PT92157B

PT92157B - Processo para a preparacao de quelantes, que posuuem um grupo funcional ligado na posicao orto, e de seus complexos

Info

Publication number: PT92157B
Application number: PT92157A
Authority: PT
Inventors: Jaime Simon; Joseph R Garlich; Kenneth Mcmillan; David A Wilson; Richard K Frank
Original assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1988-10-31
Filing date: 1989-10-30
Publication date: 1997-01-31
Also published as: HU911929D0; CA2001765C; NZ231180A; HUT51594A; DE68927271T2; IL92160A; BR8905657A; HU895608D0; NO894326D0; EP0570022A2; NO178571B; SG44640A1; JPH02196761A; DE68922368T2; EP0570022A3; PH31170A; KR0153468B1; EP0367223B1; CN1042536A; TW201694B

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE QUELANTES, QUE POSSUEM UM GRUPO FUNCIONAL LIGADO NA POSIÇÃO ORTO, E DE SEUS COMPLEXOS

Em complemento, determinados complexos de quelante-rádionuclídeos podem ser empregados, eficazmente , em composições úteis como agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico para tumores calcíficos e/ou para o alivio de dores nos ossos.

Os quelantes agora preparados apresentam a fórmula (I):

em que Z é um grupo que permite a ligação a um anticorpo X, Rj, R₂, RjjR^ e R5 são, por exemplo, hidrogénio, B é um grupo amina ou polialquileno-amina e n é 0 ou 1.

O processo de preparação utiliza como composto de partida um composto de fórmula:

Z

-3em que X é hidrogénio.

invento em consideração diz respeito a quelantes, que possuem o grupo funcional ligado na posição orto a seus complexos e aos seus conjugados, aos processos para a sua preparação. As composições para o seu emprego e aos processos para o seu emprego, nos diagnósticos do cancro e/ou na sua terapia.

Os quelantes funcionalizados, ou os coordenadores bifuncionais, são aceites como sendo capazes de se ligarem, covalentemente, a um anticorpo, que tem a especificidade para os epitopos ou para os antigénios das células do cancro ou dos tumores. Os complexos de radionudideos de tais conjugados de anticorposqBlantes são úteis , nas aplicações diagnósticas e/ou terapêuticas, como um meio de transmitir o radionuclídeo a uma célula do cancro ou dos tumores, veja, por exemplo, Meares et al., Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984); e Krejcarek et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77 , 581-585 (1977).

Os agentes de quelação do ácido aminocarboxilico têm sido compreendidos e estudados na bibliografia, durante diversos anos. Os ácidos aminocarboxilicos caracteristicos são o ácido nitrilotriacético (NTA) o ácido etilenodiaminatetracético (EDTA), o ácido hidroxietiletilenodiaminatriacético (HEDTA) e o ácido trans-1,2-diaminociclohexanotetracético (CDTA). Numerosos agentes de quelação bifuncionais, baseados nos ácidos aminocarboxilicos, têm sido propostos e preparados. Por exemplo, o dianidrido cíclico de DTPA (Hnatowich e outro Ciência 220 , 613 a 615, 1983 Patente N9 4.479.930, dos Estados Unidos da América) e os anidridos carboxicarbónicos mistos de DTPA (Gansow, U.S. patents 4.454.106 e 4.472.509; Krejcarek et al., Biochem. and Biophys, Res. Comm. 77, 581-585, 1977) têm sido apresentados na bibliografia. Quando os anidridos são associados às proteinas, a associa

-5ção processa-se pela formação de uma ligação amida, deixando , deste modo, quatro dos cinco grupos originais de carboximetilo , na estrutura da dietilenotriamina (DETA) (Hnatowich et al. , Int. J. Appl . , Isot. 33 , 327-332 1982). Em complemento, as Patentes N2 4.432.907 e N2 4.352.751 ambas dos Estados Unidos da América, divulgam os agentes de quelação bifuncionais, úteis para a ligação dos iões metálicos às espécies orgânicas, tais como as moléculas ou anticorpos, orgânicos alvo. Tal como no antecedente, a ligação é obtida por meio de um grupo através da utilização de dianidridos do ácido diaminotetracético. Exemplos de anidridos incluem dianidridos de EDTA, CDTA, ácido propilenodiaminatetracético e ácido fenileno-1,2-diaminatetraacético. A Patente N2 4.647.447, recente, dos Estados Unidos da América, divulga diversos sais de complexos, formados a partir do anião de um ácido de complexação, para emprego nas diversas técnicas de diagnósticos. A conjugação, por meio de um grupo carboxilo do ácido de complexação é divulgada, o que processa uma ligação através de uma ligação amida.

Uma outra classe de agentes de quelação bifuncionais, baseados no funcionamento dos ácidos aminocarboxilicos, encontra-se, também, bem documentada, na bibliografia. Assim, Sundberg e outro, na Revista de Quimica Médica. 17 (12). 1304 (1974) divulgam os análogos bifuncionais de EDTA. Representantes destes compostos são o ácido 1-(p-nitrofenil)etilenodiaminatetraacético, o ácido

1-(p-aminofenilJetilenodiaminatetraacético e o ácido 1-(p-benzenodiazónio Jetilenodiaminatetraacético. Debate-se a associação às proteinas, através do para-substituinte, e a ligação dos iões dos metais rádioactivos ao grupo de quelação. Os compostos são, também divulgados em Biochem. Biophys. Res. Comm, 75 (1), 149 (1977) e nas Patentes N2 3.994.966 e N2 4.043.998, ambas dos Estados Unidos da América.

É importante verificar-se que a ligação do grupo aromático à estrutura da EDTA é feita através de um átomo de carbono da estrutura de etilenodiamina. Agentes de guelação bifuncionais , opticamente activos baseados em EDTA, HEDTA e DTPA, são divulgados na Patente N3 4.622.420, dos Estados Unidos da América. Também, nesta exposição, a ligação do funcionamento do ácido aminocarboxilico, ao resto da molécula de quelação bifuncional , é feita através de um átomo de carbono da estrutura da etilenodiamina. Nestes compostos, um grupo de alquileno liga o grupo aromático (que contém o funcionamento necessário para a ligação para a proteina) ao carbono da poliamina, que contém o grupo fucnional da quelação. Outras referências a tais compostos incluem, Brechbiel et al., Inorg. Chem.

25, 2772.2781 (1986) Patente NQ 4.647.447, dos Estados Unidos da América, e um Pedido de PCT publicado, que tem o Número WO 86/06384 da Publicação Internacional. Mais recentemente, determinados agentes de quelação bifuncional macrocíclica e o emprego dos seus conjugados quelato de cobre, para aplicações diagnósticas, ou terapêuticas, tèm sido divulgados, na Patente N2 4.678.667, dos Estados Unidos da América. A ligação do grupo funcional do ácido aminocarboxilico, ao resto da molécula de quelação bifuncional, é feita através de um átomo de carbono em anel da estrutura de poliaminas cíclicas. Deste modo, um agente de ligação, ligado, numa extremidade a um átomo de carbono em anel da poliamina cíclica, está, também ligado, na sua outra extremidade , a um grupo funcional , capaz de reacção com a proteina.

Uma outra classe de agentes de quelação bifuncionais, também digna de nota, é constituída por compostos em que a metade de quelação, isto é, o ácido aminocarboxilico, da molécula, está ligada, através de um átomo de azoto, ao grupo funcional da molécula, contendo a metade capaz de reagir com a proteina. Como um exemplo,

-7Mikola e outro, num Pedido de pCT publicado (Publicação Internacional Número WO 84/03698, publicado em 9/27/84) divulga um agente de quelação bifuncional, preparado pela reacção de p-nitrobenzilbrometo, com DETA, seguida pela reacção com o ácido bromoacético, para produzir o ácido aminocarboxilico. O grupo de nitro é reduzido ao grupo de amina correspondente e, em seguida, é transformado no grupo de isotiocianato, por reacção com o tiofosgénio. Estes compostos são agentes de quelação bifuncionais, que podem ser conjugados com as moléculas bio-orgânicas, para emprego como agentes diagnósticos, capazes de quelarem as lantamidas. Visto que a ligação da parcela do agente de ligação da molécula se processa através de um dos átomos de azoto do ácido aminocarboxilico, por isso um grupo de aminocarboxilo potencial se desvia para a quelação. Deste modo, um quelante bifuncional. baseado em DETA, contendo quatro (e não cinco) grupos de ácidos, é preparado. A este respeito, esta classe de quelantes bifuncionais é semelhante àquelas em que a ligação à proteina se faz através de um grupo amida com a subsequente perda de um grupo de quelação carboxilo.

Na J. Radioanalytical Chem. 57 (12) páginas 553 a 564 (1980), Palk et al divulgam o emprego de p-nitrobenzilbrometo, numa reacção com uma dietilenotriamina bloqueada isto é, bis-(2-ftalimidoetil)amina , seguida por processos de desbloqueamento e a carboximetilação, empregando-se o ácido cloroacético, dando origem ao ácido N,N,N,N-tetraacético de N'-p-nitrobenzildietilenotriamina. Igualmente, visto que a ligação se faz através de um átomo de azoto, se obtém um derivado do ácido tetracético. Expõe-se a conjugação do agente de quelação bifuncional e a quelação com índio. A substituição do átomo de azoto é, também preconizada por Eckelman et al., na J. Pharm. Sei 64(4) (1975) reagindo aminas, tais como etilenodiamina ou dietilneotriamina , com o brometo de alquilo adequado,

antes da carboximetilação. Os compostos são apresentados como agentes de representação rádiofarmacêutica potencial.

Recentemente, Carney, Rogers e Johnson divulgaram (3rd International . Conference on Monoclonal Antibodies; San Diego; Califórnia - Fevereiro 4 a 6 1988) resumos intitulados Absense of Intrinsically Higher Tissue Uptake from Indium-111 Labeled Antibodies: Co-adminis tartion of Indium-111 and Iodine-125 Labeled B72.3 in a Nude Mouse Model e Influence of Chelator Denticity on the Biodistribution of Indium-111 Labeled B72.3 Immunoconjugates in Nude Mice. A biodistribuição de índio-111, complexados com um agente de guelação bifuncional EDTA e DTPA e divulgada. A ligação do anel aromático às metades de EDTA/DTPA é feita através de um radical acetato. No precedente, Hunt et al., nas Patentes N3 4.088.747 e NS 4.091.088 (1978), ambas dos Estados Unidos da América, divulgaram o ácido etilenodiaminaacético (EDDA), baseado nos agentes de quelação, em que a ligação de um anel aromático à metade de EDDA é feita através de um radical alquileno ou acetato. Os compostos são divulgados como sendo proveitosos como quelatos, para o estudo da função hepatobiliar. O metal preferido é o tecnécio-99m. O índio-111 e o índio-113 são, também, divulgados como radionuclideos proveitosos para a representação.

Martell et al., na Inorgânica Chemica Acta 138, páginas 215 a 230, divulgam um agente de quelação de ferro, para o tratamento da anemia de Cooleuy Os ligandos empregados eram análogos de EDTA, com grupos de doadores de amino e de carboxilato, ou tendo grupos de doadores complementares existentes como grupO3 fenólicos ou como grupos fenólicos substituídos nos aneis de piridina; com grupos do ácido aminofosfónico ou do éster aminofosfónico, com doadores suplementares de fenolato e de amino; com poliaminas macrocíclcicas, tendo grupos de doadores

-9de carboxilato e/ou de fenolato; com ácidos trishidroxâfflicos; com triscatecóis; e com ligandos multidentados, com grupos de amida de coordenação.

O desenvolvimento de metastases dos ossos é um acontecimento catastrófico vulgar e frequente, para um doente canceroso. A dor, as fracturas patológicas, os déficits neurológicos frequentes e a imobilidade forçada frequente, originadas por estas lesões metastáticas , diminuem , de um modo digno de nota , a capacidade da vida do doente cancerosos. 0 número de doentes, que contraiem a doença metastática é enorme, visto que cerca de 50% de todos os doentes , que contraem o carcinoma do seio , do pulmão ou da próstata, desenvolverão, eventualmente, as metastases dos ossos. As metastases dos ossos verificam-seç também, nos doentes com o carcinoma do rim, da tiróide, da bexiga, do cerviz e de outros tumores, e, colectivamente, eles representam menos do que 20% dos doentes, em que se desenvolvem as metastases dos ossos. O cancro dos ossos metastéticos põe, raramente, em perigo a vida, e, às vezes, os doentes vivem, durante anos, depois da descoberta das lesões dos ossos. Inicialmente, o tratamento tem por objectivo o alivio da dor, com redução das exigências para a terapêutica narcótica e para a ambulação crescente. Como é evidente, tem-se a esperança de que alguns cancros possam ser curados.

O emprego dos rádionuclídeos, para o tratamento do cancro metastático dos ossos, remonta ao principio dos anos 1950. Tem sido proposto injectar-se um nuclídeo emissor de partículas rádioactivas, de uma forma adequada, para o tratamento das lesões calcificas. É desejável que tais nuclideos sejam concentrados na região da lesão dos ossos, com quantidades minimas, a atingir o tecido macio e o osso normal. Os compostos de fósforo rádioactivo (P-32 e P-33) têm sido propostos, mas as propriedades nuclea-10res e de biolocalização limitam a utilidade destes compostos (Kaplan, E. , et al.. J. Nuc. Med 1(1). 1. (1960); Patente

N2 3.965.254, dos Estados Unidos da América).

Uma outra tentativa, para tratar o cancro dos ossos, tem sido feita, empregando-se os compostos de fósforo, contendo um residuo de boro. Os compostos foram injectados no corpo (intravenosamente) e foram acumulados no sistema esquelético. A região do tratamento foi, em seguida, irradiada com neutrões, com a finalidade de activar o boro e proporcionar uma dose de radiação terapêutica. (Patente NQ 4.399.817, dos Estados Unidos da América).

Nos processos mencionados no precedente, não é possivel dar doses terapêuticas ao tumor, sem prejudicar, substancialmente, os tecidos normais. Em muitos casos, especialmente para as lesões metásticas dos ossos, o tumor espalha-se em todo o sistema esquelético, e a amputação ou a irradiação não é eficaz. (Seminário da Medicina Nuclear IX (2) Abril de 1979).

O emprego de Re~r&6 , complexado com um difosfonato, tem, também, sido proposto. (Mathieu, L, e outro, Int. J.App. Rad.& Isot. 30 , 725-727 (1979 ); Weinenger J., Ketring A.R., et al., J. Nuc. Med. 24 (5), 125 (1983)7. Não obstante , a preparação e a purificação, necessárias para este complexo, condicionam o seu emprego e a sua ampla aplicação.

O estrôncio-89 tem, também, sido proposto para doentes, com lesões metásticas de ossos. Não obstante, o periodo prolongado (50,4 dias), os elevados niveis de sangue e uma lesão fraca para as proporções de ossos normais, podem ser desvantajoesos. (Firusian, N.,

Mellin, F. , Schmidt, C., G., A Revista de Urologia, 116

764, (1976); Schmidt, C. G,, Firusian, N. , Revista de Farmacologia Clinica Int.. 93 Páginas 199 a 205 (1974)).

Um tratamento paliativo das metástases dos ossos relatado, emprega alfa-amino-(3-iodo-4-hidroxibenzeilideno )difosfonato designado como 1-131 (Eisenhut, M., J. Nuc. Med. 25 (12), páginas 1.356 a 1.361 (1984 )). O emprego de rádioiodo, como um rádionuclideo terapêutico, é menos que desejável, devido à tendência bem conhecida do iodo a localizar-se na tiróide. Eisenhut regista o iodo como uma das metabolites possíveis deste composto. Em complemento, qualquer 1-131, deixada da reacção da iodação e não separada, no processamento da lavagem, constitui uma ameaça para a tiróide.

Os ácidos aminocarboxilicos são conhecidos para quelarem os iões de metais. Quelatos, particularmente estáveis, formam-se com metais das séries de metais alcalino terrosos e de transição.

O'Mara et al (J. Nuc. Med. 10 páginas 49 a 51, 1969) têm preparado complexos de terra rara dos ácidos aminocarboxilicos, em quelante, para proporções de metais de 10:1. Eles encontraram boas propriedades esqueletais e propuseram o seu emprego como agentes esqueletais de diagnóstico. Em complemento da elevada destruição dos ossos, observaram-se grandes quantidades de radiação, no músculo e/ou no fígado. Dos nuclídeos de terra rara avaliados Sm-153 e Er-171 foram indicados como tendo as características mais adequadas, para utilização nos entes humanos. A utilidade destes agentes, para a terapia, não é, todavia,Sugerida.

Rosoff, B. et al., Int. J. App. Rad and Isot. 14 , 129-135 (1963), divulga os complexos de EDTA e de nTA, com determinados rádionuclideos, designada-12-

mente Sc-46, Y-91, La-140 e Sm-153. A afinidade da constante de estabilidade destes complexos , com a excreção urinária, é revelada. Proporções de quelante para molares de metais de 5:1 foram empregadas, e observaram-se concentrações elevadas de rádioactividade, no fígado, no baço, no rim no pulmão e no osso.

O invento em consideração tem em vista os quelantes novos , que possuem o grupo funcional ligado na posição da orto . quelantes esses que formam complexos com metais , especialmente com metais radioactivos que possuem a quimica do tipo de terra rara. Os metais radio,153 activos preferidos incluem o samario-153 ( Sm), o hólmio-166 (^θ^Ηο), o ítrio-90 (^θΥ), o promécio-149 (^^^Pm) Ί RQ140 p gadolínio-159 ( Gd), o lantano-140 ( La), o lutécio-177 (^^^Lu), o itérbio-175 (^^^Yb), o escândio-47 (^^Sc) z142 e o praseodimio-142 ( Pr). Os complexos, deste modo formados, podem ser empregados, eles próprios, ou podem ser ligados a um anticorpo, ou a um seu fragmento e empregados para fins terapêutivos e/ou diagnósticos. Os complexos e/ou os seus conjugados podem ser formulados para emprego in vivo ou in vitro. Os empregos preferidos dos conjugados formulados são o tratamento do cancro em animais, especialmente nos humanos .

Em complemento, determinados complexos de quelante-rádionuclideo podem ser empregados, eficientemente, em composições proveitosas como agentes terapêuticos e/ou diagnósticos, para tumores calcíficos e/ou em composições proveitosas como agentes terapêuticos, para o alivio da dor dos ossos.

mais especificamente. o invento em consideração diz respeito a compostos, que tem a fórmula:

em que:

Z é uma metade electrofilica ou nucleofilica, que permite a ligação covalente a um anticorpo, ou a um seu fragmento, ou a umagente de ligação sintético . que não interfere com a formação da complexação com um rádionuclídeo e que pode ser ligado a um anticorpo, ou a um seu fragmento;

X é hidrogénio, alquilo de C^-C^ ^ou CR^R^COOH;

R^, R£, R3 e são, cada um, independentemente, hidrogénio hidroxi, CO2H ou um grupo de alquilo C^-C^;

RJ) é hidrogénio ou (CRj_lR2 ^CR^R^B;

B representa uma amina linear ou ramificada, ou uma amina de polialquileno, em que, pelo menos, um dos hidrogénios da amina foi substituido por um grupo de CR^R^COOH;

n é 0 ou 1; ou a um seu sal farmacêuticamente aceitável.

É preferível que o qrupo de carboseja ligado ao primeiro, do xilo (quando existente) gundo, átomo de carbono de carbono alfa ou beta

-14ao da ou ao seazoto do grupo Β, isto é, o átomo azoto na metade de quelante . fórmula I são aqueles em que são, cada um, hidrogénio; ou n

Os compostos preferidos ' n é 0; ou , R₂ , Rg e R^, é 0, e um de Rg ou é hidrogénio e o outro é COOH; ou X é hidrogénio. Quando os quelantes devam ser empregados como agentes de quelação bifuncionais, então Z é de preferência, amino, isotiocianato, semicarbazida, tiosemicarbazida,carboxilo, bromoacetamida ou maleimida.

deração diz respeito a

Em complemento, o invento em consicompostos, que têm a fórmula:

em que

Z' é hidrogénio, NH^, N0₂ , NHC(O)CH₃ ou N(R')₂, em que R* é hidrogénio ou alquilo C^-C-g;

X é hidrogénio alpilo ^{ou CR}3^R4COOH;

R¹·^ é hidrogénio ou COOH;

-15R*2, R'₄ e R'g são, independentemente, hidrogénio ou CR^R^COOH, com a ressalva de que, pelo menos, um de R'^, R^, R'₄ e R'^ é hidrogénio; ou a um seu sal farmacêuticamente aceitável.

Além disso, o invento em consideração diz respeito a compostos, que têm a fórmula:

em que Z' é hidrogénio, NH₂, N0₂, NHCÍOjCH^, N(R')₂, em que R' é hidrogénio ou alquilo C^-C^;

X é hidrogénio, alquilo de C^-Cg ou CR^R^COOH;

R'l e R'₂ são, cada um, hidrogénio ou COOH, com a ressalva de que, pelo menos, um é COOH; R'^, R'₄, ^R's ^e R'g são, independentemente hidrogénio ou CR^R^COOH, com a ressalva de que, pelo menos, três são CR^R^COOH; ou a um seu sal farmacêuticamente aceitável.

O invento em consideração diz , também. respeito a complexos de iões de metais rádioactivos , especialmente a complexos de iões de metais do tipo de terra rara. e a conjugados formados com os complexos

mencionados no precedente, e a anticorpos ou a fragmentos de anticorpos , mencionados no preoaàente. Em complemento, o invento em consideração inclui, também, composições, gue têm complexos de quelante-rádionuclideos e/ou os conjugados do invento e um veiculo farmacêuticamente aceitável. Tipicamente , o veiculo farmacêuticamente aceitável , nestas composições , encontra-se m forma liquida. 0 invento inclui, também, um processo para o diagnóstico, ou para o tratamento , de uma classe de doenças, especialmente do cancro, num ente mamifero, pela administração, ao mamífero, de uma quantidade eficiente da composição.

Tal como o empregado nesta Memória Descritiva, os termos indicados, que se seguem, têm estes significados: no que diz respeito à definição de Z: metades electrofílicas incluem, mas não se limitam ao isotiocianato, à bromoacetamida, à maleimida, ao imidoester, à tioftalimida, ao éster de N-hidroxisuccinimilo, ao dissulfureto de piridilo e à azida de fenilo; metades nucleofílicas adequadas incluem, mas não se limitam ao carboxilo, à amina à hidrazida de acilo, à semicarbazida e à tiosemicarbazida; agentes de ligação sintéticos incluem quaisdquer agentes de ligaçãé inorgânicos ou orgânicos, sintéticos, que sejam capazes de estarem ligados, covalentemente, a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo , de preferência agentes de ligação sintéticos que sejam agentes de ligação sintéticos biodesintegráveis, que sejam estáveis no soro de um doente mas que tenham uma possibilidade para a clivagem enzimática num orgão de separação para o rádioisótopo, por exemplo os péptidos biodesintegráveis, ou os grupos que contêm os péptidos. das metades electrofílicas, são preferidos o isotiocianato, a bromoacetamida e a maleimida, e especialmente preferido é o isotiocianato; e das metades nucleofílicas , são preferidos o amino, o carboxilo, a semicarbazida e a tiosemicarbazida, e especialmente preferidos são o amino

-17e o carboxilo. É desejável que a natureza e/ou a posição de Z seja tal que ela não interfira, apreciavelmente, com a reacção da quelação. Z pode, também, ser uma metade não reactiva, tal como H, NO^, NHC(O)CH₃, NR’(em que R' é H ou alquilo (C^-C^), quando o emprego final não envolva a ligação do quelato à proteina.

O termo alquilo inclui o me tilo, o etilo, o n-propilo e o isopropilo.

O termo amina de polialquileno, ou amina, linear ou ramificada designa as metades de alquilo, de caeeia linear ou ramificada, que contêm, pelo menos, um, e, habitualmente, mais do que um, átomo de azoto.

Tal como o empregado, nesta Memória Descritiva, o termo mamifero designa os animais que alimentam os seus filhos com leite segregado pelas suas glândulas mamárias, de preferência, os mamíferos de sangue quente, e, com mais preferência, os entes humanos.

Anticorpo refere-se a qualquer anticorpo quimérico, monoclonal ou policlonal, ou a um heteroanticorpo, de preferência a um anticorpo monoclonal; fragmento de anticorpo inclui os fragmentos de Fab e os fragmentos de F (ab'^, e qualquer parcela de um anticorpo que tenha a especificidade relativamente a um epítopo ou a epítopos, desejados. Quando se emprega o termoconjugado de quelato/anticorpo de metal radioactivo ou conjugado, o anticorpo designa a inclusão de todos os anticorpos e/ou os fragmentos de anticorpos, incluindo as suas variantes concebidas geneticamente ou semi-sinteticamente. Os anticorpos preferidos são o CC-49, e os fragmentos de anticorpos preferidos são o Fab e o Ffab'^. Outros anticorpos possíveis são o CC-83 e ο B72.3. A série de células de hibrido-13mas Β 72.3 encontra-se depositada na Colecção da Cultura do Tipo Americano (ATCC) e tem o número de aquisição ATCC

HB 8.108. Os outros anticorpos monoclonais murinos ligam-se a epítopos de TAG-72, um antigénio associado a tumores.

Tal como o empregado nesta Memória Descritiva, o complexo de metais rádioactivos ou complexo' refere-se a um complexo do composto da invenção, por exemplo , fórmula I, complexado com um ião de metal do tipo de terra rara, especialmente um ião de metal do tipo de terra rara radioactivo, em que, pelo menos, um átomo de metal está quelado ou isolado; conjugado de quelato/anticorpo de ião de metal radioactivo ou conjugado de ião de metal rádio activo refere-se a um conjugado de ião de metal rádioactivo, que se encontra ligado, covalentemente. a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo, radioactivo, quando empregado em conjunção com as palavras ião de metal refere

-se a um, ou a mais isótopos dos elementos do tipo de terra

153 xara , que emitem partículas e/ou fotões . tais como Sm.

166„ 90_v 149_n 159_, 140. 177, 175^ 47_

Ho . Y . Pm . Gd. La . Lu , Yb, Sc e

142

Pr. Os termos coordenador bifuncional agente de quelação bifuncional e quelante funcionalizado são empregados alternadamente e referem-se a compostos que possuem uma metade de quelante, capaz de quelar uma ião de metal, e a uma metade de quelante, que seja capaz de servir como um meio de ligar, covalentemente, a um anticorpo, ou a um fragmento de anticorpo.

Tal como o empregado nesta Memória

Descritiva, sal farmacêuticamente aceitável designa qualquer sal de um composto de fórmula (I), que não seja suficientemente tóxico, para ser proveitoso na terapia, ou no diagnós tico, dos mamíferos. Deste modo, os sais são proveitosos de acordo com este invento. Os representantes daqueles sais, formados pelas reacções normalizadas de fontes, tanto orgâ-19-

nica3 , como inorgânicas, incluem, por exemplo, os ácidos sulfúrico. clorídrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, láctico, maléico. fumárico , palmitico, eólico, pamóico , múcico, glutâmico. d-canfórico , glutárico, glicólico, ftálico . tartárico, fórmico , láurico, estérico, salicílico, metanosulfónico, benzenosulfónico, sórtico , pícrico benzóico, cinâmico e outros ácidos adequados. Também incluídos estão os sais formados pelas reacções normalizadas, de fontes, tanto orgânicas, como inorgânicas, tais como o amónio, os iões de metais alcalinos, os iões de metais alcalino terrosos, e outros iões semelhantes. Particularmente preferidos, são os sais dos compostos de fórmula (I), em que o sal é o potássio, o sódio, o amónio, ou as suas misturas .

Os agentes de quelação bifuncionais descritos nesta Memória Descritiva (representados pela fórmula I) podem ser empregados para quelar ou isolar os iões de metais do tipo de terra rara, particularmente os iões de metais do tipo de terra rara rádioactivos, de modo a formarem os quelatos de iões de metais (também designados nesta Memória Descritiva como complexos). Os complexos devido à presença da metade de funcionalização (representada por Z na fórmula I). podem ser ligados a apoios funcionalizados . tais como os apoios poliméricos funcionalizados ou. de preferência, podem ser ligados, covalentemente, a anticorpos, ou a fragmentos de anticorpos. Deste modo, os complexos, descritos nesta Memória Descritiva, podem ser ligados, covalentemente, a um anticorpo, ou a um fragmento de um anticorpo, e são designados, nesta Memória Descritiva como conjugados.

Os anticorpos , ou os fragmentos dos anticorpos, que podem ser empregados nos conjugados descritos nesta Memória Descritiva, podem ser preparados pelos processos, bem conhecidos da técnica. Anticorpos

monoclonais específicos de nivel elevado, podem ser produzidos por processos de hibridização, bem conhecidos da técnica, veja, por exemplo, Kohler e Milstein (Natureza 256 páginas 495 a 497 (1975); e Eur, J. Ummunol. £, pág.

511 a 519 (1976)). Tais anticorpos têm, normalmente , uma reactividade elevadamente especifica. Nos conjugados de iões de metais rádioactivos tendo em vista anticorpos , os anticorpos administrados contra qualquer antigénio , ou hapténio, podem ser empregados. De preferência, os anticorpos . que são empregados nos conjugados de iões de metais rádioactivos, são os anticorpos monoclonais, ou os seus fragmentos. que possuem elevada especificidade, para um epítopo(s) desejado(s). Os anticorpos, empregados no invento em consideração, podem ser administrados contra, por exemplo, tumores, bactérias, fungos, virus, parasitas, micoplasmas, antigénios de diferenciação de membranas de outras células, antigénios de superfície de micróbios patogénicos toxinas, enzimas, alergénicos, medicamentos e quaisquer moléculas biologicamente activas. Alguns exemplos de anticorpos, ou fragmentos de anticorpos, são CC-11, CC-15, CC30, CC-46, CC-49 F (ab')₂, CC-49, CC-83, CC-83 F (ab')₂CC-92 e B72.3. /“veja D. Colcher et al., Câncer Res. 48, 4597-4603 (Aug. 15, 1988) para CC-49, CC-83 e B72.3 anticorpos?. Os anticorpos CC, que se seguem, têm sido depositados em ATCC, como se segue: CC-11 como HB 9455; CC-15 como HB 9460; CC-30 como HB 9457; CC-46 como HB 9458; CC-49 como HB 9459; CC-83 como HB 9453; e CC-92 como HB HB 9454. B723 tem sido depositado em ATCC como HB 8 108. uma lista, mais completa, de antigénios pode ser verificada na Patente NQ 4.193.983, dos Estados Unidos da América.

Os conjugados de quelatos/anticorpos de iões de metais rádioactivos, do invento em consideração, são particularmente preferidos .pa ra o diagnóstico e para o tratamento de diversos cancros

-21Os complexos do tipo (lantanida e pseudo-lantanida) de terra rara, do invento em consideração , são representados pela fórmula:

C /'

Ln(BFC) 7 em que: Ln tal como:

um ião de (lantanida) metal de terra rara,

Pr^{3 +}

Tm^{3 +} , Nd³⁺, Pm³⁺, Yb^{3 +} e Lu tal como Sc³⁺, Y , Sm³⁺, Eu³⁺3+ . ~ , , ou ião de 3+ . 3 + e la . Gd^{3 +} metal , Tb³⁺, Dy³⁺, Ho³⁺, de pseudo-lanta; BFC representa um quelante

Ce³⁺, Er³⁺. nida, bifuncional; e C representa um ião farmacêuticamente aceitável , ou um grupo de iões de carga suficiente para render todo o complexo neutral. Se o BFC contém quatro ou nais metades carregadas negativamente, então C é um um grupo de catiões, tal como:

catião, ou

H⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺, cs⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Sr²⁺nh4⁺, n(ch3)₄+, n(c₂h₅)₄ ⁺, n(c₃h_?)₄ ⁺ / (ΟθΗ(-)₃Ρ = ?2^{n+ e} outras aminas protonadas. Se o BFC contém três metades carregadas negativamente , então C não se torna necessário, Se o BFC contém duas metades carregadas negativamente, então C é um anião tal como:

, Ba*⁺, Ra²⁺, , N(C₄Hg)₄ , As(CgHg>₄ ,

F , Cl, Br, I , CIO ₄ , BF₄, H₂PO₄ , HCO₃ , HCC>₂ ,

CH_S0_o~, H_oC-C_cH.-S0-~, PF , CH_oC0„“ e B(C-H_c) ..

3 64 3 6 32 654

Este invento é empregado com um veiculo, excipiente ou transporte farmaceuticamente aceitável, para esse fim. Os processos, para a preparação de tais composições, são bem conhecidos. As composições podem apresentar-se na modalidade de uma suspensão, de uma solução injectável, ou de outras composições adequadas. Os meios de suspensão farmaceuticamente aceitáveis com, ou sem, adjuvantes, podem ser empregados.

Uma quantidade eficiente da composição é empregada para a terapia. A dose varia, dependendo da doença a ser tratada. Não obstante os diagnósticos in vitro possam ser levadas a efeito com as composições deste invento, os diagnósticos in vivo podem ser, também contemplados, empregando-se as composições deste invento. Os conjugados e as composições deste invento podem, também ser empregados, na cirurgia guiada, rádioimuna (RIGS); não obstante, outros metais, que podem ser empregados, com esta finalidade, incluem, também:

99rn_m 111_ 113n_T 67_ 68,,

Tc , In, In, Ga e Ga.

Quando os complexos quelantes-rádionuclídeos, deste invento, devam ser empregados, para o tratamento do cancro dos ossos, determinados critérios devem ser respeitados.

Apesar de as propriedades dos rádionuclideos serem importantes, as propriedades totais da composição, contendo o complexo de rádionuclideo-quelante, são o factor determinante.

As desvantagens de qualquer uma propriedade podem ser ultrapassadas pela superioridade de uma ou mais , das propriedades, quer do ligamento , quer do rádionuclídeo, e da sua combinação, visto que devem ser consideradas, na composição no seu tçdo.

que se segue é um estudo daqueles critérios., que devem ser considerados, na escolha de qualque? combinação especifica (isto é, complexo) de rádionuclideo e de ligando empregado na composição do invento. Os complexos de rádionuclideo-quelante, quando empreqados na inexistência de um excesso adequado dos ligandos, empregados no invento podem não ser proveitosos, ou eficientes, terapêuticamente .

Tornam-se, por isso, necessárias composições, que possuam os critérios, que se seguem, pelos quais seja possível administrar doses de radiação terapêutica, para calcificar os tumores, com doses minimas para o tecido macio.

rádionuclídeo deve ser administrado, de preferência, ao osso, em vez do tecido macio. Mais particularmente, a absorção no fígado, ou no sangue é indesejável.

rádionuclideo deve ser eliminado rapidamente. do tecido não ósseo . para se evitar um prejuízo desnecessário, para tais tecidos; por exemplo, ele deve ser eliminado. rapidamente. do sangue emprego proposto , para algumas das composições deste invento e o tratamento terapêutico dos tumores calcíficos. nos animais. Tal como empregado nesta Memória Descritiva, o termo tumores calcíficos

incluem os tumores principais, em que o sistema esquelético é o principal local da complicação, e o cancro do osso metástico em que o neoplasma se espalha dos outros locais principais, tais como a próstata e o seio, no sistema esquelético. Este invento proporciona um meio de se aliviar a dor e/ou reduzir a dimensão e/ou inibir o desenvolvimento e/ou a expansão de, ou a causa da regressão de e/ou a destrui ção dos tumores ealcíficos, pela administração de uma dose de radicação terapêutica.

A composição pode ser administrada como uma dose única , ou como doses múltiplas, durante ám periodo mais prolongado de tempo. A administração do rádionuclídeo. ao tumor, deve ser em quantidades suficientes para proporcionar os benefícios, referidos no precedente.

Outros empregos de alguns dos quelantes, do invento em consideração, podem incluir a remoção de metais indesejáveis (isto é, ferro) do corpo a representação da ressonância magnética, a ligação dos suportes poliméricos para os diversos fins, por exemplo, como agentes diagnósticos e a retirada do ião de metal de lantanida, ou do ião do metal de pseudo-lantanida, por extracção selectiva. Em complemento, os complexos de metal-ligando, empregados para se administrarem os rádionuclídeos para os locais calcíficos, podem ter utilidade na ablação da medula do osso (isto é, para os transplantes da medula do osso).

Os rádionuclídeos podem ser produzidos de diversos modos. Num reactor nuclear, um nuclídeo é bombardeado com neutrões, para se obter um rádionuclídeo por exemplo

25Sm-152 + neutrão - Sm-153 + gama

Um outro processo, de se obterem os rádionuclídeos, é bombardearem os nuclídeos, com partícula produzidas por um acelerador linear, ou por um ciclotrão. Ainda um outro processo é isolar d rádionuclídeo de uma mistura de produtos de cisão. O processo, de se obter os nuclideos, empregados, no invento em consideração, não é por isso, pormenor para constituir um embaraço.

Os agentes de quelação, divulgados nesta Memória Descritiva, podem ser preparados de modos bem conhecidos da técnica. E assim, por exemplo, veja os Agentes de Quelação e os Quelatos de Metais, Dwyer e Mellor. Revista Académica (1964), Capitulo 7. Veja também, os processos para se produzirem os aminoacidos na Produção Sintética e Utilização dos Aminoacidos (editada por Kameko e outro) João Wiley e Filhos (1974).

Quando se escolhe Z (na fórmula) para ser uma metade electrofilica, ele pode ser preparado por processos conhecidos pela técnica. Tais processos podem ser deparados em Acc. Chem. Res. 1(7, páginas 20 2 a 20 9 (1984).

Exemplos de alguns dos processos , que podem ser empregados, para se prepararem os quelantes das fórmulas I, II e III, são:

-26A) a reacção de um composto da formula

em que:

Z é uma metade electrofilica, ou nucleofilica , que permite a ligação covalente a um anticorpo, ou a um seu fragmento, ou a um agente de ligação sintético, que não interfere com a formação de complexação com um radionuclideo e que pode ser ligado a um anticorpo, ou a um seu fragmento;

X é hidrogénio;

é hidrogénio ou (CRj^ )_n ^CR3^R4^T - ^etn 9^{ue R}i - ^R2 ' ^R3 ^{e R}4 são, cada um. independentemente, hidrogénio, hidroxi, CC^H ou um grupo de alquilo de C^-C^ . n é 0 ou 1; e T representa um polialquileno amina, ou uma amina, linear ou ramificada em que, pelo menos, um dos hidrogénios da amina é substituido por um grupo de CR^R^CC^H; ou de um seu sal farmacêuticamente aceitável;

com um composto B e um equivalente de um aldeido, ou de um precursor de aldeido, em que B representa um polialquileno amina ou uma amina, linear ou ramificada, em que existe

I

-2 7-

pelo menos, um hidrogénio de amina; na presença de um produto cáustico e de um solvente adequado, a uma temperatura de 20Q C, ou inferior, seguida pelo aquecimento e pela separação do produto desejado de fórmula I, II ou III;

B) a reacção do produto obtido na Fase (A), com um ácido halo-(CR^R^)_nCRgR^, a um pH de 9. ou superior, na presença de um produto cáustico, a uma temperatura de 200C, ou inferior , para dar origem aos compostos de fórmula I, II ou III, em que, pelo menos, um de , R£, Rj e é ^CO2⁹’

C) a hidrólise do produto da Fase (B), em que Z é NHC(O)CHg, com NaOH em para se obterem os produtos de fórmula I, II ou III, em que Z é Ní^;

D) a reacção do produto obtido da Fase (A), com glicolonitri lo, num produto cáustico, a um pH de 9, ou superior, a uma temperatura de 202C, ou inferior, seguida pela hidrólise do de grupo de ciano com HC1 em f^O, para dar origem nos produtcs fórmula I, II ou III, em que, pelo menos, um de , R£, e R₄ é CC^H;

E) a hidrólise do produto da Fase (A), em que Z é NHCÍOjCH^ com DC1 em D£0, com aquecimento, para dar origem aos produtos de formula I, II ou III. em que Z é ; e

F) a reacção do produto obtido de qualquer uma das Fases (A) a (E), em que Z é NH₂, com tiofosgénio, para dar origem aos produtos de fórmula I, II ou III, em que Z é o isotiocianato.

As condições das reacções e os reagentes, para as diversas fases precedentes são as que se seguem: Quando a temperatura é 20SC, ou inferior, ela é, habitualmente, completada pelo emprego de um banho de gelo/água. 0 aquecimento é feito quer à temperatura do refluxo, quer à temperatura superior à do ambiente. O produto cáustico preferido é o hidróxido de sódio, mas qualquer base adequada. capaz de manter o pH desejado, sem o efeito contrario no produto formado da reacção, é aceitável. Um solvente adequado é inerte e proporciona a solubilidade aos reagentes; exemplos de tais solventes são a água e os álcoois, tais como o metanol. 0 produto desejado pode ser separado por quaisquer processos convencionais pot·'. exemplo, a precipitação num solvente, tal como a acetona .

Os complexos de fórmula I, II ou III são preparados por processos convencionais, por exemplo pela reacção do quelante, com um metal, sob condições tais que o metal seja isolado pelo quelante. Frequentemente, o quelante é em excesso, em relação ao metal.

Os conjugados de fórmula I, II ou III são preparados por processos convencionais, por exemplo, pela ligação covalente do complexo a um anticorpo ou a fragmento de anticorpo.

-29O invento tornar-se-à evidente, mais adiante, por uma consideração dos exemplos, que se seguem, que pretendem ser apenas exemplos puros do emprego do invento. As estruturas dos compostos, com referência à fórmula I genérica, estão representadas na Tabela I.

Preparação dos Materiais de Partida

EXEMPLO A: Preparação do Acido Etilenodiaminadiacético não Simétrico

Água desionizada (60,6 gramas) N-acetiletilenodiamina a 98% (20,4 gramas, 0,2 mole) re ácido bromoacético (55,7 gramas, 0,40 mole) foram introduzidos num recipiente para reacção, e foram arrefecidos num banho de gelo-água. O pH da mistura foi ajustado, enquanto se agitava, a cerca de 8.1, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A temperatura da mistura foi mantida a menos de 202C, durante a adição do produto cáustico. O banho de gelo-agua foi retirado e o pH foi mantido entre 7 e 8, pela adição da solução de hidróxido de sódio a 25%. A temperatura foi controlada a menos do que 37QC, por arrefecimento, periódico, com um banho de gelo-água. A mistura da reacção foi agitada e mantida, como no precedente durante cerca de 31 horas, e, em seguida, foi transferida para um balão de reacção de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com uma haste de agitador magnético, com um termómetro, com um funil de adição e com uma cobertura para aquecimento. Adicionou-se a solução do hidróxido de sódio (40 ,1 gramas de solução a 50%), e a mistura foi aquecida, com agitação, ao refluxo.

durante cerca de 15 horas, e, em seguida, foi arrefecida e filtrada, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. O filtrado foi transferido, quantitativamente, (empregando-se água desionizada) para uma proveta, e foi arrefecido num banho de gelo, a menos do que 252C. Adicionou-se a água desionizada (100 ml), com agitação, e o pH foi ajustado a cerca de 4, com o ácido cloridrico concentrado enquanto se mantinha a temperatura a menos do que 259C. A mistura foi filtrada, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Introduziram-se cerca de 1.200 ml de etanol num frasco de boca larga, e eles forams agitados com uma haste de agitador magnético. O filtrado do precedente foi adicionado ao etanol. com meticulosa agitação. Formou-se uma substância oleosa que, gradualmente, se transformou num sólido branco. A agitação continuou-se durante duas horas, momento em gue os sólidos foram reunidos por filtração, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Os sólidos foram deixados a secarem-se, por exposição ao ar livre, durante cerca de 1,5 horas, e, em seguida, foram colocados num forno de vácuo e foram secos a 55 a 602C, durante várias horas. Cerca de 42,9 gramas de sólidos brancos, contendo sal inorgânico, foram recolhidos e foram identificados, como o ácido etilenodiaminadiacético não simétrico, por Ressonância Magnética Nuclear de protões e de carbono.

EXEMPLO B Preparação do Acido de 2-Oxo-l-Piperazinaacético lactama do Acido Etilenodiaminadiacético

Água desionizada (150 gramas), 25,0 gramas (0,14 mole) de ácido etilenodiaminadiacético simétrico, e 28 gramas de ácido clorídrico concentrado introduziram-se, num balão de reacção de fundo redondo, equipado com um termómetro, com um controlador da temperatura com um condensador de refluxo arrefecido a água, e com uma abertura para aquecimento. A mistura foi agitada com uma haste de agitador magnético, e foi aquecida ao refluxo, durante quatro horas, e foi arrefecida. 0 conteúdo foi filtrado, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. O pH do filtrado foi ajustado a cerca de 1.5, com uma solução de hidroxido de sódio a 50%, e o filtrado foi filtrado com um funil de frita de vidro médio, empregando-se o vácuo. O pH do filtrado foi ajustado a cerca de 5, com uma solução de hidróxido de sódio a 50%. e os produtos voláteis foram removidos (no vacuo) , a uma temperatura de 60 a 70SC. Os sólidos foram secos num forno de vácuo, a 55 a 60QC, durante algumas horas. O lactamo do ácido etilenodiamina diacético simétrico foi confirmado pela Ressonância Magnética Nuclear de protões e de carbono.

EXEMPLO C

Preparação do Acido 2-Oxo-l,4-Piperazinadiacético; lactama do Acido Etilenodiaminatriacético

cerca de 40,8 gramas do ácido

2-oxo-l-piperazinaacético, preparado pelo processo do Exemplo Be, e 70 gramas de água de3ionizada foram introduzidos num frasco de boca larga, e foram agitados, durante algumas horas, com uma haste de agitador magnético. O conteúdo foi filtrado, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. O filtrado e 20,0 gramas de ácido bromoacético foram introduzidos num frasco de boca larga e foram agitados até que todo o ácido bromoacético se tivesse dissolvido.

O pH foi ajustado a cerca de 7, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A temperatura foi mantida a menos do que 250C durante a adição do produto cáustico, pelo arrefecimento num banho de gelo-água. O banho de gelo-água foi removido e deixou-se a mistura a agitar-se, durante cerca de 4 a 5 horas, a cerca de 352C, enquanto se mantinha o pH a cerca de 7, pela adição periódica da solução de hidróxido de sódio a 25%. A mistura da reacção foi deixada a assentar-se, durante algumas horas e. em seguida, foi concentrada (no vácuo) até um peso de cerca de 90 a 100 gramas, e foi filtrada. empregando-se um funil de frita de vidro medio e vácuo. Os produtos voláteis foram removidos (no vácuo) do filtrado a uma temperatura de 55 a 602C. e o material foi seco num forno de vácuo, a 55 a 602C, durante algumas horas. O lactamo do ácido etilenodiaminatriacético foi confirmada pela Ressonância Magnética Nuclear de protões e de carbono.

-33EXEMPLO D

Preparação do Acido Etilenodiaminatriacético de Trisódio cerca de 44,5 gramas do ácido

2-oxo-l,4-piperazinadiacético bruto, preparado pelo processo do Exemplo C, e 280 gramas de água desionizada foram introduzidos num frasco de boca larga, e foram agitados até que o lactamo se tivesse dissolvido. A solução do produto cáustico (110 gramas, 50%) foi adicionada, com agitação. A temperatura foi mantida a menos do que 25SC, por arrefecimento num banho de gelo. A hidrólise foi, em seguida, efectuada, pela imersão de tubos contendo a solução, num banho de água, controlada a 872C. Depois de 15 minutos, as soluções foram removidas e arrefecidas num banho de gelo-água. A análise, pela Ressonância Magnética Nuclear de protões e do carbono , confirmou a presença do ácido etilenodiaminatriacético de trisódio, no meio alcalino da hidrólise.

EXEMPLO E Preparação do Acido 4-Dietilenotriaminaacético

Num balão, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água , com um agitador magnético e com um termómetro, introduziram-se 75.0 gramas de anidrido ftálico, 350,5 gramas de ácido acético e 26.0 gramas de dietilenotriamina. A mistura foi agitada e foi aquecida a cerca de 1162C, durante 15 horas, e. em seguida, foi arrefecida. Os produtos voláteis foram removidos, sob o vácuo, a 65 a 70 SC, até se ter obtido um peso de 218 gramas. A mistura foi derramada em 600 gramas de etanol, com agita-34-

ção. Depois de duas horas, os sólidos foram filtrados, empregando-se um funil de frita de vidro médio. Os sólidos foram lavados, por duas vezes, com 500 ml de etanol, e em seguida, foram secos num forno de vácuo, a 60 a 65QC. cerca de 66 gramas de material dó composto de diftaloílo foram recolhidos.

O éster de etilo do composto de diftaloílo foi preparado introduzindo-se 65,6 gramas do compos to de diftaloílo, preparado no preasdente, 17,7 gramas de carbonato de 3Ódio e 800 ml de etanol, num balão equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com um funil de adição, com um agitador mecânico e com um termómetro equipado com um controlador de temperatura. Adicionou-se o bromoacetato de etilo (51,0 gramas) durante um periodo superior a 15 minutos, à mistura em agitação, e, em seguida aquecida ao refluxo, durante 16 horas. 0 etanol (200 ml) foi removido por destilação, empregando-se um sifão de destilação Dean-Stark . e a mistura da reacção restante foi arrefecida até menos do que 52C . por adição de gelo triturado. A mistura foi arrefecida, durante mais 5 horas, num banho de gelo, e foi filtrada, empregando-se um funil de frita de vidro médio. Os sólidos foram lavados, por duas vezes, com etanol, e foram secos num forno de vácuo a 65 a 702C. Cerca de 81 gramas de 1,7-difialoíl-4-dietilenotriaminaacetato de etilo foram obtidos. Em 30,32 gramas de água e 76,4 gramas de ácido cloridrico concentrado, foram dissolvidos 20,1 gramas (0,045 mole) de 1,7-diftaloí1-4-dietilenotriaminaacetato de etilo, com aquecimento até 932C, e a mistura foi mantida a 932C, durante 6,5 horas. O precipitado branco, resultante, foi filtrado e foi lavado com água. O filtrado reunido foi concentrado, a 60QC, sob o vácuo, dando origem a um sólido branco. A análise da Ressonância Magnética Nuclear indicou que os grupos de ftaloílo não tinham sido completamente hidrolisados. Os dois sólidos foram, em seguida, reunidos e adicionados ao ácido clorídrico concentrado, com uma quantidade pequena de água. A mistura foi, em seguida, aquecida ao refluxo, durante 6 horas, foi arrefecida até a temperatur ambiente, e foi filtrada, dando origem a 12,3 gramas de ácido ftálico. O filtrado foi, em seguida, evaporado, sob o vácuo, dando origem a 13,9 gramas do produto, como um sólido amarelo. O produto foi dissolvido em água, pela adição de 6 gramas de hidróxido de sódio a 50%, e foi tratado com carvão vegetal activado, a 1002C, seguido pela filtração e pela evaporação, sob o vacuo, dando origem a 15,2 gramaá de ácido 4-dietilenotriaminaacético.

Preparação dos Produtos Finais

EXEMPLO 1: Preparação do Acido 2-/Ϊ2- /“Bis(carboximetil)7

Amino^j Etil )Amino7-2- (5-Acetamido-2-Hidroxifenil )-Etanóico

Agua desionizada (10,3 gramas) 4-acetamidafenol a 98% (15,1 gramas, 0,1 mole) ácido glioxilico aquoso a 50% (14,8 gramas, 0,1 mole) e netanol (50,5 gramas), foram introduzidos num frasco de boca larga e foram misturados , empregando-se uma haste de um agitador magnético O ácido etilenodiaminadiacético não simétrico (19,5 gramas) preparado pelo processo do Exemplo A. foi adicionado, e a mistura foi arrefecida num banho de gelo-água. O pH da mistura foi ajustado, durante a agitação, a cerca de 8,0. com uma solução de hidróxido de sódio a 50%. A temperatura da mistura foi mantida a menos do que 20QC, durante a adição do produto cáustico. 0 banho de gelo-água foi removido, e a

mistura foi ajustada a pH 8,7, e foi agitada a 25 a 322C, durante cerca de 2 horas. A mistura foi transferida para um balão de reacção de fundo redondo, equipado com um conden. sador de refluxo arrefecido a água , com uma haste de um agitador magnético, com um termómetro e com uma cobertura para aquecimento. A mistura foi aquecida, com agitação, a 70QC, durante 8 horas, e, em seguida, foi arrefecida e filtra da, empregando-se um funil de frita de vidro médid e vácuo. Os sólidos foram deixados a secarem-se, pela exposição ao ar, durante 7 horas, e, em seguida, foram colocados num forno de vácuo e foram secos a 55 a 60QC, durante algumas horas. Cerca de 29,6 gramas de sólidos foram recolhidos.

material foi, em seguida, agitado com cerca de 300 gramas de acetona, e foi filtrado, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo de serviço. Os sólidos foram lavados, mais uma vez, com um suplemento de 300 gramas de acetona, foram secos ao ar, e, em seguida, foram colocados num forno de vácuo, durante uma hora, a 55 a 602C. Cerca de 26,7 gramas de sal de sódio do ácido 2-/T2-Ç/“bis(carboximetil)7amino etil)amino7-2-(5-acetamido-2-hidroxifenil )et£ noico foram recolhidos .

Estes sólidos e 180 gramas de água desionizada foram introduzidos num frasco de boca larga e foram agitados com uma haste de um agitador magnético. 0 pH foi ajustado a 2,2, com o ácido clorídrico concentrado, momento em que a modalidade do ácido do produto começou a precipiiar-se da solução. O produto foi recolhido por filtração, e foi lavado com cerca de 150 gramas de água desionizada. O produto, ácido 2-/T /“bis(carboximetil27aminoJ etil)amino7-2-(5-acetamido-2-hidroxifenil)etanóico, foi seco num forno de vácuo, a 55 a 602C, durante algumas horas, cerca de 14,2 gramas do produto foram obtidos. A Ressonância Magnética Nuclear de protões verificou a estrutura do produto (Veja a Tabela I).

-37EXEMPLO 2: Preparação do Ácido 2-/72- /Bis(Carboximetil)7

-Amino3 Etil) (Carboximetil)Amino7-2-/^-5-Acetamido-2-(Carboximetiloxi)Fenil7Etanóico

Agua desionizada (4,5 gramas), ácido bromoacético (2,0 gramas) e ácido 2-/72-^/~bis(carboximetil ^amino^ etil)amino7-2-(5-acetamido-2-hidroxifenil)etanó„ co (2,5 gramas) preparado pelo processo do Exemplo 1, foram introduzidos num recipiente de reacção pequeno , e foram arrefecidos num banho de gelo-água . O pH da mistura foi ajustado, durante a agitação, a cerca de 9,3, com uma solução de hidróxido de sodio a 25%. A temperatura da mistura foi man tida a menos do que 202C, durante a adição do produto cáustico. O banho de gelo-água foi retirado e a mistura foi deixada a agitar-se durante 48 horas, a uma temperatura de 35 a 402C, ao mesmo tempo que se mantinha o pH entre 10,5 e 11,5 pela adição periódica de uma solução de hidróxido de sódio a 25%. Uma parcela da mistura da reacção (10,2 gramas) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada com uma haste de um agitador magnético. Adicionou-se a acetona (125 gramas) à solução, durante um periodo superior a 15 minutos, resultando a precipitação de um óleo. A parcela da acetona foi retirada por decantação, e adicionou-se um suplemento de 50 gramas de acetona, ao precipitado, que se misturou, e o estracto da acetona foi retirado. O óleo foi seco ao ar livre e , em seguida, foi seco num forno de vácuo, a 60 a 652C, durante cerca de duas horas, dando origem a um sólido amarelo duro e seco. O produto foi purificado pela

TM cromatografia de troca de aniões . no Q-Sepharose , de Pharmacia Inc. numa coluna de 15 mm x 500 mm. eluindo-se com um gradiente de ácido fórmico a 0 a 30%. durante mais de das horas, a um ritmo de 3 ml/min. e recolhendo as parcelas.

As parcelas foram controladas pela absorção de ultravioletas

e as parcelas adequadas foram reunidas e liofilizadas, dando origem ao produto desejado (Veja a Tabela 1).

EXEMPLO 3: Preparação do Sal de Penta Sódio, do Acido 2-/T2^/~Bis(Carboximetil)7-AminoJj Etil) (Carboximetil) Amino7-2-/^-5-Amino-2-(Carboximetiloxi)Fenil7Etanóico

Cerca de 40 mg do ácido 2—/^—(2—

- ^/~bis(carboximetil)7amino2jetil) (carboximetil)amino7-2-/~5-acetamido-2-(carboximetiloxi)fenil7etanóico , preparado pelo processo do Exemplo 2, foram dissolvidos em 700 çl de D2O, e ajustados a pH 13, com NaOD/D2O. A hidrólise do grupo de N-acetilo, ao funcionamento da anilina correspondente , desenvolveu-se a temperatura ambiente e foi seguida pela Ressonância Magnética Nuclear de protões , que confirmou a estrutura. (Veja a Tabela I).

EXEMPLO 4:

Preparação do Acido 2-/Ϊ2- /Bis(Carboximetil)7 AminoJ) Etil) (Cianometil)Amino7-2-(5-Acetamido- -2-Hidroxifenil)Etanoico

Agua desionizada (3,1 gramas) e

2,5 gramas de ácido 2-/Ϊ2-y /bis(carboximetil)7aminoetil) amino7-2-(5-acetamido-2-hidroxifenil)etanóico, preparado pelo processo do Exemplo 1, foram introduzidos num recipiente pequeno de vidro e foram arrefecidos num banho de gelo-água. 0 pH foi ajustado a 9,8 a 9,9 com uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A temperatura da mistura foi mantida a menos do que 202C, durante a adição do produto cáustico.

banho de gelo foi retirado, 1,0 grama de uma solução de gliconitrilo aquosa a 40% depois ffiai adicionado, com misturação, e o pH foi ajustado a 9,9 a 10,0, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A mistura foi transferida para um balão pequeno de reacção, equipado com um termómetro contendo um controlador da temperatura, com um condensador de refluxo arrefecido a água, e com uma cobertura para aquecimento A mistura da reacção foi agitada com uma haste de um agitador magnético, foi aquecida a 49 a 509C, durante oito horas, foi arrefecida a foi deixada a assentar-se à temperatura ambiente. durante 72 horas. Uma parcela da mistura da reacção (8,5 gramas) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada com uma haste de um agitador magnético. Adicionaram-se 146 gramas de acetona à solução , durante um periodo superior a 10 minutos , resultando-se na precipitação de uma substância sólida. A parcela de acetona foi retirada, por decantação, e um suplemento de 50 gramas de acetona foi adicionado ao precipitado e foi misturado, e o estrato de acetona foi retirado. O material foi seco num forno de vácuo, a 60 a 652C, durante cerca de quatro horas. Recolheram

-40-se cerca de 2,9 gramas do produto. A Ressonância Magnética

Nuclear de protões confirmou o derivado desejado de aminoacetonitrilo. (Veja a Tabela I).

EXEMPLO 5; Preparação do Acido 2-/72- //Bis(Carboximetil )7-Amino^ Etil) (Carboximetil)Amino7-2-(5-Amino-2-Hidroxifenil)Etanóico

Cerca de 1,0 grama do ácido 2-/72-/bis(carboximetil)7-amino/ etil) (cianometil)amino7-2-(5-acetamido-2-hidroxifenil)etanóico, preparado no preaeden te, pelo processo do Exemplo 4, foi hidrolisado, sob condições acidicas, para transformar o funcionamento do aminoaceto nitrilo no grupo correspondente de acetato, e o grupo de N-acetilo no grupo de anilina. O composto de aminoacetonitrilo, 2,2 gramas de D₂O e 7,8 gramas de DC1 a 20% foram introduzidos num tubo de vidro. 0 tubo foi colocado num banho de água de temperatura controlada a 88 a 895C, durante um total de 33 minutos e, em seguida, foi retirado, e foi arrefecido. A hidrólise foi seguida pela Ressonância Magnética Nuclear de pirtões. A solução foi, em seguida seca até a congelação e foi liofilizada, dando origem a 1,3 gramas de sólidos. O produto foi purificado por (Q-Sepharose ) de troca de aniões, numa coluna de 15 mm x 500 mm, eluindo-se com um gradiente de ácido acético a 0 a 1 M, durante mais de uma hora, a um ritmo de 3 ml/min, e reunindo-se as parcelas de 6 ml. As parcelas foram reunidas e foram liofilizadas dando origem ao produto desejado. (Veja a Tabela I).

EXEMPLO 6 Preparação do Acido 2-/~Bis(2- /iBis(Carboximetil )7Amino J) Etil )Amino7-2-/~5-Acetamido-2-(Carboiximetiloxi)Fenil7Etanóico e do Ácido 2-/^-^ 2-/7-2-^/^-Bis (Carboximetil )7AminoJj Etil) (Carboximetil )Amino7 Etil Jy (Carboximetil )Amino7-2-/~5-Acetamido-2-(Carboximetiloxi)Fenil7Etanóicc

Água desionizada (24,8 gramas),

15,1 gramas (0,1 mole) de 4-acetamidofenol a 98%, e 14,8 gramas de ácido glioxilico aquoso a 50% introduzidos num frasco de boca larga e num banho de gelo-água. O pH da mistura com uma solução de hidróxido de sódio a mantinha a temperatura a menos do que 202C. então DETA (9,8 gramas). Mais uma vez, a temperatura se (0 ,1 mole ) foram foram arrefecidos foi ajustado a 3,3 25%, enquanto se Adicionou-se manteve abaixo dos 20QC, por arrefecimento num banhp de gelo-água. O pH. após a adição de DETA, foi cerca de 10 ,2. A mistura foi transferida, para um balão de reacção, equipado com um termómetro, um controlador de temperatura, um condensador de refluxo arrefecido a água, e uma cobertura para o aquecimento. A mistura da reacção foi agitada, com uma haste de um agitador magnético, foi aquecida a 752C, durante cerca de sete horas, e foi arrefecida. A acetona (1.400 gramas) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada com uma haste de um agitador magnético. Cerca de 40 gramas da solução de reacção, preparada no pretíedente, foram adicionados durante um periodo superior a 10 minutos , resultando a precipitação de um material sólido. A parcela da acetona foi retirada, por decantação, um suplemento de 1.460 gramas de acetona foi adicionado e o sólido foi tri turado e misturado meticulosamente, sob a acetona. Os produtos sólidos foram recuperados por filtração, empregando-se um funil de frita de vidro medido e vácuo. Os produtos

-42sólidos foram lavados com uma quantidade copiosa de acetona e, em seguida, foram secos num forno de vácuo, a uma temperatura de 60 a 65°C, durante várias horas. Cerca de 7,8 gramas de produtos sólidos foram recuperados , revelando a Ressonância Magnética Nuclear de protões que a mistura era os isómeros desejados do composto de DETA.

Agua desionizada (5,3 gramas) e gramas dos produtos sólidos isolados do precedente foram introduzidos num frasco de boca larga e foram agitados , com uma haste de agitador magnético, durante cerca de três horas , momento em que os produtos sólidos se tinham dissolvido completamente. Adicionou-se, com agitação, o ácido bromoacético (10,1 gramas) e a mistura foi arrefecida num banho de gelo-água. O pH da mistura foi ajustado a cerca de 11, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A temperatura foi mantida a menos do que 20QC, durante a adição do produto cáustico. O banho de gelo-água foi retirado e a mistura foi deixada a agitar-se, durante 50 horas, a uma temperatura de 35 a 40°C, enquanto o pH se mantinha entre 10,5 e 11,5 pela adição periódica de uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A acetona (240 gramas) foi introduzida, num frasco de boca larga, e agitada com uma haste de um agitador magnético. Cerca de 5 gramas da solução da reacção foram adicionados à acetona, resultando daí a precipitação de um sólido. A parcela da acetona foi decantada, e um suplemento de 245 gramas de acetona foi adicionado e foi misturado ' e o estrato de acetona foi retirado. Os produtos sólidos foram recolhidos, por filtração , empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Os produtos sólidos foram lavados com acetona e, em seguida, foram secos num forno de vácuo, a 55 a 602C, durante várias horas. Recolheram-se cerca de 2,6 gramas de produtos sólidos. (Veja a Tabela I).

EXEMPLO 7

Preparação do Ácido 2-/~Bis 2-/ÍBis (carboximetil )7AminoJj Etil )Amino7-2-/^-5-Amino-2-(carboximetiloxi)Fenil7Etanóico e do Ácido 2-/ Bis(carboximetil)Aminoj Etil) (Carboximetil)Ámino7Etil (Carboximetil)Amino7-2-/~5-Amino-2-(Carboximetiloxi)Fenil7Etanóico

Cerca de 376 mg do ácido 2-/~bis (2-^/Tbis(carboximetil27amino^etil)amino7-2-/~5-acetamido-2-(carboximetiloxi)fenil7etanóico e do ácido 2-/^2-/T2-^/~bis(carboximetil)7aminoJ etil) (carboximetil)amino7 etil (carboximetil)amino7-2-/5-acetamido-2-(carboximetiloxi )fenil7etanóico, preparado pelo processo do Exemplo 6, foram dissolvidos em 1,0 grama de D2O, e foram tratados com 5 gotas de DC1 a 37%. A solução acídica foi , em seguida aquecida a 802C, durante 2 horas.

Ressonância Magnética mente todos os grupos nos grupos de anilina em seguida . congalada após o que o espectro de Nuclear de protões indicou que virtualde acetanilida tinham sido transformado e no ácido acético. A solução foi. num banho de acetona de gelo seco, e foi liofilizada de um dia para o outro, dando origem ao produto desejado, como um sólido castanho pálido.

(Veja a Tabela I).

EXEMPLO 8:

Preparação do Acido 2-/~ 2-/Ϊ2-/Bis(Carboxi- metil)7 Amino Etil ) (Carboximetil) Amino7Etil (Carboximetil)Amino7-2-/ 5-Amino-2-(Carboximetiloxi)Fenil7Etanóico

Em 40 ml de água foram dissolvidos 8,0 gramas de ácido 4-dietilenotriaminaacético, preparado pelo processo do Exemplo E, e, em seguida, a mistura foi arrefecida num banho de gelo. A esta solução arrefecida adicionaram-se 6,08 gramas (0,04 mole) de 4-acetamidofenol e uma solução arrefecida a 5,95 gramas (0,04 mole) de uma solução a 50%, em peso, de ácidd glioxilico em água. Enquanto se mantinha a mistura a menos do que 209C, com o banho de gelo adicionou-se uma quantidade de 2,5 ml de hidróxido de sódio a 50% em peso. A mistura resultante, a pH 8,75, foi aquecida, lentamente a 802C, foi mantida a esta temperatura durante 4,5 horas, com agitação, e, em seguida, foi deixada a arrefecer-se de um dia para o outro. A solução foi, em seguida, evaporada, sob o vácuo, até um volume de cerca de 25 ml, e foi adicionada a 300 ml de acetona. A acetona foi decantada do sólido resultante. O sólido foi lavado por diversas vezes. com acetona, e foi seco , dando origem a

26.1 gramas de produto, como um solido escuro pegajoso.

Uma quantidade de 26,05 gramas deste solido foi dissolvida em 50 ml de água. Nesta solução foram dissolvidos 26,7 gramas (0,192 mole) de acido bromoacético. A solução resultante foi arrefecida num banho de gelo, o pH foi ajustado a 10,5 com o hidróxido de sódio a 50%, em peso, e a solução foi deixada a aquecer-se até a temperatura ambiente, e, em seguida, foi aquecida até 469C. A temperatura foi mantida a 462C, e o pH foi mantido a 10,5, pela adição de hidroxido de sódio a 50%, em peso, durante cerca de 23 horas. O volume foi, em seguida, reduzido a 50ml, sob o vácuo. A solução

concentrada foi adicionada a 500 ml de acetona, com agitação vigorosa, e o precipitado resultante foi deixado a assentar-se. A acetona foi decantada e um suplemento de 400 ml de acetona foi adicionado, foi agitado vigorosamente e foi, em seguida, decantado. Foi feita uma lavagem final, de modo semelhante, empregando-se 100 ml de acetona. O sólido foi seco, sob o vácuo, dando origem a 52,55 gramas de um sólido castanho duro e seco. Uma amostra de 2,00 gramas deste sólido castanho foi dissolvido em 20 ml de água e foi tratado comi, 48 gramas de ácidocloridrico concentrado.

Esta solução foi aquecida até 80QC, até que a análise, pela Ressonância Magnética Nuclear de protões, indicasse a hidroll ss completa da metade de N-acetilo. A solução foi, aquecida até 80SC, até que a análise, pela Ressonância Magnética Nuclear de protões , indicasse a hidrólise completa da metade de N-acetilo. A solução foi, em seguida, seca por congelação dando origem a 2.13 gramas de um sólido castanho, contendo o produto em epígrafe. (Veja a Tabela I).

EXEMPLO 9

Preparação do Ácido 2-/T2-/T2-/T2-^/Bis(Carboximetil)7

Amino^Etil)(Carboximetil)Amino7Etil)(Carboximetil)Amino7

Etil)(Carboximetil)Amino7-2-/^-5-Acetamido-2-(Carboximetiloxi)Fenil7Etanóico e do Ácido 2/T2-/T2-£/~Bis(Carboximetil)7 AminoJ^ Etil)(Carboximetil)Amino7Etil)(2-^/~Bis(Carboximetil )7 AminoEtil)Amino7-2-/~5-Acetamido-2-(Carboximetiloxi)Fenil7

Etanóico

Agua desionizada (12,5 gramas)

4-acetamidofenol a 98% (7,6 gramas) e uma solução de ácido glioxilico aquoso a 50% (7,4 qramas) foram introduzidos num frasco de boca larga e foram arrefecidos num banho de gelo-água. O pH da mistura foi ajustado a 3,6, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%, enquanto a temperatura se mantinha a menos do que 202C. A trietilenotetraamina linear (7,2 gramas) foi adicionada, enquanto a temperatura se mantin abaixo de 202C. 0 pH, depois na, foi de cerca de 10,6. A um balão de reacção, equipado com um termómetro, contendo ia da adição da trietilenotetraamimistura foi transferida para um controlador de temperatura, um condensador de refluxo arrefecido a água, e uma cobertura para o aguecimento. A mistura da reacção foi agitada com uma haste de um agitador magnético e foi aquecida a 80 a 832C, durante 4,5 horas e foi arrefecida. A acetona (175 gramas) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada , com uma haste de um agitador magnético. Cerca de 12 gramas da solução da reacção foram adicionados, resultando-se a precipitação de um óleo. A parcela da acetona foi retirada por decantação, um suplemen to de 175 gramas de acetona foi adicionado e a agitação continuou-se. A parcela da acetona foi retirada, e o precitado foi seco num forno de vacuo , a 60 a 652C, durante várias horas. Cerca de 3,1 gramas de sólido foram recolhidos.

Os produtos sólidos foram, em seguida, misturados com 100 gramas de acetona, misturados meticulosamente e filtrados, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Os produtos sólidos foram, em seguida, lavados com um suplemento de 250 ml de acetona, e foram secos , mais uma vez, num forno de vácuo, a 60 a 652C durante cerca de quatro horas. Cerca de 2 ,0gramas de matéria] foram recuperados, indicando a Ressonância Magnética Nuclear de protões que a mistura continha isómeros de trietilenotetraamina.

Agua desionizada (2,0 gramas) e 1,86 gramas do produto sólido precdente foram introduzidos num frasco de boca larga e foram agitados durante uma hora momento em que os sólidos estavam dissolvidos na sua maior parte. Adicionou-se o ácido bromoacético (5,0 gramas), com agitação e a mistura foi arrefecida num banho de gelo-agua. 0 pH da mistura foi ajustado a cerca de 10,5 e foi mantido , durante 47 horas , a uma temperatura de 35 a 402C ao mesmo tempo se mantinha entre 10,5 e 11,5 pela adição periódica de uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A acetona (130 gramas) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada com uma haste de um agitador magnético. Cerca de 10,8 gramas da solução da reacção foram adicionados à acetona, resultando daí a precipitação de um sólido.

A parcela da acetona foi decantada, e um suplemento de 150 gramas de acetona foi adicionado ao precipitado e foi misturé do, e o estracto de acetona foi retirado. Os produtos sólidos foram secos num forno de vácuo, a 60 a 652C, durante várias horas. Cerca de 7,2 gramas dos produtos sólidos foram recolhidos. (Veja a Tabela I).

-48EXEMPLO 10

Preparação de 2,6-Bis /Bis(Carboximetil)Amino7 (Carboxi)Metil1 -4-(Acetamido)Fenol

Num frasco de boca larga, introduziram-se 38,6 gramas de 4-acetamidafenol, 35,3 gramas de ácido iminodiacético a 98%, 150 mis de metanol, 38,5 gramas de uma solução de ácido glioxilico aquosa a 50% e 30 gramas de água desionizada. A mistura foi arrefecida num banho de gelo-água, e o pH foi ajustado, enquanto se misturava a cerca de 9,4, com uma solução de hidróxido de sódio a 50%. A temperatura foi mantida a menos do que 302C, durante a adição do produto cáustico. A mistura foi transferida para um balão de reacção, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, um termómetro e uma cobertura para o aquecimento. A mistura da reacção foi aquecida a cerca de 74 a 762C, e o pH foi controlado e foi mantido entre 8,7 e 9,5, pela adição periódica de uma solução de hidróxido de s^odio a 50%. A mistura foi aquecida durante um total de 18 horas. Durante este tempo, cerca de 40 gramas de água desionizada foram adiciooados. Depois do arrefecimento, a mistura da reacção foi filtrada, empregando-se um funil de cozimento de vidro médio e vácuo. Adicionou-se a água desionizada (75 gramas) ao filtrado, e o metanol foi retirado (no vácuo) â temperatura ambiente (cerca de 20 a 25ac). Deixou-se a solução a assentar-se durante várias horas , e os sólidos precipitados foram retirados da solução, por filtração, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Cerca de 30 gramas do filtrado e 15 gramas de éter de etilo foram misturados meticulosamente, e o estracto de ester foi, em seguida, separado. O processo foi repetido, empregando-se 15 gramas e 10 gramas de éter de etilo, sucessivamente. O estrato aquoso foi ajustado, com uma solução de ácido clorídrico aquoso, a um pH cerca de 0,5 e os produtos voláteis foram retirados (no

-49vácuo) , a uma temperatura de 50 a 552C. Recolheram-se cerca de 13,5 gramas de produtos sólidos. Adicionou-se o metanol (75 gramas), aos produtos sólidos, e os sais insolúveis foram retirados, por filtração. O metanol foi removido (no vácuo) e os sólidos remanescentes foram secos num forno de vácuo a 70 a 752C, durante várias horas. O produto, que continha, ainda, algum sal inorgânico, foi analisado pela Ressonância Magnética Nuclear de protões, e verificou-se ser predominantemente, o produto bis-substituido (Veja Tabela I).

EXEMPLO 11: Preparação de 2,6-BisX/T2-k/Sis(Carboximetil27

Amino^Etil) (Carboximetilj/Amino-MetilTj -4-(Acetamido)Fenol

A solução do ácido etilenodiaminatriacético de trissódio alcalina, preparada pelo processo do Exemplo D, foi arrefecida num banho de gelo, e o ácido clorídrico foi adicionado, com agitação, para se obter um pH cerca de 13,8. A temperatura foi mantida a meoos do que 352C, durante a adição do ácido. Os produtos voláteis foram retirados (no vácuo) à temperatura ambiente, até se atingir um peso de 210 gramas. Os produtos sólidos foram retirados por filtração, num funil de frita de vidro médio, empregando-se o vácuo. O filtrado foi transferido para um balão de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo, arrefecido a água, com uma haste de um agitador magnético, com um termómetro, com um controlador de temperatura, com uma cobertura para o aquecimento e com um funil de adição. O pH foi ajustado a cerca de 11, com o ácido clorídrico. A temperatura foi mantida a menos do que 302C, durante a adição do ácido.

A mistura foi aquecida até cerca de 402C, e 11,6 gramas de uma solução de formaldeido aquosa a 37% foi adicionada, gota a gota e lentamente do funil de adição, durante um periodo superior a 35 minutos. A mistura da reacção foi agitada e aquecida, durante um suplemento de 30 minutos, e, em seguida, foi arrefecida. A solução foi ajustada, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%, a um pH cerca de 9,8, e foi transferida para um funil de adição. Num frasco de boca larga introduziram-se 10,3 gramas de 4-acetamidofenol a 98% 25,2 gramas de água desionizada e 9,5 gramas de uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A mistura foi agitada, até se ter obtido a dissolução completa. A solução foi transferida para um balão de reacção de fundo redondo, equipado como foi descrito no precedente, e iniciaram-se o aquecimento e a agitação. A mistura foi aquecida até cerca de 652C, momento em que a solução do aduto de formaldeic preparada no precedente, foi adicionada, gota a gota e lentamente, durante um periodo superior a uma hora. A mistura de reacção foi agitada e foi aquecida a 652C, durante mais 12 horas e, em seguida, foi arrefecida. A acetona (150 gramas) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada com uma haste de um agitador magnético. Cerca de 10 gramas da mistura da reacção bruta foram adicionados à acetona, resultando daí a precipitação de uma substância oleosa.

A parcela da acetona foi decantada, e um suplemento de 150 gramas de acetona foi adicionado ao precipitado e foi misturado, e o estrato de acetona foi retirado. A substância foi seca num forno de vácuo, a 55 a 602C, durante várias horas. Cerca de 3,1 gramas de sólidos foram recolhidos. Cerca de 165 mg dos produtos sólidos foram dfssolvidos numa quantidade minima de água, e foram deitados numa coluna de

TM

Q-Sepharose (de Pharmacia Inc.) de 1,5 cm x 50 cm do tipo de acetato, e foram eluidos, empregando-se um gradiente de acetato de amónio de 0 a 1 M, durante mais de duas horas, a 2 ml por minuto. A absorvância a 3Q»0 nm foi verificada. O pro-51-

duto estava incluido no terceiro pico principal. Ele foi isolado e foi seco por congelação, dando origem a 36,4 mg de sólidos, que foram identificados pela Ressonância Magnética

Nuclear de protões e de carbono e pela espectrometria de massa de bombardeamento rápido, como 2,6-bis/72-^/Bis(carbos metil)7amino3 etil)(carboximetil)7aminometil^-4-(acetamido) fenol. (Veja a Tabela I).

EXEMPLO 12:

Preparação de 2,6-Bis^/T2-^/5is(Carboximetil)7 Amino 2) Etil) (Carboximetil27Aminometil^-4- (Amino ) Fenol

Cerca de 264 mg de 2,6-bis£/72- £/bis (carboximetil27aminoj| etil) (carboximetil )7aminometilJ| -4-(acetamido)fenol, preparado pelo processo do Exemplo 11 foram introduzidos num tubo de Ressonância Magnética Nuclear de 5 mm, e foram dissolvidos numa mistura de D2O (0,5 ml) e de DC1 (0,5 ml, 20%). O tubo de Ressonância Magnética Nuclear foi introduzido num banho de água quente (852C), durante períodos curtos de tempo, e o desenvolvimento da reacção foi controlado pela Ressonância Magnética Nuclear (deparecimento dos protões de metilo acetamida e aparecimento do ácido acético). Depois de 35 minutos, a reacção estava completa. A mistura da reacção foi seca por congelação, para dar origem ao cloridrato de amina bnto, como um material sólido escuro. O produto bruto foi dissolvido numa quantidaΦΜ de minima de água e foi deitado numa coluna de Q-Sepharose de 1,5 cm x 50 cm, do tipo de acetato, e foi eluido, empregando-se um gradiente de acetato de amónio, de 0 a 1 M, durante mais de três horas, a 2 ml por minuto. A absorvência a 300 nm foi verificada. O produto estava incluido no tercei-52-

ro pico principal. Ele foi isolado e foi seco por congelação deixando um sólido ambar pálido (122 mg), que era uma mistura do produto de amina desejado e de cloreto de amónio. A mistura do produto foi identificada pela Ressonância Magnética Nuclear de protões e de carbono e pela análise elementar. 0 produto, que continha o sal (250 mg de lotes reunidos)

TM foi purificado, posteriormente, pela Q-Sepharose , de 1,5 cm x 50 cm, do tipo de formiato, empregando-se um gradiente de ácido fórmico de 0 a 10%, durante mais de quatro horas. Verificou-se a absorvância a 300 nm. 0 primeiro pico principal continha o produto desejado. Ele foi isolado e foi seco por congelação, para dar origem a 8,3 mg de um sólido cristalino branco. A estrutura foi confirmada pela Ressonância Magnética Nuclear de protões e de carbono e pela espectrometria de massa de bombardeamento atómico rápido.

(Veja a Tabela I).

EXEMPLO 13: Preparação de 2.6-BisÇ /12-^/Bis(Carboximetil )7 Amino^Etil) (Carboximetil) 7AminometilJ| -4- (Isotiocianato)Fenol produto, que continha, 2,6-bisy /T2-/Eis(carboximetil)/ãmino etil)(carboximetil)7amino metil2)-4-(amino)fenol e sal inorgânico (208 mg, 15% em NH^Cl preparado pelo processo do Exemplo 12, foi dissolvido numa quantidade minima de água e foi passada através de uma coluna

TM de dessalinização de Sephadex G-10 (Pharmacia, Inc.) de cm x 35 cm. A amina livre de sal foi eluida com água e foi seca por congelação (11,5 mg). A amina foi dissolvida em água (10 ml) e foi introduzida num balão de reacção de

fundo redondo. Adicionou-se o tiofosgénio (0,015 ml, 10 eq) , dissolvido em cloreto de metileno (1 ml). A mistura da reacção foi agitada à temperatura ambiente, durante uma hora. A mistura foi, em seguida, lavada com diversas porções de cloreto de metileno, para se retirar o excesso de tiofosgénio e o estracto aquoso seco até a congelação, dando origem ao produto de isotiocianato bruto, que foi identificado pela espectrometria de massa de bombardeamento atómico rápido (Veja a Tabela I).

EXEMPLO 14.

Preparação de 2- ( ^/Bis(Carboximetilj/Amino^ Metil)-4(Acetamido)Fenol

Agua desionizada (35,3 gramas)

35,3 gramas de ácido iminodiacético a 98% (0,25 mole) e 29,9 gramas de uma solução de hidróxido de sódio aquosa a 50%, foram introduzidos num balão de reacção de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com um agitador mecânico, com um termómetro equipado com um controlador de temperatura, e com um funil de adição. A mistura foi aquecida, com agitação, a uma temperatura de 552C. Uma solução de formaldeido aquosa a 37% (21,5 gramas) foi introduzida num funil de adição e foi adicionada ao balão de reacção, durante um periodo de mais de 15 minutos. A mistura da reacção foi aquecida a 552C, durante cerca de 45 minutos, foi arrefecida e foi transferida para um funil de adição. Num balão de fundo redondo, equipado como no precedente, introduziram-se 38,7 gramas (0,25 mole)

de 4-acetamidofenol a 98%, 35,3 gramas de água desionizada e 12,2 gramas de uma solução de hidróxido de sódio aquoso a 50%. A mistura foi aquecida, com agitação, a uma temperatura de cerca de 652C, e a solução do aduto do ácido formaldeido-iminodiacético foi adicionada, durante um periodo superior a 30 minutos. A mistura da reacção foi aquecida a 65QC, durante mais doze horas, e foi arrefecida. Adicionou-se o ácido clorídrico concentrado (55,5 gramas) e a mistura da reacção foi agitada, durante uma hora. Deixou-se a solução assentar, durante várias semanas, e, em seguida, o precipitado cristalino foi filtrado, foi lavado com água desionizada e foi seco num forno de vácuo a 652C, durante várias horas. Cerca de 17,4 gramas de sólidos foram recuperados. A estrutura foi confirmada pela Ressonância Magnética Nuclear de protões (Veja a Tabela I).

EXEMPLO 15

Preparação de 2- ( γ/Sis(Carboximetil)7Aminoj Metil)-6-\/T ^/5is(Carboximetil27AminoJ Etil)(Carboximetil)Amino7 Metil (Acetamido )Fenol

Cerca de 5,7 gramas de ácido 2-oxo-l,4-piperizinadiacético bruto, preparado pelo processo do Exemplo C, e 38,6 gramas de água desionizada, foram introduzidos num frasco de boca larga e misturados, até· que a dissolução do lactamo se tivesse efectuado. Uma solução de produto cáustico (13,5 gramas de uma solução de hidróxido de sódio a 50%) foi adicionada, enquanto se mantinha a temperatura a menos do que 302C, por arrefecimento num banho de gelo-água. A solução foi, em seguida, transfe-55-

rida para um tubo de vidro e foi imersa num banho de água a 902C, durante 10 minutos, e, em seguida, foi arrefecida num abnho de gelo-água. A transformação do lactamo no sal de trissódico do ácido etilenodiaminatriacético foi confirmada pela Ressonância Magnética Nuclear de protões. A solução alcalina foi, em seguida, ajustada a um pH de cerca de

11,9, pela adição de ácido cloridrico. A temperatura foi mantida a menos do que 252C, por arrefecimento num banho de gelo-água. A solução foi transferida para um recipiente de reacção, e 1,5 gramas de uma solução de formaldeido aquosa a 37% foi adicionada, gota a gota e lentamente, durante um periodo de mais de 20 minutos. Uma quantidade pequena de uma solução cáustica aquosa foi, também, adicionada, durante este tempo, para o ajustamento de pH. A mistura foi agitada durante mais uma hora, com adições periódicas de hidróxido de sódio aquoso, para manter o pH entre 11,0 e 11,5.

Num recipiente de reacção separado foram introduzidos 1,5 gramas de 2- (^/Sis(carboximetil)7 aminoj^ metil-4-(acetamido )fenol , preparado pelo processo do Exemplo 12, e 2.5 gramas de água desionizada. Adicionou-se o hidróxido de sódio aquoso a 25%, enquanto se arrefecia num banho de gelo, para se obter um pH de cerca de 11. A solução do aduto de formaldeido, preparada no precedente, foi, em seguida, adicionada, durante um periodo de mais de 30 minutos, ao composto fenólico, a uma temperatura cerca de 302C. A mistura da reacção foi misturada e foi aquecida, durante mais 10 horas, a 70QC, e, em seguida, foi arrefecida. A acetona (100 gramas) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada com uma haste de um agitador magnético. Grca de 10 gramas da mistura da reacção bruta foi adicionada à acetona, resultando daí a precipitação de um material gomoso. A parcela da acetona foi decantada e um suplemento de 50 gramas de acetona foi adicionada ao material, e o produto foi triturado sob a acetona. O es-56-

trato de acetona foi retirado, por decantação, e os sólidos foram secos num forno de vácuo a 60 a 652C, durante várias horas. O produto desejado foi retirado da mistura bruta, passando uma solução aquosa dos sólidos através de uma coluTM na de Q-Sepharose e isolando a parcela desejada, como no Exemplo 11. (Veja a Tabela I).

EXEMPLO U

Preparação do Ácido N , N ' -Di (2-Hidroxi , 5-Acetamidobenzil) Etilenodiamina-N.N'-Diacético (Comparativo )

O ácido etilenodiamina-N,N¹ -diacético (10 gramas, 0.056 mole), 25 gramas de água desionizada, 7,0 gramas de uma solução de hidróxido de sódio a 50%, e 5,0 gramas de metanol foram introduzidos num balão de reacção de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com um agitador mecânico, com um termómetro equipado com um controlador de temperatura, e com um funil de adição. A mistura da reacção foi aquecida a 552C. Uma solução aquosa a 37% de formaldeido (9,2 gramas, 0,11 mole) foi introduzida num funil de adição e foi adicionada durante um periodo superior a vinte minutos. A mistura de reacção foi aquecida a 552C, durante uma hora, e, em seguida foi arrefecida e foi transferida para um outro funil de adição. Num balão de reacção, equipado como no precedente, foram introduzidos 17,2 gramas de 4-acetamidofenol (0,11 mole), 36 gramas de água desionizada, 2,0 gramas de uma solução de hidróxido de sódio a 50%, e 36 gramas de metanol.

A mistura foi aquecida a 652C, e uma solução aquosa de aduto

do ácido formátíeido/etilenodiamina-N,N¹-diacético foi adicionada durante um periodo superior a uma hora e quinze minutos. A mistura da reacção foi aquecida a mais 12 horas a 64 a 659C, e , em seguida foi arrefecida. Uma parcela do produto da reacção foi concentrada, e o metanol foi retirado sob o vácuo. A solução foi ajustada a pH 1,5 a 2,0, com o ácido cloridrico, resultando daí a precipitação do produto de acetilo. O material foi filtrado, foi lavado com água desionizada, e foi seco num forno de vácuo, a 55 a 602C, durante várias horas. A estrutura foi confirmada pela Ressonância Magnética Nuclear de protões.

EXEMPLO V

Preparação do Cloridrato do Acido N.N'-Di(2-Hidroxi-5-Aminobenzil)Etilenodiamina-N,N'-Diacético (comparativo )

A cerca de 0,9 grama do produto isolado do Exemplo U, adicionaram-se 12,5 gramas de água desionizada e 8 gramas de ácido cloridrico concentrado. A solução foi aquecida ao refluxo e foi agitada durante uma hora, num balão de reacção de fundo redondo. Os produtos voláteis foram retirados (no vácuo), e o produto cloridrato de amina foi seco num forno de vácuo, a 50 a 602C, durante várias horas. A estrutura foi confirmada pela Ressonância Magnética Nuclear de protões.

EXEMPLO W

Preparação do Acido Etilenodiaminadi/T2-Hidroxi-5-Acetamidofenil)Acético7 (Comparativo)

Acido glioxilico aquoso a 50% (30,0 gramas, 0,20 mole), 4-acetamidofenol a 98% (30,9 gramas, 0,20 mole) e água desionizada (22 gramas) foram introduzidos num balão de reacção de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com um agitador mecânico e com um termómetro equipado com um controlador de temperatmra. O balão foi arrefecido com um banho de gelo-água e 19,0 gramas de uma solução de hidróxido de sódio a 50% foi adicionada, lentamente e com agitação enquanto a temperatura se mantinha a menos do que 302C. Adicionou-se a etilenodiamina (6,1 gramas, 0,10 mole) a uma temperatura a menos do que 302C. O banho de gelo foi retirado e a mistura de reacção foi aquecida e foi agitada, durante cinco horas, a 85 a 862C. Cerca de 20 gramas do produto aquoso da reacção foram tratados com 10 gramas de éter de etilo. 0 extracto de éter foi retirado e o processo foi novamente repetido. A parcela aquosa foi, em seguida ajustada a um pH de cerca de 4.2, com o ácido clorídrico e foi agitada com 35 gramas de acetona. O extracto de acetona foi retirado e foi posto de parte. Ao material remanescente adicionaram-se 65 gramas de metanol, com agitação. Os sólidos resultantes foram filtrados e foram secos num forno de vácuo, a 55 a 602 C, durante várias horas.

EXEMPLO X:

Preparação do Acido Etilenodiaminadi/T2-Hidroxi-5-Aminofenil)

Acético7 (Comparativo)

A cerca de 4,5 gramas dos sólidos do precedente, adicionaram-se 6 gramas de água desionizada e 21 gramas de ácido clorídrico concentrado. A mistura foi filtrada, e adicionaram-se 6 gramas de água. A solução foi introduzida num balão de reacção de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com um agitador mecânico e com um termómetro. A solução foi aquecida, durante uma hora, a 100 a 10 32C, e. em seguida, foi arrefecida. Os produtos voláteis foram retirados no vácuo, e o produto, o cloridato do ácido etilenodiaminadi(2-hidroxi-5-aminofenil)acético. foi seco, num forno de vácuo, a 602C durante varias horas. A hidrólise do funcionamento do acetilo foi acompanhada pela Ressonância Magnética Nuclear de protões .

Preparação do Complexo e Determinação da Percentagem do Complexo

Nos Exemplos, que se seguem, foram empregados os termos, que se seguem: conc designa concentrado; OAc designa a metade de acetato, OCOCH^: TLC designa cromatografia de camada fina; temperatura ambiente designa a temperatura cerca de 20 a 25QC, de um dia para o outro designa cerca de 9 a 18 horas; resina de C-25 de SP-Sephadex -é uma resina de troca de catiões que tem o funcionamento do ácido sulfónico , vendida pela

Pharmacia . Inc.

Os complexos de ítrio e/ou de samário , dos diversos compostos . foram preparados e a percentagem da complexação foi determinada como se segue:

Preparação do Complexo de ítrio¹

Os complexos foram feitos, preparando-se uma solução de ítrio a 0,0003M em água. (YClj.õl^O 303,26g/mole; YÍOAc)^, 12,1% í^O). Adicionou-se YCl^ rádioactivo (Laboratórios Nacionais de Oakridge), para se obterem em número desejado de pontos. Dez ul da solução de ligando (a 0,0 3M) foram adicionados a 990 yl da solução de Y, dando uma proporção de ligandos para os metais de 1:1 (dez vezes a quantidade da solução de ligandos foi empregada para uma proporção de 10:1 de ligandos para os metais).

O pH foi. em seguida, ajustado a 7,4, empregando-se quantidades de microlitros de acido clorídrico ou de hidróxido de sódio . A solução, foi, em seguida , analisada, para a quantidade de ítrio complexado. empregando-se o processo de troca de catiões, exposto a seguir.

Determinação da Percentagem do Complexo

Uma coluna de plástico (Biorad) de 10 ml disponível foi cheia com 1 a 2 ml de resina de troca de catiões C-25 Sephadex intumescida de água. A água foi eluída sob pressão,para o ponto mais elevado da resina. Quinze gl do complexo (ou mais, se os pontos fossem

poucos) foram adicionados ao ponto mais elevado da resina. Isto foi seguido por 2 ml de 4:1 (Volume: volume) de solução de salina isotónica: hidróxido de amónio, como um eluente, que foi deixado cair gota a gota, num tubo de contagem. Isto foi, também, eluido sob pressão, ao ponto mais elevado da resina. Um complemento de 2 ml do eluente foi adicionado e a coluna foi eluida sob pressão, para se retirar todo o liguido. A resina seca foi, em seguida, introduzida num terceiro tubo de contagem, e os três tubos foram contados num contador de precisão de Nal, empregando-se um analisador de multicanais Canberra, ligado a um computador. A percentagem do complexo foi determinada dividindo-se o numero de pontos , nas duas eluições pelo total de pontos nas eluições mais os da coluna . tudo vezes 100. Por este processo, o itrio não complexado foi retido na coluna.

Preparação do Complexo de Samário/Determinação da Percentageir do Complexo:

Os complexos de samário foram pro duzidos, como foi descrito no precedente, para os complexos de itrio, excepto de que o samário 0 ,0003M foi preparado por dissolução de Sn^O^ (348,7 gramas/mole) em ácido clorídrico a O,1M. Sm-153 rádioactivo foi obtido como uma solução a 0,0003M em ácido clorídrico a 0,1M da Universidade de Reactores de Investigação de Missouri, Colúmbia, Missouri A determinação da percentagem dos complexos foi feita da mesma maneira gue para o complexo de itrio. Os resultados estão resumidos na Tabela II.

Tabela II

Dados da Complexação

Exemplo do Complexo .Ίο.	Composto do Número Ex. No.	% Complexo(10:1)
Y	Sm
16	1	98
17	2	>99
18	2		>99
19	3	>99
20	4	>99
21	5	99
22	6		>99
23	7		96**
2U	n 0		>99**
25	9		>99
26	10	98
• 27	11	99
28	1 1	98*
29	12	99
30	12		98
31	12	98«
32	12		98*
33	15	99

A proporção do ligando/metal foi cerca de 1:11

A proporção do 1igando/meta 1 foi cerca de 50:1

Exemplos I a XV e Exemplos Comparativos A a F In Vivo

Filtragem dos Quelatos Bifuncionais

A estabilidade de determinados quelatos de terras raras tem sido correlacionada com as análises in vivo nos animais. Por exemplo, Rosoff e outro na International Journal of Applied Radiation and Isotopes 14, páginas 129 a 135 (1963), relata a distribuição de quelatos de terras raras rádioactivas em ratos, por determinados ácidos aminocarboxilicos. A correlação verificada foi que in vivo a competição entre o agente de quelação e os constituintes do corpo (inorgânicos e orgânicos) para os iões de terras raras, determina a sua deposição e a sua evacuação. Os quelatos de terras raras fortes aceitam-se como dissociando muito pouco e sendo evacuados , enquanto os quelatos de vigor fraco e intermediário se dissociam mais rapidamente, e, deste modo, são depositados em orgãos tais como o fígado. Não obstante, a concentração do rádionuclídeo , no fígado . não é sempre . devido a formação reduzida de complexos . mas , em algur>3 casos, e devida a afinidade que o quelato do metal tem pelo fígado (veja os Exemplos Comparativos A a B, na .Tabela III). Os compostos têm, de facto, sido preparados e utilizados, para a avaliação da função do fígado (Fritzberg, Alan R., Radiopharamceuticals: Progress and Clinicai Perspectives) 1^, (1986);

Patentes N2 4.088.747 e N2 4.091.088, ambas dos Estados Unidos da América (Hunt e outro).

A biodistribuição dos diversos quelatos de samário e/ou de ítrio, divulgada nesta Memória

Descritiva, foi determinada, e também a percentagem da dose no fígado empregada como um processo de filtragem in vivo para se estimar, qualitativamente, a estabilidade dos quelatos. Os quelatos de NTA e de EDTA foram incluídos, para comparação.

Também o samário foi injectado como o cloreto de samário, na modalidade não quelatada.

Os ratos da estirpe de Sprague-Dawley, com o peso de 150 a 200 gramas, foram adquiridos nos Charles River Laboratories. Estes animais foram colocados em jaulas e foram alimentados com água e com a alimentação, a seu bel-prazer. Os animais foram aclimatados, durante pelo menos cinco dias, antes do seu emprego. Antes da injecção do complexo, os animais foram colocados sob uma lâmpada de aquecimento (15 a 30 minutos) para se dilatar a veia da cauda. Em seguida, o animal foi colocado numa jaula de restrição, a cauda foi limpa com álcool, e o animal foi injectado (50 a 200 yl) via veia da cauda. Depois da injecção, o animal foi colocado numa outra jaula, durante duas horas, após o que o animal foi morto por luxação cervical. 0 animal foi, em seguida, dissecado, e as partes foram enxaguadas com água desionizada, foram secas e foram pesadas num frasco de contagem tarado. Qualquer que fosse o volume da injecção praticada, pelo menos três lotes do mesmo material foram preparados e contados com as partes do animal. A percentagem da dose é o numero de contagens no orgão, dividido pelo número de contagem no lote vezes 100 (Veja a Tabela III).

Tabela III

Dados da Biodistribuição

Exemplo da Biologia No.	Composto do Número d< Exe^l^	Metal	% da Dose Injectada no Fígado
T	1	Y	0.87
II	2	Y	0.22
III	3	Y	0.22
17	4	Y	1 . 4
7	5	Y	0.38
71	6	Sm	0.38
711	9	Sm	2.3
VIII( 10)	10	Sm	1.3
VII1(300)	10	Sm	0.12
7111(10)	10	Y	0.39
viii(300)	10	Ho	0.26
IX	1 1	Y	0.22
X	1 1	Sm	0.33
XI	12	Y	0.28
. XII	12	Y	0.18
XIII	12	Sm	0.35
XIV	12	Sm	0.26
XV	15	Y	0.37
(A)	U(comp)	Sm	12
(B)	X(comp)	Sm	24
(C)	EDTA	Sm	8.4
(D)	EDTA	Sm	4.4
(E)	NTA	Sm	8.6
(F)	SmC13	Sm	39

Os complexos foram preparados nas proporções de ligando/me tal de 10:1 para os Exemplos I a XI, XIII e XV; de 1:1 para os Exemplos XII e XIV; de 5:1 para o Exemplo C; e de cerca 300:1 para os Exemplos D e E.

Exemplos XVI e XVII complexo 1:1 de ítrio , com o ácido 1-(p-aminobenzil)dietilenotriaminapentaacético (ABDTPA). um quelato bifuncional bem conhecido na bibliografia, e com o ligando do Exemplo 2 (Agora Exemplo XVI) e do Exemplo 12 (Agora Exemplo XVII) foi preparado, empregando-se as técnicas descritas anteriormente. Diversas partes aliquotas de 100 microlitros foram, em seguida, recolhidas em tubos centrífugos separados. Adicionou-se um excesso de metal, de tal modo que a alteração do volume total fosse minimizada, e foi anotado o tempo. Meia hora depois da adição do metal, a percentagem do complexo foi determinada, pelo processo C-25 de Sephadex¹ ' ^{e e a} foi comparada com a quantidade original do complexo. A percentagem do complexo em face do metal adicionado, dá uma indicação da instabilidade do complexo de ligando-metal. Os resultados são dados a seguir e são comparados com o complexo de EDTA-ítrio.

Tabela IV

Estudo do Complexo

Proporção Molar do metal-Ligando	í Complexo
Ex. XVI	Ex. XVII	ABDTPA	EDTA
1	99	95	97	98
10	94	93	95	86
100	84	90	92	78
250	--	90	87	48
500	75	79	70	16

Exemplo XVIII

Uma solução a 0,18M/L do ácido 1-(p-aminobenzil)dietilenotriaminapentaacético (ABDTPA) e uma solução a 0,18M/L idêntica do ligando do Exemplo 12, foram preparadas num tampão de acetato de sódio a 0 ,5M a pH 6,5.

As soluções foram, em seguida, tratadas com 1,5 equivalentes de ítrio-90, como o cloreto de ítrio a 0 ,03M/L. O pH do complexo resultante foi a 6.

excesso de Y-90 foi retirado passando o complexo através de um volume de camada de um TM ml de resina de Chelex Bio-Rad Laboratories. A concentração do complexo, nesta modalidade purificada, foi de 0,0013M. Uma quantidade adequada da solução foi adicionada _9 a 1,7 x 10 moles de aldeído contendo o anticorpo monoclonal CC-46, para dar origem a uma proporção de 40:1 do complexo para o anticorpo. Depois de uma exposição de uma hora, um excesso molar de 236 (sobre o anticorpo) de NaCNBH^ foi adicionado, e as soluções foram deixadas a assentarem-se, durante cerca de uma hora. Decorrido este tempo, o anticorpo (e qualquer complexo ligado covalentemente) foi separado do complexo não ligado, por filtração

TM de gel G-25 de Sephadex . Este processo proporcionou uma média de 5,0 complexos. por anticorpo, para o ácido 1—(p—aminobenzi1)dieti1enotriaminapentaacético, e uma média de 5,4 complexos, por anticorpo, para o ligamento do Exemplo 12.

EXemplo XIX

Com a finalidade de se demonsi trar a ausência de reacção dos conjugados do anticorpo-complexo do Exemplo XVIII, os conjugados foram provocados com um excesso do ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) pela maneira seguinte. Os anticorpos-complexos purificados foram adicionados a um tampão de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico) a pH 7,4, e foram tratados com uma quantidade adequada de uma solução de DTPA a 0,1M (pH 7,4) para se assegurar um excesso molar de 1.000 vezes de DTPA sobre o complexo ligado ao anticorpo. Depois de uma hora, uma parte alíquota foi retirada, e os

-69conjugados de anticorpo-complexos foram separados das substâncias de peso molecular pequeno, empregando-se a filtração de gel. Os resultados indicam que o sistema ABDTPA perdeu mais de 98% do itrio . enquanto o sistema , que empregou o ligando do Exemplo 12 perdeu cerca de 39% do itrio.

EXEMPLO XX

Preparação do Complexo de Samário de 2,6-Bis ^/T2-^/Bis(Carboximetil/ZAminoEtil)(Carboximetil)7Aminometil3~4-(Amino)Fenol

Uma solução de samário foi..

153 preparada, combinando-se, num frasco de 1 ml Sm (200 -4 ql de uma solução de 3 x 10 M. em acido clorídrico a 0 ,1M 6 x 10mmole) com SmClg.õHjO frio (4,8 mg, 1,31 Λ 10~²mmoles). Esta solução foi adicionada a 2,6-bis£ /T2-Ç/bis (carboximetil)7amino2) etil)(carboximetil)7aminometil \ -4-(acetamido)fenol (3.3 mg. 5,31 x 10 mmoles), preparada pelo processo do Exemplo 11. O pH foi, em seguida, ajistado a 7, pela adição de hidróxido de sódio (40 ql de uma solução a 1,0Μ). A percentagem do complexo foi verificada ser TM

68%, empregando-se o processo C-25 de Sephadex

O complexo precedente foi purifiTM cado pela cromatografia de troca de anioes (Q-Sepharose

1,5 cm x 21 cm, NaCl a 0 a 1M, durante mais de 30 minutos ml por minuto, detecção a 285 nm) . As parcelas, que continham o complexo (1 ml cada, 6 ml no total) foram reunidas, e a percentagem do complexo foi verificada ser 95%.

EXEMPLO XXI

2-^/Bis(Carboximetil27Amino2 Etil)(Carboximetil27AminometilJj -4-(Amino )

Fenol, com o Anticorpo Monoclonal de CC-46

O bicarbonato de sódio (60 mg, 7,14 χ 10¹ mmoles) foi introduzido num frasco de vidro dracma, e a solução do complexo do Exemplo XX foi adiciona-4 da (1 ml, cerca de 8,8 x 10 mmoles). Adicionou-se o tiofosgénio (10 gl , 1,31 χ 10^-·¹ mmoles), em clorofórmio (1 ml) e o frasco foi vedado, a mistura foi agitada, durante 15 minutos, após o que o estracto aquoso foi lavado , por duas vezes, com clorofórmio (parcelas de 1 ml), a percentagem do complexo foi verificada e achou-se ser de 96%.

o complexo de Sm de isotiocianato precedente (100 ql cerca de 8,8 4 10mmoles) foi combinado com o anticorpo monoclonal CC-46 (100 ql de uma solução de 8 mg/ml, cerca de 5,3 χ 10^_θ mmoles) e foi deixado assentar durante 24 horas. A quantidade do complexo conjugado com o anticorpo foi verificada ser de 46% pela cromatografia de exclusão de capacidade.

EXEMPLO XXII

Preparação do Complexo de Samário do Acido 2-/Bis(2-j,/7Bis (Carboximetil) 7Amino2jEtil) Amino7-2-/5-Amino-2-(Carboximetiloxi)Fenil7Etanóico e do Acido 2-^/2-/72- ^/Bis (carboximetil )7Aminolj Etil) (Carboximetil )Amino7 Etil 3(Carboximetil) Amino7-2-/5-Amino-2-(Carboximetiloxi) fenil7Etanóico

Uma solução de ligamentos do Exemplo 7 foi preparada, dissolvendo-se 266 mg do sólido liofilizado, em 1 ml de água. Uma parte alíquota de 33,85 ql desta solução foi tratada com 1 ml de SmCl, a 3 x 10“*M, em ácido cloridrico a O,1N, contendo uma quantidade de tracedor de ¹⁵³Sm radioactivo. 0 pH da solução do complexo foi ajustado a cerca de 13, empregando-se o hidróxido de sódio a 50%, em peso, e, em seguida, ajustado a pH cerca de 7,5, empregando-se o ácido cloridrico a Ι,ΟΝ. A percentagem de Sm, que foi complexado, foi determinada como foi descrito nos Exemplos 16 até 33, e foi verificada ser de 100%.

A ausência de reacção do complexo, foi comprovada introduzindo-se duas partes alíquotas de 500 ql da solução do complexo, em frascos separados. Uma parte foi tratada com parcelas de 1 a 2 ul de ácido cloridrico a 0,lN, até que o pH se tivesse baixado, e a outra parte foi tratada com o hidróxido de sódio a 0 ,1N para elevar o pH. Os complexos foram deixados assentarem durante 5 a 10 minutos, em cada alteração de pH, e em seguida, eles foram experimentados, para se determinar a percentagem da complexação, naquele pH, pelo processo descrito para os Exemplos 16 a 33. Os resultados são revelados na tabela, que se segue.

Tabela V

PH	% d o Comple xado
1	98
2	100
3	100
4	100
5	100
7	100
9	100
11	100
13	100

Exemplo XXIII

Preparação do Complexo de Samário do Acido 2—/ 2—/T2—

- ^/Bis (Carboximetil )7Amino2) Etil) (Carboximetil) Amino/EtiP) (Carboximetil)Amino7-2-/5-Amino-2-(Carboximetiloxi)Fenil7 Etanóico

Uma solução do ligando do Exemplo 8 foi preparada, dissolvendo-se 13,9 mg do sólido acastanhado, em 772 ql de água. Um complexo foi preparado, dissolvendo-se 500 ql desta solução de ligando, em 1 ml de 3 x

M de SmCl- (contendo o acido cloridrico a 0,lN),que ^J 153 tinha sido guarnecido com Sm radioactivo. O pH da solução do complexo foi ajustado a cerca de 7, pela adição de hidróxido de sódio a Ι,ΟΝ. A percentagem da complexação foi determinada pelo processo descrito para os Exemplos 16 a 33, e verificou-se ser 96%.

A ausência da reacção do complexo foi comprovada introduziram-se duas partes alíquotas de 500 yl cada da solução do complexo, em frascos separados. Uma parte foi tratada com parcelas de 1 a 2 yl de ácido cloridrico l,0N, até que o pH se baixasse, e a outra parte foi tratada com Ο,ΙΝ, l,0N e hidróxido de sódio a 50%, em peso, para se elevar o pH. Os complexos foram deixados a assentarem-se, durante cerca de 5 minutos, em cada alteração de pH, e, em seguida, eles foram experimentados, para se determinar a percentagem da complexação. aquele pH, pelo processo descrito para os Exemplos 16 a 33. Os resultados estão apresentados na tabela, qúei se segue.

Tabela VI

pH	% do Comple xado-----
1	91
2	88
3	92
5	96
7	96
9	99
12	98
13	99

EXEMPLOS DOS DADOS DA BIODISTRIBUIÇÃO

Os complexos foram preparados misturando-se uma solução do ligamento e do metal, e, em seguida, ajustando-se o pH a 7 a 8. A quantidade do metal que foi complexado ao ligamento, foi determinada pela cromatografia de troca de catiões. 0 metal livre foi retido pela resina; o metal, na modalidade de um complexo, não o foi.

Um cento de ul dos complexos foi injectado na veia da cauda de três ratos da estirpe de Sprague Dawley. Duas horas depois da injecção, os ratos foram mortos por luxução cervical e as amostras dos tecidos foram retirados. Os tecidos foram pesados, e a quantidade da radiação, em cada tecido, foi determinada, medindo-se o número de pontos, empregando-se um contador de precisão de Nal, e comparando-os com os padrães. A percentagem da dose , no sangue, foi determinada presumindo-se que o peso do sangue era 6,5% do peso do animal. A quantidade no osso era de 25 vezes a percentagem da dose num fémur. Os exemplos que se seguem, diferem no ligamento, na quantidade do ligando e na quantidade do metal , empregados. 0 metal não rádioactivo foi empregado, para se obter as desejadas proporções de ligando ao metal, e o metal rádioactivo do traçador foi empregado para se obter a biodistribuição.

Exemplo XXIV ligamento do Exemplo 10 foi misturado com uma solução de Sm-153. A concentração de Sm foi de 3 x 10 M, e o ligando foi empregado com um excesso molar de 300 vezes. A biodistribuição revelou 52,7% no osso 0,12% no fígado, 0,005% no baço, 0,23% nõ músculo e 0,05% no sangue.

Exemplo XXV ligando do Exemplo 10 foi com -4 plexado a Ho-166. A concentração de Ho era de 3 x 10 M, e a composição continha 300 vezes o excesso molar do ligando. A biodistribuição revelou 52,9% no osso, 0,25% no fígado, 0 ,007% no baço. 1,1% no músculo e 0 ,09% no sangue.

EXEMPLO XXVI

O ligamento do Exemplo 10 foi complexado a Sm-153, empregando-se uma concentração de Sm de 3 x 10 M e 10 vezes o excesso molar do ligamento.

A biodistribuição revelou 48,5% no osso, 1,3% no fígado,

0,01% no baço, 0,73% no músculo e 0,18% no sangue.

EXEMPLO XXVII

Um coelho foi injectado, da mesma maneira que os ratos , com uma composição que tinha Y-90 com Y a 3 x 10~^M, e o ligando do Exemplo 10 a 10 vezes o excesso molar. A actividade foi verificada concentrar-se no osso (59%). no fígado (1.1%), no baço (0,19%) no músculo (1,5%) e no sangue (0,68%), revelando uma absorção minima.

Exemplo XXVIII

O ligamento do Exemplo 1 foi complexado, empregando-se Y-90 como um traçador. A concen-4 tração de Y foi de 3 x 10 M , e o ligando foi adicionado num excesso molar de 10 vezes. A biodistribuição do rato (média de dois ratos) revelou 56,1% no osso, 0,87% no fígado, 0,03% no baço, 0,78% no músculo e 0,57% no sangue.

Exemplo XXIX

Um cão foi apresentado com um osteosarcoma no número proximal direito, e andava com uma coxeadura digna de nota. Um complexo foi preparado, empregando-se o ligando do Exemplo 10 , com uma solução de Sm-153 -4

A concentração de Sm foi de 3 x 10 M, e o ligando foi empregado com um excesso molar de 300 vezes. A actividade especifica do Sm-153 foi de 30 mCl/min. Administrou-se ao cão uma injecção intravenosa deste complexo, que continha 0,95 mCi de Sm-153, por kg do peso do corpo do cão. Uma semana depois da injecção, o passo do cão tinha-se aperfeiçoado de modo perceptivel.

Tabela I: Estrutura Genérica

Tabela 1: (CONT.

Tabela 1 (Cont.

Tabela 1: Cont.

Tabela 1 : Cont .

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Quelante bifuncional, caracterizado por possuir um grupo funcional ligado na posição orto e por ter a fórmula:

(I) em que:

Z é um ligador sintético, que não interfere com a formação de complexação com um radionuclídeo, e que pode ser ligado a um anticorpo, ou a um seu fragmento, seleccionado de entre amino, isotiocianato, semicarbazida, tio-semicarbazida, carboxilo, bromoacetamido ou maleimido;

X é hidrogénio, alquilo ou CR₃R₄CO₂H;

R_v R₂, R₃ e R₄, são cada um, independentemente, hidrogénio, hidroxi, CO₂H ou um grupo alquilo C^Cj, com a condição de que quando n = 0 e R$ = H, então um de R₄ ou Rs tem de ser CO₂H;

R§ é hidrogénio ou (CR₁R₂)_nCR₃R₄B;

-85B representa uma amina ou polialquileno-amina, linear ou ramificada, em que, pelo menos, um dos hidrogénios amínicos foi substituído por um grupo

CR₃R₄CO₂H;

n é 0 ou 1; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. Quelante bifuncional de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por n ser 0.
3. Quelante bifuncional de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por R₄ ser CO₂H.
4. Quelante bifuncional de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por X ser hidrogénio.
5. Quelante bifuncional de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por R_b R₂ e R₃ serem cada um hidrogénio.
6. Quelante bifuncional de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser o 2-((2-( (bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetil)amino]-2-[5-amino-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico.
7. Quelante bifuncional de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser o 2-((2-( [bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetil)amino]-2-(5-amino-2-hidroxifenil)etanóico.

-868. Quelante bifuncional de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser o ácido 2,6-bis{[(2-{[bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetil)]aminometil} -4-(amino)fenol.
9. Quelante bifuncional de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser o ácido 2,6-bis{[(2-{[bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetiI)]aminometil}-4-(isotiocinato)fenol.
10. Complexo, caracterizado por compreender um quelante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, complexado com um ião de metal, seleccionado de entre La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y ou Sc.
11. Complexo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ião de metal ser ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁷Lu, ¹⁷⁵Yb, ⁴⁷Sc ou ¹⁴²Pr.
12. Conjugado, caracterizado por compreender um complexo, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, ligado covalentemente a um anticorpo, ou a um fragmento do anticoipo.
13. Conjugado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o anticorpo, ou seu fragmento, ser um anticoipo monoclonal, ou um seu fragmento.
14. Conjugado de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o anticorpo, ou fragmento de anticorpo, ser CC-46, CC-49, CC-49 F(ab')₂, CC-83 F(ab')₂ ou B72.3.
15. Formulação farmacêutica, caracterizada por compreender um complexo de acordo com a reivindicação 10 ou 11 e um veículo fisiologicamente aceitável.
16. Formulação farmacêutica, caracterizada por compreender um conjugado de acordo com a reivindicação 12 e um veículo fisiologicamente aceitável.
17. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada por se destinar ao tratamento do cancro.
18. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada por se destinar ao tratamento de dores nos ossos.