RS65417B1 - Diaril makrocikli kao modulatori protein kinaza - Google Patents

Description

Napomene:

Predmet sadrži tehničke informacije dostavljene nakon podnošenja prijave i nisu uključene u ovu specifikaciju

Opis

OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na određeni diaril makrociklični derivat za primenu u lečenju kancera.

STANJE TEHNIKE

[0002] Protein kinaze su ključni regulatori za rast, proliferaciju i preživljavanje ćelija. Genetske i epigenetske promene se akumuliraju u ćelijama kancera što dovodi do abnormalne aktivacije puteva transdukcije signala koji pokreću maligne procese. Manning, G. i sarad., Science 2002, 298, 1912-1934. Farmakološka inhibicija ovih signalnih puteva predstavlja obećavajuće mogućnosti intervencije za ciljane terapije kancera. Sawyers, C., Nature 2004, 432, 294-297.

[0003] MET, zajedno sa RON, pripada jedinstvenoj podfamiliji receptorskih tirozin kinaza, i uglavnom se proizvodi u ćelijama epitelnog ili endotelnog porekla. Park, M. i sarad., Cell 1986, 45, 895-904. Faktor rasta hepatocita (Hepatocyte growth factor - HGF), takođe poznat kao faktor raspršivanja (scatter factor - SF), je jedini poznati prirodni ligand visokog afiniteta za MET, i uglavnom se eksprimira u ćelijama mezenhimskog porekla. Bottaro, D. P. i sarad., Science 1991, 251, 802-804. HGF/MET signalizacija kontroliše MET-zavisnu ćelijsku proliferaciju, preživljavanje i procese migracije koji su kritični za invazivni rast tokom embrionalnog razvoja i postnatalne regeneracije organa, i potpuno su aktivni kod odraslih samo u procesima zarastanja rana i regeneracije tkiva. Trusolino, L. i sarad., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2010, 11, 834-848. Osa HGF/MET je često ushodno regulisana kod mnogih kancera kroz aktiviranje mutacije, gensku amplifikaciju, aberantnu proizvodnju parakrinog ili autokrinog liganda, i snažno je povezana sa tumorogenezom, invazivnim rastom i metastazama. Gherardi, E. i sarad., Nature Rev. Cancer 2012, 12, 89-103. Pored toga, aktivacija HGF/MET signalizacije se pojavljuje kao važan mehanizam u otpornosti na lečenje EGFR i BRAF inhibitorima putem MET amplifikacije i/ili ushodne regulacije stromalnog HGF-a. Engelman, J. A. i sarad., Science 2007, 316, 1039-1043; Wilson, T.R. i sarad., Nature 2012, 487, 505-509. Zbog uloge aberantne HGF/MET signalizacije u humanoj onkogenezi, invaziji/metastazi i rezistenciji, inhibicija HGF/MET signalnog puta ima veliki potencijal u terapiji kancera.

[0004] ALK, zajedno sa leukocitnom tirozin kinazom (LTK), je grupisana unutar superfamilije receptora za insulin (IR) receptorskih tirozin kinaza. ALK je uglavnom eksprimirana u centralnim i perifernim nervnim sistemima što ukazuje na potencijalnu ulogu u normalnom razvoju i funkciji nervnog sistema. Pulford, K. i sarad., Cell Mol. Life Sci. 2004, 61, 2939. ALK je prvi put otkrivena kao fuzioni protein, NPM (nukleofozmin)-ALK, kodirana fuzionim genom koji nastaje od t(2;5)(p23;q35) hromozomske translokacije u ćelijskim linijama anaplastičnog limfoma velikih ćelija (anaplastic large cell lymphoma - ALCL). Morris, S.W. i sarad., Science 1994, 263, 1281. Više od dvadeset različitih partnera za translokaciju ALK otkriveno je kod mnogih kancera, uključujući ALCL (učestalost 60-90%), inflamatorne miofibroblastične tumore (IMT, 50-60%), nesitnoćelijske kancere pluća (NSCLC, 3-7%), kolorektalne kancere (CRC, 0-2.4%), kancere dojke (0-2.4%) i druge kancere. Grande, E. i sarad., Mol. Cancer Ther. 2011, 10, 569-579. ALK-fuzioni proteini se nalaze u citoplazmi, a fuzioni partneri sa ALK igraju ulogu u dimerizaciji ili oligomerizaciji fuzionih proteina kroz interakciju kalem-kalem da bi se stvorila konstitutivna aktivacija funkcije ALK kinaze. Bischof, D. i sarad., Mol. Cell Biol., 1997, 17, 2312-2325. EML4-ALK, koja sadrži delove gena za protein koji je sličan proteinu pridruženom mikrotubulama ehinodermata - 4 (EML4) i gena ALK, prvi put je otkriven u NSCLC, visoko je onkogen i pokazalo se da izaziva adenokarcinom pluća kod transgenih miševa. Soda, M. i sarad., Nature 2007, 448, 561-566. Tačkaste mutacije onkogena ALK-a u familijarnim i sporadičnim slučajevima neuroblastoma. Mossé, Y. P. i sarad., Nature 2008, 455, 930-935. ALK je atraktivna molekularna meta za terapijsku intervenciju kancera zbog važne uloge u hematopoetskim, čvrstim i mezenhimskim tumorima. Grande, supra.

[0005] Receptorske tirozin kinaze koje su u vezi sa tropomiozinom (Trk) su receptori visokog afiniteta za neurotrofine (NT), familiju proteina faktora rasta nerava (NGF). Članovi familije Trk su visoko eksprimirani u ćelijama neuronskog porekla. Aktivacija Trk (TrkA, TrkB, i TrkC) njihovim preferiranim neurotrofinima (NGF do TrkA, neurotrofni faktor koji potiče iz mozga [BDNF] i NT4/5 do TrkB i NT3 do TrkC) posreduje u preživljavanju i diferencijaciji neurona tokom razvoja. NT/Trk signalni put funkcioniše kao endogeni sistem koji štiti neurone nakon biohemijskih povreda, prolazne ishemije ili fizičke povrede. Thiele, C. J. i sarad., Clin. Cancer Res. 2009, 15, 5962-5967. Međutim, Trk je prvobitno kloniran kao onkogen spojen sa genom tropomiozina u ekstracelularnom domenu. Aktivirajuće mutacije uzrokovane hromozomskim preuređivanjem ili mutacijama u NTRK1 (TrkA) identifikovane su kod papilarnog i medularnog kancera tiroidne žlezde, a nedavno i kod nesitnoćelijskog kancera pluća. Pierotti, M. A. i sarad., Cancer Lett.2006, 232, 90-98; Vaishnavi, A. i sarad., Nat. Med.2013, 19, 1469-1472. Pošto Trk igraju važnu ulogu u osećaju bola kao i u rastu tumorskih ćelija i signalnog preživljavanja, inhibitori Trk receptorskih kinaza mogu da obezbede benefite kao tretmani za bol i kancer.

[0006] Receptorska tirozin kinaza AXL pripada familiji proteina TAM i prvobitno je otkrivena kod pacijenata sa hroničnom mijeloidnom leukemijom (CML) kao neidentifikovani transformišući gen. Verma, A. i sarad., Mol. Cancer Ther.2011, 10, 1763-1773. Primarni ligand za TAM receptore je specifičan protein za zaustavljanje rasta 6 (Gas6). AXL je sveprisutno eksprimiran i otkriven je u velikom broju organa i ćelija, uključujući hipokampus i mali mozak, monocite, makrofage, trombocite, endotelne ćelije (EC), srce, skeletne mišiće, jetru, bubrege i testise. Ushodna regulacija Gas6/AXI, je prijavljena kod mnogih humanih kancera uključujući debelo crevo, jednjak, tiroidnu žlezdu, dojke, pluća, jetru i astrocitomglioblastom. Id. Povećana aktivacija AXL je primećena kod modela kancera pluća mutantnih EGFR in vitro i in vivo sa stečenom rezistencijom na erlotinib u odsustvu promene EGFR T790M ili MET aktivacije. Zhang, Z. i sarad., Nat. Genet. 2012, 44, 852-860. Genetska ili farmakološka inhibicija AXL vratila je osetljivost na erlotinib u ovim modelima tumora. Povećana ekspresija AXL i, u nekim slučajevima, njegovog liganda Gas6 pronađena je kod EGFR-mutantnih kancera pluća dobijenih od osoba sa stečenom rezistencijom na inhibitore tirozin kinaze. Id. Stoga je AXL obećavajuća terapijska meta za pacijente sa EGFR-mutantnim kancerom pluća koji je stekao otpornost na EGFR inhibitore.

[0007] Krizotinib (PF-02341066) je lek tirozin kinaze koji cilja na MET/ALK/ROS1/RON sa umerenom aktivnošću protiv TRK i AXL. Cui, J. J. i sarad., J. Med. Chem. 2011, 54, 6342-6363. Odobren je za lečenje određenih pacijenata sa NSCLC (lokalno uznapredovalim ili metastatskim) u kasnoj fazi koji eksprimira abnormalni ALK fuzioni gen identifikovan pratećim dijagnostičkim testom (Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit). Slično imatinibu i drugim lekovima inhibitorima kinaze, rezistencija se uvek razvija nakon određenog vremena lečenja krizotinibom. Mehanizmi rezistencije uključuju amplifikaciju ALK gena, sekundarne ALK mutacije i aberantnu aktivaciju drugih kinaza uključujući KIT i EGFR. Katayama, R. i sarad., Sci. Transl. Med. 2012, 4, 120ra17. Na osnovu kliničkog uspeha druge generacije ABL inhibitora u lečenju rezistencije na imatinib kod pacijenata sa CML, pojavljuje se druga generacija ALK inhibitora. Ovi lekovi imaju za cilj lečenje pacijenta, otpornog na krizotinib ili rezistentnog na NSCLC, sa snažnijom inibicijom i protiv divljih i mutantnih ALK proteina. Gridelli, C. i sarad., Cancer TreatRev. 2014, 40, 300-306.

[0008] Modulacijom višestrukih ciljeva među grupom strukturno povezanih tirozin kinaza MET, ALK, AXL i TRK, ovde opisana jedinjenja adresiraju rezistenciju na krizotinib, rezistenciju na lek inhibitor EGFR i druge primarne indikacije sa abnormalnom ćelijskom signalizacijom usled MET, ALK, AXL i/ili TRK mutacija i amplifikacije gena. Ovde opisana jedinjenja su inhibitori MET, divljih i mutantnih ALK, AXL i TRK i biće od koristi u lečenju pacijenata sa kancerom sa abnormalnom signalizacijom bilo kog ili više MET, ALK, AXL ili TRK.

[0009] Janus familija kinaza (JAK) uključuje JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2 koji predstavljaju citoplastične tirozin kinaze potrebne za fiziološku signalizaciju citokina i faktora rasta. Quintas-Cardama, A. i sarad., Nat. Rev. Drug Discov.2011, 10(2), 127-40; Pesu, M. i sarad., Immunol. Rev. 2008, 223, 132-142; Murray, P.J., J. Immunol.2007, 178(5), 2623-2329. JAK se aktiviraju oligomerizacijom izazvanom ligandom, što rezultira aktivacijom nishodnog signalnog puta transdukcije zvanog STAT (signal transducers and activators of transcription- pretvarači signala i aktivatori transkripcije). Fosforilovani STAT dimerizuju i translociraju se u jedro da bi pokrenuli ekspresiju specifičnih gena uključenih u proliferaciju, apoptozu, diferencijaciju i neophodni su za hematopoezu, upalu i imuni odgovor. Murray, supra.

[0010] Studije na nokaut mišu su implicirale primarne uloge JAK-STAT signalizacije sa određenim preklapanjem među njima. JAK1 igra ključnu ulogu u signalizaciji različitih proinflamatornih citokina kao što su IL-1, IL-4, IL-6 i faktor nekroze tumora alfa (TNFα). Muller, M. i sarad., Nature 1993, 366(6451), 129-135. JAK2 funkcioniše u signalizaciji hematopoetskih faktora rasta kao što su Epo, IL-3, IL-5, GM-CSF, trombopoetinski hormon rasta i signalizaciji posredovanoj prolaktinom. Neubauer, H. i sarad., Cell 1998 93(3), 397-409. JAK3 igra ulogu u posredovanju imunih odgovora, a TYK2 se povezuje sa JAK2 ili JAK3 da bi preveo signalizaciju citokina, kao što je IL-12. Nosaka, T. i sarad., Science 1995, 270(5237), 800-802; Vainchenker, W. i sarad., Semin. Cell. Dev. Biol.

2008, 19(4), 385-393.

[0011] Aberantna regulacija puteva JAK/STAT je umešana u višestruke ljudske patološke bolesti, uključujući kancer (JAK2) i reumatoidni artritis (JAK1, JAK3). Mutacija povećanja funkcije JAK2 (JAK2V617F) je otkrivena sa velikom učestalošću kod pacijenata sa MPN. Levine, R.L. i sarad., Cancer Cell 2005, 7(4), 387-397; Kralovics, R. i sarad., N. Engl. J. Med. 2005, 253(17), 1779-1790; James, C. etal., Nature 2005, 434(7037), 1144-1148; Baxter, E.J. i sarad. Lancet 2005, 365(9464), 1054-1061. Mutacija u JH2 pseudokinaznom domenu JAK2 dovodi do konstitutivne aktivnosti kinaze. Ćelije koje sadrže JAK2V617F mutaciju, stiču sposobnost rasta nezavisnu od citokina i često postaju tumor, pružajući jaku racionalnost za razvoj JAK inhibitora kao ciljne terapije.

[0012] Višestruki JAK inhibitori u kliničkom ispitivanju pokazali su značajnu korist u splenomegaliji i konstitucijskim simptomima u vezi sa bolešću kod pacijenata sa mijelofibrozom, uključujući prvi JAK2 inhibitor ruksolitinib koji je odobrila FDA 2011. Quintas-Cardama, supra; Sonbol, M.B. i sarad., Ther. Adv. Hematol. 2013, 4(1), 15-35; LaFave, L.M. i sarad., Trends Pharmacol. Sci.2012, 33(11), 574-582. Nedavno prikupljeni klinički podaci u vezi sa lečenjem ruksolitinibom pokazali su da JAK inhibitori deluju i na JAK2 divlji tip i JAK2 mutirane slučajeve. Verstovsek, S. i sarad., N. Engl. J. Med. 2012, 366(9), 799-807; Quintas-Cardama, A. i sarad., Blood 2010, 115(15), 3109-3117. Otkrivanje selektivnih inhibitora JAK2 protiv JAK1/3 ostaje nerešen izazov. Pored toga, hiperaktivacija JAK2/signalnih pretvarača i aktivatora transkripcije 3 (JAK2/STAT3) je odgovorna za abnormalnu diferencijaciju dendritskih ćelija što dovodi do abnormalne diferencijacije dendritskih ćelija i akumulacije imunosupresivnih mijeloidnih ćelija kancera (Nefedova, Y. i sarad., Cancer Res 2005; 65(20): 9525-35). Kod Pten-null senescentnih tumora, aktivacija Jak2/Stat3 puta uspostavlja imunosupresivno tumorsko mikrookruženje koje doprinosi rastu tumora i hemorezistenciji (Toso, A. i sarad., Cell Reports 2014, 9, 75-89). Stoga, farmakološka inhibicija JAK2/STAT3 puta može da bude nova važna terapijska strategija za poboljšanje antitumorske aktivnosti putem regulacije antitumorskog imuniteta.

[0013] ROS1 kinaza je receptorska tirozin kinaza sa nepoznatim ligandom. Normalne funkcije ljudske ROS1 kinaze nisu u potpunosti shvaćene. Međutim, prijavljeno je da se ROS1 kinaza podvrgava genetskim preuređenjima kako bi se stvorili konstitutivno aktivni fuzioni proteini u različitim vrstama humanih kancera uključujući glioblastom, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), holangiokarcinom, kancer jajnika, adeno karcinom želuca, kolorektaln kancer, inflamatorni miofibroblastični tumor, angiosarkom i epitelioidni hemangioendoteliom (Davies, K. D. i sarad., Clin Cancer Res 2013, 19 (15): 4040-4045). Ciljanje na ROS1 fuzione proteine sa krizotinibom je pokazalo obećavajuću kliničku efikasnost kod pacijenata sa NSCLC čiji su tumori pozitivni na ROS1 genetske abnormalnosti (Shaw, A. T. i sarad., N Engl J Med.2014, 371(21):1963-1971). Stečene rezistentne mutacije su primećene kod pacijenata na lečenju krizotinibom (Awad, M. M. i sarad., N Engl J Med.2013, 368(25):2396-2401). Hitno je razviti drugu generaciju inhibitora ROS1 za prevazilaženje rezistencije ROS1 na krizotinib.

[0014] Ostaje potreba za inhibitorima malih molekula ovih višestrukih meta proteina ili tirozin kinaze sa poželjnim farmaceutskim osobinama. U kontekstu predmetnog pronalaska nađeno je da određena diaril makrociklična jedinjenja imaju ovaj povoljan profil aktivnosti.

REZIME

[0015] Predmet pronalaska je kao što je navedeno u priloženim patentnim zahtevima.

[0016] Jedan aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na jedinjenje koje ima formulu

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so,

za primenu u lečenju kancera ciljanjem na protein ili tirozin kinazu odabranu iz grupe koja se sastoji od ALK, ROS1, AXL, TRK-a, i JAK-a.

[0017] Poželjna tehnička rešenja su izložena u podzahtevima.

DETALJAN OPIS

[0018] Pre nego što se predmetni pronalazak dalje opisuje, treba razumeti da predmetni pronalazak nije ograničen na određena opisana tehnička rešenja, jer takva, naravno, mogu da variraju. Takođe treba razumeti da je terminologija korišćenja ovde samo u svrhu opisivanja određenih tehničkih rešenja, i nije namera da budu ograničavajuća, pošto će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.

[0019] Osim ako nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni pojmovi imaju isto značenje koje obično razume stručnjak u oblasti kojoj pripada predmetni pronalazak.

[0020] Kako se ovde koristi i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine članova u engleskom jeziku "a," "an," i "the" uključuju množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Dalje se napominje da patentni zahtevi mogu biti sastavljeni tako da isključe bilo koji element po izboru. Kao takva, ova izjava treba da posluži kao prethodna osnova za upotrebu takve ekskluzivne terminologije kao što su "isključivo", "samo" i slično u vezi sa navođenjem elemenata patentnog zahteva, ili primenom "negativnog" ograničenja.

[0021] Kako se ovde koristi, pojmovi "uključujući," "koji sadrži" i "koji obuhvata" se koriste u svom otvorenom, neograničavajućem smislu.

[0022] Da bi se pružio sažetiji opis, neki od kvantitativnih izraza koji su ovde dati nisu kvalifikovani pojmom "oko". Podrazumeva se da, bez obzira da li se pojam "oko" koristi eksplicitno ili ne, svaka količina koja je ovde data ima za cilj da se odnosi na stvarnu datu vrednost, a takođe treba da se odnosi na aproksimaciju takvoj datoj vrednosti koja bi se razumno mogla zaključiti na osnovu uobičajene veštine u oblasti, uključujući ekvivalente i aproksimacije zbog eksperimentalnih i/ili uslova merenja za takvu datu vrednost. Kad god je prinos dat u procentima, takav prinos se odnosi na masu entiteta za koji je prinos dat u odnosu na maksimalnu količinu istog entiteta koja bi se mogla dobiti pod određenim stehiometriskim uslovima. Koncentracije koje su date u procentima odnose se na masene odnose, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0023] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi korišćeni ovde imaju isto značenje koje obično razume stručnjak u oblasti kojoj predmetni pronalazak pripada. Iako se bilo koji postupak i materijali, slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, takođe mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, sada su opisani poželjni postupci i materijali.

[0024] Osim ako je drugačije naznačeno, postupci i tehnike ovih tehničkih rešenja se generalno izvode u skladu sa konvencionalnim postupcima dobro poznatim u oblasti i kako je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane u ovoj specifikaciji. Videti, npr., Loudon, Organic Chemistry, Četvrto izdanje, Njujork: Oxford University Press, 2002, str. 360-361, 1084-1085; Smith i March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, peto izdanje, Wiley-Interscience, 2001.

[0025] Hemijska nomenklatura za jedinjenja koja su ovde opisana generalno je izvedena korišćenjem komercijalno dostupnog ACD/Name 2014 (ACD/Labs) ili ChemBioDraw Ultra 13.0 (Perkin Elmer).

[0026] Smatra se da određene karakteristike predmetnog pronalaska, koje su, radi jasnoće, opisane u kontekstu odvojenih tehničkih rešenja, takođe mogu biti obezbeđene u kombinaciji u jednom tehničkom rešenju. Nasuprot tome, različite karakteristike predmetnog pronalaska, koje su, radi sažetosti, opisane u kontekstu jednog tehničkog rešenja, takođe mogu biti obezbeđene odvojeno ili u bilo kojoj pogodnoj podkombinaciji. Sve kombinacije tehničkih rešenja koje se odnose na hemijske grupe predstavljene promenljivim su posebno obuhvaćene predmetnim pronalaskom i ovde su stavljene na uvid javnosti baš kao da je svaka kombinacija pojedinačno ili eksplicitno stavljena na uvid javnosti, u meri u kojoj takve kombinacije obuhvataju jedinjenja koja su stabilna jedinjenja (tj., jedinjenja koja se mogu izolovati, okarakterisati i testirati na biološku aktivnost). Pored toga, sve podkombinacije hemijskih grupa navedenih u tehničkim rešenjima koje opisuju takve promenljive su takođe posebno obuhvaćene predmetnim pronalaskom i ovde su stavljene na uvid javnosti baš kao da je svaka takva podkombinacija hemijskih grupa ovde pojedinačno i eksplicitno stavljena na uvid javnosti.

[0027] Bilo koja formula koja je ovde prikazana treba da predstavlja jedinjenje te strukturne formule kao i određene varijacije ili forme. Na primer, ovde data formula treba da uključi racemski oblik, ili jedan ili više enantiomernih, dijastereomernih ili geometrijskih izomera, ili njihovu smešu. Pored toga, bilo koja ovde data formula treba takođe da se odnosi na hidrat, solvat ili polimorf takvog jedinjenja, ili njihovu smešu.

[0028] Bilo koja ovde data formula je takođe namenjena da predstavlja neobeležene oblike kao i izotopski obeležene oblike jedinjenja. Izotopski obeležena jedinjenja imaju strukture koje su prikazane ovde datim formulama osim što je jedan ili više atoma zamenjeno atomom koji ima odabranu atomsku masu ili maseni broj. Primeri izotopa koji se mogu ugraditi u jedinjenja predmetnog pronalaska uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, fluora, hlora i joda, kao što su<2>H,<3>H,<11>C,<13>C,<14>C,<15>N,<18>O,<17>O,<31>P,<32>P,<35>S,<18>F,<36>Cl i<125>I, redom. Takva izotopski obeležena jedinjenja su korisna u metaboličkim studijama (poželjno sa<14>C), studijama kinetike reakcije (sa, na primer<2>H ili<3>H), tehnikama detekcije ili snimanja [kao što je pozitronska emisiona tomografija (PET- single-photon emission computed tomography) ili jednofotonska emisiona kompjuterska tomografija (SPECT- single-photon emission computed tomography)] uključujući testove distribucije leka ili supstrata u tkivu, ili u radioaktivnom lečenju pacijenata. Dalje, supstitucija sa težim izotopima kao što je deuterijum (tj.,<2>H) može da pruži određene terapijske prednosti koje su rezultat veće metaboličke stabilnosti, na primer produženog poluživota in vivo ili smanjenih zahteva za dozom. Izotopski obeležena jedinjenja ovog predmetnog pronalaska se generalno mogu pripremiti sprovođenjem postupaka stavljenih na uvid javnosti u shemama ili u primerima i dobijanjima opisanim u nastavku zamenom lako dostupnog izotopski obeleženog reagensa za neizotopski obeleženi reagens.

[0029] Ova specifikacija takođe stavlja na uvid javnosti farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja.

[0030] "Farmaceutski prihvatljiva so" označava so slobodne kiseline ili baze ovde predstavljenog jedinjenja koje je netoksično, biološki tolerantno ili na drugi način biološki pogodno za administriranje subjektu. Videti, generalno, S.M. Berge, i sarad., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19. Poželjne farmaceutski prihvatljive soli su one koje su farmakološki efikasne i pogodne za kontakt sa tkivima subjekata bez nepotrebne toksičnosti, iritacije ili alergijskog odgovora. Ovde opisano jedinjenje može imati dovoljno kiselu grupu, dovoljno baznu grupu, obe vrste funkcionalnih grupa, ili više od jedne od svakog tipa, i shodno tome reaguje sa brojnim neorganskim ili organskim bazama i neorganskim i organskim kiselinama, da bi se formirala farmaceutski prihvatljiva so.

[0031] Primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju sulfate, pirosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, fosfate, monohidrogen-fosfate, dihidrogenfosfate, metafosfate, pirofosfate, hloride, bromide, jodide, acetate, propionate, dekanoate, kaprilate, akrilate, formate, izobutirate, kaproate, heptanoate, propiolate, oksalate, malonate, sukcinate, suberate, sebakate, fumarate, maleate, butin-1,4-dioate, heksin-1,6-dioate, benzoate, hlorobenzoate, metilbenzoate, dinitrobenzoate, hidroksibenzoate, metoksibenzoate, ftalate, sulfonate, metilsulfonate, propilsulfonate, besilate, ksilensulfonate, naftalen-1-sulfonate, naftalen -2-sulfonate, fenilacetate, fenilpropionate, fenilbutirate, citrate, laktate, γ-hidroksibutirate, glikolate, tartarate i mandelate. Lista drugih odgovarajućih farmaceutski prihvatljivih soli nalaze se u Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Izdanje, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985.

[0032] Farmaceutski prihvatljiva so se može dobiti bilo kojim pogodnim postupkom dostupnim u oblasti, na primer, tretmanom slobodne baze neorganskom kiselinom, kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, sulfaminska kiselina, azotna kiselina, borna kiselina, fosforna kiselina, i slično, ili organskom kiselinom, kao što je sirćetna kiselina, fenilsirćetna kiselina, propionska kiselina, stearinska kiselina, mlečna kiselina, askorbinska kiselina, maleinska kiselina, hidroksimaleinska kiselina, izetionska kiselina, ćilibarna kiselina, valerijanska kiselina, fumarna kiselina, malonska kiselina, pirogrožđana kiselina, oksalna kiselina, glikolna kiselina, salicilna kiselina, oleinska kiselina, palmitinska kiselina, laurinska kiselina, piranozidilna kiselina, kao što je glukuronska kiselina ili galakturonska kiselina, alfa-hidroksi kiselina, kao što je bademova kiselina, limunska kiselina ili vinska kiselina, amino kiselina, kao što je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina, aromatična kiselina, kao što je benzojeva kiselina, 2-acetoksibenzojeva kiselina, naftojeva kiselina ili cimetna kiselina, sulfonska kiselina, kao što je laurilsulfonska kiselina, ptoluenesulfonska kiselina, metansulfonska kiselina, ili etansulfonska kiselina ili bilo koja kompatibilna smeša kiselina kao što su one ovde date kao primeri i bilo koje druge kiseline i njihove smeše koje se smatraju ekvivalentima ili prihvatljivim zamenama u svetlu uobičajenog nivoa veštine u ovoj tehnologiji.

[0033] U sledećem je samo primer 93 deo predmetnog pronalaska. Ostali primeri su referentni primeri.

i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE

[0036] Za svrhe lečenja, farmaceutske kompozicije koje sadrže ovde opisano jedinjenje mogu dalje da sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens je supstanca koja je netoksična i inače biološki pogodna za administriranje subjektu. Takvi ekscipijensi olakšavaju administriranje ovde opisanih jedinjenja i kompatibilni su sa aktivnim sastojkom. Primeri farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa uključuju stabilizatore, lubrikante, surfaktante, razblaživače, antioksidanse, vezivna sredstva, boje, sredstva za povećanje zapremine, emulgatore ili sredstva za modifikaciju ukusa. U poželjnim tehničkim rešenjima, farmaceutske kompozicije prema ovoj specifikaciji su sterilne kompozicije. Farmaceutske kompozicije se mogu dobiti korišćenjem tehnika mešanja koje su poznate ili koje postaju dostupne stručnjacima u oblasti.

[0037] Sterilne kompozicije su takođe stavljene na uvid javnosti u ovoj specifikaciji, uključujući kompozicije koje su u skladu sa nacionalnim i lokalnim propisima koji regulišu takve kompozicije.

[0038] Ovde opisane farmaceutske kompozicije i jedinjenja mogu biti formulisani kao rastvori, emulzije, suspenzije ili disperzije u odgovarajućim farmaceutskim rastvaračima ili nosačima, ili kao pilule, tablete, pastile, supozitorije, kesice, dražeje, granule, praškovi, praškovi za rekonstituciju, ili kapsule zajedno sa čvrstim nosačima prema konvencionalnim postupcima poznatim u oblasti za dobijanje različitih doznih oblika. Farmaceutske kompozicije stavljene na uvid javnosti u ovoj specifikaciji mogu se administrirati odgovarajućim putem, kao što su oralni, parenteralni, rektalni, nazalni, topikalni ili okularni putevi, ili inhalacijom. Poželjno su kompozicije formulisane za intravensko ili oralno administriranje.

[0039] Za oralno administriranje, jedinjenje predmetnog pronalaska se može obezbediti u čvrstom obliku, kao što je tableta ili kapsula, ili kao rastvor, emulzija ili suspenzija. Za pripremu oralnih kompozicija, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti formulisana tako da daju dozu od, npr., od oko 0.1 mg do 1 g dnevno, ili oko 1 mg do 50 mg dnevno, ili oko 50 do 250 mg dnevno, ili oko 250 mg do 1 g dnevno. Oralne tablete mogu uključivati aktivni sastojak(sastojke) pomešan sa kompatibilnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima kao što su razblaživači, agensi za dezintegraciju, vezivni agensi, agensi za podmazivanje, zaslađivači, agensi za ukus, agensi za bojenje i konzervansi. Pogodni inertni punioci uključuju natrijum i kalcijum karbonat, natrijum i kalcijum fosfat, laktozu, skrob, šećer, glukozu, metil celulozu, magnezijum stearat, manitol, sorbitol i slično. Primeri tečnih oralnih ekscipijenasa uključuju etanol, glicerol, vodu i slično. Skrob, polivinil-pirolidon (PVP), natrijum skrob glikolat, mikrokristalna celuloza, i alginska kiselina su primeri dezintegracionih agenasa. Vezivni agensi mogu uključivati skrob i želatin. Sredstvo za podmazivanje, ako postoji, može biti magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk. Po želji, tablete mogu biti obložene materijalom kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat da bi se odložila apsorpcija u gastrointestinalnom traktu, ili mogu biti obložene enteričkom prevlakom.

[0040] Kapsule za oralno administriranje uključuju tvrde i meke želatinske kapsule. Za pripremu tvrdih želatinskih kapsula, aktivni sastojak(sastojci) se može pomešati sa čvrstim, polučvrstim ili tečnim razblaživačem. Meke želatinske kapsule se mogu pripremiti mešanjem aktivnog sastojka sa vodom, uljem, kao što je ulje od kikirikija ili maslinovo ulje, tečnim parafinom, smešom mono i di-glicerida kratkolančanih masnih kiselina, polietilen glikolom 400 ili propilen glikolom.

[0041] Tečnosti za oralno administriranje mogu biti u obliku suspenzija, rastvora, emulzija ili sirupa, ili mogu biti liofilizovane ili predstavljene kao suvi proizvod za rekonstituciju sa vodom ili drugim pogodnim nosačem pre upotrebe. Takve tečne kompozicije mogu po izboru da sadrže: farmaceutski prihvatljive ekscipijense kao što su agensi za suspendovanje (na primer, sorbitol, metil celuloza, natrijum alginat, želatin, hidroksietilceluloza, karboksimetilceluloza, aluminijum stearat gel i slično); nevodene nosače, npr., ulje (na primer, bademovo ulje ili frakcionisano kokosovo ulje), propilen glikol, etil alkohol ili vodu; konzervanse (na primer, metil ili propil p-hidroksibenzoat ili sorbinska kiselina); sredstva za vlaženje kao što je lecitin; i, po želji, arome ili boje.

[0042] Za parenteralnu upotrebu, uključujući intravenske, intramuskularne, intraperitonealne, intranazalne ili subkutane puteve, agensi predmetnog pronalaska mogu biti obezbeđeni u sterilnim vodenim rastvorima ili suspenzijama, puferovanim do odgovarajućeg pH i izotoničnosti ili u parenteralno prihvatljivom ulju. Pogodni vodeni nosači uključuju Ringerov rastvor i izotonični natrijum hlorid. Takvi oblici mogu biti predstavljeni u obliku jedinične doze kao što su ampule ili uređeji za injektiranje za jednokratnu upotrebu, u oblicima sa više doza kao što su bočice iz kojih se može povući odgovarajuća doza, ili u čvrstom obliku ili predkoncentratu koji se može koristiti za pripremu injekcione formulacije. Ilustrativne doze infuzije se kreću od oko 1 do 1000 µg/kg/minutu agensa pomešanog sa farmaceutskim nosačem tokom perioda u rasponu od nekoliko minuta do nekoliko dana.

[0043] Za nazalno, inhalirano ili oralno administriranje, inventivne farmaceutske kompozicije se mogu administerirati korišćenjem, na primer, formulacije u spreju koja takođe sadrži odgovarajući nosač. Inventivne kompozicije mogu se formulisati za rektalno administriranje kao supozitorije.

[0044] Za lokalnu aplikaciju, jedinjenja predmetnog pronalaska su poželjno formulisana kao kreme ili masti ili sličan nosač pogodan za lokalno administriranje. Za lokalno administriranje, inventivna jedinjenja se mogu mešati sa farmaceutskim nosačem u koncentraciji od oko 0.1% do oko 10% leka u nosaču. Drugi način administriranja agenasa predmetnog pronalaska može da koristi formulaciju flastera da bi se izvršilo transdermalno oslobađanje.

[0045] Kako se ovde koristi, pojmovi "lečiti" ili "lečenje" obuhvataju i "preventivno" i "kurativno" lečenje. "Preventivno" lečenje ima za cilj da ukaže na odlaganje razvoja bolesti, simptoma bolesti, ili zdravstvenog stanja, suzbijanje simptoma koji se mogu pojaviti, ili smanjenje rizika od razvoja ili ponovne pojave bolesti ili simptoma. "Kurativno" lečenje uključuje smanjenje težine ili suzbijanje pogoršanja postojeće bolesti, simptoma ili stanja. Prema tome, lečenje uključuje ublažavanje ili sprečavanje pogoršanja postojećih simptoma bolesti, sprečavanje pojave dodatnih simptoma, ublažavanje ili sprečavanje osnovnih sistemskih uzroka simptoma, inhibiranje poremećaja ili bolesti, npr., zaustavljanje razvoja poremećaja ili bolesti, ublažavanje poremećaja ili bolesti, uzrokujući regresiju poremećaja ili bolesti, ublažavanje stanja izazvanog bolešću ili poremećajem, ili zaustavjanje simptoma bolesti ili poremećaja.

[0046] Pojam "subjekat" se odnosi na pacijenta sisara kome je potrebno takvo lečenje, kao što je čovek.

[0047] Primeri bolesti uključuju kancer, bol, neurološke bolesti, autoimune bolesti i upale. Kancer uključuje, na primer, kancer pluća, kancer debelog creva, kancer dojke, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, karcinom bubrežnih ćelija, kancere želuca i jednjaka-želuca, glioblastom, kancere glave i vrata, inflamatorne miofibroblastične tumore i anaplastični limfom velikih ćelija. Bol uključuje, na primer, bol iz bilo kog izvora ili etiologije, uključujući bol od kancera, bol od hemoterapijskog lečenja, nervni bol, bol od povrede ili drugih izvora. Autoimune bolesti uključuju, na primer, reumatoidni artritis, Sjogrenov sindrom, Dijabetes Tipa I i lupus. Primeri neurološke bolesti uključuju Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, Amiotrofičnu lateralnu sklerozu i Hantingtonovu bolest. Primeri inflamatornih bolesti uključuju aterosklerozu, alergiju i upalu izazvanu infekcijom ili povredom.

[0048] U jednom aspektu, jedinjenje i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska specifično ciljaju na tirozin kinazni receptor, posebno ALK, AXL, TRK, i JAK. Prema tome, ova jedinjenja i farmaceutske kompozicije mogu da se koriste da spreče, preokrenu, uspore ili inhibiraju aktivnost jedne ili više ovih kinaza. U poželjnim tehničkim rešenjima, postupci lečenja ciljaju na kancer. U drugim tehničkim rešenjima, postupci su za lečenje kancera pluća ili nesitnoćelijskog kancera pluća. Navode postupaka lečenja treba shvatiti kao one koje se odnose na dotičnu supstancu za upotrebu u postupku lečenja.

[0049] U inhibitornim postupcima lečenja predmetnog pronalaska, "efikasna količina" označava količinu dovoljnu da inhibira ciljni protein. Merenje takve ciljne modulacije može se izvesti rutinskim analitičkim metodama kao što su one opisane u nastavku. Takva modulacija je korisna u različitim okruženjima, uključujući in vitro testove. U takvim postupcima, poželjno je da je ćelija kancerogena ćelija sa abnormalnom signalizacijom zbog ushodne regulacije MET, ALK, AXL, TRK, i/ili JAK.

[0050] U postupcima lečenja prema predmetnom pronalasku, "efikasna količina" označava količinu ili dozu dovoljnu da generalno dovede do željene terapijske koristi kod subjekata kojima je takvo lečenje potrebno. Efikasne količine ili doze jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se utvrditi rutinskim metodama, kao što su modelovanje, eskalacija doze ili klinička ispitivanja, uzimajući u obzir rutinske faktore, npr., način ili put administriranja ili isporuke leka, farmakokinetika agensa, ozbiljnost i tok infekcije, zdravstveno stanje subjekta, stanje i težina, i procena lekara koji leči. Primerna doza je u opsegu od oko 0.1 mg do 1 g dnevno, ili oko 1 mg do 50 mg dnevno, ili oko 50 do 250 mg dnevno, ili oko 250 mg do 1 g dnevno. Ukupna doza se može dati u pojedinačnim ili podeljenim doznim jedinicama (npr., BID, TID, QID).

[0051] Kada dođe do poboljšanja bolesti pacijenta, doza se može prilagoditi radi prevencije ili održavanja lečenja. Na primer, doza ili učestalost administriranja, ili oboje, mogu se smanjiti u zavisnosti od simptoma, do nivoa na kome se održava željeni terapijski ili profilaktički efekat. Naravno, ako su simptomi ublaženi do odgovarajućeg nivoa, lečenje može prestati. Pacijentima, međutim, može biti potrebno povremeno lečenje na dugotrajnoj osnovi nakon bilo kakvog ponovnog pojavljivanja simptoma. Pacijentima takođe može biti potrebno hronično lečenje na dugoročnoj osnovi.

KOMBINACIJE LEKOVA

[0052] Ovde opisano inventivno jedinjenje može se koristiti u farmaceutskim kompozicijama ili postupcima u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih sastojaka u lečenju bolesti ili poremećaja opisanih ovde. Daljnji dodatni aktivni sastojci uključuju druge terapeutike ili agense koji ublažavaju štetne efekte terapija za predviđene ciljajuće bolesti. Takve kombinacije mogu poslužiti za povećanje efikasnosti, ublažavanje drugih simptoma bolesti, smanjenje jednog ili više neželjenih efekata, ili smanjenje potrebne doze inventivnog jedinjenja. Dodatni aktivni sastojci se mogu administrirati u odvojenoj farmaceutskoj kompoziciji od jedinjenja predmetnog pronalaska ili mogu biti uključeni sa jedinjenjem predmetnog pronalaska u (pojedinačnu jednu) farmaceutsku kompoziciju. Dodatni aktivni sastojci se mogu administrirati istovremeno sa, pre ili posle administriranja jedinjenja predmetnog pronalaska.

[0053] Kombinovani agensi uključuju dodatne aktivne sastojke koji su poznati ili otkriveni da su efikasni u lečenju ovde opisanih bolesti i poremećaja, uključujući one aktivne protiv druge mete povezane sa bolešću. Na primer, kompozicije i formulacije predmetnog pronalaska, kao i postupci lečenja, mogu dalje da sadrže druge lekove ili farmaceutske proizvode, npr., druge aktivne agense korisne za lečenje ili palijativnu terapiju za ciljne bolesti ili srodne simptome ili stanja. Za indikacije kancera, takvi dodatni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore kinaze, kao što su EGFR inhibitori (npr., erlotinib, gefitinib), Raf inhibitori (npr., vemurafenib), VEGFR inhibitori (npr., sunitinib), standardni agensi za hemoterapiju kao što su agensi za alkilovanje, antimetaboliti, antitumorski antibiotici, inhibitori topoizomeraze, lekovi platine, mitotički inhibitori, antitela, hormonske terapije ili kortikosteroidi. Za indikcije bola, pogodni kombinovani agensi uključuju antiinflamatorne lekove kao što su NSAID. Farmaceutske kompozicije stavljene na uvid javnosti u ovoj specifikaciji mogu dodatno da sadrže jedan ili više takvih aktivnih agenasa, a postupci lečenja mogu dodatno da sadrže administriranje efikasne količine jednog ili više takvih aktivnih agenasa.

HEMIJSKA SINTEZA

[0054] U nastavku se napominje da je samo primer 93 deo predmetnog pronalaska. Svi ostali primeri su samo referentni primeri.

[0055] Primeri hemijskih entiteta korisnih u postupcima stavljenim na uvid javnosti u ovoj specifikaciji će sada biti opisani pozivanjem na ilustrovane sintetičke sheme za njihovo opšte dobijanje u nastavku i na specifične primere koji slede. Stručnjaci će prepoznati da bi se dobila različita jedinjenja ovde, polazni materijali mogu biti na odgovarajući način odabrani tako da se na kraju željeni supstituenti sprovedu kroz reakcionu shemu sa ili bez zaštite kako je prikladno da bi se dobio željeni proizvod. Alternativno, može biti neophodno ili poželjno da se umesto konačnog željenog supstituenta koristi odgovarajuća grupa koja se može sprovesti kroz reakcionu shemu i zameniti po potrebi željenim supstituentom. Štaviše, stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati da se transformacije prikazane na shemama ispod mogu izvesti bilo kojim redosledom koji je kompatibilan sa funkcionalnošću određenih bočnih grupa. Svaka od reakcija prikazanih na opštim shemama poželjno se odvija na temperaturi od oko 0 °C do temperature refluksa korišćenog organskog rastvarača. Osim ako nije drugačije naznačeno, promenljive su kao što je gore definisano u vezi sa Formulom (I). Izotopski obeležena jedinjenja kao što je ovde opisano se dobijaju prema postupcima opisanim u nastavku, koristeći odgovarajuće obeležene početne materijale. Takvi materijali su generalno dostupni od komercijalnih dobavljača radioaktivno obeleženih hemijskih reagenasa.

Opšti postupak A:

[0056]

[0057] Shvatiće se da jedinjenja formule A ili A-1 mogu biti napravljena prema Opštem postupku A korišćenjem odgovarajuće funkcionalizovanih polaznih materijala i međuproizvoda.

[0058] Korak 1. U rastvor odgovarajuće funkcionalizovanog jedinjenja A-1 (~1.00 ekv.), gde su R<A>i R<B>grupe kompatibilne sa ovde opisanim reakcionim uslovima, a Nu je nukleofilna grupa kao što je anjon ili grupa sposobna da formira nukleofil, kao što je halogenid, u reagensu sposobnom da promoviše sastavljanje A-1 i A-2, kao što je kiselina (npr. TfOH (0.6 M)) ili alkil halid (npr.. n-BuLi) može se dodati A-2, gde je R<C>grupa kompatibilna sa reakcionim uslovima opisanim ovde i X<2>je, na primer, odlazeća grupa (~1.00 ekv.) na odgovarajućoj temperaturi (npr.0°C). Smeša se može mešati na odgovarajućoj temperaturi (npr.60°C) dok se reakcija ne završi. Reakcija se zatim može vratiti na temperaturu okoline, a reakciona smeša može biti kvenčovana, neutralisana, isprana, ekstrahovana, osušena i/ili koncentrovana pod vakumom po potrebi da se dobije A-3.

[0059] Korak 2. Smeša A-3, gde su R<A>, R<B>i R<C>grupe kompatibilne sa ovde opisanim reakcionim uslovima (u nekim primerima ovde opisanih tehničkih rešenja, A-3 može biti komercijalno dostupan aldehid ili keton, ili se A-3 može dobiti iz koraka 1, ~1.00 ekv.) i komercijalno dostupan amin A-4, gde je R<C>grupa kompatibilna sa ovde opisanim reakcionim uslovima, (~1.50 ekv.) u odgovarajućem rastvaraču (npr. metanol (0.5 M)) se može mešati na odgovarajućoj temperaturi (npr. temperaturi okoline) u odgovarajućem vremenskom periodu ili dok se formiranje imina ne završi pomoću TLC ili LC-MS. Reakcionom rastvoru se u porcijama može dodati redukciono sredstvo (npr. NaBH4(~2.00 ekv.)). Smeša se može mešati na odgovarajućoj temperaturi (npr. temperaturi okoline) dok TLC ili LC-MS ne pokažu da je redukcija potpuna. Reakcija može biti kvenčovana, isprana, ekstrahovana, osušena i/ili koncentrovana pod vakumom po potrebi da bi se dobio A-5.

[0060] Korak 3. Smeša dobijenog ili komercijalno dostupnog A-5, gde su R<A>, R<B>i R<C>grupe kompatibilne sa ovde opisanim reakcionim uslovima (~1 ekv.), komercijalno dostupan etil 5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilat (A-6, ~1 ekv.) i odgovarajuća baza (npr. diizopropiletilamin (~5 ekv.)) u odgovarajućem rastvaraču (npr. butanol (0.4 M)) se može mešati na odgovarajućoj temperaturi (npr. 110 °C) tokom određenog vremenskog perioda ili dok se ne pokaže da je reakcija završena. Reakcija se može vratiti na temperaturu okoline i razblažiti vodom po potrebi. Smeša se može ekstrahovati, isprati, osušiti, koncentrovati pod sniženim pritiskom i/ili prečistiti hromatografskim metodama po potrebi da bi se dobio A.

[0061] U nekim primerima tehničkih rešenja, Opšti postupak A se može izvesti na sledeći način:

[0062] Korak 1. U rastvor A-1 (1.00 ekv.) u TfOH (0.6 M) može se dodati A-2 (1.00 ekv.) na 0°C. Smeša se može mešati na 60°C tokom 4 sata ili dok se reakcija ne završi. Posle hlađenja na temperaturu okoline, reakciona smeša se može sipati u ledenu vodu (m/m = 1/1), neutrolisati pomoću NaHCO3do pH - 9, i ekstrahovati pomoću EtOAc tri puta po potrebi. Kombinovani organski slojevi mogu biti isprani slanim rastvorom, osušeni po potrebi iznad anhidrovanog Na2SO4i koncentrovani da bi se dobio A-3.

[0063] Korak 2. Smeša A-3 (komercijalno dostupan aldehid ili keton, ili dobijen iz koraka 1, 1.00 ekv.) i komercijalno dostupnog amina A-4 (1.50 ekv.) u metanolu (0.5 M) se može mešati na temperaturi okoline tokom 2 sata ili dok se pomoću TLC ili LC-MS ne pokaže da je formiranje imina završeno. Reakcionom rastvoru se u porcijama može dodati NaBH4(2.00 ekv.). Smeša se može mešati na temperaturi okoline dok se pomoću TLC ili LC-MS ne pokaže da je redukcija potpuna. Reakcija se može kvenčovati vodom i ekstrahovati tri puta dihlorometanom po potrebi. Kombinovana organska faza može biti isprana slanim rastvorom, osušena anhidrovanim Na2SO4, filtrirana i koncentrovana u vakuumu da bi se dobio A-5.

[0064] Korak 3. Pripremljeni ili komercijalno dostupni A-5 (1 ekv.), etil 5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilat (A-6, 1 ekv.) i diizopropiletilamin (5 ekv.) u butanolu (0.4 M) se može zagrevati na 110 °C tokom 30 minuta ili dok se ne pokaže da je reakcija završena. Reakcija se može ohladiti i razblažiti vodom. Smeša se može ekstrahovati dihlorometanom četiri puta (po potrebi) i kombinovani ekstrakti se mogu osušiti iznad anhidrovanog natrijum sulfata. Posle filtracije, smeša se može koncentrovati pod sniženim pritiskom, a ostatak se može prečistiti fleš hromatografijom da bi se dobio A.

Alternativni Opšti postupak A:

[0065]

[0066] Korak kuplovanja 1. Smeša odgovarajuće funkcionalizovanog AA-1 (~1.00 ekv.), odgovarajuće funkcionalizovanog vinil reagensa za kuplovanje (~1.00-1.50 ekv.) i paladijum katalizatora (~0.05 ekv.) može biti zagrevana pod odgovarajućim reakcionim uslovima na odgovarajućoj temperaturi (npr. - 90°C) u odgovarajućem vremenskom periodu pod inertnom atmosferom dok TLC ne pokaže da je početni materijal u potpunosti potrošen. Reakciona smeša se može sipati u H2O po potrebi. Smeša se može ekstrahovati i organska faza isprati, osušiti, koncentrovati i po potrebi prečistiti hromatografijom na koloni silika gela, da se dobije AA-2.

[0067] Korak kuplovanja 2. Smeša jedinjenja tipa AA-2 (~1.00 ekv.), etil 5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilata (A-6, -1.00 ekv.) i paladijum katalizatora pod odgovarajućim reakcionim uslovima može da se zagreje do odgovarajuće temperature (npr. 120°C) tokom odgovarajućeg vremenskog perioda pod inertnom atmosferom dok TLC ne pokaže da je početni materijal potpuno utrošen. Reakciona smeša se može sipati u H2O po potrebi. Smeša se može ekstrahovati i organska faza se može isprati, osušiti, koncentrovati i prečistiti hromatografijom na koloni silika gela po potrebi da se dobije AA-3.

[0068] Korak 3. U smešu AA-3 (~1.00 ekv.) i 4-metilbenzensulfonohidrazida (u molarnom višku) u odgovarajućem rastvaraču može se dodati odgovarajuća baza (u molarnom višku) na odgovarajućoj temperaturi pod inertnom atmosferom. Smeša se može zagrejati do odgovarajuće temperature (npr. 65 °C) i mešati u odgovarajućem vremenskom periodu dok TLC ne pokaže da je reakcija završena. Smeša se može ohladiti i koncentrovati pod sniženim pritiskom po potrebi. Koncentrovana reakciona smeša se može razblažiti vodom po potrebi i ekstrahovati. Kombinovana organska faza može biti isprana, osušena, filtrirana, koncentrovana u vakuumu, i prečišćena da bi se dobio AA-4.

Opšti postupak B:

[0069]

[0070] Korak 1. Rastvor aldehida B-1 (~1.0 ekv) gde su R<A>i R<B>grupe kompatibilne sa ovde opisanim reakcionim uslovima, B-2 (~1.0 ekv) gde je X<1>odlazeća grupa a PG je zaštitna grupa, pogodna baza (u molarnom višku) i katalistin pogodan rastvarač se mogu zagrevati i mešati tokom odgovarajućeg vremenskog perioda dok se reakcija ne završi. Dodatni B-2 se može dodati i po potrebi primeniti dalje zagrevanje. Smeša može da se ohladi na temperaturu okoline i po potrebi razblaži vodom. Smeša se može ekstrahovati, a kombinovani ekstrakti se mogu isprati, osušiti i po potrebi koncentrovati pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod reakcije se može prečistiti fleš hromatografijom da se dobije B-3.

[0071] Korak 2. Aldehid B-3 (~1.0 ekv) i odgovarajuće funkcionalizovani amin (~2.0-4.0 ekv) gde je R<C>grupa kompatibilna sa ovde opisanim reakcionim uslovima u odgovarajućem rastvaraču mogu se zagrejati i mešati u odgovarajućem vremenskom periodu. Smeša se može ohladiti na temperaturu okoline i može se dodati odgovarajući redukujući agens (~1.0 ekv). Smeša se može mešati u odgovarajućem vremenskom periodu a zatim kvenčovati dodavanjem vode po potrebi. Smeša se može ekstrahovati odgovarajućim organskim rastvaračem, a kombinovani ekstrakti se mogu isprati, osušiti i po potrebi koncentrovati pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod reakcije se može po potrebi prečistiti fleš hromatografijom da bi se dobio B-4.

[0072] Korak 3. Jedinjenje B-4 (~1.0 ekv), etil 5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilat (A-6, ~1.0 ekv) i odgovarajuća baza (u molarnom višku) u odgovarajućem rastvaraču mogu se zagrevati u odgovarajućem vremenskom periodu. Reakcija se može ohladiti i razblažiti vodom po potrebi. Smeša se može ekstrahovati pomoću odgovarajućeg organskog rastvarača, a kombinovani ekstrakti se mogu osušiti i po potrebi koncentrovati pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod reakcije se može prečistiti fleš hromatografijom da bi se dobio B1.

[0073] U nekim primerima tehničkih rešenja, Opšti postupak B se može izvesti na sledeći način:

[0074] Korak 1. Rastvor aldehida B-1 (~1.0 ekv) gde su R<A>i R<B>grupe kompatibilne sa reakcionim uslovima opisanim ovde, B-2 (~1.0 ekv) gde je X<1>odlazeća grupa a PG je zaštitna grupa, kalijum karbonat (u molarnom višku) i kalijum jodid (katalitička količina) u DMF-u mogu da se zagreju do 60 °C i mešaju tokom ~15 sati. Dodatni hlorid B-2 se može dodati i može da se primeni, po potrebi, dalje zagrevanje na 80 °C dok se ne pokaže da je reakcija završena. Smeša se može ohladiti do temperature okoline i po potrebi razblažiti dodavanjem vode (250 mL). Smeša se može ekstrahovati etil acetatom (3 × 300 mL) a kombinovani ekstrakti se mogu isprati vodom (200 mL) i slanim rastvorom (100 mL), mogu se osušiti natrijum sulfatom i koncentrovati pod sniženim pritiskom po potrebi. Sirovi proizvod reakcije se može prečistiti fleš hromatografijom da bi se dobio B-3.

[0075] Korak 2. Aldehid B-3 (~1.0 ekv) i metilamin (~2.5 ekv) u metanolu mogu se zagrejati na 60 °C i mešati tokom ~1 sata. Smeša se može ohladiti na temperaturu okoline i može se dodati natrijum borohidrid (~1.0 ekv). Smeša se može mešati tokom ~30 minuta a zatim po potrebi kvenčovati dodavanjem vode (200 mL). Smeša se može ekstrahovati dihlorometanom a kombinovani ekstrakti mogu da se isperu slanim rastvorom (50 mL), osuše natrijum sulfatom i koncentruju pod sniženim pritiskom po potrebi. Sirovi proizvod reakcije se može prečistiti fleš hromatografijom da bi se dobio B-4.

[0076] Korak 3. Amin B-4 (~1.0 ekv), etil 5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilat (A-6, ~1.0 ekv) i Hunigova baza (u molarnom višku) u butanolu mogu da se zagreju na 110 °C tokom ~25 minuta. Reakcija se može ohladiti i razblažiti vodom (250 mL). Smeša se može ekstrahovati dihlorometanom, a kombinovani ekstrakti se mogu po potrebi osušiti natrijum sulfatom. Smeša se po potrebi može koncentrovati pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod reakcije može se prečistiti fleš hromatografijom da bi se dobio B.

Opšti postupak C

[0078] Korak 1. U rastvor C-1 (~1.0 ekv.) gde su R<A>, R<B>, R<C>, R<D>i R<E>grupe kompatibilne sa reakcionim uslovima opisanim ovde, X<1>AlkNHPG (~1.5-2.0 ekv.) gde je X<1>odlazeća grupa, Alk je odgovarajuće funkcionalizovana alkil grupa i PG je zaštitna grupa u odgovarajućem rastvaraču može se dodati odgovarajuća baza (~3.0 ekv.). Smeša može se može zagrevati do odgovarajuće temperature u odgovarajućem vremenskom periodu pod inertnom atmosferom dok se pomoću LC-MS ne pokaže potpuna konverziju početnog materijala u proizvod. Smeša se može ohladiti na temperaturu okoline, razblažiti vodom i po potrebi ekstrahovati odgovarajućim organskim rastvaračem. Kombinovani organski ekstrakti se mogu isprati vodom i slanim rastvorom, osušiti iznad Na2SO4, i po potrebi koncentrovati. Dobijeni ostatak se može po potrebi prečistiti hromatografijom na koloni silika gela da bi se dobio C-2.

[0079] Korak 2. U rastvor C-2 (1 ekv.) gde su R<A>, R<C>, R<D>i R<E>grupe kompatibilne sa ovde opisanim reakcionim uslovima, Alk je odgovarajuće funkcionalizovana alkil grupa a PG je zaštitna grupa u odgovarajućem rastvaraču, može se dodati odgovarajuća baza (u molarnom višku). Rastvor se može zagrevati na odgovarajućoj temperaturi u odgovarajućem vremenskom periodu. Reakcija se može neutralisati odgovarajućom kiselinom do pH<5, a reakciona smeša može biti ekstrahovana pomoću odgovarajućeg organskog rastvarača. Kombinovane organske materije se mogu isprati i osušiti po potrebi. Smeša sirovog proizvoda reakcije može da se filtrira, koncentruje pod sniženim pritiskom i osuši pod visokim vakuumom po potrebi da se dobije C-3.

[0080] Korak 3. U rastvor C-3 (~1.0 ekv.) u odgovarajućem organskom rastvaraču može se dodati odgovarajuća kiselina (~ 4 ekv.) na odgovarajućoj temperaturi (npr. 0 °C). Reakciona smeša se može mešati na odgovarajućoj temperaturi u odgovarajućem vremenskom periodu dok se pomoću LC-MS ne pokaže da je reakcija završena. Sirovi proizvod može da se filtrira, ispere i može da se osuši pod visokim vakuumom da bi se dobio C-4.

[0081] Korak 4a. U rastvor C-4 (~1.0 ekv.) u odgovarajućem rastvaraču može se dodati odgovarajuća baza (u molarnom višku). Rastvor se može ohladiti u kupatilu sa ledenom vodom i može se dodati pogodno sredstvo za kuplovanje (~1.5 ekv.) da bi se dobio aktivirani estar. Rastvor se može polako zagrevati na temperaturu okoline i mešati dok se pomoću LC-MS ne pokaže da se početni materijal pretvara u željeni proizvod. Smeša se može razblažiti vodom i ekstrahovati odgovarajućim organskim rastvaračem po potrebi. Kombinovani organski ekstrakti se po potrebi mogu isprati, osušiti i koncentrovati pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se može prečistiti hromatografijom na koloni silika gela da se dobije C.

[0082] U nekim primerima tehničkih rešenja, Opšti postupak C se može izvesti na sledeći način:

[0083] Korak 1. U rastvor C-1 (~1.0 ekv.), gde su R<A>, R<B>, R<C>, R<D>i R<E>grupe kompatibilne sa reakcionim uslovima opisanim ovde, X<1>AlkNHPG (~1.5-2.0 ekv.) gde je X<1>odlazeća grupa, Alk je odgovarajuće funkcionalizovana alkil group i PG je zaštitna grupa u DMF-u (0.5 M) može se dodati K2CO3(~3.0 ekv.). Smeša može da se zagreva na ~80 °C tokom ~2 sata ili dok se pomoću LC-MS ne pokaže potpuna konverzija početnog materijala u proizvod. Smeša se može ohladiti na temperaturu okoline, razblažiti vodom po potrebi i ekstrahovati tri puta sa EtOAc po potrebi. Kombinovani organski slojevi se zatim mogu isprati vodom i slanim rastvorom, mogu se osušiti iznad Na2SO4, i koncentrovati po potrebi. Dobijeni ostatak se može prečistiti hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem pomoću EtOAc/Heksan (5-100%, 10CV) da bi se dobio C-2.

[0084] Korak 2. U rastvor C-2 (~1 ekv.) u metanolu/THF/H2O (3:1:1, 0.2M) može se dodati LiOH.H2O (~5.0 ekv.). Rastvor može da se zagreva na ~70°C tokom ~2 sata. Reakcija se može neutralisati na ~0°C pomoću vod. HCl (2M) do pH<5, i ekstrahovati četiri puta pomoću CH2Cl2po potrebi. Kombinovani organski ekstrakti se mogu isprati slanim rastvorom, i po potrebi se mogu osušiti iznad Na2SO4. Smeša sirovog proizvoda se može filtrirati, koncentrovati pod sniženim pritiskom, i osušiti pod visokim vakuumom po potrebi da bi se dobio C-3.

[0085] Korak 3. U rastvor C-3 (~1.0 ekv.) u CH2Cl2(0.25M) može se dodati HCl u dioksanu (4 M, ~4 ekv.) na ~0 °C. Reakcija se može mešati i ostaviti da se zagreje od 0 °C do sobne temperature oko 27 sati ili dok se pomoću LC-MS ne pokaže da je reakcija završena. Dobijena reakciona smeša može biti filtrirana, isprana pomoću CH2Cl2i osušena pod visokim vakuumom po potrebi da bi se dobio C-4.

[0086] Korak 4a. Ciklizacija sa HATU. U rastvor C-4 (~1.0 ekv.) u -10 mL DMF-a (~0.005M) može se dodati DIPEA (~5.0 ekv.). Rastvor se može ohladiti u kupatili sa ledenom vodom i može se dodati HATU (~1.5 ekv.). Rastvor se može ostaviti da se zagreje do temperature okoline i mešati sve dok se pomoću LC-MS ne pokaže potpuna konverzija početnog materijala u željeni proizvod. Smeša se može razblažiti vodom i ekstrahovati tri puta sa EtOAc po potrebi. Kombinovani organski ekstrakti mogu biti isprani vodom i slanim rastvorom, osušeni iznad Na2SO4, i koncentrovani pod sniženim pritiskom po potrebi. Dobijeni ostatak se može prečistiti hromatografijom na koloni silika gela (0-5% MeOH/DCM) da bi se dobio C.

[0087] Korak 4b. Ciklizacija sa FDPP. U rastvor DIPEA (~5 ekv.) u DMF/CH2Cl2(3:1, ~0.005M) može se dodati C-4 (~1.00 ekv.). Nakon što se C-4 potpuno rastvori, može se dodati pentafluorofenil difenilfosfinat (FDPP, ~1.05 ekv.). Kuplovanje može da se ostavi da se meša tokom 30 minuta ili dok se pomoću LC-MS ne pokaže da je reakcija završena. Reakcioni rastvor se može razblažiti sa CH2Cl2, isprati tri puta vodom, vodenim rastvorom Na2CO3(2 M) i slanim rastvorom, može se osušiti iznad Na2SO4po potrebi. Posle filtracije i koncentrovanja pod sniženim pritiskom, ostatak se može prečistiti hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa MeOH/CH2Cl2(0-5%) da bi se dobio C.

PRIMERI

[0088] Sledeći primeri su ponuđeni da ilustruju ali ne i da ograniče predmetni pronalazak. Stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati da sledeće sintetičke reakcije i sheme mogu biti modifikovane izborom odgovarajućih početnih materijala i reagenasa da bi se pristupilo drugim jedinjenjima Formule (I) ili (I-A). Biciklične heteroaromatične grupe sa odgovarajućom funkcionalnošću za primenu u sintetičkim postupcima su komercijalno dostupne.

[0089] Skraćenice Ovde opisani primeri koriste materijale, uključujući ali ne ograničavajući se na, one opisane sledećim skraćenicama koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti:

Primer A6

[0090]

[0091] Korak 1. U rastvor 5-fluoro-2-hidroksibenzaldehida (500.00 mg, 3.57 mmol, 1.00 ekv.) u MeOH (20.00 mL) dodat je 1-metilpirolidin-3-amin (357.43 mg, 3.57 mmol, 1.00 ekv.) u jednoj porciji na 16 °C pod N2. Smeša je mešana na 16 °C tokom 10 sati pod N2. Zatim je dodat NaBH4(270.00 mg, 7.14 mmol, 2.00 ekv.) i smeša je mešana na 16 °C tokom 6 sati pod N2. TLC (DCM:MeOH=15:1) je pokazala da je reakcija završena. Reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se uklonio MeOH. Ostatak je razblažen vodom (50 mL) i ekstrahovan pomoću DCM (20 mLx3). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom (50 mL), osušeni iznad Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobio A6-5 (350.00 mg, 1.56 mmol, 43.71% prinos) kao žuta čvrsta supstanca.<1>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 6.94 (dd, J=2.7, 9.3 Hz, 1H), 6.86 (dt, J=3.0, 8.6 Hz, 1H), 6.67 (dd, J=4.7, 8.7 Hz, 1H), 3.71 (s, 2H), 3.24 - 3.09 (m, 1H), 2.58 (dd, J=7.1, 8.8 Hz, 1H), 2.48 - 2.32 (m, 2H), 2.30 - 2.17 (m, 4H), 2.05 - 1.82 (m, 1H), 1.60 - 1.43 (m, 1H).

[0092] Korak 2. U rastvor A6-5 (300.00 mg, 1.34 mmol, 1.00 ekv.) i etil 5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilat (302.34 mg, 1.34 mmol, 1.00 ekv.) u n-BuOH (40.00 mL) dodat je DIPEA (1.04 g, 8.04 mmol, 6.00 ekv.) na 16 °C pod N2. Smeša je mešana na 120 °C tokom 2 sata. TLC (PE:EtOAc =1:1) je pokazala da je reakcija završena. Smeša je sipana u vodu (50 mL) i ekstrahovana pomoću DCM (50 mLX3). Smeša je prečišćena pomoću Pre-PLC da bi se dobila so mravlje kiseline A6 (290.00 mg, 701.43 umol, 52.35% prinos) kao bela čvrsta supstanca.

Primer A8

[0093]

[0094] U rastvor etil 5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilata (1.25 g, 5.54 mmol) i (R)-2-(1-aminoetil)-4-fluorofenol HCl soli (kupljeno od NetChem, Inc.) u EtOH (15.83 mL) dodata je Hunigova baza (3.58 g, 27.70 mmol) i zagrevano je do 70 °C tokom 1.5 sati. Reakcija je uparena do suva, suspendovana u vodi, i ekstrahovana pomoću DCM (5 × 50 mL). Kombinovani ekstrakti su osušeni pomoću Na2SO4i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija (ISCO sistem, silika (40 g), 0-5% metanol u dihlorometanu) dala je A8 (1.89 g, 5.49 mmol, 99% prinos).

Primer A9

[0095]

[0096] Korak 1. U rastvor 4-fluorofenola (2.00 g, 17.84 mmol, 1.00 ekv.) u TfOH (30.00 mL) dodat je propanoil hlorid (1.65 g, 17.84 mmol, 1.00 ekv.) na 0°C. Smeša je mešana na 60°C tokom 4 sata. TLC je pokazala da je reakcija završena. Smeša je ohlađena na 25 °C, sipana u ledenu vodu (m/m = 1/1) (120 mL), neutralisina pomoću NaHCO3da se dobije pH ~ 9, i ekstrahovana pomoću EtOAc (120 mLx3). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom (50 mL), osušeni anhidrovanim Na2SO4, i koncentrovani da bi se dobio A9-3 (1.80 g, 10.70 mmol, 59.98% prinos) kao bezbojno ulje.<1>HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.09 (s, 1H), 7.45 (dd, J=3.0, 9.0 Hz, 1H), 7.26 - 7.20 (m, 1H), 6.97 (dd, J=4.5, 9.0 Hz, 1H), 3.02 (q, J=7.3 Hz, 2H), 1.27 (t, J=7.2 Hz, 3H).

[0097] Korak 2. Gas amonijaka je u mehurićima pušten u MeOH (20 mL) na -78°C tokom 10 minuta. A9-3 (1.00 g, 5.95 mmol, 1.00 ekv.) je dodat u rastvor i mešan na 25°C tokom 1 sata. U rekacionu smešu je dodat Ti(i-PrO)4(1.63 g, 7.14 mmol, 1.20 ekv.) i smeša je mešana još 1sat. Zatim je dodat NaBH4(449.93 mg, 11.89 mmol, 2.00 ekv.). Smeša je mešana na 25°C tokom 12sati. TLC je pokazala da je početni materijal u potpunosti potrošen. Ostatak je sipan u vodu (50 mL) i mešan tokom 30minuta. Smeša je filtrirana i filtrat je podešen pomoću HCl (1 M) na pH ~ 1 i ekstrahovan pomoću EtOAc (50 mLX2). Natrijum bikarbonat je dodat u vodenu fazu da se podesi pH ~ 9 i ekstrahovan pomoću DCM (50 mLx2). Kombinovani organski slojevi su isprani zasićenim rastvorom soli (50 mL), osušeni anhidrovanim Na2SO4, filtrirani i koncentrovani u vakuumu da bi se dobio A9-5 (310.00 mg, 1.83 mmol, 30.79% prinos) kao žuta čvrsta supstanca.<1>HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.86 (dt, J=3.0, 8.4 Hz, 1H), 6.79 - 6.74 (m, 1H), 6.67 (dd, J=2.9, 8.9 Hz, 1H), 3.98 (t, J=7.0 Hz, 1H), 1.92 - 1.81 (m, 1H), 1.80 - 1.68 (m, 1H), 0.95 (t, J=7.4 Hz, 3H).

[0098] Korak 3. A9-5 je kuplovan sa etil 5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilatom u prisustvu DIPEA u n-BuOH da bi se dobio A9 kao što je opisano u Opštem postupku A.

Primer A13-5: Dobijanje 2-(1-amino-2-ciklopropiletil)-4-fluorofenola

[0099]

[0100] Korak 1. U smešu 2-ciklopropilsirćetne kiseline (4.47 g, 44.60 mmol, 1.00 ekv.) u DCM (150.00 mL) je dodat CDI (7.96 g, 49.10 mmol, 1.10 ekv.) u jednoj porciji na 25°C pod N2. Smeša je mešana na 25°C tokom 1 sata. Zatim je dodat N-metoksimetanamin hidrohlorid (4.79 g, 49.06 mmol, 1.10 ekv.). Smeša je mešana na 25°C još 12 sati. Reakcija je kvenčovana 1N vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (50 mL) i razdvojena u slojeve. Vodeni sloj je ekstrahovan pomoću DCM (30 mLx2). Kombinovani organski sloj je ispran zasićenim 50% vodenim rastvorom natrijum karbonata (50 mL) i zasićenim rastvorom soli (30 mL), osušen anhidrovanim Na2SO4, filtriran i koncentrovan u vakuumu da bi se dobio 2-ciklopropil-N-metoksi-N-metilacetamid (6.00 g, 41.91 mmol, 93.96% prinos) kao ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.65 (s, 1H), 3.18 (s, 1H), 2.33 (d, J=6.8 Hz, 2H), 1.13 - 1.02 (m, 1H), 0.57 - 0.49 (m, 2H), 0.19 - 0.11 (m, 2H).

[0101] Korak 2. U smešu 2-ciklopropil-N-metoksi-N-metilacetamida (6.00 g, 29.27 mmol, 1.00 ekv.) u THF (100.00 mL) dodat je n-BuLi (2.5 M, 12.88 mL, 1.10 ekv.) u kapima na -78°C pod N2. Smeša je mešana na -78°C tokom 10 min. Zatim je smeša tretirana 2-bromo-4-fluoro-1-metoksibenzenom (4.19 g, 29.27 mmol, 1.00 ekv.) u THF (20 mL) tokom perioda od 20 min.

Posle mešanja na -78°C tokom 1 sata, smeša je ostavljena da se zagreje na 25°C i mešana je još jedan sat. TLC je pokazala da je reakcija završena. Smeša je sipana u 10% vodeni rastvor HCl (100 mL) i mešana tokom 10 min. Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom (300 mLx3). Kombinovana organska faza je isprana slanim rastvorom (200 mL), osušena iznad anhidrovanog Na2SO4, filtrirana i koncentrovana u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (Petrol etar/Etil acetat=50/1, 10/1) da bi se dobio 2-ciklopropil-1-(5-fluoro-2-metoksifenil)etan-1-on (2.4 g, 39.38% prinos) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.42 (dd, J=3.3, 8.8 Hz, 1H), 7.15 (ddd, J=3.3, 7.5, 9.0 Hz, 1H), 6.91 (dd, J=4.0, 9.0 Hz, 1H), 3.91 - 3.85 (m, 3H), 2.89 (d, J=6.8 Hz, 2H), 1.18 - 1.05 (m, 1H), 0.61 - 0.50 (m, 2H), 0.20 - 0.09 (m, 2H).

[0102] Korak 3. U rastvor 2-ciklopropil-1-(5-fluoro-2-metoksifenil)etan-1-ona (500.00 mg, 2.40 mmol, 1.00 ekv.) u DCM (10.00 mL) dodat je BCl3(1 M, 3.00 mL, 1.25 ekv.) u kapima na -78°C pod N2. Smeša je mešana na -78 °C tokom 2 sata. TLC je pokazala da je reakcija završena. Smeša je zagrejana na 25°C i sipana u ledenu vodu (m/m = 1/1) (10 mL) i mešana tokom 10 min. Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom (30 mLx3). Kombinovana organska faza je isprana zasićenim rastvorom soli (30 mL), osušena iznad anhidrovanog Na2SO4, filtrirana i koncentrovana u vakuumu da bi se dobio 2-ciklopropil-1-(5-fluoro-2-hidroksifenil)etan-1-on (430.00 mg, 2.21 mmol, 92.3% prinos) kao ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.12 (s, 1H), 7.40 (dd, J=3.0, 8.8 Hz, 1H), 7.24 (ddd, J=3.0, 7.8, 9.0 Hz, 1H), 6.98 (dd, J=4.5, 9.3 Hz, 1H), 2.88 (d, J=6.8 Hz, 2H), 1.23 - 1.11 (m, 1H), 0.70 - 0.63 (m, 2H), 0.25 (q, J=5.0 Hz, 2H).

[0103] Korak 4. U rastvor 2-ciklopropil-1-(5-fluoro-2-hidroksifenil)etan-1-ona (400.00 mg, 1.92 mmol, 1.00 ekv.) u MeOH (20.00 mL) je dodat NH2OH.HCl (160.18 mg, 2.31 mmol, 1.20 ekv.) i AcONa (189.09 mg, 2.31 mmol, 1.20 ekv.) na 25°C pod N2tokom 12 sata. TLC (Petrol etar/Etil acetat=3:1) je pokazala da je početni materijal u potpunosti potrošen. Reakcija je kvenčovana vodom i zatim ekstrahovana pomoću DCM (30 mLx3). Kombinovana organska faza je isprana slanim rastvorom (30 mL), osušena iznad anhidrovanog Na2SO4, filtrirana i koncentrovana u vakuumu da bi se dobio čisti proizvod 2-ciklopropil-1-(5-fluoro-2-hidroksifenil)etan-1-on oksim (400.00 mg, 1.79 mmol, 93.32% prinos) kao bela čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je korišćena za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.

[0104] Korak 5. U rastvor 2-ciklopropil-1-(5-fluoro-2-hidroksifenil)etan-1-on oksima (260.00 mg, 1.16 mmol, 1.00 ekv.) u MeOH/HCl (10.00 mL, 4N) dodat je Pd-C (10%, 100 mg) pod N2. Suspenzija je degazirana pod vakuumom i pročišćena pomoću H2nekoliko puta. Smeša je mešana pod H2(50 psi) na 50°C tokom 12 sata. LC-MS su pokazali da je početni materijal u potpunosti potrošen. Reakciona smeša je filtrirana i filtrat je koncentrovan da bi se dobio 2-(1-amino-2-ciklopropiletil)-4-fluorofenol (200.00 mg, 955.75 umol, 82.39% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.44 - 9.82 (m, 1H), 8.52 (br. s., 2H), 7.36 (dd, J=2.8, 9.5 Hz, 1H), 7.07-6.93 (m, 2H), 4.49 (d, J=5.5 Hz, 1H), 1.82-1.72 (m, 2H), 0.67 -0.55 (m, 1H), 0.43 - 0.28 (m, 2H), 0.12-0.06 (m, 1H), (-0.03)-(-0.09) (m, 1H).

Primer A14-5: Dobijanje 2-(amino(fenil)metil)-4-fluorofenola

[0105]

[0106] Korak 1. U rastvor A14-3 (2.00 g, 9.25 mmol, 1.00 ekv.) i AcOK (1.10 g, 11.20 mmol, 1.20 ekv.) u etanolu (30.00 mL) dodat je NH2OH.HCl (642.80 mg, 9.25 mmol, 1.00 ekv.) u jednoj porciji na 25°C pod N2. Smeša je mešana na 25 °C tokom 30 minuta, zatim zagrevana do 90 °C i mešana tokom 5 sati. TLC je pokazala da je reakcija završena. Smeša je koncentrovana i i dodata je voda (50 mL). Smeša je ekstrahovana etil acetatom (50 mLx3). Kombinovana organska faza je isprana slanim rastvorom (50 mL), osušena iznad anhidrovanog Na2SO4, filtrirana i koncentrovana da bi se dobio (5-fluoro-2-hidroksifenil)(fenil)metanon oksim (1.50 g, 6.49 mmol, 70.13% prinos) kao žuta čvrsta supstanca.<1>HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.50 - 7.37 (m, 5H), 7.19 - 7.07 (m, 2H), 6.71 (dd, J=2.9, 8.9 Hz, 1H).

[0107] Korak 2. U smešu (5-fluoro-2-hidroksifenil)(fenil)metanon oksima (900.00 mg, 4.18 mmol, 1.00 ekv) i Zn praha (1.09 g, 16.73 mmol, 4 ekv.) u THF (10.00 mL) je dodat NH4Cl (2.24 g, 41.82 mmol, 10.00 ekv.) u jednoj porciji na 25°C pod N2. Smeša je mešana na 25 °C tokom 30 minuta, zatim zagrevana na 60 °C i mešana tokom 15 sati. Smeša je koncentrovana i dodata je voda (100 mL), a zatim je ekstrahovana etil acetatom (50 mLx3). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom, osušeni iznad anhidrovanog Na2SO4, filtrirani i koncentrovani da bi se dobio A14-5 (630.00 mg, 2.90 mmol, 69.38% prinos) kao žuta čvrsta supstanca.<1>HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.42 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.33 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.27 -7.20 (m, 1H), 6.93 - 6.80 (m, 2H), 6.70 (dd, J=4.9, 8.7 Hz, 1H), 5.28 (s, 1H).

Primer A17

[0108]

[0109] Korak 1. U rastvor etil 5-((2-bromo-5-fluorobenzil)(metil)amino)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilata (dobijen prema Opštem postupku A) (300.00 mg, 0.736 mmol, 1.00 ekv.), 2-metilpropan-2-tiola (166.10 mg, 1.84 mmol, 2.50 ekv.), Pd2(dba)3(84.72 mg, 0.147 mmol, 0.20 ekv.) u dioksanu (8.00 mL) dodati su XantPhos (ksantfos - 127.87 mg, 0.221 mmol, 0.30 ekv.) i K2CO3(101.81 mg, 0.736 mmol, 1.00 ekv.). Smeša je degasirana i zagrevana na 120°C tokom 24 sata pod N2. TLC (Petrol etar/Etil acetat=1:1) je pokazala da je početni materijal u potpunosti potrošen. Reakciona smeša je sipana u H2O (20 mL) i ekstrahovana etil acetatom (50 mLx3). Organska faza je isprana slanim rastvorom (30 mL), osušena iznad anhidrovanog Na2SO4, koncentrovana i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (Petrol etar/Etil acetat=2:1 do 1:1) da bi se dobio etil 5-((2-(terc-butiltio)-5-fluorobenzil)(metil)amino)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilat (200.00 mg, 0.48 mmol, 65.18% prinos,) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.34 (s, 1H), 8.29 (br. s., 1H), 7.60 (dd, J=5.9, 8.4 Hz, 1H), 7.00 (t, J=7.7 Hz, 1H), 6.29 (br. s., 2H), 5.00 (br. s., 2H), 4.37 (d, J=6.8 Hz, 2H), 3.41 (br. s., 3H), 1.36-1.20 (m, 12H).

[0110] Korak 2. U rastvor etil 5-((2-(terc-butiltio)-5-fluorobenzil)(metil)amino)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilata (300.00 mg, 0.720 mmol, 1.00 ekv.) u DCM-u (8.00 mL) dodat je kap po kap BBr3(902.21 mg, 3.60 mmol, 5.00 ekv.) na 0°C pod N2. Smeša je mešana na 0°C tokom 2.5 sata. TLC (Petrol etar: Etil acetat=1:1) je pokazala da je reakcija završena. Smeša je sipana u vodu (20 mL). Vodena faza je ekstrahovana dihlorometanom (50 mLx3). Kombinovana organska faza je isprana slanim rastvorom (30mL), osušena pomoću anhidrovanog Na2SO4, filtrirana i koncentrovana u vakuumu. Ostatak je prečišćen primenom preparativne HPLC (Kolona: Phenomenex Synergi C18 150*30mm*4um i Uslov: 0.05% HCl-ACN) i liofilizovan da bi se dobila A17 HCl so (38.00 mg, 0.098 mmol, 13.61% prinos) kao bela čvrsta supstanca.

Primer A18

[0111]

[0112] Korak 1. Smeša 2-bromo-4-fluorofenola (10.00 g, 52.36 mmol, 1.00 ekv.), trifluoro(vinil)-boran kalijumove soli (9.84 g, 66.50 mmol, 1.27 ekv.), Cs2CO3(51.18 g, 157.08 mmol, 3.00 ekv.) i Pd(PPh3)2Cl2(1.84 g, 2.62 mmol, 0.05 ekv.) u THF-u (90.00 mL) i H2O (10.00 mL) je degasirana i zatim zagrevana na 90°C tokom 12 sati pod N2. TLC (Petrol etar/Etil acetat=10/1) je pokazala da je početni materijal u potpunosti potrošen. Reakciona smeša je sipana u H2O (100 mL). Smeša je ekstrahovana etil acetatom (300 mLx3). Organska faza je isprana zasićenim rastvorom soli (200 mL), osušena iznad anhidrovanog Na2SO4, koncentrovana i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (eluirano sa EtOAc/Petrol etar=1/30) da bi se dobio 4-fluoro-2-vinilfenol (3.50 g, 25.34 mmol, 48.39% prinos) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.12 (dd, J=3.0, 9.5 Hz, 1H), 6.89 - 6.81 (m, 1H), 6.79 - 6.73 (m, 1H), 5.75 (d, J=17.6 Hz, 1H), 5.64 (s, 1H), 5.39 (d, J=11.3 Hz, 1H).

[0113] Korak 2. Smeša 4-fluoro-2-vinilfenola (1.95 g, 14.12 mmol, 1.00 ekv.), TBSCl (6.38 g, 42.35 mmol, 3.00 ekv.) i 1H-imidazola (5.77 g, 84.70 mmol, 6.00 ekv.) u DCM-u (20.00 mL) je mešana na 20°C tokom 5 sati pod N2. TLC (Petrol etar/Etil acetat=10:1) je pokazala da je početni materijal u potpunosti potrošen. Reakciona smeša je sipana u H2O (30 mL). Smeša je ekstrahovana dihlorometanom (50 mLx3). Organska faza je isprana slanim rastvorom (50 mL), osušena iznad anhidrovanog Na2SO4, koncentrovana i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela, eluiranjem petrol etrom da bi se dobio tri-butil(4-fluoro-2-vinilbenzil)silan (2.30 g, 9.11 mmol, 64.54% prinos) kao bezbojno ulje.

[0114] Korak 3. Smeša tri-butil(4-fluoro-2-vinilbenzil)silana (2.30 g, 9.11 mmol, 1.00 ekv.), etil 5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilata (2.06 g, 9.11 mmol, 1.00 ekv.), Pd(PhCN)2Cl2(118.20 mg, 0.455.63 mmol, 0.05 ekv.) i tris-o-tolilfosfana (277.36 mg, 0.911 mmol, 0.10 ekv.), DIPEA (7.07 g, 54.68 mmol, 6.00 ekv.) u DMF-u (25.00 mL) je degasirana i zatim zagrevana na 120°C tokom 24 sata pod N2. TLC (Petrol etar/Etil acetat=1:1) je pokazala da je početni materijal u potpunosti potrošen. Reakciona smeša je sipana u H2O (30 mL). Smeša je ekstrahovana etil acetatom (100 mLx3). Organska faza je isprana zasićenim rastvorom soli (30 mL), osušena iznad anhidrovanog Na2SO4, koncentrovana i prečišćena hromatografijom na koloni silika gela (EtOAc: petrol etar=1:3) da bi se dobio etil (E)-5-(5-fluoro-2-hidroksistiril)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilat (1.00 g, 2.26 mmol, 24.86% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.29 (br. s., 1H), 8.50 (d, J=7.0 Hz, 1H), 8.28 (br. s., 1H), 7.84 (d, J=16.6 Hz, 1H), 7.20 - 7.04 (m, 3H), 6.69 (d, J=5.8 Hz, 2H), 4.20 (q, J=6.9 Hz, 2H), 1.30 - 1.19 (m, 3H).

[0115] Korak 4. U smešu etil (E)-5-(5-fluoro-2-hidroksistiril)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilata (378.22 mg, 1.04 mmol, 1.00 ekv.) i 4-metilbenzensulfonohidrazida (3.29 g, 17.68 mmol, 17.00 ekv.) u THF (4.00 mL) je dodat NaOAc (1.71 g, 20.80 mmol, 20.00 ekv.) u jednoj porciji na 20 °C pod N2. Smeša je zatim zagrejana do 65 °C i mešana tokom 12 sati. TLC je pokazala da je reakcija završena. Smeša je ohlađena na 20 °C i koncentrovana pod sniženim pritiskom na 45°C. Ostatku je dodata voda (100 mL). Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom (300 mLx2). Kombinovana organska faza je isprana zasićenim rastvorom soli (50 mL), osušena anhidrovanim Na2SO4, filtrirana, koncentrovana u vakuumu i prečišćena primenom preparativne HPLC (Kolona: Phenomenex Synergi Max-RP 250*50 mm*10 um, 0.225%FA-ACN) da bi se dobio A18 (120.00 mg, 0.347 mmol, 33.42% prinos) kao bela čvrsta supstanca.

Primer A20

[0116]

[0117] U smešu 4-fluoro-2-metilaminometil-fenola (305.2 mg, 1.97 mmol) i etil estra 6-hloroimidazo[1,2-b]piridazin-3-karboksilne kiseline (230 mg, 1.02 mmol) u DMSO (5 mL) je dodat KF (180 mg, 3.01 mmol). Reakciona smeša je mešana na 120°C tokom 18 sati pod azotom. Rastvor je zatim ohlađen do temperature okoline, razblažen vodom (20 mL) i ekstrahovan pomoću EtOAc (3 × 50 mL). Kombinovani organski slojevi su dalje isprani vodom (3 × 50 mL) i slanim rastvorom (50 mL), osušeni iznad Na2SO4i koncentrovani. Ostatak je zatim prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/heksanom (0-50%, 10 CV) da bi se dobio željeni proizvod kao bela čvrsta supstanca (240 mg, 69%).

Primer A22

[0118]

[0119] A21-1 je dobijen prema Opštem postupku A. U rastvor A22-1 (150 mg, 0.387 mmol) u etanolu (2 mL) je dodat 4M HCl u dioksanu (2 mL) i reakcioni rastvor je zagrejan na 75°C tokom 2 sata. Rastvarači su upareni a ostatak je neutralisan pomoću Et3N i prečišćen na kertridžu od silika gela eluiranjem sa metanol/CH2Cl2(0-12.5%) da bi se dobio A22 (144 mg, 100%).

Primer A23

[0120]

[0121] Korak 1. U smešu (5-fluoro-2-metoksifenil)metantiola (496.1 mg, 2.88 mmol) i etil estra 6-hloro-imidazo[1,2-b]piridazin-3-karboksilne kiseline (650.0 mg, 2.88 mmol) u etanolu (14.4 mL) je dodat DIPEA (1.12 g, 8.64 mmol). Reakciona smeša je mešana na 80 °C tokom 1 sata. Rastvor je ohlađen do temperature okoline, razblažen vodom (50 mL) i ekstrahovan pomoću DCM (3 × 50 mL). Kombinovani ekstrakti su osušeni iznad Na2SO4i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (ISCO sistem, silika (120 g) eluiranjem sa EtOAc/heksanom (0-50%) da bi se dobio A23-2 (560 mg, 54% prinos). A23-2 je izbačen sa kolone tokom prečišćavanja.

[0122] Korak 2. U rastvor A23-2 ( 498.7 mg, 1.38 mmol) u metanolu (100 mL) je dodat 4M HCl u dioksanu (10 mL) i reakcioni rastvor je zagrevan na 75°C tokom 2 sata. Rastvarači su upareni i ostatak je neutralisan pomoću Et3N i prečišćen na kertridžu od silika gela eluiranjem sa metanol/CH2Cl2(0-12.5%) da bi se dobio A23 (470 mg, 98%).

[0123] A1-A24 su dobijeni prema Opštem postupku A i ovde opisanim metodama.

Primer B7

[0124]

[0125] Korak 1. U smešu 1-(5-fluoro-2-hidroksi-fenil)-etanona (773 mg, 5.0 mmol) i terc-butil estra (2-hloro-etil)-karbaminske kiseline (1.80 g, 10.0 mmol) u DMF-u (20 mL) su dodati KI (2.0 mg, 0.012 mmol) i Cs2CO3(3.26 g, 10.0 mmol). Smeša je mešana na 80 °C preko noći. Smeša je zatim ohlađena do sobne temperature, razblažena sa EtOAc i isprana pomoću 1N NaOH (5 x 10 mL) sve dok se nije, pomoću LCMS, pokazao pik 1-(5-fluoro-2-hidroksi-fenil)-etanona. Organski sloj je osušen iznad Na2SO4i koncentrovan. Ostatak je zatim prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/heksanom (0-30%, 10 CV) da bi se dobio željeni proizvod B7-2 kao žućkasta čvrsta supstanca (1.1 g, 73.8%): LC-MS (ESI) m/z 320.3 (M+Na)<+>.

[0126] Korak 2. U rastvor B7-2 (1.0 g, 3.36 mmol) u MeOH (10 mL) u porcijama je dodat NaBH4(640 mg, 16.8 mmol). Smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 2 h sve dok prema LCMS nije ostalo početnog materijala. Rastvor je zatim razblažen vodom (50 mL) i ekstrahovan pomoću DCM (3 x 20 mL). Kombinovani DCM slojevi su sušeni iznad Na2SO4i koncentrovani. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/heksan (0-50%, 10 CV) da bi se dobio željeni proizvod B7-3 kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.75g, 75%). LC-MS (ESI) m/z 322.3 (M+Na)<+>;<1>H NMR (500 MHz, Hloroform-d) δ 7.11 (dd, J = 9.2, 3.4 Hz, 1H), 6.89 (ddd, J= 9.0, 7.9, 3.2 Hz, 1H), 6.77 (dd, J= 8.9, 4.4 Hz, 1H), 5.09 (q, J= 6.6 Hz, 1H), 4.92 (d, J= 4.4 Hz, 1H), 4.03 (t, J= 5.2 Hz, 2H), 3.62 - 3.50 (m, 2H), 1.49 (d, J= 6.4 Hz, 3H), 1.45 (s, 9H).

[0127] Korak 3: U rastvor B7-3 (600 mg, 2.0 mmol) i terc-butil estra f 2-[4-fluoro-2-(1-hidroksi-etil)-fenoksi]-etil}-karbaminske kiseline (450 mg, 2.0 mmol) u suvom THF (40.0 mL) na -78 °C dodat je NaH (60%, 80 mg, 2.0 mmol) u porcijama. Suspenzija je mešana na -78 °C tokom 4 h i ostavljena da se zagreje na0 °C i mešana još 4 h. Smeša je zatim stavljena u zamrzivač na -20 °C preko noći. Pomoću LC-MS je pokazana dobra konverziju u željeni proizvod. Smeša je zatim kvenčovana smešom leda i 1N HCl i ekstrahovana pomoću EtOAc (3 x 20 mL). Organski sloj je osušen iznad Na2SO4, koncentrovan i prečišćen dva puta da bi se dobio željeni proizvod B7 kao žuta čvrsta supstanca (240 mg, 25%):

[0128] B1-B7 su dobijeni prema Opštem postupku B i ovde opisanim postupcima.

Primeri 2 i 2-1.

[0129]

Sinteza A:

[0130] Primer 2 se može dobiti kao što je prikazano na sledećoj shemi, počevši od racemskih ili enantiomerno obogaćenih početnih materijala:

[0131] Korak 1. U smešu jedinjenja 2A (1 ekviv.) i 2B (1.2 ekviv.) u anhidrovanom DMF (0.2 M) dodat je Cs2CO3(1.5 ekviv.) i reakcija je zagrevana u uljanom kupatilu na 80 °C pod azotom preko noći. Smeša je ohlađena, sipana u vodu i ekstrahovana pomoću EtOAc tri puta. Kombinovani organski slojevi su isprani vodom pet puta, isprani slanim rastvorom i osušeni iznad Na2SO4. Posle kondenzacije, ostatak je prečišćen na fleš koloni eluiranjem sa EtOAc/Heksanima da bi se dobilo jedinjenje 2C.

[0132] Korak 2. U rastvor jedinjenja 2C (1 ekviv.) u anhidrovanom THF-u (0.2 M) dodat je NaH (1.2 ekviv.). Reakciona smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 0.5 sata. U smešu je dodato jedinjenje 2D i reakcija je zagrevana na refluksu pod azotom preko noći. Reakcija je ohlađena do temperature okoline i razblažena porcijom vode (1/3 zapremine THF) i NaOH (3 ekviv.). Smeša se meša i zagreva na 70 °C tokom 2 sata ili dok se estar potpuno ne hidrolizuje do odgovarajuće kiseline. Nakon hlađenja, organski sloj se odvoji a vodeni sloj se neutrališe na pH~5. Dobijeni talog se filtrira, ispira vodom tri puta, i osuši pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje 2E, koje se koristi bez daljeg prečišćavanja.

[0133] Korak 3. U rastvor jedinjenja 2E (1 ekviv.) u CH2Cl2(0.2 M) dodat je 4 M HCl/dioksan (10 ekviv.) i smeša se meša dok se jedinjenje 2E potpuno ne pretvori u jedinjenje 2F. Smeša je koncentrovana, a ostatak je prečišćen primenom preparativne HPLC reverzne faze da bi se dobilo jedinjenje 2F.

[0134] Korak 4. Rastvor jedinjenja 2F (1 ekviv.) i DIPEA (10 ekviv.) u DMF (0.2 M) dodat je u kapima u rastvor HATU (1.4 ekvivalent) u DMF (0.1 M) na 0 °C. Nakon što je dodavanje završeno, smeša je mešana na 0 °C još 30 min. Dodata je voda i smeša je ekstrahovana pomoću EtOAc tri puta. Kombinovani organski slojevi su dva puta isprani zasičenim NaHCO3, zatim slanim rastvorom, osušeni iznad Na2SO4i koncentrovani. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/Heksanima da bi se dobio Primer 2.

Sinteza B:

[0135] Primeri 2 i 2-1 se takođe mogu dobiti prema sledećoj shemi, korišćenjem racemskih ili enantiomerno obogaćenih početnih materijala:

[0136] Korak 1. Jedinjenje 2C reaguje sa jedinjenjem 2G pod uslovima opisanim u Sintezi A, Korak 2, da bi se dobilo jedinjenje 2H.

[0137] Korak 2. Jedinjenje 2H se konvertuje u jedinjenje 2I pod uslovima opisanim u Sinteza A, Korak 3.

[0138] Korak 3. U rastvor jedinjenja 2I (1 ekviv.) i DIPEA (2 ekviv.) u toluenu (0.01 M) dodat je Pd(P-tBu3)2(1 ekviv.). Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C pod 4 bara CO preko noći, a zatim koncentrovana. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/heksanima da bi se dobio Primer 2.

Primeri 10 i 10-1.

[0139]

[0140] Primeri 10 i 10-1 se mogu dobiti kao što je prikazano na sledećoj shemi korišćenjem racemskih ili enantiomerno obogaćenih početnih materijala:

[0141] Korak 1. Jedinjenje 10C se dobija iz jedinjenja 10A i 10B korišćenjem postupka opisanog u Primeru 2, Sinteza A, Korak 1.

[0142] Korak 2. Jedinjenje 10E se dobija iz jedinjenja 10C i 10D korišćenjem postupka opisanog u Primeru 2, Sinteza A, Korak 2.

[0143] Korak 3. Smeša jedinjenja 10E (1 ekviv.) i NH2-NH2(10 ekviv.) u metanolu (0.2 M) je zagrevana uz refluks dok se jedinjenje 10E potpuno ne pretvori u jedinjenje 10F. Smeša je koncentrovana i ostatak je prečišćen primenom preparativne HPLC reverzne faze da bi se dobilo jedinjenje 10F.

[0144] Korak 4. Jedinjenje 10F se konvertuje u Primer 10 u skladu sa postupkom opisanim za primer 2, Sinteza A, Korak 4.

Primer 11-1

[0146] Korak 1: U rastvor 2-hloro-3-fluoro-6-hidroksi-benzaldehida (175 mg, 1.0 mmol), bistos etilen glikola (740 mg, 2.0 mmol) u ACN (5 mL), dodati su K2CO3(276 mg, 2.0 mmol) i KI (2 mg). Reakciona smeša je mešana na 120 °C tokom 24 sata. Čvrsta supstanca je filtrirana i filtrat je koncentrovan i prečišćen hromatografijom na koloni da bi se dobio željeni proizvod 11-1B kao bela čvrsta supstanca. Materijal je direktno korišćen u sledećem koraku.

[0147] Korak 2: U rastvor 11-1B (373 mg, 1 mmol) u ACN (5 mL), dodat je NaN3(650 mg, 10 mmol) i smeša je mešana na 120 °C tokom 24 sata. Čvrsta supstanca je filtrirana i ostatak je koncentrovan i prečišćen hromatografijom na koloni da bi se dobio 11-1C kao bela čvrsta supstanca (200 mg, 82%).<1>H NMR (500 MHz, Hloroform-d) δ 10.49 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.31 (dd, J = 9.2, 8.2 Hz, 1H), 6.88 (dd, J = 9.2, 3.7 Hz, 1H), 4.21 (dd, J = 5.4, 4.5 Hz, 2H), 3.67 (dd, J = 5.4, 4.5 Hz, 2H).

[0148] Korak 3: U rastvor 11-1C (100 mg, 0.41 mmol) u anhidrovanom THF-u (5 mL) na -78°C, dodat je metil magnezijum bromid (1N u Et2O, 0.82 mL, 0.82 mmol). Smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana je tokom 2 sata dok TLC ne pokaže da nema prisutnog početnog materijala. Rastvor je zatim ohlađen na 0°C i kvenčovan pomoću zasić. vod. NH4OAc i ekstrahovan pomoću EtOAc (20 mL × 3). Kombinovani organski sloj je osušen iznad Na2SO4i koncentrovan. Ostatak 11-1D je direktno korišćen u sledećem koraku.<1>H NMR (500 MHz, Hloroform-d) δ 6.97 (dd, J = 9.2, 8.3 Hz, 1H), 6.77 (dd, J = 9.1, 4.1 Hz, 1H), 5.27 (q, J = 6.7 Hz, 1H), 4.34 - 4.29 (m, 1H), 4.22 - 4.16 (m, 1H), 4.04 - 3.98 (m, 1H), 3.95 - 3.88 (m, 2H), 1.51 (d, J = 6.7 Hz, 3H).

[0149] Korak 4: U rastvor etil estra 5-Hloro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilne kiseline (100 mg, 0.44 mmol) i 11-1D (110 mg, 0.41 mmol) u anhidrovanom THF (5.0 mL) na - 78°C, dodat je NaH (60%, 17 mg, 0.44 mmol). Smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana tokom 8 sati dok se nije formirala dobra količina željenog proizvoda. Smeša je zatim razblažena vodom/ledom i ekstrahovana pomoću DCM (3x20 mL). Organski sloj je osušen iznad Na2SO4, koncentrovan i prečišćen hromatografijom na koloni silika gela da bi se dobio 11-1E kao žuta tečnost (20 mg, 0.045 mmol, 6%), koja se koristi direktno u sledećem koraku.

[0150] Korak 5: U rastvor 11-1E (20 mg, 0.045 mmol) u MeOH (1mL), dodat je LiOH (16 mg, 0.38 mmol), a zatim 1mL H2O. Smeša je ostavljena da se meša na 60 °C tokom 4 sata dok LCMS i TLC ne pokažu da je reakcija završena. Rastvor je ohlađen do sobne temperature, delimično koncentrovan i zakiseljen pomoću 1N HCl do pH 2-3. Vodena smeša je ekstrahovana pomoću DCM (3x10 mL). Organski sloj je osušen iznad Na2SO4i koncentrovan. Ostatak 11-1F je direktno korišćen u sledećem koraku.

[0151] Korak 6: U rastvor 11-1F (20 mg, 0.045 mmol) u DCM (5mL), dodat je PPh3(24 mg, 0.09 mmol). Rastvor je mešan tokom 1sata dok TLC ne pokaže potpunu konverziju početnog materijala u željeni proizvod. Smeša je zatim direktno korišćena u sledećem koraku bez dalje karakterizacije. 11-1G MS ESI<+>m/z 417.7 (M+Na)<+>.

[0152] Korak 7: U rastvor 11-1G dobijenog iz prethodnog koraka u DMF (10 mL), dodat je DIPEA (0.20 mL, 1.15 mmol). Rastvor je ohlađen u kupatilu sa suvim ledom/acetonom i dodat je HATU (40.0 mg, 0.11 mmol). Rastvor je ostavljen da se polako zagreje do sobne temperature i pomoću LCMS je pokazana čista transformacija početnog materijala u željeni proizvod. Smeša je zatim razblažena vodom (50 mL) i ekstrahovana pomoću EtOAc (3 × 50 mL). Kombinovani organski sloj je ispran vodom (3 × 50mL) i slanim rastvorom (50 mL) i osušen preko Na2SO4. Rastvarač je uklonjen i dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silicijum dioksida (0-5% MeOH/DCM) dajući željeni proizvod u vidu bele čvrste supstance (2.6 mg, 20% prinos).

Primeri 14 i 14-1.

[0153]

[0154] Primeri 14 i 14-1 se mogu dobiti prema sledećoj shemi korišćenjem racemskih ili enantiomerno obogaćenih početnih materijala:

[0155] Korak 1. U smešu jedinjenja 14A (1 ekviv.) i 14B (1.2 ekviv.) u anhidrovanom DMF (0.2 M) dodat je Cs2CO3(1.5 ekviv.) i reakcija je zagrevana u uljanom kupatilu na 80 °C pod azotom preko noći. Smeša je ohlađena, sipana u vodu, i ekstrahovana pomoću EtOAc tri puta. Kombinovani organski slojevi su isprani vodom pet puta, isprani slanim rastvorom i osušeni iznad Na2SO4. Posle kondenzacije, ostatak je prečišćen na fleš koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/Heksanima da se dobije 14C.

[0156] Korak 2. U ohlađeni (-78 °C) rastvor 14C (1 ekviv.) u anhidrovanom THF (0.2 M) dodat je MeMgBr (3 ekviv, 3 M u dietil etru). Reakcija je mešana tokom 2 h od -78 °C do 0 °C, i kvenčovana zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl, a zatim ekstrahovana sa EtOAc (2x). Organski slojevi su osušeni iznad MgSO4, filtrirani i koncentrovani. Ovaj ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/Heksanima da bi se dobio 14D.

[0157] Korak 3. U rastvor jedinjenja 14D (1 ekviv.) u anhidrovanom THF (0.2 M) dodat je NaH (1.2 ekviv.). Reakciona smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 0.5 sati. U smešu je dodat 14E i reakcija je zagrevana do refluksa pod azotom preko noći. Reakcija je ohlađena do temperature okoline, i zatim sipana u vodu. Proizvod se ekstrahuje EtOAc-om tri puta. Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom, osušeni iznad Na2SO4, i koncentrovani. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/Heksanima da bi se dobio proizvod 14F.

[0158] Korak 4. U rastvor jedinjenja 14F (1 ekviv.) u CH2Cl2(0.2 M) dodat je 4 M HCl/dioksan (10 ekviv.) i smeša se meša dok se sav 14F ne pretvori u 14G. Nakon koncentrovanja, ostatak je prečišćen primenom preparativne HPLC reverzne faze da bi se dobio 14G.

[0159] Korak 5. U rastvor 14G (1 ekviv.) i DIPEA (2 ekviv.) u toluenu (0.01 M) dodat je Pd(P-t-Bu3)2(1 ekviv.). Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C pod 4 bara CO preko noći, a zatim koncentrovana. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/heksanima da se dobije 14.

Primeri 15 i 15-1.

[0160]

[0161] Primeri 15 i 15-1 se mogu dobiti prema sledećoj shemi korišćenjem racemskih ili enantiomerno obogaćenih početnih materijala:

[0162] Korak 1. U suspenziju 15A (1.0 ekviv.) u THF (0.15 M) dodat je rastvor 2.0 M vodenog rastvora NaOH (3 ekviv.). Homogena reakciona smeša je mešana preko noći, a zatim su organske materije uklonjene pod sniženim pritiskom. Vodeni ostatak je doveden do pH~41.0 M vodenim rastvorom HCl. Dobijeni talog je sakupljen filtracijom i ispran pomoću H2O da bi se dobila čvrsta supstanca 15B. Filtrat se ekstrahuje pomoću EtOAc (2x), a organski slojevi su koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobio dodatni deo od 15B.

[0163] Korak 2. Osnovni rastvor Džonsovog reagensa (2.67 M) je pripremljen pažljivim dodavanjem koncentrovane H2SO4(2.3 mL) u CrOs (2.67 g) i zatim razblaženjem do 10 mL sa H2O. U suspenziju 15B (1.0 ekviv.) u acetonu (0.067 M) polako se dodaje Džonsonov reagens (1.2 ekviv.). Reakciona smeša je mešana tokom 15 min a zatim kvenčovana sa i-PrOH i filtrirana kroz jastučić dijatomejske zemlje, isprana acetonom. Filtrat je koncentrovan da bi se dobio 15C koje se koristi bez daljeg prečišćavanja.

[0164] Korak 4. U rastvor 15C (1.0 ekviv.) u DMF (0.40 M) na 0 °C dodat je NaH (60% u mineralnom ulju, 1.5 ekviv.). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 min a zatim ohlađena ponovo na 0 °C, i polako je dodat 2-(trimetilsilil)etoksimetil hlorid (4.3 mL, 1.2 ekviv.). Reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature, mešana tokom 1 h, a zatim kvenčovana pomoću H2O i ekstrahovana pomoću EtOAc (3x). Kombinovani organski slojevi su isprani sa H2O (3x) i slanim rastvorom, a zatim osušeni iznad MgSO4i koncentrovani. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu eluiranjem sa 20-30% EtOAc/heksana da se dobije 15D.

[0165] Korak 5. U reakcionu smešu 14D (1.0 ekviv.), bakar(I) jodida (0.05 ekviv.), 8-hidroksihinolina (0.1 ekviv.), i trobaznog kalijum fosfata (2.0 ekviv.) u DMF (0.2 M) u atmosferi azota dodat je 15D (1.2 ekviv.) i reakciona smeša je zagrevana na 120 °C tokom 24 h. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i zatim razblažena sa EtOAc. Smeša je filtrirana kroz jastučić dijatomejske zemlje i filtrat je uparen pod vakuumom. Sirovi ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAC/Heksanima da se dobije 15E.

[0166] Korak 6. Suspenzija 15E (1.0 ekviv.) na 0 °C u 1,4-dioksanu (0.062 M) i vodi (1/3 THF-a) je tretirana sulfaminskom kiselinom (6.0 ekviv.). Rastvor natrijum hlorita (1.3 ekviv.) i kalijum dihidrogen fosfata (12 ekviv.) u vodi (1.2 M) se dodaje preko levka kapalice tokom 20 min. Nakon što je dodavanje završeno, ledeno kupatilo je uklonjeno i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Doda se THF i reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi dodatna 3 sata. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana pomoću EtOAc (2x). Kombinovani organski slojevi su isprani vodom i slanim rastvorom, a zatim osušeni iznad Na2SO4, filtrirani i koncentrovani. Ostatak je triturisan sa etil acetat/heksanima da se dobije 15F.

[0167] Korak 7. U rastvor jedinjenja 15F (1 ekviv.) u CH2Cl2(0.2 M) se dodaje 4 M HCl/dioksan (10 ekviv.) i smeša se meša dok se sav 15F ne pretvori u 15G. Nakon koncentrovanja, ostatak je prečišćen primenom preparativne HPLC reverzne faze da bi se dobilo 15G.

[0168] Korak 8. Rastvor jedinjenja 15G (1 ekviv.) i DIPEA (10 ekviv.) u DMF (0.2 M) dodaje se u kapima u rastvor HATU (1.4 ekviv.) u DMF (0.1 M) na 0 °C. Nakon završenog dodavanja, smeša je mešana na 0 °C još 30 min. Dodata je voda i smeša je ekstrahovana pomoću EtOAc tri puta. Kombinovani organski slojevi su dva puta isprani zasićenim NaHCOs, slanim rastvorom, osušeni iznad Na2SO4i upareni. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/Heksanima da bi se dobio 15.

Primeri 18 i 18-1.

[0169]

[0170] Primeri 18 i 18-1 se mogu dobiti prema sledećoj shemi korišćenjem racemskih ili enantiomerno obogaćenih početnih materijala:

[0171] Korak 1. U reakcionu smešu 14D (1.0 ekviv.), 18A (1.2 ekviv.) i bakar(I) jodida (0.05 ekviv.) u DMF (0.2 M) u atmosferi azota dodat je NaH (3.0 ekviv.). Reakciona smeša je zagrevana na 120 °C tokom 24 h, a zatim je ohlađena do sobne temperature i razblažena pomoću EtOAc. Smeša je filtrirana kroz jastučić dijatomejske zemlje i filtrirana je uparavanjem pod vakuumom. Sirovi ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/Heksanima da se dobije 18B.

[0172] Korak 2. U reakcionu smešu 18B (1.0 ekviv.) u DMF (0.2 M) dodaju se KOH (2 ekviv.) i I2(1.1 ekviv.). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 h, a zatim kvenčovana pomoću NaHSOs i ekstrahovana pomoću EtOAc. Kombinovani organski slojevi su dva puta isprani zasićenim NaHCOs, slanim rastvorom, osušeni iznad Na2SO4i upareni.

Ostatak je prečišćen na kolonom silika gela eluiranjem sa EtOAc/Heksanima da bi se dobio 18C.

[0173] Korak 3. U rastvor jedinjenja 18C (1 ekviv.) u CH2Cl2(0.2 M) se dodaje 4 M HCl/dioksan (10 ekviv.) i smeša se meša dok se sav 18C ne pretvori u 18D. Nakon koncentrovanja, ostatak je prečišćen primenom preparativne HPLC reverzne faze da bi se dobio 18D.

[0174] Korak 4. U rastvor 18D (1 ekviv.) i DIPEA (2 ekviv.) u toluenu (0.01 M) dodat je Pd(P-t-Bu3)2(1 ekviv.). Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C pod 4 bara CO preko noći i zatim koncentovana. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/heksanima da bi se dobio 18.

Primer 20,

[0175]

[0176] Primer 20 je dobijen prema sledećoj shemi:

[0177] Korak 1. Terc-butil (2-(4-fluoro-2-formilfenoksi)etil)karbamat (20C). Zagrejan je rastvor aldehida 20A (1.5 g, 11 mmol), hlorida 20B (2.1 g, 12 mmol), kalijum karbonata (7.4 g, 54 mmol) i kalijum jodida (36 mg, 0.2 mmol) u DMF (11 mL) do 60 °C i mešano tokom 15 sati. Dodatak hlorida 20B (1.0 g, 6 mmol) i dalje zagrevanje na 80 °C tokom 5 sati je završilo reakciju. Smeša je ohlađena do sobne temperature i razblažena dodavanjem vode (250 mL). Smeša je ekstrahovana etil acetatom (3 × 300 mL) i kombinovani ekstrakti su isprani vodom (200 mL) i slanim rastvorom (100 mL), osušeni natrijum sulfatom i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija (ISCO sistem, silika, 0-20% etil acetat u heksanu) je dala 20C (3.0 g, 99%) kao viskozno ulje. LRESIMS m/z 306.1 [M+Na]<+>, izrač. za C14H18F1N1Na1O4306.1.

[0178] Korak 2. Terc-butil (2-(4-fluoro-2-((metilamino)metil)fenoksi)etil)karbamat (20D). Aldehid 20C (2.5 g, 8.8 mmol) i metilamin (0.69 g, 22 mmol) u metanolu (88 mL) su zagrevani do 60 °C i mešani tokom 1 sata. Smeša je ohlađena do sobne temperature i dodat je natrijum borohidrid (.33 g, 8.8 mmol). Smeša je mešana tokom 30 minuta, a zatim kvenčovana dodavanjem vode (200 mL). Smeša je ekstrahovana dihlorometanom (4 × 100 mL) i kombinovani ekstrakti su osušeni slanim rastvorom (50 mL), natrijum sulfatom i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija (ISCO sistem, silicijum dioksid, 0-100% (10% metanol u etil acetatu) u heksanu) dala je jedinjenje iz naslova (2.1 g, 80%) u obliku gela. LRESIMS m/z 299.2 [M+H]<+>, izrač. za C15H24F1N2O3299.2.

[0179] Korak 3. Etil 5-((2-(2-((terc-butoksikarbonil)amino)etoksi)-5-fluorobenzil)(metil)amino)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilat (20F). Amin 20D (2.1 g, 7.0 mmol), estar 20E (1.59 g, 7.0 mmol) i Hunigova baza (7.0 mL, 5.2 g, 40 mmol) u butanolu (17 mL) zagrevani su na 110 °C tokom 25 minuta. Reakcija je ohlađena i razblažena vodom (250 mL). Smeša je ekstrahovana dihlorometanom (4 × 100 mL) i kombinovani ekstrakti osušeni natrijum sulfatom. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija (ISCO sistem, silicijum dioksid, 20-100% etil acetat u heksanu) dala je jedinjenje iz naslova (2.1 g, 75%) u obliku čvrste supstance. LRESIMS m/z 488.3 [M+H]<+>, izrač. za C24H31F1N5O5488.2.

[0180] Korak 4. 5-((2-(2-((terc-Butoksikarbonil)amino)etoksi)-5-fluorobenzil)(metil)amino)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina (20G). Natrijum hidroksid (40 mL, 2 M u vodi) je dodat u mešani rastvor estra 20F (2.1 g, 4.3 mmol) u tetrahidrofuran:metanol (3:2, 100 mL) na sobnoj temperaturi. Reakcija je zagrejana do 60 °C i mešana tokom 6.5 sati. Smeša je ohlađena na 0 °C i zakiseljena hlorovodoničnom kiselinom (45 mL, 2 M u vodi) a zatim razblažena vodom (100 mL). Smeša je ekstrahovana etil acetatom (4 × 150 mL) i kombinovani ekstrakti osušeni slanim rastvorom (50 mL) i natrijum sulfatom. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1.92 g, 97%) kao čvrsta supstanca. LRESIMS m/z 460.2 [M+H]<+>, izrač. za C22H27F1N5O5460.2.

[0181] Korak 5. 5-((2-(2-Aminoetoksi)-5-fluorobenzil)(metil)amino)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina (20H). Hlorovodonična kiselina (5 mL, 4M u dioksanu) je dodata u mešani rastvor karboksilne kiseline 20G (1.92 g, 4.2 mmol) u dihlorometanu (25 mL) na sobnoj temperaturi. Reakcija je mešana tokom 2 sata zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao čvrsta supstanca. LRESIMS m/z 360.2 [M+H]<+>, izrač. za C17H10F1N5O3360.2.

[0182] Korak 6. U atmosferi argona HATU (1.67 g, 4.4 mmol) je dodat u mešani rastvor karboksilne kiseline 20H (1.50 g, 4.2 mmol) i Hunigove baze (7.28 mL, 5.40 g, 41.8 mmol) u DMF:dihlorometanu (5:1, 60 mL) na -78 °C. Reakcija je polako zagrejana do sobne temperature i mešana tokom 3 sata zatim kvenčovana vodom (300 mL). Smeša je ekstrahovana etil acetatom (3 × 100 mL) zatim dihlorometanom (2 × 100 mL) i kombinovani ekstrakti osušeni slanim rastvorom (50 mL) i natrijum sulfatom. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija (ISCO sistem, silicijum dioksid, 1-4% metanol u dihlorometanu) praćena rekristalizacijom iz etil acetat/metanol dala je Primer 20 (0.98 g, 68%, 2 koraka) kao čvrstu supstancu. LRESIMS m/z 342.2 [M+H]<+>, izrač. za C17H17F1N5O2342.1;<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.43 (dd, J = 6.9, 2.7 Hz, 1 H), 8.76 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 8.10 (s, 1 H), 7.19 - 7.25 (m, 1 H), 7.03 - 7.07 (m, 2 H), 6.72 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 5.64 (dd, J = 14.9, 1.5 Hz, 1 H), 4.48 (dt, J = 10.2, 4.3 Hz, 1 H), 4.04 - 4.10 (m, 2 H), 3.81 - 3.87 (m, 1 H), 3.58 (s, 3 H), 3.38 - 3.46 (m, 1 H).

Alternativna sinteza Primera 20:

[0183] Primer 20 je takođe dobijen sledećim alternativnim putem:

[0184] Korak 1. Etil 5-okso-4H-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilat (20J). U smešu 20I (150.00 g, 1.08 mmol) i etil (E)-3-etoksiprop-2-enoata (292.16 g, 2.03 mol) u DMF (3.2 L) dodat je Cs2CO3(656.77 g, 2.02 mol) u jednoj porciji na 20 °C pod N2. Smeša je mešana na 110 °C tokom 6 sati. Smeša je ohlađena na 20 °C i filtrirana kroz jastučić dijatomejske zemlje. Filterski kolač je ispran etil acetatom (3x30 mL). Filtrat je dodat u H2O (2 L) i zakiseljen pomoću HOAc do pH=4. Dobijeni precipitat je filtriran da bi se dobio 20J (173.00 g, 834.98 mmol, 86.36% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 (d, J=7.91 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H), 6.13 (d, J=7.91 Hz, 1H), 4.27 (q, J=7.11 Hz, 2H), 1.28 (t, J=7.09 Hz, 3H).

[0185] Korak 2.5-Hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilat (20K). U smešu 20J (158.00 g, 762.59 mmol) u MeCN (1.6 L) je dodat POCl3(584.64 g, 3.81 mol) na 20 °C pod N2. Smeša je mešana na 100 °C tokom 2 sata. Smeša je ohlađena na 20 °C i sipana u ledenu vodu (5000 mL) u porcijama na 0 °C i mešana tokom 20 min. Precipitat je filtriran i osušen da bi se dobio 20K (110.00 g, 487.52 mmol, 63.93% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.33 (d, J=7.28 Hz, 1H), 8.66 (s, 1H), 7.41 (d, J=7.15 Hz, 1H), 4.31 (q, J=7.15 Hz, 2H), 1.32 (t, J=7.09 Hz, 3H).

[0186] Korak 3.4-Fluoro-2-metilaminometil-fenol (20M). U rastvor 20 L (5.00 g, 35.69 mmol, 1.00 ekv.) u MeOH (50.00 mL) dodat je vodeni metanamin (8.8 mL, 71.38 mmol, 25%, 2.00 ekv) u jednoj porciji na 25 °C pod N2. Smeša je mešana na 25°C tokom 3 sata, zatim je dodat NaBH4(2.70 g, 71.38 mmol, 2.00 ekv) u porcijama, i smeša je mešana na 25°C još 9 sati. TLC je pokazala da je reakcija završena. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom na 45°C. Ostatak je sipan u vodu (50 mL). Vodena faza je ekstrahovana dihlorometanom (3 × 200 mL) i kombinovana organska faza je isprana slanim rastvorom (200 mL), osušena iznad anhidrovanog Na2SO4, filtrirana i koncentrovana u vakuumu da bi se dobio 20M (5.10 g, 32.87 mmol, 92.09% prinos) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (400MHz, CDCl3) δ 6.86 (dt, J=3.0, 8.7 Hz, 1H), 6.78 - 6.69 (m, 2H), 3.93 (s, 2H), 2.48 (s, 3H).

[0187] Korak 4. Etil estar 5-[(5-Fluoro-2-hidroksi-benzil)-metil-amino]-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilne kiseline (A1). U suspenziju 20M (33.70 g, 217.17 mmol, 1.00 ekv.) i 20K (49.00 g, 217.17 mmol, 1.00 ekv.) u n-BuOH (740.00 mL), dodat je DIPEA (159.98 g, 1.24 mol, 5.70 ekv.). Reakciona smeša je mešana na 120 °C tokom 2 sata pod azotom. TLC je pokazala da je reakcija završena. Rastvor je ohlađen na 25°C a zatim je uklonjen rastvarač. Ostatak je razblažen vodom (500 mL) i ekstrahovan dihlorometanom (3 × 500 mL). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (300 mL), osušeni iznad anhidrovanog Na2SO4i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je triturisan pomoću EtOAc(100 mL) da bi se dobio A1 (60.00 g, 174.25 mmol, 80.24% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, Hloroform-d) δ 9.71 (s, 1H), 8.32 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.30 (s, 1H), 6.98 - 6.87 (m, 3H), 6.37 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.42 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.21 (s, 3H), 1.39 (t, J = 7.1 Hz, 3H).

[0188] Korak 5. Etil estar 5-{[2-(2-terc-Butoksikarbonilamino-etoksi)-5-fluoro-benzil]-metilamino}-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina (B1). U rastvor A1 (102.85g, 298.6 mmol, 1 ekv.), terc-butil estra (2-hloro-etil)-karbaminske kiseline (56.33 g, 313.5 mmol, 1.05 ekv.) u DMF-u (854 mL) dodat je K2CO3(206.41 g, 1493 mmol, 5.0 ekv.). Smeša je zagrevana na 80 °C tokom 20 sati uz konverziju od -85% početnog materijala u proizvod pomoću LC-MS. Dodatne porcije terc-butil estra (2-hloro-etil)-karbaminske kiseline (5.633 g, 31.35 mmol, 0.1 ekv.) i K2CO3(41.282 g, 298.6 mmol, 1 ekv.) su dodati u reakcioni balon. Reakcija je nastavljena na 80 °C još 21 sat. Smeša je zatim ohlađena do sobne temperature, kvenčovana vodom (1000 ml) i ekstrahovana pomoću EtOAc (3 × 900 mL). Kombinovani organski ekstrakti su zatim isprani vodom (3 × 700mL) i slanim rastvorom (500 mL), osušeni iznad Na2SO4i koncentrovani. Dobijeni ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/Heksanom (0-70%) da bi se dobio B1 kao bela čvrsta supstanca (128.74 g, 96.7% prinos). LC-MS (ESI) m/z 510.1 (M+Na)<+>;<1>H NMR (500 MHz, Hloroform-d) δ 8.30 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 6.92 (td, J = 8.6, 3.3 Hz, 1H), 6.83 - 6.76 (m, 1H), 6.31 (s, 1H), 4.93 (s, 2H), 4.51 - 4.44 (m, 1H), 4.36 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.03 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 3.69 - 3.63 (m, 1H), 3.51 (s, 2H), 3.30 (s, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.41 - 1.35 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

[0189] Korak 6. 11-Fluoro-14-metil-6,7,13,14-tetrahidro-1,15-etenopirazolo[4,3-f][1,4,8,10]benzoksatriazaciklotridecin-4(5H)-on (20). U rastvor B1 (128.74 g, 264.07 mmol, 1 ekv.) u metanolu (750 mL) i THF-u (250 mL) dodat je LiOHHzO (55.40 g, 1320 mmol, 5.0 ekv.) u H2O (250 mL). Bistri rastvor je zagrevan na 70°C tokom 2 sata. Reakcija je neutralisana na 0°C pomoću vod. HCl (2M, 250 mL) do pH<5, a zatim ekstrahovana pomoću CH2Cl2(1x1000 mL, 3x500 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom (300 mL) i osušeni iznad Na2SO4. Posle filtracije, uparavanja i sušenja u visokom vakuumu, dobijena je bela čvrsta supstanca (126.47 g, 275.25 mmol, 104% prinos). Rastvoru kiseline (121.30 g, 264 mmol) u CH2Cl2(996 mL) dodata je HCl u dioksanu (4 M, 204 mL) na 0 °C. Nastavljeno je mešanje od 0 °C do sobne temperature tokom 27 sati dok se de-Boc ne završi pomoću LC-MS. Bela čvrsta supstanca je filtrirana, isprana DCM-om (400 mL) i osušena u visokom vakuumu da bi se dobila bela čvrsta supstanca amin 3HCl soli (123.55 grama) koja je korišćena direktno bez daljeg prečišćavanja. U rastvor DIPEA (169.4 g, 228 mL, 1310 mmole) u DMF-u (3.7 L) i CH2Cl2(1.0 L) dodata je kisela amin HCl so (22.92 g, 49.0 mmol, 1.00 ekv.). Nakon što je so čvrste supstance potpuno rastvorena, dodat je pentafluorofenil difenilfosfinat (FDPP) u CH2Cl2(1.1 M, 19.76 g, 51.44 mmol, 1.05 ekv.). Kuplovanje je završeno za 30 minuta pomoću LC-MS, a zatim su dodate druge porcije soli i FDPP po istoj proceduri kao i prva porcija. Dodavanje soli praćeno FDPP je ponavljano svakih 30 minuta i praćeno pomoću LC-MS za svaki ciklus dodavanja. Ukupna so (123.55 g, 264 mmol, 1.00 ekv) i FDPP (106.44 g, 277 mmol, 1.05 ekv.) su dodati u reakcioni balon u porcijama. Reakcioni rastvor je koncentrovan do zapremine od ~ 500 mL i formirano je mnogo taloga. Čvrst proizvod 20 je filtriran i ispran DMF-om (50 mLx3). Filtrat je sipan u vodu (2L) i dodatni proizvod je istaložen. Čvrst proizvod je filtriran i ispran vodom (100 mLx3). Kombinovani čvrsti proizvod je osušen i ponovo rastvoren u 10% metanolu i dihlorometanu (1.5 L) i zatim je dodat etil acetat (1 L). Rastvor je kondenzovan do ∼ 500 mL i formirano je mnogo bele čvrste supstance. Posle filtracije i sušenja u visokom vakuumu, dobijeno je belo čvrsto jedinjenje 20 (74.58 g, 83% prinos).

Difrakcija rendgenskih zraka na prahu (PXRD) Primera 20.

[0190] Uzorak Primera 20, kristalni polimorfni oblik 1, je prebačen na ploču sa nultom pozadinom za PXRD analizu. PXRD podaci su dobijeni korišćenjem Bruker D8 rendgenskog difraktometra u skladu sa procedurama koje preporučuje proizvođač. Parametri za skeniranje: 2-teta opseg: 4.5 do 39.1 stepeni; veličina koraka: 0.02 stepeni; vreme koraka: 1 sekund; vreme analize: 180 sekundi.

[0191] Difrakcioni pikovi se obično mere sa greškom od ±0.1 stepeni (2θ).

[0192] Rezultati su prikazani na Slici 1. Podaci su sumirani u Tabeli 1.

Tabela 1

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) Primera 20,

[0193] DSC merenja, prikazana na Slici 2, izvedena su korišćenjem Seiko Modela SSC/5200 Diferencijalno skenirajućeg kalorimetra. Uzorak od 7.92 mg Primera 20, kristalni polimorfni oblik 1, je uravnotežen na 36 °C, a zatim je temperatura povećana na 380 °C brzinom od 10 °C/min. Uzorak Primera 20, kristalni polimorfni oblik 1, demonstrirao je tačku topljenja od 298.9 °C.

Primer 26.

[0194]

[0195] Primer 26 se može dobiti prema sledećoj shemi:

[0196] Korak 1. Titanijum(IV) izopropoksid (1.3 ekviv.) se dodaje u komercijalno dostupan rastvor metilamina u metanolu (2 M, 3 ekviv.), a zatim se dodaje početni aldehid 14C (1.0 ekviv.). Reakciona smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 5 h, nakon čega je dodat natrijum borohidrid (1.0 ekviv.) i dobijena smeša je dalje mešana još 2 sata. Reakcija je zatim kvenčovana dodavanjem vode, dobijeni neorganski precipitat je filtriran i ispran sa EtOAc. Organski sloj je odvojen, a vodeni deo je dalje ekstrahovan pomoću EtOAc (x2). Kombinovani ekstrakti su osušeni (K2CO3) i koncentrovani u vakuumu da bi se dobio 26A.

[0197] Korak 2. Smeša jedinjenja 26A (1 ekviv.) i DIPEA (2 ekviv.) u n-BuOH (0.2 M) je zagrevana na 120 °C preko noći, ohlađena do temperature okoline, a zatim koncentrovana. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/Heksanima da bi se dobio proizvod 26B.

[0198] Korak 3. U rastvor jedinjenja 26B (1 ekviv.) u CH2Cl2(0.2 M) dodat je 4 M HCl/dioksan (10 ekviv.) i smeša se meša dok se sav 26B ne pretvori u 26C. Nakon koncentrovanja, ostatak je prečišćen primenom preparativne HPLC reverzne faze da bi se dobio 26C.

[0199] Korak 4. U rastvor 26C (1 ekviv.) i DIPEA (2 ekviv.) u toluenu (0.01 M) dodat je Pd(P-t-Bu3)2(1 ekviv.). Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C pod 4 bara CO preko noći, a zatim koncentrovana. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/heksanima da bi se dobio 26.

Primeri 37 i 37-1.

[0200]

[0201] Primeri 37 i 37-1 se mogu dobiti prema sledećoj shemi od racemski ili enantiomerno obogaćenih početnih materijala:

[0202] Korak 1. Jedinjenje 37B se dobija od jedinjenja 2C i jedinjenja 37A korišćenjem postupka opisanog za Primer 2, Sinteza A, Korak 2.

[0203] Korak 2. Jedinjenje 37C se dobija od jedinjenja 37B korišćenjem postupka opisanog u Primeru 2, Sinteza A, Korak 3.

[0204] Korak 3. Primer 37 se dobija od jedinjenja 37C korišćenjem postupka opisanog u Primeru 2, Sinteza A, Korak 4.

Primeri 38 i 38-1.

[0205]

[0206] Primeri 38 i 38-1 se mogu dobiti prema sledećoj shemi od racemski ili enantiomerno obogaćenih početnih materijala:

[0207] Korak 1. Jedinjenje 38B se dobija iz jedinjenja 2C i 38A kao što je opisano u Primeru 2, Sinteza A, Korak 2.

[0208] Korak 2. Jedinjenje 38C se dobija iz jedinjenja 38B korišćenjem postupka opisanog u Primeru 2, Sinteza A, Korak 3.

[0209] Korak 3. Primer 38 se dobija iz jedinjenja 38C korišćenjem postupka opisanog u Primeru 2, Sinteza B, Korak 4.

Primer 39.

[0210]

[0211] Primer 39 je dobijen prema sledećim shemama:

[0212] Korak 1. Terc-butil estar 2-(3-Hloro-4-fluoro-2-formil-fenoksi)-etil]-karbaminske kiseline (39B). U rastvor 2-hloro-3-fluoro-6-hidroksi-benzaldehida (39A, 53 mg, 0.3 mmol) i terc-butil estra (2-hloro-etil)- karbaminske kiseline (135 mg, 0.75 mmol) u DMF (5 mL) dodati su KI (2.0 mg, 0.012 mmol) i K2CO3(105 mg, 0.75 mmol). Smeša je stavljena u mikrotalasnu na 100 °C tokom 2 sata. Smeša je zatim razblažena vodom (20 mL) i ekstrahovana pomoću EtOAc (3x20 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani vodom (3x20 mL) i slanim rastvorom (20 mL), osušeni iznad Na2SO4i koncentrovan da bi se dobio 39B. Sirovi ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku. LC-MS: (ESI) m/z 340.3 (M+Na)<+>.

[0213] Korak 2. Terc-butil estar {[2-(3-Hloro-4-fluoro-2-metilaminometil-fenoksi)-etil]-karbaminske kiseline (39C). U rastvor 39B (95.4 mg, 0.3 mmol) u MeOH (3 mL) je dodat metilamin hidrohlorid (50.7 mg, 0.75 mmol). Smeša je mešana na 60 °C tokom 30 min. Rastvor je zatim ohlađen do temperature okoline i dodat je NaBH4(11.1 mg, 0.3 mmol). Smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 2 h. Rastvor je zatim razblažen vodom (50 mL) i ekstrahovan pomoću DCM (3 × 20 mL). Kombinovani organski slojevi su sušeni iznad Na2SO4i koncentrovani da bi se dobio 39C. Sirovi ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku. LC-MS: (ESI) m/z 333.3 (M+H)<+>.

[0214] Korak 3. Etil estar 5-{[6-(2-terc-Butoksikarbonilamino-etoksi)-2-hloro-3-fluorobenzil]-metil-amino}-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilne kiseline (39D). U rastvor 20K (67.5 mg, 0.3 mmol) i 39C (99.9 mg, 0.3 mmol) u n-BuOH (2.0 mL) je dodat DIEA (1.0 mL). Smeša je zagrevana u mikrotalasnoj pećnici na 150 °C tokom 2 sata. Smeša je zatim razblažena vodom i ekstrahovana DCM-om (3x20 mL). Organski sloj je osušen iznad Na2SO4, koncentrovan i prečišćen hromatografijom na koloni silika gela da bi se dobio 17 kao žuta tečnost. LC-MS: (ESI) m/z 522.5 (M+H)<+>.

[0215] Korak 4. 5-{[6-(2-terc-Butoksikarbonilamino-etoksi)-2-hloro-3-fluoro-benzil]-metilamino}-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina (39E). U rastvor 39D (40 mg, 0.0776 mmol) u MeOH (1mL) dodat je LiOH (16 mg, 0.38 mmol) i H2O (1 mL). Smeša je mešana na 60 °C tokom 4 h. Rastvor je ohlađen do temperature okoline, delimično koncentrovan i zakiseljen vodenim rastvorom HCl (1 N) do pH 2-3. Vodena smeša je ekstrahovana DCM-om (3x10 mL). Organski sloj je osušen iznad Na2SO4i koncentrovan da bi se dobio 39E. Sirovi ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku. LC-MS: (ESI) m/z 494.3 (M+H)<+>.

[0216] Korak 5. 5-{[6-(2-Amino-etoksi)-2-hloro-3-fluoro-benzil]-metil-amino}-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina (39F). U rastvor 39E (40 mg, 0.0776 mmol) u DCM (2 mL), dodat je TFA (0.4 mL). Rastvor je mešan tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen na rotacionom uparivaču. Ostatak je ponovo rastvoren pomoću DCM i ponovo koncentrovan (3X) da se dobije 39F kao čvrsta supstanca nalik peni. LC-MS: (ESI) m/z 393.5 (M+H)<+>.

[0217] Korak 6. U rastvor 39F (36 mg, 0.078mmol) u 10 mL DCM je dodat DIEA (0.20 mL, 1.15 mmol). Rastvor je ohlađen u kupatilu sa suvim ledom/acetonom i dodat je HATU (40.0 mg, 0.11 mmol). Rastvor je ostavljen da se polako zagreje do temperature okoline. Smeša je razblažena vodom (50 mL) i ekstrahovana EtOAc-om (3 × 50 mL). Kombinovani organski sloj je ispran vodom (3 × 50 mL) i slanim rastvorom (50 mL), osušena iznad Na2SO4i koncentrovana. Dobijeni ostatak je prečišćen na koloni silicijum dioksida (0-5% MeOH/DCM) dajući Primer 39 kao belu čvrstu supstancu (6.2 mg, 23.4%). LC-MS (ESI) m/z 376.5 (M+H)<+>.<1>H NMR (500 MHz, hloroform-d) δ 9.51 (s, 1H), 8.40 - 8.33 (m, 2H), 7.03 (ddd, J = 8.9, 8.0, 0.7 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 9.3, 4.2 Hz, 1H), 6.40 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.97 (dd, J = 15.0, 2.1 Hz, 1H), 4.49 - 4.43(m, 1H), 4.31 (ddd, J = 10.9, 6.4, 4.5 Hz, 1H), 4.12 - 4.03 (m, 1H), 3.91 (d, J = 14.9 Hz, 1H), 3.72 - 3.63 (m, 1H), 3.56 (s, 3H).

Primer 40.

[0218]

[0219] Primer 40 je dobijen kao što je prikazano na sledećoj shemi:

[0220] Korak 1. 5-[(5-Fluoro-2-hidroksi-benzil)-metil-amino]-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina (40B). U rastvor 19A (75 mg, 0.14 mmol) u MeOH (2 mL) dodat je LiOH (60 mg, 1.4 mmol) i H2O (2 mL). Smeša je mešana na 60 °C tokom 4 h. Rastvor je ohlađen do temperature okoline, delimično koncentrovan i zakiseljen vodenim rastvorom HCl (1 N) do pH 2-3. Dobijena suspenzija je ekstrahovana pomoću EtOAc (3 × 20mL). Organski sloj je osušen iznad Na2SO4i koncentrovan da bi se dobio 40A. LC-MS (ESI) m/z 331.6 (M+H)<+>.

[0221] Korak 2. 5-[(5-Fluoro-2-hidroksi-benzil)-metil-amino]-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina (2-hidroksi-etil)-amid (40B). U rastvor 40A (140 mg, 0.42 mmol) i 2-amino-etanola (244 mg, 4 mmol) u DCM (5 mL) na 0 °C su dodati DIEA (0.20 mL, 1.15 mmol) i HATU (380.0 mg, 1.0 mmol). Rastvor je ostavljen da se polako zagreje do temperature okoline. Smeša je zatim razblažena vodom (25 mL) i ekstrahovan pomoću EtOAc (3 × 25 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani pomoću HCl (1N, 3 × 20mL) i slanim rastvorom (50 mL), osušeni iznad Na2SO4i koncentrovani. Dobijeni ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem pomoću 0-5% MeOH/DCM (10 CV) dajući 40B kao belu čvrstu supstancu (74 mg, 47%). LC-MS (ESI) m/z 374.3 (M+H)<+>.

[0222] Korak 3. U rastvor 40B (74 mg, 0.2 mmol) u THF (3 mL) i DCM (3 mL) na 0 °C dodati su PPh3(131 mg, 0.5 mmol) i di-terc-butil azodikarboksilat (DTAD) (115 mg, 0.5 mmol). Smeša je ostavljena da se zagreje do temperature okoline i mešana je još 4 sata. Rastvarač je uklonjen i ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem pomoću 0-10%, MeOH/DCM (10 CV), praćeno preparativnom TLC da bi se dobio Primer 40 kao bela čvrsta supstanca (15 mg). LC-MS (ESI) m/z 356.5 (M+H)<+>;<1>H NMR (500 MHz, hloroform-d) δ 8.12 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.93 (ddd, J = 9.0, 3.1, 0.9 Hz, 1H), 6.78 (ddd, J = 9.0, 7.3, 3.0 Hz, 1H), 6.71 (dd, J = 9.1, 4.5 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 5.77 (dd, J = 15.2, 1.7 Hz, 1H), 4.38 - 4.33 (m, 1H), 3.98 (s, 1H), 3.91 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 15.1, 0.9 Hz, 1H), 3.45 (s, 3H), 3.43 - 3.36 (m, 1H), 2.45 (s, 3H).

Primer 41.

[0223]

[0224] Primer 41 je dobijen korišćenjem postupka prikazanog na sledećoj shemi:

[0225] Korak 1. Terc-butil estar [2-(2-Acetil-4-fluoro-fenoksi)-etil]-karbaminska kiselina (41B). U smešu 1-(5-fluoro-2-hidroksi-fenil)-etanona (41A, 773 mg, 5.0 mmol) i terc-butil estra (2-hloroetil)-karbaminske kiseline (1.80 g, 10.0 mmol) u DMF (20 mL) su dodati KI (2.0 mg, 0.012 mmol) i Cs2CO3(3.26 g, 10.0 mmol). Smeša je mešana na 80 °C preko noći. Smeša je zatim ohlađena do sobne temperature, razblažena pomoću EtOAc i isprana pomoću 1 N NaOH (5 × 10 mL) sve dok pomoću LCMS nije prikazan pik 1-(5-fluoro-2-hidroksi-fenil)-etanona. Organski sloj je osušen iznad Na2SO4i koncentrovan. Ostatak je zatim prečišćen na koloni silika gela eluiranjem pomoću EtOAc/heksan (0-30%, 10 CV) da bi se dobio željeni proizvod 41B kao žuta čvrsta supstanca (1.1 g, 73.8%). LC-MS (ESI) m/z 320.3 (M+Na)<+>.

[0226] Korak 2. Terc-Butil (2-(4-fluoro-2-(1-hidroksietil)fenoksi)etil)karbamat (41C). U rastvor 41B (1.0 g, 3.36 mmol) u MeOH (10 mL) je u porcijama dodat NaBH4(640 mg, 16.8 mmol). Smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 2 h. Rastvor je zatim razblažen vodom (50 mL) i ekstrahovan pomoću DCM (3 × 20 mL). Kombinovani DCM slojevi su sušeni iznad Na2SO4i koncentrovani. Ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem pomoću EtOAc/heksan (0-50%, 10 CV) da bi se dobio željeni proizvod kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.75g, 75%). LC-MS (ESI) m/z 322.3 (M+Na)<+>;<1>H NMR (500 MHz, hloroform-d) δ 7.11 (dd, J = 9.2, 3.4 Hz, 1H), 6.89 (ddd, J = 9.0, 7.9, 3.2 Hz, 1H), 6.77 (dd, J = 8.9, 4.4 Hz, 1H), 5.09 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 4.92 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.03 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.62 - 3.50 (m, 2H), 1.49 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.45 (s, 9H).

[0227] Korak 3. Etil estar 6-{1-[2-(2-terc-Butoksikarbonilamino-etoksi)-5-fluoro-fenil]-etoksi}-imidazo[1,2-b]piridazin-3-karboksilna kiselina (41D). U rastvor 41C (600 mg, 2.0 mmol) i terc-butil estra {2-[4-fluoro-2-(1-hidroksi-etil)-fenoksi]-etil}-karbaminske kiseline (450 mg, 2.0 mmol) u suvom THF (40.0 mL) na -78 °C dodat je NaH (60%, 80 mg, 2.0 mmol) u porcijama. Suspenzija je mešana na -78 °C tokom 4 sata i ostavljena da se zagreje do 0 °C i mešana još 4 sata. Smeša je zatim stavljena u zamrzivač na -20 °C preko noći. Smeša je zatim kvenčovana smešom leda i 1 N HCl i ekstrahovana pomoću EtOAc (3 × 20 mL). Organski sloj je osušen iznad Na2SO4, koncentrovan i prečišćen dva puta da bi se dobio željeni proizvod kao žuta čvrsta supstanca (240 mg, 25%). LC-MS (ESI) m/z 511.6 (M+Na)<+>;<1>H NMR (500 MHz, hloroform-d) δ 8.16 (s, 1H), 7.90 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 9.0, 3.2 Hz, 1H), 0.95 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 6.90 - 6.88 (m, 1H), 6.81 - 6.78 (m, 1H), 6.68 (q, J = 6.2 Hz, 1H), 5.84 - 5.68 (m, 1H), 4.38 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.15 - 4.09 (m, 2H), 3.60 - 3.52 (m, 2H), 1.65 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.38 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.35 (s, 9H).

[0228] Korak 4. Jedinjenje 41D je konvertovano u Primer 41 korišćenjem postupaka analognih onima koji su ovde opisani. MS: 343.2 (M+H)<+>;<1>H NMR (500 MHz, Hloroform-d) δ 9.82 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.09 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 8.9, 3.2 Hz, 1H), 7.01 - 6.94 (m, 2H), 6.83 (dd, J = 9.0, 4.3 Hz, 1H), 6.60 - 6.53 (m, 1H), 4.63 - 4.52 (m, 1H), 4.27 -4.16 (m, 1H), 4.16 - 4.04 (m, 1H), 3.70 - 3.56 (m, 1H), 1.70 (d, J = 6.4 Hz, 3H)

Primer 42.

[0229]

[0230] Primer 42 je dobijen korišćenjem postupaka prikazanih na sledećoj shemi:

[0231] Korak 1. Etil estar 6-[(5-Fluoro-2-hidroksi-benzil)-metil-amino]-imidazo[1,2-b]piridazin-3-karboksilna kiselina (42B). U smešu 4-fluoro-2-metilaminometil-fenola (20L, 305.2 mg, 1.97 mmol) i etil estra 6-hloro-imidazo[1,2-b]piridazin-3-karboksilne kiseline (42A, 230 mg, 1.02 mmol) u DMSO (5 mL) je dodat KF (180 mg, 3.01 mmol). Reakciona smeša je mešana na 120 °C tokom 18 sati pod azotom. Rastvor je zatim ohlađen do temperature okoline, razblažen vodom (20 mL) i ekstrahovan pomoću EtOAc (3 × 50 mL). Kombinovani organski slojevi su dalje isprani vodom (3 × 50 mL) i slanim rastvorom (50 mL), osušeni iznad Na2SO4i koncentrovani. Ostatak je zatim prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/heksanom (0-50%, 10 CV) da bi se dobio željeni proizvod kao bela čvrsta supstanca (240 mg, 69%). LCMS (ESI) m/z 345.2 (M+H)<+>;<1>H NMR (500 MHz, hloroform-d) δ 8.61 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.91 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.00 - 6.86 (m, 4H), 4.78 (s, 2H), 4.47 (qd, J = 7.2, 0.5 Hz, 2H), 3.17 (s, 3H), 1.41 (td, J = 7.1, 0.5 Hz, 3H).

[0232] Korak 2. Etil estar 6-{[2-(2-terc-Butoksikarbonilamino-etoksi)-5-fluoro-benzil]-metilamino}-imidazo[1,2-b]piridazin-3-karboksilne kiseline (42C). U rastvor etil estra 6-[(5-fluoro-2-hidroksi-benzil)-metil-amino]-imidazo[1,2-b]piridazin-3-karboksilne kiseline (2B, 200 mg, 0.58 mmol) i terc-butil estra (2-hloro-etil)-karbaminske kiseline (209 mg, 1.16 mmol) u DMF (5 mL) dodati su K2CO3(200 mg, 1.45 mmol) i KI (2.0 mg, 0.012 mmol). Smeša je zagrevana na 90 °C tokom 4 sata pod azotom. Smeša je zatim razblažena vodom (20 mL) i ekstrahovana pomoću EtOAc (3 × 10 mL). Kombinovani organski slojevi su zatim isprani vodom (3 × 5mL) i slanim rastvorom (2 × 5mL). Organski sloj je osušen iznad Na2SO4i koncentrovan. Dobijeni ostatak je prečišćen na koloni silika gela eluiranjem sa EtOAc/heksanom (0-100%, 10 CV) da bi se dobio 42C kao bela čvrsta supstanca (203 mg, 76%). LC-MS (ESI) m/z 510.1 (M+Na)<+>;<1>H NMR (500 MHz, Hloroform-d) δ (ppm) 8.16 (s, 1H), 7.85 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 7.00 (dd, J= 8.9, 3.2 Hz, 1H), 6.95 - 6.87 (m, 2H), 6.80 (dd, J = 8.9, 4.3 Hz, 1H), 4.95 (s, 1H), 4.74 (s, 2H), 4.41 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.56 - 3.50 (m, 2H), 3.26 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.40 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

[0233] Korak 3. Jedinjenje 42C je konvertovano u Primer 42 korišćenjem postupaka analognih onima koji su ovde opisani. MS: 342.5 (M+H)<+>;<1>H NMR (500 MHz, hloroform-d) δ 10.01 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.04 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.07 - 7.04 (m, 1H), 7.00 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 6.96 - 6.92 (m, 1H), 6.84 (dd, J = 9.1, 4.5 Hz, 1H), 5.69 (dd, J = 15.8, 1.6 Hz, 1H), 4.55 (dt, J= 9.9, 3.7 Hz, 1H), 4.20 - 4.09 (m, 2H), 3.98 (dd, J = 15.9, 1.0 Hz, 1H), 3.66 -3.62 (m, 1H), 3.61 (s,3H).

Primer 51-1

[0234]

[0235] Korak 1 U rastvor A8 (399.4 mg, 1.16 mmol) i terc-butil (2-hloroetil)karbamata (260.5 mg, 1.45 mmol) u DMF-u (5.8 mL) dodat je K2CO3(801.6 mg, 5.80 mmol) i zagrevan je na 80 °C uz mešanje tokom 6 sati. Reakcija je ohlađena do temperature okoline i razblažena sa DCM (3 mL), filtrirana kroz špric filter i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija (ISCO sistem, silicijum dioksid (12 g), 0-70% etil acetat u heksanu) je dala 51-1A (407.4 mg, 0.836 mmol, 72% prinos).

[0236] Korak 2. U rastvor 51-1A (407.4 mg, 0.836 mmol) u MeOH (6 mL) i THF (4 mL) dodat je vodeni rastvor LiOH (2M, 4.0 mL) na temperaturi okoline. Reakcioni rastvor je zagrevan na 70 °C tokom 2 sata. Reakcioni balon je hlađen do temperature okoline, razblažen vodom i metanolom, a zatim kvenčovan vodenim rastvorom HCl (2 M, 4 mL) do pH <5. Smeša je ekstrahovana pomoću DCM (3 × 5 mL), osušena sa Na2SO4, koncentrovana pod redukcijom i sušena u visokom vakuumu preko noći. U rastvor kiselog proizvoda u DCM (6 mL) dodata je 4 M HCl u 1,4-dioksanu (2.97 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata, i zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom i osušena u visokom vakuumu. U rastvor de-Boc proizvoda i FDPP (352.9 mg, 0.918 mmol) u DMF-u (21 mL) dodata je Hunigova baza (539.5 mg, 0.327 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana 2.5 sata, a zatim je reakcija kvenčovana sa 2 M rastvorom Na2CO3(21 mL). Smeša je mešana tokom 15 min i zatim ekstrahovana pomoću DCM (4 × 10 mL). Kombinovani ekstrakti su osušeni sa Na2SO4i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (ISCO sistem, silicijum dioksid (12 g), 0-11.25% metanol u dihlorometanu) da se dobije 51-1 (164.0 mg, 0.480 mmol, 57.55 % prinos za tri koraka).

Primer 53.

[0237]

[0238] Primer 53 je dobijen korišćenjem postupaka prikazanih na sledećoj shemi:

[0239] Korak 1. 5-[1-(5-Fluoro-2-hidroksi-fenil)-etilamino]-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina (53A). U rastvor etil estra 5-[(5-fluoro-2-hidroksi-benzil)-metil-amino]-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilne kiseline (20M, 300 mg, 0.87 mmol) u MeOH (5 mL), dodat je LiOH (420 mg, 10 mmol), a zatim 5 mL H2O. Smeša je ostavljena da se meša na 60 °C tokom 4 sata. Rastvor je ohlađen do temperaturee okoline, delimično koncentrovan i zakiseljen sa 1 N HCl do pH 2-3. Dobijena suspenzija je ekstrahovana pomoću EtOAc (3 × 20 mL). Kombinovani organski slojevi su sušeni iznad Na2SO4i koncentrovani. Ostatak je direktno korišćen u sledećem koraku. LCMS (ESI<+>) m/z 317.4 (M+H)<+>.

[0240] Korak 2. Metil estar 3-({5-[(5-Fluoro-2-hidroksi-benzil)-metil-amino]-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karbonil}-amino)-2-hidroksi-propionske kiseline (53B). U rastvor 53A (80 mg, 0.25 mmol) i 3-amino-2-hidroksi-propionske kiseline metil estar hidrohlorida (70 mg, 0.5 mmol) u DCM (5 mL) na 0 °C dodat je DIPEA (1.0 mL, 5.7 mmol), a zatim HATU (140.0 mg, 0.5 mmol). Rastvor je ostavljen da se polako zagreje do temperature okoline. Smeša je razblažena vodom (25 mL) i ekstrahovana EtOAc (3 × 25 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani pomoću 1 N HCl (3 × 20 mL) i slanim rastvorom (50 mL) i osušeni iznad Na2SO4. Rastvarač je uklonjen, a dobijena bela čvrsta supstanca je direktno korišćena u sledećem koraku. LC-MS (ESI<+>) m/z 418.4 (M+H)<+>.

[0241] Korak 3. Metil 11-fluoro-14-metil-4-okso-4,5,6,7,13,14-heksahidro-1,15-etenopirazolo[4,3-f][1,4,8,10]benzoksatriazaciklotridecin-7-karboksilat (53C). U rastvor 53B (83 mg, 0.2 mmol) u DCM-u (5 mL) dodat je PPh3(263 mg,1.0 mmol), a zatim CBr4(332 mg, 1.0 mmol). Smeša je mešana na temperaturi okoline preko noći. Rastvarač je uklonjen i ostatak je ponovo rastvoren u DMF-u (5 mL), a zatim je dodat K2CO3(116.8 mg, 0.84 mmol). Smeša je zatim mešana na 80 °C do potpunog formiranja željenog proizvoda. Smeša je zatim razblažena sa EtOAc i isprana vodom. Organski sloj je osušen iznad Na2SO4i koncentrovan. Ostatak je prečišćen na koloni sa silicijum dioksidom (0-10%, MeOH/DCM) da se dobije 53C kao bela čvrsta supstanca (40 mg). LC-MS (ESI<+>) m/z 400.2 (M+H)<+>.

[0242] Korak 4. U 53C (20 mg, 0.05 mmol) je dodat NH3u rastvoru MeOH (7 N, 2 mL). Smeša je mešana na 60 °C preko noći. Rastvarač je uklonjen i ostatak je prečišćen na koloni sa silicijum dioksidom (0-10%, MeOH/DCM) da bi se dobio Primer 53 kao bež čvrsta supstanca (8 mg). LC-MS (ESI<+>) m/z 385.5 (M+H)<+>;<1>H NMR (300 MHz, Hloroform-d) δ 8.41 (s, 1H), 8.34 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 6.99 - 6.92 (m, 2H), 6.77 (dd, J = 6.2, 3.5 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.63 - 5.44 (m, 2H), 5.09 (dd, J = 11.0, 8.4 Hz, 1H), 4.38 (dd, J = 14.7, 11.0 Hz, 1H), 4.28 - 4.17 (m, 1H), 4.17 - 4.07 (m, 2H), 3.22 (s, 3H).

Primer 54.

[0243]

[0244] Primer 54 je dobijen korišćenjem postupka prikazanog na sledećoj shemi:

[0245] U rastvor Jedinjenja 53C (20 mg, 0.05 mmol) u MeOH (2 mL) je u porcijama dodat NaBH4(19 mg, 0.5 mmol). Smeša je mešana tokom 4 sata. Rastvarač je uklonjen i ostatak je prečišćen na koloni silicijum dioksida (0-10%, MeOH/DCM) da bi se dobio željeni proizvod kao bela čvrsta supstanca (8 mg). LC-MS (ESI<+>) m/z 372.5 (M+H)<+>;<1>H NMR (300 MHz, Hloroform-d) δ 8.39 (s, 1H), 8.32 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.01 - 6.85 (m, 3H), 6.35 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.55 - 5.43 (m, 1H), 4.92 - 4.82 (m, 1H), 4.09 - 3.98 (m, 2H), 3.80 - 3.70 (m, 3H), 3.23 (s, 3H).

Primer 93.

[0246]

[0247] Korak 1. U rastvor terc-butil (R)-(2-hidroksipropil)karbamata (1.00 g, 5.71 mmol) i tozil hlorida (1.14 g, 6.00 mmol) u DCM-u (29 mL) dodat je trietilamin (1.44 g, 14.28 mmol i smeša je mešana na sobnoj temperature tokom 48 sati. Reakcioni rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (ISCO sistem, silicijum dioksid (40 g), 0-20% etil acetat u heksanu) da bi se dobio (R)-1-((terc-butoksikarbonil)amino)propan-2-il 4-metilbenzensulfonat (1.12 g, 3.40 mmol, 59.54% prinos).

[0248] Korak 2. U rastvor A8 (100.00 mg, 0.290 mmol) i (R)-1-((tercbutoksikarbonil)amino)propan-2-il 4-metilbenzensulfonata (143.50 mg, 0.436 mmol) u DMF-u (1.45 mL) dodat je K2CO3(200.7 mg, 1.45 mmol) i zagrevan je na 80 °C uz mešanje tokom 16 sati. Reakcija je ohlađena do temperature okoline i razblažena sa DCM (3 mL), filtrirana kroz špric filter i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija (ISCO sistem, silicijum dioksid (12 g), 0-60% etil acetat u heksanu) dala je 93A (32.90 mg, 0.0656 mmol, 22.59% prinos).

[0249] Korak 3. U rastvor 93A (32.90 mg, 0.0656 mmol) u MeOH (3 mL) i THF (2 mL) dodat je vodeni rastvor LiOH (2M, 2 mL) na temperaturi okoline. Reakcioni rastvor je zagrevan na 70 °C tokom 2 sata. Reakcioni balon je ohlađen do temperature okoline, razblažen vodom i metanolom, a zatim kvenčovan vodenim rastvorom HCl (2 M, 2 mL) do pH <5. Smeša je ekstrahovana sa DCM (3 × 5 mL), osušena sa Na2SO4, koncentrovana pod redukcionim uslovima i osušena u visokom vakuumu preko noći. U rastvor kiselog proizvoda u DCM (4 mL) dodata je 4 M HCl u 1,4-dioksanu (2.0 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom i osušena u visokom vakuumu. U rastvor de-Boc proizvoda i FDPP (27.62 mg, 0.0719 mmol) u DMF-u (1.6 mL) dodata je Hunigova baza (42.23 mg, 0.327 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana 2.5 sata, a zatim je reakcija kvenčovana 2 M rastvorom Na2CO3(2 mL). Smeša je mešana tokom 15 min zatim ekstrahovana sa DCM (4 × 10 mL). Kombinovani ekstrakti su osušeni pomoću Na2SO4i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (ISCO sistem, silicijum dioksid (12 g), 0-10% metanol u dihlorometanu) da bi se dobio 93 (10.1 mg, 0.0284 mmol, 43.49% prinos za tri koraka).

Primeri 104, 106 i 107

[0250]

[0251] Korak 1. U rastvor A17·HCl (38 mg, 0.096 mmol) i terc-butil (2-hloroetil)karbamata (12.9 mg, 0.072 mmol) u DMF-u (0.5 mL) dodat je K2CO3(33.1 mg, 0.24 mmol) i zagrevan na 80 °C uz mešanje tokom 1.5 sata. Reakcija je ohlađena do temperature okoline i razblažena sa DCM (3 mL), filtrirana kroz špric filter i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija (ISCO sistem, silicijum dioksid (12 g), 0-60% etil acetat u heksanu) dala je 104A (20.8 mg, 0.0413 mmol, 86.3% prinos).

[0252] Korak 2.104 je dobijen prema Opštm postupku C iz 104A kao bela čvrsta supstanca.

[0253] Korak 3. U rastvor 104 (4.6 mg, 0.0129 mmol) u DCM-u (0.3 mL) dodat je metil 3-hlorobenzoperoksoat (2.2 mg, 0.0129 mmol) i reakcija je mešana tokom 20 minuta a zatim je dodat zasićeni rastvor NaHCO3(3 mL) i ekstrahovan pomoću DCM (4 × 4mL). Kombinovani ekstrakti su osušeni pomoću Na2SO4i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija (ISCO sistem, silicijum dioksid (12 g), 0-12.5% metanol u dihlorometanu) dala je 106 (0.5 mg, 10.4% prinos) i 107 (1.7 mg, 33.9% prinos).

[0254] Sledeći primeri su dobijeni korišćenjem postupaka analognih onima koji su ovde opisani posebno Opštih postupaka A, B i C kako su ovde opisani.

[0255] Dodatni primeri su dobijeni korišćenjem postupaka analognih onima opisanim gore.

Biološki Primer 1: Biohemijski testovi kinaze.

[0256] Inhibicija enzima MET/ALK/AXL/TRK-a može se meriti Omnia (Invitrogen Inc.) kontinuiranim fluorometrijskim testom. Reakcije su izvedene u zapreminama od 50 µL u pločama sa 96-bunarića na 30 °C. Smeše sadrže 1 nM domena humane rekombinantne ciljajuće kinaze, 2 µM fosfoakceptorskog pepida, testirano jedinjenje (11-doza, 3-struka serijska razblaženja, 2% DMSO finalni) ili samo DMSO, 0.2 mM DTT i 10 mM MgCl2u 20 mM Hepes, pH 7.5, a reakcije se započinju dodavanjem ATP-a (100 µM konačne koncentracije) nakon 20 min prethodne inkubacije. Početne brzine formiranja fosfopeptida mere se tokom 20 min korišćenjem čitača mikroploče Tecan Safire sa podešavanjem talasne dužine od 360 nm za ekscitaciju i 485 nm za emisiju. Vrednosti Kise izračunavaju tako što se podaci uklapaju u jednačinu za kompetitivnu inhibiciju korišćenjem metode nelinearne regresije (GraphPad Prism, GraphPad Software, San Dijego, CA).

Biološki Primer 2: ELISA testovi fosforilacije ćelijske kinaze

[0257] Eksperimenti su izvedeni na osnovu procedura opisanih u publikaciji (Christensen, J. i sarad., "Cytoreductive antitumor activity of PF-2341066, a novel inhibitor of anaplastic lymphoma kinase and c-Met, in experimental models of anaplastic large-cell lymphoma", Mol. Cancer Ther.2007, 6 (12): 3314-3322.) Svi eksperimenti se rade pod standardnim uslovima (37 °C i 5% CO2). IC50vrednosti su izračunate prilagođavanjem krive koncentracija/odgovor korišćenjem četvoroparametarske metode bazirane na Microsoft Excel-u. Ćelije su zasejane u ploče sa 96-bunarića u medijumu sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i prenete u medijum bez seruma [sa 0.04% goveđeg serumskog albumina (BSA)] posle 24 h. U eksperimentima koji istražuju ligand-zavisnu RTK fosforilaciju, dodaju se odgovarajući faktori rasta do 20 min. Posle inkubiranja ćelija sa inhibitorom u trajanju od 1 sat i/ili odgovarajućim ligandima tokom naznačenih vremena, ćelije se jednom isperu sa HBSS sa dodatkom 1 mmol/L Na3VO4, a iz ćelija se generišu proteinski lizati. Nakon toga, fosforilacija odabranih proteinskih kinaza se procenjuje pomoću sendvič ELISA metode korišćenjem specifičnih antitela za hvatanje za oblaganje ploča sa 96-bunarića i antitela za detekciju specifičnog za fosforilisane ostatke tirozina. Ploče obložene antitelima su (a) inkubirane u prisustvu proteinskih lizata na 4 °C preko noći, (b) isprane sedam puta u 1% Tween 20 u PBS-u, (c) inkubirane u antitelu protiv ukupnog fosfotirozina konjugovanom sa ren peroksidazom (PY-20) (1:500) tokom 30 min, (d) ponovo isprane sedam puta, (e) inkubirane u supstratu 3,3,5,5-tetrametilbenzidin peroksidaze (Bio-Rad) da bi se pokrenula kolorimetrijska reakcija koja je zaustavljena dodavanjem 0.09 N H2SO4i (f) merena je apsorpcija na 450 nm korišćenjem spektrofotometra. Ćelijske linije koje se koriste za pojedinačne kinaze uključuju A549 za MET, Karpas 299 za ALK, 293-AXI, za AXL, PAET RKA za TRKA i PAE-TRKB za TRKB.

Biološki primer 3: Testovi vezivanja kinaze.

[0258] Testovi vezivanja kinaze su izvedeni na DiscoveRx korišćenjem opšteg KINOMEscan KdProtokola (Fabian, M. A. i sarad., "A small molecule-kinase interaction map for clinical kinase inhibitors," Nat. Biotechnol. 2005, 23(3):329-36). Za većinu testova, sojevi T7 faga označeni kinazom su dobijeni u domaćinu E. coli koji je izveden iz soja BL21. E. coli su uzgajane do log-faze i inficirane T7 fagom i inkubirane uz mućkanje na 32°C do lize. Lizati su centrifugirani i filtrirani da bi se uklonili ćelijski ostaci. Preostale kinaze su proizvedene u ćelijama HEK-293 i potom označene sa DNK za qPCR detekciju. Magnetne perle obložene streptavidinom tretirane su biotinilovanim ligandima malih molekula tokom 30 minuta na sobnoj temperature da bi se stvorile afinitetne smole za testove kinaze. Perle sa ligandom su blokirane viškom biotina i isprane puferom za blokiranje (SeaBlock (Pierce), 1% BSA, 0.05% Tween 20, 1 mM DTT) da bi se uklonio nevezani ligand i smanjilo nespecifično vezivanje. Reakcije vezivanja su sastavljene kombinovanjem kinaza, afinitetnih perli sa ligandom i test jedinjenjima u 1x puferu za vezivanje (20% SeaBlock, 0.17x PBS, 0.05% Tween 20, 6 mM DTT). Sve reakcije su izvedene u polistirenskim pločama sa 96-bunarića u konačnoj zapremini od 0.135 mL. Ploče za testove su inkubirane na sobnoj temperaturi uz mućkanje tokom 1 sata i afinitetne perle su isprane puferom za ispiranje (1× PBS, 0.05% Tween 20). Perle su zatim ponovo suspendovane u puferu za eluiranje (1× PBS, 0.05% Tween 20, 0.5 µM nebiotinilovani afinitetni ligand) i inkubirane na sobnoj temperaturi uz mućkanje 30 minuta. Koncentracija kinaze u eluatima je merena pomoću qPCR. Rezultati za jedinjenja testirana u ovom testu su predstavljeni u Tabeli 2. Sa ovom metodom, Primer 20 je takođe imao afinitet vezivanja za PLK4 kinazu (Kd2.9 nM).

Tabela 2.

Biološki Primer 4: Test Ba/F3 ćelijske proliferacije.

[0259] Tesovi proliferacije ćelija TRKA Ba/F3 su izvedeni pomoću ACD (Advanced Cellular Dynamics). Ba/F3 ćelijske linije su održavane u medijumu kulture RPMI-1640 koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma i antibiotike. Ćelije u logaritamskoj fazi rasta su sakupljane i 5,000 ćelija je raspoređeno u svaki bunarić ploče sa 384-bunarića u 50 µL medijuma za rast. Pedeset nanolitara razblaženog jedinjenja je dodato u odgovarajuće bunariće, u duplikatu, i ćelije su kultivisane tokom 48 sati na 37°C u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2. Vijabilnost je određena dodavanjem 15 µL CellTiter-Glo i merenjem luminescencije, koja je prijavljena kao relativne svetlosne jedinice (RLU) merene u brojanjima u sekundi. Podaci (RLU) za svako jedinjenje su normalizovani na prosečni maksimalni odgovor dobijen u prisustvu samog nosača (DMSO). Ovi podaci su korišćeni za izvođenje procenta inhibicije (100 - % maksimalnog odgovora) i prosek od dve tačke podataka/koncentracija je korišćen za izračunavanje IC50vrednosti (koncentracija koja izaziva polovinu od maksimalne inhibicije ćelijskog preživljavanja) nelinearnom regresivnom analizom koristeći softver GraphPad Prism (GraphPad, Inc., San Dijego, CA). Ovim postupkom, Primer 20 inhibirao je ćelijsku proliferaciju TRKA Ba/F3 ćelija sa IC50od 3.0 nM. Podaci za jedinjenja testirana u ovom testu su predstavljeni u Tabeli 3. Biološki Primer 5: Test stvaranja stabilne ćelijske linije EML4-ALK Ba/F3 i ćelijske proliferacije.

[0260] Gen divljeg tipa EML4-ALK (varijanta 1) je sintetisan u GenScript i kloniran u pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro plazmid (Sistem Biosciences, Inc). Ba/F3-EML4-ALK ćelijska linija divljeg tipa je generisana inficiranjem Ba/F3 ćelija lentivirusom koji sadrži EML4-ALK široki tip. Stabilne ćelijske linije su odabrane tretmanom puromicinom, nakon čega je usledilo povlačenje IL-3. 5000 ćelija je zasejano u belu ploču sa 384 bunarića preko noći pre tretmana jedinjenjem. Ćelijska proliferacija je merena korišćenjem testa detekcije ATP-a baziranog na luciferazi CellTiter-Glo (Promega) prema protokolu proizvođača nakon 48 sata inkubacije različitih koncentracija jedinjenja. Određivanja IC50su obavljena korišćenjem softvera GraphPad Prism (GraphPad, Inc., San Dijego, CA.). Podaci za jedinjenja testirana u ovom testu su predstavljeni u Tabeli 3.

Biološki Primer 6: Testovi ćelijske proliferacije.

[0261] Ćelije kolorektalne ćelijske linije KM 12 (sadrže endogeni TPM3-TRKA fuzioni gen) su gajene u kulturi medijuma DMEM, dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma i 100 U/mL penicilin/streptomicina. 5000 ćelija je zasejano u belu ploču sa 384 bunarića tokom 24 sata pre tretmana jedinjenjima. Ćelijska proliferacija je merena korišćenjem testa detekcije ATP-a baziranog na luciferazi CellTiter-Glo (Promega) prema protokolu proizvođača nakon 72 sata inkubacije. Određivanja IC50su obavljena korišćenjem softvera GraphPad Prism (GraphPad, Inc., San Dijego, CA).

[0262] Alternativno: Ćelije kolorektalne ćelijske linije KM12 (sadrže endogeni TPM3-TRKA fuzioni gen) su kultivisane u DMEM medijumu, dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma i 100 U/mL penicilin/streptomicina. Ćelije esencijalne SET-2 ćelijske linije trombocitemije (sadrže endogenu JAK2 V618F tačkastu mutaciju) ili ćelijska linija T ćelijskog limfoma Karpas-299 (sadrži endogeni NPM-ALK fuzioni gen) su kultivisane u RPMI medijumu, dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma i 100 U/mL penicilin/streptomicina.5000 ćelija je zasejano u belu ploču sa 384 bunarića tokom 24 sata pre tretmana jedinjenjem. Ćelijska proliferacija je merena korišćenjem testa detekcije ATP-a baziranog na luciferazi CellTiter-Glo (Promega) prema protokolu proizvođača nakon 72 sata inkubacije. Određivanja IC50su obavljena korišćenjem softvera GraphPad Prism (GraphPad, Inc., San Dijego, CA).

[0263] Podaci za jedinjenja testirana u ovim testovima su predstavljeni u Tabeli 3.

Tabela 3

EML4-ALK Ba/F3 ćeliijska prolif. prolif. ćeliijska prolif. ćeliijska prolif.

Pr. KM 12 SET2 ćeliijska Karpas 299 EML4-ALK Ba/F3 ćeliijska prolif. prolif. ćeliijska prolif. ćeliijska prolif.

Biološki Primer 7: Studije ćelijskog mehanizma delovanja TRKA i testovi fosforilacije nishodnih signalnih meta.

[0264] Ćelije kolorektalne ćelijske linije KM 12 (sadrže endogeni TPM3-TRKA fuzioni gen) su kultivisane u DMEM medijumu, dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma i 100 U/mL penicilin/streptomicina. Milion ćelija je zasejano na ploči sa 6-bunarića tokom 24 sata pre tretmana jedinjenjima. Ćelije su isptrane sa 1xPBS i sakupljene nakon 5 sati tretmana i lizirane u RIPA puferu (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% Deoksiholat, 0.1% SDS) sa dodatkom 10 mM EDTA, inhibitorima Halt proteaze i fosfataze (Thermo Scientific). Proteinski lizati (20 µg) su rastvoreni na 4-12% Bolt Bis-Tris gotovim gelovima sa MES radnim puferom (Life Technologies), preneti na nitrocelulozne membrane korišćenjem Trans-Blot Turbo Transfer Sistema (Bio-Rad) i detektovani antitelima koja ciljaju fosfolrilisani TRK A (Tehnologija ćelijske signalizacije, Y496, Y680, Y681, klon C50F3; 1:1000 razblaženje), ukupni TRK A (Santa Cruz Biotechnology, sc-11; klon C-14, 1:2000 razblaženje), fosfolrilisani AKT (Ćelijska signalizacija, S473, D9E, #9271; 1:5000 razblaženje), ukupan AKT (Tehnologija ćelijske signalizacije, 40D4; 1:2000 razblaženje), fosforilisani ERK (Tehnologija ćelijske signalizacije, Thr 202/204, D13.14.4E, #4370; 1:2000 razblaženje), ukupan ERK (Tehnologija ćelijske signalizacije,; 1:1000 razblaženje) i Tubulin (Sigma, T4026, 1:5000 razblaženje). Antitela su uglavnom inkubirana preko noći na 4 °C uz lagano mućkanje, praćeno ispiranjem i inkubacijom sa odgovarajućim HRP-konjugovanim sekundarnim antitelima. Membrane su izložene hemiluminiscentnom supstratu tokom 5 min na sobnoj temperaturi (SuperSignal West Femto, Thermo Scientific). Slike su dobijene pomoću C-Digit Imaging Sistema (LI-COR Biosciences). Relativna gustina traka dobijena je direktno preko Image Studio Digits od LICOR. Vrednosti polovine inhibitorne koncentracije (IC50) su izračunate korišećnjem nelinearne regresione analize preko GraphPad Prism softvera (GraphPad, Inc., San Dijego, CA). Ovim postupkom, Primer 20 inhibirao je autofosforilaciju TPM3-TRKA sa IC50od 1.07 nM i fosforilaciju njegovih nishodno regulisanih signalnih meta AKT i ERK sa IC50od 2.80 nM i 2.00 nM, redom, u KM12 ćelijama.

Biološki Primer 8: Testovi aktivnosti kaspaze.

[0265] Ćelije KM12 su održavane u DMEM medijumu sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma i antibiotika. 500,000 ćelija je zasejano u pločama sa 12-bunarića i različite koncentracije jedinjenja su uvedene tokom 72 sata. Za tretman staurosporinom, 500 nM STS je dodato u vremenu od 60 sati i inkubacijom od 12 sati kao pozitivnom kontrolom. Sve ćelije su sakupljene i isprane sa 1xPBS dva puta a zatim lizirane u puferu za lizu (20mM HEPES, 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM EDTA, 1% NP40) sa dodatkom inhibitora Halt proteaze i fosfataze (Thermo Scientific). Za testove kaspaze, oko 20 µL (20 µg) ćelijskog lizata je inkubirano sa 20 µL kaspaze 3 glo reagensa (Promega), mereći aktivnost enzima oslobađanjem luminescencije nakon 20 min inkubacije na 37°C. Za vestern blot, ćelijski lizati su kuvani i analizirani pomoću SDS-PAGE/imunoblotinga korišćenjem PARP, ili antitela na aktin. Ovim postupkom, Primer 20 je indukovao apoptozu ćelija KM 12.

Claims (11)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje koje ima formulu
2. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za primenu u lečenju kancera ciljanjem proteina ili tirozin kinaze odabrane iz grupe koja se sastoji od ALK, ROS1, AXL, TRK-a i JAK-a. 2. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 1, koje ima formulu
3. 3. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu primena u lečenju kancera obuhvata ciljanje ALK.
4. 4. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu primena u lečenju kancera obuhvata ciljanje ROS1.
5. 5. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu primena u lečenju kancera obuhvata ciljanje AXL.
6. 6. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu primena u lečenju kancera obuhvata ciljanje TRK.
7. 7. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je TRK odabrana od TRKA, TRKB i TRKC.
8. 8. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu primena u lečenju kancera obuhvata ciljanje JAK.
9. 9. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je JAK odabrana od JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2.
10. 10. Jedinjenje za primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je kancer odabran iz grupe koja se sastoji od kancera pluća, kancera debelog creva, kancera dojke, kancera prostate, hepatocelularnog karcinoma, karcinoma bubrežnih ćelija, kancera želuca i kancera jednjaka-želuca, glioblastoma, kancera glave i vrata, inflamatorno miofibroblastičnih tumora i anaplastičnog limfoma velikih ćelija.
11. 11. Jedinjenje za primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je kancer kancer pluća ili nesitnoćelijski kancer pluća. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5