PT98430B - Processo para a preparacao de heparinas calcicas - Google Patents

Description

Ο presenta invento relacione-se com a preparação de sais de heparina ou. com produtos derivados de heparina, como as fracções de peso molecular baixo, que são obtidas por extracção ou por despolimerização parcial. 0 processo que é o objectivo do invento, permite mais particularmente a preparação de sal ds cálcio de heparina ou de seus derivados.

A heparina, conhecida pela sua acção anticoagulante do sangue, é extraída sob a forma de sal de sódio (heparina sódica) a partir dos diferentes orgãos dos animais como os pulmões ou os intestinos de boi ou de porco, A utilização terapêutica de heparina sódica é efectuada através de administração intravenosa, A aplicação FR--2 225 149 (73 13581) descreve a heparina cálcica que permite efectuar uma terapia heparínica através de administração sob cutSnea, bem mais agradável, processo de Tsorxcu do sal de cáioio, o mais frequen· te à escala, industrial, consiste na realização de permuta entre sódio e cálcio através de dissolução de heparina sódica numa solução de um sal de cálcio, é certo, que o cálcio apresenta uma sodio, mas uma só é su f i c i en te para maior afinidade para a heparina do que o permuta, mesmo em excesso de cálcio, não eliminar totalmente o sódio que, depois das diferenças farmacopeias, deve estar presente em menos do que 0,1 X no produto final, é preciso pois precipitar com álcool a mistura da heparina de sódio e de cálcio logo na primeira permuta, depois redissolução do precipitado obtido numa nova solução rica em cálcio. Esta operação deve ser renovada várias vezes até que o teor em sódio seja suficientemente baixo. A precipitação em meio alcoólico é uma operação lenta (um a dois dias), apresentando este processo o inconveniente de ser moroso e consumidor de álcool e de ser uma operação manual, Por outro lado, o rendimento das precipitações não sendo de 100 X, uma parte da heparina, recuperada sob a forma de fracções segundárias nos operações de purificação, sobrenadan tes, deve sofrer outras uutros métodos foram propostos para a permuta catiónica sobre a heparinas realização da — A diálise ática de heparina sódica com os sais de cálcio que é um processo muito lento para que possa ser aplicado industrialmente, A utilização de um aparelho do tipo de hemodiálise está descrito na aplicação US~4 409 103»

- A utilização de resinas de permuta catiónica, apresenta o inconveniente da passagem da heparina sob a forma de ácido heparínico, nitidamente instável, visto que se auto-hidro~ lisa rapidamente (Patente US-4.168.377).

- A diafiltração por uma solução de um sal de cálcio está descrita na Patente US-4 409 103, Ela utiliza as membranas de ultrafiltração (não permutadoras de iSes). Os sais são arrastados pelo fluxo de água que atravessa as membranas sob a acção de um gradiente de pressão, A heparina é retida pelo efeito da filtração, sendo a sua dimensão superior aos dos poros da membrana, 0 inconveniente deste processo è que, para ser suficientemente rápido, as membranas utilizadas devem apresentar permeabilidades em relação à água importantes, logo com poros de grande diâmetro, o que pode arrastar partes de heparina através das membranas»

Num estudo sobre •olubil idade dos diferentes sais de heparina e de sulfato de condroitina, estes produtos sofreram pergaminho método de detecta de electrodiálise aquando da utilização de membranas de (Έ, dorpes, Biochem. 3. Í935, 29, 1817 - \S30). 0 dosagem não estã suficientemente preciso, o autor não ί

perto a actividade antes e depois da electrodiálise. E ainda, ele demonstra que 1 % da actividade inicial é perdida no compartimento anódico. Por outro lado, o método descrito por E. Jarpes relaciona-se com a heparina sob a forma ácida, instável.

JP-Oi-149801 método para objectivo da Patente Japonesa com c número (Chemical Abstract 115·, 22607m> é descrever um a preparação de éter de celulose modificada, particularmente os sais de carboxi-metÁlcelulose, sobre o qual se submete o sal de sódio a uraa electrodiálise através de uma membrana de permuta iónica ou de uma membrana de ultrafiltração, para originar uma forma ácida e através de tratamento do ácido assim obtida com hidroxilo ou com um sal do catião, obtem-se o sal desejado. Este método também passa através do intermediário de forma ácida e, logo que ele é aplicado á heparina sódica, comporta uma perda devido à degradação da heparina sob a forma de ác ido» é: também dito que se pode separar uma solução de diferentes iões metálicos e particularmente os iSes de sódio, cálcio ou de ferro (férrico), através da formação de complexos com um agente quelante como EDTA, depois através da submissão dos complexos assim obtido of Japan Vol 13 MS 286 , a uma electrodiálise (Patente ASzstracts (c-613)/3634/₅ 29.06.89; JP-10S040S).

A electrodiálise tem sido também utilizada para a preparação em continuo de soluções que contêm diferentes sais minerais de peso molecular pequeno, de amónio ou de magnésio a partir de suifureto de cálcio (Patente US-4.009.088).

Foi agora descoberto que através da utilização de uma sucessão alternada de membranas permeáveis aos aniões (MPA) e de membranas permeáveis aos catiões (MFC) num aparelho de

electrodiálise clássico, estando estas membranas juntas de uma forma que permitem a circulação ds líquidos entre duas membranas adjacentes, e fazendo circular uma solução do sal de sódio de heparina ou de fragmentos ou de fracçSes de heparina e uma solução do sal de cálcio utilizada para a permuta dos iões, se obtem directamente o sal de cálcio correspondente sem passar pela heparina na forma de ácido.

Foi igualmente descoberto que a reacção é praticamente quantitativa e que, nas soluções de salmoura, aquelas definidas abaixo, e de lavagem dos eléctrodos, detecta—se menos do que 0,1 X da heparina inicial (ou das suas fracções ou fragmentos).

presente invento relaciona-se pois com o processo para a preparação do sal de cálcio de heparina ou de seus fragmentos ou de suas fracçSes, caracterizado por se fazer circular uma solução de sal de sódio de heparina ou de suas fracções ou de seus fragmentos e uma solução de um sal hidra-solúvel de cálcio num aparelho de electrodiálise que compreende membranas permeáveis aos aniões e de membranas permeáveis aos catiões alternadas permitindo a circulação dos líquidos.

Como produtos de partida, utiliza-se de preferãncia heparina sódica ou uma das suas fracções obtidas por fraccionamerrto ou por despolimerização, partieularmente nadroparina conhecida também com o nome CY 216 e descrita na Patente US-4 686 288, na forma de sal de sódio. Neste último caso, o processo do presente invento é partieularmente vantajoso, quando a massa molecular da nadroparina, de aproxima com um pico que se situa inferior ao da heparina;

damente de 2000 a cerca de 8000 daltons á volta dos 450Θ daltons, é nitidamente a permuta Na - Ca no processo de ultrafiltração ou. de diâlise implicará perdas importantes.

h

Coma produtos ds partida, pode-se utilizar a heparina sódica ou os seus fragmentos de heparina como a nadroparina sódica purificada ou a que não sofreu purificação final e que contêm eventualmente pequenas quantidades de etanol, de sulfato de sódio ou de cloreto de sódio. Ds ensaios comparativos mostraram que esses produtos, visto que eles são obtidos em pequenas quantidades nos produtos de partida, não influenciam a qualidade (pureza) da heparina cãicica ou dos fragmentos de heparina na forma de sais de cálcio obtidos com o processo do invento.

Todos estes produtos da partida são chamados depois aqui de heparinas” visto que os produtos finais são chamados de “haparinas cálcicas¹'» □ sal hidro-solúvel de cálcio utilizado de preferência é o ds cloro.

processo do presente invento consiste na utilização de membranas permeáveis aos anioes (MPA) e ds membranas permeáveis aos catiões (MPC) num aparelho de electrodiálise clássico»

Estas membranas permutadoras de iões são juntas numa sucessão alternada permitindo a circulação de líquidos entre duas membranas adjacentes. □ processo consiste em fazer circular na sucessão das membranas uma solução que contém o sal de sódio de heparina ou de uma das suas fracções ou de seus fragmentos e um sal hidro-solúvel que contém o catião de cálcio que se pretende permutar com o sódio (por exemplo CaCl._,)»

As membranas têm de preferência uma permeabilidade ds modo a permitir a passagem unicamente de moléculas que têm um peso molecular inferior a cerca de 50© dal tons,

A título ds exemplo membranas ASAHI SLASS^AMV/CSV AMÍ (Tokayama Soda, fornecedor não limitador, pode-se citar - R ou as membranans Neo-Septa CMI as e

processo ds acordo com o invento é il desenhos em anexo» Sobre esses desenhos5 trado nos

- A figura 1 mostra esquematicamente o funcionamento de um aparelho de electrodiálise no proce•o do invento»

- A figura 2 mostra esquematicamente a migração dos iões no aparelho de electrodiálise no caso da preparação de heparina de cálcio íneparina c-ãlcica)«

No aparelho de electrodiâlise E (Fig lí uma parte é introduzida e por onde circula uma solução í, depois chamada solução produto, que contém uma heparina sódica (Η , nNa ) e um sal hidra-solúvel de cálcio, por exemplo uma solução 2, depois chamada salmoura”, que ao fim contém apenas uma pequena quantidade de sal (por exemplo CaCl^í para assegurar uma conductividade e que a seguir se enriquece em sais (por exmplo NaCl e CaCl»,) e que é substituída durante a electrodiálise por dois ajustes do sal hidro-solúvel de cálcio (por exemplo CaCl^) na solução produto í» 0 aparelho de electrodiálise E compreende um conjunto de células, cada um-a constituída por uma MPA e uma MPC, 0 número de membranas M utilizadas é de 3® a 6© e de preferência de 4® a 5®, que são permeáveis a moléculas com pesos inferiores a cerca de daltons» Os eléctrodos são lavados de modo conhecida, por exemplo com uma solução 3 de HCl (®,5 X> ou de KC1 íí 7.Í» A solução produto í circula num compartimento sobre dois, então a salmoura 2 circula nos outros compartimentos (ver figura 2),

I eléctrico contido perpendicu-r uma fonte V em contínuo):

as MPC em direcção ao cátodo e salmoura adjacente quando eles

Sob o efeito de um campo larmente âs membranas (fornecido po

- Os iSes Na* atravessam são confinados no compartimento de reencontram uma MPA?

- Os iões que são desejáveis para a permutação com os Na , na espécie de Ca^-1- , atravessam igualmente as MPC, na direcção ao cátodo, e são confinados no compartimento de salmoura adjacente, visto que a sua migração estâ bloqueada pelo reencontro de uma MPA.

- Os aniões do sal de cálcio reajustados pela substituí ção do sódio atravessam as MPA em direcção ao Snodo e são confinados num compartimento de salmoura quando reencontram uma MPC.

- Os iões de heparinato (Η^Π ) migram pars as MPA mas não podem atravessá-los quando a sua massa molecular for demasiadamente elevada. As membranas de electrodiálise só são por conseguinte permeáveis a espécies com massa molecular inferior a cerca de 5€«δ„ Os iSes de hepar inato permanecem por conseguinte na solução produto 1» à medida que os catiões de sódio e os catiões de cálcio em excesso são transferidos para a salmoura na forma de sal de anião utilizado para a substituição do sódio, de preferência na forma de cloro, adiciona-se na solução produto o catião desejado, o cálcio em espécie, de maneira a substituir totalmente o sódio.

Agora para recuperar a solução produto é suficiente esvazear o circuito do produto e de adicionar etanol (ou um outro precipifcante de heparina) a essa solução, de modo pitar o sal de cálcio de heparina ou uma das suas a fazer preci-T fcíCÇÓGS «

A tensão que é aplicada aos eléctrodos pode ser de 2 a 38 volt/cm, de preferência ds 5 a 3® volt/cm» 0 processo é conduzido a uma temperatura de ® a S®°C, de preferência á temperatura amhiente.

processo do presente invento é de realização muito simples, è muito rápido e origina os sais de cálcio muito puros, com um teor em sódio inferior a ®,í % e com um bom rendimento em actividade biológica.

Ainda, através de uma electrodiálise muito simples, que é um processo de desalinização, o processo do presente invento realiza uma troca, directa de catiões sobre uma macromolécula aniónica. Por outro lado, os macro-aniões são conhecidos por colmatar a superfície das membranas de electrodiálise? de forma de sobrenadante, através de uma lavagem simples com água entre dois ensaios, constatou-se nenhuma baixa na capacidade das membranas, como será visto depois aqui,

Por descrição dos processos conhecidos, o processo do presente invento comporta melhoramentos consideráveis, concretamente 5 processo do de conciliar

No que diz respeito à ultrafiitração ou ã diálise, o invento alia, rapidez e poucas pertías, o que é difícil através dos dois métodos acima mencionados?

- Em relação às precipitações sucessivas, diminiu-se consideravelmente a duração do tratamento, o número das manipulações e a formação do precipitado»

1® -

Os exemplos seguintes ilustram o invento material utilizado nestes exemplos é o seguintes ·· Aparelho de electrodiálise SRTI modelo Pi

--- Membranas ASAHI GLASS AMV/CSV (2© células de 69 cia*·) (sendo uma célula constituída por uma MPA e uma MPC>. Q aparelho de electrodiálise é por conseguinte constituído por um total de 41 membranas»

As condiçoes operatórias são as seguintes?

- Tensão aplicada aos eléctrodos exemplo í e volts para o exemplo 2» volts- para o

- Temperatura ; ambiente.

EXEMPLO 1; Produção de Heparina Cálcíca

PREPARAÇÃO A MA PRESENÇA DE IMPUREZAS

ÍÍ5 g de heparina de sódio (sejam 2©,ó x 1©“ unidades segundo a Pharmacopée Europêenne, Ed. 199©, página 333, monogra fia de Heparinato de Sódio ~ titulação s v.2.2.6») s-ão colocadas em solução com 9©© g de água. Adiciona-se 15 g de etanol, 1,2 g de Wa_oS0₄ e 17© mg de NaCl. Esta solução é submetida a uma electrodiálise, os iões são transferidos progressívamente para uma solução de salmoura com a composição inicial seguintes CaCl_o s 5g/H_n0 s 1 Kg» Os eléctrodos do aparelho são lavados com 1,2

An litros de KOI a 1 % que recircula em contínuo» As adições de 1©© g de uma solução de CaCl._ a 38,5 % são efectuadas no produto aos ©, 3© e 9© minutos. Substituiu-se a salmoura enrequecida em sais por 1 Kg de CaCl^ a ©,5> 7 aos 3© e 9© minutos. Ao fim de 15©

minutos recupera-se a solução do produto por esvaziamento, h heparina é agora precipitada com etanol, moída, lavada com álcool depois seca na estufa sob vácuo, Recupera-se 120 g de um produto em dó com as características seguintes;

- actividade biológica to ds 100 5)

- teor em sódio 5 0,,03

- teor em cálcio ; 9,2

Ai

20,6 κ 10' unidades CrendimenPor dosagem com azul de toluidina (0,P. DUCLOS, HEPARINE, Ed. Masson, p. 285) detectou-se 0,6 X de heparina inicial nas soluções de salmoura e de lavagem dos eléctrodos, Isto prova bem a quase totalidade de impermeabilidade das membranas ã heparina»

PREPARAÇÃO B UTILIZANDO UMA HEPARINA SÓDICA PURA

115 g ds heparina sódica (seja 20,6 x 10 unidades segundo a Pharmacopé© Europèenne, Ed. 1990, página 333, monogrs fia de Heparinato de sódio - titulação s V.2.2.6.) são colocados em solução com 900 g ds água» Esta solução é submitida a uma electrodiálise, os iões são transferidos progressivamente para uma solução de salmoura com a composição inicial seguintes CaCl^, : 5 g; H,_,0 ϊ 1 í<g» Os eléctrodos do aparelho são lavados com 1,2 litro de KC1 a 1 X, qus recircula em contínuo, As adições de 100 g de uma solução de CaCl.-, a 38,5 X são efectuadas no produto aos 0, 30 e 90 minutos, Substituiu-se a salmoura enrsquscida em sais por i Kg de CaCI„_> a 0,5 X aos 30 e 90 minutos. Ao fim de 150 j£» minutos, recupera-se a solução produto por esvazeamento, A heparina é agora precipitada com etanol, moída, lavada com álcool depois seca na estufa sob vácuo. Recuperou-se 120 g de um produto em pó com as características seguintes!

- actividade biológica s 20,6 χ 10& unidades (rendimento de 188 X)

- teor em sódio £ ®,@3 %

- teor em cálcio s 9,2 X

EXEMPLO 2s Produção ds Sal de Cálcio da Nadroparina ,-·ό (seja ó2,® x 10 unidades 335 - 337), obtidas como

220 g de nadroparina sódica anti-Xa segundo Path» Biol, 1988, 36. descrita no exemplo 1 da Patente US-4 68ó 288, são colocados em solução com 186® g de água» Esta solução é dividida em duas partes iguais, e cada parte é submita a uma electrodiálise Co aparelho não pode tratar um litro por lote), os iões são progressivamente transferidos para uma solução de salmoura com a composição inicial seguinte ϊ CaCl₇ 5 5 g/Η,,Ο s í Kg» Os eléctrodos do aparelho são lavados em contínuo, As adições de 100 g de uma solução de CaCl.-, a 38,3 % são efectuadas no produto aos 0, 26 e z.

minutos para a electrodiálise do primeiro lote s aos 0, 37 e 77 minutos para a electrodiálise do segundo lote» A salmoura & substituída por 1 litro de CaCl_o a 0,5 % em cada adição de CaCl_o à solução» □ pH da solução é mantido entre 6 e 7 através de ajuste com Ca(0H)_o. Ao fim ds 83 minutos para a primeira electrodiálise e de 127 minutos para a segunda, recuperou-se o produto por vazamento e lavagem do circuita do produto com águ.a destilada» A nadroparina cálcica é agora precipitada com etanol, moída, lavada com etanol e seca na estufa sob vácuo» Recuperou-se 22® g de produto em pó com as características seguintes:

- actividade biológica s 62,7 x 10 unidades anti-Xa (rendimento aproximadamente de 10£t X) ·- teor em sódio : 0,08 X

- teor em cálcio s 9,8 X

Através da ensaia de precipitação com etanol estimou-s que menos do que ζ^,θί 7 da quantidade de nadroparina foi perdid através das membranas.

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a preparação de um sal de cálcio de heparina ou de seus fragmentos ou fracções, caracterizado por fazer circular uma solução de sal de sódio de heparina ou de suas fracções ou fragmentos e uma solução de um sal solúvel de cálcio, dentro de um aparelho de electrodiálise que compreende membranaspermeáveis aos aniSes e de membranas permeáveis aos catiSes nuaia sucessão alternada, permitindo a circulação dos líquidos.

   ter
2. 2sí. — ProuesSu de acordo com a reivindicação í, carac— ado por a electrodiálise ser conduzida sobre uma tensão de 2 vo1tz cm.
3. 3â. ·- Processo de acordo com a reivindicação í, carac— terizado por a eletrodiáliss ser conduzida sobre uma tensão de 5 a 3® volt/cm.
4. 4ê. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por as membranas utilizadas permitirem a. passagem unicamente de moléculas tendo um peso molecular inferior a. cerca de 5€>® daltons.
5. 5â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, cara.cterizado por como sal de câcio se utilizar o óâ. — Processo de ã 5. caracterizado cações 1 acordo com qualquer u.ma das reivindipor a electrodiálise ser conduzida a uma. temperatura, desde ® a 8®°C.

   — í O ~
6. 7â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, terizado por a electrodiálise ser conduzida â temperatura te,