JP2524446B2 - 成長ホルモン結晶及びこのようなｇｈ―結晶の製造方法 - Google Patents

成長ホルモン結晶及びこのようなｇｈ―結晶の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は陽イオンの存在下において成長ホルモン結晶
を製造する方法、新規なる成長ホルモン結晶、及びこの
ような新規なる結晶を含む薬品製剤に関する。
発明の背景 人間及び一般の家畜に由来する成長ホルモン（GH）
は、下垂体前葉から合成且つ分泌された約191個のアミ
ノ酸のタンパク質である。成長ホルモンは身体の成長の
調節に関与するのみでなく、タンパク質、炭水化物及び
脂質の代謝の調節にも関与する重要なホルモンである。
この40年間以上にわたって多大なる注目があらゆる種
に由来する成長ホルモンの生化学機能の解明に向けられ
てきた。このタンパク質の分子機能におけるこの感心の
理由は獣医学及び医学的環境の両方からの商業的感心に
基づく。GH遺伝子は現在クローン化されており、そして
ヒト成長ホルモン（hGH）及びMet−hGHは現在細菌及び
哺乳類細胞培養物の両方の利用を介して生体合成的に製
造されている。
GHの薬品製剤は不安定になりがちである。劣化生成
物、例えば脱アミド化又はスルホキシド化生成物、並び
にダイマー又はポリマー形態が生ずる−特にGHの溶液に
おいて。従って、現在GHは凍結乾燥され、そして使用開
始前に患者によって再形成されるまでこの凍結乾燥状態
において４℃で保存されている。
再形成せしめた製剤は好ましくは溶液の中での劣化を
最小とするために４℃で保存される。しかしながら、約
14日間の期間にまでわたりうるこのような保存の間に若
干の劣化が生じうる。従って、より安定なGHの製剤が当
業界において要望されている。
更に、GH製剤の製造において凍結乾燥工程を除くこと
は有利であろう。凍結乾燥は時間及び費用のかかる処理
であり、そして凍結乾燥庫の容量に起因してしばしば規
制された工程でもある。
本発明は、上記した要望がGHの製造における結晶化工
程によって満たされるという驚くべき認識に基づいてい
る。
結晶化にとって十分の量において容易に獲得できるに
もかかわらず、GHは今までのところ効果的に結晶化され
ていない。微小結晶又はアモルファス物質が種々の起源
から報告されている：（Jonesら著、Bio−Technology
（1987）5,499−500;Wilheimら著、J.Biol.Chem（198
4）176,735−745;Clarksonら著、J.Mol.Biol.（1989）2
08,719−721;及びBellら著、J.Biol.Chem（1985）260,8
520−8525）。
懸滴法がこの目的にとっての利用において最も一般的
な方法である。成長ホルモン製剤における不均質性に明
らかに起因して、結晶の大きさ及び形態は大いに変化す
ることが報告されている。最も大きい結晶はJonesら（1
987）により報告されている。彼らの成功実験に関し
て、彼らは中性pHのポリエチレングリコール3500とベー
ターオクチルグルコシドの混合物を利用している。Clar
ksonら（1989）は、低級アルコールとアセトンの利用が
種々の形態の0.001〜0.005立方mmの結晶の生成を可能と
することを報告している。しかしながらどの公知の方法
もGH結晶の商業的製造に適当でなく、その理由は数週間
から１年までの成長時間が必要とされる事実に起因す
る。
獣医学的利用のために二価イオン及び油の混合物の中
で牛成長ホルモンが製剤化されている（EP 343 696
号）。脂質の存在下において、牛又は羊成長ホルモンの
いづれかにZncl2を添加することによって、長期放出製
剤を形成するような定まっていない粒子が製造されてい
る。成長ホルモン分子当り１〜４個のZn分子が捕捉され
るような手法において成長ホルモンを分散させている。
この溶液は高いpH（9.5）で種々の濃度の変性溶質（１
〜4Mの尿素）の存在下において調製されている。hGHに
よるこの工程の再現は、この手法では結晶を製造するこ
とができないことを示した。
論文より、結晶工程中の二価陽イオンの存在は、分析
の際に優れた配向性を可能とするのみでなく、インスリ
ンの結晶化のための物理学的条件の改善を可能とするこ
とがよく知られている（例えば米国特許第2,174,862
号）。ところで成長ホルモンはインスリンよりも３倍大
きく、従って全体的に異なるコンホメーションを有して
いる。驚くべきことに、hGHを含む溶液への陽イオンの
添加は成長ホルモンの安定な均一な結晶を高収量におい
て生じせしめることを可能とする。更に、高品質のhGH
結晶の形成にとって利用される時間は比較的短い。
発明の概要 その最も広い観点において、本発明はGH又はGH誘導体
の陽イオン結晶の製造のための方法に関連し、この方法
は以下の段階： ａ）pH5〜８でGH又はその誘導体の溶液に無機又は有機
的性質の陽イオンを加え、 ｂ）約０〜30℃の温度で結晶を成長させ、そして ｃ）既知の手段によりこの陽イオン結晶を単離すること
を含んで成る。
本明細書において、GHは人間、牛、豚、羊、サケ、マ
ス、又はマグロを含む全ての種のGHを包含することを意
図とする。GH誘導体はタンパク質配列における若干の変
異を伴う人間又は動物の種のGHを包含することを意図す
る。従っていくつかのアミノ酸残基が欠失しているか、
又は他のアミノ酸残基によって交換されていることがあ
る。更には成長ホルモン及びその誘導体の短縮型、並び
にタンパク質のＮ−及び／又はＣ−末端にアミノ酸残基
が付加されている成長ホルモン、例えばMet−hGHを包含
する。
本発明に関する方法は、はじめて化学的に安定であ
り、且つ均一な陽イオン−GH結晶を製造することを可能
にした。更に、本法は要望に従って成長ホルモンの大小
両方の結晶の製造が可能である。
段階ａ）におけるpHは好ましくは5.0〜7.5、より好ま
しくは5.0〜6.8、更により好ましくは5.8〜6.5、そして
最も好ましくは6.0〜6.5である。
本発明の好ましい態様に関して、該成長ホルモンは人
間性（humannature）である。
該陽イオンは無機又は有機的性質でありうる。二価陽
イオンが好ましく、そしてそのうちで無機陽イオン、例
えばZn++が安定なGH結晶の迅速な形成に適することが見
い出されている。これらの陽イオンの混合物も利用でき
る。
該陽イオンはよく規定された結晶の迅速且つ効率的な
形成を提供するような量において添加すべきである。添
加する陽イオンの量の上限値は、かなりの量のアモルフ
ァス物質の無秩序な沈殿を生じせしめるであろう量であ
る。
Zn++を用いる場合、適当な濃度は典型的には0.2〜10
モルZn++/モルGHであろう。しかしながら、この結晶反
応混合物が多少の陽イオンと結合できる（例えば錯体の
形態において）緩衝剤又はその他の化学物を含んでいる
とき、この多少の陽イオンが結晶過程にとって有用とな
らないため、より高い濃度の陽イオンが必要とされるで
あろう。
Zn++はVH結晶の形成を生じせしめるであろう量におい
て利用されることが好ましく、Zn++とGHのモル比は約0.
2〜約10、好ましくは約0.5〜約５、そしてより好ましく
は約0.5〜約２であろう。
本発明の好ましい態様において、段階ａ）に有機溶媒
又は有機溶媒の混合物を加える。この有機溶媒は短鎖の
脂肪族、環式又は芳香族アルコール及びケトンより成る
群から選ばれる。適当な有機溶媒はアセトン、メタノー
ル、エタノール及び２−プロパノールである。好ましい
有機溶媒はエタノール又はアセトンである。有機溶媒の
濃度は0.1〜50容量％、好ましくは0.1〜30容量％、より
好ましくは0.1〜20容量％、更により好ましくは５〜15
容量％、そして最も好ましくは６〜12容量％である。
本法は大量溶液中の結晶の形成に基づいて、問題の成
長ホルモンの迅速且つ効率的な下流処理（downstream p
rocessing）として利用されうる。
本発明はGH又はGH誘導体の新規なる陽イオン結晶にも
関連する。
該結晶は好ましくはhGH結晶又はhGH誘導体の結晶であ
る。該陽イオンは好ましくはZn++であり、そしてZn++と
GHとのモル比は典型的には約0.2〜10、好ましくは0.5〜
５、そしてより好ましくは0.5〜2.0である。結晶の大き
さはZn++対GHの比、並びにこの方法において用いる溶媒
の選択及び含有量に依存するであろう。
本発明に関するhGH結晶は試験管内及び生体内試験に
おいて、可溶化hGH標準品と類似の生物的な効力を有す
ることが示された。従って新規なるGH結晶は商業的に入
手できるhGH製剤と同じ適用に関して利用されうる。
新規なるGH結晶を含む薬品製剤は典型的には溶液又は
懸濁物であり、そして薬学的hGH製剤のために利用され
ている通常の補助剤及び添加剤、例えば緩衝剤、グリセ
ロール及び防腐剤を含みうる。この製剤は市販のhGH製
剤と同じ方法において投与されうる。該結晶は乾燥結晶
品として製剤化されてもよく、これは従って使用開始前
に再形成されうる。
新規なるGH結晶を含む薬品製剤は驚くべきことに、商
業的に入手できるGHから作られた製剤と比べて非常に高
い化学的安定性を有する。
従って本発明は特に患者にとってより便利な薬品製剤
の製造の可能性を提供する。懸濁物におけるこの結晶の
高い安定性に起因して、本発明は例えば、使用前に患者
によって再形成されることを必要としないであろう、懸
濁物の形態にあるすぐに使用できる薬品製剤の製造を可
能とする。
本発明の更なる観点において、GHの製造及び精製目的
のための有利な手段を提供する。
発明の詳細な説明 任意の起源であってよく、且つ所望するならば溶液中
に誘導されている出発材料である成長ホルモンを約0.1m
g/ml以上、より好ましくは約４〜7mg/ml、そして最も好
ましくは約6mg/mlの濃度に調整する。このpHは6.0〜6.3
であることが好ましい。
上記の溶液に有機溶媒を加えてよい。好ましい有機溶
媒はエタノールであり、その濃度は0.1〜20％、好まし
くは５〜15％、そして最も好ましくは６〜12％において
変えることができる。
エタノールの代わりに、又はそれと一緒にその他の溶
媒、例えばアセトン、メタノールもしくはプロパノール
を単独で、又は混合物として１〜50％の範囲内の濃度に
おいて利用してよい。
次にここで得られる溶液に、無機もしくは有機的性質
の陽イオン、又はその混合物を加える。
好ましい陽イオンはZn++であり、これは通常は0.5〜1
0モル／モルGH、好ましくは1.0〜3.0モル／モルGH、よ
り好ましくは1.1〜2.2モル／モルGH、そして最も好まし
くは1.2〜2.0モル／モルGHの濃度において用いらるれで
あろう。
Zn++以外の無機的陽イオンを用いるとき、その濃度は
0.5〜10モル／モルGHで変えられうる。
次に結晶を１〜120時間、好ましくは５〜72時間、最
も好ましくは20〜48時間の期間にわたり、０〜30℃、好
ましくは４〜25℃の温度で成長させる。
この結晶を遠心又は濾過によって回収し、次いで残留
有機溶媒を除去するために洗浄及び／又は凍結乾燥して
よい。
乾燥結晶又は懸濁物中の結晶の薬品製剤がこれより、
種々の選ばれた緩衝剤及びその他の薬学的に受け入れら
れている添加剤を用いて製剤化されうる。
本発明を限定ではない以下の実施例により更に説明す
る： 実施例１ Zn++の存在下におけるhGHの結晶化 H.Dalbφgeら著、Bio−Thchnology（1987）,5,161−1
64に従って製造した。6mg/mlの濃度のhGH溶液500mlを10
mMのリン酸緩衝液（NaH2,PO4）中でインキュベートし、
そしてH3PO4によりpH6.1に調整した。最終濃度が10％
（容量）となるまでアセトンを加え、次いで0.08mgのZn
Ac2、2H2O/ml（1.34モルZn++/モルhGH）の最終濃度とな
るまで酢酸亜鉛溶液を加えた。
ここで得られる溶液を15℃で20時間放置し、これによ
って結晶を形成させた。
その後、この結晶を回収し、そしてアセトンを含まな
い結晶化緩衝液によって３回洗った。結晶化は顕微鏡に
より検査し、そして結晶の大きさは８〜12μｍであると
測定された。顕微鏡写真を図１に示す。
hGHの結晶の収率は、洗浄した結晶を7Mの尿素に可溶
化し、次いでイオン変換HPLC分析することによって決定
した。
収率は50％以上であった。
実施例２ 実施例１を繰り返したが、ただしhGHの代わりにMet−
hGHを用いた。この工程により回収した結晶は、hGHによ
って得られたものと形態及び大きさにおいて同じであっ
た。収率は50％以上であった。
実施例３ 実施例１も繰り返したが、ただしアセトンの添加を省
いた。この工程から得られるhGHの結晶は、実施例１か
ら得られた結晶よりもかなり小さく、２μｍ以下であっ
た。
実施例４ アセトンをエタノールで代替し、そして成長期間中の
温度を15℃の代わりに20℃とした条件のもとで実施例１
を繰り返した。その他の全ての実験条件は実施例１に記
載のものと同一である。エタノール濃度を変えることに
より、その最適濃度は7.5％（容量）であることが見い
出せた。最初の16時間にわたる結晶化の後にこの母液に
更に４％（容量）のエタノールを添加し、そして結晶温
度を16時間にわたって20℃から10℃に下げたとき、収率
は＞80％に上昇した。結晶の大きさは３〜６μｍであ
り、その形態は実施例１に詳細のものと類似していた。
実施例５ hGH結晶中のZn結合の量の決定 実施例１を繰り返したが、ただしアセトンの代わりに
7.5％（容量）の濃度においてエタノールを加え、そし
て結晶を20℃で16時間にわたり形成させ、次いでこの結
晶を遠心によって母液から分け、そして10mMのリン酸緩
衝液で１回洗った。pHをNaOHによって8.0にまで上昇さ
せることによって結晶を可溶化させた。このhGHをイオ
ン交換HPLCにより、又はUV測定によって測定した。Zn濃
度は原子吸収によって測定し、そして得られる結果を全
結晶懸濁物に関して得られた値と比べた。結合Zn対hGH
のモル当り1.9モルのZnであることが見い出せた。
実施例６ hGHを含む薬品製剤の組成： 実施例５に記載の通りに結晶を成長させ、そして４℃
で保存した。次にこの結晶を遠心によって単離し、次い
で母液を除去した。次にこの結晶を一夜凍結乾燥させ、
残留有機溶媒を有さない乾燥結晶を得た。乾燥結晶の薬
品懸濁物を以下の組成に従って調製した： hGH結晶 1.3mg/ml NaH2PO4,2H2O 3.0mg/ml Zn（Ac）2,H2O 0.1mg/ml グリセロール 15.0mg/ml ベンジルアルコール 15.0mg/ml pHを6.2に調整。
実施例７ 実施例６を繰り返したが、ただしZn（Ac）2,H2Oを省
き、以下の組成の懸濁物を得た： hGH結晶 1.3mg/ml NaH2PO4,2H2O 3.0mg/ml グリセロール 15.0mg/ml ベンジルアルコール 15.0mg/ml pHを6.2に調整。
実施例８ 実施例６と同じ方法において結晶を処理し、そして以
下の懸濁物を製剤化した： hGH結晶 1.3mg/ml NaH2PO4,2H2O 2.5mg/ml NaCl 5.7mg/ml ベンジルアルコール 15.0mg/ml pHを6.2に調整。
実施例９ 実施例６と同じ方法において結晶を処理し、そして以
下の懸濁物を製剤化した： hGH結晶 1.3 mg/ml NaH2PO4,2H2O 2.14mg/ml NaCl 9.0 mg/ml pHを6.1に調整。
実施例10 脛骨試験 本発明に従って調製したhGH結晶の生体内生物学的効
力を評価するため、下垂体を切除したラットを用いて脛
骨試験を行った。この試験はEuropean Pharmacopoeiaに
詳細の方法に従って行った。
例１に従って製造し、そして例９に従って製剤として
製剤化した、それぞれ4IUに相当する評価値を含んでい
る２種類のhGH結晶製剤（Ｆ−７とＦ−８）を溶解せし
めた標準hGH製剤に対して試験した。
以下の結果が得られた： 実施した試験から、本発明に関するhGH結晶は可溶化h
GH標準品と等しい生物学的効力を有し、従って通常の可
溶化hGHと同等な生物学的有用性を有するであろうこと
が考えられうる。
実施例11 実施例５に記載の通りにhGH結晶を成長させた。使用
直前にこの結晶を遠心にかけ、次いで、母液を除去し、
そしてこの結晶を無菌の10mMのNaH2PO4に再懸濁して最
終濃度が0.16mghGH/ml懸濁物となるようにして懸濁物を
調製した。
重量増加試験においてこのhGH結晶製剤の効力を評価
するのにこの懸濁物を利用した。この試験はEuropean P
harmacopoeiaに記載の方法に従って行ったが、ただし生
物学的応答を最高にするために投与期間を10日までに延
長した。
二種類のhGH結晶製剤を用い、それぞれは対抗して試
験した成長ホルモン標準品の製剤と同じhGHタンパク質
量を含んでいた。この標準品は形成させた凍結乾燥hGH
製剤である。全ての動物は同量のhGHを受け取った。
hGH結晶製剤の効力は標準品の92.6％であることが見
い出せた。95％の信頼限界は標準品の79.1−126.4％で
あった。
従ってhGH結晶製剤は、可溶化hGH標準品と同等な生物
学的効力を有することが示された。
実施例12 22−24℃にて６ケ月にわたり懸濁物において保存したhG
H結晶の安定性 実施例１に記載の通り結晶に形成せしめたが、ただし
アセトンを10％ではなく7.5％（容量）で加えた。
結晶を母液の中で22−24℃で６ケ月間にわたって懸濁
状態において維持した。遠心によってhGH結晶のサンプ
ルを取り出し、アセトンを含まない結晶化緩衝液で一回
洗い、そしてpHを8.0に上昇させることにより可溶化せ
しめた。
デスアミド及び分裂形態、又はダイマー及びポリマー
それぞれの検出のために、この可溶化hGH結晶をイオン
交換HPLC及びGPCの分析にかけた。
このデーターを25℃で32日間保持した再形成凍結乾燥
hGH製剤のそれと比べたとき、再形成hGH結晶におけるhG
Hのメインピークは比較条件のもとで保存した。再形成
凍結乾燥hGHより優れていた。（表２参照）。

Claims (25)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】GH（成長ホルモン）又はGH誘導体の陽イオ
    ン結晶の製造のための方法であって、以下の段階： ａ）GH又はその誘導体の溶液に、pH5.0〜6.8にて、無機
    又は有機的性質の陽イオンと、短鎖の脂肪族、環式及び
    芳香族アルコールもしくはケトンより成る群から選ばれ
    る有機溶媒又はそれらの有機溶媒の混合物とを加え、 ｂ）０〜30℃の温度において結晶を成長させ、そして ｃ）既知の手段によって前記陽イオン結晶を単離するこ
    と、を含んで成る方法。
  2. 【請求項２】段階ａ）におけるpHが5.8〜6.5である、請
    求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】段階ａ）におけるpHが6.0〜6.5である、請
    求の範囲第１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記有機溶媒がアセトン、メタノール、エ
    タノール及び２−プロパノールより成る群から選ばれ
    る、請求の範囲第１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記有機溶媒がエタノール又はアセトンで
    ある請求の範囲第４項に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記有機溶媒を0.1〜50容量％に濃度にお
    いて加える、請求の範囲第１〜５項のいづれか１項に記
    載の方法。
  7. 【請求項７】前記有機溶媒を0.1〜30容量％に濃度にお
    いて加える、請求の範囲第６項に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記有機溶媒を0.1〜20容量％に濃度にお
    いて加える、請求の範囲第６項に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記有機溶媒を５〜15容量％において加え
    る、請求の範囲第６項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記有機溶媒を６〜12容量％において加
    える、請求の範囲第６項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記陽イオンが二価陽イオンである、請
    求の範囲第１〜10項のいづれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記二価陽イオンがZn++である、請求の
    範囲第11項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記Zn++を、アモルファス物質の無秩序
    な沈殿にとって限界である濃度以下において加える、請
    求の範囲第12項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記Zn++を0.5〜10モルZn++/モルGH濃度
    において加える、請求の範囲第13項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記Zn++の濃度が1.0〜3.0モルZn++/モ
    ルGHである、請求の範囲第14項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記Zn++の濃度が1.1〜2.2モルZn++/モ
    ルGHである、請求の範囲第14項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記Zn++の濃度が1.2〜2.0モルZn++/モ
    ルGHである、請求の範囲第14項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記成長ホルモンがhGH（ヒト成長ホル
    モン）又はその誘導体である、請求の範囲第１〜17項い
    づれか１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】段階ｂ）における温度が４℃〜25℃であ
    る、請求の範囲第１〜18項のいづれか１項に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】請求の範囲第１〜19項のいづれか１項に
    記載の方法により製造されたhGH又はhGH誘導体の陽イオ
    ン結晶。
  21. 【請求項２１】前記陽イオンがZn++である、請求の範囲
    第20項に記載の結晶。
  22. 【請求項２２】Zn++とGHのモル比が0.2〜10である、請
    求の範囲第21項に記載の結晶。
  23. 【請求項２３】Zn++とGHのモル比が0.5〜５である、請
    求の範囲第21項に記載の結晶。
  24. 【請求項２４】Zn++とGHのモル比が0.5〜2.0である、請
    求の範囲第21項に記載の結晶。
  25. 【請求項２５】請求の範囲第20〜24項のいづれか１項に
    記載の結晶を含むことを特徴とするhGH薬品製剤。
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