TW202334200A - 抗澱粉樣蛋白β抗體及其使用方法 - Google Patents

抗澱粉樣蛋白β抗體及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明概念係關於抗體，諸如重組人類化及單株抗體；製備抗體之方法；及使用抗體之方法，該等抗體諸如針對且能夠特異性結合至且清除腦中之澱粉樣蛋白-β（Aβ）斑塊的抗體，其適用於治療病症，諸如阿茲海默氏病（AD）。

Description

抗澱粉樣蛋白β抗體及其使用方法
本申請案尤其關於抗澱粉樣蛋白β（Aβ）抗體以及其製造及使用方法。
阿茲海默氏病（Alzheimer's disease，AD）之澱粉樣蛋白假說表明，Aβ之清除與產生之間的不平衡導致蛋白質在腦中積累；此引發若干最終導致神經元及突觸丟失之下游事件，表現為AD之臨床症狀（Selkoe及Hardy 2016）。最近用於治療AD之藥物開發集中於減少可溶性、單體及不溶性、沈積形式之Aβ的化合物，在過去的二十年中已測試若干與不同形式之Aβ結合的mAb（van Dyck 2018）。被動免疫療法主要為投與抗Aβ mAb以治療AD之方法的基礎，因為mAb結合至Aβ以刺激有助於清除蛋白質之免疫反應。
歷史上，靶向Aβ之mAb未能證明在減緩AD之認知及功能衰退方面的功效。然而，此等試驗已產生與安全性相關之重要資料。此外，此等研究提供了對可能需要針對減緩AD進展之特定形式之Aβ的洞察，使得許多人認為Aβ仍為開發AD療法之適當目標（van Dyck 2018）；（Aisen, Cummings等人2020）。事實上，阿杜卡努單抗（aducanumab）之3期試驗（NCT02484547）及多奈單抗（donanemab）之2期試驗（NCT03367403）的最新結果表明，此類化合物可能對治療AD有效。因此，鑒於對AD之澱粉樣蛋白假說的科學支持以及在最近的抗Aβ mAb試驗中所見之積極信號，開發新的抗Aβ mAb為尋找有效AD治療提供了進一步的希望。
在眾多臨床試驗中，已向數千名個體投與抗Aβ mAb。總體而言，其具有良好耐受性：一項回顧靶向Aβ之主動及被動免疫學化合物（包含若干mAb）的綜合分析發現，在幾乎所有不良事件、嚴重不良事件及死亡方面，與安慰劑相比無差異（Penninkilampi, Brothers等人2017）。不良事件資料之一個例外為接受抗Aβ mAb之個體更有可能出現澱粉樣蛋白相關成像異常（ARIA）。
ARIA為適用於經由MRI偵測到的腦血管異常之術語。ARIA分為兩類：ARIA-E代表與血管源性水腫、腦溝積液及偶發性腦回腫脹相關之成像發現，而ARIA-H捕捉反映實質微出血及含鐵血黃素沈積之MRI信號異常（Sperling, Jack等人2011）。儘管兩種類型均已在抗Aβ mAb試驗中記錄，但ARIA-E由於抗Aβ mAb投與而發生頻率更高（Penninkilampi, Brothers等人2017，Greenberg, Bacskai等人2020）。ARIA之確切機制尚不清楚，但可能與澱粉樣蛋白自腦血管系統中之清除或藉由在血管澱粉樣蛋白沈積部位引發炎症反應有關（Greenberg, Bacskai等人 2020）。ARIA之風險因素包含投與靶向Aβ肽之N末端的mAb；既往有微出血史；攜帶載脂蛋白基因之ε4對偶基因；及更高劑量之藥物，儘管目前尚不清楚ARIA風險升高是否與絕對劑量水平或投與更高劑量而不滴定相關（van Dyck 2018，Aisen, Cummings等人2020，Greenberg, Bacskai等人2020）。
AC-264713，亦稱為hu Aβ（AC-264713）[hu IgG1/K]，係一種重組人類化免疫球蛋白G1（IgG1）κ單株抗體（mAb），其結合至N末端截短、在胺基酸位置3處經焦麩胺酸修飾之Aβ（Aβ pE3），Aβ pE3係一種特別快速且不溶的Aβ聚集形式。AC-264713以0.7 nM之半數最大有效濃度（EC 50）選擇性結合至人類Aβ pE3-42原纖維，但不結合至非焦麩胺酸化、全長形式之Aβ。
因此，提供了重組人類化IgG1 κ單株抗體之胺基酸序列，該單株抗體特異性結合Aβ（Aβ pE3），適用於自AD腦中移除澱粉樣斑塊。抗體在結構上包括可變重鏈及可變輕鏈，包含選擇性結合於Aβ pE3-42原纖維之互補決定區（CDR）。亦提供一種抗體，其包含包括片段可結晶區（Fc）之重鏈恆定區及輕鏈恆定區。由胺基酸序列抗體編碼之此等結構元件提供有效治療患者之AD的醫藥組合物。
本文描述一種抗人類Aβ pE3抗體，其包括：(i)包括3個CDR之可變重鏈（vH）；及(ii)包括3個CDR之可變輕鏈（vL），其中： vH CDR1為GFSLSTSGMGVS（SEQ ID NO:1）； vH CDR2為HIYWDDDKRYNPYMKR（SEQ ID NO:2）； vH CDR3為RADDYDVGFAY（SEQ ID NO:3）； vL CDR1為LASQTIGTWLA（SEQ ID NO:4）； vL CDR2為AATSLAD（SEQ ID NO:5）；且 vL CDR3為QQLYSSPFT（SEQ ID NO:6）。
在某些實施例中，抗人類Aβ pE3抗體包括重鏈可變區，其包括闡述為SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包括闡述為SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗人類Aβ pE3抗體包括兩條重鏈，各重鏈包括闡述為SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，及兩條輕鏈，各輕鏈包括闡述為SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗人類Aβ pE3抗體包括IgG恆定區。
在某些實施例中，抗人類Aβ pE3抗體包括人類重鏈恆定區，該人類重鏈恆定區包括Fc部分，其中Fc部分為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同型。
在某些實施例中，抗人類Aβ pE3抗體包括κ輕鏈恆定區。
本文中亦提供包括抗人類Aβ pE3抗體之組合物，該抗體包括(i)包括3個CDR之可變重鏈（vH）；及(ii)包括3個CDR之可變輕鏈（vL），其中： vH CDR1為GFSLSTSGMGVS（SEQ ID NO:1）； vH CDR2為HIYWDDDKRYNPYMKR（SEQ ID NO:2）； vH CDR3為RADDYDVGFAY（SEQ ID NO:3）； vL CDR1為LASQTIGTWLA（SEQ ID NO:4）； vL CDR2為AATSLAD（SEQ ID NO:5）；且 vL CDR3為QQLYSSPFT（SEQ ID NO:6）。
本文中亦提供治療神經退化性病症之方法，其包括向有需要之患者投與抗人類Aβ pE3抗體，該抗體包括(i)包括3個CDR之可變重鏈（vH）；及(ii)包括3個CDR之可變輕鏈（vL），其中： vH CDR1為GFSLSTSGMGVS（SEQ ID NO:1）； vH CDR2為HIYWDDDKRYNPYMKR（SEQ ID NO:2）； vH CDR3為RADDYDVGFAY（SEQ ID NO:3）； vL CDR1為LASQTIGTWLA（SEQ ID NO:4）； vL CDR2為AATSLAD（SEQ ID NO:5）；且 vL CDR3為QQLYSSPFT（SEQ ID NO:6）。
在某些實施例中，神經退化性病症為阿茲海默氏病（AD）。
本文中亦提供多核苷酸，其包括編碼抗人類Aβ pE3抗體之核苷酸序列，其中該抗體包括(i)包括三個CDR之vH鏈；及(ii)包括三個CDR之vL鏈，其中： vH CDR1為GFSLSTSGMGVS（SEQ ID NO:1）； vH CDR2為HIYWDDDKRYNPYMKR（SEQ ID NO:2）； vH CDR3為RADDYDVGFAY（SEQ ID NO:3）； vL CDR1為LASQTIGTWLA（SEQ ID NO:4）； vL CDR2為AATSLAD（SEQ ID NO:5）；且 vL CDR3為QQLYSSPFT（SEQ ID NO:6）。
本文中亦提供包括多核苷酸之載體，該多核苷酸包括編碼抗人類Aβ pE3抗體之核苷酸序列，其中該抗體包括(i)包括三個CDR之vH鏈；及(ii)包括三個CDR之vL鏈，其中： vH CDR1為GFSLSTSGMGVS（SEQ ID NO:1）； vH CDR2為HIYWDDDKRYNPYMKR（SEQ ID NO:2）； vH CDR3為RADDYDVGFAY（SEQ ID NO:3）； vL CDR1為LASQTIGTWLA（SEQ ID NO:4）； vL CDR2為AATSLAD（SEQ ID NO:5）；且 vL CDR3為QQLYSSPFT（SEQ ID NO:6）。
本文中亦提供經載體轉型之真核宿主細胞，該載體包括多核苷酸，該多核苷酸包括編碼抗人類Aβ pE3抗體之核苷酸序列，其中該抗體包括(i)包括三個CDR之vH鏈；及(ii)包括三個CDR之vL鏈，其中： vH CDR1為GFSLSTSGMGVS（SEQ ID NO:1）； vH CDR2為HIYWDDDKRYNPYMKR（SEQ ID NO:2）； vH CDR3為RADDYDVGFAY（SEQ ID NO:3）； vL CDR1為LASQTIGTWLA（SEQ ID NO:4）； vL CDR2為AATSLAD（SEQ ID NO:5）；且 vL CDR3為QQLYSSPFT（SEQ ID NO:6）。
在某些實施例中，真核宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
本文中亦提供一種產生抗人類Aβ pE3抗體之方法，其包括：(a)培養哺乳動物宿主細胞及(b)回收抗人類Aβ pE3抗體。
本文進一步提供抗人類Aβ pE3抗體，其中抗體包括兩條重鏈，各重鏈包括闡述為SEQ ID NO: 37之胺基酸序列，及兩條輕鏈，各輕鏈包括闡述為SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。
相關申請案之交互參考
本申請案主張2021年10月28日申請之美國臨時專利申請案第63/263204號之權益，其以全文引用之方式併入本文中。 對電子序列表之引用
標題為「ABV21397USO1_ST26.xml」之序列表以全文引用之方式併入本文中，該序列表包括SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 37，其包括本文揭示之胺基酸及DNA序列。該序列表已以XML格式以電子方式提交。該序列表創建於2022年10月27日，且大小為22,528位元組。
出於促進對本發明之原理之理解的目的，現將參考各種實施例。儘管如此，應理解，並不由此意欲限制本發明之範疇，如本文中所說明之本發明之此類更改及其他修改預期為熟習本發明相關技術者通常將想到的。
本文所用之冠詞「一(a)」、「一（an）」及「該（the）」係指該冠詞之一個或超過一個（亦即至少一個）文法對象。舉例而言，「一個要素」意謂至少一個要素且可包含超過一個要素。術語「及/或」包含相關聯所列項目中之一或多者的任何及所有組合，且可被縮寫為「/」。
如本文所用，術語「包括」除其常規含義以外亦可包含且在一些實施例中可尤其指表述「基本上由……組成」及/或「由……組成」。因此，表述「包括」亦可指其中「包括」特定列出之要素之所主張內容不包含其他要素的實施例，以及其中「包括」特定列出之要素之所主張內容可涵蓋及/或的確涵蓋其他元件，或涵蓋實質上不影響所主張內容之基本及新穎特徵之其他要素的實施例。舉例而言，「包括」特定列出之要素之所主張內容，諸如方法、套組、系統等亦涵蓋例如方法、套組、系統等「由......組成」，亦即其中所主張內容不包含其他元件，及例如方法、套組、系統等「基本上由……組成」，亦即其中所主張內容可包含實質上不影響所主張內容之基本及新穎特徵之其他元件。
如本文所用，術語「約」意欲限定其修飾之數值，將此類值表示為在誤差邊際內之變數。當未列舉特定誤差邊際，諸如與圖表或資料表中給出之平均值的標準偏差時，術語「約」應理解為意謂包含可涵蓋所列舉值及範圍之例如±20%、±15%或±10%，且在一些實施例中，±5%、±3%或±2%的範圍。
除非另作定義，否則本文中所用之所有技術術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所瞭解相同的含義。
本揭示案之實施例係關於結合至大腦中Aβ之沈積形式以刺激幫助清除蛋白質之免疫反應的抗體，及使用此等抗體例如治療AD之方法。
Aβ pE3係似乎尤其快速聚集之Aβ形式（Jawhar, Wirths等人2011）。鑒於靶向Aβ pE3之多奈單抗（donanemab）達成了自人類AD腦中快速移除斑塊，且相對於其他形式之Aβ，Aβ pE3在腦血管系統中之普遍性較低（Kuo, Emmerling等人1997），產生了旨在達成快速移除斑塊且降低ARIA風險之抗Aβ pE3抗體，諸如AC-264713。
AC-264713為結合至Aβ pE3之重組人類化IgG1κ mAb。AC-264713之起源為結合至Aβ pE3之鼠類mAb。鼠類抗體之可變域經人類化且接著與人類IgG1重鏈及Ig κ輕鏈恆定區融合以產生AC-264713。應瞭解，使例如鼠類mAb人類化以提供人類化mAb，諸如本發明之抗體可藉由熟習此項技術者已知之任何方法無限制地實現。
在一些實施例中，本揭示案之抗體包括兩條可變鏈，一條重鏈及一條輕鏈。在各可變鏈上，存在三個允許抗體結合至Aβ pE3之CDR。在重鏈及輕鏈可變鏈上，存在總共六種不同CDR。另外，在一個實施例中，抗體含有人類重鏈恆定區，其包含免疫球蛋白G1類（IgG1）之人類Fc。本文所述之抗Aβ pE3抗體可經岩藻醣基化或去岩藻醣基化且展現試管內功能性、免疫安全性及藥物樣特性。
根據本揭示案之抗體係經由使用人類Aβ pE3-42原纖維在融合瘤操作中鑑定之抗體的人源化和人類化及傾向工程改造產生的。為了優先考慮人類化抗體，評估了抗體結合原纖維性Aβ pE3-42之能力。抗Aβ pE3抗體AC-264713與人類及食蟹猴獼猴Aβ pE3交叉反應，但不結合小鼠或大鼠Aβ pE3。
如本文所用，術語「抗體」（Ab）係指特異性結合至特定抗原，例如Aβ pE3原纖維之免疫球蛋白分子。本發明概念之抗Aβ pE3抗體結合至Aβ pE3且因此調節免疫系統。本發明概念之抗Aβ pE3抗體在輕鏈及重鏈可變域中均包含互補決定區（CDR），亦稱為高變區。可變域之更高度保守部分稱為構架區（FR）。如此項技術中所知，描繪抗體高變區之胺基酸位置/邊界可取決於情形及此項技術中已知之各種定義而變化。可變域內之一些位置可視為混合高變位置，因為此等位置根據一組標準可視為在高變區範圍內，而根據一組不同標準可視為在高變區外。此等位置中之一或多個亦可見於擴展之高變區中。本發明概念提供在此等雜合高變位置中包含修飾之抗體。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個FR區，主要呈β-片層組態，藉由三個CDR連接，形成連接β-片層結構之環且在一些情況下形成β-片層結構之一部分。各鏈中之CDR藉由FR區緊密保持在一起且與來自另一條鏈之CDR一起促成抗體之目標結合位點的形成。參見Kabat等人, 《免疫學感興趣蛋白質之序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）》(National Institute of Health, Bethesda, Md.1987)，其可用於鑑定及編號可變域內之CDR序列。
本揭示案之抗體可為單株、基因工程化及/或在性質上以其他方式修飾的，包含但不限於嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體等。在各種實施例中，該等抗體包含抗體恆定區之全部或一部分。在一些實施例中，恆定區為選自以下之同型：IgA（例如IgA1或IgA2）、IgD、IgE、IgG（例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）及IgM。在特定實施例中，本文所述之抗Aβ pE3抗體包含IgG1。在其他實施例中，抗Aβ pE3抗體包含IgG2。在其他實施例中，抗Aβ pE3抗體包含IgG4。如本文所用，抗體之「恆定區」包含天然恆定區、異型或變異體。
抗Aβ pE3抗體之輕鏈恆定區可為卡帕（κ）輕鏈區或拉姆達（λ）區。λ輕鏈區可為已知亞型中之任一者，例如λ1、λ2、λ3或λ4。在一些實施例中，抗Aβ pE3抗體包含卡帕（κ）輕鏈區。
如本文所用之術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。單病毒株抗體係藉由任何可用或此項技術中已知的手段，自單一純系得到，該純系包含任何真核、原核或噬菌體純系。可用於本發明概念之單株抗體可使用此項技術中已知之廣泛多種技術製備，包含使用融合瘤、重組及噬菌體呈現技術，或其組合。
如本文所用的術語「嵌合」抗體係指具有源自以下的可變序列的抗體：諸如大鼠或小鼠抗體之非人類免疫球蛋白及通常選自人類免疫球蛋白模板的人類免疫球蛋白恆定區。
非人類（例如鼠類）抗體之「人類化」形式包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中CDR區之全部或實質上全部對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且FR區之全部或實質上全部係人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區（Fc）之至少一部分，通常人類免疫球蛋白共有序列之至少一部分。
本揭示案之抗Aβ pE3抗體包含全長（完整）抗體分子，其包括兩條全長輕鏈及兩條全長重鏈。
包含人類IgG4恆定區之抗Aβ pE3抗體可包含已報導防止Fab臂交換之S228P突變。參見例如Silva, JP等人, 《生物化學雜誌（Journal of Biological Chemistry）》, 290(9), 5462-5469(2015)。
對Aβ pE3具有高親和力之抗Aβ pE3抗體對於治療及診斷用途可為合乎需要的。因此，本發明概念考慮對Aβ pE3具有高結合親和力之抗體。在特定實施例中，抗Aβ pE3抗體以至少約25 nM之親和力結合至Aβ pE3，但可展現較高親和力，例如至少約20 nM、15 nM、10 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或甚至更高。在一些實施例中，抗體以在約1 pM至約10 nM、約100 pM至約10 nM、約100 pM至約1 nM、約100 pM至約2 nM範圍內之親和力或在任何前述值之間的範圍內之親和力結合人類Aβ pE3。
在一些實施例中，本發明提供具有兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈之單株抗Aβ pE3抗體，其包括兩組兩個不同可變區內之兩組六個不同互補決定區（CDR）。
在一些實施例中，抗體為結合至Aβ pE3之重組、去岩藻醣基化、人類化IgG1 κ單株抗體。
在一實施例中，抗體包括六個包含以下序列之CDR： vH CDR1為GFSLSTSGMGVS（SEQ ID NO:1）； vH CDR2為HIYWDDDKRYNPYMKR（SEQ ID NO:2）； vH CDR3為RADDYDVGFAY (SEQ ID NO:3)； vL CDR1為LASQTIGTWLA（SEQ ID NO:4）； vL CDR2為AATSLAD（SEQ ID NO:5）；且 vL CDR3為QQLYSSPFT（SEQ ID NO:6）。
在一些實施例中，本揭示案之抗體包括：包含或具有SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列的vH CDR1、包含或具有SEQ ID NO: 2中所闡述之胺基酸序列的vH CDR2；包含或具有SEQ ID NO: 3中所闡述之胺基酸序列的vH CDR3、包含或具有SEQ ID NO: 4中所闡述之胺基酸序列的vL CDR1、包含或具有SEQ ID NO: 5中所闡述之胺基酸序列的vL CDR2；及包含或具有SEQ ID NO: 6中所闡述之胺基酸序列的vL CDR3。
在一些實施例中，本揭示案之抗體包括包含或具有SEQ ID NO: 7中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 7具有至少98%序列一致性之序列的重鏈可變區： EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPYMKRRLTISKDTSKNQVSLKISSVTAADTAVYYCARRADDYDVGFAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO:7）
在一些實施例中，本揭示案之抗體包括包含或具有SEQ ID NO: 8中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 8具有至少98%序列一致性之序列的輕鏈可變區： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKSPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLYSSPFTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO:8）
在一些實施例中，本揭示案之抗體包括包含或具有SEQ ID NO: 9中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 9具有至少98%序列一致性之序列的重鏈（恆定區為 粗體；可變重鏈域 加底線；CDR為 加底線的粗體斜體 （按出現之次序分別闡述於SEQ ID NO: 1-3中））： EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTFS GFSLSTSGMGVS WIRQPPGKGLEWLA HIYWDDDKRYNPYMKR RLTISKDTSKNQVSLKISSVTAADTAVYYCAR RADDYDVGFAY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:9）。
在一些實施例中，本揭示案之抗體包含C端離胺酸經截短之重鏈，例如C端離胺酸經截短/移除之SEQ ID NO: 9中所闡述之重鏈。
在一些實施例中，本揭示案之抗體包括包含或具有SEQ ID NO: 10中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 10具有至少98%序列一致性之序列的輕鏈（恆定區為 粗體；可變重鏈域 加底線；CDR為 加底線的粗體斜體 （按出現之次序分別闡述於SEQ ID NO: 4-6中））： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC LASQTIGTWLA WYQQKPGKSPKLLIY AATSLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQLYSSPFT FGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:10）。
本發明概念之實施例亦包含編碼SEQ ID NO: 9之重鏈序列的核酸，及編碼SEQ ID NO: 10之輕鏈序列的核酸。在一些實施例中，舉例而言，SEQ ID NO: 9中所闡述之成熟重鏈序列可由SEQ ID NO: 13中所闡述之核酸序列編碼（由序列編碼之恆定區為 粗體；由序列編碼之可變重鏈域 加底線；且由序列編碼之CDR為 加底線的粗體斜體 ）： GAAGTGCAGCTGCAAGAGTCCGGCCCGGGCTTGGTCAAGCCGTCGCAGACCCTCAGCCTTACTTGCACCTTCTCG GGATTCTCGCTGTCCACTAGCGGCATGGGCGTGTCG TGGATCAGGCAGCCTCCTGGCAAAGGGCTGGAGTGGCTTGCC CACATCTACTGGGACGATGACAAGAGATACAACCCCTATATGAAGCGC CGCCTGACCATCAGCAAGGACACCTCCAAAAACCAAGTCTCGCTGAAGATCTCCTCCGTGACCGCCGCGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGG CGGGCCGACGACTATGACGTGGGATTTGCGTAC TGGGGACAGGGGACCCTGGTCACCGTGTCCTCC GCCTCAACTAAGGGACCCAGCGTGTTCCCTCTCGCCCCATCATCGAAGTCCACTAGTGGCGGGACCGCTGCTCTCGGTTGTCTGGTTAAGGACTACTTCCCGGAACCCGTCACCGTATCATGGAACTCCGGTGCACTGACATCCGGCGTGCACACCTTCCCGGCCGTGCTGCAAAGCTCCGGACTGTACTCCCTGTCGAGCGTGGTCACTGTGCCCTCATCAAGCCTGGGTACTCAGACGTACATTTGCAACGTGAACCACAAGCCGTCCAACACCAAGGTCGACAAGAAAGTGGAGCCGAAGTCCTGCGACAAGACCCATACTTGCCCGCCGTGCCCAGCCCCTGAGCTGCTGGGTGGACCGAGCGTGTTCCTGTTCCCACCTAAACCCAAGGACACCCTGATGATTAGCCGCACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTCGTGGATGTGTCCCACGAAGATCCCGAAGTCAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTCGAAGTGCATAACGCCAAGACTAAGCCCCGCGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACTGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCACTGCCAGCGCCCATCGAGAAAACGATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCGAGAGAACCTCAGGTCTACACCCTGCCGCCATCCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAAGTGTCCCTTACCTGTCTCGTGAAGGGATTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGATGGATCTTTCTTCCTGTACTCGAAGCTCACCGTGGATAAGTCGCGGTGGCAACAGGGGAATGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCATAACCACTACACTCAGAAGTCGCTGTCACTCTCCCCCGGGAAA（SEQ ID NO:13）
在一些實施例中，舉例而言，SEQ ID NO: 10中所闡述之成熟輕鏈序列可由SEQ ID NO: 14中所闡述之核酸序列編碼（由序列編碼之恆定區為 粗體；由序列編碼之可變重鏈域 加底線；且由序列編碼之CDR為 加底線的粗體斜體 ）： GACATCCAGATGACCCAGTCCCCGTCCTCGGTGTCAGCGTCAGTGGGGGACAGGGTCACGATCACTTGC CTGGCCAGCCAGACCATTGGCACTTGGCTGGCC TGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGTCACCGAAGCTGTTGATCTAC GCCGCAACTTCCCTGGCCGAT GGCGTGCCCTCGCGGTTCTCCGGTTCCGGGTCGGGAACTGACTTTACCCTGACCATTAGCTCTCTGCAACCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGT CAGCAACTGTACTCCTCGCCGTTCACC TTCGGACAAGGCACCAAGTTGGAAATCAAG CGGACTGTGGCGGCACCCAGCGTGTTCATCTTTCCTCCATCCGACGAACAGCTGAAGTCCGGTACCGCTAGCGTGGTCTGTCTCCTGAACAACTTCTACCCGCGCGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAACGCGCTCCAGAGCGGCAACAGTCAGGAATCCGTGACCGAACAGGACTCCAAGGATTCGACCTACTCGCTGTCCTCCACTCTCACCCTGTCCAAAGCCGATTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCTTGCGAAGTGACCCATCAAGGCCTTAGCAGCCCCGTGACAAAGTCCTTCAATCGGGGAGAGTGC（SEQ ID NO:14）
熟習此項技術者應瞭解，作為遺傳密碼中密碼簡併之結果，在不脫離本發明概念之範疇的情況下考慮不同於SEQ ID NO: 13、14、15及16中所闡述之序列的核酸序列，該等所闡述序列分別編碼SEQ ID NO: 9之重鏈序列、SEQ ID NO: 10之輕鏈序列、SEQ ID NO: 11之重鏈序列及SEQ ID NO: 12之輕鏈序列。
在一些實施例中，抗體包括人類重鏈恆定區，其包含人類CH1、人類鉸鏈、人類CH2及人類CH3域。在一些實施例中，經編碼重鏈恆定區包括Fc部分，其中Fc部分為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、或IgM同型。在一實施例中，Fc為IgG1，且異型為z、非a。在一實施例中，輕鏈為κ輕鏈。 編碼抗 Aβ pE3 抗體之多核苷酸、表現系統及製造抗體之方法
本發明概念涵蓋編碼抗Aβ pE3抗體之免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因的多核苷酸分子、包含此類多核苷酸之載體及能夠產生本揭示案之抗Aβ pE3抗體之宿主細胞。
本揭示案之抗Aβ pE3抗體可藉由免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因在宿主細胞中之重組表現來製備。為重組表現抗體，用攜帶編碼該抗體免疫球蛋白輕鏈及重鏈之DNA片段的一或多個重組表現載體轉染宿主細胞，由此使該輕鏈及重鏈在宿主細胞中表現且視情況，分泌至培養宿主細胞之培養基中，可自該培養基回收該等抗體。
為了產生編碼此類抗Aβ pE3抗體之多核苷酸，首先獲得編碼輕鏈及重鏈可變區之DNA片段。可藉由例如使用聚合酶鏈反應（PCR）擴增及修飾編碼輕鏈及重鏈可變序列之生殖系DNA或cDNA來獲得此等DNA。
一旦獲得編碼抗Aβ pE3抗體相關VH及VL區段的之DNA片段，即可藉由標準重組DNA技術進一步操作此等DNA片段，例如將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接於編碼另一蛋白質（諸如抗體恆定區或柔性連接子）之另一DNA片段。如本文中所用，術語「可操作地連接」意指兩個DNA片段以使得該兩個DNA片段所編碼之胺基酸序列保持同框的方式連接。
編碼VH區的經分離之DNA可藉由將編碼VH之DNA操作性地連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2、CH3及視情況，CH4)之另一DNA分子而轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列係此項技術中已知的（參見例如Kabat, E.A.等人，1991, 《免疫感興趣蛋白質之序列》, 第五版, 美國衛生及公共服務部（U.S.Department of Health and Human Services）, NIH出版號91-3242），且包括此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但在某些實施例中為IgG1或IgG4。對於Fab片段重鏈基因，編碼VH之DNA可操作地連接至另一個僅編碼重鏈CH1恆定區之DNA分子。
編碼VL區之經分離DNA可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子來轉變成全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人類輕鏈恆定區基因之序列係此項技術中已知的（參見例如Kabat, E.A.等人，1991, 《免疫感興趣蛋白質之序列》, 第五版, 美國衛生及公共服務部, NIH出版號91-3242），且包括此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但在某些實施例中為κ恆定區。
為了表現抗Aβ pE3抗體，如上文所述獲得之編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA插入至表現載體中，使得基因可操作地連接於轉錄及轉譯控制序列。在此上下文中，術語「可操作地連接」意欲意謂抗體基因接合至載體中，使得載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調節抗體基因之轉錄及轉譯的預期功能。選擇與所用表現宿主細胞相容的表現載體及表現控制序列。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可插入至獨立載體中，或更典型地，將兩個基因插入至同一表現載體中。
藉由標準方法（例如抗體基因片段及載體上的互補限制部位之接合或若無限制部位存在時之鈍端接合）將抗體基因插入至表現載體中。在插入抗Aβ pE3抗體相關輕鏈或重鏈序列之前，表現載體可能已經攜帶抗體恆定區序列。舉例而言，一種將抗Aβ pE3單株抗體相關VH及VL序列轉化為全長抗體基因之方法係將其分別插入已編碼重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中，使得VH區段可操作地連接於載體內之（多個）CH區段且VL區段可操作地連接於載體內之CL區段。另外或替代地，重組表現載體可編碼信號肽，其促進抗體鏈自宿主細胞分泌。可將抗體鏈基因選殖至載體中，以使得信號肽與抗體鏈基因之胺基末端同框連接。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽（亦即來自非免疫球蛋白蛋白質之信號肽）。
除了抗體鏈基因之外，本揭示案之重組表現載體攜帶調控序列，該等調控序列控制宿主細胞中抗體鏈基因之表現。術語「調控序列」意欲包含啟動子、強化子及控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯的其他表現控制元件（例如聚腺苷酸化信號）。
除抗體鏈基因及調控序列之外，本揭示案之重組表現載體可攜帶額外序列，諸如調控宿主細胞中載體之複製的序列（例如複製起點）及選擇性標記物基因。選擇性標記基因促進已引入載體之宿主細胞之選擇。對於輕鏈及重鏈之表現，將編碼重鏈及輕鏈之一或多個表現載體藉由標準技術轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中的多種技術，例如電穿孔、脂質體轉染、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。
可在原核或真核宿主細胞中表現本揭示案之抗體。在某些實施例中，抗體之表現係在真核細胞，例如哺乳動物宿主細胞中執行，以最佳地分泌正確摺疊的免疫活性抗體。用於表現本揭示案之重組抗體的例示性哺乳動物宿主細胞包含中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）（包含Urlaub及Chasin(1980)《美國國家科學院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)）》77:4216-4220中描述之DHFR- CHO細胞，用於DHFR選擇性標記物，例如Kaufman及Sharp, 1982, 《分子生物學（Mol.Biol.）》159:601-621中所描述)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞一段足以允許在宿主細胞中表現該抗體或將抗體分泌至生長宿主細胞之培養基中的時間來產生抗體。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。亦可使用宿主細胞產生完整抗體之部分，諸如Fab片段或scFv分子。應理解，以上程序之變化在本揭示案之範圍內。舉例而言，可能需要用編碼本揭示案之抗Aβ pE3抗體之輕鏈或重鏈（但非兩者）的DNA轉染宿主細胞。
亦可使用重組DNA技術移除並非結合至Aβ pE3所必需的編碼輕鏈及重鏈中之任一者或兩者的DNA之一部分或全部。本揭示案之抗體亦涵蓋自此類截短之DNA分子表現的分子。
對於本揭示案之抗Aβ pE3抗體之重組表現，宿主細胞可經兩種本揭示案之表現載體共轉染，第一載體編碼重鏈衍生之多肽且第二載體編碼輕鏈衍生之多肽。該兩種載體可含有相同的選擇性標記物，或其可各自含有獨立的選擇性標記物。或者，可使用編碼重鏈及輕鏈多肽兩者之單一載體。
一旦已獲得編碼抗Aβ pE3抗體之一或多個部分的多核苷酸，則可將其他改變或突變引入編碼序列中，例如以產生編碼具有不同CDR序列之抗體、對Fc受體之親和力降低之抗體（例如具有LALA突變之抗體）、或不同子類之抗體的多核苷酸。應瞭解，可引入至編碼序列中以產生編碼抗體之多核苷酸的其他改變及/或突變可藉由熟習此項技術者已知之任何方法無限制地實現，且產生之多核苷酸用於產生例如其他抗Aβ pE3抗體，諸如對Fc受體之親和力降低之抗Aβ pE3抗體及/或不同子類之抗Aβ pE3抗體。
本揭示案之抗Aβ pE3抗體亦可藉由化學合成或藉由使用無細胞平台產生。 抗 Aβ pE3 抗體之純化
一旦藉由重組表現產生本揭示案之多肽，亦可藉由此項技術中已知用於純化蛋白質之任何方法對其進行純化。
一旦分離，則可進一步純化抗Aβ pE3抗體。 組合物
本揭示案之抗體可以適合於向個體投與之組合物形式提供。在一些實施例中，抗體組合物為醫藥組合物，其包含本揭示案之抗體及醫藥學上可接受之載劑。 本發明抗體特性之概述
藉由AC-264713例示但不限於其之本發明抗體之特性包含以下：
與人類Aβ pE3原纖維之高親和力結合，例如，藉由例如實例1之直接結合ELISA確定的對人類Aβ pE3-42原纖維之EC 50為約2.5 nM或更低、2 nM或更低、1.5 nM或更低、1 nM或更低、0.9 nM或更低、0.8 nM或更低、0.7 nM或更低、0.6 nM或更低、約0.5 nM或更低、0.4 nM或更低、約0.3 nM或更低、約0.2 nM或更低、約0.1 nM或更低、或約0.05 nM或更低，或約0.05 nM與約2.5 nM之間的任何EC 50值範圍。
與人類Aβ pE3原纖維之高特異性結合，例如與人類Aβ pE11-40原纖維無顯著交叉反應，且與來自所有物種，包含人類、猴、狗、兔、大鼠及小鼠之Aβ 1-40無顯著交叉反應。
藉由細胞介素釋放分析確定之良好之免疫安全性。
在一些實施方案中，本揭示案之抗體可例如展現以劑量依賴性方式結合至含有澱粉樣斑塊之AD腦，EC 50為0.4 μg/mL，而不結合至不存在澱粉樣斑塊之非AD人類、大鼠或食蟹獼猴腦組織。
使用表現澱粉樣前驅蛋白及早老素1之人類轉殖基因之APPPS1-21小鼠模型的研究資料表明，AC-264713在單次注射後進入大腦且結合至Aβ斑塊。AC-264713亦結合至來自患有AD之供體的人類腦組織中之澱粉樣斑塊。另外，試管內資料表明，AC-264713之可結晶片段（Fc）部分具有觸發經由hiPSC衍生之吞噬細胞介導之斑塊移除的完整效應功能。當使用APPPS1-21小鼠在急性微出血模型中進行評估時，AC-264713不誘導微出血。總之，資料支持AC-264713，亦即一種具有完整效應功能之抗人類Aβ pE3原纖維單株抗體自AD腦移除澱粉樣斑塊。 使用方法
在實施例中，本文所述之方法涉及用本揭示案之抗Aβ pE3抗體治療AD患者。
關於例如治療AD及與AD相關之Aβ斑塊之發展的「抑制」、「減少」或此等術語之任何變化形式包含任何可量測減少或完全抑制以達成所需結果。例如，可減少（移除）Aβ斑塊負荷之約、至多約或至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更多，或其中可推導之任何範圍，或AD患者中之Aβ斑塊發展的減少及該患者之治療。 實例
出於說明之目的提供以下實例，其突出顯示本文所述之本發明概念之例示性實施例的某些特徵及特性。 實例 1 ： 鑑定之重組融合瘤 mAb 組與重組 Aβ 蛋白質之結合
直接結合ELISA用於評估經鑑定及以重組方式表現之mAb組與人類Aβ pE3-42原纖維結合之能力及其與人類Aβ 1-40、人類Aβ 1-42或人類Aβ pE11-40之交叉反應性。由於人類、猴子、狗與兔子之間的100%序列一致性；以人類Aβ 1-40及Aβ 1-42作為此等其他物種之代表進行結合研究。重組人類Aβ蛋白在0.2 M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液中稀釋。Aβ蛋白自0.1 mM/0.2 mM儲備溶液稀釋至1 µg/mL之工作濃度，且將50 µL/孔（50 ng/孔）添加至96孔半面積高結合ELISA盤中。將盤在4℃下以100 rpm振盪培育隔夜。塗佈後，使用自動盤洗滌器，用190 µL/孔之1× PBS將盤洗滌四次。盤用190 µL/孔之2% BSA/DPBS封閉且在室溫（RT）下培育1小時。用於ELISA之試劑在0.25% BSA/DPBS中稀釋。 在 ELISA 中測試之 Aβ 肽清單
肽序列 序列
Aß pE3-42原纖維 (Pyr-E)FRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII GLMVGGVVIA SEQ ID NO:17
Aß pE11-40原纖維 (Pyr-E)VHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV SEQ ID NO:18
Aß 3-42單體 EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII GLMVGGVVIA SEQ ID NO:19
Aß 3-42原纖維 EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII GLMVGGVVIA SEQ ID NO:19
Aß 1-40原纖維 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV SEQ ID NO:20
Aß 1-42原纖維 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA SEQ ID NO:21
小鼠/大鼠Aβ 1-40 DAEFGHDSGF EVRHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV SEQ ID NO:22
在稀釋盤中製備mAb組之稀釋液，自儲備溶液稀釋至67 nM或100 nM之工作1×初始濃度，且對各mAb進行8點5×稀釋系列。培育封閉後，使用自動盤洗滌器，用190 µL/孔之1× PBS將盤洗滌四次。製備1:10,000稀釋度之抗小鼠IgG-HRP用於偵測，且添加50 µL至各孔。將盤在室溫下培育30分鐘。在用1× PBS洗滌四次之後，將50 µL TMB受質（Life Technology，002023）添加至各孔中，且將盤在室溫下培育約5-10分鐘直至顯色。藉由添加50 µL/孔之2N硫酸來停止反應。在盤讀取器上讀取盤以獲得450 nm處之吸光度（OD 450）。在GraphPad Prism 8.4.3中使用非線性回歸（4參數劑量-反應曲線模型：Y = 底部 + (頂部底部)/(1+10^((LogIC50-X) *希爾斜率))）計算mAb與Aβ蛋白的結合（EC 50）。
單株抗體（mAb）AC233661展示對Aβ pE3-42物種之特異性及選擇性且經選擇用於人類化。AC-264713為AC-233661之人類化型式。
在一些情況下，使用比較抗體表徵AC-264713。出於比較目的包含於實驗中之抗體的胺基酸序列描述於下文： 抗體
比較Ab1 重鏈 SEQ ID NO:23
輕鏈 SEQ ID NO:24
比較Ab2 重鏈 SEQ ID NO:25
輕鏈 SEQ ID NO:26
小鼠前驅體抗體（AC-233661） 重鏈 SEQ ID NO:11
輕鏈 SEQ ID NO:12
實例 2 ： 結合特異性及表位鑑定 A. 與人類 Aβ pE3-42 原纖維之結合特異性AC-264713對人類AβpE3-42原纖維之結合使用如實例1中所述之方法評估，不同之處在於使用抗人類IgG-HRP替代抗小鼠IgG-HRP進行偵測。AC-264713與人類Aβ pE3-42原纖維結合之EC 50值為0.7 nM。圖1顯示AC-264713與人類Aβ pE3-42原纖維之代表性結合。 B. 表位鑑定
如下所列，在C末端用生物素產生了來自N末端3-16個胺基酸長度之十個生物素化肽，其中甘胺酸點位置變化取代了自胺基酸3開始之各胺基酸。 甘胺酸位置突變 Aβ 肽之清單
肽序列 SEQ ID NO:
pE3—l6 Pyr—EFRHDSGYEVHHQK-生物素 SEQ ID NO:27
4—l6 —FRHDSGYEVHHQK-生物素 SEQ ID NO:28
5—l6 —RHDSGYEVHHQK-生物素 SEQ ID NO:29
E3—l6 EFRHDSGYEVHHQK-生物素 SEQ ID NO:30
pEG4 Pyr—E G RHDSGYEVHHQK-生物素 SEQ ID NO:31
mpE3—l6 Pyr—EF G HDSGFEVHHQK-生物素 SEQ ID NO:32
pEG6 Pyr—EFR G DSGYEVHHQK-生物素 SEQ ID NO:33
pEG7 Pyr—EFRH G SGYEVHHQK-生物素 SEQ ID NO:34
pEG8 Pyr— EFRHD G GYEVHHQK-生物素 SEQ ID NO:35
pEFlO Pyr—EFRHDSG G EVHHQK-生物素 SEQ ID NO:36
Aβ=澱粉樣蛋白-β；突變成甘胺酸之胺基酸突出顯示且加粗且加底線
藉由直接結合ELISA評估AC-264713結合至肽之能力。結合損失表明AC-264713需要殘基來結合Aβ pE3-42原纖維。在蒸餾水中稀釋重組人類Aβ生物素化肽。將Aβ肽稀釋至2 µg/mL之工作濃度，且將50 µL/孔（100 ng/孔）添加至96孔半面積高結合ELISA盤中。將盤在4℃下以100 rpm振盪培育隔夜。塗佈後，使用自動盤洗滌器，用190 µL/孔之1× PBS將盤洗滌四次。盤用190 µL/孔之2% BSA/DPBS封閉且在室溫下培育1小時。用於ELISA之試劑在0.25% BSA/DPBS中稀釋。
在稀釋盤中製備AC-264713之稀釋液，自儲備溶液稀釋至67 nM或100 nM之工作1×初始濃度，且對mAb進行8點5×稀釋系列。培育封閉後，使用自動盤洗滌器，用190 µL/孔之1× PBS將盤洗滌四次。製備1:10,000稀釋度之抗人類IgG-HRP用於AC-264713偵測，且添加50 µL至各孔。將盤在室溫下培育30分鐘。在用PBS洗滌四次之後，將50 µL TMB受質添加至各孔中，且將盤在室溫下培育約5-10分鐘直至顯色。藉由添加50 µL/孔之2N硫酸來停止反應。在ClarioStar盤讀取器上讀取盤以獲得450 nm處之吸光度（OD 450）。在GraphPad Prism 8.4.3中使用非線性回歸（4參數劑量-反應曲線模型：Y = 底部 + (頂部底部)/(1+10^((LogIC50-X) *希爾斜率))）計算AC-264713與Aβ蛋白的結合（EC 50）。進行三次獨立實驗。
結果概述於下表中。 Epitope Finder ELISA EC 50 值 - AC-264713 之甘胺酸位置突變 Aβ 肽結合 EC 50 值
肽（ SEQ ID NO: ） EC 50 （ nM ）（平均值 ±SD ）
pE3—l6（SEQ ID NO:27） 0.3 ± 0.1
4—l6（SEQ ID NO:28） NB
5—l6（SEQ ID NO:29） NB
E3—l6（SEQ ID NO:30） 0.9 ± 0.1
pEG4（SEQ ID NO:31） NB
mpE3—l6（SEQ ID NO:32） NB
pEG6（SEQ ID NO:33） 0.5 ± 0.1
pEG7（SEQ ID NO:34） 0.4 ± 0.1
pEG8 Pyr（SEQ ID NO:35） 0.4 ± 0.03
pEF10（SEQ ID NO:36） 0.5 ± 0.1
AC-264713與甘胺酸突變肽之結合分析表明殘基pyro 3、4及5對結合重要。有趣的是，AC-264713結合至E3-16，但與pE3-16相比，結合效力降低了3倍，其可能係由於重組Aβ肽製劑中麩胺酸自發轉化為焦麩胺酸。 實例 3 AC-264713 與 AD 腦組織中澱粉樣斑塊之結合
使用低溫恆溫器自人類屍體AD腦之大腦皮層製備未固定的20 µm組織切片，且解凍安裝至載玻片上。接著將組織切片在含有0.3% H 2O 2之Tris緩衝鹽水（TBS）中培育10分鐘。用TBS洗滌三次之後，將切片在含有3%牛奶之TBS中培育30分鐘。接著將生物素化AC-264713添加至樣品且在4℃下培育隔夜。用TBS洗滌三次後，藉由在1:400 ABC Elite中培育一小時，接著在DAB中培育五分鐘觀測免疫反應性。
使用載玻片掃描儀自所有樣品獲取影像。使用HALO TM影像分析軟體v3.1.1076.423中之面積量化模組對AD樣品（n=6）中生物素化AC-264713之IR進行量化。使用該軟體勾勒出灰質，且「臨限值」係由對染色條件不知情之觀測者確定。設定臨限值以便軟體識別DAB信號，且自分析中排除背景/非特異性染色。一旦設定適當臨限值，軟體便量測含有正信號之所關注區域的百分比。
使用Prism 9.1.0版（Graph Pad Software）進行非線性回歸分析。使用可變斜率模型，由IR覆蓋之面積% = 底部 + (X 希爾斜率)*(頂部-底部)/(X 希爾斜率+ EC 50 希爾斜率)，其中底部固定為零，且頂部固定為10%，作為斑塊覆蓋之典型總面積。在結合資料擬合中分析了所有六名供體之資料。
在AD腦組織（n=6）中，AC-264713以濃度依賴性方式結合斑塊，範圍為0.5-100 µg/mL（圖2），EC 50為0.4 µg/ml（信賴區間：0.1-0.7 μg/ml）。相比之下，比較抗體Ab1與AD腦組織結合之EC 50經估計為12 μg/ml（圖2.信賴區間：8-17 μg/ml）。AC-264713及Ab1之希爾係數均接近1（分別為1.5及0.8）。
圖2描繪來自額葉皮層之新鮮冷凍人類AD組織中由AC-264713及比較抗體Ab1結合之斑塊面積。 實例 4 藉由 hiPSC 衍生之吞噬細胞自未固定之 APPPS1-21 腦組織中移除經刺激之澱粉樣斑塊 分析方案
在低溫恆溫器上自21月齡的APPPS1-21小鼠製備未固定之20 μm冠狀腦組織切片，且將其解凍安裝至12 mm聚D-離胺酸塗佈之蓋玻片上。用PBS短暫洗滌乾燥組織切片，且與含0或劑量a、劑量b或劑量c（其中0 µg/ml ＜劑量a ＜劑量b ＜劑量c）之AC-264713之PBS在4℃下培育隔夜。在即將添加人類誘導多潛能幹細胞（hiPSC）衍生之吞噬細胞之前，用PBS洗滌組織切片三次。
如先前所述地產生hiPSC衍生之吞噬細胞（van Wilgenburg, Browne等人2013，Haenseler, Sansom等人2017）。簡言之，解離之hiPSC在EB分化培養基[補充有Revitacell、50 ng/ml人類VEGF、50 ng/ml人類BMP-4（Peprotech）及20 ng/ml SCF（R&D Systems）之mTeSR-1]中聚集成造血胚狀體（EB）。將EB維持在T75培養瓶中，該培養瓶含有EB維持培養基[補充有100 U/ml青黴素、100 μg/ml鏈黴素（Thermo-Fisher）、2 mM Glutamax、55 μM 2-巰基乙醇、100 ng/mL重組人類M-CSF及25 ng/mL重組人類IL-3之X-VIVO 15]。自EB培養瓶中收集吞噬細胞懸浮液，且在37℃/5% CO 2下在吞噬細胞培養基[補充有100 U/ml青黴素/100 μg/ml鏈黴素（Thermo-Fisher）、2 mM Glutamax、55 μM 2-巰基乙醇、N-2補充劑（Thermo-Fisher）及100 ng/ml重組人類M-CSF之Advanced DMEM/F12]中以0.4×10 6個細胞/0.5 ml之密度直接在抗體處理之APPPS1-21組織切片上培養72小時。
在與iPSC衍生之吞噬細胞共培養後，將組織切片固定在4%多聚甲醛中，且用0.025%硫黃素S標記原纖維性斑塊。使用載玻片掃描儀獲取螢光影像，且使用HALO影像分析軟體v3.1.1076.423進行分析。對於原纖維性斑塊面積之量測，對來自對照處理之組織切片的螢光影像取臨限值以突出緻密斑塊，且用相同參數對後續組織切片取臨限值。資料報導為緻密斑塊佔據之量測面積（臨限值面積），表示為各切片之總組織面積的百分比。
使用Prism 8.4.3版（Graph Pad Software）進行統計分析。緻密斑塊面積量測係藉由單因素變異數分析（one-way ANOVA）繼之以鄧尼特氏多重比較檢驗（Dunnett's multiple comparisons test）進行分析，將各AC-264713治療組（劑量a、劑量b及劑量c）之平均值與對照組（0 μg /ml）之平均值進行比較。n=6個組織切片/組。如圖3中所示，在劑量a、劑量b或劑量c下與hiPSC衍生之吞噬細胞共培養後，AC-264713使得澱粉樣斑塊之百分比面積統計顯著降低（n=6，經調整p值＜ 0.0001，用於比較濃度a至c與0 μg/ml）。 實例 5 APPPS1-21 小鼠中之活體內 AC-264713 暴露及靶標結合（ PK/TB ）
在APPPS1-21動物中進行了抗體暴露及靶標結合活體內研究，以確定AC-264713投與之後的腦及血清分佈以及活體內斑塊結合潛力。 動物
8.5至12.5月齡的APPPS1-21（B6.Cg-Tg(Thy1-APPSw,Thy1-PSEN1*L166P)21Jckr））（Radde, Bolmont等人2006）用於PK/TB研究。原始種鼠係由Mathias Jucker實驗室根據與Fa Koesler (Germany)之許可協定獲得的。小鼠在Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germany)飼養，且送至AbbVie Deutschland GmbH之飼養室且老化以執行實驗。動物健康及舒適度由獸醫控制。小鼠在有12:12小時之黑暗/光照循環之溫度及濕度受控之房間中，隨意獲取水及食物。 活體內方法
對於此研究，AC-264713以及比較抗體Ab1在劑量1至4之範圍內進行測試，且經由尾靜脈進行靜脈內給藥。將三隻雌性動物用於各劑量。研究時間點為施用後72小時。在研究終止時，在72小時藉由心臟穿刺抽血，且分離血清。隨後將動物用含有1000 U/L肝素之冷PBS灌注10分鐘，且解剖腦，在正中矢狀位切成兩半，且右腦半球準備用於免疫組織化學。分離左側皮層、前腦之其餘部分及小腦，分別在液氮中快速冷凍，且左側皮層用於藉由ELISA對AC-264713進行定量。 組織處理、免疫組織化學及靶標結合分析
用於免疫組織化學之右半球在10%福馬林中滴固定24小時，且接著切換為70%乙醇。使用標準乙醇系列修整組織且將樣品脫水，接著進行二甲苯及石蠟包埋（ASP300, Leica）。基於測試物及劑量隨機化腦半球，且生成含有4個隨機化半球之石蠟塊。使用基於檸檬酸鹽緩衝液之熱誘導抗原修復溶液及基於3,3'-二胺基聯苯胺（DAB）之偵測，在自動染色機上製備及處理4 µm石蠟切片。為了偵測活體內給藥下AC-264713及比較抗體Ab1，以3.7 µg/mL之濃度使用偵測人類IgG（H+L）(Jackson Immuno)之生物素化驢抗人類F(ab`) 2片段。Aβ pE3目標面積係藉由施用0.35 µg/mL之AC-264713或濃度為0.26 µg/mL之比較抗體Ab1進行免疫染色來確定。
用P1000掃描儀收集影像。為了量化各分子與Aβ pE3之結合，藉由在來自相鄰切片之斑塊中分別基於AC-264713或比較抗體Ab1 IR定義Aβ pE3之總目標面積來標準化AC-264713或比較抗體Ab1佔據之面積。為此，使用HALO TM影像分析軟體中之面積量化模組對各腦三個匹配切片進行了分析。對於各切片，均對皮層進行了勾勒。使用該軟體，「臨限值」係由對動物治療不知情之觀測者確定。設定臨限值以便軟體識別hIgG或AC-264713或比較抗體Ab1免疫反應性之陽性棕色DAB染色，且自分析排除背景/非特異性染色。一旦設定適當臨限值，軟體便量測對hIgG或AC-264713或比較抗體Ab1具有陽性免疫反應性之所關注區域（皮層）的百分比。接著將皮層中之hIgG IR區域標準化為AC-264713IR或Ab1 IR，且在GraphPadPrism（版本8，GraphPad Software）中繪製及分析值。資料表示為平均值±SEM，且藉由單因素變異數分析繼之以克魯斯卡爾-沃利斯多重比較檢驗（Kruskal-Wallis multiple comparison test）進行分析。 評估血清及腦中之 AC264713 水平
使用偵測人類IgG1之電化學發光免疫分析來分析血清及腦樣品之AC-264713及比較抗體Ab1。簡言之，用PBS或含有適當濃度之樣品基質的PBS稀釋血清，以在所有樣品中達成1%血清之最終濃度。根據預期分析物水平選擇稀釋因子。以三種稀釋度量測樣品，其中至少兩種稀釋度在可接受的量測範圍內。將稀釋之樣品裝載至預塗有捕捉人類IgG1之生物素化抗體ab99757（0.5 µg/mL）的鏈黴抗生物素蛋白盤上。將盤培育1小時，用TTBS（Tris Tween緩衝鹽水）洗滌，且用磺基標記之EB89抗體（1 µg/mL）偵測人類IgG1。
對於腦樣品之分析，一般分析程序保持不變。實驗前，將腦組織在勻質化緩衝液（50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM NaF、1 mM Na 2VO 4、1 mM EDTA（pH 7.5）、0.25%去氧膽酸鈉、1% NP-40及1×蛋白酶抑制劑錠劑）中以1:5勻質化。對於該分析，稀釋因子進行了適當調整，且CSF樣品為1:40，且腦勻漿為1:4。
AC-264713或Ab1用於構築各別標準曲線及包含與測試樣品相同濃度之生物基質的對照樣品。對於血清樣品之分析，標準曲線係基於覆蓋31至7500 ng/mL濃度範圍之七個標準點。對於CSF及腦，使用十一個標準點生成標準曲線，其覆蓋0.023至1330 ng/mL之濃度範圍。兩種分析物之血清及腦LLOQ均分別為31 ng/mL及0.152 ng/g。 靶標結合之活體內效力的資料分析
使用Prism 9.1.0版（Graph Pad Software）對作為皮層抗體濃度之函數的標準化IR信號進行非線性回歸分析。使用可變斜率模型， 由免疫反應性覆蓋之面積 % [norm.] = 底部 + X*( 頂部 - 底部 )/(X + EC50)，其中頂部固定為100%。
hIgG染色切片之影像分析揭示了皮層中測試物AC-264713及比較抗體Ab1之斑塊的劑量依賴性增加及定位。皮層中Aβ pE3免疫反應性斑塊之分析及hIgG IR對Ab1 IR或AC-264713 IR之標準化亦顯示AC-264713以及比較抗體Ab1之斑塊覆蓋率的劑量依賴性增加（圖4）。
所有量測濃度均在定量限度內。在所有測試劑量下，皮層及血清中之濃度均呈劑量依賴性增加，且AC-264713之平均濃度範圍在皮層中為0.0016至0.29 µg/g，且在血清中為4.5至352 µg/mL。組織與血清比（T/S）在0.03%與0.08%之間。
將觀測到的個別動物腦濃度與藉由IR量化之靶標結合相關聯（圖5），AC-264713與Aβ pE3結合之EC 50為0.031 μg/g（信賴區間：0.016-0.065 μg/g），相比之下，比較抗體Ab1之結合效力較低，EC 50為0.28 μg/g（信賴區間：0.13-1.2 μg/g）。 實例 6 使用 APPPS1-21 小鼠在急性微出血模型中評估 AC-264713
進行了一項活體內研究，以確定AC-264713小鼠前驅體抗體是否在使用APPPS1-21小鼠之急性微出血模型中誘導微出血。 動物
15-17月齡的APPPS1-21小鼠用於微出血研究。小鼠在Charles River Laboratories (Wilmington, USA)飼養，且送至AbbVie Bioresearch Center之飼養室且老化，且轉移至Cambridge Research Center（CRC）飼養室執行實驗。小鼠在有12:12小時之黑暗/光照循環之溫度及濕度受控之房間中，隨意獲取水及食物。CRC飼養室中之動物被分組飼養在單獨通風的籠子中，具有12小時:12小時光-暗循環，且隨意獲取食物及水。在給藥之前使小鼠適應至少72小時。 活體內方法
在有一些修改的先前所述之模型中進行微出血研究（Janssens, Hermans等人2021）。在15月齡時，可在腦血管系統中偵測到Aβ pE3，但在APPPS1-21小鼠中不如一些其他N末端Aβ物種豐富。給予小鼠（n=4，混合性別）單劑量之AC-233661，或經由腹膜內注射。將小鼠IgG用作陰性對照（n=4，混合性別），且將具有在AD患者中引起ARIA之μ IgG2a/k的比較抗體Ab2用作陽性對照（n=5）。陰性及陽性對照均經由腹膜內注射投與。注射後三天，或一旦觀測到嚴重不良反應（以先到者為準），用戊巴比妥鈉對小鼠實施安樂死，灌注PBS，且迅速取出腦。 微出血之組織學分析
接著將右腦半球在10%福馬林中滴固定24小時，且接著切換為含有30%蔗糖之PBS。使用冷凍滑動切片機自各腦半球之頭端到尾端收集厚度為50 μm之連續冠狀切片。
對於紅血球定量，每12個切片安裝在載玻片上，用蘇木精複染。
經由普魯士藍（Prussian Blue）染色對含鐵血黃素沈積物進行染色。每12個切片安裝在載玻片上。接著將切片在PBS中再水化且在含有0.25% Triton-X-100之PBS中透化。在含有飽和NaCl及0.01M NaOH之80%乙醇中培育後，將切片在含有飽和NaCl、0.01M NaOH及0.5%剛果紅（Congo Red）之80%乙醇中培育。接著將載玻片在80%乙醇及生理鹽水中洗滌，然後在含2%亞鐵氰化鉀之0.12 M HCl中培育。在PBS中洗滌後，將載玻片脫水、蓋上蓋玻片且掃描。
使用載玻片掃描儀掃描後，使用HALO TM影像分析軟體中之面積量化模組對腦切片進行分析。使用該軟體，勾勒出整個切片，且「臨限值」係藉由對動物治療不知情之觀測者確定。設定臨限值以便軟體識別紅血球或普魯士藍信號，且自分析排除背景/非特異性染色。一旦設定適當臨限值，軟體便量測含有正信號之所關注區域（整個切片）的百分比。對於各動物，計算間隔為600 µm之一組連續切片的平均值。
比較抗體Ab2在三天內誘導顯著微出血。相比之下，經AC-264713治療之APPPS1-21小鼠的小鼠前驅體抗體在此期間保持健康，且紅血球及含鐵血黃素沈積物與陰性對照mIgG2a/k抗體相當（圖6）。 實例之概述
在直接結合ELISA中，AC-264713以0.7 nM之EC 50結合至人類Aβ pE3-42原纖維。AC-264713不與另一人類焦麩胺酸修飾之Aβ物種Aβ pE11-40交叉反應。AC-264713亦不與來自包含人類、猴、狗、兔、大鼠及小鼠之所有物種的Aβ 1-40交叉反應。另外，胺基酸殘基pyro 3、4及5可能對AC-264713與Ab pE3-42結合至關重要。對未固定腦組織之免疫染色表明AC-264713以劑量依賴性方式結合至含有澱粉樣斑塊之AD腦，EC 50為0.4 μg/mL，而不結合至不存在澱粉樣斑塊之非AD人類、大鼠或食蟹獼猴腦組織。當AC-264713在濃度為a至c之離體吞噬分析中進行測試時，其活化hiPSC衍生之吞噬細胞以移除斑塊。在將AC-264713全身注射至APPPS1-21小鼠體內後三天（單次IV注射後），在腦及血清中偵測到其暴露量呈劑量依賴性增加，且以劑量依賴性方式結合斑塊。在使用APPPS1-21小鼠之急性微出血模型中，AC-264713小鼠前驅體抗體在單次IP注射之後的3天內未引起微出血。總之，試管內及活體內資料說明AC-264713之提議作用模式，亦即具有完整效應功能之抗Aβ pE3單株抗體，其可在周邊投與後結合腦中之澱粉樣斑塊且活化微神經膠質細胞吞噬作用。前述表明AC-264713適用於藉由自AD腦中移除澱粉樣斑塊來治療阿茲海默氏病。 例示性實施例
雖然已說明及描述各種特定實施例，但下文表示一些實施例。應瞭解，可在不偏離本發明概念之精神及範疇之情況下進行各種改變。 1.        一種抗人類Aβ pE3抗體，其包括(i)包含3個CDR之可變重鏈（vH）；及(ii)包含3個CDR之可變輕鏈（vL），其中： vH CDR1為GFSLSTSGMGVS（SEQ ID NO:1）； vH CDR2為HIYWDDDKRYNPYMKR（SEQ ID NO:2）； vH CDR3為RADDYDVGFAY（SEQ ID NO:3）； vL CDR1為LASQTIGTWLA（SEQ ID NO:4）； vL CDR2為AATSLAD（SEQ ID NO:5）；且 vL CDR3為QQLYSSPFT（SEQ ID NO:6）。 2.        如實施例1之抗人類Aβ pE3抗體，其中抗體包括包含闡述為SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈可變區及包含闡述為SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的輕鏈可變區。 3.        如實施例1之抗人類Aβ pE3抗體，其中抗體包括包含闡述為SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的重鏈及包含闡述為SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的輕鏈。 4.        如實施例1之抗人類Aβ pE3抗體，其中抗體包括IgG恆定區。 5.        如實施例4之抗人類Aβ pE3抗體，其中抗體包括人類重鏈恆定區，該人類重鏈恆定區包含Fc部分，其中Fc部分為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同型。 6.        如實施例5之抗人類Aβ pE3抗體，其中抗體包括κ輕鏈恆定區。 7.        一種組合物，其包含如實施例1之抗人類Aβ pE3抗體。 8.        一種治療神經退化性病症之方法，其包含向有需要之患者投與如實施例1之抗人類Aβ pE3抗體。 9.        如實施例8之方法，其中該神經退化性病症為阿茲海默氏病（AD）。 10.      一種多核苷酸，其包含編碼抗人類Aβ pE3抗體之核苷酸序列，其中抗體包括(i)包含三個CDR之vH鏈；及(ii)包含三個CDR之vL鏈，其中： vH CDR1為GFSLSTSGMGVS（SEQ ID NO:1）； vH CDR2為HIYWDDDKRYNPYMKR（SEQ ID NO:2）； vH CDR3為RADDYDVGFAY（SEQ ID NO:3）； vL CDR1為LASQTIGTWLA（SEQ ID NO:4）； vL CDR2為AATSLAD（SEQ ID NO:5）；且 vL CDR3為QQLYSSPFT（SEQ ID NO:6）。 11.      一種載體，其包含如實施例10之多核苷酸。 12.      一種真核宿主細胞，其經如實施例11之載體轉型。 13.      如實施例12之真核宿主細胞，其為哺乳動物宿主細胞。 14.      一種產生抗人類Aβ pE3抗體之方法，其包含：(a)培養如實施例13之真核宿主細胞及(b)回收抗人類Aβ pE3抗體。 15.      一種抗人類Aβ pE3抗體，其中該抗體包括兩條重鏈，各重鏈包括闡述為SEQ ID NO: 37之胺基酸序列，及兩條輕鏈，各輕鏈包括闡述為SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。
熟習此項技術者將易於理解本發明概念非常適合於實施該等目標及獲得提及之目的及優勢，以及其中固有之目的及優勢。本文所述之特定實施例意欲為代表性及例示性的，且並不意欲作為對本發明之範疇的限制。熟習此項技術者將顯而易見涵蓋於如申請專利範圍之範疇所定義的本發明之精神內的其中之變化及其他用途。 參考文獻Aisen, P. S., J. Cummings, R. Doody, L. Kramer, S. Salloway, D. J. Selkoe, J. Sims, R. A. Sperling and B. Vellas (2020)."The Future of Anti-Amyloid Trials." J Prev Alzheimers Dis 7(3): 146-151. Greenberg, S. M., B. J. Bacskai, M. Hernandez-Guillamon, J. Pruzin, R. Sperling and S. J. van Veluw (2020)."Cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer disease - one peptide, two pathways." Nat Rev Neurol 16(1): 30-42. Haenseler, W., S. N. Sansom, J. Buchrieser, S. E. Newey, C. S. Moore, F. J. Nicholls, S. Chintawar, C. Schnell, J. P. Antel, N. D. Allen, M. Z. Cader, R. Wade-Martins, W. S. James and S. A. Cowley (2017)."A Highly Efficient Human Pluripotent Stem Cell Microglia Model Displays a Neuronal-Co-culture-Specific Expression Profile and Inflammatory Response." Stem Cell Reports 8(6): 1727-1742. Janssens, J., B. Hermans, M. Vandermeeren, E. Barale-Thomas, M. Borgers, R. Willems, G. Meulders, C. Wintmolders, D. Van den Bulck, A. Bottelbergs, L. Ver Donck, P. Larsen, D. Moechars, W. Edwards, M. Mercken and B. Van Broeck (2021)."Passive immunotherapy with a novel antibody against 3pE-modified Abeta demonstrates potential for enhanced efficacy and favorable safety in combination with BACE inhibitor treatment in plaque-depositing mice." Neurobiol Dis 154: 105365. Jawhar, S., O. Wirths and T. A. Bayer (2011)."Pyroglutamate amyloid-beta (Abeta): a hatchet man in Alzheimer disease." J Biol Chem 286(45): 38825-38832. Kuo, Y. M., M. R. Emmerling, A. S. Woods, R. J. Cotter and A. E. Roher (1997)."Isolation, chemical characterization, and quantitation of A beta 3-pyroglutamyl peptide from neuritic plaques and vascular amyloid deposits." Biochem Biophys Res Commun 237(1): 188-191. Penninkilampi, R., H. M. Brothers and G. D. Eslick (2017)."Safety and Efficacy of Anti-Amyloid-β Immunotherapy in Alzheimer's Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis." J Neuroimmune Pharmacol 12(1): 194-203. Radde, R., T. Bolmont, S. A. Kaeser, J. Coomaraswamy, D. Lindau, L. Stoltze, M. E. Calhoun, F. Jaggi, H. Wolburg, S. Gengler, C. Haass, B. Ghetti, C. Czech, C. Holscher, P. M. Mathews and M. Jucker (2006)."Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology." EMBO Rep 7(9): 940-946. Selkoe, D. J. and J. Hardy (2016)."The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years." EMBO Mol Med 8(6): 595-608. Sperling, R. A., C. R. Jack, Jr., S. E. Black, M. P. Frosch, S. M. Greenberg, B. T. Hyman, P. Scheltens, M. C. Carrillo, W. Thies, M. M. Bednar, R. S. Black, H. R. Brashear, M. Grundman, E. R. Siemers, H. H. Feldman and R. J. Schindler (2011)."Amyloid-related imaging abnormalities in amyloid-modifying therapeutic trials: recommendations from the Alzheimer's Association Research Roundtable Workgroup." Alzheimers Dement 7(4): 367-385. van Dyck, C. H.(2018)."Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise." Biol Psychiatry 83(4): 311-319. van Dyck, C. H.(2018)."Anti-amyloid-β monoclonal antibodies for Alzheimer's disease: pitfalls and promise." Biol Psychiatry 83(4): 311-319. van Wilgenburg, B., C. Browne, J. Vowles and S. A. Cowley (2013)."Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions." PLoS One 8(8): e71098.
無
圖1顯示AC-264713與人類Aβ pE3-42原纖維之代表性結合。在直接結合ELISA中評估AC-264713與人類Aβ pE3-42原纖維之結合。用人類Aβ pE3-42原纖維塗佈之盤(50 ng/孔)與連續稀釋之AC-264713一起培育。重複ELISA三次且展示代表性圖示。在Y軸上標繪450 nm處之光學密度。AC-264713與人類Aβ pE3-42原纖維結合之EC 50值為0.7 nM。
圖2描繪來自額葉皮層之新鮮冷凍人類AD組織中由AC-264713及比較抗體Ab1結合之斑塊面積。分析了來自6個AD供體之組織，且資料表示為平均值±SEM。AC-264713以濃度依賴性方式結合AD腦組織中之斑塊。線表示對如實例3中所述組合之6個供體之資料的擬合。
圖3顯示AC-264713刺激hiPSC衍生之吞噬細胞自未固定APPPS1-21腦組織中移除澱粉樣蛋白斑塊。hiPSC衍生之吞噬細胞與用不同濃度之AC-264713預培育之APPPS1-21腦組織共培養。使用硫黃素S對組織中剩餘之澱粉樣蛋白斑塊進行染色且進行量化。資料表示為平均值±SEM，且使用單因素變異數分析繼之以鄧尼特氏多重比較檢驗進行分析*，p ＜ 0.05。
圖4描繪了在單次腹膜內投與後72小時，APPPS1-21小鼠中AC-264713之劑量依賴性靶標結合。使用抗hIgG免疫組織化學偵測腦中之AC-264713（圖A）及比較抗體Ab1（圖D）。使用AC-264713（圖B）或比較抗體Ab1（圖E）對相鄰切片上之總目標Aβ pE3進行染色。接著計算由AC-264713（圖C）或比較抗體Ab1（圖F）在增加劑量下佔據之總目標%，且呈現在y軸上。* P＜0.05（克魯斯卡爾-沃利斯繼之以鄧氏多重比較檢驗）。
圖5顯示在雌性小鼠中單次靜脈內給藥後72小時，腦中AC-264713及比較抗體Ab1暴露與APPPS1-21小鼠中之劑量依賴性靶標結合的相關性。將個別動物腦暴露與Aβ pE3佔有率關聯之資料（符號）與非線性擬合（線）一起顯示。
圖6顯示了AC-264713對APPPS1-21小鼠模型中之微出血的影響，該模型使用AC-264713小鼠前驅體抗體及比較抗體Ab2進行了研究。（圖A）紅血球定量之影像。（圖B）普魯士藍定量之影像。資料表示為平均值±SEM。染色影像代表陽性對照組之微出血誘導結果。圖A中之空心箭頭表示紅血球。圖B中之箭頭指示普魯士藍染色信號。
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Claims (15)

  1. 一種抗人類Aβ pE3抗體，其包括：(i)包括3個CDR之可變重鏈（vH）；及(ii)包括3個CDR之可變輕鏈（vL），其中： vH CDR1為GFSLSTSGMGVS（SEQ ID NO:1）； vH CDR2為HIYWDDDKRYNPYMKR（SEQ ID NO:2）； vH CDR3為RADDYDVGFAY（SEQ ID NO:3）； vL CDR1為LASQTIGTWLA（SEQ ID NO:4）； vL CDR2為AATSLAD（SEQ ID NO:5）；且 vL CDR3為QQLYSSPFT（SEQ ID NO:6）。
  2. 如請求項1之抗人類Aβ pE3抗體，其中該抗體包括：包括闡述為SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈可變區及包括闡述為SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  3. 如請求項1之抗人類Aβ pE3抗體，其中該抗體包括兩條重鏈，各重鏈包括闡述為SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，及兩條輕鏈，各輕鏈包括闡述為SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之抗人類Aβ pE3抗體，其中該抗體包括IgG恆定區。
  5. 如請求項4之抗人類Aβ pE3抗體，其中該抗體包括人類重鏈恆定區，該人類重鏈恆定區包括Fc部分，其中該Fc部分為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同型。
  6. 如請求項5之抗人類Aβ pE3抗體，其中該抗體包括κ輕鏈恆定區。
  7. 一種組合物，其包括如請求項1之抗人類Aβ pE3抗體。
  8. 一種治療神經退化性病症之方法，其包括向有需要之患者投與如請求項1之抗人類Aβ pE3抗體。
  9. 如請求項8之方法，其中該神經退化性病症為阿茲海默氏病（AD）。
  10. 一種多核苷酸，其包括編碼抗人類Aβ pE3抗體之核苷酸序列，其中該抗體包括(i)包括三個CDR之vH鏈；及(ii)包括三個CDR之vL鏈，其中： vH CDR1為GFSLSTSGMGVS（SEQ ID NO:1）； vH CDR2為HIYWDDDKRYNPYMKR（SEQ ID NO:2）； vH CDR3為RADDYDVGFAY（SEQ ID NO:3）； vL CDR1為LASQTIGTWLA（SEQ ID NO:4）； vL CDR2為AATSLAD（SEQ ID NO:5）；且 vL CDR3為QQLYSSPFT（SEQ ID NO:6）。
  11. 一種載體，其包括如請求項10之多核苷酸。
  12. 一種真核宿主細胞，其經如請求項11之載體轉型。
  13. 如請求項12之真核宿主細胞，其為哺乳動物宿主細胞。
  14. 一種產生抗人類Aβ pE3抗體之方法，其包括：(a)培養如請求項13之哺乳動物宿主細胞及(b)回收該抗人類Aβ pE3抗體。
  15. 一種抗人類Aβ pE3抗體，其中該抗體包括兩條重鏈，各重鏈包括闡述為SEQ ID NO: 37之胺基酸序列，及兩條輕鏈，各輕鏈包括闡述為SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。
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