CN110950889B - 一种多靶点激酶抑制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或异构体，及其在制备用来治疗ALK介导的疾病的药物中的用途

Description

一种多靶点激酶抑制剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及具有多种激酶抑制活性的吡唑并[1，5-a]嘧啶大环衍生物、其制备方法、其药物组合物，还涉及这类化合物及其药物组合物治疗受益于这些激酶抑制的疾病的用途。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康及生命一类疾重大疾病，尤其是癌症近几年的发病率及死亡率呈快速上升趋势，己超越心血管疾病成为人类健康的头号杀手.
肿瘤的増殖、凋亡、转移等与细胞内外的一系列信号传导通路中某个环节的异常密切相关。在这些信号传导途径中，一类重要的分子就是蛋白质激酶.蛋白激酶活性的异常不仅与肿瘤直接相关，也是导致一系列其他与炎症或増殖反应有关的人类疾病，例如类风湿性关节炎、心血管和神径系统疾病、哮喘、银屑病等的主要原因.目前己知有四百多种人类疾病与蛋白激酶直接或间接相关，这使得蛋白激酶成为一大类重要药物靶标。
之前的研究表明，间变性淋巴瘤激酶(ALK)是一种受体酪氨酸激酶，属于胰岛素受体超家族中的一员.ALK是一种跨膜蛋白，其中央部位具有跨膜区域，N端具有胞外区域，C端具有胞内酪氨酸激酶区域.ALK在发育中神经系统的分离区域正常表现，ALK mRNA在小肠中表达，大脑、结肠、前列腺和睾丸中含量低；肺部未检出；人类视网膜中检测到ALK蛋白质.ALK基因可以与多种蛋白基因发生融合，表达产生ALK蛋白；也可产生突变、扩增等变异.在1997年，首次描述了异生性大细胞淋巴瘤上染色体2的短臂上的致癌性ALK基因重组，之后，在其他恶性肿瘤也有发现，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤以及恶性组织球增多症，还有多种实质肿瘤也有发现，包括炎性肌纤维母细胞瘤、食道鳞状上皮细胞癌、神经母细胞瘤以及非小细胞肺癌(NSCLC)等。
2007年首次报道ALK基因可通过与EML4基因形成融合基因来编码产生ALK，从而促进肺癌细胞生长.EML4-ALK融合由2号染色体短臂插入引起，迄今已发现多种变异类型.在一般的非小细胞肺癌患者中，EML4-ALK融合基因阳性率较低，约为3％～7％左右。EML4-ALK融合基因主要见于不吸烟肺腺癌，且与EGFR突变和KRAS突变相互排斥。2010年报告的一项研究显示，在中国肺腺癌患者中，EML4-ALK融合基因阳性率明显高于欧美患者，为16.13％(10/62例)；非吸烟肺腺癌中，其阳性率为19.23％(10/52例)；缺乏EGFR和KRAS突变的肺腺癌中，其突变率高达42.8％(9/21例).
美国辉瑞公司(Pfizer)的XALKORI(Crizotinib、PF-02341066)于2011年11月被美国食品药品管理局(FDA)批准上市，是第一个上市的ALK抑制剂非小细胞肺癌靶向药物.其疗效显著，但和其它靶向药物类似，患者用药大约10个月后会产生耐药性.耐药性产生的机理主要有：靶基因的放大与过表达、信号通路改变、继发突变。之后相继有Ceritinib、Alectinib、Brigatinib批准上市，它们对野生型和继发突变ALK激酶都有更高的活性，但同时又有新的突变如溶剂前沿突变G1202R等产生.
原肌球蛋白相关受体酪氨酸激酶(TRKs)是一类重要的跨膜蛋白，是神经营养因子的高亲和力配体，在神经细胞的存活、增殖、分化、迁移、凋亡以及学习和记忆等高级功能中都扮演着重要角色.然而TRK在胞外区域开始克隆为与原肌球蛋白基因融合的癌基因.染色体重排或NTRK1(TRKA)突变造成的活化突变在乳头状和髓样甲状腺癌、非小细胞肺癌中都有发现.由于TRKs在痛觉及肿瘤细胞的存活、增殖等信号通路中起着重要作用，因此TRK抑制剂可应用于治疗疼痛和癌症。目前还没有TRK抑制剂被批准上市，各项目基本都处于临床或临床前的研究阶段，如Entrectinib、Larotrectinib等。
ROS1激酶是一种受体酪氨酸激酶，与ALK/LTK及胰岛素受体激酶家族密切相关.虽然ROS1激酶的正常生理功能尚未完全研究清楚，但是其异常表达和持续产生活化的不同融合蛋白形式，在许多癌症中都有发现，如胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、胆管癌、卵巢癌、胃腺癌、结直肠癌、炎性肌纤维母细胞瘤、血管肉瘤、上皮样血管内皮瘤等.FIG-ROS1融合蛋白是第一个被发现的ROS1融合蛋白，于2003年在多形性胶质母细胞瘤中被发现.在肺癌中发现了ROS1与多种蛋白发生融合，包括TMP3、SDC4、SLC34A2、CD74、EZR和LRIG3等，表明ROS1激酶在肺癌中是一种致癌因素.之后在不同的癌症中发现了越来越多种的ROS1融合蛋白，如KDELR2、CCDC6、MSN等近二十种.临床试验表明，ALK/MET/ROS1多靶点抑制剂Crizotinib对ROS1表达异常的癌症患者有显著疗效.与其它靶向药物同样，患者在用药一段时间后也出现了基于继发突变如ROS1G2032R以及旁路信号激活造成的耐药.综上所述，ROS1激酶是治疗许多ROS1蛋白激酶活性异常的癌症的可靠靶标。目前尚且没有针对ROS1的抑制剂被批准上市，各项目基本都处于临床或临床前的研究阶段，如Crizotinib、Lorlatinib、TPX-0005等。
多靶点抑制剂不仅会有更加广泛的适应症，而且可以期待对多个信号通路的抑制而减少因旁路信号激活造成的耐药。
本发明提供的取代的喹啉酮类化合物具有非常好的多靶点抑制活性，其活性与进入I期临床的多靶点激酶抑制剂TPX-0005的活性相当或更优，并且具有非常好的体内代谢水平，有望成为更合适的多靶点抑制剂类药物.
发明概述
本发明提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或异构体，
Figure BSA0000171399190000021
其中，
R1选自H和C1-6烷基，所述C1-6烷基可任选地被1-2个羟基取代；
Ar选自苯基和吡啶基，所述苯基和吡啶基可任选地被1-2个氟取代；
L1选自C1-3亚烷基和
Figure BSA0000171399190000031
所述亚烷基可任选地被C1-6烷基取代，所述
Figure BSA0000171399190000032
可任选地被1-2个氟取代；
在一些实施方式中，所述
Figure BSA0000171399190000033
为
Figure BSA0000171399190000035
L2选自C2-6亚烷基，所述亚烷基可任选地被1-2个C1-3烷基取代
根据本发明的一些实施方式，本发明的式(I)化合物为：
Figure BSA0000171399190000034
Figure BSA0000171399190000041
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或异构体；
本发明的式(I)化合物可以用于治疗ALK介导的疾病；在一些实施方式中，所述ALK介导的疾病为非小细胞肺癌、间变性大细胞淋巴瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、鼻咽癌、乳腺癌、结直肠癌、弥漫大B细胞淋巴瘤、全身组织细胞增生症和神经母细胞瘤等，优选为ALK阳性的非小细胞肺癌；
本发明另一方面还涉及药物组合物，其包含本发明的式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或异构体，以及药学上可接受的载体；
在另一方面，本发明提供了治疗ALK介导的疾病的方法，所述方法包含给对象施用有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或异构体、或者上述组合物；在一些实施方式中，所述ALK介导的疾病为非小细胞肺癌、间变性大细胞淋巴瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、鼻咽癌、乳腺癌、结直肠癌、弥漫大B细胞淋巴瘤、全身组织细胞增生症和神经母细胞瘤等，优选为ALK阳性的非小细胞肺癌；
在本发明的一些实施方式中，本发明涉及的所述对象为包括人类的哺乳动物.
在另一方面，本发明提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或异构体、或者上述组合物在制备用来治疗ALK介导的疾病的药物中的用途；在一些实施方式中，所述ALK介导的疾病为非小细胞肺癌、间变性大细胞淋巴瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、鼻咽癌、乳腺癌、结直肠癌、弥漫大B细胞淋巴瘤、全身组织细胞增生症和神经母细胞瘤等，优选为ALK阳性的非小细胞肺癌.
发明详述
在下文的发明详述中陈述了利用本发明原理的示例性实施方式.通过参考以下发明内容可更好地理解本发明的特征和优点.
应理解本发明各个方面的保护范围由权利要求书决定，并且这些权利要求范围内的方法和结构以及其等价的方法和结构均在本权利要求书涵盖的范围之内.
除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同.除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利申请、公开材料通过引用方式整体并入本文。
应理解，上述简述和下文的详述都是示例性的、解释性的，而不是对任何本发明主题的限制。除非另有具体说明，否则使用单数形式时也包括复数.除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”.此外，所用术语“包括”以及其它形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性。
某些化学术语
术语“任选”、“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生也可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况.例如，“任选取代的烷基”表示“未取代的烷基”或“取代的烷基”。并且，任选取代的基团可以是未取代的(例如：-CH2CH3)、完全取代的(例如：-CF2CF3)、单取代的(例如：-CH2CH2F)或者介于单取代和完全取代之间的任意层级(例如：-CH2CHF2、-CF2CH3、-CFHCHF2等).本领域技术人员可理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，不会引入任何在空间上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式.
除非另有说明，否则采用本领域技术范围内的常规方法，如质谱、核磁、高效液相色谱、红外和紫外/可见光谱法和药理学方法.除非提出具体定义，否则本文在分析化学、有机合成化学以及药物和医药化学的有关术语以及实验步骤和技术是本领域已知的。可在化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送、以及对患者的治疗中使用标准技术.例如，可利用厂商对试剂盒的使用说明，或者按照本领域公知的方式或本发明的说明来实施反应和进行纯化.通常可根据本说明书中引用和讨论的多个概要性和较具体的文献中的描述，按照本领域熟知的常规方法实施上述技术和方法.在本说明书中，可由本领域技术人员选择基团及其取代基以提供稳定的结构部分和化合物.
当通过从左向右书写的常规化学式描述取代基时，该取代基也同样包括从右向左书写结构式时所得到的在化学上等同的取代基.举例而言，-CH2O-等同于-OCH2-.
本文所用术语“基团”、“化学基团”是指分子的一个特定的部分或官能团.化学基团经常被认作为嵌入或附加到一个分子中的化学实体.
一些在此命名的化学基团可以用简略记号表示碳原子的总个数。例如，C1-C6烷基描述了一个烷基基团，如下定义的那样，具有总共1到6个碳原子.简略记号所示碳原子总个数不包括可能的取代基上的碳原子.
本文单独或作为其它组分的一部分(比如：单烷基氨基)使用的术语“烷基”是指任选取代的直链或任选取代的支链的一价饱和烃，其具有1-12个碳原子，优选1-8个碳原子，更优选1-6个碳原子，通过单键与分子的其它部分相连，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、2-甲基己基、3甲基己基、正辛基，正壬基、正癸基等.
本文单独或组合使用的术语“亚烷基”是指由上述定义的一价烷基衍生的二价基团。实例包括但不限于亚甲基(-CH2)、亚乙基(-CH2CH2)、亚丙基(-CH2CH2CH2)和异亚丙基(-CH(CH3)CH2)等.
本发明使用的术语“多晶型物”或“多晶型(现象)”是指本发明的化合物具有多种晶格形态.本发明的一些化合物可能有一个以上的晶体形式，本发明涵盖所有的多晶型态或其混合物。
本发明化合物的中间体化合物及其多晶形物也在本发明的范围内.
除非另有指定，本发明化合物所含有的烯烃双键包括E和Z异构体.
应理解，本发明化合物可能含有不对称中心.这些不对称中心可以独立的为R或S构型.一些本发明化合物也可显示出顺-反异构现象，这对于本领域技术人员而言是显而易见的.应理解，本发明化合物包括它们的单独的几何异构体和立体异构体以及它们的混合物，包括外消旋混合物.通过实施或修改已知方法，例如层析技术和重结晶技术可以从它们的混合物中分离这些异构体，或者可以由它们的中间体的合适的异构体分别制备它们.
本文所用术语“药学上可接受的盐”既包括加酸盐，也包括加碱盐.
“药学上可接受的加酸盐”是指那些保留了化合物的游离碱的生物效力和特性、在生物学上或其它方面并非不合需要、跟元机酸，例如但是不限于，氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，或有机酸，例如但不限于，乙酸、2，2-二氯乙酸、已二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、癸酸、己酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸等形成的盐.“药学上可接受的加碱盐”是指那些保留了化合物的游离酸的生物效力和特性、在生物学上或其它方面并非不合需要的盐。这些盐通过游离酸跟无机碱或有机碱反应制备.通过跟无机碱反应生成的盐包括，但不限于，钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等.优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐、和锰盐.
形成盐的有机碱包括，但不限于，伯胺、仲胺、叔胺、环胺等，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、乙醇胺、二环己胺、乙二胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、胆碱和咖啡因等.特别优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因.
结晶经常产生本发明化合物的溶剂化物.本文所用术语“溶剂化物”是指由一个或多个本发明化合物分子和一个或多个溶剂分子组合而成的合体.
溶剂可以是水，这种情况下，溶剂化物是水合物。另外还可以是有机溶剂.因此，本发明化合物可作为水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、三水合物、四水合物等，以及相应的溶剂化形态。本发明化合物可以是真溶剂化物，但在其它一些情况下，本发明化合物也可能只是偶然保留了水或水跟一些其它溶剂的混合物。本发明化合物可在一种溶剂中反应或在一种溶剂中沉淀或结晶。本发明化合物的溶剂化物也包括在本发明的范围内.
本文所用术语“药物组合物”是指混合有本发明化合物和通常在本领域被接受的用来将具有生物活性的化合物传送给哺乳动物(比如人类)的介质的制剂。这种介质包含所有药学上可接受的载体.
本文所用的跟制剂、组合物或成分相关的术语“可接受的”是指对治疗主体的总体健康没有持续的有害影响.
本文所用术语“药学上可接受的”是指不影响本发明化合物的生物活性或性质的物质(如载体或稀释剂)，并且相对无毒，即该物质可施用于个体而不造成不良的生物反应或以不良方式与组合物中包含的任意组分相互作用.
“药学上可接受的载体”包括但不限于已经被相关政府行政部门批准的可以被用于人类和驯养动物的佐剂、载体、赋形剂、助剂、脱臭剂、稀释剂、保鲜剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂和润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、或乳化剂.
本文所用术语“主体”、“患者”、“对象”或“个体”是指患有疾病、紊乱或病症等的个体，包括哺乳动物和非哺乳动物.哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人，非人的灵长类动物(例如黑猩猩和其它猿类和猴)；家畜，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，例如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等.非人哺乳动物的实例包括但不限于鸟类和鱼类等.在本文提供的一个有关方法和组合物的实施方案中，所述哺乳动物为人。
本文所用术语“治疗”是指对哺乳动物特别是人类的相关疾病或病症的治疗，包括
(i)预防哺乳动物，特别是之前已经暴漏在某个疾病或病症下但尚未被诊断患有该疾病或病症的哺乳动物，产生相应的疾病或病症；
(ii)抑制疾病或病症，即，控制其发展；
(iii)缓解疾病或病症，即，使疾病或病症消退；
(iv)缓解疾病或病症引起的症状.
本文所用术语“疾病”和“病症”可以互相替代，也可以是不同意思，因为某些特定疾病或病症还没有已知的致病因子(所以发病原因尚不清楚)，所以还不能被认作疾病而只能被看做不想要的状况或综合症，所述综合症或多或少有一些具体症状已经被临床研究人员证实。
本文所使用术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”是指服用后足以在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一个或多个症状的至少一种药剂或化合物的量.其结果可以为迹象、症状或病因的消减和/或缓解，或生物系统的任何其它所需变化.例如，用于治疗的“有效量”是在临床上提供显著的病症缓解效果所需的包含本文公开化合物的组合物的量.可使用诸如剂量递增试验的技术测定适合于任意个体病例中的有效量.
本文所用术语“服用”、“施用”、“给药”等是指能够将化合物或组合物递送到进行生物作用的所需位点的方法.这些方法包括但不限于口服途径、经十二指肠途径、胃肠外注射(包括静脉内、皮下、腹膜内、肌内、动脉内注射或输注)、局部给药和经直肠给药.在优选的实施方案中，本文讨论的化合物和组合物通过口服施用。
本发明化合物的制备
本发明还提供了一种制备上述式化合物的方法，包括以下合成方案：
合成方案1：
Figure BSA0000171399190000071
化合物式1-5可以使用合成方案1合成。中间体1-1与N-Boc保护的氨基醇发生Mitsunobu反应得到中间体1-2。中间体1-2用碱将酯水解成酸得到中间体1-3.中间体1-3用酸脱去氨基上的Boc保护基得到中间体1-4.中间体1-4在缩合剂作用下发生分子内关环得到化合物1-5.
合成方案2：
Figure BSA0000171399190000072
最终化合物式2-1可以使用合成方案1合成.酰胺中间体1-5先与五氯化磷反应，再一锅法与羟胺或O-烷基取代的羟胺反应得到产物2-1.
上述合成方案只是列举了本发明中部分化合物的制备方法，按照本领域的公知技术，技术人员在上述合成方案的基础上，采用类似的方法也可合成本发明中的化合物.
下面的具体实施例，其目的是使本领域的技术人员能更清楚地理解和实施本发明.它们不应该被认为是对本发明范围的限制，而只是本发明的示例性说明和典型代表.本领域技术人员应该理解：还有形成本发明化合物的其它合成途径，下面提供的是非限制性的实施例.
凡涉及易氧化或易水解的原料的所有操作都在氮气保护下进行.除非另有说明，本发明使用的原料都是市场上直接买到未经进一步纯化直接使用的.
柱层析色谱采用青岛化工有限公司生产的硅胶(200-300目).薄层色谱采用E.Merck公司生产的预制板(硅胶60PF254，0.25毫米)。手性化合物分离和对映体过量值(ee)测定使用Agilent LC 1200series(柱子：CHIRALPAK AD-H，
Figure BSA0000171399190000081
x 250毫米，5微米，30℃).核磁共振色谱(NMR)使用Varian VNMRS-400核磁共振仪测定；液质连用(LC/MS)使用FINNIGAN Thermo LCQ Advantage MAX，Agilent LC 1200series(柱子：Waters SymmetryC18，
Figure BSA0000171399190000084
x50毫米，5微米，35℃)，采用ESI(+)离子模式.
实验部分
中间体1：5-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
Figure BSA0000171399190000082
5-氯吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯按照专利WO2017015367中实施例1的方法合成。
中间体2：(R)-5-(1-(5-氟-2-羟基苯基)乙基氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙 酯
Figure BSA0000171399190000083
(R)-5-(1-(5-氟-2-羟基苯基)乙基氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯按照专利WO2015112806A2中实施例A8的方法合成。
中间体3：5-氟-3-((2R，4S)-4-氟吡咯烷-2-基)-2-甲氧基吡啶
Figure BSA0000171399190000091
5-氟-3-((2R，4S)-4-氟吡咯烷-2-基)-2-甲氧基吡啶按照专利WO2017087778中实施例11的方法合成。
中间体4：(R)-5-(2-(5-氟-2-羟基苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲 酸乙酯
Figure BSA0000171399190000092
(R)-5-(2-(5-氟-2-羟基苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯按照专利WO2011006074中实施例86的方法合成.
中间体5：(4R)4-(叔丁基二甲基硅基氧基)-2-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡咯烷-1-甲 酸叔丁酯
Figure BSA0000171399190000093
(4R)-4-(叔丁基二甲基硅基氧基)-2-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯按照专利US8933084中第17页的方法合成.
中间体6：5-((2R，4S)-4-氟-2-(5-氟-2-羟基苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a] 嘧啶-3-甲酸乙酯
Figure BSA0000171399190000101
步骤1：(4R)-2-(5-氟-2-甲氧基苯基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
冰浴下，将四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M，100mL)缓慢滴加进中间体5(26.5g)的无水四氢呋喃(300mL)溶液中，然后去掉冰浴，升至室温搅拌2小时。减压浓缩，残余物溶于乙酸乙酯，水洗涤、干燥、浓缩，所得粗品经硅胶色谱分离(石油醚∶乙酸乙酯，15∶1)得产物17.5g.MS m/z[ESI]：312.16[M+1].
步骤2：(3R)-5-(5-氟-2-羟基苯基)吡咯烷-3-醇
将(4R)-2-(5-氟-2-甲氧基苯基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(15.6g)溶于无水二氯甲烷(300mL)中，冷却至0℃，然后缓慢滴加1M三溴化硼的二氯甲烷溶液(200mL)，然后去掉冰浴，升至室温搅拌1小时。冷却至0℃，滴加甲醇淬灭反应，有机相分别用饱和碳酸氢钠水溶液、水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得粗品直接用于下一步反应.MS m/z[ESI]：198.10[M+1]。
步骤3：(4R)-2-(5-氟-2-羟基苯基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将步骤2所得粗品溶于二氯甲烷(150mL)中，加入三乙胺(15mL)，然后冷却至0℃，加入二碳酸二叔丁酯(10.9g)，升至室温搅拌过夜.反应混合物分别用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得粗品经硅胶色谱(石油醚∶乙酸乙酯，15∶1)分离得产物9.5g。MS m/z[ESI]：298.15[M+1].
步骤4：(2R，4S)-4-氟-2-(5-氟-2-羟基苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将步骤3得到的(4R)-2-(5-氟-2-羟基苯基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(5.94g)溶于干燥的二氯甲烷(100mL)中，冷却至-78℃，然后缓慢滴加二乙胺基三氟化硫(3.55g)的二氯甲烷(22mL)溶液，-78℃下搅拌1小时，升至室温.有机相分别用饱和碳酸氢钠水溶液、水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物经硅胶色谱(石油醚∶乙酸乙酯，20∶1)分离得产物1.90g.MS m/z[ESI]：300.14[M+1].
步骤5：4-氟-2-((2R，4S)-4-氟吡咯烷-2-基)苯酚
将(2R，4S)-4-氟-2-(5-氟-2-羟基苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.50g)溶于二氯甲烷(30mL)中，加入氯化氢的二氧六环溶液(4M，10mL)，室温搅拌4小时.减压浓缩，向残留物中倒入饱和碳酸氢钠水溶液，乙酸乙酯萃取，萃取液用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得粗品经硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇，30∶1，+0.5％氨水)分离得产物800mg.MS m/z[ESI]：200.09[M+1].
步骤6：5-((2R，4S)-4-氟-2-(5-氟-2-羟基苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
将4-氟-2-((2R，4S)-4-氟吡咯烷-2-基)苯酚(800mg)、二异丙基乙基胺(1.55g)和中间体1(900mg)溶于正丁醇(30mL)中，加热至120℃搅拌过夜.冷却至室温，减压浓缩，向残留物中倒入乙酸乙酯和水，分液，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得粗品经硅胶柱色谱(石油醚∶乙酸乙酯，1∶1)分离得产物1300mg.MS m/z[ESI]：389.14[M+1].
中间体7：(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡唑 并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮
Figure BSA0000171399190000111
步骤1：5-((R)-1-(2-((S)-4-(叔丁氧羰基)氨基丁-2-基氧基)-5-氟苯基)乙基氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
0℃、氮气氛下，将偶氮二甲酸二异丙酯(280mg)的四氢呋喃(2mL)溶液滴加到三苯基膦(366mg)、(R)-3-羟基丁基氨基甲酸叔丁酯(285mg)和中间体2(400mg)的四氢呋喃(20mL)溶液中，10分钟滴加完毕。0℃下搅拌0.5小时，然后升至室温搅拌12小时。向反应液中加入乙酸乙酯和水，分液，有机相经饱和食盐水洗涤和无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，残留物经硅胶柱色谱(石油醚∶乙酸乙酯，3∶1)分离，得到产物544mg.MS m/z[ESI]：516.26[M+1].
步骤2：5-((R)-1-(2-((S)-4-(叔丁氧羰基)氨基丁-2-基氧基)-5-氟苯基)乙基氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
将一水合氢氧化锂(420mg)加到步骤1产物(520mg)的四氢呋喃/水(1∶1，10mL)溶液中，加热至50℃搅拌2小时，冷却至室温后，用饱和柠檬酸水溶液调pH至5-6。用乙酸乙酯萃取，萃取液经饱和食盐水洗涤和无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，残留物经硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇，30∶1)分离得到所需产物420mg。MS m/z[ESI]：488.23[M+1].
步骤3：5-((R)-1-(2-((S)-4-氨基丁-2-基氧基)-5-氟苯基)乙基氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
室温下，将步骤2产物(410mg)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入氯化氢的二氧六环溶液(4M，5mL)，室温搅拌4小时。减压浓缩，向残留物中倒入饱和碳酸氢钠水溶液，乙酸乙酯萃取，萃取液用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得粗品经硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇，15∶1)分离得产物300mg.MS m/z[ESI]：388.18[M+1].
步骤4：(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮
将步骤3的产物(194mg)、二异丙基乙基胺(194mg)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(188mg)加入N，N-二甲基甲酰胺(10mL)中，加热至50℃搅拌4小时。将反应液倾入水中，乙酸乙酯萃取，萃取液分别用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物经硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇，25∶1)分离后得到所需产物95mg.MS m/z[ESI]：370.17[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.77(1H，s)，8.29(1H，s)，8.14(1H，d，J＝7.6Hz)，7.04(1H，dd，J＝8.8Hz，2.8Hz)，6.82-6.87(2H，m)，6.46(1H，d，J＝7.2Hz)，6.19(1H，d，J＝7.6Hz)，5.80-5.90(1H，m)，4.72-4.77(1H，m)，3.90-3.98(1H，m)，3.50-3.58(1H，m)，2.10-2.17(2H，m)，1.49(3H，d，J＝6.8Hz)，1.36(3H，d，J＝6.4Hz)。
中间体8：(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3）-吡唑 并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮
Figure BSA0000171399190000121
(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮按照专利WO2015112806A2中实施例93的方法合成.
中间体9：(R，1aE，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮
Figure BSA0000171399190000122
(R，13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮按照专利WO2015112806A2中实施例51-1的方法合成。
中间体10：(R，13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮
Figure BSA0000171399190000131
(R，13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮按照专利WO2015112806A2中实施例76-1的方法合成.
中间体11：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮
Figure BSA0000171399190000132
步骤1：5-((2R，4S)-2-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体7中步骤1的合成方法，将(R)-3-羟基丁基氨基甲酸叔丁酯替换为2-羟基乙基氨基甲酸叔丁酯，中间体2替换为中间体6，得到所需产物.MS m/z[ESI]：532.24[M+1]。
步骤2：5-((2R，4S)-2-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤2的合成方法，将中间体7中步骤1的产物替换为中间体11中步骤1的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：504.21[M+1].
步骤3：5-((2R，4S)-2-(2-(2-氨基乙氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤3的合成方法，将中间体7中步骤2的产物替换为中间体11中步骤2的产物，得到所需产物。MS m/z[ESI]：404.16[M+1].
步骤4：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮
按中间体7中步骤4的合成方法，将中间体7中步骤3的产物替换为中间体11中步骤3的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：386.15[M+1].
中间体12：(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮
Figure BSA0000171399190000141
步骤1：5-((2R，4S)-2-(2-(((S)-1-((叔丁氧羰基)氨基)丙烷-2-基)氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体7中步骤1的合成方法，将(R)-3-羟基丁基氨基甲酸叔丁酯替换为(R)-2-羟基丙基氨基甲酸叔丁酯，中间体2替换为中间体6，得到所需产物.MS m/z[ESI]：546.25[M+1].
步骤2：5-((2R，4S)-2-(2-(((S)-1-((叔丁氧羰基)氨基)丙烷-2-基)氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤2的合成方法，将中间体7中步骤1的产物替换为中间体12中步骤1的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：518.22[M+1].
步骤3：5-((2R，4S)-2-(2-(((S)-1-氨基丙烷-2-基)氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤3的合成方法，将中间体7中步骤2的产物替换为中间体12中步骤2的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：418.17[M+1].
步骤4：(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮
按中间体7中步骤4的合成方法，将中间体7中步骤3的产物替换为中间体12中步骤3的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：400.16[M+1].
中间体13：(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮
Figure BSA0000171399190000151
步骤1：5-((2R，4S)-2-(2-(((S)-4-((叔丁氧羰基)氨基)丁烷-2-基)氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体7中步骤1的合成方法，将中间体2替换为中间体6，得到所需产物。MS m/z[ESI]：560.27[M+1].
步骤2：5-((2R，4S)-2-(2-(((S)-4-((叔丁氧羰基)氨基)丁烷-2-基)氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤2的合成方法，将中间体7中步骤1的产物替换为中间体13中步骤1的产物，得到所需产物。MS m/z[ESI]：532.24[M+1].
步骤3：5-((2R，4S)-2-(2-(((S)-4-氨基丁烷-2-基)氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤3的合成方法，将中间体7中步骤2的产物替换为中间体13中步骤2的产物，得到所需产物。MS m/z[ESI]：432.19[M+1].
步骤4：(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮
按中间体7中步骤4的合成方法，将中间体7中步骤3的产物替换为中间体13中步骤3的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：414.18[M+1].
中间体14：(13E，14E，22R，5S)-35-氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1， 5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮
Figure BSA0000171399190000161
步骤1：5-((R)-2-(2-(((S)-1-((叔丁氧羰基)氨基)丙烷-2-基)氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体7中步骤1的合成方法，将(R)-3-羟基丁基氨基甲酸叔丁酯替换为(R)-2-羟基丙基氨基甲酸叔丁酯，中间体2替换为中间体4，得到所需产物.MS m/z[ESI]：528.26[M+1].
步骤2：5-((R)-2-(2-(((S)-1-((叔丁氧羰基)氨基)丙烷-2-基)氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤2的合成方法，将中间体7中步骤1的产物替换为中间体14中步骤1的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：500.23[M+1]。
步骤3：5-((R)-2-(2-(((S)-1-氨基丙烷-2-基)氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤3的合成方法，将中间体7中步骤2的产物替换为中间体14中步骤2的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：400.18[M+1].
步骤4：(13E，14E，22R，5S)-35-氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮
按中间体7中步骤4的合成方法，将中间体7中步骤3的产物替换为中间体14中步骤3的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：382.17[M+1].
中间体15：(R，13E，14E)-35-氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2 (1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮
Figure BSA0000171399190000171
步骤1：(R)-5-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5-氟萃基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体7中步骤1的合成方法，将(R)-3-羟基丁基氨基甲酸叔丁酯替换为羟基乙基氨基甲酸叔丁酯，中间体2替换为中间体4，得到所需产物。MS m/z[ESI]：514.25[M+1]。
步骤2：(R)-5-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基乙氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤2的合成方法，将中间体7中步骤1的产物替换为中间体15中步骤1的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：486.22[M+1].
步骤3：(R)-5-(-2-(2-(2-氨基乙氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤3的合成方法，将中间体7中步骤2的产物替换为中间体15中步骤2的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：386.17[M+1]。
步骤4：(R，13E，14E)-35-氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮
按中间体7中步骤4的合成方法，将中间体7中步骤3的产物替换为中间体15中步骤3的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：368.15[M+1]。
中间体16：5-((2R，4S)-4-氟-2-(5-氟-2-羟基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并 [1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
Figure BSA0000171399190000172
步骤1：5-((2R，4S)-4-氟-2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体6中步骤6的合成方法，将4-氟-2-((2R，4S)-4-氟吡咯烷-2-基)苯酚替换为中间体3，得到所需产物.MS m/z[ESI]：404.16[M+1].
步骤2：5-((2R，4S)-4-氟-2-(5-氟-2-羟基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
室温下，将步骤1的产物(500mg)溶于二氯甲烷(2mL)中，加入氯化氢的二氧六环溶液(4M，6mL)，室温搅拌5小时.减压浓缩，向残留物中倒入饱和碳酸氢钠水溶液，乙酸乙酯萃取，萃取液用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得粗品经硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇，30∶1)分离得产物280mg.MS m/z[ESI]：390.14[M+1].
中间体17：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮
Figure BSA0000171399190000181
步骤1：5-((2R，4S)-2-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5-氟吡啶基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体7中步骤1的合成方法，将(R)-3-羟基丁基氨基甲酸叔丁酯替换为2-羟基乙基氨基甲酸叔丁酯，中间体2替换为中间体16，得到所需产物。MS m/z[ESI]：533.24[M+1]。
步骤2：5-((2R，4S)-2-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5-氟吡啶基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤2的合成方法，将中间体7中步骤1的产物替换为中间体17中步骤1的产物，得到所需产物。MS m/z[ESI]：505.21[M+1].
步骤3：5-((2R，4S)-2-(2-(2-氨基乙氧基)-5-氟吡啶基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤3的合成方法，将中间体7中步骤2的产物替换为中间体17中步骤2的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：405.16[M+1].
步骤4：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮
按中间体7中步骤4的合成方法，将中间体7中步骤3的产物替换为中间体17中步骤3的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：387.15[M+1].
中间体18：(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮
Figure BSA0000171399190000191
步骤1：5-((2R，4S)-2-(2-(((S)-1-((叔丁氧羰基)氨基)丙烷-2-基)氧基)-5-氟吡啶-3-基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体7中步骤1的合成方法，将(R)-3-羟基丁基氨基甲酸叔丁酯替换为(R)-2-羟基丙基氨基甲酸叔丁酯，中间体2替换为中间体16，得到所需产物.MS m/z[ESI]：547.25[M+1].
步骤2：5-((2R，4S)-2-(2-(((S)-1-((叔丁氧羰基)氨基)丙烷-2-基)氧基)-5-氟吡啶-3-基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤2的合成方法，将中间体7中步骤1的产物替换为中间体18中步骤1的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：519.22[M+1]。
步骤3：5-((2R，4S)2-(2-(((S)-1-氨基丙烷-2-基)氧基)-5-氟吡啶-3-基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤3的合成方法，将中间体7中步骤2的产物替换为中间体18中步骤2的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：419.17[M+1].
步骤4：(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮
按中间体7中步骤4的合成方法，将中间体7中步骤3的产物替换为中间体18中步骤3的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：401.16[M+1].
中间体19：5-(1-(5-氟-2-羟基吡啶-3-基)乙基氨基)吡唑[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙 酯
Figure BSA0000171399190000201
5-(1-(5-氟-2-羟基吡啶-3-基)乙基氨基)吡唑[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯按照专利WO2017004342中第120页的方法合成.
中间体20：(13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a] 嘧啶杂-4(3，2)-吡啶杂环壬烷-9-酮
Figure BSA0000171399190000202
步骤1：5-((1-(2-(2-((叔丁氧羰基）氨基)乙氧基)-5-氟吡啶-3-基)乙基)氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体7中步骤1的合成方法，将(R)-3-羟基丁基氨基甲酸叔丁酯替换为2-羟基乙基氨基甲酸叔丁酯，中间体2替换为中间体19，得到所需产物.MS m/z[ESI]：489.23[M+1].
步骤2：5-((1-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5-氟吡啶-3-基)乙基)氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤2的合成方法，将中间体7中步骤1的产物替换为中间体20中步骤1的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：461.20[M+1].
步骤3：5-((1-(2-(2-氨基乙氧基)-5-氟吡啶-3-基)乙基)氨基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤3的合成方法，将中间体7中步骤2的产物替换为中间体20中步骤2的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：361.14[M+1]。
步骤4：(13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(3，2)-吡啶杂环壬烷-9-酮
按中间体7中步骤4的合成方法，将中间体7中步骤3的产物替换为中间体20中步骤3的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：343.13[M+1].
中间体21：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮
Figure BSA0000171399190000211
步骤1：5-((2R，4S)-2-(2-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体7中步骤1的合成方法，将(R)-3-羟基丁基氨基甲酸叔丁酯替换为3-羟基丙基氨基甲酸叔丁酯，中间体2替换为中间体6，得到所需产物.MS m/z[ESI]：546.25[M+1].
步骤2：5-((2R，4S)-2-(2-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤2的合成方法，将中间体7中步骤1的产物替换为中间体21中步骤1的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：518.22[M+1].
步骤3：5-((2R，4S)-2-(2-(3-氨基丙氧基)-5-氟苯基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤3的合成方法，将中间体7中步骤2的产物替换为中间体21中步骤2的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：418.17[M+1].
步骤4：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮
按中间体7中步骤4的合成方法，将中间体7中步骤3的产物替换为中间体21中步骤3的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：400.16[M+1].
中间体22：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环壬烷-9-酮
Figure BSA0000171399190000221
步骤1：5-((2R，4S)-2-(2-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙氧基)-5-氟吡啶-3-基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体7中步骤1的合成方法，将(R)-3-羟基丁基氨基甲酸叔丁酯替换为3-羟基丙基氨基甲酸叔丁酯，中间体2替换为中间体16，得到所需产物.MS m/z[ESI]：547.25[M+1].
步骤2：5-((2R，4S)-2-(2-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙氧基)-5-氟吡啶-3-基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤2的合成方法，将中间体7中步骤1的产物替换为中间体22中步骤1的产物，得到所需产物。MS m/z[ESI]：519.22[M+1].
步骤3：5-((2R，4S)-2-(2-(3-氨基丙氧基)-5-氟吡啶-3-基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤3的合成方法，将中间体7中步骤2的产物替换为中间体22中步骤2的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：419.17[M+1]。
步骤4：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环壬烷-9-酮
按中间体7中步骤4的合成方法，将中间体7中步骤3的产物替换为中间体22中步骤3的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：401.16[M+1]。
中间体23：(13E，14E，22R，24S，6R)-24，35-二氟-6-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮
Figure BSA0000171399190000231
步骤1：5-((2R，4S)-2-(2-((R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)丙氧基)-5-氟吡啶-3-基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
按中间体7中步骤1的合成方法，将(R)-3-羟基丁基氨基甲酸叔丁酯替换为(R)-1-羟基丙-2-基氨基甲酸叔丁酯，中间体2替换为中间体16，得到所需产物.MS m/z[ESI]：547.25[M+1]。
步骤2：5-((2R，4S)-2-(2-((R)-2-((叔丁氧羰基)氨基)丙氧基)-5-氟吡啶-3-基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤2的合成方法，将中间体7中步骤1的产物替换为中间体23中步骤1的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：519.22[M+1]。
步骤3：5-((2R，4S)-2-(2-((R)-2-氨基丙氧基)-5-氟吡啶-3-基)-4-氟吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酸
按中间体7中步骤3的合成方法，将中间体7中步骤2的产物替换为中间体23中步骤2的产物，得到所需产物.MS m/z[ESI]：419.17[M+1]。
步骤4：(13E，14E，22R，24S，6R)-24，35-二氟-6-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮
按中间体7中步骤4的合成方法，将中间体7中步骤3的产物替换为中间体23中步骤3的产物，得到所需产物。MS m/z[ESI]：401.16[M+1]。
实施例1：(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑 并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮肟
Figure BSA0000171399190000232
将中间体8(71mg)加入到3mL干燥甲苯中，然后加入五氯化磷(125mg)，加热至80℃搅拌4小时，冷却至室温，旋干溶剂，加入10mL干燥乙腈，冷却至0℃，加入盐酸羟胺(42mg)、三乙胺(404mg)，升至室温搅拌4小时.旋干溶剂，残留物分配于二氯甲烷和水中，有机相用饱和盐水洗涤后干燥、浓缩，粗品经硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇，20∶1，+0.5％氨水)分离，得(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮肟(20mg).MS m/z[ESI]：371.17[M+1].1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.01-12.21(1H，brs)，9.45-10.01(1H，brs)，8.86(1H，s)，8.57(1H，d，J＝7.2Hz)，8.45(1H，s)，7.02-7.11(2H，m)，6.93-6.98(1H，m)，6.39(1H，d，J＝7.2Hz)，5.44-5.52(1H，m)，4.68-4.75(1H，m)，3.58-3.66(1H，m)，3.16-3.25(1H，m)，1.44(3H，d，J＝6.0Hz)，1.41(3H，d，J＝6.8Hz).
实施例2：(R，13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮肟
Figure BSA0000171399190000241
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体10，得到(R，13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮肟。MSm/z[ESI]：371.17[M+1]。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.20-11.80(1H，brs)，9.39(1H，s)，8.69(1H，s)，8.56(1H，s)，8.48(1H，d，J＝7.2Hz)，7.15(1H，d，J＝9.2Hz)，6.92-6.99(2H，m)，6.29(1H，d，J＝6.8Hz)，5.70-5.75(1H，m)，4.12-4.28(2H，m)，3.15-3.40(2H，m)，2.05-2.18(2H，m)，1.39(3H，d，J＝6.4Hz).
实施例3：(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡唑 并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000242
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体7，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮O-甲基肟。MS m/z[ESI]：399，20[M+1]。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.69(1H，s)，8.12(1H，d，J＝7.6Hz)，7.58-7.85(1H，brs)，7.03(1H，dd，J＝8.8Hz，2.4Hz)，6.77-6.86(2H，m)，6.25(1H，d，J＝7.6Hz)，6.08-6.24(1H，brs)，5.80-5.85(1H，m)，4.64-4.74(1H，m)，3.89(3H，s)，3.70-3.74(1H，m)，3.40-3.41(1H，m)，2.05-2.24(2H，m)，1.49(3H，d，J＝7.2Hz)，1.30(3H，d，J＝6.0Hz).
实施例4：(R，13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000251
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体10，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(R，13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮O-甲基肟。MS m/z[ESI]：385.18[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.72-8.82(1H，brs)，8.15(1H，d，J＝7.6Hz)，7.10-7.40(1H，brs)，6.99(1H，dd，J＝9.2Hz，2.8Hz)，6.86(1H，td，J＝9.2Hz，2.8Hz)，6.77(1H，dd，J＝9.2Hz，4.4Hz)，6.10(1H，d，J＝7.2Hz)，5.92-6.02(1H，m)，5.01-5.62(1H，brs)，4.18-4.26(2H，m)，3.87(3H，s)，3.58-3.68(1H，m)，3.40-3.52(1H，m)，2.18-2.38(2H，m)，1.49(3H，d，J＝6.8Hz).
实施例5：(R，13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000252
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体9，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(R，13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮O-甲基肟。MS m/z[ESI]：371.17[M+1].MS m/z[ESI]：371.17[M+1]。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.57(1H，s)，8.17(1H，d，J＝7.6Hz)，7.78(1H，s)，6.96(1H，dd，J＝9.2Hz，2.8Hz)，6.80-6.88(2H，m)，6.70-6.80(1H，m)，6.09(1H，d，J＝7.6Hz)，5.46(1H，s)，4.42-4.52(1H，m)，4.32-4.38(1H，m)，3.73-3.84(4H，m)，3.43-3.53(1H，m)，1.51(3H，d，J＝6.8Hz)。
实施例6：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a] 嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000261
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体11，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-甲基肟.MS m/z[ESI]：415.17[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.60(1H，s)，8.32(1H，d，J＝7.6Hz)，7.32-7.58(1H，brs)，6.79-6.87(3H，m)，6.26(1H，d，J＝7.6Hz)，5.98(1H，t，J＝7.6Hz)，5.47(1H，d，J＝51.6Hz)，4.48-4.61(2H，m)，4.01-4.18(2H，m)，3.83(3H，s)，3.68-3.78(1H，m)，3.41-3.52(1H，m)，2.80-2.91(1H，m)，2.01-2.24(1H，m)。
实施例7：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a] 嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000262
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体17，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮O-甲基肟.MS m/z[ESI]：416.17[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.63(1H，s)，8.36(1H，d，J＝6.8Hz)，7.87(1H，d，J＝2.8Hz)，7.18(1H，dd，J＝8.4Hz，3.2Hz)，6.25(1H，d，J＝6.8Hz)，5.81(1H，t，J＝8.0Hz)，5.48(1H，d，J＝52.0Hz)，5.18(1H，s)，4.35-4.46(1H，m)，4.15-4.18(1H，m)，3.97-4.10(2H，m)，3.82(3H，s)，3.70-3.80(1H，m)，3.41-3.52(1H，m)，2.84-2.94(1H，m)，2.01-2.22(1H，m).
实施例8：(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000263
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体13，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮O-甲基肟。MS m/z[ESI]：443.20[M+1].MS m/z[ESI]：443.20[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.83(1H，s)，8.30(1H，d，J＝7.2Hz)，6.88-6.90(1H，brs)，6.73-6.83(3H，m)，6.22(1H，d，J＝7.2Hz)，6.09(1H，t，J＝8.0Hz)，5.47(1H，d，J＝52.0Hz)，4.68-4.72(1H，m)，4.01-4.22(2H，m)，3.84(3H，s)，3.51-3.62(1H，m)，3.32-3.45(1H，m)，2.78-2.89(1H，m)，2.04-2.22(3H，m)，1.37(3H，d，J＝7.2Hz).
实施例9：(13E，14E，22R，5S)-35-氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000271
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体14，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(13E，14E，22R，5S)-35-氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-甲基肟.MS m/z[ESI]：411。20[M+1].MS m/z[ESI]：366.12[M+1]。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.59(1H，s)，8.25(1H，d，J＝7.6Hz)，7.65(1H，t，J＝5.6Hz)，6.80-6.85(3H，m)，6.23(1H，d，J＝7.6Hz)，5.81(1H，t，J＝6.4Hz)，4.77-4.81(1H，m)，3.87-3.93(1H，m)，3.81(3H，s)，3.67-3.78(2H，m)，3.25-3.31(1H，m)，2.37-2.51(2H，m)，2.13-2.19(1H，m)，1.90-2.05(1H，m)，1.57(3H，d，J＝6.4Hz).
实施例10：(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000272
按实施例1的合成方法，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮O-甲基肟。MS m/z[ESI]：385.18[M+1]。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.50(1H，s)，8.30(1H，s)，8.13(1H，d，J＝6.4Hz)，7.01(1H，dd，J＝8.8Hz，2.4Hz)，6.78-6.86(2H，m)，6.22(1H，d，J＝6.8Hz)，6.12(1H，s)，5.66-5.72(1H，m)，4.65-4.69(1H，m)，3.80-4.01(4H，m)，3.31-3.48(1H，m)，1.54(3H，d，J＝6.4Hz)，1.52(3H，d，J＝6.8Hz)。
实施例11：(R，13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮肟
Figure BSA0000171399190000281
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体9，得到(R，13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮肟。MSm/z[ESI]：357.15[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.69(1H，s)，8.20(1H，d，J＝7.6Hz)，7.82(1H，s)，6.97(1H，dd，J＝9.2Hz，2.4Hz)，6.80-6.88(2H，m)，6.11(1H，d，J＝7.2Hz)，5.70-5.78(1H，m)，5.40(1H，d1J＝4.8Hz)，5.30-5.39(1H，brs)，4.45-4.52(1H，m)，4.32-4.40(1H，m)，3.68-3.78(1H，m)，3.42-3.48(1H，m)，1.52(3H，d，J＝6.8Hz)。
实施例12：(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮肟
Figure BSA0000171399190000282
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体7，得到(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，9-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环癸烷-10-酮肟.MS m/z[ESI]：385.18[M+1]。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.64(1H，s)，9.78-11.20(1H，brs)，8.95(1H，s)，8.67(1H，s)，8.59(1H，d，J＝7.6Hz)，6.97-7.14(3H，m)，6.45(1H，d，J＝7.6Hz)，5.60-5.70(1H，m)，4.78-4.92(1H，m)，3.28-3.62(2H，m)，1.98-2.16(2H，m)，1.42(3H，d，J＝7.2Hz)，1.23(3H，d，J＝6.4Hz).
实施例13：(13E，14E，22E，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000283
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体12，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-甲基肟.MS m/z[ESI]：429.19[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.60(1H，s)，8.32(1H，d，J＝7.6Hz)，6.77-6.81(3H，m)，6.25(1H，d，J＝7.2Hz)，5.97(1H，t，J＝8.0Hz)，5.48(1H，d，J＝52.4Hz)，4.78-4.83(1H，m)，4.01-4.18(3H，m)，3.71-3.88(4H，m)，3.27-3.38(1H，m)，2.82-2.92(1H，m)，2.01-2.24(1H，m)，1.58(3H，d，J＝6.0Hz).
实施例14：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-乙基肟
Figure BSA0000171399190000291
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体11，将盐酸羟胺替换为O-乙基羟胺盐酸盐，得到(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-乙基肟，MS m/z[ESI]：429.19[M+1]。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.65(1H，s)，8.33(1H，d，J＝7.6Hz)，7.30-7.50(1H，brs)，6.79-6.87(3H，m)，6.26(1H，d，J＝7.6Hz)，5.98(1H，t，J＝8.0Hz)，5.48(1H，d，J＝52.0Hz)，4.48-4.60(2H，m)，3.99-4.18(4H，m)，3.68-3.81(1H，m)，3.41-3.59(1H，m)，2.81-2.91(1H，m)，1.99-2.22(1H，m)，1.31(3H，t，J＝7.2Hz).
实施例15：(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-乙基肟
Figure BSA0000171399190000292
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体12，将盐酸羟胺替换为O-乙基羟胺盐酸盐，得到(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-乙基肟。MS m/z[ESI]：443.20[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.65(1H，s)，8.32(1H，d，J＝6.4Hz)，7.39-7.51(1H，brs)，6.77-6.86(3H，m)，6.25(1H，d，J＝6.4Hz)，5.97(1H，t，J＝8.0Hz)，5.48(1H，d，J＝52.0Hz)，4.79-4.86(1H，m)，3.96-4.22(4H，m)，3.69-3.80(1H，m)，3.25-3.36(1H，m)，2.82-2.93(1H，m)，2.02-2.24(1H，m)，1.58(3H，d，J＝6.0Hz)，1.31(3H，t，J＝7.2Hz).
实施例16：(R，13E，14E)-35-氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2 (1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000301
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体15，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(R，13E，14E)-35-氟-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮O-甲基肟.MS m/z[ESI]：397.18[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.58(1H，s)，8.27(1H，d，J＝7.2Hz)，7.50-7.71(1H，brs)，6.79-6.88(3H，m)，6.25(1H，d，J＝8.0Hz)，5.82(1H，t，J＝6.4Hz)，4.48-4.58(2H，m)，3.88-3.94(1H，m)，3.82(3H，s)，3.65-3.74(2H，m)，3.41-3.53(1H，m)，2.38-2.52(2H，m)，2.13-2.24(1H，m)，1.92-2.02(1H，m).
实施例17：(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000302
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体18，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮O-甲基肟.MS m/z[ESI]：430.18[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.63(1H，s)，8.32(1H，d，J＝7.6Hz)，7.86(1H，d，J＝2.8Hz)，7.23(1H，s)，7.16(1H，dd，J＝8.0Hz，2.8Hz)，6.22(1H，d，J＝7.6Hz)，5.82(1H，t，J＝8.8Hz)，5.43-5.56(2H，m)，3.97-4.18(2H，m)，3.79-3.85(4H，m)，3.22-3.28(1H，m)，2.86-2.96(1H，m)，2.02-2.24(1H，m)，1.55(3H，d，J＝6.4Hz).
实施例18：(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮肟
Figure BSA0000171399190000303
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体13，得到(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮肟.MS m/z[ESI]：429.19[M+1]。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝11.75(1H，s)，10.10(1H，brs)，8.73-8.80(2H，m)，6.95-7.20(3H，m)，6.71(1H，d，J＝7.2Hz)，5.88(1H，m)，5.56(1H，d，J＝53.2Hz)，4.87(1H，m)，4.324.46(1H，m)，4.05-4.15(1H，m)，3.35-3.55(2H，m)，2.68(1H，m)，1.95-2.32(3H，m)，1.26(3H，d，J＝6.8Hz).
实施例19：(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮肟
Figure BSA0000171399190000311
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体12，得到(13E，14E，22R，24S，5S)-24，35-二氟-5-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环辛烷-8-酮肟.MS m/z[ESI]：415.18[M+1]。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝12.05(1H，s)，9.80(1H，brs)，8.80(1H，d，J＝7.2Hz)，8.53(1H，s)，7.20(1H，m)，7.12(1H，m)，6.90-7.02(1H，m)，6.73(1H，d，J＝7.2Hz)，5.73(1H，t，J＝8.2Hz)，5.57(1H，d，J＝52.8Hz)，4.94(1H，m)，4.28-4.42(1H，m)，4.07-4.17(1H，m)，3.62(1H，m)，3.25(1H，m)，2.64-2.75(1H，m)，2.12-2.33(1H，m)，1.48(3H，d，J＝6.4Hz).
实施例20：(13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a] 嘧啶杂-4(1，2)-吡啶杂环壬烷-9-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000312
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体9，将盐酸羟胺替换为O-甲基羟胺盐酸盐，得到(13E，14E)-45-氟-3-甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-吡啶杂环壬烷-9-酮O-甲基肟.MS m/z[ESI]：372.16[M+1].MS m/z[ESI]：371.17[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.55(1H，brs)，8.18(1H，s)，7.86(1H，d，J＝6.4Hz)，7.53(1H，m)，7.35(1H，dd，J＝8.0Hz，2.8Hz)，6.13(1H，d，J＝4.0Hz)，5.50-5.60(2H，m)，5.06-5.12(1H，m)，4.32-4.40(1H，m)，3.86(1H，m)，3.83(3H，s)，3.55(1H，m)，1.55(3H，d，J＝6.8Hz)。
实施例21：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000321
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体21，得到(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂-3(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮O-甲基肟.MS m/z[ESI]：429.19[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.82(1H，s)，8.32(1H，d，J＝7.2Hz)，6.74-6.88(3H，m)，6.24(1H，d，J＝7.2Hz)，6.13(1H，t，J＝7.4Hz)，5.49(1H，d，J＝52.8Hz)，3.99-4.37(5H，m)，3.86(3H，s)，3.59(1H，m)，3.49(1H，m)，2.86(1H，m)，2.00-2.26(3H，m)。
实施例22：(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5- a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环壬烷-9-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000322
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体22，得到(13E，14E，22R，24S)-24，35-二氟-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环壬烷-9-酮O-甲基肟.MS m/z[ESI]：430.19[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.82(1H，s)，8.34(1H，d，J＝7.8Hz)，7.84(1H，d，J＝2.8Hz)，7.11(1H，dd，J＝8.0Hz，2.8Hz)，6.55(1H，brs)，6.24(1H，d，J＝7.6Hz)，5.89(1H，m)，5.46(1H，d，J＝52.0Hz)，3.99-4.22(4H，m)，3.82(3H，s)，3.58(1H，m)，3.46(1H，m)，2.88(1H，m)，1.97-2.27(3H，m)。
实施例23：(13E，14E，22R，24S，6R)-24，35-二氟-6-甲基-4-氧杂-7-氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮O-甲基肟
Figure BSA0000171399190000323
按实施例1的合成方法，将中间体8替换为中间体23，得到(13E，14E，22R，24S，6R)-24，35-二氟-6-甲基-4-氧杂-8-氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-3(3，2)-吡啶杂-2(1，2)-吡咯烷杂环辛烷-8-酮O-甲基肟.MS m/z[ESI]：430.19[M+1].1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.56(1H，s)，8.33(1H，d，J＝6.4Hz)，7.86(1H，d，J＝2.8Hz)，7.16(1H，dd，J＝8.2Hz，2.6Hz)，6.93-7.03(1H，m)，6.21(1H，d，J＝6.4Hz)，5.76-5.90(1H，m)，5.51(1H，d，J＝52.0Hz)，5.11(1H，d，J＝7.2Hz)，3.95-4.10(2H，m)，4.15-4.28(2H，m)，3.80(3H，s)，2.83-2.98(1H，m)，2.08-2.25(1H，m)，1.46(3H，d，J＝6.4Hz).
实施例24：(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡 唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮O-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)肟
Figure BSA0000171399190000331
按实施例1的合成方法，将盐酸羟胺替换为2-(氨基氧基)-2-甲基丙-1-醇，得到(13E，14E，3R，6S)-45-氟-3，6-二甲基-5-氧杂-2，8-二氮杂-1(5，3)-吡唑并[1，5-a]嘧啶杂-4(1，2)-苯杂环壬烷-9-酮O-(1-羟基-2-甲基丙-2-基)肟.MS m/z[ESI]：443.22[M+1]。1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.59(1H，s)，8.08-8.25(2H，m)，6.95-7.02(1H，m)，6.80-6.87(2H，m)，6.16(1H，d，J＝7.2Hz)，5.60-5.74(2H，m)，4.60-4.70(1H，m)，3.60-3.78(3H，m)，3.18-3.30(1H，m)，1.70(1H，brs)，1.55(6H，s)，1.36(3H，d，J＝7.4Hz)，1.26(3H，d，J＝6.2Hz).
化合物对TRKAWT酶抑制活性的测定
本发明采用以下方法来测定发明的化合物对TRKAWT酶的抑制活性，该抑制活性采用IC50这一指标来表示，IC50即酶的活性被抑制50％时的化合物的浓度.
材料和方法：
材料：
a.白色384孔板(Perkin Elmer，目录号：607290/99)；
b.EnVision Reader(PerkinElmer 2103-0010)；
c.1M HEPES缓冲液(Invitrogen，目录号：15630-080)；
d.TK Peptide substrate(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，500μM，-20℃下贮存；
e.ATP(Sigma-Aldrich A7699)，10mM，-20℃下贮存；
f.TRKAWT(自行制备)，2μM，-80℃下贮存
g.TK antibody(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，400X，-20℃下贮存；
h.Steptavidin-XL665(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，16.67μM，-20℃下贮存
i.Detection Buffer(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，16.67μM，-20℃下贮存
j.1M MgCl2(Sigma，目录号：7786-30-3)
k.0.5M Na3VO4
l. 10％BSA
m.1％Tween-20
n.1M DTT
o.DMSO
p.dd H2O
q.待测化合物：阳性对照化合物TPX-0005和本发明实施例化合物
按以下操作顺序进行：
1.配制TRKAWT酶反应缓冲液：50mM HEPES(pH＝7.5)，0.1mM Na3VO4，0.001％Tween-20，5mM MgCl2，0.01％BSA，1mM DTT，混匀后放置于冰上备用；
2.用DMSO溶解待检测化合物至终操作浓度的100倍，在96孔板上进行5倍梯度稀释共8个浓度，第9孔加入DMSO作为空白对照，然后用酶反应缓冲液稀释25倍至终工作浓度的4倍待用；
3.用酶反应缓冲液稀释TRKAWT至2倍工作浓度(工作终浓度为0.5nM)，混匀后置于冰上备用；
4.用酶反应缓冲液配制4倍工作浓度的底物ATP(工作终浓度为40μM)和TKpeptide(工作终浓度为1μM)，混匀后置于冰上备用；
5.在384孔板中加入待测的4倍工作浓度的化合物2.5μL，加入4倍工作浓度底物2.5μL，再加入2倍工作浓度TRKAWT 5μL，离心混匀；
6.用封膜封住384孔板，在孵育箱(23℃)中孵育1小时；
7.用Detection Buffer配制4倍工作浓度的TK Antibody(100倍稀释)和4倍工作浓度的Steptavidin-XL665(工作终浓度为125nM)，各加5μL至384孔板终止反应，离心混匀；
8.用封膜封住384孔板，在孵育箱(23℃)中孵育1小时；
9.在Envision上读取荧光值(320nm激发，检测665nm与620nm的发射光，二者比值为酶活性).
10.每个化合物分别在9个浓度下测定酶的活性，数据使用Prisim软件计算得到该化合物的IC50值.
化合物对TRKAG595R酶抑制活性的测定
本发明采用以下方法来测定发明的化合物对TRKAG595R酶的抑制活性，该抑制活性采用IC50这一指标来表示，IC50即酶的活性被抑制50％时的化合物的浓度.
材料和方法：
材料：材料：
a.白色384孔板(Perkin Elmer，目录号：607290/99)；
b.EnVision Reader(PerkinElmer 2103-0010)；
c.1M HEPES缓冲液(Invitrogen，目录号：15630-080)；
d.TK Peptide substrate(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，500μM，-20℃下贮存；
e.SEB(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，2.5μM，-20℃下贮存；
f.ATP(Sigma-Aldrich A7699)，10mM，-20℃下贮存；
g.TRKAG595R(自行制备)，2μM，-80℃下贮存
h.TK antibody(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，400X，-20℃下贮存；
i.Steptavidin-XL665(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，16.67μM，-20℃下贮存
j.Detection Buffer(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，16.67μM，-20℃下贮存
k.1M MgCl2(Sigma，目录号：7786-30-3)
l.0.5M Na3VO4
m.10％BSA
n.1％Tween-20
o.1M DTT
p.DMSO
q.dd H2O(重蒸水)
r.待测化合物：阳性对照化合物TPX-0005和本发明实施例化合物
按以下操作顺序进行：
1.配制TRKAG595R酶反应缓冲液：50mM HEPES(pH＝7.5)，0.1mM Na3VO4，0.001％Tween-20，5mM MgCl2，0.01％BSA，1mM DTT，50nM SEB，混匀后放置于冰上备用；
2.用DMSO溶解待检测化合物至终操作浓度的100倍，在96孔板上进行5倍梯度稀释共8个浓度，第9孔加入DMSO作为空白对照，然后用酶反应缓冲液稀释25倍至终工作浓度的4倍待用；
3.用酶反应缓冲液稀释TRKAG595R至2倍工作浓度(工作终浓度为0.05nM)，混匀后置于冰上备用；
4.用酶反应缓冲液配制4倍工作浓度的底物ATP(工作终浓度为5μM)和TK peptide(工作终浓度为1μM)，混匀后置于冰上备用；
5.在384孔板中加入待测的4倍工作浓度的化合物2.5μL，加入4倍工作浓度底物2.5μL，再加入2倍工作浓度TRKAG595R 5μL，离心混匀；
6.用封膜封住384孔板，在孵育箱(23℃)中孵育2小时；
7.用Detection Buffer配制4倍工作浓度的TK Antibody(100倍稀释)和4倍工作浓度的Steptavidin-XL665(工作终浓度为125nM)，各加5μL至384孔板终止反应，离心混匀；
8.用封膜封住384孔板，在孵育箱(23℃)中孵育1小时；
9.在Envision上读取荧光值(320nm激发，检测665nm与620nm的发射光，二者比值为酶活性).
10.每个化合物分别在9个浓度下测定酶的活性，数据使用Prisim软件计算得到该化合物的IC50值。
化合物对ALKL1196M酶抑制活性的测定
本发明采用以下方法来测定发明的化合物对ALKL1196M酶的抑制活性，该抑制活性采用IC50这一指标来表示，IC50即酶的活性被抑制50％时的化合物的浓度.
材料和方法：
材料：
r.白色384孔板(Perkin Elmer，目录号：607290/99)；
s.EnVision Reader(PerkinElmer 2103-0010)；
t.1M HEPES缓冲液(Invitrogen，目录号：15630-080)；
u.TK Peptide substrate(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，500μM，-20℃下贮存；
v.SEB(Cisbio.HTRF KinEASE-T KKit，目录号：62TK0PEB)，2.5μM，-20℃下贮存；
w.ATP(Sigma-Aldrich A7699)，10mM，-20℃下贮存；
x.ALKL1196M(自行制备)，7μM，-80℃下贮存
y.TK antibody(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，400X，-20℃下贮存；
z.Steptavidin-XL665(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，16.67μM，-20℃下贮存
aa.Detection Buffer(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，16.67μM，-20℃下贮存
bb.1M MnCl2(Sigma，目录号：7773-01-5)
cc.0.5M Na3VO4
dd.10％BSA
ee.1％Tween-20
ff.1M DTT
gg.DMSO
hh.dd H2O
ii.待测化合物：阳性对照化合物TPX-0005和本发明实施例化合物
按以下操作顺序进行：
11.配制ALKL1196M酶反应缓冲液：50mM HEPES(pH＝7.5)，0.1mM Na3VO4，0.001％Tween-20，5mMMnCl2，0.01％BSA，1mM DTT，50nM SEB，混匀后放置于冰上备用；
12.用DMSO溶解待检测化合物至终操作浓度的100倍，在96孔板上进行5倍梯度稀释共8个浓度，第9孔加入DMSO作为空白对照，然后用酶反应缓冲液稀释25倍至终工作浓度的4倍待用；
13.用酶反应缓冲液稀释ALKL1196M至2倍工作浓度(工作终浓度为0.1nM)，混匀后置于冰上备用；
14.用酶反应缓冲液配制4倍工作浓度的底物ATP(工作终浓度为0.02μM)和TKpeptide(工作终浓度为1μM)，混匀后置于冰上备用；
15.在384孔板中加入待测的4倍工作浓度的化合物2.5μL，加入4倍工作浓度底物2.5μL，再加入2倍工作浓度ALKL1195M5μL，离心混匀；
16.用封膜封住384孔板，在孵育箱(23℃)中孵育2小时；
17.用Detection Buffer配制4倍工作浓度的TK Antibody(100倍稀释)和4倍工作浓度的Steptavidin-XL665(工作终浓度为125nM)，各加5μL至384孔板终止反应，离心混匀；
18.用封膜封住384孔板，在孵育箱(23℃)中孵育1小时；
19.在Envision上读取荧光值(320nm激发，检测665nm与620nm的发射光，二者比值为酶活性).
20.每个化合物分别在9个浓度下测定酶的活性，数据使用Prisim软件计算得到该化合物的IC50值.
化合物对ALKG1202R酶抑制活性的测定
本发明采用以下方法来测定发明的化合物对ALKG1202R酶的抑制活性，该抑制活性采用IC50这一指标来表示，IC50即酶的活性被抑制50％时的化合物的浓度.
材料和方法：
材料：材料：
jj.白色384孔板(Perkin Elmer，目录号：607290/99)；
kk.EnVision Reader(PerkinElmer 2103-0010)；
ll.1M HEPES缓冲液(Invitrogen，目录号：15630-080)；
mm.TK Peptide substrate(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，500μM，-20℃下贮存；
nn.SEB(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，2.5μM，-20℃下贮存；
oo.ATP(Sigma-Aldrich A7699)，10mM，-20℃下贮存；
pp.ALKG1202R(自行制备)，15μM，-80℃下贮存
qq.TK antibody(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，400X，-20℃下贮存；
rr.Steptavidin-XL665(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，16.67μM，-20℃下贮存
ss.Detection Buffer(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，16.67μM，-20℃下贮存
tt.1M MnCl2(Sigma，目录号：7773-01-5)
uu.0.5M Na3VO4
vv.10％BSA
ww.1％Tween-20
xx.1M DTT
yy.DMSO
zz.dd H2O
aaa.待测化合物：阳性对照化合物TPX-0005和本发明实施例化合物
按以下操作顺序进行：
21.配制ALKG1202R酶反应缓冲液：50mM HEPES(pH＝7.5)，0.1mM Na3VO4，0.001％Tween-20，5mM MnCl2，0.01％BSA，1mM DTT，50nM SEB，混匀后放置于冰上备用；
22.用DMSO溶解待检测化合物至终操作浓度的100倍，在96孔板上进行5倍梯度稀释共8个浓度，第9孔加入DMSO作为空白对照，然后用酶反应缓冲液稀释25倍至终工作浓度的4倍待用；
23.用酶反应缓冲液稀释ALKG1202R至2倍工作浓度(工作终浓度为0.05nM)，混匀后置于冰上备用；
24.用酶反应缓冲液配制4倍工作浓度的底物ATP(工作终浓度为0.2μM)和TKpeptide(工作终浓度为1μM)，混匀后置于冰上备用；
25.在384孔板中加入待测的4倍工作浓度的化合物2.5μL，加入4倍工作浓度底物2.5μL，再加入2倍工作浓度ALKG1202R 5μL，离心混匀；
26.用封膜封住384孔板，在孵育箱(23℃)中孵育2小时；
27.用Detection Buffer配制4倍工作浓度的TK Antibody(100倍稀释)和4倍工作浓度的Steptavidin-XL665(工作终浓度为125nM)，各加5μL至384孔板终止反应，离心混匀；
28.用封膜封住384孔板，在孵育箱(23℃)中孵育1小时；
29.在Envision上读取荧光值(320nm激发，检测665nm与620nm的发射光，二者比值为酶活性).
30.每个化合物分别在9个浓度下测定酶的活性，数据使用Prisim软件计算得到该化合物的IC50值。
化合物对ROS1G2032R酶抑制活性的测定
本发明采用以下方法来测定发明的化合物对ROS1G2032R酶的抑制活性，该抑制活性采用IC50这一指标来表示，IC50即酶的活性被抑制50％时的化合物的浓度。
材料和方法：
材料：
a.白色384孔板(Perkin Elmer，目录号：607290/99)；
b.EnVision Reader(PerkinElmer 2103-0010)；
c.1M HEPES缓冲液(mvitrogen，目录号：15630-080)；
d.TK Peptide substrate(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，500μM，-20℃下贮存；
e.SEB(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，2.5μM，-20℃下贮存；
f.ATP(Sigma-Aldrich A7699)，10mM，-20℃下贮存；
g.ROS1G2032R(自行制备)，1.5μM，-80℃下贮存
h.TK antibody(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，400X，-20℃下贮存；
i.Steptavidin-XL665(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，16.67μM，-20℃下贮存
j.Detection Buffer(Cisbio.HTRF KinEASE-TK Kit，目录号：62TK0PEB)，16.67μM，-20℃下贮存
k.1MMgCl2(Sigma，目录号：7786-30-3)
l.1M MnCl2(Sigma，目录号：7773-01-5)
m.0.5M Na3VO4
n.10％BSA
o.1％Tween-20
p.1M DTT
q.DMSO
r.dd H2O
s.待测化合物：阳性对照化合物TPX-0005和本发明实施例化合物
按以下操作顺序进行：
1.配制ROS1G2032R酶反应缓冲液：50mM HEPES(pH＝7.5)，0.1mM Na3VO4，0.001％Tween-20，5mM MgCl2，5mM MnCl2，0.01％BSA，1mM DTT，50nM SEB，混匀后放置于冰上备用；
2.用DMSO溶解待检测化合物至终操作浓度的100倍，在96孔板上进行5倍梯度稀释共7个浓度，第8孔加入DMSO作为空白对照，然后用酶反应缓冲液稀释25倍至终工作浓度的4倍待用；
3.用酶反应缓冲液稀释ROS1G2032R至2倍工作浓度(工作终浓度为0.1nM)，混匀后置于冰上备用；
4.用酶反应缓冲液配制4倍工作浓度的底物ATP(工作终浓度为0.2μM)和TKpeptide(工作终浓度为1μM)，混匀后置于冰上备用；
5.在384孔板中加入待测的4倍工作浓度的化合物2.5μL，加入4倍工作浓度底物2.5μL，再加入2倍工作浓度ROS1G2032R 5μL，离心混匀；
6.用封膜封住384孔板，在孵育箱(23℃)中孵育1小时；
7.用Detection Buffer配制4倍工作浓度的TK Antibody(100倍稀释)和4倍工作浓度的Steptavidin-XL665(工作终浓度为125nM)，各加5μL至384孔板终止反应，离心混匀；
8.用封膜封住384孔板，在孵育箱(23℃)中孵育1小时；
9.在Envision上读取荧光值(320nm激发，检测665nm与620nm的发射光，二者比值为酶活性).
10.每个化合物分别在8个浓度下测定酶的活性，数据使用Prisim软件计算得到该化合物的IC50值.
表1 参照物及实施例化合物对靶点激酶的抑制活性
Figure BSA0000171399190000391
Figure BSA0000171399190000401
表1的试验数据表明，本发明提供的化合物对多个靶点激酶都具有很好的抑制活性。
本发明提供的化合物具有非常好的体内代谢水平。表2列出了参照物及本发明实施例化合物在SD大鼠体内的药代动力学数据。
表2 参照物及实施例化合物的药代动力学参数
Figure BSA0000171399190000402

Claims (6)

1.式(I)化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FSB0000197701750000011
其中，
R1选自H和C1-6烷基，所述C1-6烷基可任选地被1-2个羟基取代；
Ar选自苯基和吡啶基，所述苯基和吡啶基可任选地被1-2个氟取代；
L1选自C1-3亚烷基和
Figure FSB0000197701750000012
所述亚烷基可任选地被C1-6烷基取代，所述
Figure FSB0000197701750000013
可任选地被1-2个氟取代；
L2选自C2-6亚烷基，所述亚烷基可任选地被1-2个C1-3烷基取代。
2.选自以下的化合物：
Figure FSB0000197701750000014
Figure FSB0000197701750000021
或其药学上可接受的盐。
3.一种药物组合物，其包含根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
4.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐、或者根据权利要求3所述的组合物在制备用来治疗ALK介导的疾病的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述ALK介导的疾病为非小细胞肺癌、间变性大细胞淋巴瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、鼻咽癌、乳腺癌、结直肠癌、弥漫大B细胞淋巴瘤、全身组织细胞增生症和神经母细胞瘤。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述ALK介导的疾病为ALK阳性的非小细胞肺癌。
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