PT98297B

PT98297B - Processo para a preparacao de cristais cationicos da hormona de crescimento

Info

Publication number: PT98297B
Application number: PT98297A
Authority: PT
Inventors: Flemming Junker; Claus Friis Theisen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-11
Publication date: 1999-01-29
Also published as: ES2060399T3; AU666465B2; DE69103755D1; PT98297A; EP0540582A1; HU9300067D0; HU210323B; ZA915446B; WO1992000998A1; US6117984A; JPH05507497A; EP0540582B1; HUT64086A; DK0540582T3; CA2086087C; DE69103755T2; CA2086087A1; DK168790D0; IE67054B1; NZ238904A

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CRISTAIS CATIÕNICOS DA HORMONA DE CRESCIMENTO

Âmbito da Presente Invenção

A presente invenção refere-se a um método para a produção de cristais da hormona do crescimento na presença de catiões, a novos cristais da hormona do crescimento e a preparações que contêm estes novos cristais.

Antecedentes da Presente Invenção

As hormonas do crescimento, no homem e nos animais domésticos comuns, consistem em proteínas de aproximadamente 191 aminoácidos, sintetizadas e segregadas a partir do lobo anterior da pituitária. A hormona do crescimento constitui a principal hormona envolvida na regulação não só do crescimento somático como também na regulação do metabolismo das proteínas, hidratos de carbono e lípidos.

Durante os últimos 40 anos ou mais dedicou-se a maior atenção ao esclarecimento da função bioquímica das

w hormonas do crescimento de diversas espécies . A razão de todo este interesse pela função molecular destas proteínas residia no seu interesse comercial tanto nos circulos médico como veterinário. Actualmente, já se clonou o gene da HC e tanto a hormona do crescimento humano (HCh) como Met-HCh são correntemente produzidas por biossíntese utilizando culturas de células de bactérias e de mamíferos.

As composições farmacêuticas de HC tendem a ser instáveis. Originam-se produtos de degradação tais como os produtos desamidados ou sulfoxidados e formas diméricas ou poliméricas, especialmente em soluções de HC.Contudo, actualmente a HC é liofilizada e armazenada numa forma liofilizada a 4°C até ser reconstituída pelo paciente, antes de ser utilizada.

As preparações, depois de reconstituídas são, preferencialmente, armazenadas a 4°C para minimizar a degradação em solução. No entanto, poderá ocorrer alguma degradação durante o referido armazenamento se o seu período de duração for superior a cerca de 14 dias. Existe, portanto uma necessidade, nesta especialidade no que se refere a preparações de HC mais estáveis.

Constituiria também um passo vantajoso evitar a liofilização na produção de preparações de HC. A liofilização é um processo demorado e dispendioso e constitui muitas vezes também um procedimento limitativo devido à capacidade do liofilizador.

A presente invenção baseia-se no reconhecimento surpreendente de que é possível preencher os requisitos anteriormente referidos através de um passo de cristalização na produção de

HC.

Apesar de se encontrar facilmente disponível em quantidades suficientes para cristalização, não tem sido possível, até à data, levar a efeito uma cristalização de HC bem sucedida. Foram referidos por diversas fontes microcristais ou material amorfo (Jones e outros, BioTechnology (1987) 5,499-500; Wilhelmi e outros, J. Biol. Chem (1989) 208, 719-721; e Bell e outros, J. Biol. Chem (1985) 260, 8520-8525.

método de gota pendente constitui o método mais comum utilizado para esta finalidade. Tem sido divulgado que, aparentemente, devido à heterogenicidade entre as preparações de hormona do crescimento ,as dimensões e configuração dos cristais variam significativamente. Os maiores cristais foram referidos por Jones e outros (1987). Para os seus bem sucedidos ensaios, utilizaram uma mistura de polietileno-glicol 3500 e de β-octil-glicosido, a pH neutro. Clarkson e outros (1989) referiram que a utilização de álcooisinferiores e de acetonas permitia a criação de cristais de 0,001 a 0,005 milímetros cúbicos, com diversas conformações. Contudo, para produção comercial de cristais de

HC a.o._# nenhum dos métodos conhecidos é adequado devido ao facto de serem necessários períodos de crescimento que variam entre diversas semanas e um ano.

A hormona do crescimento de bovino foi formulada para uso veterinário na forma de uma mistura de iões bivalentes e de um óleo (EP 343 696) . Mediante a adição de ZnCl2 à hormona do crescimento de bovino ou de ovino, na presença de lípidos produziram-se partículas indefinidas para dar origem a uma formulação de libertação retardada. Dispersou-se a hormona do crescimento no veículo, de tal modo a que fossem capturadas 1 a 4 moléculas de Zn por molécula de hormona do crescimento. Prepararam-se as soluções na presença de concentrações variáveis de solutos de desnaturação ( 1 a 4 M de ureia) a pH elevado (9,5). A reprodução deste processo com HCh demonstrou que não é possível produzir cristais deste modo.

De acordo com a literatura sobre a matéria sabe-se que a presença de catiões bivalentes durante o processo de cristalização permite não só uma excelente orientação durante a análise como também melhores condições físicas para a cristalização da insulina ( por exemlo, patente norteamericana n^a 2174862). No entanto, a hormona do crescimento é mais do que três vezes maior do que a insulina e possui uma conformação totalmente diferente.Surpreendentemente verificou-se que a adição de catiões às soluções contendo HCh permite actualmente a criação de cristais uniformes e estáveis de hormona do crescimento com elevado rendimento. Para além disso, o tempo dispendido na formação de cristais de HCh de alta qualidade é relativamente curto.

Resumo da Presente Invenção

No seu aspecto mais lato a presente invenção refere-se a um processo para a produção de cristais catiónicos de HC ou de derivados de HC, constituído pelos passos seguintes:

a) adição de catiões de natureza orgânica ou inorgânica a uma solução de HC ou de seus derivados a um pH entre 5 e 8,

b) desenvolvimento dos cristais a uma temperatura compreendida entre o°C e 30°C, aproximadamente e,

c) isolamento dos cristais cationicos, de acordo com métodos conhecidos.

No contexto da preente invenção considera-se que a HC engloba todas as espécies de HC incluindo a dos seres humanos, de bovino, de suino, de salmão, de truta ou de atum. Considerase que os derivados de HC abrangem HC dos seres humanos ou de outras espécies animais com menor variação na sequência das proteínas. Assim, podem ter sido eliminados alguns resíduos aminoácidos ou substituídos por outros resíduos aminoácidos. Também se encontram englobadas as formas truncadas da hormona do crescimento e seus derivados, assim como hormonas do crescimento com resíduos aminoácidos adicionados às

extremidades dos terminais N e/ou C da proteína, tal como

Met-HCh.

O processo de acordo com a presente invenção, faz com que pela primeira vez seja possível produzir quimicamente cristais catiónicos de HC, estáveis e uniformes. 0 presente processo possibilita também a produção de cristais maiores e menores de hormona do crescimento, se tal fôr necessário.

pH no passo referido na alínea a) encontra-se preferencialmente entre 5,0 e 7,5, mais preferencialmente entre 5,8 e 6,5 e ainda mais preferencialmente entre 6,0 e 6,5.

De acordo com um aspecto preferencial da presente invenção a hormona do crescimento é de natureza humana.

Os catiões podem ser de natureza orgânica ou inorgânica. Dá-se preferência aos catiões bivalentes e entre estes modificou-se um catião inorgânico tal como ZN f para ser o mais adequado possível à rápida formação de cristais estáveis de HC. Podem utilizar-se também misturas destes

I catiões.

Deverão adicionar-se os catiões numa quantidade tal que proporcione uma rápida e eficiente formação de cristais bem definidos. O limite superior para a quantidade de catiões adicionada será uma quantidade que origine uma precipitação inespecífica de quantidades substanciais de material amorfo.

Se se utilizar Zn

as concentrações adequadas oscilarão entre aproximadamente 0,2 e 10 mol de ZN⁺⁺/mol de HC. No entanto, se a mistura de reacção para cristalização contiver um tampão ou outro composto que seja capaz de fixar alguns dos catiões, por exemplo numa forma complexa, será necessária uma maior quantidade de catião devido ao facto de alguns catiões não se encontrarem disponíveis para o processo de cristalização.

Utiliza-se ZN⁺⁺ preferencialmente numa quantidade que origine a formação de cristais de HC com uma proporção molar entre ZN⁺⁺ e HC compreendida, aproximadamente entre 0,2 e 10, preferencialmente entre aproximadamente 0,5 e 5 e mais preferencialmente entre 0,5 e 2 aproximadamente.

De acordo com um aspecto preferencial da presente invenção, no passo referido na alínea a), adiciona-se um solvente orgânico ou uma mistura de solventes orgânicos. Pode seleccionar-se o solvente orgânico entre o grupo constituído por álcoois alifátieos, cíclicos ou aromáticos de cadeia curta e cetonas. Os solventes orgânicos adequados consistem em acetona, metanol, etanol e 2-propanol.0 etanol ou a acetona são solventes orgânicos preferenciais. A concentração do solvente orgânico pode variar entre 0,1 e 50% , v/v, preferencialmente entre 0,1 e 30%, mais preferencialmente entre 0,1 e 20% e ainda mais preferencialmente entre 5 e 15% e bastante mais preferencialmente entre 6 e 12%, v/v.

Pode utilizar-se o processo da presente invenção como um rápido e eficiente procedimento a jusante do processamento da hormona do crescimento em questão devido à formação de cristais em grandes volumes de soluções.

A presente invenção refere-se também a novos cristais catiónicos de HC ou de derivados de HC.

Os cristais consistem preferencialmente em cristais ++ de HCh. 0 catiao consiste preferencialmente em Zn ++ proporção molar entre Zn e HC estará compreendida aproximadamente entre 0,2 e a usualmente e 10, preferencialmente entre 0,5 e 5 e mais preferencialmente entre 0,5 e 2,0. As dimensões dos cristais dependerão da proporção ZN⁺⁺/HC e da escolha e teor do solvente utilizado no processo.De acordo com a presente invenção, demonstra-se que os criatais de HCh possuem uma potência biológica idêntica à da solução normalizada de HC, em ensaios in vitro e in vivo . Deste modo,os novos cristais de HC podem ser utilizados com as mesmas finalidades das preparações de HCh comercialmente disponíveis.

As preparações farmacêuticas contendo os novos cristais de HC consistirão habitualmente em soluções ou suspensões e poderão conter os adjuvantes e aditivos usualmente utilizados nas preparações farmacêuticas de HCh tais como tampões glicerol e conservantes. Podem administrarse as preparações segundo as mesmas vias das preparações de

HCh comercialmente disponíveis. Podem também formular-se os cristais como cristais secos que terão de ser reconstituídos antes de se utilizarem.

As preparações farmacêuticas que contêm os novos cristais de HC possuem surpreendentemente uma estabilidade química muito elevada, comparativamente com as preparações produzidas a partir de HC comercialmente disponível.

A presente invenção proporciona, para além disso, a possibilidade de se produzirem preparações farmacêuticas que sejam de maior conveniência, principalmente para os pacientes.

Devido à elevada estabilidade dos cristais em suspensão, a presente invenção torna possível a produção de composições farmacêuticas,que se encontram aptas a serem utilizadas na forma de suspensões, que não necessitam de ser reconstituídas pelos pacientes antes da sua utilização.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção proporciona um instrumento valioso para a produção e purificação de HC.

Descrição Pormenorizada da Presente Invenção

Ajusta-se o material de partida, a hormona do crescimento, qualquer que seja a sua origem e se se desejar, um seu derivado em solução, para uma concentração preferencialmente superior a cerca de 0,1 mg/ml, mais preferencialmente entre 4 e 7 mg/ml aproximadamente e ainda

à	solução
um	solvente
pode	variar
15%	e mais
tais	como a
ou como uma
etanol numa

mais preferencialmente a 6 mg/ml. 0 pH encontrar-se-à compreendido de preferência entre 6,0 e 6,3.

Pode adicionar-se um solvente anteriormente mencionada. O etanol constitu:

orgânico preferencial numa concentração que pode variar entre 0,1 e 20%, de preferência entre 5 preferencialmente entre 6 e 12%.

Podem utilizar-se outros solventes tais como acetona, o metanol ou o propanol, isoladamente ou como uma mistura dos mesmos ou conjuntamente com etanol concentração que varie entre 1 e 50%.

Pode então adicionar-se à solução resultante os catiões de natureza orgânica ou inorgânica.

Um catião preferencial é Zn que se utiliza normalmente numa concentração compreendida entre 0,5 e 10 mol/mol de HC, preferencialmente entre 1,0 e 3,0 mol/mol de HC e mais preferencialmente entre 1,1 e 2,2 mol/mol de HC e de um modo ainda mais preferencial entre 1,2 e 2,0 mol/mol de HC.

Se se utilizarem catiões de natureza inorgânica diferente de Zn⁺⁺, a concentração poderá variar entre 0,5 e 10 mol/mol de HC.

Desenvolvem-se então os cristais durante um período de 1 a 120 horas, de preferência entre 5-72 horas, mais preferencialmente entre 20-48 horas , a uma temperatura compreendida entre 0 e 30°C, de preferência entre 4 e 25°C.

Os cristais podem ser recuperados por centrifugação ou filtração, seguindo-se a sua lavagem e/ou liofilização para se removerem os solventes orgânicos restantes.

As preparações farmacêuticas de cristais secos ou de cristais em suspensão podem então ser formuladas utilizando diversos tampões escolhidos e outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis.

A presente invenção encontra-se ilustrada pelos exemplos que se seguem e que de modo algum a limitam.

Exemplo 1

Cristalização de HCh na presença de Zn—

Incubou-se uma solução de 500 ml de HCh, produzida de acordo com H.Dalboge e outros, Bio-Technology (1987), 5, 161-164, numa concentração de 6 mg/ml, em tampão fosfato 10 mM (NaHgPOzj) e ajustou-se para pH 6,1 com H3PO4. Adicionou-se acetona até uma concentração final de 10% (v/v) e adicionouse depois uma solução de acetato de zinco até uma concentração final de 0,08 mg de ZnAC2 , 2H2Ó/ml « 1,34 mol Zn⁺⁺/mol HCh.

Deixou-se a solução resultante em repouso , à temperatura de 15°C durante 20 horas para se permitir a formação dos cristais.

Após se ter realizado esta operação recuperaram-se os cristais e lavaram-se 3 vezes com tampão de cristalização sem acetona. Examinou-se a cristalização por microscopia e mediu-se as dimensões dos cristais que se verificou estarem compreendidas entre 8 e 12 μπι. Na Figura 1 apresenta-se uma fotomicrografia.

Determinou-se o rendimento da produção de cristais de HCh por solubilização dos cristais lavados em ureia 7M seguindo-se a análise por cromatografia em líquido elevada pressão (CLEP) com permuta iónica.

Verificou-se que o rendimento era superior a 50%.

Exemplo 2

Repetiu-se o Exemplo 1 exceptuando o facto de se ter utilizado Met-HCh em vez de HCh. Os cristais recuperados de acordo com este processo eram idênticos em conformação e dimensões aos obtidos com HCh. 0 rendimento foi superior a

50%.

Exemplo 3

Repetiu-se o Exemplo 1 exceptuando o facto de se ter omitido a adição de acetona.

Os cristais de HCh resultantes deste procedimento eram muito mais pequenos do que os cristais resultantes do Exemplo 1, inferiores a 2 μπι.

Exemplo 4

Repetiu-se o Exemplo 1 sob condições em que se substituiu a acetona por etanol e a temperatura durante o período de crescimento se manteve a 20°C em vez de a 15°C.

Todas as outras condições experimentais se conservaram idênticas às descritas no Exemplo 1. Fazendo variar a concentração de etanol verificou-se que a concentração óptima era de 7,5% (v/v).No caso em que se enriqueceu o fluido- mãe a seguir à fase de cristalização inicial, durante um período de 16 horas, com 4% de etanol e de se diminuiu a temperatura de cristalização de 20°C para 10°C, durante um período de 16 horas, o rendimento aumentou para 80%. As dimensões dos cristais variaram entre 3 e 6 μιη com uma conformação similar à descrita no Exemplo 1.

Exemplo 5

Determinação da quantidade de Zn fixada pelos cristais de HCh

Repetiu-se o Exemplo 1 exceptuando o facto de se haver adicionado etanol segundo uma concentração de 7,5% (v/v) em vez de acetona e de ter deixado que os cristais se formassem durante 16 horas a 20°C e de se haver separado posteriormente os cristais do fluido-mãe por centrifugação, sendo depois lavados uma vez com tampão fosfato.Solubilizaram-se os cristais fazendo o ajustamento do pH para 8,0 com NaOH. Mediu-se a HCh por CLER com permuta iónica ou por determinação por UV.Mediu-se a concentração de Zn por absorção atómica e compararam-se os resultados com os obtidos para a suspensão total de cristais. Verificou-se que a proporção de Zn fixado à HCh era de 1,9 mole de Zn por mole de HCh.

Exemplo 6

Formulação de uma Preparação Farmacêutica Contendo HCh:

Desenvolveram-se os cristais tal como se descreveu no Exemplo 5 e armazenaram-se a 5°C. Isolaram-se então os cristais por centrifugação e subsequente remoção do fluidomãe. Depois secaram-se os cristais por liofilização durante a noite para se obterem cristais secos sem solvente orgânico. Preparou-se uma suspensão farmacêutica dos cristais secos de acordo com a seguinte formulação:

Cristais de HCh 1,3 mg/ml

NaH2PO4,2H2O 3,0 mg/ml

Zn(Ac)2,H2O 0,1 mg/ml

Glicerol 15,0 mg/ml álcool benzílico 15,0 mg/ml

Ajustou-se o pH para 6,2.

Exemplo 7

Repetiu-se o Exemplo 6 com a excepção de se haver omitido Zn(Ac)2,H2O, produzindo-se uma suspensão com a formulação seguinte:

Cristais de HCh

NaH₂PO4,2H₂O

Glicerol álcool benzílico

Ajustou-se o pH para 6,2.

1,3 mg/ml 3,0 mg/ml

15,0 mg/ml 15,0 mg/ml

Exemplo 8

Tratou-se os cristais do mesmo modo que se referiu no Exemplo 6 e formulou-se a suspensão seguinte:

Cristais de HCh	1,3	mg/ml
NaH₂PO₄, 2 H₂0	2,5	mg/ml
NaCl	5,7	mg/ml
álcool benzílico	15,0	mg/ml

Ajustou-se o pH para 6,1.

Exemplo 9

Trataram-se os cristais do mesmo modo que se referiu no Exemplo 6 e formulou-se a suspensão seguinte:

Cristais de HCh	1,3	mg/ml
NaH₂P0₄, 2 H₂0	2,14	mg/ml
NaCl	9,0	mg/ml

Ajustou-se o pH para 6,1.

Exemplo 10

Ensaio da tíbia

Para se calcular a potência biológica in vivo dos cristais de HCh preparados de acordo com a presente invenção efectuou-se um teste com uma tíbia em que se utilizaram ratazanas hipofisectomizadas. Efectuou-se o ensaio de acordo com o método descrito na Farmacopeia Europeia.

Efectuou-se o ensaio utilizando duas preparações de cristais de HCh produzidos de acordo com o Exemplo 1 e formuladas conforme descrito no Exemplo 9 ( F-7 e F-8) contendo cada uma delas uma quantidade que equivalente a 4 UI_Z comparando-se com normalizada de HCh dissolvida.

Obtiveram-se os seguintes resultados:

Quadro 1

se calculou ser uma preparação

Potência das Preparações F-7 e F-8

Ensaio	Potência	Ul/ampola	Limites de conf
Prepar.	% da Soí. Normalizada		95%, %da Sol Normalizada
F-7	90,1	3,9	87,6 - 114,1
F-8	103,8	4,5	90,6 - 110,4
Sol. de HCh Normalizada 1968	= 100,0	= 4,4	—

A partir do ensaio que se efectuou pode concluir-se que os cristais de HCh, de acordo com a presente invenção, possuem uma potência biológica igual à da solução normalizada de HGh, pelo que possuem uma bio-utilização igual à da usual

HCh solubilizada.

Exemplo 11

Desenvolveram-se os cristais de HCh tal como descrito no Exemplo 5. Imediatamente antes da utilização preparou-se uma suspensão por centrifugação dos cristais, remoção subsequente do fluido-mãe e nova suspensão dos cristais em NaH2PO4 10 mM, pH 6,2, o que proporcionou uma concentração final de 0,16 mg de HGh/ml de suspensão.

Utilizou-se a suspensão para se calcular a potência da preparação de cristais de HCh num ensaio de ganho de peso. Efectuou-se este ensaio de acordo com o método descrito na Farmacopeia Europeia com excepção de se ter prolongado o tempo de doseamento até 10 dias no sentido de se optimizar a resposta biológica.

Utilizaram-se duas preparações de cristais de HCh contendo cada uma delas a mesma quantidade de proteina HCh, como preparações de uma amostra normalizada de HCh, que serviu como termo de comparação. A amostra normalizada consistiu numa preparação de HCh liofilizada e reconstituída. Administrou-se a todos os animais a mesma quantidade de HCh.

Verificou-se que a potêcia das preparações de cristais de HCh era de 92,6 % da amostra normalizada. Os limites de confiança a 95% foram de 79,1-126,4% em relação à amostra normalizada.

Demonstra-se deste modo que a preparação de cristais de HCh possui uma potência biológica igual à da solução normalizada de HCh.

Exemplo 12

Estabilidade dos Cristais de HCh Armazenados em suspensão, durante 6 Meses, a 22-24°C.

Os cristais formaram-se tal como se descreveu no

Exemplo 1 exceptuando-se o facto de se haver adicionado 7,5% de acetona (v/v) em vez de 10%.

Deixaram-se os cristais em suspensão no fluido-mãe durante 6 meses a 22-24°C. Removeu-se uma amostra de cristais de HCh por centrifugação, lavou-se uma vez com tampão de cristalização sem acetona e solubilizou-se ajustando o pH para 8,0.

Submeteram-se os cristais de HCh a análise por CLER de permuta iónica e a cromatografia em gás pressurizado (CGP) para detecção respectivamente das formas desamido e desintegradas ou dímeros e polímeros.

Quando se compararam os dados com os de uma preparação de HCh liofilizada reconstituída armazenada a 25°C durante .32 dias, o teor do pico principal de HCh nos cristais de HCh reconstituída foi superior ao da HCh liofilizada e reconstituída, armazenada sob condições idênticas (ver Quadro 2).

Quadro 2

HCh reconst. Cristais

Armazenamento	25°C 32 dias	22-24°C 6 meses
Pico principal CLER-PI (%)	71,2	92,3
Dímeros (%)	0,7	1,2
Polímeros (%)	0,3	0, 3
Grupos Desamido (%)	25,9	5,0
Grupos Didesamido(%)	2,9	1,8
Formas Desintegradas (%)	-	-

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de cristais catiónicos da hormona de crescimento ou de seus derivados, caracterizado pelo facto:

a) de se adicionarem catiões de origem inorgânica ou orgânica a uma solução de hormona do crescimento ou seus derivados a um pH compreendido entre 5 e 8?

b) de se desenvolverem os cristais a uma temperatura compreendida entre zero e 30°C, aproximadamente; e

c) de se isolarem os cristais catiónicos por métodos convencionais.
2,- Processo de acordo com a reivindicação Ϊ, carac- terizado pelo facto de decorrer a fase a) a um pH compreendido entre 5,0 e 7,5, de preferência entre 5,0 a 6,8.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se realizar a fase a) a um pH inferior a 7.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se realizar a fase a) a um pH compreendido en tre 5,8 e 6,5, de preferência entre 6,0 e 6,5.
5.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se adicionar na fase a) um dissolvente ou uma mistura de dissolventes orgânicos.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracte rizado pelo facto de' se escolher o dissolvente orgânico no grupo constituído por álcoois alifáticos inferiores (cadeia curta), álcoois cíclicos, álcoois aromáticos e cetonas.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracte rizado pelo facto de se escolher.o dissolvente orgânico entre acetona, metanol, etanol e 2-propanol.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracte rizado pelo facto de se utilizar etanol ou acetona como dissolven3 te orgânico.

t
9.- Processo de acordo com uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo facto de se adicionar o dissolvente orgânico em uma concentração entre 1 e 50% V/V, aproximadamente.
10. - Processo de acordo com a .reivindicação 9, caracterizado pelo facto de se adicionar o dissolvente orgânico em uma concentração entre 0,1 e 30%, de preferência entre 0,1 e 20% ou com maior preferência entre 5 e 15% e da forma mais conveniente en tre 6 e 12%.
11. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto.de utilizar um .catião divalente· .
12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de utilizar como catião divalente Zn^{+ +} .
13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se adicionar Zn⁺⁺ em uma concentração inferior ao limite de precipitação inespecíf.ica do material amorfo.
14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, carac terizado pelo facto de se adicionar Zn*⁺ em uma concentração entre

0,5 a 10 moles de Zn⁺⁺ para cada mole de hormona de crescimento.
15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, carac terizado pelo facto de se utilizar Zn em uma concentração compreendida entre 1,0 a 3,0 moles de Zn⁺⁺/mole de hormona de crescimento, de preferência entre 1,2 a 2,2 moles de Zn⁺⁺/mole de hormona de crescimento e da forma mais preferida entre 1,2 e 2,0 moles de Zn /mole de hormona de crescimento.
16. “ Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações precedentes, caracterizado pelo facto de a hormona de crescimento ser a hormona de crescimento humana ou seus derivados.
17. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de se realizar a fase b) a uma temperatura compreendida entre 4 e 25°C, aproximadamente.
18. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a relação molar de Zn⁺⁺ e hormona de crescimento estar compreendida entre 0,2 e 10, aproximadamente, de preferência entre 0,5 e 5, aproximadamente., e com maior vantagem entre 0,5 e 2,0, aproximadamente..
19. - Processo para a preparação de composições farma cêuticas, caracterizado pelo facto de se misturarem cristais pre- parados pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 18, como componente activo, com um ou mais veículos acei táveis em farmácia.
20.- Processo de acordo com as reivindicações 1 a 15 caracterizado pelo facto de realizar a purificação e/ou isolamento por meio de cristalização.