PT101728B

PT101728B - Quelantes que possuem um grupo funcional ligado na posicao orto e seus complexos

Info

Publication number: PT101728B
Application number: PT101728A
Authority: PT
Inventors: Jaime Simon; Joseph R Garlich; Kenneth Mcmillan; David A Wilson; Richard K Frank
Original assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1988-10-31
Filing date: 1995-06-27
Publication date: 1999-11-30
Also published as: EP0367223A2; NO178571B; ES2090787T3; IL92160A0; DE68926913T2; CN1042536A; JPH02196761A; NO894326L; CN1090286A; PT92157B; KR900006273A; IE980697A1; ATE121727T1; HUT51594A; CA2001765C; AU4391689A; HU895608D0; CA2001765A1; CN1045290C; DK541389A

Description

QUELANTES, QUE POSSUEM UM GRUPO FUNCIONAL LIGADO NA POSIÇÃO ORTO, E SEUS COMPLEXOS”

DESCRIÇÃO

O invento em consideração diz respeito a quelantes, que possuem o grupo funcional ligado na posição orto, seus complexos e seus conjugados, processos para a sua preparação, formulações para a sua utilização e métodos para a sua utilização em diagnóstico e/ou terapia do cancro.

Os quelantes funcionalizados, ou os coordenadores bifuncionais, são conhecidos como sendo capazes de se ligarem, covalentemente, a um anticorpo, que tem a especificidade para os epítopos ou para os antigénios das células do cancro ou dos tumores. Os complexos de radionuclídeos de tais conjugados de anticorpo/quelante são úteis, em aplicações de diagnóstico e/ou terapêuticas, como um meio de transmitir o radionuclídeo a uma célula do cancro ou dos tumores. Ver, por exemplo, Meares et al., Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984); Krejcarek et al., Biochem. andBiophys. Res. Comm. ΊΊ, 581-585 (1977).

Os agentes de quelação de ácido aminocarboxílico tem sido conhecidos é estudados na bibliografia, durante diversos anos. Os ácidos aminocarboxílicos característicos são o ácido nitrilotriacético (NTA), o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), o ácido hidroxietiletilenodiaminotriacético (HEDTA) e o ácido trans-l,2-diaminociclo-hexanotetracético (CDTA). Numerosos agentes de quelação bifuncionais, baseados nos ácidos aminocarboxílicos,

têm sido propostos e preparados Por exemplo, o dianidrido cíclico de DTPA (Hnatowich et al. Science 220, 613 a 615, 1983 Patente No. 4.479.930, dos

Estados Unidos da América) e os anidridos carboxicarbónicos mistos de DTPA (Gansow, patentes 4.454.106 e 4.472.509, dos Estados Unidos da América; Krejcarek et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77, 581-585, 1977) têm sido apresentados na bibliografia. Quando os anidridos são acoplados às proteínas, o acoplamento processa-se pela formação de uma ligação amida, deixando, deste modo, quatro dos cinco grupos originais de carboximetilo, na estrutura da dietilenotriamina (DETA) (Hnatowich et al., Int. J. Appl., Isot. 33, 327-332 1982). Em complemento, as Patentes No. 4.432.907 e No. 4.3 2.751 dos Estados Unidos da América, divulgam agentes de quelação bifuncionais, úteis para a ligação dos iões metálicos a espécies orgânicas, tais como moléculas ou anticorpos orgânicos alvo. Tal como no antecedente, o acoplamento é obtida por meio de um grupo através da utilização de dianidridos de ácido diaminotetracético. Exemplos de anidridos incluem dianidridos de EDTA, CDTA, ácido propilenodiaminotetracético e ácido fenileno-l,2-diaminotetracético. A Patente No. 4.647.447, recente, dos Estados Unidos da América, divulga diversos sais de complexos, formados a partir do anião de um ácido de complexação, para emprego nas diversas técnicas de diagnóstico. E divulgada a conjugação, por meio de um grupo carboxilo do ácido de complexação, o que origina uma ligação através de uma ligação amida.

Uma outra classe de agentes de quelação bifuncionais, baseados no funcionamento dos ácidos aminocarboxílicos encontra-se também bem documentada, na bibliografia. Assim, Sundberg et al., em J. ofMed. Chem. 17 (12), 1304 (1974) divulgam os análogos bifuncionais de EDTA. Representantes destes compostos são o ácido l-(p-nitrofenil)etilenodiaminotetracético, o ácido l-(p-amino-

fenil)etilenodiaminotetracético e o ácido l-(p-benzenodiazónio)etilenodiaminotetracético. E discutido o acoplamento às proteínas, através do para-substituinte, e a ligação dos iões dos metais radioactivos ao grupo do quelação. Os compostos são, também divulgados em Biochem. Biophys. Res. Comm, 75 (1), 149 (1977) e nas Patentes No. 3.994.966 e No. 4.043.998, dos Estados Unidos da América. E importante verificar-se que a ligação do grupo aromático à estrutura da EDTA é feita através de um átomo de carbono da estrutura etilenodiamina. Agentes de quelação bifuncionais, opticamente activos, baseados em EDTA, HEDTA e DTPA, são divulgados na Patente No. 4.622.420, dos Estados Unidos da América. Também nesta referência, a ligação do grupo funcional do ácido aminocarboxílico ao resto da molécula de quelação bifuncional, é feita através de um átomo de carbono da estrutura da etilenodiamina. Nestes compostos, um grupo alquileno liga o grupo aromático (que contém o grupo funcional necessário para a ligação à proteína) ao carbono da poliamina, que contém o grupo funcional da quelação. Outras referências a tais compostos incluem, Brechbiel et al., Inorg. Chem. 25, 2772.2781 (1986),Patente No. 4.647.447, dos Estados Unidos da América, e um Pedido PCT publicado, que tem o Número WO 86/06384 da Publicação Internacional. Mais recentemente, determinados agentes de quelação bifuncionais macrocíclicos e o emprego dos seus conjugados quelato de cobre, para aplicações em diagnóstico ou terapêuticas, têm sido divulgados, na Patente No. 4.678.667, dos Estados Unidos da América. A ligação do grupo funcional do ácido aminocarboxílico, ao resto da molécula de quelação bifuncional, é feita através dé um átomo de carbono de anel da estrutura poliamina cíclica. Deste modo, um agente de ligação, ligado numa extremidade a um átomo de carbono de anel da poliamina cíclica, está também ligado, na sua outra extremidade, a um grupo funcional capaz de reacção com a proteína.

Uma outra classe de agentes de quelação bifuncionais, também digna de nota, é constituída por compostos em que a porção de quelação, isto é, o ácido aminocarboxílico, da molécula, está ligada, através de um átomo de azoto, ao grupo funcional da molécula, contendo a porção capaz de reagir com a proteína. Como um exemplo, Mikola et al., num Pedido PCT publicado (Publicação Internacional Número WO 84/03698, publicado em 9/27/1984) divulga um agente de quelação bifuncional, preparado pela reacção de brometo de p-nitrobenzilo, com DETA, seguida pela reacção com o ácido bromoacético, para produzir o ácido aminocarboxílico. O grupo nitro é reduzido ao grupo de amina correspondente e, em seguida, é transformado no grupo isotiocianato, por reacção com o tiofosgénio. Estes compostos são agentes de quelação bifuncionais, que podem ser conjugados com as moléculas bio-orgânicas, para emprego como agentes de diagnóstico, capazes de quelarem as lantamidas. Visto que a ligação da porção agente de ligação da molécula se processa através de um dos átomos de azoto do ácido aminocarboxílico, então um grupo do aminocarboxilo potencial perde-se relativamente à quelação. Deste modo, um quelante bifuncional. baseado em DETA, contendo quatro (e não cinco) grupos ácido, é preparado. A este respeito, esta classe de quelantes bifuncionais é semelhante aquelas em que a ligação à proteína se faz através de um grupo amida com a subsequente perda de um grupo de quelação carboxilo.

Em J. Radioanalytical Chem. 57 (12) páginas 553 a 564 (1980), Páik et al divulgam o emprego de p-nitrobenzilbrometo, numa reacção com uma dietilenotriamina bloqueada, isto é, bis-(2-ftalimidoetil)amina, seguida por processos de desbloqueamento e a carboximetilação, empregando-se o ácido cloroacético, dando origem ao ácido N-p-nitrobenzildietilenotriamino-N,N,N,N-tetracético. Igualmente, visto que a ligação se faz através de um

-5átomo de azoto, se obtém um derivado do ácido tetracético. Expõe-se a conjugação do agente de quelação bifuncional e a quelação com índio A substituição do átomo de azoto é também preconizada por Eckelman et al., em J. Pharm. Sei. 64(4) (1975) reagindo aminas, tais como etilenodiamina ou dietilenotriamina, com o brometo de alquilo adequado, antes da carboximetilação. Os compostos são apresentados como agentes de formação de imagem radiofarmacêuticos potenciais.

Recentemente, Camey, Rogers e Johnson divulgaram (3rd Intemational Conference on Monoclonal Antibodies: San Diego: Califórnia Fevereiro 4 a 6, 1988) resumos intitulados Absence of Intrinsically Higher Tissue Uptake from Indium-111 Labeled Antibodies: Co-administration of Indium-111 and Iodine-125 Labeled B72.3 in a Nude House Model e Iníluence of Chelator Denticity on the Biodistribution of Indium-111 Labeled B72.3 Immunoconjugates in Nude Mice. A biodistribuição de índio-111, complexado com um agente de quelação bifuncional EDTA e DTPA é divulgada. A ligação do anel aromático às porções EDTA/DTPA é feita através de um radical acetato. No precedente, Hunt et al., nas Patentes No. 4.088.747 e No. 4.091.088 (1978), dos Estados Unidos da América, divulgaram agentes de quelação baseados em ácido etilenodiaminodiacético (EDDA), em que a ligação de um anel aromático à porção EDDA é feita através de um radical alquileno ou acetato. Os compostos são divulgados como sendo proveitosos como quelatos, para o estudo da função hepatobiliar. O metal preferido é o tecnécio-99m. O índio-111 e o índio-113 são também divulgados como radionuclídeos proveitosos para a formação de imagem.

Martell et al., em Inorgânica Chemica Acta 138, páginas 215 a 230, divulgam um agente de quelação de ferro, para o tratamento da anemia de Cooley. Os ligandos empregados eram análogos de EDTA. com grupos dadores de amino e de carboxilato ou tendo grupos dadores adicionais presentes, como grupos fenólicos ou como grupos fenólicos substituídos nos aneis piridina; com grupos ácido aminofosfónico ou éster aminofosfónico, com dadores adicionais de fenolato e de amino; com poliaminas macrocíclicas, tendo grupos dadores de carboxilato e/ou de fenolato; com ácidos tris-hidroxâmicos; com triscatecóis; e com ligandos multidentados, com grupos amida de coordenação.

O desenvolvimento de metástese nos ossos é um acontecimento catastrófico vulgar e frequente, para um doente canceroso. A dor, as fracturas patológicas, os défices neurológicos frequentes e a imobilidade forçada frequente, originadas por estas lesões metastáticas, diminuem, de um modo digno de nota, a capacidade da vida do doente cancerosos. O número de doentes, que contraem a doença metastática é enorme, visto que cerca de 50% de todos os doentes, que contraem o carcinoma da mama, do pulmão ou da próstata, desenvolverão, eventualmente, as metástases nos ossos. As metástases nos ossos verificam-se também, nos doentes com o carcinoma do rim, da tiróide, da bexiga, do cerviz e outros tumores, e, colectivamente, eles representam menos do que 20% dos doentes, que desenvolvem metástases nos ossos. O cancro dos ossos metastático põe, raramente, em perigo a vida, e às vezes os doentes vivem, durante anos, depois da descoberta das lesões dos ossos. Iniciálmente, o tratamento tem por objectivo o alívio da dor, com redução das exigências para a medicação narcótica e para a ambulação crescente. Como é evidente, tem-se a esperança de que alguns cancros possam ser curados.

O emprego dos radionuclídeos, para o tratamento do cancro metastático nos ossos, remonta ao princípio dos anos 1950. Tem sido proposto injectar-se um nuclídeo emissor de partículas radioactivas, de uma forma adequada, para o tratamento das lesões calcificas. E desejável que tais nuclídeos sejam concentrados na região da lesão do osso, com quantidades mínimas a atingir o tecido liso e o osso normal. Os compostos de fósforo radioactivo (P-32 e P-33) têm sido propostos, mas as propriedades nucleares e de biolocalização limitam a utilidade destes compostos. [Kaplan. E. , et al., J. Nuc. Med. j. (1), 1, (1960 ); (Patente No. 3.965.254, dos Estados Unidos da América).

Uma outra tentativa, para tratar o cancro dos ossos, tem sido feita empregando compostos de fósforo, contendo um resíduo de boro. Os compostos foram injectados no corpo (intravenosamente) e foram acumulados no sistema esquelético. A região do tratamento foi, em seguida, irradiada com neutrões, com a finalidade de activar o boro e proporcionar uma dose de radiação terapêutica. (Patente No. 4.399.817, dos Estados Unidos da América).

Nos processos mencionados no precedente, não é possível dar doses terapêuticas ao tumor, sem prejudicar, substancialmente, os tecidos normais. Em muitos casos, especialmente para as lesões metásticas nos ossos, o tumor espalha-se em todo o sistema esquelético, e a amputação ou a irradiação não é eficaz. (Seminars in Nuclear Medicine IX (2), Abril de 1979).

O emprego de Re-186 complexado com um difosfonato, tem, também, sido proposto. [Mathieu. L. et al., Int. J. App. Rad. & Isot., 30, 725727 (1979); Weinenger J., Ketring A. R., et al., J. Nuc. Med. 24 (5), 125,

-8(1983)]. Não obstante, a preparação e a purificação, necessárias para este complexo condicionam o seu emprego a a sua ampla aplicação.

O estrôncio-89 tem, também, sido proposto para doentes com lesões metásticas nos ossos. Não obstante, o período de semi-vida (50,4 dias), os elevados níveis no sangue e uma lesão fraca para proporções ósseas normais, podem ser desvantajosos. [Firusian, N., Mellin, P., Schmidt, C. G., The Jounal of Urology, 116, 764, (1976); Schmidt, C. G., Firusian, N., Int. J. Clin. Pharmacol., 93, 199-205 (1974)].

Um tratamento paliativo das metástases nos ossos relatado, emprega a-amino-(3-iodo-4-hidroxibenzilideno)difosfonato marcado com 1-131 [Eisenhut, H., J. Nuc. Med. 25 (12), 1356-1361 (1984)]. O emprego de iodo radioactivo, como um radionuclídeo terapêutico, é menos que desejável, devido à tendência bem conhecida do iodo a localizar-se na tiróide. Eisenhut apresenta o iodo como um dos metabolitos possíveis deste composto. Em complemento, qualquer 1-131, deixado a partir da reacção da iodação e não separado no procedimento da lavagem, constitui uma ameaça para a tiróide.

Os ácidos aminocarboxílicos são conhecidos por quelarem os iões de metais. Quelatos, particularmente estáveis, formam-se com metais das séries de metais alcalino-terrosos e de transição.

O'Mara et al. (J. Nuc. Med. 10, 49-51, 1969) têm preparado complexos de terras raras de ácidos aminocarboxílicos, em proporções de quelante para metal de 10:1. Eles encontraram boas propriedades esqueletais e propuseram o seu emprego como agentes esqueletais de diagnóstico Em

-9complemento da elevada destruição dos ossos, observaram-se grandes quantidades de radiação, no músculo e/ou no fígado. Dos nuclídeos de terras raras avaliados, o Sm-153 o Er-171 foram indicados como tendo as características mais adequadas, pare utilização em seres humanos. A utilidade destes agentes para a terapia não é, todavia, sugerida.

Rosoff, B. et al., Int. J. App. Rad. and Isot. 14, 129-135 (1963), divulga os complexos de EDTA e de NTA, com determinados radionuclídeos, designadamente Sc-46, Y-91, La-140 e Sm-153. A afinidade da constante de estabilidade destes complexos, com a excreção urinária, é revelada. Proporções molares 5:1 de quelante para metal foram empregadas, e observaram-se concentrações elevadas de radioactividade. no fígado, no baço, nos rins, nos pulmões e nos ossos.

O invento em consideração tem em vista os quelantes novos, que possuem o grupo funcional ligado em posição orto, quelantes esses que formam complexos com metais, especialmente com metais radioactivos que possuem a química do tipo terra-rara. Os metais radioactivos preferidos incluem o samário-153 ( ¹⁵³Se), o hólmio-166 (¹⁶⁶Ho), o ítrio-90 (θθΥ), o promécio-149 (¹⁴⁹Pm), o gadolínio-159 (¹⁵⁹Gd), o lantânio-140 (¹⁴⁰La), o lutécio-177 (¹⁷⁷Lu), o itérbio-175 (¹⁷⁵Yb), o escândio-47 (⁴⁷Sc) e o praseodímio-142 (¹⁴²Pr). Os complexos, deste modo formados, podem ser empregados, elos próprios ou podem ser ligados a um anticorpo, ou a um seu fragmento e empregados para fins terapêuticos e/ou de diagnóstico. Os complexos e/ou os seus conjugados podem ser formulados para emprego in vivo ou in vitro. Os empregos preferidos dos conjugados formulados são o tratamento do cancro em animais, especialmente nos humanos.

Em complemento, determinados complexos de quelante-radionuclídeo podem ser empregados, eficientemente, em composições proveitosas como agentes tarapêuticos e/ou de diagnóstico, para tumores calcíficos e/ou em composições proveitosas como agentes terapêuticos, para o alívio das dores dos ossos.

Mais especificamente, o invento em consideração diz respeito a compostos, que têm a fórmula:

R, R₃

I I

C--C-B

I I

R-2 /_n R4 (I) em que:

Z é uma porção electrofilica ou nucleofílica, que permite a ligação covalente a um anticorpo, ou a um seu fragmento, ou um agente de ligação sintético, que não interfere com a formação da complexação com um radionuclídeo e que pode ser ligado a um anticorpo, ou a um seu fragmento;

X é hidrogénio, alquilo de Q-Çj ou CR₃R₄COOH;

R_v R₂, R₃ e R₄ são, cada um, independentemente, hidrogénio, hidroxi, CO₂H ou um grupo alquilo Cf-C^;

Rg é hidrogénio ou (CR₁R₂)_nCR₃R₄B;

B representa uma amina linear ou ramificada, ou uma polialquilenoamina, em que, pelo menos, um dos hidrogénios da amina foi substituído por um grupo de CR₃R₄COOH;

n é 0 ou 1; ou a um seu sal farmaceuticamente aceitável

E preferível que o grupo carboxilo (quando existente) seja ligado ao primeiro, ou ao segundo, átomo de carbono a partir do azoto do grupo B, isto é, o átomo de carbono α ou β relativamente ao azoto na porção quelante. Os compostos preferidos da fórmula I são aqueles em que n é 0; ouR,, R₂, R₃ ou R₄são, cada um, hidrogénio; ou n é 0 e um de R₃ ou R₄ é hidrogénio e o outro é COOH; ou X é hidrogénio. Quando os quelantes devam ser empregados como agentes de quelação bifuncionais, então Z é de preferência, amino, isotiocianato, semicarbazida, tio-semicarbazida, carboxilo, bromoacetamida ou maleimida.

Em complemento, o invento em consideração diz respeito a compostos, que têm a fórmula:

Z' é hidrogénio, NH₂, NO₂, NHC(O)CH₃ ou N(R')₂, em que R' é hidrogénio ou alquilo

X é hidrogénio, alquilo C^Cg ou CR₃R₄COOH;

R\ é hidrogénio ou COOH;

R'₃, R'₄ e R'_s são, independentemente, hidrogénio ou

CR₃R₄COOH, com a ressalva de que, pelo manos, um de R\, R'₃, R'₄ e R'_s é hidrogénio; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Além disso, o invento em consideração diz respeito a compostos, que têm a fórmula:

em que Z' é hidrogénio, NH₂, NO₂, NHC(O)CH₃, N(R')₂, em que R' é hidrogénio ou alquilo C^Cg;

X é hidrogénio, alquilo de CpCg ou CR₃R₄COOH;

- 13R\ e R'₂ são, cada um, hidrogénio ou COOH, com a ressalva de que pelo menos um é COOH-; R'₃, R'₄, R'_s e R'₆ são, independentemente, hidrogénio ou CR3R4COOH, com a ressalva de que pelo menos, três são CR₃R₄COOH; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

O invento em consideração diz, também, respeito a complexos de iões de metais radioactivos, especialmente a complexos de iões de metais do tipo terra-rara, e a conjugado formados com os complexos mencionados no precedente, e a anticorpos ou a fragmentos de anticorpos, mencionados no precedente. Em complemento, 0 invento em consideração inclui, também, composições, que têm complexos de quelante-radionuclídeos e/ou os conjugados do invento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tipicamente, o veículo farmaceuticamente aceitável, nestas composições, encontra-se na forma líquida. O invento inclui, também, um processo para o diagnóstico, ou para o tratamento, de uma classe de doenças, especialmente do cancro, num ente mamífero, pela administração, ao mamífero, de uma quantidade eficiente da composição.

Tal como o empregado nesta Descrição, os termos indicados, que se seguem , têm estes significados: no que diz respeito definição de Z: porções electrofílicas incluem, mas não se limitam a isotiocianato, bromoacetamida, maleimida, imidoéster, tioftalimida, éster de N-hidroxiossuccinimilo, dissulfureto de piridilo e fenilazida; porções nucleofilicas adequadas incluem, mas não se limitam a carboxilo, amino, acil-hidrazida, semicarbazida e tio-semicarbazida; agentes de ligação sintéticos incluem quaisquer agentes de ligação inorgânicos ou orgânicos, sintéticos, que sejam capazes de estarem ligados, covalentemente, a

- 14um anticorpo ou a um fragmento do anticorpo, de preferência agentes de ligação sintéticos que sejam agentes de ligação sintéticos biodesintegráveis, que sejam estáveis no soro de um doente mas que tenham uma possibilidade para a clivagem enzimática num órgão de separação para o radioisótopo, por exemplo os péptidos biodesintegráveis, ou os grupos que contêm os péptidos, das porções electrofilicas. São preferidos o isotiocianato, a bromoacetamida e a maleimida, e especialmente preferido é o isotiocianato; e das porções nucleofílicas, são preferidos o amino, o carboxilo, a semicarbazida e a tio-semicarbazida, e especialmente preferidos são o amino e o carboxilo. E desejável que a natureza e/ou a posição de Z seja tal que ela não interfira, apreciavelmente, com a reacção da quelação. Z pode, também, ser uma porção não reactiva, tal como H, NO₂, NHC(O)CH₃, NR'₂ (em que R' é H ou alquilo (CÇ-C3), quando 0 emprego final não envolva a ligação do quelato à proteína.

O termo alquilo C-|-C₃ inclui 0 metilo, o etilo, o n-propilo e o isopropilo.

O termo amina linear ou ramificado ou polialquilenoamina designa as porções alquilo, de cadeia linear ou ramificada, que contêm, pelo menos um, e habitualmente mais do que um, átomo de azoto.

Tal como o empregado, nesta Descrição, o termo mamífero designa os animais que alimentam os seus filhos com leite segregado pelas suas glândulas mamárias, de preferência, os mamíferos de sangue quente, e, com mais preferência, os entes humanos.

- 15Anticorpo refere-se a qualquer anticorpo quimérico, monoclonal ou policlonal, ou a um heteroanticorpo, de preferência a um anticorpo monoclonal; fragmento de anticorpo inclui os fragmentos Fab e os fragmentos F(ab')₂, e qualquer parcela de um anticorpo que tenha a especificidade relativamente a um epítopo ou a epítopos, desejados. Quando se emprega o termo conjugado de quelato/anticorpo de metal radioactivo ou conjugado, o anticorpo, designa a inclusão de todos os anticorpos e/ou os fragmentos de anticorpos, incluindo as suas variantes concebidas geneticamente ou semisinteticamente. Os anticorpos preferidos são o CC-49, e os fragmentos de anticorpos preferidos são o Fab e o F(ab')₂. Outros anticorpos possíveis são o CC-83 e ο B72.3. A linha celular de hibridomas B 72.3 encontra-se depositada na American Type Culture Collection (ATCC) e tem o número de acesso ATCC HB 8108. Os outros anticorpos monoclonais murinos ligam-se a epítopos de TAG-72, um antigénio associado a tumores.

Tal como o empregado nesta Descrição, o complexo de metais radioactivos, ou complexo refere-se a um complexo do composto da invenção, por exemplo da fórmula I, complexado com um ião de metal do tipo terra-rara, especialmente um ião de metal do tipo terra-rara radioactivo, em que, pelo menos, um átomo de metal está quelado ou sequestrado; conjugado de quelato-anticorpo de ião de metal radioactivo ou conjugado de ião de metal radioactivo refere-se a um conjugado de ião de metal radioactivo, que se encontra ligado, covalentamente, a úm anticorpo ou a um fragmento do anticorpo; radioactivo quando empregado em conjunção com as palavras ião de metal refere-se a um ou a mais isótopos dos elementos do tipo terra-rara, que emitem partículas e/ou fotões, tais como ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ^Y, ^Pm, ^1S9Gd, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁷Lu, ¹⁷⁵Yb, ⁴⁷Sc e ¹⁴²Pr. Os termos coordenador bifuncional, agente de

- 16quelação bifuncional e quelante fimcionalizado são empregados interpermutavelmente e referem-se a compostos que possuem uma porção de quelante, capaz de quelar um ião de metal, e uma porção ligante/espaçador covalentemente ligada à porção quelante, que seja capaz de servir como um meio de ligar, covalentemente, a um anticorpo, ou a um fragmento de anticorpo.

Tal como o empregado nesta Descrição, sal farmaceuticamente aceitável designa qualquer sal de um composto de fórmula(I), que seja suficientemente não tóxico, para ser proveitoso na terapia, ou no diagnóstico, de mamíferos. Deste modo, os sais são proveitosos de acordo com este invento. Os representantes daqueles sais, formados pelas reacções padrão a partir de fontes, tanto orgânicas, como inorgânicas, incluem por exemplo, os ácidos sulfúrico, clorídrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, láctico, maleico, fumárico, palmítico, eólico, pamóico, múcico, glutâmico, d-canfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, fórmico, láurico, esteárico, salicílico, metanossulfónico, benzenossulfónico, sórbico, pícrico, benzóico, cinâmico e outros ácidos adequados. Também incluídos estão os sais formados pelas reacções padrão a partir de fontes, tanto orgânicas, como inorgânicas, tais como o amónio, os iões de metais alcalinos, os iões de metais alcalino-terrosos, e outros iões semelhantes. Particularmente preferidos, são os sais dos compostos de fórmula (I), em que o sal é de potássio, sódio, amónio, ou suas misturas.

Os agentes de quelação bifuncionais descritos nesta Descrição (representados pela fórmula I) podem ser empregados para quelar ou sequestrar os iões de metais do tipo terra-rara, particularmente os iões de metais do tipo terra-rara radioactivos, de modo a formarem quelatos de iões de metais (também designados nesta Descrição como complexos). Os complexos devido à presen

- 17ça da porção fimcionalizante (representada por Z na fórmula I) podem ser ligados a suportes fimcionalizados, tais como suportes poliméricos funcionalizados ou, de preferência, podem ser ligados, covalentemente, a anticorpos, ou a fragmentos de anticorpos. Deste modo, os complexos, descritos nesta , podem ser ligados, covalentemente, a um anticorpo, ou a um fragmento de um anticorpo, e são designados, nesta Descriçãocomo conjugados.

Os anticorpos, ou fragmentos de anticorpos, que podem ser empregados nos conjugados descritos nesta Descrição, podem ser preparados por processos bem conhecidos da técnica. Anticorpos monoclonais específicos de nível elevado, podem ser produzidos por processos de hibridação, bem conhecidos da técnica; ver, por exemplo, Kohler e Milstein [Natureza 256 páginas 495 a 497 (1975); e Eur. J. Immunol. 6, 511 a 519 (1976)]. Tais anticorpos têm. normalmente, uma reactividade altamente específica. Nos conjugados de iões de metais radioactivos dirigidos para anticorpos, os anticorpos administrados contra qualquer antigénio ou hapténio, podem ser empregados. De preferência, os anticorpos, que são empregados nos conjugados de iões de metais radioactivos, são os anticorpos monoclonais, ou os seus fragmentos, que possuem elevada especificidade, para um epítopo(s) desejado(s). Os anticorpos, empregados no invento em consideração, podem ser administrados contra, por exemplo, tumores, bactérias, fungos, vírus, parasitas, micoplasmas, antigénios de diferenciação e outros antigénios de membranas celulares, antigénios de superfície de micróbios patõgériicos, toxinas, enzimas, alergénios, drogas e quaisquer moléculas biologicamente activas. Alguns exemplos de anticorpos, ou fragmentos de anticorpos, são CC-11, CC-15, CC-30, CC-46, CC-49 F(ab')₂, CC-49, CC-83, CC-83 F(ab')₂, CC-92 a B72.3. [Ver D. Colcher et al., Câncer Res. 48. 4597-4603 (Aug. 15, 1988) para anticorpos CC-49, CC-93 e

- 18 B72.3J. Os anticorpos CC, que se sequem, foram depositados em ATCC, como se segue: CC-11 como HB 9455; CC-15 como HB 9460; CC-30 como HB 9457; CC-46 como HB 9458; CC-49 como HB 9459; CC-83 como HB 9453; a CC-92 como HB 9454; B72.3 foi depositado em ATCC como HB 8108. Uma lista, mais completa, de antigénios pode ser encontrada na Patente No. 4.193.983, dos Estados Unidos da América. Os conjugados de quelatos de iões de metais radioactivos/anticorpos, do invento em consideração, são particularmente preferidos para o diagnóstico e para o tratamento de diversos cancros.

Os complexos do tipo terra-rara (lantanídeo e pseudo-lantanídeo), do invento em consideração, são representados pela fórmula:

C[Ln (BFC)] em que: Ln é um ião de metal terra-rara (lantanídeo), tal como Ce³⁺, Pr³*, Nd³⁺, Pm³*, Sm³*, Eu³*, Gd³⁺, Tb³⁺, Dy³⁺, Ho³⁺, Er³⁺, Tm³⁺, Yb³⁺ e Lu³*, ou ião de metal pseudo-lantanídeo, tal como Sc³⁺, Y³⁺ ou La³*; BFC representa um quelante bifimcional; e C representa um ião farmaceuticamente aceitável, ou um grupo de iões de carga suficiente para tomar todo o complexo neutro. Se o BFC contém quatro ou mais porções carregadas negativamente, então C é um catião, ou um grupo de catiões, tal como H⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb*, Cs⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Sr²*, Ba²*, Ra²*, NH₄*. N(CH₃)₄*, N(C₂H₅)₄*, N(C₃H₇)„*, N(C₄H₉)₄*. As(C₆H₅)₄*, [(C₆H₅)₃P=]₂N* e outras aminas protonadas. Se o BFC contém três porções carregadas negativamente, então C não se toma necessário. Se o BFC contém duas metades carregadas negativamente, então C é um anião, tal como F‘, Cl*, Br, r, cio₄-, bf₄-, h₂po₄-, HCO₃, hco₂-, ch₃so₃-, h₃c-c₆h₄-so₃-, pf₆-, ch₃co₂e B(C₆H₅)₄*.

- 19Este invento é empregado com um suporte, excipiente ou veículo, físiologicamente aceitável, para esse fim. Os processos para a preparação de tais composições são bem conhecidos. As composições podem apresentar-se na modalidade de uma suspensão, de uma solução injectável, ou de outras composições adequadas. Podem ser empregados meios de suspensão físiologicamente aceitáveis, com ou sem adjuvantes.

Uma quantidade eficaz da composição é empregada para a

terapia. A dose varia, dependendo da doença a ser tratada. Não obstante os diagnósticos in vitro possam ser levadas a efeito com as composições deste invento, os diagnósticos in vivo podem ser, também contemplados, empregandose as composições deste invento. Os conjugados e as composições deste invento podem, também ser empregados, em cirurgia radioimuno-guiada (RIGS); não obstante, outros metais, que podem ser empregados, com esta finalidade, incluem, também ^99mTc, ¹¹¹In, ¹¹³ⁿIn, ⁶⁷Ga e ^Ga.

Quando os complexos quelante-radionuclídeos, deste invento, devam ser empregados, para o tratamento do cancro dos ossos, determinados critérios devem ser respeitados.

Apesar de as propriedades dos radionuclídeos serem importantes, as propriedades totais da composição, contendo o complexo de radionuclídeo-quelante, são o factor determinante. As desvantagens de qualquer uma propriedade podem ser ultrapassadas pela superioridade de uma ou mais, das propriedades, quer do ligando, quer do radionuclídeo, e da sua combinação, como empregados na composição, devem ser consideradas no seu todo.

que se segue é um estudo daqueles critérios, que devem ser considerados, na escolha de qualquer combinação especifica (isto é, complexo) de radionuclídeo e de ligando empregado na composição do invento. Os complexos de radionuclídeo-quelante, quando utilizados na ausência de um excesso adequado dos ligandos empregados no invento, podem não ser terapeuticamente úteis ou eficazes.

Tornam-se, por isso, necessárias composições, que possuam os critérios, que se seguem, pelos quais seja possível administrar doses de radiação terapêutica para tumores calcíficos, com doses mínimas para o tecido liso.

O radionuclídeo deve ser administrado, de preferência, ao osso, em vez do tecido liso. Mais particularmente, a absorção no fígado, ou no sangue é indesejável.

O radionuclídeo deve ser eliminado rapidamente, do tecido não ósseo, para se evitar um prejuízo desnecessário, para tais tecidos: por exemplo, ele deve ser eliminado, rapidamente, do sangue.

A utilização proposta, para algumas das composições deste invento, é o tratamento terapêutico dos tumores calcíficos em animais. Tal como empregado nesta Descrição, o termo tumores calcíficos inclui os tumores principais, em que o sistema esquelético é o principal local da complicação, e o cancro metástico nos ossos em que o neoplasma se espalha a partir de outros locais principais, tais como a próstata e o seio, no sistema esquelético. Este invento proporciona um meio de se aliviar a dor e/ou reduzir a dimensão e/ou inibir o desenvolvimento e/ou a expansão, ou causar a regressão e/ou a destruição dos tumores calcífícos, pela administração de uma dose de radiação terapêutica.

A composição pode ser administrada como uma dose única, ou como doses múltiplas, durante um período mais prolongado de tempo. A administração do radionuclídeo ao tumor, deve ser em quantidades suficientes para proporcionar os benefícios referidos no precedente.

Outros empregos de alguns dos quelantes do invento em consideração podem incluir a remoção de metais indesejáveis (isto é, ferro) do corpo, a formação de imagens em ressonância magnética, a ligação a suportes poliméricos para diversos fins, por exemplo, como agentes diagnóstico e a remoção de ião de metal lantanídeo, ou do ião de metal de pseudo-lantanídeo, por extracção selectiva. Em complemento, os complexos de metal-ligando, empregados para se administrarem os radionuclídeos aos locais calcífícos, podem ter utilidade na ablação da medula óssea (isto é, para os transplantes da medula óssea).

Os radionuclídeos podem ser produzidos de diversos modos. Num reactor nuclear, um nuclídeo é bombardeado com neutrões, para se obter um radionuclídeo, por exemplo

Sm-152 + neutrão —> Sm-153 + gama

Um outro processo, de se obterem os radionuclídeos, é bombardear os nuclídeos, com partículas produzidas por um acelerador linear, ou por um

-22ciclotrão. Ainda um outro processo é isolar radionuclídeo a partir de uma mistura de produtos de cisão. O processo de se obter os nuclídeos empregados no invento em consideração não é por isso pormenor fundamental.

Os agentes de quelação divulgados nesta Descrição, podem ser preparados de modos bem conhecidos da técnica. Assim, por exemplo, ver Chelating Agents and Metal Quelates, Dwyar & Mellor, Academic Press (1964), Capítulo 7. Ver também, os processos para produzir aminoácidos em Synthetic Production and Utilization of Amino Acids, (editada por Kameko, et al.), John Wiley & Sons (1974).

Quando se escolhe Z (na fórmula) para ser uma porção electrofílica, ele pode ser preparado por métodos conhecidos pela técnica. Tais processos podem ser encontrados emAcc. Chim. Res. 17, 202-209 (1984).

Exemplos de alguns dos métodos que podem ser empregados, para se prepararem os quelantes das fórmulas I, II e III, são:

A) a reacção de um composto da fórmula em que:

Z é uma porção electrofílica ou nucleofílica que permite a ligação covalente a um anticorpo, ou a um seu fragmento, ou a um agente de ligação sintético, que não interfere com a formação de complexação com um radionuclídeo e que pode ser ligado a um anticorpo, ou a um seu fragmento;

X é hidrogénio;

Rs é hidrogénio ou (CR₁R₂)_nCR₃R₄T, em que R_1?R₂, R₃ e R₄ são, cada um, independentemente hidrogénio, hidroxi, CO₂H ou um grupo de alquilo Q-Cg, n é 0 ou 1; e T representa uma amina ou polialquileno-amina, linear ou ramificada, em que, pelo menos, um dos hidrogénios da amina é substituído por um grupo CR₃R₄CO2H; ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável;

com um composto B e um equivalente de um aldeído, ou de um precursor de aldeído, em que B representa uma amina ou polialquileno-amina, linear ou ramificada, em que existe pelo menos, um hidrogénio de amina; na presença de um produto cáustico e de um solvente adequado, a uma temperatura de 20°C ou inferior, seguida por aquecimento e por separação do produto desejado de formula I. II ou III;

B) a reacção do produto obtido no Passo (A), com um ácido halo-(CR₁R₂)_nCR₃R₄, a um pH de 9, ou superior, na presença de um hidróxido cáustico, a uma temperatura de 20°C ou inferior, para dar origem aos compostos de fórmula I, II ou III, em que pelo menos um de R_v R₂, R₃ e R₄ é CO₂H;

C) a hidrólise do produto do Passo (B), em que Z é NHC(O)CH₃ com NaOH em H₂O, para se obterem os produtos de fórmula I, II ou III, em que Z é NH₂;

D) a reacção do produto obtido no Passo (A), com glicolonitrilo, num hidróxido cáustico, a um pH de 9, ou superior, a uma temperatura de 20°C, ou inferior, seguida por hidrólise do grupo do ciano com HC1 em H₂O, para dar origem nos produtos de fórmula I, II ou III, em que, pelo menos, um de R_1s R₂, R₃ e R₄ é CO₂H;

E) a hidrólise do produto do Passo (A), em que Z é NHC(O)CH₃ com DC1 em D₂O, com aquecimento, para dar origem aos produtos de fórmula I, II ou III. em que Z a NH₂; e

F) a reacção do produto obtido de qualquer um dos Passos (A) a (E), em que Z é NH₂, com tiofosgénio, para dar origem aos produtos de fórmula I, II ou III, em que Z é o isotiocianato.

As condições das reacções e os reagentes, para os diversos passos precedentes são as que se seguem: Quando a temperatura é 20°C ou inferior, ela é, habitualmente, conseguida pelo emprego de um banho de gelo/água. O aquecimento é feito quer à temperatura do refluxo, quer a temperatura superior à do ambiente. O hidróxido cáustico preferido é o hidróxido de sódio, mas qualquer base adequada, capaz de manter o pH desejado, sem o efeito contrário no produto formado da reacção, é aceitável, Um solvente adequado é inerte e proporciona a solubilidade aos reagentes; exemplos de tais solventes são a água e os álcoois, tais como o metanol. O produto desejado pode ser separado por quaisquer processos convencionais, por exemplo, a precipitação a partir de um solvente, tal como a acetona.

Os complexos de fórmula I, II ou III são preparados por métodos convencionais, por exemplo pela reacção do quelante com um metal, sob condições tais que o metal seja sequestrado pelo quelante. Frequentemente, o quelante está em excesso, em relação ao metal.

Os conjugados de fórmula I, II ou III são preparados por métodos convencionais, por exemplo, pela ligação covalente do complexo a um anticorpo ou a fragmento de anticorpo.

O invento será clarificado, mais adiante, por uma consideração dos exemplos que se seguem, que pretendem ser apenas puramente exemplificativos da utilização do invento. As estruturas dos compostos, com referência à fórmula I genérica, estão representadas na Tabela I.

Preparação dos Materiais de Partida

EXEMPLO A. Preparação do Ácido Etilenodiaminodiacético não Simétrico

Água desionizada (60,6 g), N-acetiletilenodiamina a 98% (20,4 g, 0,2 mol), e ácido bromoacético (55,7 g, 0,40 mol) foram introduzidos num recipiente para reacção, a foram arrefecidos num banho de gelo-água. O pH da mistura foi ajustado, enquanto se agitava, para cerca de 8,1, com uma solução de hidróxido do sódio a 25%. A temperatura da mistura foi mantida a menos de 20°C, durante a adição do hidróxido cáustico. O banho do gelo-água foi

-26removido e o pH foi mantido entro 7 e 8, pela adição de solução de hidróxido de sódio a 25%. A temperatura foi controlada a menos do que 37°C, por arrefecimento, periódico, com um banho de gelo-água. A mistura de reacção foi agitada o mantida, como no precedente durante cerca de 31 horas, e, em seguida, foi transferido para um balão de reacção de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com uma haste de agitação magnética, com um termómetro, com um funil de adição e com uma cobertura para aquecimento. Adicionou-se solução do hidróxido de sódio (40,1 g de solução a 50%), a a mistura foi aquecida, com agitação, ao refluxo durante cerca de 15 horas, e, em seguida, foi arrefecida e filtrada, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. O filtrado foi transferido, quantitativamente, (empregando-se água desionizada) para uma proveta, e foi arrefecido num banho de gelo, a menos do que 25°C. Adicionou-se água desionizada (100 ml), com agitação, e o pH foi ajuntado para cerca de 4, com ácido clorídrico concentrado enquanto se mantinha a temperatura a menos do que 25°C. A mistura foi filtrada, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Introduziram-se cerca de 1 200 ml de etanol num frasco de boca larga e foram agitados com uma haste de agitação magnética, o filtrado do precedente foi adicionado a etanol com meticulosa agitação. Formou-se uma substância oleosa que. gradualmente, se transformou num sólido branco. A agitação continuou durante duas horas, momento em que os sólidos foram reunidos por filtração, empregando-se um funil de frita de vidro médio o vácuo. Os sólidos foram deixados a secar, por exposição ao ar livre, durante cerca de 1,5 horas, e, em seguida, fóram colocados num forno de vácuo e foram secos a 55 a 60°C, durante várias horas. Cerca de 42,9 g de sólidos brancos, contendo sal inorgânico, foram recolhidos e foram identificados como ácido etilenodiaminodiacético não simétrico, por RMN de protões e de carbono.

-τι EXEMPLO Β. Preparação do Ácido 2-oxo-l-piperazinoacético; Lactama do Acido Etilenodiaminodiacético

Água desionizada (150 g), 25,0 g (0,14 mol) de ácido etilenodiaminodiacético simétrico, e 28 g de ácido clorídrico concentrado introduziram-se num balão de reacção de fundo redondo, equipado com um termómetro, com um controlador da temperatura, com um condensador de refluxo arrefecido a água, e com uma abertura para aquecimento. A mistura foi agitada com uma haste de agitação magnética, e foi aquecida ao refluxo, durante quatro horas, e foi arrefecida. O conteúdo foi filtrado, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. O pH do filtrado foi ajustado para cerca de 1,5, com uma solução de hidróxido de sódio a 50%, e filtrado com um funil de frita de vidro médio, empregando-se vácuo. O pH do filtrado foi ajustado para cerca de 5, com uma solução de hidróxido de sódio a 50%, e os produtos voláteis foram removidos (no vácuo), a uma temperatura de 60 a 70°C. Os sólidos foram secos num forno de vácuo, a 55-60°C, durante algumas horas. A lactama do ácido etilenodiaminodiacético simétrico foi confirmada por RMN de protões e de carbono.

EXEMPLO C. Preparação do Acido 2-Oxo-l,4-piperazinodiacético; Lactama do Acido Etilenodiaminotriacético

Cerca de 40,8 g do ácido 2-oxo-l-piperazinoacético, preparado pelo processo do Exemplo B e 70 g de água desionizada foram introduzidos num frasco do boca larga, e foram agitados, durante algumas horas, com uma haste de agitação magnética. O conteúdo foi filtrado, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. O filtrado e 20,0 g de ácido bromoacético foram introduzidos num frasco de boca larga e foram agitados até que todo o ácido bromoacético se tivesse dissolvido. O pH foi ajustado para cerca de 7, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A temperatura foi mantida a menos do que 25°C durante a adição do hidróxido cáustico, por arrefecimento num banho de gelo-água. O banho de gelo-água foi removido e deixou-se a mistura a agitar, durante cerca de 4 a 5 horas, a cerca de 35°C, enquanto se mantinha o pH a cerca de 7, pela adição periódica da solução de hidróxido do sódio a 25%. A mistura da reacção foi deixada a repousar, durante algumas horas e, em seguida, foi concentrada (in vacuó) até um peso de cerca de 90-100 g, e foi filtrada, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Os produtos voláteis foram removidos (in vacuó) do filtrado a uma temperatura de 55 a 60°C, e o material foi seco num forno de vácuo, a 55 a 60°C, durante algumas horas. A lactama do ácido etilenodiaminotriacético foi confirmada por RMN de protões e de carbono.

EXEMPLO D. Preparação do Ácido Etilenodiaminotriacético Trissódico

Cerca de 44,5 g de ácido 2-oxo-l,4-piperazinodiacético bruto, preparado pelo processo do Exemplo C, e 280 g de água desionizada foram introduzidos num frasco de boca larga, e foram agitados até que a lactama se tivesse dissolvido. A solução do hidróxido cáustico (110 g, 50%) foi adicionada, com agitação. A temperatura foi mantida a menos do que 25°C, por arrefecimento num banho de golo. A hidrólise foi, em seguida, efectuada. pela imersão de tubos contendo a solução, num banho de água controlado a 87°C. Depois de 15 minutos, as soluções foram removidas e arrefecidas num banho de

-29gelo-água. A análise, por RMN de protões e de carbono, confirmou a presença do ácido etilenodiaminotriacético trissódico, no meio alcalino da hidrólise.

EXEMPLO E. Preparação do Ácido 4-Dietilenotriaminoacético

Num balão, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com um agitador magnético e com um termómetro, introduziram-se 75,0 g de anidrido ftálico, 350,5 g de ácido acético e 26,0 g de dietilenotriamina. A mistura foi agitada a foi aquecida a cerca de 116°C, durante 1,5 horas, e. em seguida, foi arrefecida. Os produtos voláteis foram removidos, sob vácuo, a 65 a 70°C, até se ter obtido um peso de 218 g. A mistura foi derramada em 600 g de etanol, com agitação. Depois de duas horas, os sólidos foram filtrados, empregando-se um funil de frita de vidro médio. Os sólidos foram lavados, por duas vezes, com 500 ml de etanol, e, em seguida, foram secos num forno de vácuo, a 60-65°C. Cerca de 66 g de material do composto diftaloílo foram recolhidos.

O éster de etilo do composto diftaloílo foi preparado introduzindo 65,6 g do composto de diftaloílo, preparado no precedente, 17,7 g de carbonato de sódio e 800 ml de etanol, num balão equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com um funil de adição, com um agitador mecânico e com um termómetro equipado com um controlador de temperatura. Adicionou-se o bromoacetato de etilo (51,0 g) durante um período de 15 minutos, à mistura em agitação, e, em seguida foi aquecida ao refluxo, durante 16 horas. O etanol (200 ml) foi removido por destilação, empregando-se um dispositivo de destilação Dean-Stark, e a mistura da reacção restante foi arrefecida até menos do que 5°C, por adição de gelo triturado. A mistura foi arrefecida, durante mais 5 horas, num

-30banho de gelo, e foi filtrada, empregando-se um funil de frita de vidro médio. Os sólidos foram lavados, por duas vezes, com etanol, a foram secos num forno de vácuo a 65-70°C. Cerca de 81 g de l,7-diftaloil-4-dietilenotriaminoacetato de etilo foram obtidos. Em 30,32 g do água e 76,4 g de ácido clorídrico concentrado, foram dissolvidos 20,1 g (0,045 mol) de l,7-diftaloil-4dietilenotriaminoacetato de etilo, com aquecimento até 93°C, e a mistura foi mantida a 93°C, durante 6,5 horas. O precipitado branco, resultante, foi filtrado e foi lavado com água. O filtrado reunido foi concentrado, a 60°C, sob vácuo, dando origem a um sólido branco. A análise de RMN indicou que os grupos ftaloílo não tinham sido completamente hidrolisados. Os dois sólidos foram, em seguida, reunidos e adicionados a ácido clorídrico concentrado, com uma quantidade pequena de água. A mistura foi, em seguida, aquecida ao refluxo, durante 6 horas, foi arrefecida até a temperatura ambiente, e foi filtrada, dando origem a 12,3 g de ácido ftálico. O filtrado foi, em seguida, evaporado, sob o vácuo, dando origem a 13,9 g do produto, como um sólido amarelo. O produto foi dissolvido em água, pela adição de 6 g de hidróxido de sódio a 50%; e foi tratado com carvão vegetal activado, a 100°C, seguido pela filtração e pela evaporação, sob o vácuo, dando origem a 15,2 g de ácido 4-dietilenotriaminoacético.

Preparação dos Produtos Finais

EXEMPLO 1: Preparação do Acido 2-[(2-{[bis(carbòximetil)]-amino}etil)amino]-2-(5-acetamido-2-hidroxifenil)-etanóico

Água desionizada (10,3 g) 4-acetamidafenol a 98% (15,1 g, 0,1 mol), ácido glioxílico aquoso a 50% (14,8 g, 0,1 mol) e metanol (50,5 g), foram introduzidos num frasco de boca larga e foram misturados, empregando-se uma haste de agitação magnética. O ácido etilenodiaminodiacético não simétrico (19,5 g) preparado pelo processo do Exemplo A, foi adicionado, e a mistura foi arrefecida, num banho de gelo-água. O pH da mistura foi ajustado, durante a agitação, para cerca de 8,0, com uma solução de hidróxido de sódio a 50%. A temperatura da mistura foi mantida a menos do que 20°C, durante a adição do hidróxido cáustico. O banho de gelo-água foi removido, e a mistura foi ajustada para pH 8,7, e foi agitada a 25 a 32°C. durante cerca de 2 horas. A mistura foi transferido para um balão de reacção de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com uma haste de agitação magnética, com um termómetro e com uma cobertura para aquecimento. A mistura foi aquecida, com agitação, a 70°C, durante 8 horas, e, em seguida, foi arrefecida e filtrada, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Os sólidos foram deixados a secar, pela exposição ao ar, durante 7 horas, e, em seguida, foram colocados num forno de vácuo e foram secos a 55 a 60°C, durante algumas horas. Cerca de 29,6 g de sólidos foram recolhidos. O material foi, em seguida, agitado com cerca de 300 g de acetona, e foi filtrado, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo doméstico. Os sólidos foram lavados, mais uma vez, com um suplemento de 300 g de acetona, foram secos ao ar, e, em seguida, foram colocados num forno de vácuo, durante uma hora, a 55 a 60°C. Cerca de 26,7 g de sal de sódio do ácido 2-[(2-{[bis(carboximetil)]amino}etil)amino]-2-(5acetamido-2-hidroxifenil)etanóico foram recolhidos. Estes sólidos e 180 g de água desionizãda foram introduzidos nua frasco de boca larga e foram agitados com uma haste de agitação magnética. O pH foi ajustado para 2,2, com o ácido clorídrico concentrado, momento em que a forma ácido do produto começou a precipitar da solução. O produto foi recolhido por filtração, e foi lavado com cerca de 150 g de água desionizada. O produto, ácido 2-[(2-{[bis(carboximetil)J-32amino}etil)amino]-2-(5-acetamido-2-hidroxifonil)etanóico foi seco num forno de vácuo, a 55 a 60°C, durante algumas horas. Cerca de 14,2 g do produto foram obtidos. A RMN de protões verificou a estrutura do produto (Ver Tabela I).

EXEMPLO 2: Preparação do Acido 2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)(carboximetil)amino]-2-[5-acetamido-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico

Agua desionizada (4,5 g), ácido bromoacético (2,0 g) e ácido 2-[(2-{[bis(carboximetil)]amino}etil)amino]-2-(5-acetamido-2-hidroxifenil)etanóico (2,5 g) preparado pelo processo do Exemplo 1, foram introduzidos num recipiente de reacção pequeno, e foram arrefecidos num banho de gelo-água. O pH da mistura foi ajustado, durante a agitação, para cerca de 9,3, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A temperatura da mistura foi mantida a menos do que 20°C, durante a adição do hidróxido cáustico. O banho de gelo-água foi removido e a mistura foi deixada a agitar durante 46 horas, a uma temperatura de 35-40°C, ao mesmo tempo que se mantinha o pH entre 10,5 e

11,5 pela adição periódica de uma solução do hidróxido de sódio a 25%. Uma parcela da mistura da reacção (10,2 g) foi introduzida num franco do boca larga e foi agitada com uma haste de agitação magnética. Adicionou-se a acetona (125 g) à solução, durante um período de 15 minutos, resultando a precipitação do um óleo. A parcela da acetona foi removida por decantação, e adicionou-se um suplemento de 50 g de acetona, ao precipitado, misturou-se, e o extracto de acetona foi removido. O óleo foi seco ao ar livre e, em seguida, foi seco num forno de vácuo, a 60-65°C, durante cerca de duas horas, dando origem a um sólido amarelo encrespado. O produto foi purificado por cromatografia do permuta de aniões, em Q-Sepharose™, da Pharmacia Inc. numa coluna de 15 mm x 500 mm, eluindo com um gradiente de ácido fórmico a 0 a 30%, durante mais de duas horas, a um caudal de 3 ml/min. e recolhendo as fracções. As fracções foram controladas por UV e as fracções adequadas foram reunidas e liofilizadas, dando origem ao produto desejado (Ver Tabela I).

EXEMPLO 3. Preparação do Acido 2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)(carboximetil)amino]-2-[5-amino-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico, sal pentassódico

Cerca de 40 mg do ácido 2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)(carboximetil)amino]-2-[5-acetamido-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico, preparado pelo processo do Exemplo 2, foram dissolvidos em 700 μΐ de D2O, e ajustados para pH 13, com NaOD/D₂O. A hidrólise do grupo N-acetilo, até à funcionalidade anilina correspondente, efectuou-se à temperatura ambiente e foi seguida por RMN de protões, que confirmou a estrutura. (Ver Tabela I),

EXEMPLO 4. Preparação do Acido 2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)(cianometil)amino]-2-(5-acetamido-2-hidroxifenil)etanóico

Agua desionizada (3,1 g) e 2,5 g de ácido 2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino} etil)amino]-2-(5-acetamido-2-hidroxifenil)etanóico, preparado pelo processo do Exemplo 1, foram introduzidos num recipiente pequeno de vidro e foram arrefecidos num banho de gelo-água. O pH foi ajustado para 9,8-9,9 com uma solução de hidróxido do sódio a 25%. A temperatura da mistura foi mantida a menos do que 20°C, durante a adição do hidróxido cáustico. O banho de gelo foi removido, 1,0 g de uma solução de glicolonitrilo aquosa a 40% depois foi adicionado, com misturação, e o pH foi ajustado para 9,9-10,0, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A mistura foi transferido para um balão pequeno de reacção, equipado com um termómetro contendo um controlador da tempe

-34ratura, com um condensador de refluxo arrefecido a água, e com uma cobertura para aquecimento A mistura da reacção foi agitada com uma haste de agitação magnética, foi aquecida a 49-50°C, durante oito horas, foi arrefecida o foi deixada a repousar à temperatura ambiente, durante 72 horas. Uma parcela da mistura da reacção (0,5 g) foi introduzida num frasco de boca larga a foi agitada com uma haste de agitação magnética. Adicionaram-se 146 g de acetona à solução, durante um período de 10 minutos, resultando na precipitação de uma substância sólida. A parcela de acetona foi removida, por decantação, e um suplemento de 50 g de acetona foi adicionado ao precipitado, foi misturado, e a camada de acetona foi removida. O material foi seco num forno de vácuo, a 60 a 65°C, durante cerca de quatro horas. Recolheram-se cerca de 2,9 g do produto. A RMN de protões confirmou o derivado aminoacetonitrilo desejado. (Ver Tabela I).

EXEMPLO 5. Preparação do Acido 2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)(carboximetil)amino]-2-(5-amino-2-hdroxifenil)etanóico

Cerca de 1,0 g do ácido 2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)(cianometil)amino]-2-(5-acetamido-2-hidroxifenil)etanóico, preparado no precedente, pelo processo do Exemplo 4, foi hidrolisado, sob condições acídicas, para transformar a funcionalidade aminoacetonitrilo no grupo acetato correspondente, e o grupo N-acetilo no grupo anilina. O composto aminoacetonitrilo, 2,2 g de D₂O e 7,8 g de DC1 a 20% foram introduzidos num tubo de vidro) Ό tubo foi colocado num banho de água de temperatura controlada a 88-89°C, durante um total de 33 minutos, e, em seguida foi removido, e foi arrefecido. A hidrólise foi seguida por RMN de protões. A solução foi, em seguida, seca por congelação e foi liofilizada, dando origem a 1,3 g de sólidos. O produto foi purificado por permuta de aniões (Q-Sepharose™), numa coluna de 15 mm x 500 mm, eluindo com um gradiente do ácido acético 0-1M, durante mais de uma hora, a um caudal de 3 ml/min, e recolhendo fracções de 6 ml. As fracções foram seguidas por absorção UV e as fracções apropriadas foram reunidas e foram liofilizadas dando origem ao produto desejado. (Ver Tabela I).

EXEMPLO 6. Preparação do Acido 2-[bis(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)amino]-2-[5-acetamido-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico e do Ácido 2-[{2-[(2- {[bis(carboximetil)]-amino }etil)(carboximetil)amino]etil} (carboximetil)amino]2-[5-acetamido-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico

Água desionizada (24,8 g), 15,1 g (0,1 mol) de 4-acetamidofenol a 98%, e 14,8 g de ácido glioxílico aquoso a 50% (0,1 mol) foram introduzidos num frasco de boca larga e foram arrefecidos num banho do gelo-água. O pH da mistura foi ajustado para 3,3 com uma solução de hidróxido de sódio a 25%, enquanto se mantinha a temperaturas menor do que 20°C. Adicionou-se então DETA (9,8 g) Mais uma vez, a temperatura se manteve abaixo dos 20°C, por arrefecimento num banho de gelo-água. O pH, após a adição de DETA, foi cerca de 10,2. A mistura foi transferido, para um balão de reacção, equipado com um termómetro, um controlador de temperatura, um condensador de refluxo arrefecido a água, e uma cobertura para o aquecimento. A mistura da reacção foi agitada, com uma haste de agitação magnética, foi aquecida a 75°C, durante cerca de sete horas, e foi arrefecida. A acetona (1.400 g) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada com uma haste de agitação magnética. Cerca de 40 g da solução de reacção, preparada no precedente, foram adicionados durante um período de 10 minutos, resultando a precipitação de um material sólido. A parcela da acetona foi retirada, por decantação, um suplemento de 1.460 g de

-36acetona foi adicionado e o sólido foi triturado e misturado meticulosamente, sob acetona. Os produtos sólidos foram recuperados por filtração, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Os produtos sólidos foram lavados com uma quantidade copiosa de acetona e, em seguida, foram secos num forno de vácuo, a uma temperatura de 60 a 65°C, durante várias horas. Cerca de 7,8 g de produtos sólidos foram recuperados, revelando a RMN de protões uma mistura dos isómeros desejados do composto de DETA.

Água desionizada (5,3 g) e 4 g dos produtos sólidos isolados do precedente foram introduzidos num frasco de boca larga e foram agitados, com uma haste de agitação magnética, durante cerca de três horas, momento em que os produtos sólidos se tinham dissolvido completamente. Adicionou-se, com agitação, o ácido bromoacético (10,1 g) e a mistura foi arrefecida num banho de gelo-água. O pH da mistura foi ajustado para cerca de 11, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A temperatura foi mantida a menos do que 20°C, durante a adição do produto cáustico. O banho de gelo-água foi removido e a mistura foi deixada a agitar, durante 50 horas, a uma temperatura de 35-40°C, enquanto o pH se mantinha aproximadamente a 10,5-11,5 pela adição periódica de uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A acetona (240 g) foi introduzida, num frasco de boca larga, e agitada com uma haste de agitação magnética. Cerca de 5 g da solução da reacção foram adicionados à acetona, resultando daí a precipitação de um sólido. A parcela da acetona foi decantada, e um suplemento de 245 g de acetona foi adicionado e foi misturado e a camada de acetona foi removida. Os produtos sólidos foram recolhidos, por filtração, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Os produtos sólidos foram lavados com acetona e, em seguida, foram secos num forno de vácuo, a 55-60°C, durante várias horas. Recolheram-se cerca de 2,6 g de produtos sólidos. (Ver Tabela I).

EXEMPLQ 7. Preparação do Ácido 2-[bis(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)amino]-2-[5-amino-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico e do Acido 2-[{2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)(carboximetil)amino]etil}(carboximetil)amino]-2-[5-amino-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico

Cerca de 376 mg de ácido 2-[bis(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)amino]-2-[5-acetamido-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico e de ácido 2-[{2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)(carboximetil)amino]etil}(carboximetil)amino]-2-[5-acetamido-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico, preparado pelo processo do Exemplo 6, foram dissolvidos em 1,0 g de D₂O, e foram tratados com 5 gotas de DC1 a 37%. A solução acídica foi, em seguida aquecida a 80°C, durante 2 horas, após o que o espectro de RMN de protões indicou que virtualmente todos os grupos de acetanilida tinham sido transformados em grupos anilina e ácido acético. A solução foi. em seguida, congelada num banho de neve carbónica-acetona, e foi liofilizada de um dia para o outro, dando origem ao produto desejado, como um sólido castanho pálido.

(Ver Tabela I).

EXEMPLO 8: Preparação do Ácido 2-[{2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)(carboximetil)amino]etil}(carboximetil)amino]-2-[5-amino-2-(carboximetiloxi)fenil] etanóico

Em 40 ml de água foram dissolvidos 8,0 g de ácido 4-dietilenotriaminoacético, preparado pelo processo do Exemplo E, e, em seguida, a mistura foi arrefecida num banho do gelo. A esta solução arrefecida adicionaram-se 6,08 g (0,04 mol) de 4-acetamidofenol e uma solução arrefecida de 5,95 g (0,04

mol) de uma solução a 50%, em peso, de ácido glioxílico em água. Enquanto se mantinha a mistura a menos do que 20°C, com o banho de gelo, adicionou-se uma quantidade de 2,5 ml de hidróxido de sódio a 50% em peso. A mistura resultante, a pH 8,75, foi aquecida, lentamente a 80°C, foi mantida a esta temperatura durante 4,5 horas, com agitação, e, em seguida, foi deixada a arrefecer de um dia para o outro. A solução foi, em seguida, evaporada sob vácuo, até um volume de cerca de 25 ml, e foi adicionada a 300 ml de acetona. A acetona foi decantada do sólido resultante. O sólido foi lavado por diversas vezes, com acetona, e foi seco, dando origem a 26,1 g de produto, como um sólido escuro pegajoso. Uma quantidade de 26,05 g deste sólido foi dissolvida em 50 ml de água. Nesta solução foram dissolvidos 26,7 g (0,192 mol) de ácido bromoacético. A solução resultante foi arrefecida num banho de gelo, o pH foi ajustado para 10,5 com hidróxido de sódio a 50%, em peso, e a solução foi deixada a aquecer até á temperatura ambiente, e, em seguida, foi aquecida até 46°C. A temperatura foi mantida a 46°C, e o pH foi mantido a 10,5, pela adição de hidróxido de sódio a 50%, em peso, durante cerca de 23 horas. O volume foi, em seguida, reduzido a 50 ml, sob vácuo. A solução concentrada foi adicionada a 500 ml de acetona, com agitação vigorosa, e o precipitado resultante foi deixado a repousar. A acetona foi decantada e um suplemento de 400 ml de acetona foi adicionado, foi agitado vigorosamente e foi, em seguida, decantado. Foi feita uma lavagem final, de modo semelhante, empregando-se 100 ml de acetona. O sólido foi seco, sob vácuo, dando origem a 52,55 g de um sólido castanho encrespado. Uma amostra de 2,00 g deste sólido castanho foi dissolvida em 20 ml de água e foi tratada com 1,48 g de ácido clorídrico concentrado. Esta solução foi aquecida até 80°C, até que a análise, por RMN de protões, indicasse a hidrólise completa da porção N-acetilo. A solução foi, em seguida, seca por

-39congelação dando origem a 2,13 g de um sólido castanho, contendo o produto em epígrafe. (Ver Tabela I).

EXEMPLO 9. Preparação do Ácido 2-[(2-[(2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)(carboximetil)amino]etil)(carboximetil)amino]etil)(carboximetil)amino]-2-[5-acetamido-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico e do Ácido 2-[{2-[(2-{[bis(carboximetil)]-amino}etil)(carboximetil)amino]etil}(2-{[bis(carboximetil)]ainino)etil)amino]-2-[5-acetamido-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico

Agua desionizada (12,5 g), 4-acetamidofenol a 98% (7,6 g) e uma solução de ácido glioxílico aquosa a 50% (7,4 g) foram introduzidos num frasco de boca larga e foram arrefecidos num banho de gelo-água. O pH da mistura foi ajustado para 3,6, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%, enquanto a temperatura se mantinha a menos do que 20°C. A trietilenotetramina linear (7,2 g) foi adicionada, enquanto a temperatura ao mantinha abaixo de 20°C. O pH, depois da adição da trietilenotetramina, foi de cerca de 10,6. A mistura foi transferida para um balão de reacção, equipado com um termómetro, contendo um controlador de temperatura, um condensador de refluxo arrefecido a água, e uma cobertura para o aquecimento. A mistura da reacção foi agitada com uma haste de agitação magnética e foi aquecida a 80-83°C, durante 4,5 horas e foi arrefecida. A acetona (175 g) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada, com uma haste de agitação magnética. Cerca de 12 g da solução da reacção foram adicionados, resultando na precipitação de um óleo. A porção da acetona foi removida por decantação, um suplemento de 175 g de acetona foi adicionado e a agitação continuou. A parcela da acetona foi removida, a o precipitado foi seco num forno de vácuo, a 60-65°C, durante várias horas. Cerca de 3,1 g de sólido foram recolhidos.

-40Os produtos sólidos foram, em seguida, misturados com 100 g de acetona, misturados meticulosamente e filtrados, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Os produtos sólidos foram, em seguida, lavados com um suplemento de 250 ml de acetona, e foram secos, mais uma vez, num forno do vácuo, a 60-65°C durante cerca de quatro horas. Cerca de 2,0 gramas de material foram recuperado, indicando a RMN de protões a presença de uma mistura de isómeros trietilenotetramina.

Agua desionizada (2,0 g) e 1,86 g do produto sólido precedente foram introduzidos num frasco de boca larga e foram agitados durante uma hora, momento em que os sólidos estavam dissolvidos na sua maior parte. Adicionou-se o ácido bromoacético (5,0 g), com agitação e a mistura foi arrefecida num banho de gelo-água. O pH da mistura foi ajustado para cerca de

10,5 e foi mantido, durante 47 horas, a uma temperatura de 35-40°C ao mesmo tempo que se mantinha o pH entre 10,5-11,5 pela adição periódica de uma solução do hidróxido de sódio a 25%. A acetona (130 g) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada com uma haste de agitação magnética. Cerca de 10,8 g da solução de reacção foram adicionados à acetona, resultando daí a precipitação de um sólido. A porção da acetona foi decantada, e um suplemento de 150 g de acetona foi adicionado ao precipitado, foi misturado, e a camada de acetona foi removida. Os produtos sólidos foram secos num forno de vácuo, a 60-65°C, durante várias horas. Cerca de 7,2 g dos produtos sólidos foram recolhidos. (Ver Tabela I).

-41 EXEMPLO 10. Preparação de 2,6-Bis([bis(carboximetil)amino](carboxi)metil}-4-(acetamido)fenol

Num frasco de boca larga, introduziram-se 38,6 g de 4-acetamidofenol, 35,3 g de ácido iminodiacético a 98%, 150 ml de metanol, 38,5 g de uma solução de ácido glioxílico aquosa a 50% e 30 g de água desionizada. A mistura foi arrefecida num banho de gelo-água, e o pH foi ajustado, enquanto se misturava, até cerca de 9,4, com uma solução de hidróxido de sódio a 50%. A temperatura foi mantida a menos do que 30°C, durante a adição do hidróxido cáustico. A mistura foi transferida para um balão de reacção, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, um termómetro e uma cobertura para o aquecimento. A mistura da reacção foi aquecida a cerca de 74-76°C, e o pH foi controlado e foi mantido entre 8,7-9,5, pela adição periódica de uma solução de hidróxido de sódio a 50%. A mistura foi aquecida durante um total de 18 horas. Durante este tempo, cerca de 40 g de água desionizada foram adicionados. Depois do arrefecimento, a mistura da reacção foi filtrada, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Adicionou-se a água desionizada (75 g) ao filtrado, e o metanol foi removido (/« vácuo) à temperatura ambiente (cerca de 20 a 25°C). Deixou-se a solução a repousar durante várias horas, e os sólidos precipitados foram removidos da solução, por filtração, empregando-se um funil de frita de vidro médio e vácuo. Cerca de 30 g do filtrado e 15 g de éter de etilo foram misturados meticulosamente, e a camada de éter foi, em seguida, separada. O processo foi repetido, empregando-se 15 g e 10 g de éter de etilo, sucessivamente. A camada aquosa foi ajustada, com uma solução de ácido clorídrico aquoso, para um pH cerca de 0,5 a os produtos voláteis foram removidos (zn vácuo), a uma temperatura de 50-55°C. Recolheram-se cerca de

13,5 g de produtos sólidos. Adicionou-se o metanol (75 g) aos produtos sólidos, e os sais insolúveis foram removidos por filtração. O metanol foi removido (in vácuo) o os sólidos remanescentes foram secos num forno de vácuo a 70-75°C, durante várias horas. O produto, que continha, ainda, algum sal inorgânico, foi analisado por RMN de protões, e verificou-se ser predominantemente o produto bis-substituído (Veja Tabela I).

EXEMPLO 11. Preparação de 2,6-Bis{[(2-{[bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetil)aminometil}-4-(acetamido)fenol

A solução do ácido etilenodiaminotriacético trissódico alcalina, preparada pelo processo do Exemplo D, foi arrefecida num banho de gelo, e o ácido clorídrico foi adicionado, com agitação, para se obter um pH cerca de 13,8. A temperatura foi mantida a menos do que 35°C, durante a adição do ácido. Os produtos voláteis foram removidos (in vácuo) à temperatura ambiente, até se atingir um peso de 210 g. Os produtos sólidos foram removidos por filtração, num funil de frita de vidro médio, empregando-se o vácuo. O filtrado foi transferido para um balão de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo, arrefecido a água, com uma haste de agitação magnética, com um termómetro, com um controlador de temperatura, com uma cobertura para o aquecimento e com um funil de adição. O pH foi ajustado para cerca de 11, com o ácido clorídrico. A temperatura foi mantida a menos do que 30°C, durante a adição do ácido. A mistura foi aquecida até cerca de 40°C, e 11,6 g de uma solução do formaldeído aquosa a 37% foi adicionada, gota a gota é lentamente, a partir do funil de adição, durante um período de 35 minutos. A mistura da reacção foi agitada a aquecida, durante um suplemento de 30 minutos, e. em seguida, foi arrefecida. A solução foi ajustada, com uma solução de hidróxido de sódio a 25%, para um pH cerca de 9,8, o foi transferida para um funil de adição.

-43 Num frasco de boca larga introduziram-se 10,3 g do 4-acetamidofenol a 98%, 25,2 g de água desionizada e 9,5 g de uma solução de hidróxido de sódio a 25%. A mistura foi agitada, até se ter obtido a dissolução completa. A solução foi transferida para um balão de reacção de fundo redondo, equipado como foi descrito no precedente, e iniciaram-se o aquecimento e a agitação. A mistura foi aquecida até cerca de 65°C, momento em que a solução do aducto de fõrmaldeído preparada no precedente, foi adicionada, gota a gota e lentamente, durante um período de uma hora. A mistura de reacção foi agitada e foi aquecida a 65°C, durante mais 12 horas e, em seguida, foi arrefecida. A acetona (150 g) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada com uma haste de agitação magnética. Cerca de 10 g da mistura da reacção bruta foram adicionados à acetona, resultando dai a precipitação de uma substância oleosa. A parcela da acetona foi decantada, e um suplemento de 150 g de acetona foi adicionado ao precipitado e foi misturado, e a camada de acetona foi removida. A substância foi seca num forno de vácuo, a 55-60°C, durante várias horas. Cerca do 3,1 g de sólidos foram recolhidos. Cerca de 165 mg dos produtos sólidos foram dissolvidos numa quantidade mínima de água, e foram deitados numa coluna de Q-Sepharose™ (de Pharmacia Inc.) [1,5 cm x 50 cm, forma acetato], e foram eluídos, empregando-se um gradiente de acetato de amónio 0 a 1 M, durante mais de duas horas, a 2 ml por minuto. A absorvãncia a 300 nm foi verificada. O produto estava contido no terceiro pico principal. Ele foi isolado e foi seco por congelação, dando origem a 36,4 mg de sólidos, que foram caracterizados por RMN de protões e de carbono e por espectrometria de massa de bombardeamento rápido, como sendo 2,6-bis{[(2-{[bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetil)aminometil}-4-(acetamido)fenol. (ver Tabela I).

-44EXEMPLO 12. Preparação de 2,6-Bis{[(2-([bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetil)aminonietil} -4-(amino)feno 1

Cerca de 264 mg de 2,6-bis{[(2-{[bis(carboximetil)]amino}etiI)(cárboximetil)aminometil}-4-(acetamido)fenol, preparado pelo processo do Exemplo 11 foram introduzidos num tubo de RMN de 5 mm, e foram dissolvidos numa mistura de D₂O (0,5 ml) e de DC1 (0,5 ml, 20%). O tubo de RMN foi introduzido num banho de água quente (85°C), durante períodos curtos de tempo, e o desenvolvimento da reacção foi controlado por RMN (desaparecimento dos protões de metilo de acetamida e aparecimento de ácido acético). Depois de 35 minutos, a reacção estava completa. A mistura da reacção foi seca por congelação, para dar origem ao hidrocloreto de amina bruto, como um material sólido escuro. O produto bruto foi dissolvido numa quantidade mínima de água e foi deitado numa coluna de Q-Sepharose™ (1,5 cm x 50 cm, forma acetato), e foi eluído, empregando-se um gradiente de acetato de amónio, do 0 a 1 M, durante três horas, a 2 ml por minuto. A absorvância a 300 nm foi verificada. O produto estava contido no terceiro pico principal, Ele foi isolado e foi seco por congelação deixando um sólido âmbar pálido (122 mg), que era uma mistura do produto amina desejado e de cloreto de amónio. A mistura do produto foi caracterizada por RMN de protões e de carbono e por análise elementar. O produto, que continha o sal (250 mg a partir de lotes reunidos) foi purificado, posteriormente, por Q-Sepharose™ (1,5 cm x 50 cm, forma formato), empregando-se um gradiente de ácido fórmico de 0 a 10%, durante quatro horas' Verificou-se absorvância a 300 nm. O primeiro pico principal continha o produto desejado. Ele foi isolado e foi seco por congelação, para dar origem a 8,3 mg de um sólido cristalino branco. A estrutura foi confirmada por RMN de protões e de carbono e por espectrometria de massa de bombardeamento atómico rápido. (Ver a Tabela I).

EXEMPLO 13. Preparação de 2,6-Bis{[(2-{[bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetil)aminometil} -4-(isotiocianato)fenol

O produto, que continha 2,6-bis{[(2-{[bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetil)aminometil}-4-(amino)fenol, e sal inorgânico (208 mg, 15% em NH₄C1) preparado pelo processo do Exemplo 12, foi dissolvido numa quantidade mínima de água e foi passado através de uma coluna do dessalinização Sephadex™ G-10 (Pharmacia, Inc.) (1 cm x 35 cm). A amina livre de sal foi eluida com água a foi seca por congelação (11,5 mg). A amina foi dissolvida em água (10 ml) e foi introduzido num balão de reacção de fundo redondo. Adicionou-se o tiofosgénio (0,015 ml, 10 eq), dissolvido em cloreto de metileno (1 ml). A mistura da reacção foi agitada à temperatura ambiente, durante uma hora. A mistura foi, em seguida, lavada com diversas porções de cloreto de metileno, para se remover o excesso de tiofosgénio e a camada aquosa seca por congelação, dando origem ao produto isotiocianato bruto, que foi caracterizado por espectrometria de massa de bombardeamento atómico rápido. (Ver Tabela I).

EXEMPLO 14. Preparação de 2-({[Bis(carboximetil)]amino}metil)-4-(acetamido)fenol

Agua desionizada (35,3 g), 35,3 g do ácido iminodiacético a 98% (0,25 mol) e 29,9 g de uma solução do hidróxido de sódio aquosa a 50%, foram introduzidos num balão de reacção de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com um agitador mecânico, com um

-46termómetro equipado com um controlador de temperatura, e com um funil de adição. A mistura foi aquecida, com agitação, até uma temperatura de 55°C. Uma solução de formaldeído aquosa a 37% (21,5 g) foi introduzida num funil de adição e foi adicionada ao balão de reacção, durante um período de 15 minutos. A mistura da reacção foi aquecida a 55°C, durante cerca de 45 minutos, foi arrefecida e foi transferida para um funil de adição. Num balão do fundo redondo, equipado como no precedente, introduziram-se 39,7 g (0,25 mol) de 4-acetamidofenol a 98%, 35,3 g de água desionizada e 12,2 g de uma solução de hidróxido de sódio aquoso a 50%. A mistura foi aquecida, com agitação, a uma temperatura do cerca de 65°C, e a solução do aducto do ácido formaldeido-iminodiacético foi adicionada, durante um período de 30 minutos. A mistura da reacção foi aquecida a 65°C, durante mais doze horas, e foi arrefecida. Adicionou-se o ácido clorídrico concentrado (55,5 g) e a mistura da reacção foi agitada, durante uma hora. Deixou-se a solução repousar durante várias semanas, e, em seguida, o precipitado cristalino foi filtrado, foi lavado com água desionizada e foi seco num forno de vácuo a 65°C, durante várias horas. Cerca de 17,4 g de sólidos foram recuperados. A estrutura foi confirmada por RMN de protões (Ver Tabela I).

EXEMPLO 15. Preparação de 2-({[Bis(carboximetil)]amino}metil)-6-{[({[bis(carboximetil)]amino }etil)(carboximetil)amino]metil }4-(acetamido)fenol

Cerca de 5,7 g de ácido 2-oxo-l,4-piperizinodiacético bruto, preparado pelo processo do Exemplo C, e 38,6 g de água desionizada, foram introduzidos num frasco de boca larga e misturados, até que a dissolução da lactama se tivesse efectuado. Uma solução de hidróxido cáustico (13,5 g de uma solução de hidróxido de sódio a 50%) foi adicionada, enquanto se mantinha a

-47temperatura a menos do que 30°C, por arrefecimento num banho de gelo-água. A solução foi. em seguida, transferida para um tubo de vidro e foi imersa num banho de água a 90°C, durante 10 minutos, e, em seguida, foi arrefecida num banho de gelo-água. A transformação da lactama no sal trissódico do ácido etilenodiaminotriacético foi confirmada por RMN de protões. A solução alcalina foi, em seguida, ajustada para um pH de cerca de 11,9, pela adição do ácido clorídrico. A temperatura foi mantida a menos do que 25°C, por arrefecimento num banho do gelo-água. A solução foi transferida para um recipiente de reacção, e 1,5 g de uma solução de formaldeído aquosa a 37% foi adicionada, gota a gota e lentamente, durante um período de 20 minutos. Uma quantidade pequena de uma solução cáustica aquosa foi, também, adicionada, durante este tempo, para o ajustamento de pH. A mistura foi agitada durante mais uma hora, com adições periódicas de hidróxido de sódio aquoso, para manter o pH entre 11,0-11,5.

Num recipiente de reacção separado foram introduzidos 1,5 g de 2-{[bis(carboximetil)]amino}metil)-4-(acetamido)fenol preparado pelo processo do Exemplo 12, e 2,5 g de água desionizada. Adicionou-se o hidróxido de sódio aquoso a 25%, enquanto se arrefecia num banho de gelo, para se obter um pH de cerca de 11. A solução do aducto de formaldeído, preparada no precedente, foi, em seguida, adicionada, durante um período de 30 minutos, ao composto fenólico, a uma temperatura cerca de 30°C. A mistura da reacção foi misturada e foi aquecida, durante mais 10 horas, a 70°C, e, em seguida, foi arrefecida. A acetona (100 g) foi introduzida num frasco de boca larga e foi agitada com uma haste de agitação magnética. Cerca de 10 g da mistura da reacção bruta foi adicionada à acetona, resultando daí a precipitação de um material gomoso. A parcela da acetona foi decantada e um suplemento de 50 g de acetona foi

-48adicionado ao material, e o produto foi triturado sob acetona. A camada de acetona foi removida, por decantação, e os sólidos foram secos num forno de vácuo a 60-65°C, durante várias horas. O produto desejado foi removido da mistura bruta, passando uma solução aquosa dos sólidos através de uma coluna de Q-Sepharose™ e isolando a fracção desejada, como no Exemplo 11. (Ver Tabela I).

EXEMPLO U. Preparação do Acido N,N'-di(2-hidroxi-5-acetamidobenzil)etilenodiamino-N,N'-diacético. (Comparativo)

O ácido etilenodiamino-N,N'-diacético (10 g, 6 mol), 25 g de água desionizada, 7,0 g de uma solução de hidróxido de sódio a 50%, e 5,0 g de metanol foram introduzidos num balão de reacção de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com um agitador mecânico, com um termómetro equipado com um controlador de temperatura, e com um funil de adição. A mistura da reacção foi aquecida a 55°C. Uma solução aquosa a 37% de formaldeído (9,2 g, 0,11 mol) foi introduzida num funil de adição e foi adicionada durante um período de vinte minutos. A mistura de reacção foi aquecida a 55°C, durante uma hora, e, em seguida foi arrefecida e foi transferida para um outro funil de adição. Num balão de reacção, equipado como no precedente, foram introduzidos 17,2 g de 4-acetamidofenol (0,11 mol), 36 g de água desionizada, 2,0 g de uma solução de hidróxido de sódio a 50%. a 36 g de metanol. A mistura fói aquecida a 65°C, e uma solução aquosa de aducto de formaldeído/ácido etilenodiamino-N,N'-diacético foi adicionada durante um período de uma hora e quinze minutos. A mistura da reacção foi aquecida a mais 12 horas a 64-65°C, e, em seguida foi arrefecida. Uma parcela do produto da reacção foi concentrada, e o metanol foi removido sob o vácuo. A solução foi

-49ajustada para pH 1,5-2,0, com o ácido clorídrico, resultando daí a precipitação do produto acetilo. O material foi filtrado, foi lavado com água desionizada, e foi seco num forno de vácuo, a 55-60°C, durante várias horas. A estrutura foi confirmada por RMN de protões.

EXEMPLO V. Preparação do Hidrocloreto do ácido N,N'-di(2-hidroxi-5-aminobenzil))etilenodiamino-N,N'-diacético. (Comparativo)

A cerca de 0,9 g do produto isolado do Exemplo U, adicionaram-se

12,5 g de água desionizada e 8 g de ácido clorídrico concentrado. A solução foi aquecida ao refluxo e foi agitada durante uma hora, num balão de reacção de fundo redondo. Os produtos voláteis foram removidos (in vácuo), e o produto hidrocloreto da amina foi seco num forno de vácuo, a 50-60°C, durante várias horas. A estrutura foi confirmada por RMN de protões.

EXEMPLO W. Preparação do Acido Etilenodiaminodi[(2-hidroxi-5-acetamidofenil)acético]. (Comparativo)

Ácido glioxílico aquoso a 50% (30,0 g, 0,20 mol), 4acetamidofenol a 98% (30,9 g, 0,20 mol) e água desionizada (22 g) foram introduzidos num balão de reacção de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com um agitador mecânico e com um termómetro equipado com um controlador de temperatura. O balão foi arrefecido coo um banho do gelo-água e 19,0 g de uma solução de hidróxido de sódio a 50% foi adicionada, lentamente e com agitação, enquanto a temperatura se mantinha a menos do que 30°C. Adicionou-se a etilenodiamina (6,1 g, 0,10 mol) a uma temperatura a menos do que 30°C. O banho de gelo foi removido e a

-50mistura do reacção foi aquecida e foi agitada, durante cinco horas, a 85-86°C. Cerca de 20 g do produto aquoso da reacção foram tratados com 10 g de éter etílico. O extracto de éter foi removido e o processo foi novamente repetido. A parcela aquosa foi, em seguida ajustada para um pH de cerca de 4,2, com o ácido clorídrico e foi agitada com 35 g de acetona. O extracto do acetona foi removido e foi posto de parte. Ao material remanescente adicionaram-se 65 g de metanol, com agitação. Os sólidos resultantes foram filtrados e foram secos num forno de vácuo, a 55-60°C, durante várias horas.

EXEMPLO X. Preparação do Acido etilenodiaminodi[(2-hidroxi-5-aminofenil)acético], (Comparativo)

A cerca de 4,5 g dos sólidos do precedente, adicionaram-se 6 g de água desionizada e 21 g de ácido clorídrico concentrado. A mistura foi filtrada, e adicionaram-se 6 g de água. A solução foi introduzida num balão de reacção de fundo redondo, equipado com um condensador de refluxo arrefecido a água, com um agitador mecânico e com um termómetro. A solução foi aquecida, durante uma hora, a 100-103°C, e, em seguida foi arrefecida. Os produtos voláteis forem removidos in vacuo, e o produto hidrocloreto do ácido etilenodiaminodi(2-hidroxi-5-aminofenil)acético foi seco num forno de vácuo, a 60°C durante várias horas. A hidrólise da funcionalidade acetilo foi seguida por RMN de protões.

PREPARAÇÃO DE COMPLEXOS E DETERMINAÇÃO’ DA PERCENTAGEM DE COMPLEXOS

Nos Exemplos, que se seguem, foram empregados os termos que se seguem: conc. designa concentrado; OAc designa a porção acetato,

-51 OCOCH₃; TLC designa cromatografia de camada fina: temperatura ambiente designa a temperatura cerca de 20 a 25°C, de um dia para o outro designa cerca de 9 a 18 horas; resina SP-Sephadex™ C-25 é uma resina de permuta de catiões que tem funcionalidade ácido sulfónico, vendida por Pharmacia, Inc.

Os complexos de ítrio e/ou de samário, dos diversos compostos, foram preparados e a percentagem de complexação foi determinada como se segue:

Preparação de Complexos de ítrio:

Os complexos foram feitos, preparando-se uma solução de ítrio 0,0003M em água. (YC1₃-6H₂O, 303,26 g/mol; Y(OAc)₃, 12,1% H₂O). Adicionou-se YC1₃ radioactivo (Oakridge National Laboratories), para se obterem o número desejado de contagens. Dez μΐ da solução de ligando (0,03M) foram adicionados a 990 μΐ da solução do Y, dando uma proporção de ligando para metal de 1:1 (dez vezes a quantidade da solução de ligando foi empregada para uma proporção 10:1 de ligando para metal). O pH foi, em seguida, ajustado para 7,4, empregando-se quantidades microlítricas de ácido clorídrico ou de hidróxido de sódio. A solução, foi, em seguida, analisada, quanto à quantidade de ítrio complexado, empregando-se o processo de permuta de catiões, exposto a seguir.

Determinação da Percentagem de Complexos

Uma coluna de plástico (Biorad) de 10 ml descartável foi cheia com 1 a 2 ml de resina de permuta de catiões Sephadex™ C-25 intumescida de

-52água. A água foi eluída sob pressão, para a parte superior da resina. Quinze μΐ do complexo (ou mais, se as contagens forem baixas) foram adicionados à parte superior da resina. Isto foi seguido por 2 ml de solução salina isotónica:solução de hidróxido de amónio 4:1 (V:V) como eluente, que foi deixado cair gota a gota, num tubo do contagem. Isto foi, também, eluído sob pressão, para a parte superior da resina. Um complemento de 2 ml do eluente foi adicionado e a coluna foi eluída sob pressão, para se remover todo o líquido. A resina seca foi, em seguida, introduzida num terceiro tubo de contagem, e os três tubos foram contados num contador de precisão de Nal, empregando-se um analisador de multicanais Canberra, ligado a um computador. A percentagem de complexo foi determinada dividindo-se o número de contagens, nas duas eluições pelo total de contagens nas eluições mais a coluna, tudo vezes 100. Por este processo, o ítrio não complexado foi retido na coluna.

Preparação de Complexos de Samário/Determinação da Percentagem de Complexos:

Os complexos de samário foram produzidos, como foi descrito no procedente, para os complexos de ítrio, excepto de que o samário 0,0003M foi preparado por dissolução de Sm₂O₃ (348,7 g/mol) em ácido clorídrico O,1M. Sm-153 radioactivo foi obtido como uma solução 0,0003M em ácido clorídrico O,1M da University of Missouri Research Reactor, Columbia, Missouri. A determinação da percentagem de complexos foi feita da mesma maneira que para o complexo de ítrio. Os resultados estão resumidos na Tabela II.

Tabela II

Dados da Complexação
Exemplo de Complexo N°.	Composto do Exemplo N°.	% de Complexo (10:1)
Y	Sm
16	1	98
17	2	>99
18	2		>99
19	3	>99
20	4	>99
21	5	99
22	6		>99
23	7		96**
24	8		>99**
25	9		>99
26	10	98
27	11	99
28	11	98*
29	12	99
30	12		98
31	12	98*
32	12		98*
33	15	99

A proporção de ligando/metal foi cerca de 1:1;

A proporção de ligando/metal foi cerca de 50:1.

-54Exemplos I-XV e Exemplos Comparativos A - F zn vivo de Detecção de Quelatos Bifuncionais

A estabilidade de determinados quelatos de terras raras tem sido correlacionada com as análises in vivo em animais. Por exemplo, Rosoff et al. em Internaiional Journal of AppliedRadialion and Isotopes, 14, 129-135 (1963), relata a distribuição de quelatos de terras raras radioactivas em ratinhos, por determinados ácidos aminocarboxílicos. A correlação verificada foi que in vivo a competição entre o agente de quelação e os constituintes do corpo (inorgânicos e orgânicos) para os iões de terras raras, determina a sua deposição e a sua excreção. Pensa-se que os quelatos de terras raras fortes dissociam-se muito pouco e são excretado, enquanto os quelatos de poder fraco e intermédio dissociam-se mais rapidamente, e, deste modo, são depositados em orgãos tais como o fígado. Não obstante, a concentração de radionuclídeo no fígado, não é sempre devida à formação reduzida de complexos mas, em alguns casos, é devida à afinidade que o quelato do metal tem pelo fígado (ver os Exemplos Comparativos A & B, na Tabela III). Os compostos têm, de facto, sido preparados e utilizados para a avaliação da função do fígado (Pritzberg. Alan R., Radiopharmaceuticals: Progress and Clinicai Perspectives') 1, (1986); Patentes No. 4.088.747 e No. 4.091.088, ambas dos Estados Unidos da América (Hunt et al.).

A biodistribuição dos diversos quelatos de samário e/ou de ítrio, divulgado nesta Descrição, foi determinada, e também a percentagem da dose no fígado empregada como um processo de detecção in vivo para estimar, qualitativamente, a estabilidade dos quelatos. Os quelatos de NTA e de EDTA foram incluídos, para comparação. Também o samário foi injectado como cloreto de samário, na forma não quelada.

Ratazanas Sprague-Dawley, com o peso de 150 a 200 g, foram adquiridos em Charles River Laboratories. Estes animais foram colocados em jaulas e foram alimentados com água e comida ad libitum. Os animais foram aclimatados, durante pelo menos cinco dias, antes do seu emprego. Antes da injecção do complexo, os animais foram colocados sob uma lâmpada de aquecimento (15 a 30 minutos) para dilatar a veia da cauda. Em seguida, o animal foi colocado numa jaula de restrição, a cauda foi limpa com álcool, e o animal foi injectado (50 a 200 μΐ) via veia da cauda. Depois da injecção, o animal foi colocado numa outra jaula, durante duas horas, após o que o animal foi morto por deslocação cervical. O animal foi, em seguida, dissecado, e as partes foram enxaguadas com água desionizada, foram secas e foram pesadas num frasco de contagem tarado. Qualquer que fosse o volume da injecção praticada, pelo menos três padrões do mesmo material foram preparados e contados com as partes do animal. A percentagem da dose é o numero de contagens no órgão, dividido pelo número de contagens no padrão vezes 100 (Ver Tabela III).

/

-56Tabela III

Dados da Biodistribuição
Exemplo de Biologia N°.	Composto do Exemplo N°.’	Metal	% de Dose Injectada no Fígado
I	1	Y	0,87
II	2	Y	0,22
II	3	Y	0,22
IV	4	Y	1,4
V	5	Y	0,38
VI	6	Sm	0,38
VII	9	Sm	2,8
VIII(10)	10	Sm	1,3
VIII(300)	10	Sm	0,12
VIII(10)	10	Y	0,39
VIII(300)	10	Ho	0,26
IX	11	Y	0,22
X	11	Sm	0,33
XI	12	Y	0,28
XII	12	Y	0,18
XIII	12	Sm	0,35
XIV	12	Sm	0,26
XV	15	Y	0,37
(A)	U(comp)	Sm	12
(B)	X(comp)	Sm	24
(C)	EDTA	Sm	8,4
(D)	EDTA	Sm	4,4
(E)	NTA	Sm	8,6
©	SmCl₃	Sm	39

Os complexos foram preparados nas proporções de ligando/metal de 10:1 para os Exemplos I a XI, XIII e XV; de 1:1 para os Exemplos XII & XIV; de 5:1 para o Exemplo C; e de cerca 300:1 para os Exemplos D e E.

-57Exemplos XVI e XVII.

O complexo 1:1 de ítrio, com o ácido l-(paminobenzil)dietilenotriaminopentacético (ABDTPA), um quelato bifuncional bem conhecido na bibliografia, e com o ligando do Exemplo 2 (Agora Exemplo XVI) e o Exemplo 12 (Agora Exemplo XVII) foi preparado empregando-se as técnicas descritas anteriormente. Diversas partes alíquotas de 100 microlitros foram, em seguida, recolhidas em tubos centrífugos separados. Adicionou-se um excesso de metal, de tal modo que a alteração do volume total fosse minimizada, e foi anotado o tempo. Meia hora depois da adição do metal, a percentagem do complexo foi determinada, pelo processo Sephadex™ C-25, e ela foi comparada com a quantidade original do complexo. A percentagem do complexo em face do metal adicionado, dá uma indicação da instabilidade do complexo de ligando-metal. Os resultados são dados a seguir e são comparados com o complexo de EDTA-ítrio.

Tabela IV

Estudo do Complexo
Proporção Molar de Metal/Ligando	% de Complexo
Ex. XVI	Ex. XVII	ABDTPA	EDTA
1	99	95	97	98
10	94	93	95	86
100	84	90	92	78
250	--	90	87	48
500	75	79	70	16

-58Exemplo XVIII.

Uma solução 0,18M/L do ácido l-(p-ammobenzil)dietilenotriaminopentacético (ABDTPA) e uma solução 0,18M/L idêntica do ligando do Exemplo 12, foram preparadas num tampão de acetato de sódio 0,5M a pH 6,5. As soluções foram, em seguida, tratadas com 1,5 equivalentes de ítrio-90, como cloreto de ítrio 0,03M/L. O pH do complexo resultante foi 5-6. O excesso do Y90 foi removido passando o complexo através de um volume de leito de um ml de resina Chelex™ (Bio-Rad Laboratories). A concentração do complexo, nesta forma purificado, foi 0,0013M. Uma quantidade adequada da solução foi adicionada a 1,7 x IO⁹ mol de aldeído contendo o anticorpo monoclonal CC-46, para dar origem a uma proporção de 40:1 do complexo para o anticorpo. Depois de uma exposição de uma hora, um excesso 236 molar (relativamente ao anticorpo) de NaCNBH₃ foi adicionado, a as soluções foram deixadas a repousar, durante cerca de uma hora. Decorrido este tempo, o anticorpo (e qualquer complexo ligado covalentemente) foi separado do complexo não ligado, por filtração de gel de Sephadex™ G-25. Este processo proporcionou uma média de 5,0 complexos por anticorpo, para o ácido l-(p-ammobenzil)dietilenotriaminopentacético, e uma média de 5,4 complexos, por anticorpo, para o ligamento do Exemplo 12.

Exemplo XIX

Com a finalidade de se demonstrar a ausência de reacção dos conjugados de anticorpo-complexo do Exemplo XVIII, os conjugados foram provocados com um excesso do ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) pela maneira seguinte. Os anticorpo-complexos purificados foram adicionados a tampão HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazino-N'-2-etanossulfónico) a pH 7,4,

-59e foram tratados com uma quantidade adequada de uma solução de DTPA O,1M (pH 7,4) para se assegurar um excesso 1.000 vezes molar de DTPA relativamente ao complexo ligado ao anticorpo. Depois de uma hora, uma parte alíquota foi removida, e os conjugados de anticorpo-complexos foram separados das substâncias de peso molecular baixo, empregando-se a filtração de gel. Os resultados indicam que o sistema ABDTPA perdeu mais de 98% do ítrio, enquanto o sistema, que empregou o ligando do Exemplo 12 perdeu cerca de 39% do ítrio.

EXEMPLO XX. Preparação do Complexo 2,6-bis([(2-{[bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetil)]aminometil}-4-(amino)fenol, samário

Uma solução de samário foi preparada, combinando-se, num frasco de 1 ml, ¹⁵³Sm radioactivo (200 μΐ de uma solução 3 x 10^-4 M, em ácido clorídrico 0,lM, 6 x IO'⁵ mmol) com SmCl₃-6H₂O frio (4,8 mg, 1,31 x 10'²mmol). Esta solução foi adicionada a 2,6-bis{[(2-{[bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetil)]aminometil}-4-(acetamido)fenol (3,3 mg, 5,31 x 10*³ mmol), preparada pelo processo do Exemplo 11. O pH foi, em seguida, ajustado a 7, pela adição de hidróxido de sódio (40 μΐ de uma solução 1,0Μ). A percentagem de complexo foi verificada ser 66%, empregando-se o processo Sephadex™ C-25.

O complexo precedente foi purificado por cromatografia de permuta do aniões (Q-Sepharose™, 1,5 cm x 21 cm, NaCl 0 a 1M, durante mais de 30 minutos, 2 ml/min, detecção a 285 nm). As parcelas, que continham o complexo (1 ml cada, 6 ml no total) foram reunidas, e a percentagem de complexo foi verificada ser 95%.

-60EXEMPLO XXI. Conjugação do Complexo 2,6-bis{[(2-{[bis(carboximetil)Jamino}etil)(carboximetil)]aminometil}-4-(amino)fenol, samário, com o anticorpo monoclonal CC-46

O bicarbonato de sódio (60 mg, 7,14 x 10'¹ mmol) foi introduzido num frasco de vidro de um dracma, e a solução do complexo do Exemplo XX foi adicionada (1 ml, cerca de 8,8 x 10⁴ mmol). Adicionou-se o tiofosgénio (10 μΐ, 1,31 x 10'¹ mmol), em clorofórmio (1 ml) e o frasco foi vedado. A mistura foi agitada, durante 15 minutos, após o que a camada aquosa foi lavado, por duas vezes, com clorofórmio (parcelas de 1 ml). A percentagem do complexo foi verificada e achou-se ser de 96%.

O complexo de isotiocianato Sm precedente (100 μΐ, cerca de 8,8 x IO⁵ mmol) foi combinado com o anticorpo monoclonal CC-46 (100 μΐ de uma solução de 8 mg/ml, cerca de 5,3 x 10⁶ mmol) e foi deixado repousar durante 24 horas. A quantidade do complexo conjugado com o anticorpo foi verificada ser de 46% por cromatografia de exclusão de dimensões.

EXEMPLO XXII. Preparação do Complexo ácido 2-[bis(2-{[(bis(carboximetil)]amino}etil)amino]-2-[5-amino-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico e ácido 2[ {2-((2- {[bis(carboximetil)]amino} etil)(carboximetil)amino] etil} (carboximetil)amino]-2-[5-amino-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico, samário

Uma solução de ligandos do Exemplo 7 foi preparada, dissolvendo-se 266 mg do sólido liofilizado, em 1 ml de água. Uma parte alíquota de 33,85 μΐ desta solução foi tratada com 1 ml de SmCl₃ 3 x 10⁴ M, em ácido clorídrico 0,lN, contendo uma quantidade traçadora de ¹⁵³Sm radioactivo. O pH da solução

-61 do complexo foi ajustado para cerca de 13, empregando-se o hidróxido de sódio a 50%, em peso, e, em seguida, ajuntado para pH cerca de 7,5, empregando-se o ácido clorídrico Ι,ΟΝ. A percentagem de Sm que foi complexado foi determinada como foi descrito nos Exemplos 16 até 33, e foi verificado ser de 100%.

A ausência de reacção do complexo, foi comprovada introduzindo-se duas partes alíquotas de 500 μΐ da solução do complexo, em frascos separados. Uma parte foi tratada com parcelas de 1 a 2 μΐ de ácido clorídrico 0,lN, até que o pH tivesse baixado, e a outra parte foi tratada com o hidróxido do sódio 0,lN para elevar o pH. Os complexos foram deixados repousar durante 5-10 minutos, em cada alteração de pH, e, em seguida, eles foram testados para se determinar a percentagem da complexação, naquele pH, pelo processo descrito para os Exemplos Ϊ6 a 33. Os resultados são revelados na tabela, que se segue.

Tabela V

pH	% de Complexado
1	98
2	100
3	100
4	100
5	100
7.....	100
9	100
11	100
13	100

-62Exemplo XXIII.

Preparação do Complexo 2-[{2-[(2-{[bis(carboximetil)]amino}etil)(carboximetil)amino]etil}(carboximetil)amino]-2-[5-amino-2-(carboximetiloxi)fenil]etanóico, samário

Uma solução do ligando do Exemplo 8 foi preparada, dissolvendo-se 13,9 mg do sólido acastanhado, em 772 μϊ de água. Um complexo foi preparado, dissolvendo-se 500 μϊ desta solução de ligando, em 1 ml de SmCl₃ 3 x ÍO^M (contendo ácido clorídrico a 0, IN), que tinha sido traçado com ¹⁵³Sm radioactivo. O pH da solução do complexo foi ajustado para cerca de 7, pela adição de hidróxido de sódio a Ι,ΟΝ. A percentagem da complexação foi determinada pelo processo descrito para os Exemplos 16 a 33, e verifícou-se ser 96%.

A ausência de reacção do complexo foi comprovada introduzindo duas partes alíquotas de 500 μϊ cada da solução do complexo, em frascos separados. Uma parte foi tratada com parcelas de 1-2 μϊ de ácido clorídrico l,0N, até que o pH ao baixasse, e a outra parta foi tratada com hidróxido de sódio 0,1Ν, l,0N e 50%, em peso, para elevar o pH. Os complexos foram deixados a repousar, durante cerca de 5 minutos, em cada alteração de pH, e, em seguida, eles foram testados para se determinar a percentagem da complexação, naquele pH, pelo processo descrito para os Exemplos 16 a 33. Os resultados estão apresentados na tabela que se segue.

-63 Tabela VI

PH	% de Complexado
1	91
2	88
3	92
5	96
7	96
9	99
12	98
13	99

EXEMPLOS DE DADOS DE BIODISTRIBUIÇÃO

Os complexos foram preparados misturando-se uma solução do ligando e do metal, e, em seguida, ajustando-se o pH para 7-8. A quantidade do metal que foi complexado com ligando, foi determinada por cromatografia de permuta de catiões. O metal livre foi retido pela resina; o metal, na forma de um complexo, não o foi.

Cem μΐ dos complexos foram injectados na veia da cauda de três ratazanas Sprague Dawley. Duas horas depois da injecção, as ratazanas foram mortas por deslocação cervical e amostras dos tecidos foram retirados. Os tecidos foram pesados, e a quantidade da radiação, em cada tecido, foi determinada, medindo-se o número de contagens, empregando-se um contador de precisão de Nal, e comparando com os padrões. A percentagem da dose, no sangue, foi determinada presumindo-se que o peso de sangue era 6,5% do peso

-64do animal. A quantidade nos ossos era de 25 vezes a percentagem da dose num fémur. Os exemplos que se seguem, diferem no ligando, na quantidade de ligando e na quantidade do metal empregados. Foi empregado metal não radioactivo, para se obter as desejadas proporções de ligando para metal, e o metal radioactivo traçador foi empregado para se obter a biodistribuição.

Exemplo XXIV

O ligamento do Exemplo 10 foi misturado com uma solução de Sm-153. A concentração de Sm foi de 3 x ÍO^M, e o ligando foi empregado com um excesso 300 vezes molar. A biodistribuição revelou 52,7% nos ossos, 0,12% no fígado, 0,005% no baço, 0,23% nos músculos e 0,05% no sangue.

Exemplo XXV.

O ligando do Exemplo 10 foi complexado com Ho-166. A concentração de Ho era de 3 x IO⁴ M, e a composição continha um excesso 300 vezes molar do ligando. A biodistribuição revelou 52,9% nos ossos, 0,26% no fígado, 0,007% no baço, 1,1% nos músculos e 0,09% no sangue.

EXEMPLO XXVI.

O ligando do Exemplo 10 foi complexado com Sm-153, empregando-se uma concentração de Sm de 3 x 10^-4 H e excesso 10 vezes molar de ligando. A biodistribuição revelou 48,5% nos ossos, 1,3% no fígado, 0,01% no baço, 0,73% nos músculos e 0,18% no sangue.

-65EXEMPLO XXVIL

Um coelho foi injectado, da mesma maneira que as ratazanas, com uma composição que tinha Y-90 com Y a 3 x IO⁴ M e o ligando do Exemplo 10 num excesso 10 vezes molar. A actividade foi verificada concentrar-se nos ossos (59%), no fígado (1,1%),. no baço (0,19%), nos músculos (1,5%) e no sangue (0,68%), revelando uma absorção mínima.

Exemplo XXVIII.

O ligando do Exemplo 1 foi complexado, empregando-se Y-90 como traçador. A concentração de Y foi de 3 x 10⁴ M, e o ligando foi adicionado num excesso 10 vezes molar. A biodistribuição em ratazanas (média de duas ratazanas) revelou 56,1% nos ossos, 0,87% no fígado, 0,03% no baço, 0,78% nos músculos e 0,57% no sangue.

Exemplo XXIX.

Um cão foi apresentado com um osteossarcoma no húmero proximal direito, e andava com uma coxeadura significativa. Um complexo foi preparado, empregando-se o ligando do Exemplo 10, com uma solução de Sm-153. A concentração de Sm foi de 3 x 10⁴ M, e o ligando foi empregado com um excesso 300 vezes molar. A actividade especifica do Sm-153 foi de 30 mCi/min. Administrou-se ao cão uma injecção intravenosa deste complexo, que continha 0,95 mCi de Sm-153, por kg de peso do corpo do cão. Uma semana depois da injecção, o passo do cão tinha melhorado de modo perceptível.

-66TABELA I: ESTRUTURA GENÉRICA

Exemplo N°.	Z	X	*6	n	Ri	*2	r₃		B
1	-nhcoch₃	-H	-H	0	-	-	-H	-COOH	—NH \Z n^Z COOH V^COOH
2	-NHCOCH3	ch₂cooh	-H	0	-	-	-H	-COOH	/—COOH —N /X \Z N ^C00HY^COOH
3	-nh₂	ch₂cooh	-H	0	-	-	-H	-COOH	/—-COOH —N /k \Z ^X _N ^Z COOH V--COOH
4	-nhcoch₃	-H	-H	0	-	-	-H	-COOH	/—CN —N z\ \Z N COOH V—COOH

TABELA I: continuação

Exemplo N°.	Z	X	*5	n	Ri	*2	Ra	r₄	B
5	-nh₂	-H	-H	0	-	-	-H	-COOH	/—COOH ^N\/^X _n ^/XCOOH V^COOH
6	-nhcoch₃	CH₂CO₂H	-H	0	•	*	-H	-COOH	/-COOH _Z ^N COOH U-COOH
									COOH /
									>—COOH \ -<Ã z^T^COOHx/ N L^cooh

-68TABELA I: continuação

Exemplo N°.	Z	X	Rs	n	Ri	Ra	r₃	R₄	B
7	-nh₂	ch₂cooh	-H	0			-H	-COOH	f-COOH ^Xx^^x _n ^/X'COOH V^COOH 4. COOH >—COOH ( -</ z^^Nx/^COOHN V^COOH
8	-nh₂	ch₂cooh	-H	0	-	-	-H	-COOH	COOH —^COOH L^cooh

TABELAI: continuação

Exemplo N°.	Z	X	Rs	n	Ri	R2	R3	R₄	B
9	-NHCOCH3	CH₂CO₂H	-H	0			-H	-COOH	^COOH ^COOH ^COOH ^COOH + ^coofAcooh N^^COOH —COOH
10	-nhcoch₃	-H	HOOC—\ COOH HOOC—' '	0	-	-	-H	-COOH	]/-^C00H \—COOH

-70TAB£LA I: continuação

Exemplo N°.	Z	X	*5	n	Ri	*2	r₃	r₄	B
11	-nhcoch₃	-H	HOOC—COOH H00C-7 n—ξ	0	-	-	-H	-H	/—COOH ~ ⁿ\Z\^z^cooh L^cooh
12	-nh₂	-H	^HOOC—\ .COOH jv HOOC—'	0	-	-	-H	-H	/—COOH ~ⁿ\Z^k _n ^/Xxcooh L^cooh
13	-NCS	-H	HOOC—COOH «ooc^N				-H	-H	/—COOH ~^N\/^X _n^^xCOOH V-COOH

-71 TABELA I: continuação

Exemplo N°.	Z	X	*5	n	^Ri	*2	*3	*4	B
14	-nhcoch₃	-H	-H	0	-	-	-H	-H	COOH COOH
15	-nhcoch₃	-H	HOOC^ COOH	0	-	-	-H	-H	—^C0°^H \—COOH

Lisboa, 27 de Junho de 1995

Claims

1. Quelante, caracterizado por possuir um grupo funcional ligado na posição orto e por ter a fórmula: em que:

Z' é hidrogénio, NH₂, NO₂, NHC(O)CH₃ ou N(R')₂, onde R'₂ é hidrogénio ou alquilo C_rC₃;

X é hidrogénio, alquilo C^-C^ ou CR₃R₄COOH;

R\ e R'₂ são, cada um, hidrogénio ou COOH, com a condição de que pelo menos um seja COOH;

R'₃, R'₄, R'₅ e R'₆, são, independentemente, hidrogénio ou CR₃R₄COOH, com a condição de que pelo menos três sejam CR₃R₄COOH; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

2. Quelante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R^ 2 R'₂ serem COOH, R'₃, R'₄, R'_s e R'₆ serem CH₂COOH.

3. Quelante de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por Z' ser NHC(O)CH₃ e X ser hidrogénio.

4. Complexo, caracterizado por compreender um quelante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, complexado com um ião de metal, seleccionado de entre La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y ou Sc.

5. Complexo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ião de metal ser ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁷Lu, ¹⁷⁵Yb, ⁴⁷Sc ou ^,42Pr.

6. Conjugado, caracterizado por compreender um complexo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, ligado covalentemente a um anticorpo, ou a um fragmento do anticoipo.

7. Conjugado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o anticorpo, ou seu fragmento, ser um anticoipo monoclonal, ou um seu fragmento.

8. Conjugado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o anticoipo, ou fragmento de anticoipo, ser CC-46, CC-49, CC-49 F(ab')₂, CC-83 F(ab')₂ ou B72.3.

9. Formulação fannacêutica, caracterizada por compreender um complexo de acordo com a reivindicação 4 ou 5 e um veículo físiologicamente aceitável.

10. Formulação fannacêutica, caracterizada por compreender um conjugado, de acordo com a reivindicação 6 e um veículo físiologicamente aceitável.

11. Fonnulação fannacêutica de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada por se destinar ao tratamento do cancro.

12. Fonnulação fannacêutica de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada por se destinar ao tratamento de dores nos ossos.