći peptid i ne mogu se osloboditi putem konvencionalnog sekretornog puta, iako studije sugerišu da se oslobađanje IL-1Rrp2 agonista može kontrolisati mehanizmima različitim od onih koji regulišu sekreciju IL-1β. Da bi se potvrdili specifični biološki efekti ovih citokina i da bi se prepoznalo da se svi oni vezuju za isti receptor, nedavno je predložena izmena nomenklature IL-1 homologa. Stoga se IL-1 Rrp2 sada naziva IL-36R, a njegovi ligandi se nazivaju IL-36α (IL-1F6), IL-36β (IL-1F8) i IL-36γ (IL-1F9). Pored toga, IL-1F5, za koji se pokazalo da vrši aktivnosti antagonista receptora, preimenovan je u IL-36Ra.
[0012] Informacione RNK za IL-36α, IL-36β i IL-36γ su visoko eksprimirane u nekoliko tkiva, posebno u unutrašnjim epitelnim tkivima, koja su izložena patogenima i u koži. Interesantno je da je ekspresija IL-36Ra i IL-36α značajno povećana u ljudskim keratinocitima stimulisanim sa IL-1β/TNF-β, a IL-36Ra i IL-36γ mRNK su visoko povećane u koži sa lezijama psorijaze. Štaviše, proizvodnja IL-36γ proteina je pojačana u ljudskim keratinocitima nakon stimulacije TNF-α i IFN-γ. Povišena IL-36α mRNK i ekspresija proteina prijavljena je i kod hroničnog oboljenja bubrega.
[0014] Transgeni miševi koji prekomerno eksprimiraju IL-36α u keratinocitima pokazuju inflamatorne kožne lezije koje dele neke karakteristike sa psorijazom. Ovaj fenotip je bio teži kada su transgeni miševi ukršteni sa miševima sa nedostatkom IL-36Ra, podržavajući regulatornu funkciju IL-36Ra in vivo. Inflamatorno stanje kože u transgenom IL-36α specifičnom za keratinocite još je sličnije ljudskoj psorijazi ako se miševi leče 12-O-tetradekanoilforbolom 13-acetatom, koji histološki, molekularno i u odgovoru na terapiju podseća na bolest kod ljudi. Štaviše, ljudska koža sa psorijatičnim lezijama transplantirana na imunodeficijentne miševe se normalizuje kada se miševi tretiraju sa anti-IL-36R antitelima, tvrdeći da je osa IL-36 potrebna za održavanje lezijskog fenotipa u ljudskoj psorijatičnoj koži (Blumberg H. et al., J. Immunol 2010; 185:4354-4362). Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da IL-36R ligandi, uključujući IL-36α, IL-36β i IL-36γ, imaju proinflamatorne efekte in vitro i in vivo i da IL-36Ra deluje kao prirodni antagonist, oponašajući tako sistem IL-1/IL-1Ra.
[0016] Stoga postoje dokazi da su IL-36R ligandi uključeni u brojne bolesti, i postoji potreba za novim terapijskim agensima koji ciljaju ovaj put, posebno za upotrebu u lečenju inflamatornih oboljenja.
[0017] Suština pronalaska
[0019] Obim pronalaska je definisan patentnim zahtevima. Svi aspekti, primeri ili izvođenja koji ne spadaju u obim patentnih zahteva uključeni su samo u ilustrativne ili uporedne svrhe.
[0021] Ovaj pronalazak se bavi prethodno navedenom potrebom obezbeđivanjem bioterapeutika, posebno antitela, koja se vezuju za IL-36R. Antitela ovog pronalaska blokiraju signalizaciju posredovanu ligandom IL36 (α, β i/ili γ). Dalje, antitela ovog pronalaska su korisna, na primer za lečenje upale/fibroze posredovane epitelima kod bolesti kao što su psorijaza, inflamatorna bolest creva, skleroderma, COPD i hronična bolest bubrega.
[0023] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži a) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinu sekvencu SEQ ID NO: 26 (L-CDR1), aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 (L-CDR2) i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44 (L-CDR3); i b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53 (H-CDR1), aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62 (H-CDR2) i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 72 (H-CDR3), pri čemu anti-IL-36R antitelo blokira signalizaciju posredovanu sa IL-36α-, IL-36β- i IL-36γ.
[0025] U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska ima visoku potentnost molekulskog/ćelijskog vezivanja. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska vezuje ljudski IL-36R pri K<D>< 0,1 nM. U daljem aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska, posebno humanizovano anti-IL-36R antitelo, vezuje ljudski IL-36R pri K<D>< 50 pM. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska vezuje ćelije koje eksprimiraju IL-36R na EC<90><5 nM.
[0027] U drugom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska ima visoku potentnost funkcionalnog blokiranja na bazi ćelija. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska blokira sva tri IL-36R agonistička liganda (α, β, γ) na IC<90>≤ 5 nM, u ćelijskim linijama relevantnim za bolest i primarnim ćelijama.
[0029] U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska ima potentnost molekulskog/ćelijskog vezivanja i gore navedenu potentnost funkcionalnog blokiranja na bazi ćelija.
[0030] U daljem aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska ima visoku selektivnost, na primer, veću od 1000 puta selektivnost protiv ljudskih IL-1R1 ili IL-36R negativnih ćelijskih linija. U daljem aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska ne vezuje ljudske IL-1R1 ili IL-36R negativne ćelijske linije.
[0032] U primeru izvođenja jedan, anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje ljudski IL-36R pri K<D>jednakoj ili < 0,1 nM.
[0034] U primeru izvođenja dva, anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen u skladu sa primerom izvođenja jedan je monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
[0036] U primeru izvođenja tri, anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen u skladu sa primerom izvođenja jedan ili dva je humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
[0038] U primeru izvođenja četiri, anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen u skladu sa primerom izvođenja tri vezuje ljudski IL-36R pri K<D>jednakoj ili < 50 pM.
[0040] U primeru izvođenja pet, anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od primera izvođenja jedan do četiri ne vezuje ljudski IL-1R1.
[0042] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 78, 79 ili 80; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 87, 88, 89 ili 90.
[0044] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87; ili
[0045] varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88; ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89.
[0047] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 116, 117 ili 118; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 125, 126, 127 ili 128.
[0049] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125.
[0051] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126.
[0053] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127.
[0055] Ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži:
[0056] a) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 (L-CDR2); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44 (L-CDR3); i
[0057] b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53 (H-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62 (H-CDR2); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 72 (H-CDR3), pri čemu anti-IL-36R antitelo blokira signalizaciju posredovanu sa IL-36α-, IL-36β- i IL-36γ.
[0058] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku je monoklonsko antitelo. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku je humanizovano antitelo. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku je monoklonsko humanizovano antitelo.
[0060] U daljem primeru izvođenja, ovaj pronalazak pruža farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen u skladu sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0062] U daljem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili farmaceutski sastav u skladu sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, za upotrebu u medicini.
[0064] U daljem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili farmaceutski sastav prema pronalasku, za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti, autoimune bolesti, respiratorne bolesti, metaboličkog poremećaja,epitelno posredovanog inflamatornog poremećaja, fibroze ili raka.
[0066] U daljem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili farmaceutski sastav za upotrebu u skladu sa pronalaskom, pri čemu se primena odnosi na lečenje psorijaze, inflamatorne bolesti creva, psorijatičnog artritisa, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, hronične astme ili ankilozirajućeg spondilitisa.
[0068] U daljem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili farmaceutski sastav za upotrebu u skladu sa pronalaskom, pri čemu je upotreba za lečenje inflamatorne bolesti creva.
[0070] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili farmaceutski sastav za upotrebu u skladu sa pronalaskom, pri čemu je bolest Kronova bolest.
[0071] U drugom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili farmaceutski sastav za upotrebu u skladu sa pronalaskom, pri čemu je bolest izabrana između inflamatorne bolesti, autoimune bolesti, respiratorne bolesti, metaboličkog poremećaja, epitelno posredovanog inflamatornog poremećaja, fibroze i raka.
[0073] U drugom primeru izvođenja bolest je izabrana između psorijaze, inflamatorne bolesti creva, psorijatičnog artritisa, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, hronične astme i ankilozirajućeg spondilitisa.
[0075] Dalji primeri izvođenja pronalaska obuhvataju:
[0076] o izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja kodira anti-IL-36R antitelo ili fragment koji vezuje antigen u skladu sa pronalaskom, poželjno DNK ili RNK sekvencu;
[0077] o vektor koji sadrži polinukleotid u skladu sa pronalaskom, poželjno ekspresijski vektor, poželjnije vektor koji sadrži polinukleotid u skladu sa pronalaskom u funkcionalnoj asocijaciji sa sekvencom koja reguliše ekspresiju; o ćeliju domaćina koja sadrži polinukleotid i/ili vektor prema pronalasku; o postupak za proizvodnju anti-IL-36R antitela ili fragmenta koji vezuje antigen u skladu sa pronalaskom, poželjno postupak rekombinantne proizvodnje koji sadrži upotrebu polinukleotida u skladu sa pronalaskom i/ili vektora u skladu sa pronalaskom i/ili ćelije domaćina u skladu sa pronalaskom;
[0078] o takav postupak sadrži korake (a) kultivacije ćelije domaćina pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju anti-IL-36R antitela ili fragmenta koji vezuje antigen i (b) oporavka anti-IL-36R antitela ili fragmenta koji vezuje antigen;
[0079] o dijagnostički komplet koji sadrži anti-IL-36R antitelo ili fragment koji vezuje antigen u skladu sa pronalaskom;
[0080] o dijagnostički komplet u skladu sa pronalaskom, za upotrebu u postupku in vivo dijagnoze inflamatorne bolesti, autoimune bolesti, respiratorne bolesti, metaboličkog poremećaja, inflamatornog poremećaja posredovanog epitelom, fibroze, raka, psorijaze, inflamatorne bolesti creva, psorijatičnog artritisa, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, hronične astme, ankilozirajućeg spondilitisa ili Kronove bolesti;
[0081] o antitelo ili fragment koji vezuje antigen u skladu sa ovim pronalaskom, pri čemu je antitelo ili fragment koji vezuje antigen humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen i konjugovano je sa oznakom za upotrebu u in vivo dijagnozi;
[0082] o ex vivo dijagnostički postupak koji sadrži upotrebu anti-IL-36R antitela ili fragmenta koji vezuje antigen u skladu sa pronalaskom;
[0084] o ex vivo dijagnostički postupak prema pronalasku, za dijagnozu inflamatorne bolesti, autoimune bolesti, respiratorne bolesti, metaboličkog poremećaja, inflamatornog poremećaja posredovanog epitelima, fibroze, raka, psorijaze, inflamatorne bolesti creva, psorijatičnog artritisa, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, hronične astme, ankilozirajućeg spondilitisa, Kronove bolesti ili ulceroznog kolitisa; i
[0085] o ex vivo dijagnostički postupak prema pronalasku za dijagnostikovanje poremećaja povezanog sa IL-36R ili za određivanje da li ispitanik ima povećan rizik od razvoja poremećaja povezanog sa IL-36R, koji sadrži kontakt biološkog uzorka iz ispitanika sa antitelima IL-36R prema pronalasku, detekciju vezivanja antitela za IL-36R i opciono upoređivanje nivoa IL-36R u navedenom uzorku sa kontrolnim uzorkom kako bi se utvrdilo da li ispitanik ima poremećaj povezan sa IL-36R ili je u riziku od razvoja poremećaja povezanog sa IL-36R, pri čemu je poremećaj povezan sa IL-36R inflamatorna bolest, autoimuna bolest, respiratorna bolest, metabolički poremećaj, epitelno posredovani inflamatorni poremećaj, fibroza, rak, psorijaza, inflamatorna bolest creva, psorijatični artritis, multipla skleroza, reumatoidni artritis, COPD, hronična astma, ankilozirajući spondilitis, Kronova bolest, ili ulcerozni kolitis.
[0087] Kratak opis slika nacrta
[0089]
[0091] Slika 1:
[0092] Ligandi antagonista IL-36 (IL-36RA/IL1F5, IL-38/ILF10) inhibiraju signalnu kaskadu.
[0093] Slika 2:
[0094] Analize genskih čipova pokazuju da su IL-36R ligandi povećani u psorijatičnoj koži (IL-36 RA, IL-36 α i IL-36 γ).
[0096] Slika 3
[0097] Profil ekspresije pomoću sekcija ljudske kože.
[0098] Titracije antitela u parafinskom preparatu fiksiran formalinom korišćenjem antitela 33D10
[0100] Slika 4
[0101] Postupak za procenu epidermalne debljine sekcija ljudske kože
[0103] Detaljan opis pronalaska
[0105] Ovaj pronalazak se odnosi na anti-IL-36R antitela. U jednom aspektu, antitela ovog pronalaska su za dijagnostičku i terapijsku upotrebu, na primer kod ljudi. Svako upućivanje na postupke lečenja i dijagnostike smatra se upućivanjem na jedinjenja i sastave ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ili dijagnostici koja se primenjuje na ljudskom/životinjskom telu.
[0107] Ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja vezuju IL-36R, posebno ljudski IL-36R. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na humanizovana antitela koja vezuju IL-36R. U specifičnim primerima izvođenja, sekvenca ovih humanizovanih antitela je identifikovana na osnovu sekvenci određenih vodećih mišjih antitela.
[0109] Bez želje da se veže za ovu teoriju, veruje se da se anti-IL-36R antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen vezuju ljudski IL-36R i na taj način ometaju vezivanje IL-36 agonista, i na taj način bar delimično blokiraju signalnu kaskadu od IL-36R do inflamatornih medijatora. Ovo je ilustrovano na Slici 1.
[0111] U jednom aspektu, antitela ovog pronalaska su za upotrebu u modelima ljudskih bolesti. IL-36R je takođe poznat kao IL-1RL2 i IL-1Rrp2. Prijavljeno je da agonistički IL-36 ligandi (α, β ili γ) iniciraju signalnu kaskadu angažovanjem IL-36 receptora koji zatim formira
[0114] 1
[0115] heterodimer sa pomoćnim proteinom (IL-1RAcP) IL-1 receptora. Ligandi antagonista IL-36 (IL-36RA/IL1F5, IL-38/ILF10) inhibiraju signalnu kaskadu (vidi Sliku 1).
[0117] U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska ima visoku potentnost molekulskog/ćelijskog vezivanja. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska vezuje ljudski IL-36R pri K<D>< 0,1 nM. U daljem aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska, posebno humanizovano anti-IL-36R antitelo, vezuje ljudski IL-36R pri K<D>< 50 pM. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska vezuje ćelije koje eksprimiraju IL-36R pri EC<90>< 5 nM.
[0119] U drugom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska ima visoku potentnost funkcionalnog blokiranja na bazi ćelija. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska blokira sva tri IL-36R agonistička liganda (α, β, γ) na IC<90>≤ 5 nM, u ćelijskim linijama i primarnim ćelijama relevantnim za bolest.
[0121] U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska ima prethodno navedenu potentnost molekularnog/ćelijskog vezivanja i potentnost funkcionalnog blokiranja na bazi ćelija.
[0123] U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska je humanizovano antitelo. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska je monoklonsko antitelo. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska je antitelo pune dužine. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska je humanizovano monoklonsko antitelo, na primer, humanizovano monoklonsko antitelo pune dužine.
[0125] Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ovog pronalaska prepoznaje specifični „IL-36R antigenski epitop“ ili „ IL-36R epitop“. Kao što se ovde koristi, ovi termini se odnose na molekul (npr. peptid) ili fragment molekula sposobnog za imunoreaktivnost sa anti-IL-36R antitelom.
[0127] [0046] Epitopi su najčešće proteini, kratki oligopeptidi, oligopeptidni imitatori (tj. organska jedinjenja koja imitiraju svojstva vezivanja antitela za IL-36R antigen) ili njihove kombinacije. Smatra se da je minimalna veličina peptidnog ili polipeptidnog epitopa za antitelo oko četiri do pet aminokiselina. Peptidni ili polipeptidni epitopi sadrže, na primer, najmanje sedam aminokiselina ili, na primer, najmanje devet aminokiselina ili, na primer, između oko 15 do oko 20 aminokiselina. Pošto antitelo može da prepozna antigenski peptid ili polipeptid u njegovom tercijarnom obliku, aminokiseline koje čine epitop ne moraju biti susedne, a u nekim slučajevima čak ne moraju biti ni na istom peptidnom lancu. Epitopi se mogu odrediti različitim tehnikama poznatim u struci, kao što su kristalografija rendgenskih zraka, masena spektrometrija razmene vodonika/deuterijuma (HXMS), mutageneza usmerena na lokaciju, mutageneza skeniranjem alanina i postupci skrininga peptida.
[0129] Generalizovana struktura antitela ili imunoglobulina je dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti. Ovi molekuli su heterotetramerni glikoproteini, obično od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca i obično se nazivaju antitelima pune dužine. Svaki laki lanac je kovalentno povezan sa teškim lancem jednom disulfidnom vezom da bi se formirao heterodimer, a heterotetramerni molekul se formira putem kovalentne disulfidne veze između dva identična teška lanca heterodimera. Iako su laki i teški lanci povezani jednom disulfidnom vezom, broj disulfidnih veza između dva teška lanca varira u zavisnosti od izotipa imunoglobulina. Svaki teški i laki lanac takođe ima pravilno razmaknute disulfidne mostove unutar lanca. Svaki teški lanac ima na amino-terminusu varijabilni domen (V<H>), nakon čega slede tri ili četiri konstantna domena(C<H1>, C<H2>, C<H3>, i C<H4>), kao i region šarke između C<H1>i C<H2>. Svaki laki lanac ima dva domena, amino-terminalni varijabilni domen (V<L>) i karboksi-terminalni konstantni domen (C<L>). V<L>domen se nekovalentno povezuje sa V<H>domenom, dok je C<L>domen obično kovalentno povezan sa C<H1>domenom preko disulfidne veze. Veruje se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju graničnu površinu između varijabilnih domena lakog i teškog lanca (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663). Varijabilni domeni se ovde takođe nazivaju varijabilnim regionima.
[0131] [0048] Određeni domeni unutar varijabilnih domena se u velikoj meri razlikuju između različitih antitela, tj. oni su „hipervarijabilni“. Ovi hipervarijabilni domeni sadrže ostatke koji su direktno uključeni u vezivanje i specifičnost svakog određenog antitela za njegovu specifičnu antigensku determinantu. Hipervarijabilnost, kako u varijabilnim domenima lakog lanca tako i u varijabilnim domenima teškog lanca, koncentrisana je u tri segmenta poznata kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR) ili hipervarijabilne petlje (HVL). CDR su definisani poređenjem sekvenci u Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., dok su HVL (koji se ovde takođe nazivaju CDR) strukturno definisani prema trodimenzionalnoj strukturi varijabilnog domena, kako su opisali Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196: 901-917. Ova dva postupka dovode do neznatno različite identifikacije CDR-a. Kao što je definisao Kabat, CDR-L1 je pozicioniran na oko ostataka 24-34, CDR-L2, na oko ostataka 50-56 i CDR-L3, na oko ostataka 89-97 u varijabilnom domenu lakog lanca; CDR-H1 je pozicioniran na oko ostataka 31-35, CDR-H2 na oko ostataka 50-65 i CDR-H3 na oko ostataka 95-102 u varijabilnom domenu teškog lanca. Tačan broj ostataka koji obuhvata određeni CDR variraće u zavisnosti od sekvence i veličine CDR-a. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci sadrže određeni CDR s obzirom na aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona antitela. CDR1, CDR2, CDR3 teških i lakih lanaca stoga definišu jedinstvena i funkcionalna svojstva specifična za dato antitelo.
[0133] Tri CDR-a unutar svakog od teških i lakih lanaca razdvojena su regionima okvira(FR), koji sadrže sekvence koje imaju tendenciju da budu manje varijabilne. Od amino terminusa do karboksi terminusa varijabilnih domena teškog i lakog lanca, FR i CDR su raspoređeni redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. U velikoj meri konfiguracija β-ploča FR-a dovodi CDR-ove unutar svakog od lanaca u blisku blizinu međusobno, kao i CDR-ovima iz drugog lanca. Rezultirajuća konformacija doprinosi mestu vezivanja antigena (vidi Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669), iako nisu svi ostaci CDR-a nužno direktno uključeni u vezivanje antigena.
[0135] FR ostaci i Ig konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, već doprinose vezivanju antigena i/ili posreduju u funkciji efektora antitela. Smatra se da neki FR ostaci imaju značajan uticaj na vezivanje antigena na najmanje tri načina: nekovalentnim vezivanjem direktno za epitop, interakcijom sa jednim ili više CDR ostataka i uticajem na graničnu površinu između teških i lakih lanaca. Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, već posreduju u različitim funkcijama Ig efektora, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC), citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC) i ćelijskoj fagocitozi zavisnoj od antitela (ADCP).
[0137] Laki lanci imunoglobulina kičmenjaka se dodeljuju jednoj od dve jasno različite klase, kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnog domena. Poređenja
[0140] 1
[0141] radi, teški lanci imunoglobulina sisara raspoređuju se u jednu od pet glavnih klasa, prema sekvenci konstantnih domena: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. IgG i IgA se dalje dele na potklase (izotipove, npr., IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>, i IgA<2>. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se a, δ, ε, γ i µ, respektivno. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije klasa nativnih imunoglobulina su dobro poznate.
[0143] Termini „antitelo“, „anti-IL-36R antitelo“, „humanizovano anti-IL-36R antitelo“, „humanizovano anti-IL-36R epitopsko antitelo“ i „varijanta humanizovanog anti-IL-36R epitopskog antitela“ specifično obuhvataju monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela kao što su varijabilni domeni i drugi delovi antitela koji pokazuju željenu biološku aktivnost, npr. vezivanje za IL-36R. Termin „monoklonsko antitelo“ (mAb) odnosi se na antitelo koje je visoko specifično, usmereno protiv jedne antigene determinante, „epitopa“. Stoga, modifikator „monoklonski“ ukazuje na antitela usmerena na identičan epitop i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Treba razumeti da se monoklonska antitela mogu napraviti bilo kojom tehnikom ili metodologijom poznatom u struci; uključujući npr. postupak hibridoma ( Kohler et al., 1975, Nature 256:495) ili postupke rekombinantne DNK poznate u struci (vidi, npr. U.S. Pat.4,816,567), ili postupke izolacije monoklonskih rekombinantno proizvedenih korišćenjem biblioteka faga antitela, koristeći tehnike opisane u Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.222: 581-597.
[0145] Termin „monomer“ se odnosi na homogeni oblik antitela. Na primer, za antitelo pune dužine, monomer označava monomerna antitela koja imaju dva identična teška lanca i dva identična laka lanca.
[0147] [0054] Himerna antitela se sastoje od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca antitela jedne vrste (npr. ne-humanog sisara kao što je miš) i konstantnih regiona teškog i lakog lanca druge vrste (npr. ljudskog) antitela i mogu se dobiti povezivanjem DNK sekvenci koje kodiraju varijabilne regione antitela iz prve vrste (npr. miša) sa DNK sekvencama za konstantne regione antitela iz druge (npr. ljudske) vrste i transformacijom domaćina sa ekspresionim vektorom koji sadrži povezane sekvence kako bi mu se omogućilo da proizvede himerno antitelo. Alternativno, himerno antitelo takođe može biti ono u kojem je jedan ili više regiona ili domena teškog i/ili lakog lanca identičan sa, homologan ili varijanta odgovarajuće sekvence u monoklonskom antitelu iz druge klase ili izotipa imunoglobulina, ili iz konsenzus ili sekvence germinativne linije. Himerna antitela mogu uključivati fragmente takvih antitela, pod uslovom da fragment antitela pokazuje željenu biološku aktivnost svog matičnog antitela, na primer vezivanje za isti epitop (vidi, npr. U.S. Pat. No.4.816.567; i Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).
[0149] Termini „fragment antitela“, „fragment anti-IL-36R antitela“, „fragment anti-IL-36R epitopskog antitela“, „fragment humanizovanog anti-IL-36R antitela“, „fragment humanizovanog anti-IL-36R epitopskog antitela“, „fragment varijante humanizovanog anti-IL-36R epitopskog antitela“ odnose se na deo anti-IL-36R antitela pune dužine, u kome je zadržan varijabilni region ili funkcionalna sposobnost, na primer, specifično vezivanje za IL-36R epitop. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', F(ab')<2>, Fd, Fv, scFv i scFv-Fc fragment, diatelo, linearno antitelo, jednolančano antitelo, minitelo, diatelo formirano od fragmenata antitela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.
[0151] Antitela pune dužine mogu se tretirati enzimima kao što su papain ili pepsin za generisanje korisnih fragmenata antitela. Digestija papaina se koristi za proizvodnju dva identična fragmenta antitela koja se vezuju za antigen pod nazivom "Fab" fragmenti, od kojih svaki ima jedno mesto vezivanja za antigen, i rezidualni "Fc" fragment. Fragment Fab takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i C<H1>domen teškog lanca. Lečenje pepsinom daje F(ab')<2>fragment koji ima dva mesta vezivanja antigena i još uvek je sposoban za umrežavanje antigena.
[0153] Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po prisustvu dodatnih ostataka, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona šarki antitela na C-terminusu C<H1>domena. F(ab')<2>fragmenti antitela su parovi Fab' fragmenata povezanih cisteinskim ostacima u regionu šarke. Poznate su i druga hemijska spajanja fragmenata antitela.
[0155] Fragment "Fv" sadrži potpuno mesto prepoznavanja i vezivanja antigena koje se sastoji od dimera jednog teškog i jednog varijabilnog domena lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj asocijaciji. U ovoj konfiguraciji tri CDR-a svakog varijabilnog domena interaguju kako bi
[0158] 1
[0159] definisali mesto vezivanja antigena na površini V<H>-V<L>dimera. Kolektivno, šest CDR daje specifičnost vezanja antigena za antitelo.
[0161] Fragment "jednolančanog Fv" ili "scFv" antitela je jednolančana Fv varijanta koja sadrži V<H>i V<L>domene antitela gde su domeni prisutni u jednostrukom polipeptidnom lancu. Jednolančani Fv je sposoban da prepozna i veže antigen. scFv polipeptid može opciono da sadrži i polipeptidni linker pozicioniran između domena V<H>i V<L>da bi se olakšalo formiranje željene trodimenzionalne strukture za vezivanje antigena od strane scFv (vidi, npr. Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315).
[0163] „Diatelo“ se odnosi na male fragmente antitela sa dva mesta vezivanja antigena, koji fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (V.sub.H) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (V.sub.L) u istom polipeptidnom lancu (V.sub.H-V.sub.L ili V.sub.L-V.sub.H). Diatela su detaljnije opisana u, npr., Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
[0165] Drugi prepoznati fragmenti antitela uključuju one koji sadrže par tandemskih Fd segmenata (V<H>-C<H1>-V<H>-C<H1>) za formiranje para vezujućih regiona antigena. Ova "linearna antitela" mogu biti bispecifična ili monospecifična kao što je opisano u, na primer, Zapata et al. 1995, Protein Eng.8(10):1057-1062.
[0167] „Humanizovano antitelo“ ili „fragment humanizovanog antitela“ je specifična vrsta himernog antitela koja uključuje varijantu aminokiselinske sekvence imunoglobulina ili njen fragment, koja je sposobna da se vezuje za unapred određeni antigen i koja sadrži jedan ili više FR koji imaju suštinski aminokiselinsku sekvencu ljudskog imunoglobulina i jednog ili više CDR koji imaju suštinski aminokiselinsku sekvencu ne-humanog imunoglobulina. Ova nehumana aminokiselinska sekvenca koja se često naziva "import" sekvenca se obično uzima iz domena "import" antitela, posebno varijabilnog domena. Generalno, humanizovano antitelo uključuje najmanje CDR-ove ili HVL-ove ne-humanog antitela, insertovane između FR-ova ljudskog varijabilnog domena teškog ili lakog lanca. Ovaj pronalazak opisuje specifična humanizovana anti-IL-36R antitela koja sadrže CDR izvedene iz mišjih monoklonskih antitela ili humanizovanih CDR insertovanih između FR varijabilnih domena teškog i lakog lanca
[0170] 1
[0171] sekvence ljudske germinativne linije. Podrazumeva se da određeni mišji FR ostaci mogu biti važni za funkciju humanizovanih antitela i stoga su određeni ostaci varijabilnih domena sekvence teškog i lakog lanca ljudske germinativne linije modifikovani tako da budu isti kao i ostaci odgovarajuće mišje sekvence.
[0173] U drugom aspektu, humanizovano anti-IL-36R antitelo sadrži u suštini sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena (kao što su sadržani, na primer, u Fab, Fab', F(ab')2, Fabc i Fv fragmentima) u kojima svi, ili suštinski svi, CDR odgovaraju onima ne-humanog imunoglobulina, a posebno ovde, svi CDR su mišje ili humanizovane sekvence kao što je detaljno opisano u nastavku i svi, ili suštinski svi, FR su oni konsenzusne ili germinativne sekvence ljudskog imunoglobulina. U drugom aspektu, humanizovano anti- IL-36R antitelo takođe uključuje najmanje deo imunoglobulinskog Fc regiona, tipično onog humanog imunoglobulina. Obično, antitelo će sadržati i laki lanac, kao i barem varijabilni domen teškog lanca. Antitelo takođe može uključivati jedan ili više C<H1>, šarku, C<H2>, C<H3>i/ili C<H4>regiona teškog lanca, po potrebi.
[0175] Humanizovano anti-IL-36r antitelo može biti izabrano iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog izotipa, uključujući IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>i IgA<2>. Na primer, konstantni domen može biti konstantni domen koji fiksira komplement gde je poželjno da humanizovano antitelo pokazuje citotoksičnu aktivnost, a izotip je tipično IgG<1>. Kada takva citotoksična aktivnost nije poželjna, konstantni domen može biti drugog izotipa, npr., IgG<2>. Alternativno humanizovano anti-IL-36R antitelo može da sadrži sekvence iz više od jedne klase ili izotipa imunoglobulina, a izbor određenih konstantnih domena za optimizaciju željenih efektorskih funkcija je u okviru uobičajene stručnosti u ovoj oblasti. U specifičnim primerima izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja su IgG1 antitela i, preciznije, koja su IgG1 antitela kod kojih postoji nokaut efektorskih funkcija.
[0177] FR i CDR, ili HVL, humanizovanog anti-IL-36R antitela ne moraju precizno da odgovaraju parentalnim sekvencama. Na primer, jedan ili više ostataka u import CDR-u ili HVL-u, ili konsenzusnoj ili germinativnoj FR sekvenci mogu biti izmenjeni (npr. mutagenizovati) supstitucijom, insercijom ili delecijom tako da rezultujući aminokiselinski ostatak više nije identičan originalnom ostatku u odgovarajućoj poziciji u bilo kojoj parentalnoj sekvenci, ali antitelo ipak zadržava funkciju vezivanja za IL-36R. Takve izmene obično neće
[0180] 1
[0181] biti obimne i biće konzervativne. Obično će najmanje 75% ostataka humanizovanih antitela odgovarati ostacima parentalnog konsenzusa ili germinativne FR i importovanih CDR sekvenci, češće najmanje 90%, a najčešće više od 95%, ili više od 98% ili više od 99%.
[0183] Imunoglobulinski ostaci koji utiču na graničnu površinu između varijabilnih regiona teškog i lakog lanca (''V<L>-V<H>granična površina'') su oni koji utiču na blizinu ili orijentaciju dva lanca u međusobnom odnosu. Određeni ostaci koji mogu biti uključeni u interakcije između lanaca uključuju V<L>ostatke VL 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 i 98 i V<H>ostatke 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 i 103 (koristeći sistem numeracije utvrđen u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). U.S. Pat. No.6.407.213 takođe govori o tome da ostaci kao što su V<L>ostaci 43 i 85, i V<H>ostaci 43 i 60 takođe mogu biti uključeni u ovu interakciju. Iako su ovi ostaci indikovani samo za ljudski IgG, primenjuju se na sve vrste. Značajni ostaci antitela za koje se razumno očekuje da će biti uključeni u interakcije između lanaca izabrani su za supstituciju u konsenzusnoj sekvenci.
[0185] Termini „konsenzusna sekvenca“ i „konsenzusno antitelo“ odnose se na aminokiselinsku sekvencu koja sadrži najčešće javljajući aminokiselinski ostatak na svakoj lokaciji u svim imunoglobulinima bilo koje određene klase, izotipa ili strukture podjedinice, npr. varijabilni domen ljudskog imunoglobulina. Konsenzusna sekvenca može se bazirati na imunoglobulinima određene vrste ili mnogih vrsta. Pod „konsenzusnom“ sekvencom, strukturom ili antitelom podrazumeva se da obuhvataju konsenzusnu ljudsku sekvencu kako je opisano u određenim primerima izvođenja i da se odnose na aminokiselinsku sekvencu koja sadrži najčešće aminokiselinske ostatke na svakoj lokaciji u svim ljudskim imunoglobulinima bilo koje određene klase, izotipa ili strukture podjedinice. Dakle, konsenzusna sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja na svakoj poziciji ima aminokiselinu koja je prisutna u jednom ili više poznatih imunoglobulina, ali koja možda ne duplira tačno celu aminokiselinsku sekvencu bilo kog pojedinačnog imunoglobulina. Konsenzusna sekvenca varijabilnog regiona nije dobijena iz bilo kog prirodno proizvedenog antitela ili imunoglobulina. Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., i varijante istog.
[0187] Sekvence ljudske germinativne linije se prirodno nalaze u ljudskoj populaciji. Kombinacija tih gena germinativnih linija generiše raznolikost antitela. Sekvence
[0190] 1
[0191] germinativnih antitela za laki lanac antitela potiču od konzerviranih ljudskih germinativnih kapa ili lambda v-gena i j-gena. Slično tome, sekvence teških lanaca potiču od germinativnih v-, d- i j-gena (LeFranc, M-P and LeFranc, G, "The Immunoglobulin Facts Book" Academic Press, 2001).
[0193] Kao što se ovde koristi, „varijanta“, „anti- IL-36R varijanta“, „humanizovana anti- IL-36R varijanta“ ili „varijanta humanizovanog anti- IL-36R“ svaka se odnosi na humanizovano anti-IL-36R antitelo koje ima bar varijabilni mišji CDR lakog lanca. Varijante uključuju one koje imaju jednu ili više promena aminokiselina u jednom ili oba varijabilna domena lakog lanca ili teškog lanca, pod uslovom da promena aminokiselina ne narušava značajno vezivanje antitela za IL-36R.
[0195] ''Izolovano'' antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili oporavljeno od komponente svog prirodnog okruženja. Kontaminirajuće komponente prirodnog okruženja antitela su oni materijali koji mogu ometati dijagnostičku ili terapijsku upotrebu antitela, a mogu biti enzimi, hormoni ili druge proteinske ili neproteinske rastvorljive supstance. U jednom aspektu, antitelo će biti prečišćeno do najmanje više od 95% izolacije po težini antitela.
[0197] Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija u kojima se proizvodi, jer najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Međutim, obično će izolovano antitelo biti pripremljeno najmanje jednim korakom prečišćavanja u kome je uklonjen rekombinantni ćelijski materijal.
[0199] Termin „performanse antitela“ odnosi se na faktore koji doprinose prepoznavanju antigena antitela ili efikasnosti antitela in vivo. Promene u aminokiselinskoj sekvenci antitela mogu uticati na svojstva antitela kao što je savijanje i mogu uticati na fizičke faktore kao što su početna brzina vezivanja za antigen (k<a>), konstanta disocijacije antitela iz antigena (k<d>), konstanta afiniteta antitela za antigen (Kd), konformacija antitela, stabilnost proteina i poluživot antitela.
[0201] Termin „epitopski označen“ kada se ovde koristi, odnosi se na anti-IL-36R antitelo spojeno sa „epitopskom oznakom“. "Epitopska oznaka" je polipeptid koji ima dovoljan broj aminokiselina da obezbedi epitop za proizvodnju antitela, ali je dizajniran tako da ne ometa
[0204] 1
[0205] željenu aktivnost humanizovanog anti-IL-36R antitela. Epitopska oznaka je obično dovoljno jedinstvena da antitelo proizvedeno protiv epitopske oznake ne reaguje značajno unakrsno sa drugim epitopima. Pogodni označeni polipeptidi generalno sadrže najmanje 6 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže oko 8 do 50 aminokiselinskih ostataka, ili oko 9 do 30 ostataka. Primeri epitopskih oznaka i antitela koja se vezuju za epitop uključuju polipeptid HA oznake gripa i njegovo antitelo 12CA5 (Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol.8: 2159-2165; c-myc oznaku i 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 i 9E10 antitela na njih (Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol.5(12):3610-3616; i oznaku glikoproteina D (gD) virusa Herpes simplex i njegovo antitelo (Paborsky et al.1990, Protein Engineering 3(6): 547-553). U određenim primerima izvođenja, epitopska oznaka je "epitop koji vezuje receptor za spasavanje". Kao što se ovde koristi, termin „epitop koji vezuje receptor za spasavanje“ odnosi se na epitop Fc regiona IgG molekula (kao što je IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, ili IgG<4>koji je odgovoran za povećanje poluživota IgG molekula u serumu in vivo.
[0207] U nekim primerima izvođenja, antitela ovog pronalaska mogu biti konjugovana sa citotoksičnim agensom. To je svaka supstanca koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili uzrokuje destrukciju ćelija. Termin treba da obuhvati radioaktivne izotope (kao što su I<131>, I<125>, I<90>i Re<186>, hemoterapeutske agense i toksine kao što su enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla i njihove fragmente. Takvi citotoksični agensi se mogu povezati sa humanizovanim antitelima ovog pronalaska korišćenjem standardnih procedura i koristiti, na primer, za lečenje pacijenta indikovanog za terapiju antitelima.
[0209] „Hemoterapeutski agens“ je hemijsko jedinjenje korisno u lečenju raka. Postoje brojni primeri hemoterapijskih agenasa koji bi mogli biti konjugovani sa terapijskim antitelima ovog pronalaska. Primeri takvih hemoterapeutskih agenasa uključuju alkilirajuće agense kao što su tiotepa i ciklofosfamid; alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenine (posebno bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); kriptoficine (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin, auristatine (uključujući analoge monometil-auristatin E i monometil-auristatin F); duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CBI-TMI); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotni iperiti kao što su hlorambucil, hlomafazin,
[0212] 2
[0213] holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin; trofosfamid, uracil iperit; nitrozuree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotici kao što su enedijinski antibiotici (npr. kaliheamicin, posebno kaliheamicin gama1I i kaliheamicin fil1, vidi na primer, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186; dinemicin, uključujući dinemicin A; bisfosfonati, kao što je klodronat; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodni hromoproteinski enedijinski antibiotski hromomofori), aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (Adriamicin<™>) (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolinodoksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubucin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini kao što je mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tuberkulidin, ubenimeks, zinostatin, zorobicin; antimetaboliti kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tiogvanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgeni kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antiadrenali kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; nadoknađivači folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demokolcin; diazikvon; elfomitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; majtanzinoidi kao što su majtanzin i ansamitocini; mitoguazon, mitoksantron; mopidamol; nitrakrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK<®>; razoksan; rizoksin; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; trihoteceni (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i angidin); uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitabronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid („Ara-C“); ciklofosfamid; tiotepa; taksoidi, npr. paklitaksel (TAXOL<®>, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i doksetaksel (TAXOTERE<®>, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); hlorambucil; gemcitabin (Gemzar<™>); 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin (Navelbine<™>); novantron; tenipozid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoidi kao što je retinoinska kiselina; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore navedenih. Takođe su uključeni u ovu definiciju antihormonski agensi koji deluju na regulaciju ili inhibiciju hormonskog delovanja na tumore kao što su antiestrogeni i selektivni modulatori estrogenskih receptora (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući Nolvadex<™>), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen (Fareston<™>); inhibitori aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koja reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5) -imidazoli, aminoglutetimid, megestrol acetat (Megace<™>), eksemestan, formestan, fadrozol vorozol Rivisor<™>, letrozol (Femara<™>), i anastrozol (Arimidex<™>); i antiandrogeni kao što su flutamid, nilutamid, bicalutamid, leuprolid i goreselin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo koje prethodno navedene kiseline. Bilo koji od ovih agenasa može biti konjugovan sa humanizovanim antitelima ovog pronalaska kako bi se obezbedilo korisno terapeutsko sredstvo za lečenje različitih poremećaja.
[0215] Antitela se takođe mogu konjugovati sa prolekovima. „Prolek“ je prekursorski ili derivatni oblik farmaceutski aktivne supstance koja je manje citotoksična za tumorske ćelije u poređenju sa matičnim lekom i sposobna je da se enzimski aktivira ili konvertuje u aktivniji oblik. Vidi, na primer, Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", In Biochemical Society Transactions, 14, str.375-382, 615th Meeting Belfast i Stella et al., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press. Korisni prolekovi uključuju, ali nisu ograničeni na, prolekove koji sadrže fosfate, prolekove koji sadrže tiofosfat, prolekove koji sadrže sulfate, prolekove koji sadrže peptide, prolekove modifikovane D-amino kiselinom, glikozilirane prolekove, prolekove koji sadrže β-laktam, opciono supstituisane prolekove koji sadrže fenoksiacetamid i opciono supstituisane prolekove koji sadrže fenilacetamid, 5-fluorocitozin i druge 5-fluorouridinske prolekove koji se mogu pretvoriti u aktivniji citotoksični slobodni lek. Primeri citotoksičnih lekova koji se mogu derivatizovati u oblik proleka uključuju, ali nisu ograničeni na gore opisane hemoterapijske agense.
[0217] [0077] U dijagnostičke svrhe, kao i u svrhe terapijskog praćenja, antitela pronalaska takođe mogu biti konjugovana sa obeleživačem, bilo samo sa obeleživačem ili sa obeleživačem i dodatnim drugim agensom (prolekom, hemoterapijskim agensom i slično). Obeleživač, za razliku od drugih sekundarnih agenasa, odnosi se na agens koji je jedinjenje ili sastav koji se mogu detektovati i može se konjugovati direktno ili indirektno sa humanizovanim antitelima ovog pronalaska. Sam obeleživač može biti detektabilan (npr. radioizotopski obeleživači ili fluorescentni obeleživači) ili, u slučaju enzimskog obeleživača, može katalizovati hemijsku promenu supstratnog jedinjenja ili sastava koji se može detektovati. Obeleženo humanizovano anti-IL-36R antitelo može se pripremiti i koristiti u različitim primenama, uključujući in vitro i in vivo dijagnostiku.
[0219] Antitela ovog pronalaska mogu se formulisati kao deo liposomskog preparata kako bi se uticalo na njihovu isporuku in vivo. "Liposom" je mala vezikula sastavljena od različitih vrsta lipida, fosfolipida i/ili surfaktanta. Liposomi su korisni za isporuku sisaru jedinjenja ili formulacije, kao što je humanizovano anti-IL-36R antitelo obelodanjeno ovde, opciono, spojeno sa ili u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski aktivnih agenasa i/ili obeleživača. Komponente liposoma su obično raspoređene u dvoslojnoj formaciji, slično lipidnom rasporedu bioloških membrana.
[0221] Određeni aspekti ovog pronalaska odnose se na izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju humanizovana antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen iz ovog pronalaska. "Izolovani" molekul nukleinske kiseline je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen iz najmanje jednog kontaminirajućeg molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično povezan u prirodnom izvoru nukleinske kiseline antitela. Izolovani molekul nukleinske kiseline se razlikuje od molekula nukleinske kiseline kao što postoji u prirodnim ćelijama.
[0223] U različitim aspektima ovog pronalaska, jedan ili više domena humanizovanih antitela će biti rekombinantno eksprimirani. Takva rekombinantna ekspresija može da koristi jednu ili više kontrolnih sekvenci, tj. polinukleotidne sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane sekvence kodiranja u određenom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence pogodne za upotrebu u prokariotskim ćelijama uključuju, na primer, sekvence promotora, operatera i mesta vezivanja ribosoma. Eukariotske kontrolne sekvence uključuju, ali nisu ograničene na, promotore, signale poliadenilacije i pojačivače. Ove kontrolne sekvence se mogu koristiti za ekspresiju i proizvodnju humanizovanog anti-IL-36R antitela u prokariotskim i eukariotskim ćelijama domaćina.
[0226] 2
[0227] Sekvenca nukleinske kiseline je "operativno povezana" kada se stavi u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, presekvenca nukleinske kiseline ili sekretorni lider je operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid ako je eksprimirana kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili mesto vezivanja ribosoma je operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakšava translaciju. Generalno, „operativno povezano“ znači da su povezane DNK sekvence susedne i, u slučaju sekretornog lidera, susedne i u okviru čitanja. Međutim, pojačivači su opciono susedni. Povezivanje se vrši ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, mogu se koristiti sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri.
[0229] Kao što se ovde koristi, izrazi „ćelija“, „ćelijska linija“ i „ćelijska kultura“ koriste se naizmenično i sva takva označavanja uključuju njihovo potomstvo. Dakle, „transformanti“ i „transformisane ćelije“ uključuju primarnu predmetnu ćeliju i kulture izvedene iz nje bez obzira na broj transfera.
[0231] Termin „sisar“ u svrhu lečenja odnosi se na bilo koju životinju klasifikovanu kao sisar, uključujući ljude, pripitomljene i domaće životinje i zoološke, sportske životinje ili kućne ljubimce, kao što su psi, konji, mačke, krave i slično. Poželjno, sisar je čovek.
[0233] „Poremećaj“, kako se ovde koristi, je svako stanje koje bi imalo koristi od lečenja humanizovanim anti-IL-36R antitelima opisanim ovde. To uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući i ona patološka stanja koja sisara predisponiraju za dotičnu bolest. Neograničavajući primeri ili poremećaji koji se ovde tretiraju uključuju inflamatorne, angiogene, autoimune i imunološke poremećaje, respiratorne poremećaje, rak, hematološke maligne bolesti, benigne i maligne tumore, leukemije i limfoidne maligne bolesti.
[0235] Termini „kancer“ i „kancerozan“ odnose se na ili opisuju fiziološko stanje kod sisara koje se tipično karakteriše neregulisanim rastom ćelija. Primeri raka uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju.
[0236] Poremećaj povezan sa IL-36R uključuje bolesti i poremećaje imunog sistema, kao što su autoimuni poremećaji i inflamatorni poremećaji. Takva stanja uključuju, ali nisu ograničena na, reumatoidni artritis (RA), sistemski eritematozni lupus (SLE), sklerodermu, Sjogrenov sindrom, multiplu sklerozu, psorijazu, psorijatični artritis, inflamatornu bolest creva (npr. ulcerozni kolitis i Kronova bolest), zapaljenje pluća, astmu, idiopatsku trombocitopeničnu purpuru (ITP), epitelne inflamatorne poremećaje, fibrozu i ankilozirajući spondilitis.
[0238] Termin „intravenska infuzija“ se odnosi na uvođenje agensa u venu životinje ili ljudskog pacijenta tokom vremenskog perioda dužeg od približno 15 minuta, obično između približno 30 i 90 minuta.
[0240] Termin „intravenski bolus“ ili „intravenska infuzija“ odnosi se na primenu leka u venu životinje ili čoveka tako da telo primi lek za približno 15 minuta ili manje, obično 5 minuta ili manje.
[0242] Termin „subkutana primena“ odnosi se na uvođenje agensa pod kožu životinje ili ljudskog pacijenta, poželjno unutar džepa između kože i osnovnog tkiva, relativno sporom, održivom isporukom iz kontejnera za lek. Stiskanje ili povlačenje kože nagore i dalje od donjeg tkiva može stvoriti džep.
[0244] Termin „subkutana infuzija“ se odnosi na uvođenje leka pod kožu životinje ili ljudskog pacijenta, poželjno unutar džepa između kože i tkiva ispod nje, relativno sporom, održivom isporukom iz kontejnera za lek u vremenskom periodu koji uključuje, ali nije ograničen na, 30 minuta ili manje, ili 90 minuta ili manje. Opciono, infuzija se može izvršiti subkutanom implantacijom pumpe za isporuku leka implantirane pod kožu životinje ili ljudskog pacijenta, pri čemu pumpa isporučuje unapred određenu količinu leka u unapred određenom vremenskom periodu, kao što je 30 minuta, 90 minuta ili vremenskom periodu koji obuhvata dužinu režima lečenja.
[0246] Termin „subkutani bolus“ se odnosi na primenu leka ispod kože životinje ili ljudskog pacijenta, gde je isporuka bolusa manja od približno 15 minuta; u drugom aspektu, manje od 5 minuta, a u još jednom aspektu, manje od 60 sekundi. U još jednom aspektu, primena je unutar
[0249] 2
[0250] džepa između kože i tkiva ispod nje, gde se džep može stvoriti štipanjem ili povlačenjem kože gore i dalje od tkiva ispod nje.
[0252] Termin „terapeutski efikasna količina“ se koristi za označavanje količine aktivnog agensa koji ublažava ili olakšava jedan ili više simptoma poremećaja koji se leči. U drugom aspektu, terapijski efikasna količina se odnosi na ciljnu koncentraciju u serumu koja se pokazala efikasnom, na primer, u usporavanju progresije bolesti. Efikasnost se može meriti na konvencionalne načine, u zavisnosti od stanja koje treba lečiti.
[0254] Termini „lečenje“ i „terapija“ i slično, kako se ovde koriste, treba da obuhvate terapeutske, kao i profilaktičke, ili supresivne mere za bolest ili poremećaj koji dovodi do bilo kog klinički poželjnog ili korisnog efekta, uključujući, ali ne ograničavajući se na ublažavanje ili olakšavanje jednog ili više simptoma, regresiju, usporavanje ili prekid progresije bolesti ili poremećaja. Tako, na primer, termin lečenje uključuje primenu agensa pre ili nakon pojave simptoma bolesti ili poremećaja, čime se sprečava ili uklanja jedan ili više znakova bolesti ili poremećaja. Kao drugi primer, termin uključuje primenu agensa nakon kliničke manifestacije bolesti radi suzbijanja simptoma bolesti. Dalje, primena agensa nakon početka i nakon što se razviju klinički simptomi gde primena utiče na kliničke parametre bolesti ili poremećaja, kao što je stepen povrede tkiva ili količina ili obim metastaza, bez obzira da li lečenje dovodi do ublažavanja bolesti, obuhvata "lečenje" ili "terapiju" kako se ovde koristi. Štaviše, sve dok sastavi pronalaska bilo sami ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom ublažavaju ili olakšavaju najmanje jedan simptom poremećaja koji se leči u poređenju sa tim simptomom u odsustvu upotrebe sastava humanizovanog anti-IL-36R antitela, rezultat treba smatrati efikasnim lečenjem osnovnog poremećaja bez obzira na to da li su svi simptomi poremećaja ublaženi ili ne.
[0256] Termin „uputstvo za upotrebu“ koristi se za uputstva koja se obično nalaze u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, a koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.
[0259] 2
[0260] Antitela
[0262] U jednom aspektu, ovde opisana i obelodanjena su anti-IL-36R antitela, posebno humanizovana anti-IL-36R antitela, i sastavi koji sadrže jedno ili više anti-IL-36R antitela, posebno jedno ili više humanizovanih anti-IL-36R antitela ovog pronalaska. Opisani su i agensi za vezivanje koji uključuju antigen vezujući fragment anti-IL-36 antitela, posebno humanizovano anti-IL-36R antitelo.
[0264] Varijabilni regioni i CDR reprezentativnih antitela ovog pronalaska i referentna antitela su obelodanjeni u nastavku:
[0266] Sekvence anti-IL-36R mišjih antitela
[0268] Varijabilni regioni i CDR referentnih antitela i mišje vodeće antitelo ovog pronalaska (mišji predložak: antitelo 81 B4) prikazani su u nastavku:
[0270] Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona (VK) lakog lanca
[0273]
[0277] 2
[0278]
[0280] Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH)
[0281]
[0284] 2
[0285]
[0286]
[0287]
[0288]
[0289]
[0290]
[0293] 2
[0294]
[0297] Aminokiselinske sekvence lakog lanca CDR-1 (L-CDR1)
[0299] >33D10G1 L-CDR1
[0300] TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 21)
[0301] >172C8B12 L-CDR1
[0302] LASQTIGTWLA (SEQ ID NO: 22)
[0303] >67E7E8 L-CDR1
[0304] LASQTIGTWLG (SEQ ID NO: 23)
[0305] >78C8D1 L-CDR1
[0306] RSSQNIVHSNGNTYLQ (SEQ ID NO: 24)
[0307] >81A1D1 L-CDR1
[0308] RASQDIYKYLN (SEQ ID NO: 25)
[0309] >81B4E11 L-CDR1
[0310] TASSSVSSSYFH (SEQ ID NO: 26)
[0311] >73C5C10 L-CDR1
[0312] KASQDVGTNVL (SEQ ID NO: 27)
[0313] >73F6F8 L-CDR1
[0314] KASQDVGTNVL (SEQ ID NO: 27)
[0315] >76E10E8 L-CDR1
[0316] KASQNVGRAVA (SEQ ID NO: 28)
[0317] >89A12B8 L-CDR1
[0318] LASQTIGTWLG (SEQ ID NO: 29)
[0319] Aminokiselinske sekvence lakog lanca CDR-2 (L-CDR2)
[0321] >33D10B12 L-CDR2
[0322] STSNLAS (SEQ ID NO: 30)
[0323] >172C8B12 L-CDR2
[0324] AATSLAD (SEQ ID NO: 31)
[0325] >67E7E8 L-CDR2
[0326] RSTTLAD (SEQ ID NO: 32)
[0327] >78C8D1 L-CDR2
[0328] KVSNRFS (SEQ ID NO: 33)
[0329] >81A1D1 L-CDR2
[0330] YTSGLHS (SEQ ID NO: 34)
[0331] >81B4E11 L-CDR2
[0332] RTSNLAS (SEQ ID NO: 35)
[0333] >73C5C10 L-CDR2
[0334] SASYRHS (SEQ ID NO: 36)
[0335] >73F6F8 L-CDR2
[0336] SASYRHS (SEQ ID NO: 36)
[0337] >76E10E8 L-CDR2
[0338] SASNRYT (SEQ ID NO: 37)
[0339] >89A12B8 L-CDR2
[0340] RATSLAD (SEQ ID NO: 38)
[0342] Aminokiselinske sekvence lakog lanca CDR-3 (L-CDR3)
[0344] >33D10B12 L-CDR3
[0345] HQHHRSPVT (SEQ ID NO: 39)
[0346] >172C8B12 L-CDR3
[0347] QQVYTTPLT (SEQ ID NO: 40)
[0348] >67E7E8 L-CDR3
[0349] QQLYSAPYT (SEQ ID NO: 41)
[0350] >78C8D1 L-CDR3
[0351] FQGSHVPFT (SEQ ID NO: 42)
[0354] 1 >81A1D1 L-CDR3
[0355] QQDSKFPWT (SEQ ID NO: 43)
[0356] >81B4E11 L-CDR3
[0357] HQFHRSPLT (SEQ ID NO: 44)
[0358] >73C5C10 L-CDR3
[0359] QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 45)
[0360] >73F6F8 L-CDR3
[0361] QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 45)
[0362] >76E10E8 L-CDR3
[0363] QQYSSYPLT (SEQ ID NO: 46)
[0364] >89A12B8 L-CDR3
[0365] QQLYSGPYT (SEQ ID NO: 47)
[0367] Aminokiselinske sekvence teškog lanca CDR-1 (H-CDR1)
[0369] >33D10B12 H-CDR1
[0370] GNTVTSYWMH (SEQ ID NO: 48)
[0371] >172C8B12 H-CDR1
[0372] GYTFTDNYMN (SEQ ID NO: 49)
[0373] >67E7E8 H-CDR1
[0374] GFNIKDDYIH (SEQ ID NO: 50)
[0375] >78C8D1 H-CDR1
[0376] GFSLTKFGVH (SEQ ID NO: 51)
[0377] >81A1D1 H-CDR1
[0378] GFSLSSYEIN (SEQ ID NO: 52)
[0379] >81B4E11 H-CDR1
[0380] GYSFTSSWIH (SEQ ID NO: 53)
[0381] >73C5C10 H-CDR1
[0382] GFSLTNYAVH (SEQ ID NO: 54)
[0383] >73F6F8 H-CDR1
[0384] GFSLTNYAVH (SEQ ID NO: 54)
[0385] >76E10E8 H-CDR1
[0386] GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 55)
[0389] 2 >89A12B8 H-CDR1
[0390] GFNIKDDYIH (SEQ ID NO: 56)
[0392] Aminokiselinske sekvence teškog lanca CDR-2 (H-CDR2)
[0394] >33D10B12 H-CDR2
[0395] EILPSTGRTNYNENFKG (SEQ ID NO: 57)
[0396] >172C8B12 H-CDR2
[0397] RVNPSNGDTKYNQNFKG (SEQ ID NO: 58)
[0398] >67E7E8 H-CDR2
[0399] RIDPANGNTKYAPKFQD (SEQ ID NO: 59)
[0400] >78C8D1 H-CDR2
[0401] VIWAGGPTNYNSALMS (SEQ ID NO: 60)
[0402] >81A1D1 H-CDR2
[0403] VIWTGITTNYNSALIS (SEQ ID NO: 61)
[0404] >81B4E11 H-CDR2
[0405] EINPGNVRTNYNENF (SEQ ID NO: 62)
[0406] >73C5C10 H-CDR2
[0407] VIWSDGSTDFNAPFKS (SEQ ID NO: 63)
[0408] >73F6F8 H-CDR2
[0409] VIWSDGSTDYNAPFKS (SEQ ID NO: 64)
[0410] >76E10E8 H-CDR2
[0411] VIWPVGSTNYNSALMS (SEQ ID NO: 65)
[0412] >89A12B8 H-CDR2
[0413] RIDPANGNTKYDPRFQD (SEQ ID NO: 66)
[0415] Aminokiselinske sekvence teškog lanca CDR-3 (H-CDR3)
[0417] >33D10B12 H-CDR3
[0418] VYFGNPWFAY (SEQ ID NO: 67)
[0419] >172C8B12 H-CDR3
[0420] TKNFYSSYSYDDAMDY (SEQ ID NO: 68)
[0421] >67E7E8 H-CDR3
[0422] SFPNNYYSYDDAFAY (SEQ ID NO: 69)
[0423] >78C8D1 H-CDR3
[0424] QIYYSTLVDY (SEQ ID NO: 70)
[0425] >81A1D1 H-CDR3
[0426] GTGTGFYYAMDY (SEQ ID NO: 71)
[0427] >81B4E11 H-CDR3
[0428] VFYGEPYFPY (SEQ ID NO: 72)
[0429] >73C5C10 H-CDR3
[0430] KGGYSGSWFAY (SEQ ID NO: 73)
[0431] >73F6F8 H-CDR3
[0432] KGGYSGSWFAY (SEQ ID NO: 73)
[0433] >76E10E8 H-CDR3
[0434] MDWDDFFDY (SEQ ID NO: 74)
[0435] >89A12B8 H-CDR3
[0436] SFPDNYYSYDDAFAY (SEQ ID NO: 75)
[0438] Anti-IL-36R CDR mišje sekvence
[0440] Rezime CDR sekvenci referentnih antitela i vodećeg mišjeg antitela (antitelo 81B4) antitela prema pronalasku prikazan je u nastavku:
[0442]
[0446] 4
[0447]
[0448]
[0451] Sekvence humanizovanih antitela anti-IL-36R
[0453] Ljudske sekvence okvira izabrane su za mišje vodeće na osnovu homologije okvira, CDR strukture, konzerviranih kanonskih ostataka, konzerviranih ostataka pakovanja granične površine i drugih parametara za proizvodnju humanizovanih varijabilnih regiona (vidi primer 5).
[0455] Reprezentativni humanizovani varijabilni regioni izvedeni iz antitela 81B4 (mišji vodeći deo antitela ovog pronalaska) i 73C5 (referentno antitelo) prikazani su u nastavku.
[0457] Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona (VK) lakog lanca
[0460]
[0461]
[0462]
[0463]
[0464]
[0465]
[0466]
[0467]
[0468]
[0469]
[0470] Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH)
[0472]
[0473]
[0475] Prethodno prikazane CDR sekvence iz humanizovanih varijabilnih regiona izvedenih iz antitela 81B4 i 73C5 prikazane su u nastavku.
[0476] Aminokiselinske sekvence L-CDR1
[0478] >81B4vK32_3 L-CDR1 TASSSVSSSYFH (SEQ ID NO: 26) >81B4vK32_105 L-CDR1 TASSSVSSSYFH (SEQ ID NO: 26) >81B4vK32_116 L-CDR1 TASSSVSSSYFH (SEQ ID NO: 26) >81B4vK32_127 L-CDR1 TASSSVSSSYFH (SEQ ID NO: 26) >81B4vK32_138 L-CDR1 TASSSVSSSYFH (SEQ ID NO: 26) >81B4vK32_140 L-CDR1 TASSSVSSSYFH (SEQ ID NO: 26) >81B4vK32_141 L-CDR1 TASSSVSSSYFH (SEQ ID NO: 26) >81B4vK32_147 L-CDR1 TASSSVSSSYFH (SEQ ID NO: 26) >73C5vK39_2 L-CDR1 KASQDVGTNVL (SEQ ID NO: 27) >73C5vK39_7 L-CDR1 KASQDVGTNVL (SEQ ID NO: 27) >73C5vK39_15 L-CDR1 KASQDVGTNVL (SEQ ID NO: 27)
[0480] Aminokiselinske sekvence L-CDR2
[0482] >81B4vK32_3 L-CDR2 (SEQ ID 102) RTSTLAS
[0483] >81B4vK32_105 L-CDR2 (SEQ ID 103) RTSILAS
[0484] >81B4vK32_116 L-CDR2 (SEQ ID 104) RTSRLAS
[0487] 4 >81B4vK32_127 L-CDR2 (SEQ ID 104) RTSRLAS
[0488] >81B4vK32_138 L-CDR2 (SEQ ID 104) RTSRLAS
[0489] >81B4vK32_140 L-CDR2 (SEQ ID 105) RTSQLAS
[0490] >81B4vK32_141 L-CDR2 (SEQ ID 106) RTSKLAS
[0491] >81B4vK32_147 L-CDR2 (SEQ ID 140) RTSHLAS
[0492] >73C5vK39_2 L-CDR2
[0493] SASYRHS (SEQ ID NO: 36) >73C5vK39_7 L-CDR2
[0494] SASYRHS (SEQ ID NO: 36) >73C5vK39_15 L-CDR2
[0495] SASYRHS (SEQ ID NO: 36)
[0497] Aminokiselinske sekvence L-CDR3
[0499] >81B4vK32_3 L-CDR3
[0500] HQFHRSPLT (SEQ ID NO: 44) >81B4vK32_105 L-CDR3 HQFHRSPLT (SEQ ID NO: 44) >81B4vK32_116 L-CDR3 HQFHRSPLT (SEQ ID NO: 44) >81B4vK32_127 L-CDR3 HQFHRSPLT (SEQ ID NO: 44) >81B4vK32_138 L-CDR3 HQFHRSPLT (SEQ ID NO: 44) >81B4vK32_140 L-CDR3 HQFHRSPLT (SEQ ID NO: 44) >81B4vK32_141 L-CDR3 HQFHRSPLT (SEQ ID NO: 44) >81B4vK32_147 L-CDR3 HQFHRSPLT (SEQ ID NO: 44) >73C5vK39_2 L-CDR3 QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 45) >73C5vK39_7 L-CDR3 QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 45) >73C5vK39_15 L-CDR3 QQYSRYPLT (SEQ ID NO: 45)
[0502] Aminokiselinske sekvence L-CDR1
[0504] >81B4vH33_49 H-CDR1 GYSFTSSWIH (SEQ ID NO: 53) >81B4vH33_85T H-CDR1 GYSFTSSWIH (SEQ ID NO: 53) >81B4vH33_90 H-CDR1 GYSFTSSWIH (SEQ ID NO: 53) >81B4vH33_93 H-CDR1 GYSFTSSWIH (SEQ ID NO: 53) >81B4vH50_22 H-CDR1 GYSFTSSWIH (SEQ ID NO: 53) >81B4vH50_30 H-CDR1 GYSFTSSWIH (SEQ ID NO: 53) >81B4vH51_13 H-CDR1 GYSFTSSWIH (SEQ ID NO: 53) >81B4vH51_15 H-CDR1 GYSFTSSWIH (SEQ ID NO: 53) >81B4vH52_83 H-CDR1 GYSFTSSWIH (SEQ ID NO: 53) >73C5vH46_4 H-CDR1 GFSLTDYAVH (SEQ ID NO: 107) >73C5vH46_19 H-CDR1 GFSLTDYAVH (SEQ ID NO: 107) >73C5vH46_40 H-CDR1
[0505] GFSLTDYAVH (SEQ ID NO: 107) >73C5vH47_65 H-CDR1
[0506] GFSLTDYAVH (SEQ ID NO: 107) >73C5vH47_77 H-CDR1
[0507] GFSLTDYAVH (SEQ ID NO: 107) >73C5vH58_91 H-CDR1
[0508] GFSLTDYAVH (SEQ ID NO: 107)
[0510] Aminokiselinske sekvence L-CDR2
[0512] >81B4vH33_49 H-CDR2 EINPGNVRTNYNENF (SEQ ID NO: 62) >81B4vH33_85T H-CDR2 EINPGNVRTNYNENF (SEQ ID NO: 62) >81B4vH33_90 H-CDR2 EINPGNVRTNYNENF (SEQ ID NO: 62) >81B4vH33_93 H-CDR2 EINPGNVRTNYNENF (SEQ ID NO: 62) >81B4vH50_22 H-CDR2 EILPGVVRTNYNENF (SEQ ID NO: 108) >81B4vH50_30 H-CDR2 EINPGAVRTNYNENF (SEQ ID NO: 109) >81B4vH51_13 H-CDR2 EINPGLVRTNYNENF (SEQ ID NO: 110) >81B4vH51_15 H-CDR2 EINPGAVRTNYNENF (SEQ ID NO: 109) >81B4vH52_83 H-CDR2 EINPGSVRTNYNENF (SEQ ID NO: 111) >73C5vH46_4 H-CDR2 VIWSDGSTDYNAPFKS (SEQ ID NO: 64) >73C5vH46_19 H-CDR2 VIWSDGSTDYNAPFKS (SEQ ID NO: 64)
[0515] 4 >73C5vH46_40 H-CDR2 VIWSDGSTDYNAPFKS (SEQ ID NO: 64) >73C5vH47_65 H-CDR2 VIWSDGSTDYNAPFKS (SEQ ID NO: 64) >73C5vH47_77 H-CDR2 VIWSDGSTDFNAPFKS (SEQ ID NO: 63) >73C5vH58_91 H-CDR2 VIWSDGSTDYNAPFKS (SEQ ID NO: 64)
[0517] Aminokiselinske sekvence L-CDR3
[0519] >81B4vH33_49 H-CDR3 VFYGEPYFPY (SEQ ID NO: 72) >81B4vH33_85T H-CDR3 VFYGEPYFPY (SEQ ID NO: 72) >81B4vH33_90 H-CDR3 VFYGEPYFPY (SEQ ID NO: 72) >81B4vH33_93 H-CDR3 VFYGEPYFPY (SEQ ID NO: 72) >81B4vH50_22 H-CDR3 VFYGEPYFPY (SEQ ID NO: 72) >81B4vH50_30 H-CDR3 VFYGEPYFPY (SEQ ID NO: 72) >81B4vH51_13 H-CDR3 VFYGEPYFPY (SEQ ID NO: 72) >81B4vH51_15 H-CDR3 VFYGEPYFPY (SEQ ID NO: 72) >81B4vH52_83 H-CDR3 VFYGEPYFPY (SEQ ID NO: 72) >73C5vH46_4 H-CDR3 KGGYSGSWFAY (SEQ ID NO: 73) >73C5vH46_19 H-CDR3 KGGYSGSWFAY (SEQ ID NO: 73) >73C5vH46_40 H-CDR3
[0520] KGGYSGSWFAY (SEQ ID NO: 73)
[0521] >73C5vH47_65 H-CDR3
[0522] KGGYSGSWFAY (SEQ ID NO: 73)
[0523] >73C5vH47_77 H-CDR3
[0524] KGGYSGSWFAY (SEQ ID NO: 73)
[0525] >73C5vH58_91 H-CDR3
[0526] KGGYSGSWFAY (SEQ ID NO: 73)
[0528] U jednom aspektu, varijabilni region ovog pronalaska je povezan sa konstantnim regionom. Na primer, varijabilni region ovog pronalaska povezan je sa konstantnim regionom prikazanim u nastavku da bi se formirao teški lanac ili laki lanac antitela.
[0530]
[0533] Reprezentativne sekvence lakog i teškog lanca ovog pronalaska (laki lanac: SEQ ID NO: 116, 117, 118; teški lanac: SEQ ID NO: 125, 126, 127, 128) i referentne sekvence prikazane su u nastavku (humanizovani varijabilni regioni izvedeni iz antitela 81B4 i 73C5 povezani sa konstantnim regionima).
[0536] 4
[0537] Aminokiselinske sekvence lakog lanca
[0538]
[0541] 4
[0543] Aminokiselinske sekvence teškog lanca
[0544]
[0547] 4
[0548]
[0549]
[0550]
[0553] 4
[0554]
[0555]
[0556]
[0557]
[0558]
[0559]
[0562] 4
[0565] Prethodno navedeni CDR-ovi definisani su korišćenjem Chothia sistema numeracije (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948).
[0567] [0105] U jednom aspektu, antitelo ovog pronalaska sadrži laki lanac i varijabilni region teškog lanca kao što je prethodno navedeno. U jednom aspektu, varijabilni region lakog lanca pronalaska je spojen sa konstantnim regionom lakog lanca, na primer, kapa ili lambda konstantnim regionom. U jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca pronalaska je spojen sa konstantnim regionom teškog lanca, na primer IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM, posebno IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, ili IgG<4>.
[0569] Ovde opisano je anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 115; i teški lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 125 (antitelo B1).
[0571] Ovde je takođe opisano anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126 (antitelo B2).
[0573] Ovde je takođe opisano anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127 (antitelo B3).
[0575] Ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125 (antitelo B4).
[0577] Ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126 (antitelo B5).
[0579] Ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127 (antitelo B6).
[0581] Ovde opisano je anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138 (antitelo C3).
[0584] 1
[0585] Ovde je takođe opisano anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139 (antitelo C2).
[0587] Ovde opisano je anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138 (antitelo C1).
[0589] Reprezentativna antitela ovog pronalaska (antitela B4, B5 i B6) i referentna antitela (B1-3 i C1-3) prikazana su u nastavku.
[0591] Tabela A
[0593]
[0597] 2
[0598]
[0599] Tabela B
[0601]
[0604] Antitela ovog pronalaska su korisna u postupcima za lečenje različitih bolesti ili poremećaja, na primer imunoloških, inflamatornih, autoimunih bolesti i respiratornih bolesti kod ljudi. Na primer, antitela ovog pronalaska su korisna u postupcima za lečenje psorijaze, reumatoidnog artritisa, inflamatorne bolesti creva ili psorijatičnog artritisa. Na primer, antitela
[0607] 4
[0608] ovog pronalaska su korisna u postupcima za lečenje hroničnog opstruktivnog pulmonalnog poremećaja (COPD) ili astme. Na primer, antitela ovog pronalaska su korisna u postupcima za lečenje skleroderme, palmoplantarne pustuloze, generalizovane pustularne psorijaze, dijabetičke nefropatije, lupusnog nefritisa, skleroderme, ankilozirajućeg spondilitisa, autoimune bolesti deficijencije antagonista IL-36 receptora (DITRA), autoimune bolesti deficijencije antagonista IL-1 receptora (DIRA) ili periodičnih sindroma povezanih sa kriopirinom (CAPS).
[0610] U nekim aspektima, humanizovano antitelo pokazuje aktivnost blokiranja, pri čemu smanjuje vezivanje liganda IL-36 za receptor IL-36 za najmanje 45%, za najmanje 50%, za najmanje 55%, za najmanje 60%, za najmanje 65%, za najmanje 70%, za najmanje 75%, za najmanje 80%, za najmanje 85%, za najmanje 90% ili za najmanje 95%. Sposobnost antitela da blokira vezivanje liganda IL-36 za receptor IL-36 može se meriti korišćenjem testova kompetitivnog vezivanja, koji su poznati u struci. Alternativno, blokirajuća aktivnost antitela može se izmeriti procenom bioloških efekata IL-36, kao što je proizvodnja IL-8, IL-6 i GM-CSF kako bi se utvrdilo da li je signalizacija posredovana IL-36 receptorom inhibirana.
[0612] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje humanizovano anti-IL-36R antitelo koje ima povoljna biofizička svojstva. U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska prisutno je u monomernom obliku najmanje 90%, ili u monomernom obliku najmanje 92%, ili u monomernom obliku u puferu najmanje 95%. U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-36R antitelo ovog pronalaska ostaje najmanje 90% u monomernom obliku, ili najmanje 92% u monomernom obliku, ili najmanje 95% u monomernom obliku u puferu tokom jednog meseca ili tokom četiri meseca.
[0614] U jednom aspektu, humanizovano antitelo ovog pronalaska je antitelo B4, antitelo B5 ili antitelo B6. Shodno tome, u jednom primeru izvođenja, humanizovano antitelo ovog pronalaska sadrži sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:125 (antitelo B4). U drugom primeru izvođenja, humanizovano antitelo ovog pronalaska sadrži sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:126 (antitelo B5). U drugom primeru izvođenja, humanizovano antitelo ovog pronalaska sadrži sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:127 (antitelo B6).
[0615] U daljem primeru izvođenja, humanizovano antitelo ovog pronalaska sastoji se od sekvence lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvence teškog lanca SEQ ID NO:125 (antitelo B4). U drugom primeru izvođenja, humanizovano antitelo ovog pronalaska sastoji se od sekvence lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvence teškog lanca SEQ ID NO:126 (antitelo B5). U drugom primeru izvođenja, humanizovano antitelo ovog pronalaska sastoji se od sekvence lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvence teškog lanca SEQ ID NO:127 (antitelo B6).
[0617] U nekim primerima izvođenja, humanizovana anti-IL-36R antitela, uključujući njihove fragmente koji vezuju antigen, kao što su varijabilni regioni teškog i lakog lanca, sadrže aminokiselinsku sekvencu ostataka izvedenih iz antitela B4, antitela B5 ili antitela B6.
[0619] U daljem primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se kompetitivno vezuje za ljudski IL-36R sa antitelom ovog pronalaska, na primer antitelo B4, antitelo B5 ili antitelo B6. Sposobnost antitela ili fragmenta koji vezuje antigen da se kompetitivno veže za IL-36R može se meriti korišćenjem testova kompetitivnog vezivanja koji su poznati u struci.
[0621] Humanizovana anti-IL-36R antitela opciono uključuju specifične aminokiselinske supstitucije u konsenzusnim ili germinativnim regionima okvira. Specifična supstitucija aminokiselinskih ostataka u ovim pozicijama okvira može poboljšati različite aspekte performansi antitela, uključujući afinitet i/ili stabilnost vezivanja, u poređenju sa onim što je pokazano kod humanizovanih antitela formiranih „direktnom zamenom“ CDR-a ili HVL-a u regione okvira ljudske germinativne linije.
[0623] U nekim primerima izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje monoklonska antitela sa kombinacijama varijabilnih regiona lakog lanca i varijabilnih regiona teškog lanca SEQ ID NO: 80/88, 80/89 ili 80/87. Takvi varijabilni regioni mogu se kombinovati sa ljudskim konstantnim regionima.
[0625] [0125] U daljem primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR-ove od SEQ ID NO:80 i regione okvira koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu aminokiselinskoj sekvenci regiona okvira aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO:80 i humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR-ove SEQ ID NO:88 i regione okvira koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu aminokiselinskoj sekvenci regiona okvira aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO:88. U jednom primeru izvođenja, anti-IL-36R antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo.
[0627] U daljem primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR-ove SEQ ID NO:80 i regione okvira koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu aminokiselinskoj sekvenci regiona okvira varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO:80 i humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR-ove SEQ ID NO:89 i regione okvira koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu aminokiselinskoj sekvenci regiona okvira aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO:89. U jednom primeru izvođenja, anti-IL-36R antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo.
[0629] U daljem primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR-ove SEQ ID NO:80 i regione okvira koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu aminokiselinskoj sekvenci regiona okvira varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO:80 i humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR-ove SEQ ID NO:87 i regione okvira koji imaju aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu aminokiselinskoj sekvenci regiona okvira aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO:87. U jednom primeru izvođenja, anti-IL-36R antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo.
[0631] Anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku sadrži:
[0632] L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:26, 104, 44, 53, 62 i 72, respektivno.
[0633] U određenim primerima izvođenja, humanizovano anti-IL-36R antitelo je fragment antitela. Različiti fragmenti antitela su generalno razmatrani prethodno i postoje tehnike koje su razvijene za proizvodnju fragmenata antitela. Fragmenti se mogu izvesti proteolitičkom digestijom intaktnih antitela (vidi, npr. Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; i Brennan et al., 1985, Science 229:81). Alternativno, fragmenti se mogu proizvesti direktno u rekombinantnim ćelijama domaćina. Na primer, Fab'-SH fragmenti se mogu direktno izdvojiti iz E. coli i hemijski spojiti da bi se formirali F(ab')<2>fragmenti (vidi, npr. Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167). Drugim pristupom, F(ab')<2>fragmenti se mogu izolovati direktno iz kulture rekombinantnih ćelija domaćina. Ostale tehnike za proizvodnju fragmenata antitela biće očigledne kvalifikovanom praktičaru. Shodno tome, u jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje fragmente antitela koji sadrže kombinacije L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenci SEQ ID NO: 26, 104, 44, 53, 62 i 72.
[0635] Određeni primeri izvođenja uključuju F(ab')<2>fragment humanizovanog anti-IL-36R antitela koji sadrži sekvencu lakog lanca bilo koje od SEQ ID NO: 118 u kombinaciji sa sekvencom teškog lanca SEQ ID NO: 125, 126 ili 127. Takvi primeri izvođenja mogu uključivati intaktno antitelo koje sadrži takvo F(ab')<2>.
[0637] U nekim primerima izvođenja, antitelo ili fragment antitela uključuje konstantni region koji posreduje u efektorskoj funkciji. Konstantni region može pružiti odgovore ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), ćelijske fagocitoze zavisne od antitela (ADCP) i/ili citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) protiv ciljne ćelije koja eksprimira IL-36R. Efektorski domen(i) mogu biti, na primer, Fc region Ig molekula.
[0639] Efektorski domen antitela može biti od bilo koje pogodne vrste i izotipa kičmenjaka. Izotipovi različitih životinjskih vrsta razlikuju se u sposobnostima posredovanja efektorskih funkcija. Na primer, sposobnost ljudskog imunoglobulina da posreduje u CDC i ADCC/ADCP je generalno u redosledu IgM≈IgG<1>≈IgG<3>>IgG<2>>IgG<4>i IgG<1>=IgG<3>>IgG<2>/IgM/IgG<4>, respektivno. Mišji imunoglobulini u CDC i ADCC/ADCP generalno u redosledu mišjih IgM≈IgG<3>>>IgG<2b>>IgG<2a>>>IgG<1>i IgG<2b>>IgG<2a>>IgG<1>>>IgG<3>, respektivno. U drugom primeru, mišji IgG<2a>posreduje u ADCC, dok i mišji IgG<2a>i IgM posreduju u CDC.
[0640] Modifikacije antitela
[0642] Humanizovana anti-IL-36R antitela i agensi mogu uključivati modifikacije humanizovanog anti-IL-36R antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen. Na primer, može biti poželjno modifikovati antitelo u pogledu efektorske funkcije, kako bi se poboljšala efikasnost antitela u lečenju raka. Jedna od takvih modifikacija je uvođenje cisteinskih ostataka u Fc region, čime se omogućava formiranje disulfidne veze između lanaca u ovom regionu. Tako generisano homodimerno antitelo može imati poboljšanu sposobnost internalizacije i/ili povećano ubijanje ćelija posredovano komplementom i/ili ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Vidi, na primer, Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; i Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922. Homodimerna antitela koja imaju pojačanu antitumorsku aktivnost takođe se mogu pripremiti korišćenjem heterobifunkcionalnih umrežavajućih sredstava kao što je opisano u Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565. Alternativno, antitelo se može konstruisati tako da sadrži dvostruke Fc regione, poboljšavajući lizu komplementa i ADCC sposobnosti antitela. Vidi Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230.
[0644] Antitela sa poboljšanom sposobnošću da podrže ADCC generisana su modifikacijom obrasca glikozilacije njihovog Fc regiona. Ovo je moguće jer je glikozilacija antitela na ostatku asparagina, N297, u C<H2>domenu uključena u interakciju između IgG i Fcγ receptora koji su preduslov za ADCC. Ćelijske linije domaćina su konstruisane da eksprimiraju antitela sa izmenjenom glikozilacijom, kao što je povećano bisektovanje N-acetilglukozamina ili redukovana fukoza. Redukcija fukoze obezbeđuje veće poboljšanje aktivnosti ADCC nego povećanje prisustva bisekcirajućeg N-acetilglukozamina. Štaviše, pojačanje ADCC antitelima sa niskim sadržajem fukoze je nezavisno od polimorfizma FcγRIIIa V/F.
[0646] Modifikovanje aminokiselinske sekvence Fc regiona antitela je alternativa inženjeringu glikozilacije radi poboljšanja ADCC-a. Mesto vezivanja na ljudskom IgG<1>za Fcγ receptore određeno je opsežnom mutacionom analizom. To je dovelo do generisanja humanizovanih IgG<1>antitela sa Fc mutacijama koje povećavaju afinitet vezivanja za FcyRIIIa i poboljšavaju ADCC in vitro. Pored toga, Fc varijante su dobijene sa mnogo različitih permutacija svojstava vezivanja, npr. poboljšano vezivanje za specifične FcγR receptore sa nepromenjenim ili smanjenim vezivanjem za druge FcγR receptore.
[0647] Drugi aspekt uključuje imunokonjugate koji sadrže humanizovano antitelo ili njegove fragmente konjugovane sa citotoksičnim agensom kao što je hemoterapeutski agens, toksin (npr. enzimski aktivni toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla ili njegovi fragmenti) ili radioaktivni izotop (tj. radioaktivni konjugat).
[0649] Hemoterapeutski agensi korisni u generisanju takvih imunokonjugata su prethodno opisani. Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu koristiti za formiranje korisnih imunokonjugata uključuju lanac difterije A, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, lanac egzotoksina A (iz Pseudomonas aeruginosa), lanac ricina A, lanac abrin A, lanac modekcina A, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, diantinske proteine, proteine Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin, trikoteceni i slično. Za proizvodnju radiokonjugovanih humanizovanih anti-IL-36R antitela dostupni su različiti radionuklidi. Primeri uključuju<212>Bi,<131>I,<131>In,<90>Y, i<186>Re.
[0651] Konjugati humanizovanog anti-IL-36R antitela i citotoksičnog ili hemoterapijskog agensa mogu se izraditi poznatim postupcima, korišćenjem različitih bifunkcionalnih agenasa za spajanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutareldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bisaktivna fluor jedinjenja (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina se može pripremiti kako je opisano u Vitetta et al., 1987, Science 238:1098. 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom-14 je primer helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Konjugati se takođe mogu formirati sa cepivim linkerom.
[0653] [0139] Humanizovana anti-IL-36R antitela koja su ovde obelodanjena takođe se mogu formulisati kao imunoliposomi. Liposomi koji sadrže antitelo pripremljeni su postupcima koji su poznati u struci, kao što je opisano u Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; i U.S. Pat. No.4,485,045 i 4,544,545. Liposomi koji imaju povećano vreme cirkulacije obelodanjeni su, na primer, u U.S. Pat. No.5,013,556.
[0655] Posebno korisni liposomi mogu se generisati postupkom reverznog faznog isparavanja sa lipidnim sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Liposomi su ekstrudirani kroz filtere definisane veličine pora da bi se dobili liposomi sa željenim prečnikom. Fab' fragmenti antitela koji su ovde obelodanjeni mogu se konjugovati sa liposomima kao što je opisano u Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288 putem reakcije disulfidne izmene. Hemoterapeutski agens (kao što je doksorubicin) je opciono sadržan u liposomu. Vidi, npr. Gabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst.81(19):1484.
[0657] Ovde opisana i obelodanjena antitela takođe se mogu koristiti u ADEPT (terapija prolekom enzima usmerenim na antitela) procedurama konjugacijom antitela sa enzimom koji aktivira prolek i koji pretvara prolek (npr. peptidil hemoterapeutski agens) u aktivni lek protiv raka. Vidi, na primer, WO 81/01145, WO 88/07378 i U.S. Pat. No. 4,975,278. Enzimska komponenta imunokonjugata korisna za ADEPT je enzim sposoban da deluje na prolek na takav način da ga konvertuje u njegov aktivniji, citotoksični oblik. Specifični enzimi koji su korisni u ADEPT uključuju, ali nisu ograničeni na, alkalnu fosfatazu za pretvaranje prolekova koji sadrže fosfate u slobodne lekove; arilsulfatazu za pretvaranje prolekova koji sadrže sulfate u slobodne lekove; citozin deaminazu za pretvaranje netoksičnog 5-fluorocitozina u lek protiv raka, 5-fluorouracil; proteaze, kao što su seratija proteaza, termolizin, subtilizin, karboksipeptidaze i katepsini (kao što su katepsini B i L), za pretvaranje prolekova koji sadrže peptide u slobodne lekove; D-alanilkarboksipeptidaze, za pretvaranje prolekova koji sadrže D-aminokiselinske supstituente; enzime koji cepaju ugljene hidrate kao što su b-galaktozidaza i neuraminidaza za pretvaranje glikozilovanih prolekova u slobodne lekove; beta-laktamazu za pretvaranje lekova derivatizovanih sa beta-laktamima u slobodne lekove; i penicilin amidaze, kao što su penicilin V amidaza ili penicilin G amidaza, za pretvaranje lekova derivatizovanih na njihovim aminskim azotima sa fenoksiacetil ili fenilacetil grupama, respektivno, u slobodne lekove. Alternativno, antitela koja imaju enzimsku aktivnost ("abzimi") mogu se koristiti za pretvaranje prolekova u slobodne aktivne lekove (vidi, na primer, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Konjugati antitela i abzima mogu se pripremiti poznatim postupcima za isporuku abzima populaciji tumorskih ćelija, na primer, kovalentnim vezivanjem enzima za
[0660] 1
[0661] humanizovano anti-IL-36R antitelo/heterobifunkcionalne reagense za umrežavanje o kojima je prethodno bilo reči. Alternativno, fuzioni proteini koji sadrže bar region za vezivanje antigena antitela, koji je ovde obelodanjen povezanog sa bar funkcionalno aktivnim delom enzima kao što je prethodno opisano mogu se konstruisati korišćenjem tehnika rekombinantne DNK (vidi, npr. Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608).
[0663] U određenim primerima izvođenja, može biti poželjno koristiti fragment humanizovanog anti-IL-36R antitela, umesto intaktnog antitela, kako bi se povećala penetracija u tkivo, na primer. Možda je poželjno modifikovati fragment antitela kako bi se produžio njegov poluživot u serumu. To se može postići, na primer, ugradnjom epitopa koji vezuje spasilački receptor u fragment antitela. U jednom postupku, odgovarajući region fragmenta antitela može biti izmenjen (npr. mutiran), ili epitop može biti ugrađen u peptidnu oznaku koja se zatim spaja sa fragmentom antitela na bilo kom kraju ili u sredini, na primer, sintezom DNK ili peptida. Vidi, npr. WO 96/32478.
[0665] U drugim primerima izvođenja, takođe su uključene kovalentne modifikacije humanizovanog anti-IL-36R antitela. Kovalentne modifikacije uključuju modifikaciju ostataka cisteinila, ostataka histidila, ostataka lizinila i amino-terminalnih ostataka, ostataka arginila, ostataka tirozila, karboksilnih bočnih grupa (aspartil ili glutamil), ostataka glutaminila i asparaginila, ili ostataka serila ili treonila. Druga vrsta kovalentne modifikacije uključuje hemijsko ili enzimsko spajanje glikozida sa antitelom. Takve modifikacije se mogu izvršiti hemijskom sintezom ili enzimskim ili hemijskim cepanjem antitela, ako je primenljivo. Druge vrste kovalentnih modifikacija antitela mogu se uvesti u molekul reakcijom ciljanih aminokiselinskih ostataka antitela sa organskim derivatizujućim agensom koji je sposoban da reaguje sa izabranim bočnim lancima ili aminokiselinskim ili karboksi-terminalnim ostacima.
[0667] Uklanjanje bilo kojih delova ugljenih hidrata prisutnih na antitelu može se izvršiti hemijski ili enzimski. Hemijsku deglikozilaciju je opisao Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 i Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131. Enzimsko cepanje delova ugljenih hidrata na polipeptidima može se postići upotrebom različitih endo- i egzoglikozidaza kako je opisano kod Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350.
[0670] 2
[0671] Druga vrsta korisne kovalentne modifikacije sadrži povezivanje antitela sa jednim od različitih neproteinskih polimera, npr. polietilen glikolom, polipropilen glikolom ili polioksialkilenima, na način naveden u jednom ili više U.S. Pat. No.4.640.835, U.S. Pat. No.
[0672] 4.496.689, U.S. Pat. No. 4.301.144, U.S. Pat. No. 4.670.417, U.S. Pat. No. 4.791.192 i U.S. Pat. No.4.179.337.
[0674] Humanizacija i varijante aminokiselinske sekvence
[0676] Varijante aminokiselinske sekvence anti-IL-36R antitela mogu se pripremiti uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u DNK anti-IL-36R antitela ili sintezom peptida. Takve varijante uključuju, na primer, delecije i/ili insercije u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci anti-IL-36R antitela iz primera ovde. Svaka kombinacija delecija, insercija i supstitucija vrši se kako bi se došlo do konačnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt poseduje željene karakteristike. Promene aminokiselina takođe mogu da promene posttranslacione procese humanizovanog ili varijantnog anti-IL-36R antitela, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije.
[0678] Korisni postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regiona anti-IL-36R antitela koji su poželjne lokacije za mutagenezu naziva se „mutageneza skeniranjem alanina“, kako su opisali Cunningham and Wells (Science, 244: 1081-1085 (1989)). Ovde se identifikuje ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) i zamenjuju neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (obično alanin) kako bi se uticalo na interakciju aminokiselina sa IL-36R antigenom. Te lokacije aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu senzitivnost na supstitucije se zatim rafinišu uvođenjem daljih ili drugih varijanti na mestima supstitucije ili za mesta supstitucije. Dakle, dok je mesto za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određeno, priroda mutacije sama po sebi ne mora biti unapred određena. Na primer, da bi se analiziralo dejstvo mutacije na datom mestu, skeniranje alaninom ili slučajna mutageneza se sprovodi na ciljnom kodonu ili regionu, a eksprimirane varijante anti-IL-36R antitela se skrinuju na željenu aktivnost.
[0680] [0148] Insercije aminokiselinske sekvence uključuje fuzije amino- i/ili karboksil terminala u rasponu dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekventne insercije jednog ili više aminokiselinskih ostataka u sekvencu. Primeri terminalnih insercija uključuju anti-IL-36R antitelo spojeno sa epitopskom oznakom. Druge insercione varijante molekula anti-IL-36R antitela uključuju fuziju enzima ili polipeptida sa N-ili C-terminusom anti-IL-36R antitela, što povećava poluživot antitela u serumu.
[0682] Druga vrsta varijante je varijanta supstitucije aminokiselina. Ove varijante imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u molekulu anti-IL-36R antitela uklonjen i različiti ostatak insertovan na njegovo mesto. Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regione, ali se razmatraju i promene FR. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 5 pod naslovom „poželjne supstitucije“. Ako takve supstitucije dovedu do promene biološke aktivnosti, onda se mogu uvesti značajnije promene, pod nazivom „primerne supstitucije“ ili kako je dalje opisano u nastavku u vezi sa klasama aminokiselina, i proizvodi se mogu skrinovati.
[0684] TABELA C
[0686]
[0690] 4
[0691]
[0694] U hemiji proteina, opšte je prihvaćeno da se biološka svojstva antitela mogu postići odabirom supstitucija koje se značajno razlikuju po svom uticaju na održavanje (a) strukture polipeptidnog lanca u području supstitucije, na primer, kao pločaste ili spiralne konformacije, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljnom mestu, ili (c) većeg dela bočnog lanca. Prirodni ostaci su podeljeni u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca:
[0695] 1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile;
[0696] (2) neutralni hidrofilni: cys, ser, thr;
[0697] (3) kiseli: asp, glu;
[0698] (4) bazni: asn, gln, his, lys, arg;
[0699] 5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i
[0700] (6) aromatični: trp, tyr, phe;
[0702] Nekonzervativne supstitucije podrazumevaju zamenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.
[0704] Svaki cisteinski ostatak koji nije uključen u održavanje pravilne konformacije humanizovanog ili varijantnog anti-IL-36R antitela takođe može biti supstituisan, generalno serinom, kako bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekula, sprečilo aberantno umrežavanje ili obezbedile utvrđene tačke konjugacije sa citotoksičnim ili citostatičnim jedinjenjem.
[0706] Nasuprot tome, cisteinske veze se mogu dodati antitelima kako bi se poboljšala njihova stabilnost (posebno kada je antitelo fragment antitela kao što je Fv fragment).
[0708] [0154] Tip supstitucione varijante uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili ljudskog antitela). Generalno, rezultujuće varijante izabrane za dalji razvoj imaće poboljšana biološka svojstva u odnosu na matično antitelo iz kojeg su generisane. Pogodan način za generisanje takvih supstitucionih varijanti uključuje afinitetno sazrevanje korišćenjem prikaza na fagu. Ukratko, nekoliko mesta hipervarijabilnog regiona (npr.6-7 mesta) je mutirano da bi se generisale sve moguće aminosupstitucije na svakom mestu. Tako generisane varijante antitela prikazane su na monovalentan način iz čestica filamentoznih faga kao fuzije sa proizvodom gena III M13 upakovanog unutar svake čestice. Varijante prikazane na fagu se zatim skrinuju na njihovu biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja). Da bi se identifikovala mesta hipervarijabilnih regiona kandidata za modifikaciju, može se izvršiti mutageneza skeniranjem alanina kako bi se identifikovali ostaci hipervarijabilnih regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigenantitelo kako bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela i ljudskog IL-36R. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju u skladu sa ovde razrađenim tehnikama. Kada se takve varijante generišu, panel varijanti se podvrgava skriningu kao što je ovde opisano i antitela sa superiornim svojstvima u jednom ili više relevantnih testova mogu se izabrati za dalji razvoj.
[0710] Druga vrsta aminokiselinske varijante antitela menja originalni obrazac glikozilacije antitela. Pod „promenom“ se podrazumeva delecija jednog ili više delova ugljenih hidrata koji se nalaze u antitelima i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koja nisu prisutna u antitelima.
[0712] [0156] U nekim primerima izvođenja, može biti poželjno modifikovati antitela pronalaska da bi se dodala mesta glikozilacije. Glikozilacija antitela je tipično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezano se odnosi na vezivanje ugljenohidratnog dela za bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenohidratnog dela za asparaginski bočni lanac. Dakle, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze za hidroksi aminokiselinu, najčešće serina ili treonina, iako se takođe može koristiti 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin. Dakle, da bi se glikozilirao dati protein, npr. antitelo, aminokiselinska sekvenca proteina je projektovana da sadrži jednu ili više prethodno opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-vezana mesta glikozilacije). Promena se takođe može izvršiti adicijom ili supstitucijom jednim ili više serinskih ili treoninskih ostataka sekvenci originalnog antitela (za O-vezana mesta glikozilacije).
[0714] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijante aminokiselinske sekvence anti-IL-36R antitela pripremaju se različitim postupcima poznatim u struci. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, izolovanje iz prirodnog izvora (u slučaju prirodnih varijanti aminokiselinske sekvence) ili pripremu oligonukleotidima posredovanom (ili usmerenom na mesto) mutagenezom, PCR mutagenezom i kasetnom mutagenezom ranije pripremljene varijante ili nevarijantne verzije anti-IL-36R antitela.
[0716] Polinukleotidi, vektori, ćelije domaćina i rekombinantni postupci
[0718] Ostala otelotvorenja obuhvataju izolovane polinukleotide koji sadrže sekvencu koja kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo, vektore i ćelije domaćina koji sadrže polinukleotide i rekombinantne tehnike za proizvodnju humanizovanog antitela. Izolovani polinukleotidi mogu da kodiraju bilo koji željeni oblik anti-IL-36R antitela, uključujući, na primer, monoklonska antitela pune dužine, Fab, Fab', F(ab')<2>i Fv fragmente, diatela, linearna antitela, molekule jednolančanih antitela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.
[0720] Neka otelotvorenja uključuju izolovane polinukleotide koji sadrže sekvence koje kodiraju varijabilni region lakog lanca antitela ili fragmenta antitela koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO:78, 79 ili 80. Neka otelotvorenja uključuju izolovane polinukleotide koji sadrže sekvence koje kodiraju varijabilni region teškog lanca antitela ili fragment antitela koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87, 88, 89 ili 90.
[0722] U jednom aspektu, izolovane polinukleotidne sekvence kodiraju antitelo ili fragment antitela koji ima varijabilni region lakog lanca i teškog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:118 i SEQ ID NO:126, respektivno; SEQ ID NO:118 i SEQ ID NO:127, respektivno; ili SEQ ID NO:118 i SEQ ID NO:125, respektivno.
[0724] [0161] Polinukleotidi koji sadrže sekvencu koja kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment ili lanac mogu se fuzionisati u jednu ili više regulatornih ili kontrolnih sekvenci, kao što je poznato u struci, i mogu biti sadržani u odgovarajućim ekspresijskim vektorima ili ćeliji domaćina kao što je poznato u struci. Svaki od polinukleotidnih molekula koji kodiraju varijabilne domene teškog ili lakog lanca može se nezavisno fuzionisati sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira konstantni domen, kao što je ljudski konstantni domen, omogućavajući proizvodnju intaktnih antitela. Alternativno, polinukleotidi, ili njihovi delovi, mogu se fuzionisati zajedno, pružajući šablon za proizvodnju jednolančanog antitela.
[0726] Za rekombinantnu proizvodnju, polinukleotid koji kodira antitelo insertuje se u replicirajući vektor za kloniranje (amplifikaciju DNK) ili za ekspresiju. Dostupni su mnogi pogodni vektori za eksprimiranje rekombinantnog antitela. Komponente vektora generalno uključuju, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: signalnu sekvencu, poreklo replikacije, jedan ili više marker gena, element pojačivača, promoter i sekvencu završetka transkripcije.
[0728] Humanizovana anti-IL-36R antitela se takođe mogu proizvesti kao fuzioni polipeptidi, u kojima je antitelo fuzionisano sa heterolognim polipeptidom, kao što je signalna sekvenca ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na amino terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Izabrana heterologna signalna sekvenca je obično ona koja se prepoznaje i obrađuje (tj. cepa signalnom peptidazom) od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne obrađuju signalnu sekvencu humanizovanog anti-IL-36R antitela, signalna sekvenca može biti supstituisana prokariotskom signalnom sekvencom. Signalna sekvenca može biti, na primer, alkalna fosfataza, penicilinaza, lipoprotein, toplotno stabilni lideri enterotoksina II i slično. Za sekreciju kvasca, nativna signalna sekvenca može biti supstituisana, na primer, vodećom sekvencom dobijenom iz alfa-faktora invertaze kvasca (uključujući lidere α-faktora Saccharomyces i Kluyveromyces), kisele fosfataze, glukoamilaze C. albicans ili signala opisanog u WO90/13646. U ćelijama sisara mogu se koristiti signalne sekvence sisara, kao i lideri virusne sekrecije, na primer, gD signal herpes simpleksa. DNK za takav prekursorski region je ligiran u okviru čitanja sa DNK koja kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo.
[0730] [0164] Vektori ekspresije i kloniranja sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava vektoru da se replicira u jednoj ili više izabranih ćelija domaćina. Generalno, u vektorima kloniranja ova sekvenca je ona koja omogućava vektoru da se replicira nezavisno od hromozomske DNK domaćina, i uključuje poreklo replikacije ili sekvenci koje se autonomno repliciraju. Takve sekvence su dobro poznate po raznim bakterijama, kvascima i virusima. Poreklo replikacije iz plazmida pBR322 je pogodno za većinu gram-negativnih bakterija, poreklo 2-u. plazmida je pogodno za kvasac, a porekla različitih virusa (SV40, poliom, adenovirus, VSV i BPV) su korisna za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Generalno, poreklo komponente replikacije nije potrebno za vektore ekspresije kod sisara (poreklo SV40 se obično može koristiti samo zato što sadrži rani promoter).
[0732] Vektori ekspresije i kloniranja mogu sadržati gen koji kodira selektivni marker kako bi se olakšala identifikacija ekspresije. Tipični selektivni marker geni kodiraju proteine koji daju rezistenciju na antibiotike ili druge toksine, npr. ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, ili alternativno, imaju auksotrofne nedostatke komplementa, ili u drugim alternativama snabdevaju specifične hranljive materije koje nisu prisutne u složenim medijima, npr. gen koji kodira D-alanin racemazu za bacile.
[0734] Jedan primer šeme selekcije koristi lek za zaustavljanje rasta ćelije domaćina. One ćelije koje se uspešno transformišu heterolognim genom proizvode protein koji daje otpornost na lekove i na taj način preživljavaju režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin.
[0736] Uobičajeni selektivni markeri za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija kompetentnih da preuzmu nukleinsku kiselinu koja kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo, kao što su DHFR (dihidrofolat reduktaza), timidin kinaza, metalotionein-I i -II (kao što su geni metalotioneina primata), adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza i slično. Ćelije transformisane genom za selekciju DHFR prvo se identifikuju kultivacijom svih transformanata u hranljivoj podlozi koja sadrži metotreksat (Mtx), konkurentni antagonist DHFR-a. Odgovarajuća ćelija domaćin kada se koristi DHFR divljeg tipa je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) sa nedostatkom DHFR aktivnosti (npr. DG44).
[0738] [0168] Alternativno, ćelije domaćina (posebno domaćini divljeg tipa koji sadrže endogeni DHFR) transformisane ili ko-transformisane DNK sekvencama koje kodiraju anti-IL-36R antitelo, divlji tip DHFR proteina i drugi selektabilni marker, kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH), mogu se izabrati rastom ćelija u medijumu koji sadrži sredstvo za selekciju za selektabilni marker, kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr. kanamicin, neomicin ili G418. Vidi, npr. U.S. Pat. No.4,965,199.
[0740] Kada se rekombinantna proizvodnja vrši u ćeliji kvasca kao ćeliji domaćina, TRP1 gen prisutan u plazmidu kvasca YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39) može se koristiti kao selektabilni marker. Gen TRP1 obezbeđuje marker selekcije za mutirani soj kvasca koji nema sposobnost da raste u triptofanu, na primer, ATCC br. 44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). Prisustvo lezije trp1 u genomu ćelije domaćina kvasca zatim pruža efikasno okruženje za detekciju transformacije rastom u odsustvu triptofana. Slično tome, sojevi kvasca sa nedostatkom Leu2p kao što su ATCC 20.622 i 38.626 dopunjeni su poznatim plazmidima koji nose gen LEU2.
[0742] Pored toga, vektori izvedeni iz kružnog plazmida pKD1 od 1,6 µm mogu se koristiti za transformaciju kvasaca Kluyveromyces. Alternativno, prijavljen je sistem ekspresije za veliku proizvodnju rekombinantnog telećeg himozina za K. lactis (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). Takođe su obelodanjeni stabilni vektori ekspresije sa više kopija za sekreciju zrelog rekombinantnog ljudskog serumskog albumina industrijskim sojevima Kluyveromyces (Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975).
[0744] Vektori ekspresije i kloniranja obično sadrže promoter koji je prepoznat od strane organizma domaćina i operativno je povezan sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira anti-IL-36R antitelo ili njegov polipeptidni lanac. Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promoter, sisteme promotera β-laktamaze i laktoze, alkalnu fosfatazu, triptofan (trp) promoter sistem i hibridne promotere kao što je tac promoter. Pogodni su i drugi poznati bakterijski promoteri. Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima takođe će sadržati sekvencu Shine-Dalgarno (S.D.) koja je operativno povezana sa DNK koja kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo.
[0746] [0172] Poznate su mnoge sekvence eukariotskih promotera. Praktično svi eukariotski geni imaju region bogat AT-om koji se nalazi oko 25 do 30 baza uzvodno od mesta gde je inicirana transkripcija. Druga sekvenca pronađena 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region gde N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskih gena je AATAAA sekvenca koja može biti signal za adiciju poly A repa na 3' kraj kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence su odgovarajuće insertovane u eukariotske ekspresione vektore.
[0748] Primeri pogodnih promotivnih sekvenci za upotrebu sa domaćinima kvasca uključuju promotere za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, kao što su enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triosefosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i glukokinaza.
[0750] Inducibilni promoteri imaju dodatnu prednost transkripcije kontrolisanu uslovima rasta. To uključuje regione promotera kvasca za alkohol dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselu fosfatazu, derivate enzima povezane sa metabolizmom azota, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu i enzime odgovorne za korišćenje maltoze i galaktoze. Pogodni vektori i promoteri za upotrebu u ekspresiji kvasca su dalje opisani u EP 73,657. Pojačivači kvasca se povoljno koriste sa promoterima kvasca.
[0752] Humanizovana transkripcija anti-IL-36R antitela sa vektora u ćelijama domaćina sisara kontroliše se, na primer, promoterima dobijenim iz genoma virusa kao što su polioma virus, virus boginja peradi, adenovirus (kao što je adenovirus 2), virus papiloma goveda, virus sarkoma ptica, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa B i virus majmuna 40 (SV40), od heterolognih promotera sisara, npr. promotera aktina ili promotera imunoglobulina, ili od promotera toplotnog šoka, pod uslovom da su takvi promoteri kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.
[0754] Rani i kasni promoteri virusa SV40 se pogodno dobijaju kao restrikcioni fragment SV40 koji takođe sadrži mesto početka replikacije virusa SV40. Neposredni rani promoter humanog citomegalovirusa se zgodno dobija kao restrikcioni fragment Hindlll E. Sistem za eksprimiranje DNK kod domaćina sisara koji koriste goveđi papiloma virus kao vektor obelodanjen je u U.S. Pat. No.4.419.446. Modifikacija ovog sistema je opisana u U.S. Pat. No.
[0755] 4,601,978. Vidi takođe Reyes et al., 1982, Nature 297: 598-601, obelodanjujući ekspresiju humanog p-interferona cDNK u mišjim ćelijama pod kontrolom promotera timidin kinaze iz herpes simpleks virusa. Alternativno, dugo terminalno ponavljanje Rous sarcoma virusa može se koristiti kao promoter.
[0758] 1
[0759] Još jedan koristan element koji se može koristiti u rekombinantnom ekspresionom vektoru je sekvenca pojačivača, koja se koristi za povećanje transkripcije DNK koja kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo od strane viših eukariota. Mnoge sekvence pojačivača su sada poznate iz gena sisara (npr. globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein i insulin). Tipično, međutim, koristi se pojačivač iz virusa eukariotskih ćelija. Primeri uključuju pojačivač SV40 na kasnoj strani mesta početka replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani mesta početka replikacije i pojačivače adenovirusa. Vidi takođe Yaniv, 1982, Nature 297:17-18 za opis elemenata koji poboljšavaju aktivaciju eukariotskih promotera. Pojačivač može biti splajsovan u vektor na poziciji 5' ili 3' u odnosu na humanizovanu sekvencu koja kodira anti-IL-36R antitela, ali se poželjno nalazi na mestu 5' od promotera.
[0761] Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćina (kvasac, gljivice, insekti, biljne, životinjske, ljudske ili ćelije sa jedrom iz drugih višećelijskih organizama) takođe mogu da sadrže sekvence neophodne za prekid transkripcije i za stabilizaciju iRNK. Takve sekvence su obično dostupne iz 5' i, povremeno 3', netransliranih regiona eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilisani fragmenti u netransliranom delu iRNK koji kodira anti-IL-36R antitelo. Jedna korisna komponenta za terminaciju transkripcije je region poliadenilacije goveđeg hormona rasta. Vidi WO94/11026 i ekspresioni vektor koji je u njemu obelodanjen. U nekim primerima izvođenja, humanizovana anti-IL-36R antitela mogu se eksprimirati korišćenjem sistema CHEF. Vidi, npr. U.S. Pat. No.5.888.809)
[0763] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili eksprimiranje DNK u vektorima ovde su gore opisane ćelije prokariota, kvasca ili viših eukariota. Pogodni prokarioti u ovu svrhu uključuju eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što je Escherichia, npr. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr. Salmonella typhimurium, Serratia, npr. Serratia marcescans i Shigella, kao i Bacilli kao što su B. subtilis i B. licheniformis (npr. B. licheniformis 41 P obelodanjeno u DD 266.710 published Apr.12, 1989), Pseudomonas kao što je P. aeruginosa i Streptomyces. Jedan poželjan domaćin za kloniranje E. coli je E. coli 294 (ATCC 31,446), iako
[0766] 2
[0767] su pogodni drugi sojevi kao što su E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) i E. coli W3110 (ATCC 27,325). Ovi primeri su ilustrativni, a ne ograničavajući.
[0769] Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne gljive ili kvasac su pogodni domaćini kloniranja ili ekspresije za humanizovane vektore koji kodiraju anti-IL-36R antitela. Saccharomyces cerevisiae, ili obični pekarski kvasac, je najčešće koršćen kada su u pitanju mikroorganizmi niži eukariotski domaćini. Međutim, brojni drugi rodovi, vrste i sojevi su ovde obično dostupni i korisni, kao što su Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces domaćini kao što su K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans i K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis; i filamentozne gljive kao što su Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i Aspergillus domaćini kao što su A. nulans i A. niger.
[0771] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikoziliranog humanizovanog anti-IL-36R antitela potiču od višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata, uključujući, npr. brojne bakulovirusne sojeve i varijante i odgovarajuće permisivne ćelije domaćina insekata od domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (voćna mušica) i Bombyx mori (svilena buba). Različiti virusni sojevi za transfekciju su javno dostupni, npr. L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, a takvi virusi se mogu koristiti, posebno za transfekciju Spodoptera frugiperda ćelija.
[0773] Kulture biljnih ćelija pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza i duvana takođe se mogu koristiti kao domaćini.
[0775] [0183] U drugom aspektu, ekspresija humanizovanog anti-IL-36R se vrši u ćelijama kičmenjaka. Propagacija ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postalo je rutinska procedura i tehnike su široko dostupne. Primeri korisnih ćelijskih linija sisara domaćina su linija bubrega majmuna CV1 transformisana pomoću SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija bubrega humanog embriona (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham et al., 1977, J. Gen Virol.36: 59), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK, ATCC CCL 10), ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR1 (Cho, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; npr. DG44), mišje sertoli ćelije (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587), ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2), ćelije bubrega pasa (MDCK, ATCC CCL 34), ćelije jetre bivoljeg pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442), ćelije ljudskih pluća (W138, ATCC CCL 75), ćelije ljudske jetre (Hep G2, HB 8065), tumor mlečne žlezde miša (MMT 060562, ATCC CCL51), TR1 ćelije (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci.383: 44-68), MRC 5 ćelije, FS4 ćelije i linija humanog hepatoma (HEP G2).
[0777] Ćelije domaćina su transformisane sa prethodno opisanim vektorima ekspresije ili kloniranja za proizvodnju humanizovanih anti-IL-36R antitela i kultivisane u konvencionalnim hranljivim podlogama modifikovanim prema potrebi za indukciju promotera, selekciju transformatora ili pojačavanje gena koji kodiraju željene sekvence.
[0779] Ćelije domaćina koje se koriste za proizvodnju humanizovanog anti-IL-36R antitela opisanog u ovom dokumentu mogu se kultivisati u različitim medijima. Komercijalno dostupni mediji kao što su Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.) i Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.) pogodni su za kultivisanje ćelija domaćina. Pored toga, bilo koji od medija opisanih u jednom ili više Ham et al., 1979, Meth. Enz.58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem.102: 255, U.S. Pat. No.4,767,704, U.S. Pat. No.4,657,866, U.S. Pat. No. 4,927,762, U.S. Pat. No. 4,560,655, U.S. Pat. No. 5,122,469, WO 90/103430 i WO 87/00195 mogu se koristiti kao hranljiva podloga za ćelije domaćina. Bilo koji od ovih medijuma može se po potrebi dopuniti hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je gentamicin), elementima u tragovima (definisanim kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u finalnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Svi drugi neophodni suplementi takođe mogu biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni
[0782] 4
[0783] sa ćelijom domaćina izabranom za ekspresiju i biće očigledni prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.
[0785] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti intracelularno, u periplazmičkom prostoru ili direktno izlučiti u medijum. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, ćelije mogu biti poremećene da bi se oslobodio protein kao prvi korak. Čestice otpadnog materijala, bilo ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, mogu se ukloniti, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167 opisuje postupak izolovanja antitela koja se izlučuju u periplazmički prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta je odmrznuta u prisustvu natrijum acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 minuta. Ostaci ćelija se mogu ukloniti centrifugiranjem. Kada je antitelo izlučeno u medijum, supernatanti iz takvih ekspresijskih sistema se obično prvo koncentrišu koristeći komercijalno dostupan filter za koncentraciju proteina, na primer, jedinicu za ultrafiltraciju Amicon ili Millipore Pellicon. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od gore navedenih koraka za inhibiciju proteolize i mogu biti uključeni antibiotici kako bi se sprečio rast slučajnih kontaminanata. Za izolovanje antitela iz ćelije domaćina mogu se koristiti različiti postupci.
[0787] [0187] Sastav antitela pripremljen iz ćelija može se prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksilapatitne hromatografije, gel elektroforeze, dijalize i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija tipična tehnika prečišćavanja. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa bilo kog imunoglobulinskog Fc domena koji je prisutan u antitelima. Protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela koja se zasnivaju na ljudskim gama1, gama2 ili gama4 teškim lancima (vidi, npr. Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13). Protein G se preporučuje za sve mišje izotipove i za ljudski gama3 (vidi, npr. Guss et al., 1986 EMBO J.5:1567-1575). Matrica na koju je vezan afinitetni ligand je najčešće agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice kao što su kontrolisano porozno staklo ili poli(stiren-divinil)benzen omogućavaju brže protoke i kraća vremena obrade nego što se može postići agarozom. Kada antitelo sadrži C<H3>domen, za prečišćavanje je korisna Bakerbond ABX<™>smola (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.). Druge tehnike za prečišćavanje proteina, kao što su frakcionisanje na jonoizmenjivačkoj koloni, taloženje etanola, reverzno fazna HPLC, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparinu SEPHAROSE<™>, hromatografija na anjonski ili katjonski izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliasparaginske kiseline), hromato-fokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijum sulfata su takođe dostupne u zavisnosti od antitela koje treba rekuperirati.
[0789] Nakon bilo kog koraka preliminarnog prečišćavanja, smeša koja sadrži antitelo od interesa i kontaminante može se podvrgnuti hidrofobnoj interakcionoj hromatografiji niske pH korišćenjem pufera za eluiranje pri pH između oko 2,5-4,5, koja se obično izvodi pri niskim koncentracijama soli (npr. od oko 0-0,25M soli).
[0791] Ovde su takođe obelodanjene nukleinske kiseline koje se hibridizuju pod uslovima niske, umerene i visoke strogosti, kako je ovde definisano, na sve ili deo (npr. deo koji kodira varijabilni region) nukleotidne sekvence predstavljene izolovanim polinukleotidnim sekvencama koje kodiraju antitelo ili fragment antitela ovog pronalaska. Hibridizujući deo hibridizujuće nukleinske kiseline je obično dužine najmanje 15 (npr., 20, 25, 30 ili 50) nukleotida. Hibridizujući deo hibridizujuće nukleinske kiseline je najmanje 80%, npr. najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98%, identičan sekvenci dela ili cele nukleinske kiseline koja kodira anti-IL-36R polipeptid (npr. varijabilni region teškog lanca ili lakog lanca), ili njegov komplement. Hibridizujuće nukleinske kiseline tipa opisanog u ovom dokumentu mogu se koristiti, na primer, kao sonda za kloniranje, prajmer, npr. PCR prajmer ili dijagnostička sonda.
[0793] Neterapeutske upotrebe
[0795] Ovde opisana antitela su korisna kao agensi za afinitetno prečišćavanje. U ovom procesu, antitela se imobilizuju na čvrstoj fazi kao što je smola proteina A, koristeći postupke dobro poznate u struci. Imobilisano antitelo je u kontaktu sa uzorkom koji sadrži IL-36R protein (ili njegov fragment) koji se prečišćava, a nakon toga se nosač ispere odgovarajućim rastvaračem koji će ukloniti suštinski sav materijal u uzorku osim IL-36R proteina, koji je vezan za imobilisano antitelo. Na kraju, nosač se ispire drugim pogodnim rastvaračem koji će osloboditi IL-36R protein iz antitela.
[0797] [0191] Anti-IL-36R antitela, na primer humanizovana anti-IL-36R antitela, takođe su korisna u dijagnostičkim testovima za detekciju i/ili kvantifikovanje IL-36R proteina, na primer, za detekciju ekspresije IL-36R u specifičnim ćelijama, tkivima ili serumu. Anti-IL-36R antitela se mogu koristiti dijagnostički za, na primer, praćenje razvoja ili progresije bolesti kao deo postupka kliničkog testiranja, npr. za određivanje efikasnosti datog režima lečenja i/ili prevencije. Detekcija se može olakšati spajanjem anti-IL-36R antitela. Primeri supstanci koje se mogu detektovati uključuju različite enzime, protetske grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, bioluminiscentne materijale, radioaktivne materijale, metale koji emituju pozitron koristeći različite pozitronske emisione tomografije i neradioaktivne jone paramagnetnih metala. Vidi, na primer, US Patent No.4,741,900 za jone metala koji se mogu konjugovati sa antitelima za upotrebu kao dijagnostika u skladu sa ovim pronalaskom.
[0799] Anti-IL-36R antitela se mogu koristiti u ex vivo postupcima za dijagnostikovanje poremećaja povezanog sa IL-36R (npr. poremećaja koji se karakteriše abnormalnom ekspresijom IL-36R) ili za određivanje da li ispitanik ima povećan rizik od razvoja poremećaja povezanog sa IL-36R kako je navedeno u patentnim zahtevima. Takvi postupci uključuju kontaktiranje biološkog uzorka ispitanika sa IL-36R antitelima i detekciju vezivanja antitela za IL-36R. Pod „biološkim uzorkom“ podrazumeva se bilo koji biološki uzorak dobijen iz pojedinca, ćelijske linije, kulture tkiva ili drugog izvora ćelija koje potencijalno eksprimiraju IL-36R. Postupci za dobijanje biopsija tkiva i telesnih tečnosti od sisara dobro su poznati u struci.
[0801] U nekim primerima izvođenja, postupak može dalje da sadrži upoređivanje nivoa IL-36R u uzorku pacijenta sa kontrolnim uzorkom (npr. ispitanikom koji nema poremećaj povezan sa IL-36R) kako bi se utvrdilo da li pacijent ima poremećaj povezan sa IL-36R ili postoji rizik od razvoja poremećaja povezanog sa IL-36R.
[0803] [0194] U nekim primerima izvođenja će biti korisno, na primer, u dijagnostičke svrhe, obeležiti antitelo detektabilnim delom. Dostupne su brojni detektabilni obeleživači, uključujući radioizotope, fluorescentne obeleživače, obeleživače enzimskih supstrata i slično. Obeleživač se može indirektno konjugovati sa antitelima koristeći različite poznate tehnike. Na primer, antitelo može biti konjugovano sa biotinom, a bilo koja od tri gore navedene široke kategorije obeleživača može biti konjugovana sa avidinom, ili obrnuto. Biotin se selektivno vezuje za avidin i stoga se obeleživač može konjugovati sa antitelima na ovaj indirektan način. Alternativno, da bi se postigla indirektna konjugacija obeleživača sa antitelima, antitelo se može konjugovati sa malim haptenom (kao što je digoksin), a jedna od različitih prethodno pomenutih vrsta obeleživača se konjuguje sa antihapten antitelima (npr. antidigoksin antitela). Tako se može postići indirektna konjugacija obeleživača sa antitelima.
[0805] Primeri obeleživača radioizotopa uključuju<35>S,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I. Antitelo se može obeležiti radioizotopom, koristeći tehnike opisane u, na primer, Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. Radioaktivnost se može meriti, na primer, scintilacionim brojanjem.
[0807] Primeri fluorescentnih obeleživača uključuju obeleživače izvedene iz helata retkih zemalja (helati evropijuma) ili su na raspolaganju fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, lizamin, fikoeritrin i Texas Red. Fluorescentni obeleživači se mogu konjugovati sa antitelima poznatim tehnikama, kao što su one koje su obelodanjene u Current Protocols in Immunology, na primer. Fluorescencija se može kvantifikovati pomoću fluorimetra.
[0809] Postoje različiti dobro okarakterisani obeeleživači enzima-supstrata poznati u struci (vidi, npr. U.S. Pat. No.4,275,149 za pregled). Enzim generalno katalizuje hemijsku promenu hromogenog supstrata koja se može meriti različitim tehnikama. Na primer, promena može biti promena boje u supstratu, koja se može meriti spektrofotometrijski. Alternativno, enzim može da promeni fluorescenciju ili hemiluminiscenciju supstrata. Prethodno su opisane tehnike za kvantifikaciju promene fluorescencije. Hemiluminescentni supstrat postaje elektronski pobuđen hemijskom reakcijom i zatim može emitovati svetlost koja se može meriti, na primer, pomoću hemiluminometra, ili donira energiju fluorescentnom akceptoru.
[0811] Primeri enzimskih obeleživača uključuju luciferaze kao što su fotinus-luciferin 4-monooksigenaza i bakterijska luciferaza (U.S. Pat. No. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, malat dehidrogenaza, ureaza, peroksidaza kao što je peroksidaza rena (HRPO), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze (kao što su glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza), heterocidične oksidaze (kao što su urikaza i ksantin oksidaza), laktoperoksidaza, mikroperoksidaza i slično. Tehnike za konjugaciju enzima sa antitelima opisane su, na primer, u O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone i H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166.
[0812] Primeri kombinacija enzima i supstrata uključuju, na primer: peroksidazu rena (HRPO) sa vodonik peroksidazom kao supstratom, pri čemu vodonik peroksidaza oksidiše prekursor boje kao što je ortofenilen diamin (OPD) ili 3,3',5,5' -tetrametil benzidin hidrohlorid (TMB); alkalnu fosfatazu (AP) sa para-nitrofenil fosfatom kao hromogenim supstratom; i β-D-galaktozidazu (β-D-Gal) sa hromogenim supstratom kao što je p-nitrofenil-β-D-galaktozidaza ili fluorogeni supstrat 4-metilumbeliferil-β-D-galaktozidaza.
[0814] Brojne druge kombinacije enzima i supstrata dostupne su stručnjacima u ovoj oblasti. Za opšti pregled ovih, vidi U.S. Pat. No.4,275,149 i U.S. Pat. No.4,318,980.
[0816] U drugom primeru izvođenja, humanizovano anti-IL-36R antitelo se koristi neobeleženo i detektovano sa obeleženim antitelima koja se vezuju za humanizovano anti-IL-36R antitelo.
[0818] Ovde opisana antitela mogu se primeniti u bilo kom poznatom postupku ispitivanja, kao što su testovi kompetitivnog vezivanja, direktni i indirektni ''sendvič'' testovi i testovi imunoprecipitacije. Vidi, npr., Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
[0820] Anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen može se koristiti za inhibiciju vezivanja liganda za IL-36 receptor. Takvi postupci sadrže primenu anti-IL-36R antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen na ćeliju (npr. ćeliju sisara) ili ćelijsko okruženje, pri čemu je signalizacija posredovana IL-36 receptorom inhibirana. Ovi postupci se mogu izvoditi in vitro ili in vivo. Pod „ćelijskim okruženjem“ podrazumeva se tkivo, medijum ili vanćelijska matrica koja okružuje ćeliju. Anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen primenjuje se u ćelijsku sredinu ćelije na takav način da je antitelo ili fragment sposoban da se vezuje za molekule IL-36R izvan ćelije i oko nje, čime se sprečava vezivanje liganda IL-36 za njegov receptor.
[0821] Dijagnostički kompleti
[0823] Anti-IL-36R antitelo se može koristiti u dijagnostičkom kompletu, tj. upakovanoj kombinaciji reagenasa u unapred određenim količinama sa uputstvima za izvođenje dijagnostičkog testa. Kada je antitelo obeleženo enzimom, komplet može uključivati supstrate i kofaktore koji su potrebni enzimu, kao što je prekursor supstrata koji obezbeđuje detektabilni hromofor ili fluorofor. Pored toga, mogu biti uključeni i drugi aditivi kao što su stabilizatori, puferi (na primer blok pufer ili pufer za lizu) i slično. Relativne količine različitih reagenasa mogu se razlikovati u širokom opsegu kako bi se obezbedile koncentracije u rastvoru reagenasa koje značajno optimizuju osetljivost testa. Reagensi se mogu obezbediti kao suvi praškovi, obično liofilizovani, uključujući ekscipijense koji će pri rastvaranju obezbediti rastvor reagensa odgovarajuće koncentracije.
[0825] Terapeutske upotrebe
[0827] U drugom primeru izvođenja, humanizovano anti-IL-36R antitelo obelodanjeno ovde je korisno u lečenju različitih poremećaja povezanih sa ekspresijom IL-36R kao što je ovde opisano. Humanizovano anti-IL36R antitelo za upotrebu u postupcima za lečenje poremećaja povezanog sa IL-36R sadrži terapeutski efikasnu količinu humanizovanog anti-IL-36R antitela, koje treba primeniti na ispitaniku kome je to potrebno.
[0829] Humanizovano anti-IL-36R antitelo ili agens treba primenjivati na bilo koji odgovarajući način, uključujući parenteralno, subkutano, intraperitonealno, intrapulmonalno i intranazalno, a po želji za lokalni imunosupresivni tretman, intralezionu primenu (uključujući perfuziju ili drugi način kontaktiranja grafta (kalema) sa antitelima pre transplantacije). Humanizovano anti-IL-36R antitelo ili agens može se primeniti, na primer, kao infuzija ili kao bolus. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili subkutanu primenu. Pored toga, humanizovano anti-IL-36R antitelo se adekvatno primenjuje pulsnom infuzijom, posebno sa opadajućim dozama antitela. U jednom aspektu, doziranje se daje injekcijama, najpoželjnije intravenskim ili potkožnim injekcijama, u zavisnosti od toga da li je primena kratka ili hronična.
[0830] Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela zavisiće od različitih faktora kao što su vrsta bolesti koja se leči, kako je prethodno definisano, težina i tok bolesti, da li se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodna terapija, klinička istorija pacijenta i odgovor na antitelo, kao i diskrecija ordinirajućeg lekara. Antitelo se na odgovarajući način daje pacijentu u jednom trenutku ili tokom niza tretmana.
[0832] U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 20 mg/kg (npr. 0,1-15 mg/kg) antitela je početna doza kandidata za primenu na pacijentu, bilo, na primer, jednom ili više odvojenih primena, ili kontinuiranom infuzijom. Tipična dnevna doza može biti u rasponu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od prethodno pomenutih faktora. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se održava dok se ne pojavi željena supresija simptoma bolesti. Međutim, mogu biti korisni i drugi režimi doziranja. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i testovima. Primer režima doziranja je onaj koji je obelodanjen u WO 94/04188.
[0834] Termin „supresija“ se ovde koristi u istom kontekstu kao i „olakšavanje“ i „ublažavanje“ što znači smanjenje jedne ili više karakteristika bolesti.
[0836] Sastav antitela će biti formulisan, doziran i primenjen na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju određeni poremećaj koji se leči, određenog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, način primene, raspoređivanje primene i druge faktore poznate lekarima. "Terapeutski efikasna količina" antitela koja će se primenjivati biće regulisana takvim razmatranjima i predstavlja minimalnu količinu neophodnu za sprečavanje, ublažavanje ili lečenje poremećaja povezanog sa ekspresijom IL-36R.
[0838] Antitelo ne mora biti, ali je opciono, formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno koriste za sprečavanje ili lečenje dotičnog poremećaja. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine humanizovanog anti-IL-36R antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja i drugih faktora koji su prethodno navedeni. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa putevima primene kao što se ovde koristilo pre ili oko 1 do 99% do sada korišćenih doza.
[0841] 1
[0842] Farmaceutski sastavi i njihova primena
[0844] Sastav koji sadrži IL-36R vezujući agens (npr. anti-IL-36R antitelo) može se dati ispitaniku koji ima ili je pod rizikom da ima imunološki poremećaj, respiratorni poremećaj ili rak. Pronalazak dalje predviđa upotrebu IL-36R vezujućeg agensa (npr. anti-IL-36R antitela) u proizvodnji leka za prevenciju ili lečenje raka, respiratornog poremećaja ili imunološkog poremećaja. Termin „ispitanik“ koji se ovde koristi označava svakog sisarskog pacijenta kome se može primeniti IL-36R vezujući agens, uključujući, npr. ljude i ne-humane sisare, kao što su primati, glodari i psi. Ispitanici koji su posebno namenjeni za lečenje uključuju ljude. Antitela ili agensi se mogu davati sami ili u kombinaciji sa drugim sastavima u prevenciji ili lečenju imunološkog poremećaja, respiratornog poremećaja ili raka. Takvi sastavi koji se mogu primeniti u kombinaciji sa antitelima ili agensima uključuju metotreksat (MTX) i imunomodulatore, npr. antitela ili male molekule.
[0846] Primeri antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim sastavima su takođe oni koji sadrže humanizovano antitelo ili fragment antitela koji ima varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca bilo koje od SEQ ID NO: 80 i 88, SEQ ID NO: 80 i 89 ili SEQ ID NO: 80 i 87.
[0848] Dalji primeri antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim sastavima su takođe oni koji sadrže humanizovano antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu regiona lakog lanca SEQ ID NO: 118. Poželjna antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim sastavima su takođe ona koja sadrže humanizovano antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca bilo koje od SEQ ID NO:125, 126 ili 127.
[0850] Dalji primeri antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim sastavima su i oni koji sadrže antitelo B4, antitelo B5 ili antitelo B6.
[0852] Poznati su različiti sistemi isporuke i mogu se koristiti za primenu IL-36R vezujućeg agensa. Postupci uvođenja uključuju, ali nisu ograničeni na intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, subkutane, intranazalne, epiduralne i oralne puteve. IL-36R vezujući agens se može primeniti, na primer infuzijom, bolusom ili injekcijom, i može se primeniti zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima kao što su hemoterapeutski agensi.
[0855] 2
[0856] Primena može biti sistemska ili lokalna. U poželjnim primerima izvođenja, primena je subkutanom injekcijom. Sastavi za takve injekcije mogu se pripremiti, na primer, u unapred napunjenim špricevima koji se mogu primenjivati jednom svake druge nedelje.
[0858] U specifičnim primerima izvođenja, sastav agensa za vezivanje L-36R se primenjuje injekcijom, pomoću katetera, pomoću supozitorija ili pomoću implantata, pri čemu je implantat od poroznog, neporoznog ili želatinoznog materijala, uključujući membranu, kao što je silikonska elastomerna membrana ili vlakno. Obično se prilikom primene sastava koriste materijali na koje se anti-IL-36R antitelo ili agens ne apsorbuje.
[0860] U drugim primerima izvođenja, anti-IL-36R antitelo ili agens se isporučuje u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. U jednom primeru izvođenja, može se koristiti pumpa (vidi, npr. Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). U drugom primeru izvođenja mogu se koristiti polimerni materijali. (Vidi, npr. Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Vidi takođe Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol.
[0861] 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105.) Drugi sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem se razmatraju, na primer, u Langer, supra.
[0863] Agens za vezivanje IL-36R (npr. anti-IL-36R antitelo) može se primeniti kao farmaceutski sastavi koji sadrže terapeutski efikasnu količinu agensa za vezivanje i jedan ili više farmaceutski kompatibilnih sastojaka.
[0865] [0220] U tipičnim primerima izvođenja, farmaceutski sastav je formulisan u skladu sa rutinskim procedurama kao farmaceutski sastav prilagođen za intravensku ili subkutanu primenu na ljudima. Tipično, sastavi za primenu injekcijom su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Po potrebi, farmaceutski proizvod može da sadrži i agens za solubilizaciju i lokalni anestetik kao što je lignokain za ublažavanje bola na mestu ubrizgavanja. Generalno, sastojci se isporučuju odvojeno ili pomešani zajedno u obliku jedinične doze, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenom kontejneru kao što je ampula ili kesica, što označava količinu aktivnog sastojka. Kada se sastav primenjuje infuzijom, moguće je njegovo izdavanje sa bočicom za infuziju koja sadrži sterilnu vodu farmaceutskog kvaliteta ili fiziološki rastvor. Ako se sastav daje injekcijom, može se obezbediti ampula sterilne vode za injekciju ili fiziološki rastvor tako da se sastojci mogu pomešati pre primene.
[0867] Dalje, farmaceutski sastav se može obezbediti kao farmaceutski komplet koji sadrži (a) kontejner koji sadrži agens za vezivanje IL-36R (npr. anti-IL-36R antitelo) u liofilizovanom obliku i (b) drugi kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv razblaživač (npr. sterilna voda) za injekciju. Farmaceutski prihvatljiv razblaživač se može koristiti za rekonstituciju ili razblaživanje liofilizovanog anti-IL-36R antitela ili agensa. Opciono povezano sa takvim kontejnerom/ima može biti obaveštenje u obliku koji je propisala državna agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, a koje obaveštenje odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za ljudski primenu.
[0869] Količina agensa za vezivanje IL-36R (npr. anti-IL-36R antitela) koja je efikasna u lečenju ili prevenciji imunološkog poremećaja ili raka može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Pored toga, opciono se mogu koristiti in vitro testovi kako bi se pomoglo u identifikaciji optimalnih raspona doziranja. Precizna doza koja će se primeniti u formulaciji takođe će zavisiti od puta primene, i stadijuma imunološkog poremećaja ili raka, i treba da se odluči u skladu sa procenom lekara i okolnostima svakog pacijenta. Efikasne doze mogu se ekstrapolirati iz krivih doza-odgovor dobijenih iz test sistema in vitro ili životinjskih modela.
[0871] Generalno, doza anti-IL-36R antitela ili agensa za vezivanje IL-36R koja se daje pacijentu sa imunološkim poremećajem ili rakom koji eksprimira IL-36R je obično oko 0,1 mg/kg do oko 100 mg/kg telesne mase ispitanika. Doza koja se daje ispitaniku je oko 0,1 mg/kg do oko 50 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 30 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 20 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 15 mg/kg, ili oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg telesne mase ispitanika.
[0873] Primerne doze uključuju, ali nisu ograničene na, od 1 ng/kg do 100 mg/kg. U nekim primerima izvođenja, doza je oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, oko 10 mg/kg,
[0876] 4
[0877] oko 11 mg/kg, oko 12 mg/kg, oko 13 mg/kg, oko 14 mg/kg, oko 15 mg/kg ili oko 16 mg/kg. Doza se može davati, na primer, dnevno, jednom nedeljno (nedeljno), dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, četiri puta nedeljno, pet puta nedeljno, šest puta nedeljno, dvonedeljno ili mesečno, svaka dva meseca ili svaka tri meseca. U specifičnim primerima izvođenja, doza je oko 0,5 mg/kg nedeljno, oko 1 mg/kg nedeljno, oko 2 mg/kg nedeljno, oko 3 mg/kg nedeljno, oko 4 mg/kg nedeljno, oko 5 mg/kg nedeljno, oko 6 mg/kg nedeljno, oko 7 mg/kg nedeljno, oko 8 mg/kg nedeljno, oko 9 mg/kg nedeljno, oko 10 mg/kg nedeljno, oko 11 mg/kg nedeljno, oko 12 mg/kg nedeljno, oko 13 mg/kg nedeljno, oko 14 mg/kg nedeljno, oko 15 mg/kg nedeljno ili oko 16 mg/kg nedeljno. U nekim primerima izvođenja, doza se kreće od oko 1 mg/kg/nedeljno do oko 15 mg/kg/nedeljno.
[0879] U nekim primerima izvođenja, farmaceutski sastavi koji sadrže agens za vezivanje IL-36R mogu dalje da sadrže terapeutski agens, bilo konjugovani ili nekonjugovani sa agensom za vezivanje. Anti-IL-36R antitelo ili agens za vezivanje IL-36R može se primenjivati istovremeno u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih sredstava za upotrebu u lečenju ili prevenciji imunoloških poremećaja ili karcinoma.
[0881] Takva primena kombinovane terapije može imati aditivan ili sinergijski efekat na parametre bolesti (npr., težinu simptoma, broj simptoma ili učestalost recidiva).
[0883] Što se tiče terapeutskih režima za kombinovanu primenu, u specifičnom primeru izvođenja, anti-IL-36R antitelo ili agens za vezivanje IL-36R treba primenjivati istovremeno sa terapeutskim agensom. U drugom specifičnom primeru izvođenja, terapeutski agens se primenjuje pre ili posle primene anti-IL-36R antitela ili agensa za vezivanje IL-36R, najmanje sat vremena i do nekoliko meseci, na primer najmanje sat, pet sati, 12 sati, dan, nedelju, mesec ili tri meseca, pre ili posle primene anti-IL-36R antitela ili agensa za vezivanje IL-36R.
[0885] Artikli proizvodnje
[0887] [0228] U drugom aspektu, uključen je proizvodni artikal koji sadrži materijale korisne za lečenje prethodno opisanih poremećaja. Proizvodni artikal se sastoji od kontejnera i obeleživača. Odgovarajući kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve i epruvete. Kontejneri mogu biti napravljeni od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner sadrži sastav koji je efikasan za lečenje stanja i može imati sterilni otvor za pristup. Na primer, kontejner može biti vreća za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probušiti iglom za hipodermičko ubrizgavanje. Aktivni agens u sastavu je humanizovano anti-IL-36R antitelo. Oznaka na kontejneru ili povezana sa njim ukazuje na to da se sastav koristi za tretiranje stanja po izboru. Proizvodni artikal može dalje da sadrži drugi kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što su fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje uključivati druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve i uputstva unutar pakovanja sa instrukcijama za upotrebu.
[0889] Pronalazak je dalje opisan u sledećim primerima, koji nisu namenjeni da ograniče obim pronalaska.
[0891] Primeri
[0893] Primer 1: Identifikacija antihumanih IL-36R antitela
[0895] Više mišjih sojeva imunizovani su rekombinantno proizvedenim ljudskim IL-36R (ECD - ekstracelularni domen: aminokiseline 20-332 Genbank Accession #NP_003845) proteinom, a oni koji su generisali snažan titarski odgovor korišćeni su u tradicionalnom generisanju hibridoma. Fuzioni proizvodi koji izazivaju snažno vezivanje za ljudski IL-36R (ECD), ali bez vezivanja za ljudski IL-1R1 (najsrodniji član porodice IL-1R) su subklonirani i ponovo skrinirani. Identifikovano je više hibridoma koji daju monoklonska antitela koja su se vezala i neutralisala signalizaciju iz IL-36R (videti primere 2, 3 i 4). Varijabilni domeni su klonirani iz hibridoma koristeći standardne PCR setove prajmera. Varijabilni domeni i specifični CDR reprezentativnih monoklonskih antitela opisani su prethodno. Sva mišja antitela su konvertovana u himerna antitela koja sadrže mišje varijabilne domene na ljudskim konstantnim domenima (hu IgG1KO / kappa). Hu IgG1KO (nok aut) ima dve zamenske mutacije (Leu234Ala i Leu235Ala) koje eliminišu ADCC i CDC aktivnost smanjenjem efektorskih funkcija kao što su FcyR i vezivanje komplementa. Varijabilni domeni mišjih i himernih antitela su identični. Himerna antitela se generišu da bi se potvrdila funkcija antitela i da bi se osiguralo da je dobijena ispravna sekvenca varijabilnog domena.
[0896] Primer 2: Molekularni afiniteti vezivanja identifikovanih mišjih antihumanih IL-36R antitela
[0898]
[0900] A) Kinetika i afiniteti vezivanja anti-IL-36R antitela koja se vezuju za rekombinantni humani IL-36R mereni su korišćenjem Proteon-a (Bio-Rad, Hercules, CA) koristeći materijal generisan iz hibridoma nakon prečišćavanja na jednoj koloni. Afinitet vezivanja svih mišjih ćelija za ljudski IL-36R pri jednoj koncentraciji IL-36R u površinskom sloju procenjen je na <100 pM. Afiniteti vezivanja mišjih antitela za ljudski IL-36R odvija se na 7 različitih površinskih gustina (globalno fitovano) prikazani su u Tabeli 1. Vezivanje himernih anti-IL36R IgG je ekvivalentno odgovarajućim mišjim predlošcima.
[0902] Tabela 1: Afinitet vezivanja mišjih antihumanih IL-36R antitela
[0905]
[0908] B) Molekulska selektivnost u odnosu na mišji IL-36R i ljudski IL-1R1
[0910] Mišja i himerna anti-IL-36R antitela su takođe ubrizgana preko površine mišjeg IL-36R ili ljudskog IL-1R1 u koncentraciji od 100 nM. Signal vezivanja za mišji IL-36R i ljudski IL-1R1 za ova antitela izmeren pomoću Fortebio Octet (Fortebio, Menlo Park, CA) je nula, što ukazuje na to da se ova antitela selektivno vezuju za ljudski IL-36R. Vezivanje anti-IL-36R antitela za ljudski IL-36R je takođe analizirano u prisustvu 50% ljudskog seruma i nije primećen značajan efekat seruma na brzinu vezivanja, što pokazuje visoku specifičnost.
[0911] Primer 3: Potentnost mišjih i himernih antihumanih IL-36R antitela u funkcionalnim testovima na ljudima i makaki majmunima
[0913]
[0915] Protokoli: Testovi oslobađanja pNFκB/citokina iz ljudskih NCI/ADR-RES ćelija Reagensi:
[0916] R&D Systems: skraćeni rh IL36β
[0917] R&D Systems: skraćeni rh IL36γ
[0918] R&D Systems: skraćeni rh IL36α:
[0919] MA6000 Phospho-NFκB (Ser536) Komplet za lizat celih ćelija
[0920] Meso Scale Diagnostics, LLC
[0921] MSD ELISA prilagođeni ljudski test sa 96 bunara i 4 tačke
[0922] Meso Scale Diagnostics, LLC
[0924] NCI/ADR-RES ćelije su zasejane u koncentraciji od 45000 ćelija/bunaru, u RPMI medijumu sa 0,25% seruma u ploči sa 96 bunara. Jedna ploča je korišćena za analizu pNFκB, a druga za oslobađanje citokina. Ploče su zatim inkubirane preko noći na 37°C, 5% CO<2>. Ligandi (IL36α, β ili y) i antitela su razblaženi u 4x željenoj koncentraciji u medijumu bez seruma (SS). Antagonisti (antitela) su dodati ćelijama pre liganda. Za pNFκB: NCI ćelije /-ligand i antagonist su inkubirani 1 sat, 37°C, 5% CO<2>. Medijum je zatim aspiriran i ćelije su lizirane u 100 µl/bunaru pufera za kompletnu lizu na ledu 30 min. Lizat je zatim centrifugiran na 2500 o/min, 20 min, 4°C i prebačen na MSD ELISA ploču i analiziran na pNFκB u skladu sa protokolom proizvođača. Za oslobađanje citokina: 18-24 sata nakon stimulacije, supernatanti su prebačeni na ploču MSD ELISA i testirani na citokine u skladu sa protokolom proizvođača.
[0926] Protokol: pNFκB (S536) MSD ELISA za BaF/3 IL-36R ćelije makaki majmuna
[0928] [0235] Ćelije BaF/3 makakija IL-36R su zasejane u SS medijumu u koncentraciji od 90.000 ćelija/bunaru na ploči sa 96 bunara. U kontrolne bunare je dodato 100 ul medijuma. Antagonisti (antitela) su razblaženi na 4x željenu koncentraciju i u svaku bunar je dodato 50 µl. Ligandi (IL36a, b ili y) su razblaženi na 4x željenu koncentraciju u SS medijumu i 50 µl je dodato u svaki bunar (za konačnu zapreminu od 200 µl). Ploče su inkubirane 15 minuta, na 37 C, sa 5% CO<2>. Ploče su kratko centrifugirane, medijum je aspiriran, a ćelije su lizirane u 100 µl/bunaru kompletnog pufera za lizu (videti MSD pNFkB protokol) i inkubirane na ledu 30 minuta. Lizati su zatim centrifugirani na 2500 o/min, 20min, 4°C i prebačeni na MSD ELISA ploču. Lizati su zatim procenjeni na aktivnost pNFκB korišćenjem MSD kompleta kao što je prethodno opisano.
[0930] Rezultati: Rezultati IC<90>za mišja antihumana IL-36R antitela u ljudskim funkcionalnim testovima (pNFκB i oslobađanje citokina) i funkcionalnom testu kod makaki (pNFkB) sa ljudskim IL-36 ligandima prikazani su u Tabeli 2. Rezultati IC<90>za himerna antihumana IL-36R antitela u ljudskim funkcionalnim testovima (pNFκB i oslobađanje citokina) i funkcionalnom testu kod makakija (pNFκB) sa ljudskim IL-36 ligandima prikazani su u Tabeli 3.
[0932] Tabela 2: Potentnost mišjih antitela u funkcionalnim ćelijskim testovima (izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj koncentraciji testiranoj na uzorcima)
[0934]
[0935]
[0936]
[0939] 1
[0942] 2 Tabela 3: Potentnost himernih antitela u funkcionalnim ćelijskim testovima (izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj koncentraciji testiranoj na uzorcima)
[0944]
[0946] ND – nema podataka
[0948] Primer 4: Vezivanje mišjih antihumanih IL-36R antitela za ćelije koje eksprimiraju ljudski IL-36R
[0950] Protokol za vezivanje antitela pomoću protočne citometrije
[0952] [0237] HEK293 ćelije transficirane ljudskim IL-36R ili NCI/ADR-RES ćelijama pune dužine bile su pasažirane 24 sata pre bojenja. Ćelije su uklonjene iz tikvica ispiranjem sa 10 ml 5 mM EDTA u PBS-u, a zatim inkubirane na 37°C 10 minuta sa dodatnih 10 ml 5 mM EDTA i 2,5 ml Accumax-a za razdvajanje/disperziju ćelija. Antitela su zatim razblažena do određenih koncentracija u PBS 2% BSA, a ćelije su inkubirane 20 minuta na sobnoj temperaturi. Višak antitela je zatim ispran dodavanjem 200 µl PBS-a i zatim centrifugiran. Sekundarni reagens je zatim dodat u količini od 50 µl po bunaru i ćelije su inkubirane 15 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim isprane kao što je prethodno navedeno. Ćelije su resuspendovane u 200 µl PBS i analizirane protočnom citometrijom. Vrednosti EC<50>vezivanja za mišja anti-humana IL-36R antitela koja se vezuju za transfektante ljudskog IL-36R HEK prikazane su u Tabeli 4.
[0954] Tabela 4
[0957]
[0960] Primer 5: Proizvodnja humanizovanih antitela IL-36R
[0962] Da bi se smanjila potencijalna imunogenost nakon primene kod čoveka, mišja antihumana IL-36R monoklonska antitela 81B4 i 73C5 su 'humanizovana' kroz proces dizajniranja i skrininga. Ljudske sekvence okvira su izabrane za mišje predloške na osnovu homologije okvira, CDR strukture, konzerviranih kanonskih ostataka, konzerviranih ostataka pakovanja na graničnoj površini i drugih parametara. Specifična supstitucija aminokiselinskih ostataka u ovim pozicijama okvira može poboljšati različite aspekte performansi antitela, uključujući afinitet i/ili stabilnost vezivanja, u poređenju sa onim što je pokazano kod humanizovanih antitela formiranih „direktnom zamenom“ CDR ili HVL u regione okvira ljudske germinativne linije. Fabs koja su pokazala bolje ili jednako vezivanje i poboljšanu ekspresiju u poređenju sa himernim matičnim Fab su izabrana za dalju karakterizaciju.
[0965] 4
[0966] Reprezentativni humanizovani varijabilni regioni za antitela 81B4 i 73C5 prikazani su u odeljku specifikacije. Na ovaj način, antitelo B1 do antitela B6 bila su humanizovana antitela izvedena iz mišjeg antitela 81B4 (kloniranog u ljudski IgG1 KO (KO=nokaut)/kapa skelet. Antitela B1 do B6 su prikazana u tabeli A. Antitela C1 do antitela C3 su bila humanizovana antitela izvedena iz mišjeg antitela 73C5 (kloniranog u ljudski IgG1-KO (KO=nokaut)/kapa skelet. Antitela C1 do C3 su prikazana u Tabeli C.
[0968] Primer 6: Vezivanje humanizovanih IL-36R antitela
[0970] Kinetika i afiniteti vezivanja humanizovanih anti-IL-36R antitela koja se vezuju za rekombinantni ljudski IL-36R mereni su pomoću Proteon (Bio-Rad, Hercules, CA). Ljudski IL-36R je imobilisan na 5 različitih površinskih gustina i rezultati su analizirani korišćenjem globalnog fitovanja (vidi Tabelu 5 koja prikazuje rezultate tri eksperimenta). Vezivanje humanizovanih antitela za NCI/ADR-RES ćelije putem protočne citometrije mereno je korišćenjem protokola koji je opisan u primeru 4 (vidi Tabelu 5 za vrednosti EC<90>).
[0972] Tabela 5: Molekulski i ćelijski afiniteti vezivanja humanizovanih antihumanih IL-36R antitela
[0974]
[0977] Primer 7: Potentnost humanizovanih anti-humanih IL-36R antitela u funkcionalnim testovima na ljudima
[0979] [0240] Funkcionalna blokada signalizacije humanizovanim varijantama IL-36R iz ljudskih NCI/ADR-RES ćelija testirana je kao što je opisano u primeru 3. Rezultati IC<90>za humanizovana anti-humana IL-36R antitela u funkcionalnim testovima na ljudima (pNFκB i oslobađanje citokina) sa ljudskim IL-36 ligandima prikazani su u Tabeli 6.
[0981] Tabela 6: Potentnost [IC<90>(nM)] humanizovanih antitela u humanim funkcionalnim NCI/ADR-RES ćelijskim testovima (Rezultati su jednaki prosecima iz najmanje 2 eksperimenta. Izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj testiranoj koncentraciji za uzorke.)
[0983]
[0986] Primer 8: Potentnost anti-IL-36R antitela u funkcionalnim testovima primarnih ljudskih keratinocita
[0988] Protokoli: Testovi oslobađanja pNFkB/citokina kod ljudskih primarnih epidermalnih keratinocita
[0990] Ćelije su zasejane u koncentraciji od 30.000 ćelija/bunaru u medijumu za kultivaciju u pločama sa 96 bunara i inkubirane preko noći na 37°C, 5% CO<2>. Analize su zatim izvršene kao što je opisano u primeru 3. Rezultati: Rezultati IC<90>za mišja, himerna i humanizovana anti-IL-36R antitela u testovima primarnih ljudskih keratinocita (oslobađanje pNFkB i IL-8) stimulisanih ljudskim IL-36 ligandima prikazani su u Tabeli 7, Tabeli 8 i Tabeli 9, respektivno.
[0992] Tabela 7 (izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj testiranoj koncentraciji za uzorke)
[0994]
[0995]
[0997] nema podataka
[0999] Tabela 8: Potentnost himernih anti-IL-36R antitela u testovima primarnih ljudskih keratinocita (izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj koncentraciji testiranoj na uzorcima)
[1001]
[1004] Tabela 9: Potentnost humanizovanih anti-IL-36R antitela u testovima primarnih ljudskih keratinocita (izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj koncentraciji testiranoj na uzorcima)
[1006]
[1009] Primer 9 Potentnost anti-IL-36R antitela u funkcionalnim testovima ljudskih primarnih ćelija crevnog epitela
[1010] Protokoli: Testovi oslobađanja pNFkB/citokina iz primarnih ćelija ljudskog crevnog epitela
[1012] Ćelije su zasejane u količini od 30.000 ćelija/bunaru u medijumu za kultivaciju na ploči sa 96 bunara i inkubirane preko noći na 37°C, 5% CO<2>. Testovi su zatim izvršeni kao što je opisano u primeru 3.
[1014] Rezultati: IC<90>za mišja anti-IL-36R antitela u testovima primarnih ćelija crevnog epitela (oslobađanje pNFkB i IL-8) stimulisanih ligandima ljudskog IL-36 prikazani su u Tabeli 10.
[1016] Tabela 10: Potentnost mišjih anti-IL-36R antitela u testovima primarnih ćelija ljudskog crevnog epitela (izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj koncentraciji testiranoj na uzorcima)
[1018]
[1021] Primer 10: Potentnost anti-IL-36R antitela u funkcionalnim testovima primarnih crevnih miofibroblasta kod ljudi
[1023] Protokoli: Testovi oslobađanja pNF κB/citokina iz primarnog crevnog miofibroblasta kod ljudi
[1025] Ćelije su zasejane u količini od 30.000 ćelija/bunaru u medijumu kulture u ploči sa 96 bunara i inkubirane na 37°C, 5% CO<2>.Testovi su zatim izvršeni kao što je opisano u primeru 3.
[1026] Rezultati: Rezultati IC<90>za anti-IL-36R antitela u testovima primarnih crevnih miofibroblasta kod ljudi (oslobađanje pNFkB i IL-8) stimulisanih ligandima ljudskog IL-36 prikazani su u Tabeli 11 i Tabeli 12,.
[1028] Tabela 11: Potentnost mišjih i himernih anti-IL-36R antitela u testovima primarnih ljudskih crevnih miofibroblasta (izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj koncentraciji testiranoj na uzorcima)
[1030]
[1033] Tabela 12: Potentnost humanizovanih anti-IL-36R antitela u testovima primarnih ljudskih crevnih miofibroblasta (izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj koncentraciji testiranoj na uzorcima)
[1035]
[1038] Primer 11: Potentnost anti-IL-36R antitela u funkcionalnim testovima ljudskih primarnih dermalnih fibroblasta
[1039] Protokoli: Testovi oslobađanja pNFκB/citokina iz ljudskih primarnih dermalnih fibroblasta
[1041] Ćelije su zasejane u količini od 30.000 ćelija/bunaru u medijumu za kultivaciju na ploči sa 96 bunara i inkubirane preko noći na 37°C, 5% CO<2>.Testovi su zatim izvršeni kao što je opisano u primeru 3.
[1043] Rezultati: Rezultati IC<90>za anti-IL-36R antitela u primarnim testovima ljudskih dermalnih fibroblasta (pNFkB i IL-8 oslobađanje) stimulisanih ljudskim IL-36 ligandima prikazani su u Tabeli 13 i Tabeli 14,.
[1045] Tabela 13: Potentnost mišjih i himernih anti-IL-36R antitela u primarnim testovima humanog dermalnog fibroblasta (izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj koncentraciji testiranoj na uzorcima)
[1047]
[1050] Tabela 14: Potentnost humanizovanih anti-IL-36R antitela u primarnim testovima ljudskih dermalnih fibroblasta (izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj koncentraciji testiranoj na uzorcima)
[1052]
[1056] 1
[1057] Primer 12: Potentnost mišjih anti-IL-36R antitela u funkcionalnim testovima ljudskih primarnih proksimalnih tubularnih ćelija
[1059] Protokol: Testovi oslobađanja pNFkB/citokina iz ljudskih primarnih proksimalnih tubularnih ćelija.
[1061] Ćelije su zasejane u količini od 5.000 ćelija/bunaru u medijumu za kultivaciju na ploči sa 96 bunara i inkubirane preko noći na 37°C, 5% CO<2>. Testovi su zatim izvršeni kao što je opisano u primeru 3.
[1063] Rezultati: Rezultati IC<90>za mišja, himerna i humanizovana anti-IL-36R antitela u testovima ljudskih primarnih proksimalnih tubularnih ćelija (oslobađanje IL-8) stimulisanih ljudskim ligandima IL-36 prikazani su u tabeli 15.
[1065] Tabela 15: Potentnost mišjih i ljudskih anti-IL-36R antitela u testovima na primarnim ljudskim proksimalnim tubularnim ćelijama (izotipske kontrole nisu pokazale inhibiciju aktivnosti pri najvišoj koncentraciji testiranoj na uzorcima)
[1067]
[1070] Primer 13: Inhibicija proizvodnje IL-8 iz rekonstruisanog ljudskog epidermisa stimulisane sa IL-36γ
[1072] Protokol rekonstruisanog epidermisa
[1074] Anti-IL-36R antitela (1,5 µg/ml) su predinkubirana rekonstruisanim ljudskim epidermisom i stimulisana ljudskim rekombinantnim IL-36γ (20 ng/ml). Kao pozitivna kontrola korišćen je rekombinantni humani IL-1β (20 ng/ml; R & D Systems). Nakon 24 sata
[1077] 1 1
[1078] u kulturi, prikupljeni su ćelijski supernatanti i testirani na IL-8 (testovi za IL-8 su opisani u primeru 3). Uzorci su testirani u tri primerka, a prosečna vrednost pg/ml ± standardna greška prikazana je u tabeli u nastavku (Tabela 16).
[1080] Tabela 16
[1082]
[1085] Primer 14: Inhibicija ekspresije gena S100A7 i S100A12 izazvane ligandom IL-36 u rekonstruisanom ljudskom epidermu
[1087] Stimulacija rekonstruisanog ljudskog epidermisa agonističkim IL-36 ligandima indukuje ekspresiju gena S100A7 i S100A12. S100A7 i S100A12 su geni koji se nalaze unutar kompleksa epidermalne diferencijacije.
[1089] Protokol: Rekonstruisani ljudski epidermis je inkubiran sa anti-IL-36R antitelima (1,5 µg/ml) i stimulisan ljudskim rekombinantnim IL-36γ (20 ng/ml). Kao pozitivna kontrola korišćen je rekombinantni humani IL-1β (20 ng/ml; R & D Systems). Nakon 24 sata u kulturi na 5% CO<2>i 37°C, RNK je izolovana iz rekonstruisanog ljudskog epidermisa i testirana na ekspresiju gena lančanom reakcijom reverzne transkriptaze-polimeraze u realnom vremenu. Relativna ekspresija je izračunata metodom 2<-ΔΔCt>. Uzorci su testirani u tri primerka i prosečna ekspresija ± standardna greška prikazana je u tabeli u nastavku (Tabela 17).
[1092] 1 2
[1093] Tabela 17
[1095]
[1098] Primer 15: Efikasnost anti-IL-36R antitela u modelu ksenotransplanta psorijaze
[1100] Protokol: Krv i biopsije kože bez lezija su uzete od 24 pacijenta sa psorijazom, koje je klinički dijagnostikovao dermatolog. Biopsije kože su transplantirane na imunodeficijentne NIH-III miševe i ostavljene da se presade tokom perioda od četiri do pet nedelja.
[1102] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz krvi prikupljene od svakog donora u vreme biopsije za intradermalnu injekciju u presađenu kožu. Pre injekcije, PBMC su stimulisane sa 1 µg/ml stafilokoknog enterotoksina B (Toxin Technologies, Florida, USA) i 80 U/ml humanog rekombinantnog IL-2 (Peprotech Inc., Oosterhout, The Netherlands). Autologne PBMC su intradermalno ubrizgane sa 7,5 x 10^5 ćelija u PBS kako bi se sinhronizovala indukcija upale kože i fenotip psorijaze. Tri nedelje nakon ubrizgavanja ćelija, biopsije su uzete iz miševa i analizirane histološki.
[1104] Histološko bojenje je izvršeno na kriokonzerviranom kožnom tkivu svih grupa. Dijagonalni preseci (8 µm), koji pokrivaju sve slojeve kože, pripremljeni su kako je opisano na Slici 4. Za procenu debljine epidermisa, dva neserijska preseka su nasumično izabrana iz centra biopsije i obojena hematoksilin-eozinom. Nakon toga, preseci su procenjeni pri uvećanju
[1107] 1
[1108] od 100 puta. Po celoj dužini biopsije, dužine grebena su merene u obe sekcije pomoću kamere Olympus DP71 i softvera Cell^D imaging (V2.7, Munster, Germany). Dužina grebena je definisana kao: rastojanje između gornje ivice sloja stratum granulosum i dna grebena. Biopsije su bodovane nasumično i na slepo.
[1110] Rezultati za prosečnu debljinu epidermisa i maksimalnu debljinu epidermisa za svaku tretiranu grupu prikazani su u Tabeli 18. Rezultati za neto promenu debljine epidermisa u svakoj tretiranoj grupi prikazani su u Tabeli 19.
[1112] Tabela 18
[1114]
[1117] Tabela 19
[1119]
[1122] Primer 16: Subhronično zapaljenje pluća nakon 3 nedelje izloženosti duvanskom dimu kod divljeg tipa i 2 homozigotna nokaut miša sličnih receptoru interleukina-1
[1125] 1 4
[1126] Protokol: Miševi divljeg tipa ili 2 miša slična receptoru interleukina-1 bili su izloženi dimu cigareta tokom 3 nedelje kako bi se izazvale plućni tegobe. Prva i druga nedelja sastojale su se od 5 uzastopnih dana izlaganja, dok su miševi bili izloženi 4 uzastopna dana tokom treće nedelje. Miševi su bili izloženi dejstvu 5 cigareta svakog dana sa intervalima od 24 minuta izlaganja cigaretama (16 minuta) i svežem vazduhu (8 minuta). Osamnaest sati nakon poslednjeg izlaganja, miševi su isprani sa 2 x 0,8 ml Hank's Salt Solution (0,6mM EDTA). Supernatant i ćelijski talog su sakupljeni iz bronhijalnog alveolarnog lavaža nakon centrifugiranja tokom 10 minuta. Ukupan broj makrofaga i neutrofilnih ćelija u bronhijalnoj alveolarnoj lavaži za svaku izloženu grupu prikazan je u Tabeli 20.
[1128] Tabela 20
[1130]
[1133]
[1137] 1
[1138]
[1141] 1

Claims (19)

1. Patentni zahtevi
1. Anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje sadrži:
a) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 (L-CDR1); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 (L-CDR2); aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44 (L-CDR3); i
b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53 (H-CDR1), aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62 (H-CDR2) i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 72 (H-CDR3),
pri čemu anti-IL-36R antitelo blokira signalizaciju posredovanu sa IL-36α-, IL-36β- i IL-36γ.
2. Anti-IL-36R antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema zahtevu 1, pri čemu je antitelo ili fragment koji vezuje antigen humanizovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen.
3. Farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema zahtevu 1 ili 2 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
4. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema zahtevu 1 ili 2 ili farmaceutski sastav prema zahtevu 3, za upotrebu u medicini.
5. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili farmaceutski sastav za upotrebu prema zahtevu 4, pri čemu je upotreba u medicini upotreba u postupku za lečenje inflamatorne bolesti, autoimune bolesti, respiratorne bolesti, metaboličkog poremećaja, epitelno posredovanog inflamatornog poremećaja, fibroze ili raka.
6. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili farmaceutski sastav za upotrebu prema zahtevu 4 ili 5, pri čemu je upotreba u medicini upotreba u postupku za lečenje psorijaze, inflamatorne bolesti creva, sistemskog eritematoznog lupusa, skleroderme, Sjogrenovog sindroma, psorijatičnog artritisa, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, astme, hronične astme, dijabetičke nefropatije, lupusnog nefritisa ili ankilozirajućeg spondilitisa.
7. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 4 do 6, pri čemu je upotreba u medicini upotreba u postupku za lečenje inflamatorne bolesti creva.
8. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 4 do 7, pri čemu je upotreba u medicini upotreba u postupku za lečenje Kronove bolesti ili ulceroznog kolitisa.
9. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 4 do 6, pri čemu je upotreba u medicini upotreba u postupku za lečenje palmoplantarne pustuloze ili generalizovane pustularne psorijaze.
10. Izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja kodira anti-IL-36R antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema zahtevu 1 ili 2, poželjno DNK ili RNK sekvencu.
11. Vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 10, poželjno vektor ekspresije, poželjnije vektor koji sadrži polinukleotid prema pronalasku u funkcionalnoj vezi sa sekvencom za kontrolu ekspresije.
12. Ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid prema zahtevu 10, i/ili vektor prema zahtevu 11.
13. Postupak za proizvodnju anti-IL-36R antitela ili fragmenta koji vezuje antigen prema zahtevu 1 ili 2, koji sadrži korake (a) kultivacije ćelije domaćina prema zahtevu 12 pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju anti-IL-36R antitela ili fragmenta koji vezuje antigen i (b) oporavka anti-IL-36R antitela ili fragmenta koji vezuje antigen.
14. Dijagnostički komplet koji sadrži anti-IL-36R antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema zahtevu 1 ili 2 i uputstvima za upotrebu.
15. Dijagnostički komplet prema zahtevu 14, za upotrebu u postupku in vivo dijagnoze inflamatorne bolesti, autoimune bolesti, respiratorne bolesti, metaboličkog poremećaja, epitelno posredovanog inflamatornog poremećaja, fibroze, raka, psorijaze,
1
inflamatorne bolesti creva, psorijatičnog artritisa, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, hronične astme, ankilozirajućeg spondilitisa, Kronove bolesti ili ulceroznog kolitisa.
16. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je antitelo ili fragment koji vezuje antigen humanizovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen i konjugovano je sa oznakom za upotrebu u in vivo dijagnozi.
17. Ex vivo dijagnostički postupak koji sadrži upotrebu anti-IL-36R antitela ili fragmenta koji vezuje antigen prema zahtevu 1 ili 2.
18. Ex vivo dijagnostički postupak prema zahtevu 17, za dijagnozu inflamatorne bolesti, autoimune bolesti, respiratorne bolesti, metaboličkog poremećaja, epitelno posredovanog inflamatornog poremećaja, fibroze, raka, psorijaze, inflamatorne bolesti creva, psorijatičnog artritisa, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, hronične astme, ankilozirajućeg spondilitisa, Kronove bolesti ili ulceroznog kolitisa.
19. Ex vivo dijagnostički postupak prema zahtevu 17 za dijagnostikovanje poremećaja povezanog sa IL-36R ili za utvrđivanje da li ispitanik ima povećan rizik od razvoja poremećaja povezanog sa IL-36R koji sadrži
(a) dovođenje biološkog uzorka od ispitanika u kontakt sa IL-36R antitelom prema zahtevu 1 ili 2;
(b) detektovanje vezivanja antitela za IL-36R; i opciono
(c) upoređivanje nivoa IL-36R u navedenom uzorku sa kontrolnim uzorkom kako bi se utvrdilo da li ispitanik ima poremećaj povezan sa IL-36R ili postoji rizik od razvoja poremećaja povezanog sa IL-36R, pri čemu je poremećaj povezan sa IL-36R inflamatorna bolest, autoimuna bolest, respiratorna bolest, metabolički poremećaj, epitelno posredovani inflamatorni poremećaj, fibroza, rak, psorijaza, inflamatorna bolest creva, psorijatični artritis, multipla skleroza, reumatoidni artritis, COPD, hronična astma, ankilozirajući spondilitis, Kronova bolest ili ulcerozni kolitis.
1
RS20260044A 2011-11-16 2012-11-14 Anti il-36r antitela RS67639B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161560554P 2011-11-16 2011-11-16
US201261644111P 2012-05-08 2012-05-08
US201261713713P 2012-10-15 2012-10-15
EP19169065.0A EP3536710B1 (en) 2011-11-16 2012-11-14 Anti il-36r antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67639B1 true RS67639B1 (sr) 2026-02-27

Family

ID=47215803

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191179 RS59248B1 (sr) 2011-11-16 2012-11-14 Anti il-36r atitela
RS20260044A RS67639B1 (sr) 2011-11-16 2012-11-14 Anti il-36r antitela

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191179 RS59248B1 (sr) 2011-11-16 2012-11-14 Anti il-36r atitela

Country Status (41)

Country Link
US (4) US9023995B2 (sr)
EP (2) EP3536710B1 (sr)
JP (3) JP6289375B2 (sr)
KR (3) KR102159109B1 (sr)
CN (5) CN112812183B (sr)
AP (1) AP2014007571A0 (sr)
AR (1) AR089178A1 (sr)
AU (1) AU2012339734B2 (sr)
BR (1) BR112014011594B1 (sr)
CA (1) CA2852994C (sr)
CL (1) CL2014001123A1 (sr)
CO (1) CO7020871A2 (sr)
CY (2) CY1122278T1 (sr)
DK (2) DK2780373T3 (sr)
EA (1) EA031948B1 (sr)
EC (1) ECSP14004976A (sr)
ES (2) ES2755732T3 (sr)
FI (2) FI3536710T3 (sr)
FR (1) FR23C1023I2 (sr)
GE (1) GEP20186816B (sr)
HR (2) HRP20251675T1 (sr)
HU (2) HUE047437T2 (sr)
IL (2) IL232100B (sr)
LT (3) LT2780373T (sr)
LU (1) LUC00308I2 (sr)
MX (1) MX347164B (sr)
MY (1) MY195289A (sr)
NL (1) NL301233I2 (sr)
NO (2) NO2023024I1 (sr)
PE (1) PE20142041A1 (sr)
PH (1) PH12014501108B1 (sr)
PL (1) PL2780373T3 (sr)
PT (2) PT3536710T (sr)
RS (2) RS59248B1 (sr)
SG (1) SG11201402283PA (sr)
SI (1) SI2780373T1 (sr)
TW (1) TWI573804B (sr)
UA (1) UA115540C2 (sr)
UY (1) UY34456A (sr)
WO (1) WO2013074569A1 (sr)
ZA (1) ZA201402491B (sr)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3252076B1 (en) 2011-01-14 2019-09-04 The Regents Of The University Of California Diagnostic use of antibodies against ror-1 protein
FI3536710T3 (fi) 2011-11-16 2026-01-14 Boehringer Ingelheim Int Anti-il-36r -vasta-aineita
EP3093294A1 (en) 2012-02-24 2016-11-16 Stemcentrx, Inc. Dll3 modulators and methods of use
TWI777174B (zh) * 2014-03-14 2022-09-11 瑞士商諾華公司 針對lag-3之抗體分子及其用途
RU2582569C2 (ru) * 2014-07-24 2016-04-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства Днк, кодирующая полноразмерный антагонист рецептора интерлейкина-36 человека, днк, кодирующая полноразмерный антагонист рецептора интерлейкина-36 человека с с-концевым полигистидиновым тагом, плазмидный экспрессионный вектор (варианты), штамм бактерий escherichia coli bl21 star[de3] (рет-il36raf), - продуцент полноразмерного рецепторного антагониста интерлейкина-36 и штамм бактерий escherichia coli bl21 star[de3] (pet-il36raf-his), - продуцент полноразмерного рецепторного антагониста интерлейкина-36 с с-концевым полигистидиновым тагом
CN107847589B (zh) 2015-04-01 2022-03-29 安奈普泰斯生物有限公司 针对t细胞免疫球蛋白和粘蛋白蛋白3(tim-3)的抗体
PL3283110T3 (pl) * 2015-04-15 2022-06-27 Anaptysbio, Inc. Przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi interleukiny 36 (il-36r)
WO2016201282A2 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd TGF-β3 SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS AND USES THEREOF
JP6654773B2 (ja) * 2015-12-25 2020-02-26 国立大学法人名古屋大学 インターロイキン３６受容体アンタゴニスト欠損症の治療薬
BR112019008861A2 (pt) 2016-11-01 2019-07-09 Tesaro, Inc. anticorpos direcionados contra imunoglobulina de células t e proteína de mucina 3 (tim-3)
SG10201913083SA (en) 2017-01-09 2020-03-30 Tesaro Inc Methods of treating cancer with anti-tim-3 antibodies
JP2020512344A (ja) * 2017-03-27 2020-04-23 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗ｉｌ−３６ｒ抗体併用治療
MA50424A (fr) * 2018-01-08 2020-08-26 Chemocentryx Inc Méthodes de traitement du psoriasis pustuleux généralisé avec un antagoniste de ccr6 ou cxcr2
WO2019177883A2 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of anti-il-36r antibodies for treatment of inflammatory bowel disease
WO2019177888A1 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of anti-il-36r antibodies for treatment of generalized pustular psoriasis
WO2020018503A2 (en) * 2018-07-16 2020-01-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-il36r antibodies
HRP20240999T1 (hr) 2018-07-16 2024-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavački modeli bolesti ditra i njihova upotreba
CN112638946A (zh) 2018-08-16 2021-04-09 坎塔吉亚有限责任公司 抗il1rap抗体组合物
TW202019958A (zh) * 2018-09-28 2020-06-01 日商協和麒麟股份有限公司 Il-36抗體及其用途
EP3898673A1 (en) * 2018-12-21 2021-10-27 23Andme, Inc. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
AU2019416727A1 (en) * 2018-12-27 2021-07-22 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-il-36R antibodies for treatment of palmoplantar pustulosis
KR20210137520A (ko) * 2019-03-08 2021-11-17 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 항-il-36r 항체 제형
JP7811772B2 (ja) * 2019-12-05 2026-02-06 学校法人東京薬科大学 筋組織の減少を抑制するための組成物
AR120913A1 (es) * 2019-12-27 2022-03-30 Teijin Pharma Ltd Anticuerpo que inhibe específicamente la señalización de il-36r
EP4153233A1 (en) 2020-05-19 2023-03-29 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti-il-36r antibodies for the treatment of atopic dermatitis
JP7812364B2 (ja) 2020-07-17 2026-02-09 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 好中球性皮膚症の処置のための抗ｉｌ－３６ｒ抗体
WO2022026832A1 (en) 2020-07-30 2022-02-03 Anaptysbio, Inc. Anti-interleukin 36 receptor (il-36r) therapy for ichthyosis
WO2022026829A1 (en) 2020-07-30 2022-02-03 Anaptysbio, Inc. Anti-interleukin 36 receptor (il-36r) therapy for skin toxicity
CA3192882A1 (en) 2020-09-30 2022-04-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-il-36r antibodies for treatment of chronic inflammatory pain
CN112094349B (zh) * 2020-11-04 2021-02-09 上海华奥泰生物药业股份有限公司 靶向于白介素36r的抗体及其制备方法和应用
WO2022127842A1 (zh) * 2020-12-17 2022-06-23 上海华奥泰生物药业股份有限公司 靶向il-17a和il-36r的双特异性抗体及其应用
WO2022150644A1 (en) 2021-01-08 2022-07-14 Anaptysbio, Inc. Anti-interleukin 36 receptor (il-36r) therapy for acne
WO2022150642A1 (en) 2021-01-08 2022-07-14 Anaptysbio, Inc. Anti-interleukin 36 receptor (il-36r) therapy for hidradenitis suppurativa
WO2022166977A1 (zh) * 2021-02-08 2022-08-11 上海普铭生物科技有限公司 抗人il-36r抗体及其应用
EP4301409A1 (en) 2021-03-04 2024-01-10 Boehringer Ingelheim International GmbH Methods for the treatment of gpp
WO2022192531A2 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biomarkers associated with anti-il-36r antibody treatment in generalized pustular psoriasis
BR112023017717A2 (pt) * 2021-05-03 2024-01-09 Boehringer Ingelheim Int Método para produção de espesolimabe
EP4357361A4 (en) * 2021-06-18 2025-09-03 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd ANTI-IL-36R ANTIBODY AND ITS USE
EP4370550A1 (en) 2021-07-12 2024-05-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of il-36 inhibitors for the treatment of netherton syndrome
US20230049147A1 (en) 2021-08-13 2023-02-16 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-il-36r antibodies for the treatment of a fibrotic condition
EP4409592A2 (en) 2021-09-28 2024-08-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh System and method for assessing severity of neutrophilic dermatoses with visible skin manifestation
TW202334200A (zh) 2021-10-28 2023-09-01 美商艾伯維有限公司 抗澱粉樣蛋白β抗體及其使用方法
TW202323293A (zh) * 2021-10-29 2023-06-16 新加坡商創響私人有限公司 新型抗ｉｌ－３６ｒ抗體
CN115724975A (zh) * 2022-10-20 2023-03-03 江苏荃信生物医药股份有限公司 抗人白介素36受体单克隆抗体及其应用
CN116574189A (zh) 2023-01-30 2023-08-11 北京智仁美博生物科技有限公司 针对人il-36r和/或人il-1r3的多种抗体及其用途
WO2024175031A1 (zh) 2023-02-21 2024-08-29 江苏恒瑞医药股份有限公司 Il-36r结合蛋白及其医药用途
JP2026507877A (ja) 2023-03-09 2026-03-06 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 化膿性汗腺炎（ｈｓ）を処置するための抗ｉｌ－３６ｒ抗体の使用
KR20260025132A (ko) 2023-06-09 2026-02-23 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 전신 농포성 건선(gpp)의 치료 및 예방 방법

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
DK0656789T3 (da) 1992-08-21 1998-08-24 Genentech Inc Fremgangsmåde til behandling af en LFA-1-medieretforstyrrelse.
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5888809A (en) 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
US6416973B1 (en) 1997-08-01 2002-07-09 Schering Corporation Nucleic acids encoding mammalian cell membrane protein MDL-1
ATE523593T1 (de) 1997-08-01 2011-09-15 Schering Corp Membranproteine aus säugetierzellen und verwandte reagentien
ES2637801T3 (es) * 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
EP1627927A3 (en) * 2001-03-01 2006-06-07 Epigenomics AG Methods, systems and computer program products for determining the biological effect and/or activity of drugs, chemical substances and/or pharmaceutical compositions based on their effect on the methylation status of the DNA
WO2004031362A2 (en) * 2002-10-03 2004-04-15 Large Scale Biology Corporation Multimeric protein engineering
EP2500352A1 (en) * 2005-08-19 2012-09-19 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US20070041905A1 (en) 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
US8034771B2 (en) * 2006-09-08 2011-10-11 Amgen Inc. IL-1F6 polypeptides
MX2009011500A (es) 2007-04-23 2010-01-29 Schering Corp Anticuerpos anti-mdl-1.
AU2008270710A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Merck Sharp & Dohme Corp. MDL-1 uses
RU2011105466A (ru) * 2008-08-28 2012-10-10 ВАЙЕТ ЭлЭлСи (US) Применения цитокинов семейств il-22, il-17 и il-1 при аутоиммунных заболеваниях
FI3536710T3 (fi) 2011-11-16 2026-01-14 Boehringer Ingelheim Int Anti-il-36r -vasta-aineita
PL3283110T3 (pl) 2015-04-15 2022-06-27 Anaptysbio, Inc. Przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi interleukiny 36 (il-36r)

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012339734A1 (en) 2014-04-24
CN118496365A (zh) 2024-08-16
ECSP14004976A (es) 2015-11-30
US20200231684A1 (en) 2020-07-23
AP2014007571A0 (en) 2014-04-30
CN112812183B (zh) 2024-06-11
JP6719490B2 (ja) 2020-07-08
HRP20191835T1 (hr) 2019-12-27
FR23C1023I1 (fr) 2023-07-21
JP6289375B2 (ja) 2018-03-07
CO7020871A2 (es) 2014-08-11
CN104080808A (zh) 2014-10-01
KR20190122877A (ko) 2019-10-30
EP3536710A1 (en) 2019-09-11
CN112812183A (zh) 2021-05-18
KR20140101738A (ko) 2014-08-20
KR102038310B1 (ko) 2019-11-01
FR23C1023I2 (fr) 2024-03-29
RS59248B1 (sr) 2019-10-31
SI2780373T1 (sl) 2019-12-31
MX347164B (es) 2017-04-18
EP3536710B1 (en) 2025-10-29
CA2852994A1 (en) 2013-05-23
IL232100B (en) 2020-04-30
HUE047437T2 (hu) 2020-04-28
NL301233I2 (nl) 2023-09-13
AU2012339734B2 (en) 2017-02-16
NO2025001I1 (no) 2025-01-03
LT2780373T (lt) 2019-09-25
HUS2300021I1 (hu) 2023-07-28
JP2018093885A (ja) 2018-06-21
PT2780373T (pt) 2019-11-27
LUC00308I2 (sr) 2025-09-22
JP2020156506A (ja) 2020-10-01
MX2014005759A (es) 2014-09-08
TW201333037A (zh) 2013-08-16
US20240409648A1 (en) 2024-12-12
UY34456A (es) 2013-05-31
DK3536710T3 (da) 2026-01-19
CN104080808B (zh) 2016-11-16
KR102159109B1 (ko) 2020-09-23
US20150203584A1 (en) 2015-07-23
BR112014011594B1 (pt) 2021-11-09
PT3536710T (pt) 2026-01-20
GEP20186816B (en) 2018-02-12
CY2023014I1 (el) 2023-11-15
UA115540C2 (uk) 2017-11-27
LTPA2023518I1 (sr) 2023-06-12
US20130236471A1 (en) 2013-09-12
BR112014011594A2 (pt) 2017-07-04
CY2023014I2 (el) 2023-11-15
PL2780373T3 (pl) 2020-03-31
NZ623425A (en) 2015-12-24
FIC20230020I1 (fi) 2023-06-01
EA201400579A1 (ru) 2014-10-30
US10550189B2 (en) 2020-02-04
MY195289A (en) 2023-01-12
CA2852994C (en) 2023-02-14
WO2013074569A1 (en) 2013-05-23
CL2014001123A1 (es) 2015-01-23
LT3536710T (lt) 2026-01-26
ES2755732T3 (es) 2020-04-23
EP2780373A1 (en) 2014-09-24
ZA201402491B (en) 2021-09-29
AR089178A1 (es) 2014-08-06
CN107007833B (zh) 2020-12-11
EP2780373B1 (en) 2019-08-21
PE20142041A1 (es) 2014-12-18
NL301233I1 (sr) 2023-06-07
PH12014501108A1 (en) 2014-08-04
FI3536710T3 (fi) 2026-01-14
CY1122278T1 (el) 2020-11-25
IL232100A0 (en) 2014-05-28
DK2780373T3 (da) 2019-11-04
US20170298135A9 (en) 2017-10-19
SG11201402283PA (en) 2014-06-27
KR20200110476A (ko) 2020-09-23
LTC2780373I2 (sr) 2024-11-11
NO2023024I1 (no) 2023-05-30
CN118515766A (zh) 2024-08-20
IL272035A (en) 2020-02-27
EA031948B1 (ru) 2019-03-29
HRP20251675T1 (hr) 2026-02-13
CN107007833A (zh) 2017-08-04
ES3058874T3 (en) 2026-03-13
PH12014501108B1 (en) 2014-08-04
US9023995B2 (en) 2015-05-05
TWI573804B (zh) 2017-03-11
JP2015500633A (ja) 2015-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240409648A1 (en) Anti il-36r antibodies
US20230044739A1 (en) Anti il-36r antibodies combination therapy
HK40006024A (en) Anti il-36r antibodies
NZ623425B2 (en) Anti il-36r antibodies
HK1197553B (en) Anti il-36r antibodies
HK1197553A (en) Anti il-36r antibodies
OA16896A (en) Anti IL-36R antibodies