DE68927271T2 - Chelatbildende Verbindungen die eine orthobindende Gruppe besitzen und ihre Komplexe - Google Patents

Chelatbildende Verbindungen die eine orthobindende Gruppe besitzen und ihre Komplexe

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Chelatbildner, die eine Ortho-Ligationsfunktionalität besitzen, Komplexe und Konjugate davon, Verfahren zu deren Herstellung und Formulierungen für deren Verwendung in Krebsdiagnostik und/oder -therapie.
  • Funktionalisierte Chelatbildner oder bifunktionelle Koordinatoren sind bekanntermaßen fähig kovalent an einen Antikörper gebunden zu werden, der eine Spezifität für Krebs- oder Tumorzellepitope oder -antigene aufweist. Radionuklidkomplexe derartiger Antikörper/Chelatbildner- Konjugate sind als Beförderungsmittel für das Radionuklid zu einer Krebs- oder Tumorzelle in diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendungen nützlich. Siehe z.B. Meares et al., Anal.Biochem. 142, 68-78 (1984) und Krejcarek et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77, 581-585 (1977).
  • Aminocarbonsäure-Chelatbildner sind seit mehreren Jahren in der Literatur bekannt und untersucht. Typisch für die Aminocarbonsäuren sind Nitriltriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Hydroxyethylethylendiamintriessigsäure (HEDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Trans-1,2- diaminocyclohexantetraessigsäure (CDTA). Zahlreiche, auf Aminocarbonsäuren basierende bifunktionelle Chelatbildner wurden vorgeschlagen und hergestellt. Beispielsweise wurden das cyclische Dianhydrid von DTPA (Hnatowich et al., Science 220 613-615, 1983; US-Patent 4,479,930) und gemischte Carbonsäureanhydride von DTPA (Gansow, US-Patente 4,454,106 und 4,472,509; Krejcarek et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77, 581-585, 1977) in der Literatur beschrieben. Wenn die Anhydride an Proteine gekoppelt werden, verläuft das Koppeln über die Ausbildung einer Amidbindung, wodurch somit vier der ursprünglich fünf Carboxymethylgruppen am Diethylentriamin (DETA) Grundgerüst (Hnatowich et al., Int.J.Appl.Isot. 33, 327-332, 1982) verbleiben. Zusätzlich offenbaren die US-Patente 4,432,907 und 4,352,751 bifunktionelle Chelatbildner, die zum Binden von Metallionen an "organische Spezies, wie etwa organische Zielmoleküle oder Antikörper" geeignet sind. Wie im obigen wird das Koppeln erreicht mittels einer Amidgruppe durch die Verwendung von Diaminotetraessigsäuredianhydriden. Beispiele von Anhydriden umfassen Dianhydride von EDTA, CDTA, Propylendiamintetraessigsäure und Phenylen-1,2- diamintetraessigsäure. Ein neueres US-Patent 4,647,447 offenbart verschiedene aus dem Anion einer komplexierenden Säure gebildete Komplexsalze zur Verwendung in verschiedenen diagnostischen Techniken. Es wird eine Konjugation mittels einer Carboxylgruppe der komplexierenden Säure gelehrt, die eine Verknüpfung über eine Amidbindung ergibt.
  • Eine andere Klasse bifunktioneller Chelatbildner, die auf Aminocarbonsäurefunktionalität beruht, ist in der Literatur ebenfalls gut dokumentiert. So offenbaren Sundberg et al. im J.of Med.Chem. 17 (12), 1304 (1974) bifunktionelle Analoga von EDTA. Repräsentativ für diese Verbindungen sind 1-(p- Nitrophenyl)ethylendiamintetraessigsäure, 1-(p-Aminophenyl)ethylendiamintetraessigsäure und 1-(p-Benzoldiazonium)ethylendiamintetraessigsäure. Die Kopplung an Proteine über den para- Substituenten und die Bindung von radioaktiven Metallionen an die Chelat-bildende Gruppe werden diskutiert. Die Verbindungen sind auch in Biochem.Biophys.Res.Comm. 75(1), 149 (1977) und in den US-Patenten 3,994,966 und 4,043,998 offenbart. Es ist wichtig anzumerken, daß die Verknüpfung der aromatischen Gruppe an die EDTA-Struktur über einen Kohlenstoff des Ethylendiamingrundgerüsts erfolgt. Auf EDTA, HEDTA und DTPA basierende optisch aktive bifunktionelle Chelatbildner sind im US-Patent 4,622,420 offenbart. In dieser Literaturstelle erfolgt die Verknüpfung der Aminocarbonsäurefunktionalität an den Rest des bifunktionellen Chelatbildnermoleküls auch durch einen Kohlenstoff des Ethylenamingrundgerüsts. In diesen Verbindungen verbindet eine Alkylengruppe die aromatische Gruppe (die die zur Verknüpfung an das Protein erforderliche Funktionalität enthält) mit dem Kohlenstoff des Polyamins, das die Chelat-bildende Funktionalität enthält. Andere Literaturstellen bezüglich derartiger Verbindungen umfassen Brechbiel et al. Inorg.Chem. 25, 2772-2781 (1986), US-Patent 4,647,447 und eine veröffentlichte PCT-Anmeldung mit der internationalen Veröffentlichungsnummer WO 86/06384. Vor kurzem wurden bestimmte macrocyclische bifunktionelle Chelatbildner und die Verwendung derer Kupferchelatkonjugate für diagnostische und therapeutische Anwendungen im US-Patent 4,678,667 offenbart. Verknüpfung der Aminocarbonsäurefunktionalität an den Rest des bifunktionellen Chelat-bildenden Moleküls erfolgt über einen Ringkohlenstoff des cyclischen Polyamingrundgerüsts. Somit ist ein Linker, der an einem Ende mit einem Ringkohlenstoff des cyclischen Polyamins verknüpft ist, auch an seinem anderen Ende mit einer funktionellen Gruppe verknüpft, die fähig ist mit dem Protein zu reagieren.
  • Eine andere ebenfalls bemerkenswerte Klasse bifunktioneller Chelatbildner besteht aus Verbindungen, bei denen die Chelatbildende-Gruppierung, d.h. die Aminocarbonsäure, des Moleküls über einen Stickstoff mit der funktionellen Gruppe des Moleküls, die die zum Reagieren mit dem Protein fähige Gruppierung enthält, verknüpft ist. Als ein Beispiel offenbaren Mikola et al. in einer veröffentlichten PCT- Anmeldung (internationale Veröffentlichungsnummer WO 84/03698, veröffentlicht am 27.9.1984) einen bifunktionellen Chelatbildner, der hergestellt wird durch Umsetzen von p- Nitrobenzylbromid mit DETA, gefolgt von Umsetzen mit Bromessigsäure, um die Aminocarbonsäure herzustellen. Die Nitrogruppe wird zur entsprechenden Amingruppe reduziert und wird dann durch Reaktion mit Thiophosgen in die Isothiocyanatgruppe überführt. Diese Verbindungen sind bifunktionelle Chelatbildner, die an bio-organische Moleküle konjugiert werden können zur Verwendung als diagnostische Mittel, die fähig sind, mit Lanthaniden Chelate zu bilden. Da eine Verknüpfung des Linkeranteils des Moleküls über einen der Stickstoffe der Aminocarbonsäure erfolgt, wird dann eine potentielle Aminocarboxylgruppe für die Chelatbildung verloren. Somit wird ein bifunktioneller Chelatbildner auf DETA-Basis hergestellt, der vier (nicht fünf) Säuregruppen enthält. In dieser Hinsicht ähnelt diese Klasse bifunktioneller Chelatbildner denjenigen, bei denen eine Verknüpfung an das Protein durch eine Amidgruppe mit anschließendem Verlust einer Carboxylchelat- bildenden Gruppe erfolgt.
  • Im J.Radioanalytical Chem. 57 (12), 553-564 (1980) offenbaren Paik et al. die Verwendung von p-Nitrobenzylbromid in einer Reaktion mit einem "blockierten" Diethylentriamin, d.h. bis- (2-Phthalimidoethyl)amin, gefolgt von Verfahren zum Entfernen der Blockierung und Carboxymethylierung unter Verwendung von Chioressigsäure um N'-p-Nitrobenzyldiethylentriamin-N,N,N",N"- tetraessigsäure zu ergeben. Wiederum wird, da die Verknüpfung über einen Stickstoff erfolgt, ein Tetraessigsäurederivat erhalten. Eine Konjugation des bifunktionellen Chelatbildners und Chelatbildung mit Indium wird diskutiert. Substitution am Stickstoffatom wird auch von Eckelman et al. in J.Pharm.Sci. 64 (4), (1975) gelehrt durch Umsetzen von Ammen, wie etwa "Ethylendiamin oder Diethylentriamin mit dem geeigneten Alkylbromid vor Carboxymethylierung". Die Verbindungen werden als potentielle radiopharmazeutische bilderzeugende Mittel vorgeschlagen.
  • Vor kurzem offenbarten Carney, Rogers und Johnson (3rd. International Conference on Monoclonal Antibodies; San Diego, California - 4. bis 6. Februar 1988) Zusammenfassungen mit den Titeln "Absence of Intrinsically Higher Tissue Uptake from Indium-111 Labeled Antibodies: Co-administration of Indium-111 and Iodine-125 Labeled B72.3 in a Nude Mouse Model" und "Influence of Chelator Denticity on the Biodistribution of Indium-111 Labeled B72.3 Immunoconjugates in Nude Mice". Die Bioverteilung von mit einem EDTA und DTPA bifunktionellen Chelatbildner komplexierten Indium-111 ist offenbart. Verknüpfung des aromatischen Rings an die EDTA/DTPA- Gruppierungen erfolgt durch einen Acetatrest. Früher offenbarten Hunt et al. in den US-Patenten 4,088,747 und 4,091,088 (1978) Chelatbildner auf Basis von Ethylendiamindiessigsäure (EDDA), wobei eine Verknüpfung eines aromatischen Rings an die EDDA-Gruppierung durch einen Alkylen- oder Acetatrest erfolgt. Es wird gelehrt, daß die Verbindungen als Chelate zum Untersuchen der Gallenfunktion nützlich sind. Das bevorzugte Metall ist Technetium-99m. Indium-111 und Indium-113 werden ebenfalls als geeignete Radionuklide für bilderzeugende Verfahren gelehrt.
  • Martell et al. offenbaren in Inorganica Chemica Acta 138, 215- 230 (1987) einen Eisenchelatbildner zum Behandeln von Cooley- Anämie. Die verwendeten Liganden waren EDTA-Analoga mit Amino- und Carboxylatdonorgruppen oder mit zusätzlich vorhandenen Donorgruppen, wie etwa phenolische oder an Pyridinringen substituierte phenolische Gruppen; Aminophosphonsäure oder Estergruppen mit zusätzlichen Phenolat- und Aminodonoren; macrocyclische Polyamine mit Carboxylat- und/oder Phenolatdonorgruppen; Trishydroxamsäuren; Triskatechole und mehrzähnige Liganden mit koordinierenden Amidgruppen.
  • Die Entwicklung von Knochenmetastasen ist für einen Krebspatienten ein übliches und oftmals katastrophales Ereignis. Der Schmerz, Spontanbrüche, häufig neurologische Defizite und eine erzwungene Immobilität, die durch diese Metastasenläsionen verursacht werden, vermindern die Lebensqualität für den Krebspatienten erheblich. Die Anzahl der Patienten die einen metastatischen Verlauf der Krankheit erleiden ist hoch, da annähernd 50 % aller Patienten die an Brust-, Lungen- oder Prostatakarzinomen leiden, schließlich Knochenmetastasen entwickeln. Knochenmetastasen werden ebenso bei Patienten mit Nieren-, Schilddrüsen-, Blasen-, Cervixkarzinom und anderen Tumoren beobachtet und zusammengenommen stellen diese weniger als 20 % der Patienten dar, die Knochenmetastasen entwickeln. Knochenmetastasenkrebs ist selten lebensbedrohlich und manchmal leben Patienten jahrelang nach der Entdeckung der Knochenläsionen. Anfangs drehen sich Behandlungsziele um Schmerzlinderung, Verringerung der Bedürfnisse für eine narkotisierende Medikation und steigende ambulante Behandlung. Klarerweise wird gehofft, daß manche der Krebserkrankungen geheilt werden können.
  • Die Verwendung von Radionukliden zur Behandlung von Krebsmetastasen im Knochen geht auf die frühen 50-iger Jahre zurück. Es wurde vorgeschlagen, ein radioaktives Partikelemitierendes Nuklid, in einer geeigneten Form zur Behandlung kalzifizierter Läsionen zu injizieren. Es ist erwünscht, daß derartige Nuklide im Bereich der Knochenläsion konzentriert werden, wobei minimale Mengen das Weichgewebe und normalen Knochen erreichen. Verbindungen mit radioaktivem Phosphor (P- 32 und P-33) wurden vorgeschlagen, aber die nuklearen und Biolokalisierungseigenschaften schränken die Nützlichkeit derartiger Verbindungen ein. [Kaplan, E., et al., J. Nuc. Med 1(1), 1, (1960), (US-Patent 3,965,254)].
  • Ein weiterer Versuch, Knochenkrebs zu behandeln wurde unternommen unter Verwendung von Phosphorverbindungen, die einen Bor-Rest enthalten. Die Verbindungen wurden in den Körper injiziert (intravenös) und akkumulierten im Skelettsystem. Der Behandlungsbereich wurde dann mit Neutronen bestrahlt um das Bor zu aktivieren und eine therapeutische Bestrahlungsdosis zu ergeben (US-Patent 4,399,817).
  • In den oben genannten Verfahren ist es nicht möglich dem Tumor ohne eine beträchtliche Schädigung der normalen Gewebe therapeutische Dosen zu verabreichen. In vielen Fällen, insbesondere bei metastatischen Knochenläsionen hat sich der Tumor über das Skelettsystem verbreitet und Amputation oder Bestrahlung ist nicht praktisch anwendbar (Seminars in Nuclear Medicine IX(2), April 1979).
  • Die Verwendung von mit einem Diphosphonat komplexierten Re-186 wurde ebenfalls vorgeschlagen [Mathieu, L. et al., Int.J.App.Rad. & Isot. 30, 725-727 (1979); Weinenger, J., Ketring, A.R., et al., J.Nuc.Med. 24(5), 125, (1983)]. Die für diesen Komplex erforderliche Herstellung und Reinigung begrenzt jedoch seine Nützlichkeit und weitverbreitete Anwendung.
  • Strontium-89 wurde ebenso für Patienten mit metastatischen Knochenläsionen vorgeschlagen. Die lange Halbwertszeit (50,4 Tage), hohe Blutwerte und niedrige Verhältnisse von Läsion zu normalem Knochen können jedoch nachteilig sein. [Firusian, N., Mellin, P., Schmidt, C.G., The Journal of Urology, 116, 764, (1976); Schmidt, C.G., Firusian, N., Int.J. Clin. Pharmacol., 93, 199-205, (1974)].
  • Eine lindernde Behandlung von Knochenmetastasen, die I-131 markiertes α-Amino-(3-jod-4-hydroxybenzyliden) diphosphonat verwendete wurde berichtet. Die Verwendung von Radiojod als therapeutisches Radionuklid ist aufgrund der wohlbekannten Tendenz von Jod sich in der Schilddrüse anzureichern, weniger als wünschenswert. Eisenhut führt Jod als einen der möglichen Metaboliten dieser Verbindung auf. Zusätzlich stellt alles I- 131, das aus der Jodierungsreaktion übriggeblieben ist und im Waschverfahren nicht abgetrennt wurde, auch eine Bedrohung der Schilddrüse dar.
  • Es ist bekannt, daß Aminocarbonsäuren Metallionen komplexieren. Insbesondere stabile Chelate werden mit Metallen der Erdalkah- und Übergangsmetallreihe gebildet.
  • Die EP-A 0 068 875 offenbart einen fluoreszierenden Chelatkomplex, umfassend ein Lanthanidenmetall und einen Chelatbildner, welcher Chelatbildner Aminocarbonsäuren in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfaßt. Der Chelatbildner enthält einen Anteil, der ein Triplettsensibilisierungsmittel ist, mit einer Triplettenergie größer als der des Lanthanidenmetalls und mit mindestens zwei Heteroatom-enthaltenden Gruppen, die Koordinationskomplexe mit Lanthanidenmetallen bilden und mit einer dritten Heteroatomenthaltenden Gruppe oder einem Heteroatom in oder angehängt an das Triplett-Sensibilisierungsmittel. Markierte physiologisch aktive Materialien, wie etwa markierte Antigene, Haptene, Antikörper und Hormone, umfassend die daran adsorbierten oder gebundenen fluoreszierenden Markierungen werden ebenfalls beschrieben.
  • O'Mara et al., (J.Nuc.Med.10, 49-51, 1969) haben Seltenerdkomplexe von Aminocarbonsäuren bei Verhältnissen von Chelatbildner zu Metall von 10:1 hergestellt. Sie stellen gute Eigenschaften im Skelett fest und schlagen deren Verwendung als diagnostische Mittel für das Skelett vor. Zusätzlich zur hohen Aufnahme im Knochen wurden hohe Strahlungsmengen in Muskel und/oder Leber beobachtet. Von den ausgewerteten Seltenerdnukliden wurden Sm-153 und Er-171 als die mit den am besten geeigneten Eigenschaften für bilderzeugende Verfahren in Menschen aufgeführt. Die Nützlichkeit dieser Mittel zur Therapie wird jedoch nicht vorgeschlagen.
  • Rosoff, B. et al., Int.J.App.Rad.and Isot. 14, 129-135 (1963) offenbaren Komplexe von EDTA und NTA mit bestimmten Radionukliden, nämlich Sc-46, Y-91, La-140 und Sm-153. Die Beziehung der Stabilitätskonstanten dieser Komplexe zur Ausscheidung im Harn ist gezeigt. Molare Verhältnisse von Chelatbildner zu Metall von 5:1 wurden verwendet und hohe Konzentrationen an Radioaktivität wurden in Leber, Milz, Niere, Lunge und Knochen beobachtet.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf neue Chelatbildner gerichtet, die Ortho-Ligationsfunktionalität besitzen, welcher Chelatbildner Komplexe mit Metallen ausbildet, insbesondere mit "radioaktiven" Metallen mit einer Chemie vom Seltenerdtyp. Bevorzugte radioaktive Metalle umfassen Samarium-153 (¹&sup5;³Sm) Holmium-166 (¹&sup6;&sup6;Ho), Yttrium-90 (&sup9;&sup0;y), Promethium-149 (¹&sup4;&sup9;Pm) Gadolinium-159 (¹&sup5;&sup9;Gd), Lanthan-140 (¹&sup4;&sup0;La), Lutetium-177 (¹&sup7;&sup7;Lu), Ytterbium-175 (¹&sup7;&sup5;Yb), Scandium-47 (&sup4;&sup7;Sc) und Praseodym-142 (¹&sup4;²Pr). Die so gebildeten Komplexe können selbst verwendet werden oder können mit einem Antikörper oder einem Fragment davon verbunden werden und zu therapeutischen und/oder diagnostischen Zwecken verwendet werden. Die Komplexe und/oder Konjugate können für in vivo oder in vitro Verwendungen formuliert werden. Bevorzugte Verwendungen der formulierten Konjugate ist die Behandlung von Krebs in Tieren, insbesondere in Menschen.
  • Zusätzlich können bestimmte der Chelatbildner-Radionuklid- Komplexe wirksam verwendet werden in Zusammensetzungen, die als therapeutische und/oder diagnostische Mittel für kalzifizierte Tumore nützlich sind und/oder in Zusammensetzungen, die als therapeutische Mittel zur Linderung von Knochenschmerzen nützlich sind.
  • Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf Verbindungen gerichtet, die die Formel aufweisen:
  • worin Z' Wasserstoff, NH&sub2;, NO&sub2;, NHC(O)CH&sub3;, N(R')&sub2; darstellt,
  • wobei R' Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub3; Alkyl darstellt;
  • X Wasserstoff, C&sub1;-C&sub3; Alkyl oder CR&sub3;R&sub4;COOH darstellt;
  • worin R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, CO&sub2;H oder eine C&sub1;-C&sub3; Alkylgruppe darstellen;
  • R'&sub1; und R'&sub2; jeweils Wasserstoff oder COOH darstellen, unter der Voraussetzung, daß mindestens eines COOH darstellt;
  • R'&sub3;, R'&sub4;, R'&sub5; und R'&sub6; unabhängig Wasserstoff oder CR&sub3;R&sub4;COOH darstellen, unter der Voraussetzung, daß mindestens drei CR&sub3;R&sub4;COOH darstellen; oder
  • ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
  • Die vorliegende Erfindung ist auch auf radioaktive Metallionenkomplexe gerichtet, insbesondere auf radioaktive Metallionenkomplexe vom Seltenerdtyp und auf Konjugate, die mit den vorstehend genannten Komplexen und Antikörper oder Antikörperfragmenten gebildet werden. Zusätzlich umfaßt die vorliegende Erfindung auch Formulierungen mit den Komplexen aus Chelatbildner-Radionuklid und/oder den Konjugaten der Erfindung und einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Typischerweise liegt der pharmazeutisch verträgliche Träger in diesen Formulierungen in flüssiger Form vor. Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Diagnose oder Behandlung eines Krankheitszustands, insbesondere von Krebs, in einem Säugetier durch die Verabreichung einer wirksamen Menge der Formulierung an das Säugetier.
  • Wie hierin verwendet, haben die folgenden angegeben Begriffe diese Bedeutungen:
  • "Synthetische Linker" umfassen alle synthetischen, organischen oder anorganischen Linker, die fähig sind kovalent an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gebunden zu werden. Bevorzugte synthetische Linker sind biologisch abbaubare synthetische Linker, die im Serum eines Patienten stabil sind, aber die eine Möglichkeit zur enzymatischen Spaltung innerhalb eines Clearance-Organs für das Radioisotrop haben, z.B. biologisch abbaubare Peptide oder Peptid-enthaltende Gruppen.
  • Der Begriff "C&sub1;-C&sub3;"-Alkyl umfaßt Methyl, Ethyl, n-Propyl und Isopropyl.
  • Die Begriffe "lineares oder verzweigtes Amin oder Polyalkylenamin" bedeuten geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppierungen, die mindestens ein, und üblicherweise mehr als ein Stickstoffatom enthalten.
  • Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff "Säugetier" Tiere, die ihre Nachkommen mit Milch, die aus Milchdrüsen abgeschieden wird, ernähren, bevorzugt warmblütige Säugetiere, stärker bevorzugt Menschen.
  • "Antikörper" bezeichnet jeden polyklonalen, monoklonalen, chimären Antikörper oder Heteroantikörper, bevorzugt einen monoklonalen Antikörper; "Antikörperfragment" umfaßt Fab- Fragmente und F(ab')&sub2;-Fragmente und jeden Teil eines Antikörpers mit einer gegen ein erwünschtes Epitop oder gegen erwünschte Epitope gerichteten Spezifität Wenn der Begriff "radioaktives Metallchelat/Antikörperkonjugat" oder "Konjugat" verwendet wird, ist gemeint, daß der "Antikörper" ganze Antikörper und/oder Antikörperfragmente, einschließlich semisynthetischer oder genetisch konstruierter Varianten davon, umfaßt. Bevorzugte Antikörper sind CC-49 und Antikörperfragmente, wie etwa Fab und F(ab')&sub2;. Andere mögliche Antikörper sind CC-83 und B72.3. Die Hybridomzellinie B72.3 ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt mit der Hinterlegungsnummer ATCC HB 8108. Die anderen monoklonalen Antikörper aus Maus binden an Epitope von TAG-72, einem Tumor-assoziierten Antigen.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet "radioaktiver Metallkomplex" oder "Komplex" einen Komplex der Verbindung der Erfindung, z.B. der Förmel 1, die mit einem Metallion vom Seltenerdtyp komplexiert ist, insbesondere einem radioaktiven Metallion vom Seltenerdtyp, wobei mindestens ein Metallion komplexiert oder maskiert ist; "radioaktives Metallionenchelat/Antikörperkonjugat" oder "radioaktives Metallionenkonjugat" bezeichnet ein radioaktives Metallionenkonjugat das kovalent an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gebunden ist; "radioaktiv" bezeichnet, wenn in Verbindung mit dem Wort "Metallion" verwendet, ein oder mehrere Isotope der Elemente vom Seltenerdtyp, die Teilchen und/oder Photonen emitieren, wie etwa ¹&sup5;³Sm, ¹&sup6;&sup6;Ho, &sup9;&sup0;Y, ¹&sup4;&sup9;Pm, ¹&sup5;&sup9;Gd, ¹&sup4;&sup0;La, ¹&sup7;&sup7;Lu, ¹&sup7;&sup5;Yb, &sup4;&sup7;Sc und ¹&sup4;²Pr. Die Begriffe "bifunktioneller Koordinator", "bifunktioneller Chelatbildner" und "funktionalisierter Chelatbildner" werden austauschbar verwendet und bezeichnen Verbindungen mit einer chelatbildenden Gruppierung, die fähig ist ein Metallion zu komplexieren und eine kovalent an die Chelatbildnergruppierung gebundene Linker/Spacergruppierung, die in der Lage ist als ein Mittel zur kovalenten Verknüpfung an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment zu dienen.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet "pharmazeutisch verträgliches Salz" jedes Salz einer Verbindung der Formel (I) das in ausreichender Weise nicht toxisch ist um zur Therapie oder Diagnose in Säugetieren geeignet zu sein. Somit sind die Salze gemäß dieser Erfindung geeignet. Vertreter derartiger Salze, die durch Standardreaktionen aus sowohl organischen als auch anorganischen Quellen gebildet werden umfassen beispielsweise Schwefel-, Salz-, Phosphor-, Essig-, Bernstein-, Zitronen-, Milch-, Malein-, Fumar-, Palmitin-, Chol-, Pamoa-, Mucin-, Glutamin-, d-Kampfer-, Glutar-, Glykol-, Phthal-, Wein-, Ameisen-, Laurin-, Stearin-, Salicyl-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Sorbin-, Picrin-, Benzoe-, Zimtsäuren und andere geeignete Säuren. Ebenso umfaßt werden Salze, die durch Standardreaktionen von sowohl organischen als auch anorganischen Quellen gebildet werden, wie etwa Ammonium, Alkalimetallionen, Erdalkalimetallionen und andere ähnliche Ionen. Insbesondere bevorzugt sind die Salze der Verbindungen nach Formel (I), wobei das Salz Kalium, Natrium, Ammonium oder Gemische davon ist.
  • Die hierin beschriebenen (durch Formel I dargestellten) bifunktionellen Chelatbildner können verwendet werden, um Metallionen vom Seltenerdtyp, insbesondere radioaktive Metallionen vom Seltenerdtyp zu komplexieren oder zu maskieren um Metallionenchelate (hierin ebenfalls als "Komplexe" bezeichnet) zu bilden. Die Komplexe können an funktionalisierte Träger gebunden werden, wie etwa funktionalisierte polymere Träger oder bevorzugt an Antikörper oder Antikörperfragmente kovalent gebunden werden. Die hierin beschriebenen Komplexe können somit kovalent an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gebunden werden und werden hierin als "Konjugate" bezeichnet.
  • Die Antikörper oder Antikörperfragmente, die in den hierin beschriebenen Konjugaten verwendet werden können, können durch in der Technik gut bekannte Verfahren hergestellt werden. Hochspezifische monoklonale Antikörper können durch in der Technik gut bekannte Hybridisierungsverfahren hergestellt werden, siehe z.B. Kohler und Milstein [Natur 256, 495-497 (1975) und Eur. J. Immunol. 6, 511-519 (1976)]. Derartige Antikörper besitzen üblicherweise eine hochspezifische Reaktivität. In den radioaktiven Metallionenkonjugaten, die durch Antikörper zielgerichtet sind, können Antikörper verwendet werden, die gegen jedes erwünschte Antigen oder Hapten gerichtet sind. Bevorzugt sind die, in den radioaktiven Metallionenkonjugaten verwendeten Antikörper monoklonale Antikörper oder Fragmente davon mit hoher Spezifität für ein gewünschtes Epitop, bzw. gewünschte Epitope. Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können beispielsweise gegen Tumore, Bakterien, Pilze, Viren, Parasiten, Mycoplasmen, Differentiations- und andere Zellmembranantigene, pathogene Oberflächenantigene, Toxine, Enzyme, Allergene, Medikamente und alle biologisch aktiven Moleküle gerichtet sein. Einige Beispiele für Antikörper oder Antikörperfragmente sind CC-11, CC-15, CC-30, CC-46, CC-49 F(ab')&sub2;, CC-49, CC-83, CC-83 F(ab')&sub2;, CC-92 und B72.3. [Siehe D. Colcher et al., Cancer Res. 48, 4597-4603 (15. August 1988) bezüglich der CC-49, CC-83 und B72.3 Antikörper] . Die folgenden CC-Antikörper wurden bei ATCC wie folgt hinterlegt: CC-11 als HB 9455; CC-15 als HB 9460; CC-30 als HB 9457; CC-46 als HB 9458; CC-49 als HB 9459; CC-83 als HB 9453 und CC-92 als HB 9454. B72.3 wurde bei ATCC als HB 8108 hinterlegt. Eine vollständigere Liste von Antigenen kann im US-Patent 4,193,983 aufgefunden werden. Die radioaktiven Metallionenchelat/Antikörper-Konjugate der vorliegenden Erfindung sind insbesondere bevorzugt für die Diagnose und Behandlung verschiedener Krebserkrankungen.
  • Die bevorzugten Komplexe der vorliegenden Erfindung vom Seltenerdtyp (Lanthanide oder Pseudo-Lanthanide) werden dargestellt durch die Formel
  • C [Ln (BFC)]
  • wobei: Ln ein Seltenerdmetallion (Lanthanid) ist, wie etwa Ce³&spplus;, Pr³&spplus;, Nd³&spplus;, Pm³&spplus;, Sm³&spplus;, Eu³&spplus;, Gd³&spplus;, Tb³&spplus;, Dy³&spplus;, Ho³&spplus;, Er³&spplus;, Tm³&spplus;, Yb³&spplus; und Lu³&spplus; oder ein Pseudo-Lanthanidenmetallion, wie etwa Sc³&spplus;, Y³&spplus; und La³&spplus;, BFC einen bifunktionellen Chelatbildner darstellt und C ein pharmazeutisch verträgliches Ion oder eine Ionengruppe ausreichender Ladung darstellt, um den Gesamtkomplex neutral zu machen. Falls der BFC vier oder mehr negativ geladene Gruppierungen enthält, dann ist C ein Kation oder eine Gruppe von Kationen, wie etwa H+, Li&spplus;, Na&spplus;, K&spplus;, Rb&spplus;, Cs&spplus;, Mg²&spplus;, Ca²&spplus;, Sr²&spplus;, Ba²&spplus;, Ra²&spplus;, NH&sup4;&spplus;, N (CH&sub3;)&sub4;&spplus;, N(C&sub2;H&sub5;)&sub4;&spplus;, N (C&sub3;H&sub7;)&sub4;&spplus;, N(C&sub4;H&sub9;)&sub4;&spplus;, As(C&sub6;H&sub5;)&sub4;&spplus;, [(C&sub6;H&sub5;)&sub3;P=]&sub2;N&spplus; und andere protonierte Amine. Falls der BFC drei negativ geladene Gruppierungen enhält, dann ist C nicht erforderlich. Falls der BFC zwei negativ geladene Gruppierungen enthält, dann ist C ein Anion, wie etwa F&supmin;, Cl&supmin;, Br&supmin;, I&supmin;, ClO&sub4;&supmin;, BF&sub4;&supmin;, H&sub2;PO&sub4;&supmin;, HCO&sub3;&supmin;, HCO&sub2;&supmin;, CH&sub3;SO&sub3;&supmin;, H&sub3;C-C&sub6;H&sub4;-SO&sub3;&supmin;, PF&sub6;&supmin;, CH&sub3;CO&sub2; und B(C&sub6;H&sub5;)&sub4;&supmin;.
  • Diese Erfindung wird mit einem physiologisch verträglichen Träger, Arzneimittelträger oder Vehikel dafür verwendet. Die Methoden zum Herstellen derartiger Formulierungen sind gut bekannt. Die Formulierungen können in der Form einer Suspension, injizierbaren Lösung oder anderer geeigneter Formulierungen vorliegen. Physiologisch verträgliche Suspendierungsmedien, mit oder ohne Adjuvantien, können verwendet werden.
  • Eine "wirksame Menge" der Formulierung wird zur Therapie verwendet. Die Dosis wird in Abhängigkeit von der behandelten Krankheit variieren. Obwohl in vitro Diagnostik mit den Formulierungen dieser Erfindung durchgeführt werden kann, wird in vivo Diagnostik unter Verwenden der Formulierungen dieser Erfindung ebenfalls erwogen. Die Konjugate und Formulierungen dieser Erfindung können auch in radioimmun-gelenkter Chirurgie (RIGS) verwendet werden, andere Metalle, die für diesen Zweck verwendet werden könnten, umfassen jedoch auch 99mTc, ¹¹¹In, 113nIn, &sup6;&sup7;Ga und &sup6;&sup8;Ga.
  • Wenn die Chelatbildner-Radionuklid-Komplexe dieser Erfindung zur Behandlung von Knochenkrebs verwendet werden sollen, müssen bestimmte Kriterien erfüllt werden. Obwohl die Eigenschaften des Radionuklids wichtig sind, sind die Gesamteigenschaften der den Radionuklid-Chelatbildner-Komplex enthaltenden Zusammensetzung der bestimmende Faktor. Die Nachteile irgendeiner Eigenschaft können durch die Überlegenheit einer oder mehrerer der Eigenschaften von entweder Ligand oder Radionuklid aufgewogen werden und ihre Kombination, wie in der Zusammensetzung verwendet, muß als Ganzes in Betracht gezogen werden.
  • Das folgende ist eine Diskussion derjenigen Kritieren, die beim Auswählen einer bestimmten Kombination (d.h. eines Komplexes) von Radionuklid und Ligand, die in den Zusammensetzungen der Erfindung verwendet wird, berücksichtigt werden müssen. Wenn in der Abwesenheit eines angemessenen Überschusses der in der Erfindung verwendeten Liganden verwendet, können Radionuklid-Chelatbildner-Komplexe therapeutisch nicht nützlich oder unwirksam sein.
  • Es gibt daher einen Bedarf für Zusammensetzungen, welche die folgenden Kriterien aufweisen, durch die es möglich ist, therapeutische Strahlungsdosen zu kalzifizierten Tumoren zu liefern, bei minimalen Dosen für Weichgewebe.
  • Das Radionuklid muß bevorzugt zum Knochen anstatt zum Weichgewebe geliefert werden. Insbesondere ist eine Aufnahme in entweder Leber oder Blut unerwünscht.
  • Das Radionuklid sollte schnell aus Nicht-Knochengewebe geklärt werden, um eine nicht notwendige Schädigung derartiger Gewebe zu vermeiden, z.B. sollte es schnell aus Blut geklärt werden.
  • Die vorgeschlagene Verwendung mancher der Zusammensetzungen dieser Erfindung ist die therapeutische Behandlung kalzifizierter Tumore in Tieren. Wie hierin verwendet, umfaßt der Begriff "kalzifizierte Tumore" primäre Tumore, bei denen das Skelettsystem die erste befallene Stelle ist, und metastatischen Knochenkrebs, bei dem sich die Geschwulstbildung von anderen Primärstellen, wie etwa Prostata und Brust, in das Skelettsystem ausbreitet. Diese Erfindung stellt ein Mittel bereit zum Lindern von Schmerz und/oder zum Vermindern der Größe und/oder zum Hemmen des Wachsens und/oder der Verbreitung oder zum Verursachen einer Rückbildung und/oder Zerstörung der kalzifizierten Tumore durch Anliefern einer therapeutischen Strahlungsdosis.
  • Die Zusammensetzung kann als eine Einzeldosis oder als Mehrfachdosen über einen längeren Zeitraum verabreicht werden. Die Anlieferung des Radionuklids zum Tumor muß in ausreichenden Mengen geschehen, um die oben angeführten Vorteile bereitzustellen.
  • Andere Verwendungen mancher der Chelatbildner der vorliegenden Erfindung können die Entfernung unerwünschter Metalle (z.B. Eisen) aus dem Körper, Bilderzeugung über magnetische Resonanz, Bindung an polymere Träger für verschiedene Zwecke, z.B. als Diagnostikmittel, und Entfernung von Lanthanidmetallionen oder Pseudo-Lanthanidmetallionen durch selektive Extraktion umfassen. Zusätzlich können die zur Anlieferung von Radionukliden an kalzifizierte Stellen verwendeten Metall-Ligand-Komplexe Nützlichkeit bei der Abtragung von Knochenmark (z.B. bei Knochenmarktransplantaten) haben.
  • Radionuklide können auf verschiedene Arten hergestellt werden. In einem Kernreaktor wird ein Nuklid mit Neutronen beschossen um ein Radionuklid zu erhalten, z.B.
  • Sm-152 + Neutron Sm-153 + Gamma
  • Ein anderes Verfahren zum Erhalten von Radionukliden besteht darin, Nuklide mit Teilchen zu beschiessen, die von einem Linearbeschleuniger oder einem Cyclotron erzeugt werden. Eine nochmals andere Art ist es, das Radionuklid aus einem Gemisch von Spaltprodukten zu isolieren. Das Verfahren zum Erhalten der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nuklide ist dafür nicht kritisch.
  • Die hierin offenbarten Chelatbildner können nach in der Technik gut bekannten Verfahren hergestellt werden. Siehe somit z.B. Chelating Agents and Metal Chelates, Dwyer & Mellor, Academic Press (1964), Kapitel 7. Siehe auch Verfahren zum Herstellen von Aminosäuren in Synthetic Production and Utilization of Amino Acids (herausgegeben von Kameko et al.) John Wiley & Sons (1974).
  • Beispiele mancher der Verfahren, die verwendet werden können, um die Chelatbildner der Formel I herzustellen sind:
  • A) Umsetzen einer Verbindung der Formel
  • wobei: Z' die in Formel (I) angegebene Bedeutung hat,
  • X Wasserstoff ist;
  • R&sub5; Wasserstoff oder ein lineares oder verzweigtes Amin oder Polyalkylenamin darstellt, bei dem mindestens einer der Aminwasserstoffe mit einer CR&sub3;R&sub4;CO&sub2;H-Gruppe substituiert worden ist; oder
  • ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon;
  • mit einer Verbindung B und einem Aldehyd oder einem Aldehyd- Vorläufer Äquivalent, wobei B ein lineares oder verzweigtes Amin oder Polyalkylenamin darstellt, bei dem mindestens ein Aminwasserstoff vorhanden ist;
  • in der Anwesenheit von Alkali und von einem geeigneten Lösungsmittel, bei einer Temperatur von 20ºC oder weniger, gefolgt von Erhitzen und Abtrennen des gewünschten Produkts der Formel I;
  • B) Umsetzen des aus Schritt (A) erhaltenen Produkts mit einer Halogen-(CR&sub1;R&sub2;)nCR&sub3;R&sub4;-Säure bei einem pH von 9 oder höher in Gegenwart von Alkali bei einer Temperatur von 20ºC oder weniger, um die Verbindungen der Formel I bereitzustellen, bei denen mindestens einer aus R'&sub1; und R'&sub2; CO&sub2;H ist;
  • C) Hydrolysieren des Produkts aus Schritt (B), bei dem Z NHC(O)CH&sub3; ist mit NaOH in H&sub2;O, um die Produkte der Formel I bereitzustellen, wobei Z' NH&sub2; ist;
  • D) Umsetzen des aus Schritt (A) erhaltenen Produkts mit Glycolnitril in Alkali, bei einem pH von 9 oder höher, bei einer Temperatur von 20ºC oder weniger, gefolgt von Hydrolyse der Cyangruppe mit HCl in H&sub2;O, um die Produkte der Formel I bereitzustellen, wobei mindestens einer aus R'&sub1; und R'&sub2; CO&sub2;H ist;
  • E) Hydrolysieren des Produkts aus Schritt (A), bei dem Z NHC(O)CH&sub3; ist mit DCl in D&sub2;O unter Erwärmen, um die Produkte der Formel I bereitzustellen, wobei Z' NH&sub2; ist;
  • Die Reaktionsbedingungen und Reagenzien für die verschiedenen obigen Schritte sind wie folgt. Wenn die Temperatur "20ºC oder weniger" beträgt, wird dies üblicherweise durch Verwendung eines Eis/Wasserbades erreicht. "Erhitzen" wird entweder bei Rückfluß oder überhalb Raumtemperatur durchgeführt. Das bevorzugte "Alkali" ist Natriumhydroxid, aber jede geeignete Base, die in der Lage ist, den gewünschten pH ohne nachteilige Wirkung auf das in der Reaktion gebildete Produkt aufrechtzuerhalten ist geeignet. Ein "geeignetes Lösungsmittel" ist inert und sorgt für Löslichkeit der Reaktanten, Beispiele derartiger Lösungsmittel sind Wasser und Alkohole, wie etwa Methanol. Das gewünschte Produkt kann durch jedes herkömmliche Verfahren, beispielsweise durch Präzipitation aus einem Lösungsmittel, wie etwa Aceton, abgetrennt werden.
  • Die Komplexe nach Formel I, II oder III werden durch herkömmliche Verfahren hergestellt, z.B. durch Umsetzen des Chelatbildners mit dem Metall unter Bedingungen, so daß das Metall vom Chelatbildner maskiert wird. Der Chelatbildner ist häufig im Überschuß zum Metall vorhanden.
  • Die Konjugate nach Formel I werden durch herkömmliche Verfahren hergestellt, z.B. durch kovalentes Verbinden des Komplexes mit einem Antikörper oder einem Antikörperfragment.
  • Die Erfindung wird durch Betrachtung der folgenden Beispiele weiter klar gemacht werden, die als rein beispielhaft für die Verwendung der Erfindung gedacht sind. Strukturen von Verbindungen in Bezug auf die angegebene allgemeine Formel sind in Tabelle 1 gezeigt.
    • Herstellung von Ausgangsmaterialien Beispiel A HERSTELLUNG VON UNSYMMETRISCHER ETHYLENDIAMINDIESSIGSÄURE
  • Deionisiertes Wasser (60,6 g), 98 % N-Acetylethylendiamin (20,4 g, 0,2 Mol) und Bromessigsäure (55,7 g, 0,40 Mol) wurden in ein Reaktionsgefäß gegeben und in einem Eiswasserbad gekühlt. Der pH des Gemisches wurde unter Rühren mit 25 % Natriumhydroxidlösung auf annähernd 8,1 eingestellt. Die Temperatur des Gemisches wurde während der Alkalizugabe bei weniger als 20ºC gehalten. Das Eiswasserbad wurde entfernt und der pH durch die Zugabe von 25 % Natriumhydroxidlösung zwischen 7 und 8 gehalten. Die Temperatur wurde durch periodisches Kühlen mit einem Eiswasserbad auf weniger als 37ºC geregelt. Das Reaktionsgemisch wurde gerührt und wie oben annähernd 31 Stunden gehalten und dann in einen Rundkolben transferiert, der mit einem wassergekühlten Rückflußkühler, Magnetrührfisch, Thermometer, Zugabetrichter und einem Heizmantel ausgestattet war. Natriumhydroxidlösung (40,1 g einer 50 %-igen Lösung) wurde zugegeben und das Gemisch unter Rühren annähernd 15 Stunden unter Rückfluß erhitzt, und dann gekühlt und unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Vakuum filtriert. Das Filtrat wurde (unter Verwendung von deionisiertem Wasser) quantitativ in ein Becherglas transferiert und in einem Eisbad auf weniger als 25ºC gekühlt. Deionisiertes Wasser (100 ml) wurde unter Rühren zugefügt und der pH mit konzentrierter Salzsäure auf annähernd 4 eingestellt, während die Temperatur bei weniger als 25ºC gehalten wurde. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Vakuum filtriert. Annähernd 1200 ml Ethanol wurden in einem großen Becherglas vorgelegt und mit einem Magnetrührfisch gerührt. Das obige Filtrat wurde unter gründlichem Mischen zu dem Ethanol zugegeben. Es bildet sich ein öliges Material, das sich allmählich in einen weißen Feststoff umwandelt. Das Rühren wurde für 2 Stunden fortgesetzt, zu welchem Zeitpunkt die Feststoffe durch Filtrieren unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Vakuum gesammelt wurden. Die Feststoffe wurden durch Aussetzen an Luft für etwa 1,5 Stunden trocknen gelassen und dann in einen Vakuumofen gegeben und bei 55 bis 60ºC für mehrere Stunden getrocknet. Annähernd 42,9 g weiße Feststoffe, die anorganische Salze enthielten, wurden gesammelt und durch Protonen- und Kohlenstoff-NMR als unsymmetrische Ethylendiamindiessigsäure identifiziert.
    • Beispiel B HERSTELLUNG VON 2-OXO-1-PIPERAZINESSIGSÄURE, LACTAM VON ETHYLENDIAMINDIESSIGSÄURE
  • Deionisiertes Wasser (150 g), 25,0 g (0,14 Mol) symmetrische Ethylendiamindiessigsäure und 28 g konzentrierte Salzsäure wurden in einen mit einem Thermometer, Temperaturregler, wassergekühlten Rückflußkühler und Heizmantel ausgestatteten Rundkolben gegeben. Das Gemisch wurde mit einem Magnetrührfisch gerührt und vier Stunden unter Rückfluß erhitzt und gekühlt. Die Bestandteile wurden unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Vakuum abfiltriert. Der pH des Filtrats wurde mit 50 % Natriumhydroxidlösung auf annähernd 1,5 eingestellt und es wurde mit einer mittleren Glasfilternutsche unter Verwendung von Vakuum filtriert. Der pH des Filtrats wurde mit 50 % Natriumhydroxidlösung auf etwa 5 eingestellt und die flüchtigen Stoffe bei einer Temperatur von 60 bis 70ºC (in vacuo) entfernt. Die Feststoffe wurden mehrere Stunden in einem Vakuumofen bei 55 bis 60ºC getrocknet. Das Lactam von symmetrischer Ethylendiamindiessigsäure wurde durch Protonen- und Kohlenstoff-NMR bestätigt.
    • Beispiel C HERSTELLUNG VON 2-OXO-1,4- PIPERAZINDIESSIGSÄURE; LACTAM VON ETHYLENDIAMINTRIESSIGSÄURE
  • Annähernd 40,8 g nach dem Verfahren von Beispiel B hergestellter 2-Oxo-1-piperazinessigsäure und 70 g deionisiertes Wasser wurden in ein Becherglas gegeben und mehrere Stunden mit einem Magnetrührfisch gerührt. Die Bestandteile wurden unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Vakuum filtriert. Das Filtrat und 20,0 g Bromessigsäure wurden in ein Becherglas gegeben und gerührt, bis die gesamte Bromessigsäure aufgelöst war. Der pH wurde mit 25 % Natriumhydroxidlösung auf annähernd 7 eingestellt. Die Temperatur wurde während der Alkalizugabe durch Kühlen in einem Eiswasserbad auf weniger als 25ºC gehalten. Das Eiswasserbad wurde entfernt und das Gemisch wurde annähernd 4 bis 5 Stunden bei annähernd 35ºC rühren gelassen, während der pH durch die periodische Zugabe von 25 % Natriumhydroxidlösung bei etwa 7 gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mehrere Stunden stehengelassen und dann (in vacuo) auf ein Gewicht von annähernd 90 bis 100 g eingeengt und unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Vakuum filtriert. Flüchtige Stoffe wurden aus dem Filtrat bei einer Temperatur von 55 bis 60ºC (in vacuo) entfernt und das Material mehrere Stunden in einem Vakuumofen bei 55 bis 60ºC getrocknet. Das Lactam von Ethylendiamintriessigsäure wurde durch Protonen- und Kohlenstoff-NMR bestätigt.
    • Beispiel D HERSTELLUNG VON TRINATRIUMETHYLENDIAMINTRIESSIGSÄURE
  • Annähernd 44,5 g der nach dem Verfahren von Beispiel C hergestellten ungereinigten 2-Oxo-1,4-piperazindiessigsäure und 280 g deionisiertes Wasser wurden in ein Becherglas gegeben und gerührt, bis sich das Lactam aufgelöst hatte. Alkalilösung (110 g, 50 %) wurde unter Rühren zugegeben. Die Temperatur wurde durch Kühlen in einem Eisbad bei weniger als 25ºC gehalten. Durch Eintauchen von die Lösung enthaltenden Röhrchen in ein bei 87ºC gehaltenes Wasserbad wurde dann Hydrolyse erreicht. Nach 15 Minuten wurden die Lösungen entfernt und in einem Eiswasserbad gekühlt. Analyse durch Protonen- und Kohlenstoff-NMR bestätigte die Anwesenheit von Trinatriumethylendiamintriessigsäure im alkalischen Hydrolysemedium.
    • Beispiel E HERSTELLUNG VON 4-DIETHYLENTRIAMINESSIGSÄURE
  • Zu einem mit einem wassergekühlten Rückflußkühler, Magnetrührer und Thermometer ausgestatteten Kolben wurden 75,0 g Phthalsäureanhydrid, 350,5 g Essigsäure und 26,0 g Diethylentriamin gegeben. Das Gemisch wurde gerührt und 1,5 Stunden bei annähernd 116ºC erhitzt und dann gekühlt. Flüchtige Stoffe wurden unter Vakuum bei 65 bis 70ºC entfernt, bis ein Gewicht von 218 g erreicht war. Das Gemisch wurde unter Rühren in 600 g Ethanol gegossen. Nach zwei Stunden wurden die Feststoffe unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche abfiltriert. Die Feststoffe wurden zweimal mit 500 ml Ethanol gewaschen und dann in einem Vakuumofen bei 60 bis 65ºC getrocknet. Annähernd 66 g Material der Diphthaloylverbindung wurden gesammelt.
  • Der Ethylester der Diphthaloylverbindung wurde hergestellt durch Zugeben von 65,6 g der oben hergestellten Dipthaloylverbindung, 17,7 g Natriumcarbonat und 800 ml Ethanol in einen mit einem wassergekühlten Rückflußkühler, Zugabetrichter, mechanischem Rührer und einem Thermometer mit einem Temperaturregler ausgestatteten Kolben. Ethylbromacetat (51,0 g) wurde während eines Zeitraums von 15 Minuten zu dem gerührten Gemisch zugegeben und dann wurde 16 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Ethanol (200 ml) wurde durch Destillation unter Verwendung einer Dean-Stark-Destillationsfalle entfernt und das verbleibende Reaktionsgemisch durch die Zugabe von zerstoßenem Eis auf weniger als 5ºC gekühlt. Das Gemisch wurde weitere 5 Stunden in einem Eisbad gekühlt und unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche filtriert. Die Feststoffe wurden zweimal mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuumofen bei 65 bis 70ºC getrocknet. Annähernd 81 g Ethyl-1,7- diphthaloyl-4-diethylentriaminacetat wurden erhalten. In 30,32 g Wasser und 76,4 g konzentrierter Salzsäure wurden 20,1 g (0,045 Mol) Ethyl-1,7-diphthaloyl-4-diethylentriaminacetat unter Erhitzen auf 93ºC aufgelöst und das Gemisch 6,5 Stunden bei 93ºC gehalten. Das entstandene weiße Präzipitat wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das vereinte Filtrat wurde bei 60ºC unter Vakuum eingeengt, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde. NMR-Analyse deutete an, daß die Phthaloylgruppen nicht vollständig hydrolysiert waren. Die zwei Feststoffe wurden dann vereint und dann zu konzentrierter Salzsäure mit einer geringen Wassermenge zugefügt. Die Aufschlämmung wurde dann unter Rückfluß 6 Stunden erhitzt, auf Raumtemperatur gekühlt und filtriert, wobei 12,3 g Phthalsäure erhalten wurden. Das Filtrat wurde dann unter Vakuum eingedampft, wobei 13,9 g Produkt als gelber Feststoff erhalten wurden. Das Produkt wurde durch die Zugabe von 6 g 50 % Natriumhydroxid in Wasser aufgelöst und bei 100ºC mit aktivierter Aktivkohle behandelt, gefolgt von Filtration und Eindampfung unter Vakuum, wobei 15,2 g 4-Diethylentriaminessigsäure erhalten wurden.
    • Herstellung von Endprodukten Beispiel 1. HERSTELLUNG VON 2-[(2- {[BIS(CARBOXYMETHYL)]AMINO}ETHYL)AMINO]-2-(5-ACETAMIDO-2- HYDROXYPHENYL)-ETHANSÄURE (Vergleichsbeispiel)
  • Deionisiertes Wasser (10,3 g), 98 % 4-Acetamidophenol (15,1 g, 0,1 Mol), 50 % wäßrige Glyoxalsäure (14,8 g, 0,1 Mol) und Methanol (50,5 g) wurden in ein Becherglas gegeben und unter Verwendung eines Magnetrührfisches gemischt. Durch das Verfahren von Beispiel A hergestellte unsymmetrische Ethylendiamindiessigsäure (19,5 g) wurde zugefügt und das Gemisch in einem Eiswasserbad gekühlt. Der pH des Gemisches wurde unter Rühren mit 50 % Natriumhydroxidlösung auf annähernd 8,0 eingestellt. Die Temperatur des Gemisches wurde während der Alkalizugabe bei weniger als 20ºC gehalten. Das Eiswasserbad wurde entfernt und das Gemisch auf pH 8,7 eingestellt und annähernd 2 Stunden bei 25 bis 32ºC gerührt. Das Gemisch wurde in einen mit einem wassergekühlten Rückflußkühler, Magnetrührfisch, Thermometer und einem Heizmantel ausgestatteten Rundkolben transferiert. Das Gemisch wurde unter Rühren 8 Stunden bei 70ºC erhitzt und dann gekühlt, und unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Vakuum abfiltriert. Die Feststoffe wurden durch Aussetzen an Luft 7 Stunden trocknengelassen und dann in einen Vakuumofen gegeben und mehrere Stunden bei 55 bis 60ºC getrocknet. Annähernd 29,6 g Feststoffe wurden gesammelt. Das Material wurde dann mit annähernd 300 g Aceton bewegt und unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Hausvakuum abfiltriert. Die Feststoffe wurden nochmals mit zusätzlichen 300 g Aceton gewaschen, luftgetrocknet und dann 1 Stunde bei 55 bis 60ºC in einen Vakuumofen gegeben. Annähernd 26,7 g des Natriumsalzes von 2-[(2- {[Bis(carboxymethyl)]-amino}ethyl)amino]-2-(5-acetamido-2- hydroxyphenyl)ethansäure wurden gesammelt. Diese Feststoffe und 180 g deionisiertes Wasser wurden in ein Becherglas gegeben und mit einem Magnetrührfisch gerührt. Der pH wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 2,2 eingestellt, bei welchem Punkt die Säureform des Produkts aus der Lösung zu präzipitieren begann. Das Produkt wurde durch Filtration gesammelt und mit annähernd 150 g deionisiertem Wasser gewaschen. Das Produkt, 2-[(2-{[Bis(carboxymethyl)]- amino}ethyl)amino]-2-(5-acetamido-2-hydroxyphenyl)ethansäure, wurde mehrere Stunden in einem Vakuumofen bei 55 bis 60ºC getrocknet. Annähernd 14,2 g Produkt wurden erhalten. Protonen-NMR bestätigte die Struktur des Produkts. (Siehe Tabelle I).
    • Beispiel 2. HERSTELLUNG VON 2-[(2-{[BIS(CARBOXYMETHYL)]- AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)AMINO]-2-[5-ACETAMIDO-2- (CARBOXYMETHYLOXY)PHENYL]ETHANSÄURE (Vergleichsbeispiel)
  • Deionisiertes Wasser (4,5 g), Bromessigsäure (2,0 g) und 2- [(2-{[Bis(carboxymethyl)]-amino}ethyl)amino]-2-(5-acetamido-2- hydroxyphenyl)ethansäure (2,5 g), hergestellt durch das Verfahren von Beispiel 1, wurden in ein kleines Reaktionsgefäß gegeben und in einem Eiswasserbad gekühlt. Der pH des Gemisches wurde mit 25 % Natriumhydroxidlösung unter Rühren auf annähernd 9,3 eingestellt. Die Temperatur des Gemisches wurde während der Alkalizugabe bei weniger als 20ºC gehalten. Das Eiswasserbad wurde entfernt und das Gemisch wurde 48 Stunden bei einer Temperatur von 35 bis 40ºC rühren gelassen, während der pH durch die periodische Zugabe von 25 % Natriumhydroxidlösung zwischen 10,5 und 11,5 gehalten wurde.
  • Ein Teil des Reaktionsgemisches (10,2 g) wurde in ein Becherglas gegeben und mit einem Magnetrührfisch gerührt. Aceton (125 g) wurde während eines Zeitraums von 15 Minuten zu der Lösung zugefügt, was zur Präzipitation eines Öls führte. Der Acetonanteil wurde durch Dekantieren entfernt und weitere 50 g Aceton zu dem Präzipitat zugegeben, gemischt und die Acetonschicht entfernt. Das Öl wurde luftgetrocknet und dann in einem Vakuumofen etwa 2 Stunden bei 60 bis 65ºC getrocknet, wobei ein spröder gelber Feststoff erhalten wurde. Das Produkt wurde gereinigt durch Anionenaustausch-Chromatographie über Q-Sepharose von Pharmacia Inc. auf einer 15 mm x 500 mm Säule, wobei mit einem Gradienten von 0 bis 30 % Ameisensäure über 2 Stunden bei einer Rate von 3 ml/min eluiert wurde und Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden mittels UV- Absorption überwacht und die geeigneten Fraktionen vereint und lyophylisiert, um das erwünschte Produkte zu ergeben. (Siehe Tabelle I).
    • Beispiel 3. HERSTELLUNG VON 2-[(2-{[BIS(CARBOXYMETHYL)]- AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)AMINO]-2-[5-AMINO-2- (CARBOXYMETHYLOXY)PHENYL]ETHANSÄURE, PENTANATRIUMSALZ (Vergleichsbeispiel)
  • Annähernd 40 mg von durch das Verfahren von Beipiel 2 hergestellter 2-[(2-{[Bis(carboxymethyl)]- amino}ethyl)(carboxymethyl)amino]-2-[5-acetamido-2- (carboxymethyloxy)phenyl]ethansäure wurden in 700 µl D&sub2;O aufgelöst und mit NaOD/D&sub2;O auf pH 13 eingestellt. Hydrolyse der N-Acetylgruppe zur entsprechenden Anilinfunktionalität erfolgte bei Raumtemperatur und wurde von Protonen-NMR gefolgt, was die Struktur bestätigte (siehe Tabelle I).
    • Beispiel 4. HERSTELLUNG VON 2-[(2-{[BIS(CARBOXYMETHYL)]- AMINO}ETHYL)(CYANOMETHYL)AMINO]-2-(5-ACETAMIDO-2- HYDROXYPHENYL)ETHANSÄURE
  • Deionisiertes Wasser (3,1 g) und 2,5 g von nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellter 2-[(2-{[Bis(carboxymethyl)]- amino}ethyl)amino]-2-(5-acetamido-2-hydroxyphenyl)ethansäure wurden in ein kleines Glasgefäß gegeben und in einem Eiswasserbad gekühlt. Der pH wurde mit 25 % Natriumhydroxidlösung auf 9,8 bis 9,9 eingestellt. Die Temperatur des Gemisches wurde während der Alkalizugabe bei weniger als 20ºC gehalten. Das Eisbad wurde entfernt und 1,0 g einer wäßrigen, 40 % Glycolnitrillösung wurde unter Mischen zugefügt und der pH mit 25 % Natriumhydroxidlösung auf 9,9 bis 10,0 eingestellt. Das Gemisch wurde in einen mit einem einen Temperaturregler enthaltenen Thermometer, wassergekühlten Rückflußkühler und Heizmantel ausgestatteten kleinen Reaktionskolben gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem Magnetrührfisch gerührt und 8 Stunden bei 49 bis 50ºC erhitzt, gekühlt und 72 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Ein Teil des Reaktionsgemisches (8,5 g) wurde in ein Becherglas gegeben und mit einem Magnetrührfisch gerührt. Während eines Zeitraums von 10 Minuten wurde Aceton (146 g) zu der Lösung zugefügt, was zu der Präzipitation eines festen Materials führte. Der Acetonanteil wurde durch Dekantieren entfernt und weitere 50 g Aceton wurden zum Präzipitat zugefügt, gemischt und die Acetonschicht entfernt. Das Material wurde in einem Vakuumofen etwa 4 Stunden bei 60 bis 65ºC getrocknet. Annähernd 2,9 g Produkt wurden gesammelt. Protonen-NMR bestätigte das erwünschte Aminoacetonitrilderivat (siehe Tabelle I).
    • Beispiel 5. HERSTELLUNG VON 2-[(2-{[BIS(CARBOXYMETHYL)]- AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)AMINO]-2-(5-AMINO-2-HYDROXYPHENYL)ETHANSÄURE (Vergleichsbeispiel)
  • Annähernd 1,0 g von oben nach dem Verfahren von Beipiel 4 hergestellter 2-[(2-{[Bis(carboxymethyl)]amino}ethyl)(cyanomethyl)amino]-2-(5-acetamido-2-hydroxyphenyl)ethansäure wurden unter sauren Bedingungen hydrolysiert, um die Aminoacetonitrilfunktionalität in die entsprechende Acetatgruppe und die N-Acetylgruppe in die Anilingruppe zu überführen. Die Aminoacetonitrilverbindung, 2,2 g D&sub2;O und 7,8 g 20 % DCl wurden in ein Glasröhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde für insgesamt 33 Minuten in ein temperaturgeregeltes Wasserbad bei 88-89ºC gegeben und dann entfernt und gekühlt. Die Hydrolyse wurde mittels Protonen-NMR verfolgt. Die Lösung wurde dann gefriergetrocknet und lyophylisiert, wobei 1,3 g Feststoffe erhalten wurden. Das Produkt wurde durch Anionenaustausch (Q-Sepharose ) auf einer 15 mm x 500 mm Säule gereinigt, wobei mit einem Gradienten von 0 bis 1 M Essigsäure über 1 Stunde bei einer Rate von 3 ml/min eluiert wurde und 6 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden durch UV-Absorption überwacht und die geeigneten Fraktionen wurden vereint und lyophylisiert, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde (siehe Tabelle I).
    • Beispiel 6. HERSTELLUNG VON 2-[BIS(2-{[(BIS(CARBOXYMETHYL)]AMINO}ETHYL)AMINO]-2-[5-ACETAMIDO-2-(CARBOXYMETHYLOXY)PHENYL]ETHANSÄURE UND 2-[{2-[(2-{[BIS(CARBOXYMETHYL)]- AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)AMINO]ETHYL}(CARBOXYMETHYL)AMINO]- 2-[5-ACETAMIDO-2-(CARBOXYMETHYLOXY)-PHENYL]ETHANSÄURE (Vergleichsbeispiel)
  • Deionisiertes Wasser (24,8 g), 15,1 g (0,1 Mol) 98 % 4- Acetamidophenol und 14,8 g, 50 % wäßrige Glyoxalsäure (0,1 Mol) wurden in ein Becherglas gegeben und in einem Eiswasserbad gekühlt. Der pH des Gemisches wurde mit 25 % Natriumhydroxidlösung auf 3,3 eingestellt, während die Temperatur bei weniger als 20ºC gehalten wurde. DETA (9,8 g) wurde dann zugegeben. Die Temperatur wurde wiederum durch Kühlen in einem Eiswasserbad unterhalb von 20ºC gehalten. Der pH betrug nach Zugabe der DETA annähernd 10,2. Das Gemisch wurde in einen mit einem Thermometer, einem Temperaturregler, einem wassergekühlten Rückflußkühler und einem Heizmantel ausgestatteten Reaktionskolben transferiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem Magnetrührfisch gerührt und annähernd 7 Stunden bei 75ºC erhitzt und gekühlt. Aceton (1400 g) wurde in einem großen Becherglas vorgelegt und mit einem Magnetrührfisch gerührt. Annähernd 40 g der oben hergestellten Reaktionslösung wurde während eines Zeitraums von 10 Minuten zugegeben, was zur Präzipitation eines Feststoffes führte. Der Acetonanteil wurde durch Dekantieren entfernt und weitere 1460 g Aceton wurden zugegeben und der Feststoff unter Aceton verrieben und gründlich gemischt. Die Feststoffe wurden durch Filtrieren unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Vakuum zurückgewonnen. Die Feststoffe wurden mit reichlich Aceton gewaschen und dann mehrere Stunden in einem Vakuumofen bei einer Temperatur von 60 bis 65ºC getrocknet. Annähernd 7,8 g Feststoffe wurden gewonnen, wobei Protonen-NMR ein Gemisch der gewünschten Isomere der DETA-Verbindung zeigte.
  • Deionisiertes Wasser (5,3 g) und 4 g der oben isolierten Feststoffe wurden in ein Becherglas gegeben und mit einem Magnetrührfisch etwa 3 Stunden gerührt, zu welchem Zeitpunkt die Feststoffe vollständig aufgelöst waren. Bromessigsäure (10,1 g) wurde unter Rühren zugefügt und das Gemisch in einem Eiswasserbad gekühlt. Der pH des Gemisches wurde mit 25 % Natriumhydroxidlösung auf annähernd 11 eingestellt. Die Temperatur wurde während der Alkalizugabe bei weniger als 20ºC gehalten. Das Eiswasserbad wurde entfernt und das Gemisch wurde 50 Stunden bei einer Temperatur von 35 bis 40ºC rühren gelassen, während der pH durch die periodische Zugabe von 25 % Natriumhydroxidlösung zwischen annähernd 10,5 und 11,5 gehalten wurde. Aceton (240 g) wurde in einem Becherglas vorgelegt und mit einem Magnetrührfisch gerührt. Annähernd 5 g der Reaktionslösung wurde zum Aceton zugefügt, was zur Präzipitation eines Feststoffes führte. Der Acetonanteil wurde dekantiert und weitere 245 g Aceton zugefügt, gemischt und die Acetonschicht entfernt. Die Feststoffe wurden durch Abfiltrieren unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Vakuum gesammelt. Die Feststoffe wurden mit Aceton gewaschen und dann mehrere Stunden in einem Vakuumofen bei 55 bis 60ºC getrocknet. Annähernd 2,6 g Feststoffe wurden gesammelt. (Siehe Tabelle I).
    • Beipiel 7. HERSTELLUNG VON 2-[BIS(2- {[(BIS(CARBOXYMETHYL)]-AMINO}ETHYL)AMINO]-2-[5-AMINO-2- (CARBOXYMETHYLOXY)PHENYL]-ETHANSÄURE UND 2-[{2-[(2- {[BIS(CARBOXYMETHYL)]AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)AMINO]ETHYL}(CARBOXYMETHYL)AMINO]-2-[5-AMINO-2- (CARBOXYMETHYLOXY)PHENYL]ETHANSÄURE (Vergleichsbeipiel)
  • Annähernd 376 mg von nach dem Verfahren von Beispiel 6 hergestellter 2-[Bis(2-{[(bis(carboxymethyl)]amino}ethyl)amino]-2-[5-acetamido-2-(carboxymethyloxy)phenyl]ethansäure und 2-[{2-[(2-{[Bis(carboxymethyl)]amino}ethyl)(carboxymethyl)amino]ethyl}(carboxymethyl)amino]-2-[5-acetamido-2- (carboxymethyloxy)phenyl]ethansäure wurden in 1,0 g D&sub2;O aufgelöst und mit 5 Tropfen 37 % DCl behandelt. Die saure Lösung wurde dann 2 Stunden bei 80ºC erhitzt, nach welchem Zeitraum das Protonen-NMR-Spektrum darauf hindeutete, daß weitgehend alle der Acetanilidgruppen in Anilingruppen und Essigsäure überführt worden waren. Die Lösung wurde dann in einem Trockeneis-Acetonbad gefroren und über Nacht lyophylisiert, wobei das gewünschte Produkt als ein hellbrauner Feststoff erhalten wurde (siehe Tabelle I).
    • Beispiel 8. HERSTELLUNG VON 2-[{2-[(2-{[BIS(CARBOXYMETHYL)]AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)AMINO]ETHYL}(CARBOXYMETHYL) AMINO]-2-[5-AMINO-2-(CARBOXYMETHYLOXY)PHENYL]ETHANSÄURE (Vergleichsbeispiel)
  • In 40 ml Wasser wurden 8,0 g von nach dem Verfahren nach Beispiel E hergestellter 4-Diethylentriaminessigsäure aufgelöst und dann wurde das Gemisch in einem Eisbad gekühlt. Zu dieser gekühlten Lösung wurden 6,08 g (0,04 Mol) 4-Acetamidophenol und eine gekühlte Lösung von 5,95 g (0,04 Mol) einer 50 Gew.-%igen Glyoxalsäurelösung in Wasser zugefügt. Während diese Aufschlämmung mit einem Eisbad bei weniger als 20ºC gehalten wurde, wurde eine Menge von 2,5 ml von 50 Gew.-%-igem Natriumhydroxid zugefügt. Die entstandene Aufschlämmung bei einem pH von 8,75 wurde langsam auf 80ºC erhitzt, 4,5 Stunden unter Rühren bei dieser Temperatur gehalten, dann über Nacht abkühlen gelassen. Die Lösung wurde dann unter Vakuum auf etwa 25 ml Volumen eingeengt und zu 300 ml Aceton zugefügt. Das Aceton wurde von dem entstandenen Feststoff dekantiert. Der Feststoff wurde mehrere Male mit Aceton gewaschen und getrocknet, wobei 26,1 g Produkt als ein dunkler klebriger Feststoff erhalten wurden. Eine Menge von 26,05 g dieses Feststoffs wurde in 50 ml Wasser aufgelöst. In dieser Lösung wurden 26,7 g (0,192 Mol) Bromessigsäure aufgelöst. Die entstandene Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, der pH mit 50 Gew.-%-igem Natriumhydroxid auf 10,5 eingestellt, auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und dann auf 46ºC erhitzt. Für etwa 23 Stunden wurde die Temperatur bei 46ºC gehalten und der pH durch Zugabe von 50 Gew.-%-igem Natriumhydroxid bei 10,5 gehalten. Das Volumen wurde dann unter Vakuum auf 50 ml verringert. Die konzentrierte Lösung wurde unter heftigem Rühren zu 500 ml Aceton zugegeben und das entstehende Präzipitat absetzen gelassen. Das Aceton wurde dekantiert und weitere 400 ml Aceton wurden zugegeben, heftig gerührt und dann dekantiert. In der gleichen Weise wurde eine Schlußwaschung unter Verwendung von 100 ml Aceton durchgeführt. Der Feststoff wurde unter Vakuum getrocknet, wobei 52,55 g eines spröden braunen Feststoffs erhalten wurden. Eine 2,00 g Probe dieses braunen Feststoffs wurde in 20 ml Wasser aufgelöst und mit 1,48 g konzentrierter Salzsäure behandelt. Diese Lösung wurde bei 80ºC erhitzt bis die Analyse durch Protonen-NMR eine vollständige Hydrolyse der N- Acetylgruppierung andeutete. Die Lösung wurde dann gefriergetrocknet, wobei 2,13 g eines braunen Feststoffs, der das Titelprodukt enthielt, erhalten wurden. (Siehe Tabelle I).
    • Beispiel 9. HERSTELLUNG VON 2-[(2-[(2-[(2- {[BIS(CARBOXYMETHYL)]AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)AMINO]ETHYL) (CARBOXYMETHYL)AMINO]ETHYL)(CARBOXYMETHYL)AMINO]-2-[5- ACETAMIDO-2-(CARBOXYMETHYLOXY)PHENYL]ETHANSÄURE UND 2[(2-[(2- {[BIS(CARBOXYMETHYL)AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)AMINO]ETHYL)(2 -{[BIS(CARBOXYMETHYL)]AMINO}-ETHYL)AMINO]-2-[5-ACETAMIDO-2- (CARBOXYMETHYLOXY)PHENYL]-ETHANSÄURE. (Vergleichsbeispiel)
  • Deionisiertes Wasser (12,5 g), 98 %-iges 4-Acetamidophenol (7,6 g) und 50 %-ige wäßrige Glyoxalsäurelösung (7,4 g) wurden zu einem Becherglas gegeben und in einem Eiswasserbad gekühlt. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit 25 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 3,6 eingestellt, während die Temperatur auf weniger als 20ºC gehalten wurde. Lineares Triethylentetraamin (7,2 g) wurde zugegeben, während die Temperatur unter 20ºC gehalten wurde. Der pH-Wert nach Zugabe des Triethylentetraamins betrug ungefähr 10,6. Das Gemisch wurde in einen mit einem eine Temperatursteuerung enthaltenden Thermometer, einem wassergekühlten Rückflußkühler und einem Heizmantel ausgestatteten Reaktionskolben überführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem Magnetrührfisch gerührt und bei 80 bis 83ºC 4,5 Stunden erhitzt und abgekühlt. Aceton (175 g) wurde zu einem Becherglas gegeben und mit einem Magnetrührfisch gerührt. Ungefähr 12 g der Reaktionslösung wurden zugegeben was zur Präzipitation eines Öls führte. Der Acetonanteil wurde durch Dekantieren entfernt und weitere 175 g Aceton wurden zugegeben und das Rühren fortgesetzt. Der Acetonanteil wurde entfernt und der Niederschlag in einem Vakuumofen einige Stunden bei 60 bis 65ºC getrocknet. Ungefähr 3,1 g Feststoffe wurden gesammelt. Die Feststoffe wurden dann in 100 g Aceton aufgeschlämmt, sorgfältig gemischt und gefiltert unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Vakuum. Die Feststoffe wurden dann mit weitern 250 ml Aceton gewaschen und erneut in einem Vakuumofen bei 60 bis 65ºC für ungefähr vier Stunden getrocknet. Ungefähr 2,0 g eines Materials wurden erhalten, wobei das Proton-NMR das Vorliegen eines Gemisches der Triethylentetraamin-Isomere anzeigte.
  • Deionisiertes Wasser (2,0 g) und 1,86 g des obigen festen Produkts wurden zu einem Becherglas gegeben und eine Stunde gerührt, zu welcher Zeit die Feststoffe größtenteils gelöst warden. Bromessigsäure (5,0 g) wurde unter Rühren zugegeben und die Mischung in einem Eiswasserbad gekühlt. Der pH-Wert des Gemisches wurde auf ungefähr 10,5 eingestellt und 47 Stunden bei einer Temperatur von 35 bis 40ºC gehalten, während der pH zwischen 10,5 bis 11,5 durch die regelmäßige Zugabe von 25 %-iger Natriumhydroxidlösung gehalten wurde. Aceton (130 g) wurde zu einem Becherglas gegeben und mit einem Magnetrührfisch gerührt. Ungefähr 10,8 g der Reaktionslösung wurden zu dem Aceton zugegeben, was zur Präzipitation eines Feststoffes führte. Der Acetonanteil wurde dekantiert und weitere 150 g Aceton zu dem Niederschlag zugegeben, gemischt und die Acetonschicht entfernt. Die Feststoffe wurden in einem Vakuumofen bei 60 bis 65ºC einige Stunden getrocknet. Ungefähr 7,2 g Feststoffe wurden erhalten. (Siehe Tabelle I).
    • Beispiel 10. HERSTELLUNG VON 2,6-BIS{[BIS(CARBOXYMETHYL)AMINO](CARBOXY)METHYL}-4-(ACETAMIDO)PHENOL
  • Zu einem Becherglas wurden 38,6 g 98 %-iges 4-Acetamidophenol, 35,3 98 %-ige Iminodiessigsäure, 150 ml Methanol, 38,5 g einer 50 %-igen wäßrigen Glyoxylsäurelösung und 30 g deionisiertes Wasser gegeben. Das Gemisch wurde in einem Eiswasserbad gekühlt und der pH während des Mischens mit 50 %-iger Natriumhydroxidlösung auf ungefähr 9,4 eingestellt. Die Temperatur wurde während der Basenzugabe bei weniger als 30ºC gehalten. Das Gemisch wurde in einen Reaktionskolben ausgerüstet mit einem wassergekühlten Rückflußkühler, Thermometer und Heizmantel überführt. Das Reaktionsgemisch wurde auf ungefähr 74 bis 76ºC erhitzt und der pH-Wert überwacht und zwischen 8,7 bis 9,5 gehalten durch die regelmäßige Zugabe einer 50 %-igen Natriumhydroxidlösung. Das Gemisch wurde für insgesamt 18 Stunden erhitzt. Während dieser Zeit wurden ungefähr 40 g deionisiertes Wasser zugegeben. Nach Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch unter Verwendung einer mittleren Glasfritte und von Vakuum filtriert. Deionisiertes Wasser (75 g) wurde zu dem Filtrat zugegeben und das Methanol (in vacuo) bei Raumtemperatur (ungefähr 20 bis 25ºC) entfernt. Die Lösung wurde für einige Stunden stehengelassen und die ausgefallenen Feststoffe von der Lösung durch Filtern unter Verwendung einer mittleren Glasfilternutsche und von Vakuum entfernt. Ungefähr 30 g des Filtrats und 15 g Ethylether wurden sorgfältig gemischt und die Etherschicht dann abgetrennt. Der Vorgang wurde wiederholt, wobei nacheinander 15 g und 10 g Ethylether verwendet wurden. Die wäßrige Schicht wurde mit wäßriger Salzsäurelösung auf einen pH-Wert von ungefähr 0,5 eingestellt und flüchtige Stoffe bei einer Temperatur von 50 bis 55ºC entfernt (in vacuo). Ungefähr 13,5 g Feststoffe wurden gesammelt. Methanol (75 g) wurde zu den Feststoffen gegeben und die unlöslichen Salze durch Filtration entfernt. Methanol wurde entfernt (in vacuo) und die verbliebenen Feststoffe in einem Vakuumofen bei 70 bis 75ºC einige Stunden getrocknet. Das Produkt das immer noch etwas anorganisches Salz enthielt, wurde durch Proton-NMR analysiert und bestand überwiegend aus dem bis-substituierten Produkt. (Siehe Tabelle I).
    • Beispiel 11. HERSTELLUNG VON 2,6-BIS{[(2- {[BIS(CARBOXYMETHYL)]AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)]AMINOMETHYL}- 4-(ACETAMIDO)PHENOL (Vergleichsbeispiel)
  • Die durch das Verfahren von Beispiel D hergestellte alkalische Trinatriumethylendiamintriessigsäurelösung wurde in einem Eisbad gekühlt und unter Rühren wurde Salzsäure zugefügt, um einen pH von etwa 13,8 zu erhalten. Die Temperatur wurde während der Säurezugabe bei weniger als 35ºC gehalten. Flüchtige Stoffe wurden bei Raumtemperatur (in vacuo) bis zu einem Gewicht von 210 g entfernt. Die Feststoffe wurden durch Abfiltrieren auf einer mittleren Glasfilternutsche unter Verwendung von Vakuum entfernt. Das Filtrat wurde in einen mit einem wassergekühlten Rückflußkühler, Magnetrührfisch, Thermometer, Temperaturregler, Heizmantel und Zugabetrichter ausgestatteten 250 ml Rundkolben transferiert. Der pH wurde mit Salzsäure auf etwa 11 eingestellt. Die Temperatur wurde während der Säurezugabe bei weniger als 30ºC gehalten. Das Gemisch wurde auf annähernd 40ºC erhitzt und 11,6 g einer 37 %-igen wäßrigem Formaldehydlösung während eines Zeitraums von 35 Minuten aus dem Zugabetrichter zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 30 Minuten gerührt und erhitzt und dann abgekühlt. Die Lösung wurde mit 25 % Natriumhydroxidlösung auf einen pH von etwa 9,8 eingestellt und in einen Zugabetrichter transferiert. 10,3 g 98 %-iges 4- Acetamidophenol, 25,2 g deionisiertes Wasser und 9,5 g 25 % Natriumhydroxidlösung wurden in ein Becherglas gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, bis eine vollständige Auflösung erreicht war. Die Lösung wurde in einen wie oben beschrieben ausgestatteten Rundkolben transferiert und Erhitzen und Rühren begonnen. Das Gemisch wurde auf annähernd 65ºC erhitzt, zu welchem Zeitpunkt die oben hergestellte Formaldehydaddukt- Lösung während eines Zeitraums von annähernd 1 Stunde zugetropft wurde. Die Reaktion wurde weitere 12 Stunden gerührt und bei 65ºC erhitzt und dann abgekühlt. Aceton (150 g) wurde in einem Becherglas vorgelegt und mit einem Magnetrührfisch gerührt. Annähernd 10 g des Reaktions- Rohgemisches wurden zum Aceton zugegeben, was zur Präzipitation eines öligen Materials führte. Der Acetonanteil wurde dekantiert und weitere 150 g Aceton zum Präzipitat zugefügt, gemischt und die Acetonschicht entfernt. Das Material wurde mehrere Stunden in einem Vakuumofen bei 55 bis 60ºC getrocknet. Annähernd 3,1 g Feststoffe wurden gesammelt. Annähernd 165 mg der Feststoffe wurden in einer Minimalmenge Wasser aufgelöst und auf eine Q-Sepharose Säule (von Pharmacia Inc.) [1,5 cm x 50 cm Acetatform] geladen und unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 1 M Ammoniumacetat über 2 Stunden bei 2 ml/min eluiert. Die Absorption bei 300 nm wurde überwacht. Das Produkt war im dritten Hauptpeak enthalten. Dieser wurde isoliert und gefriergetrocknet, wobei 36,4 mg Feststoffe erhalten wurden, die durch Protonen- und Kohlenstoff-NMR und Fast Atom Bombardment (FAB, Beschuß mit hochbeschleunigten Atomen) Massenspektrometrie als 2,6- Bis{[(2{[bis(carboxymethyl)amino}ethyl)(carboxymethyl)]aminomethyl}-4-(acetamido)phenol charakterisiert. (Siehe Tabelle I).
    • Beispiel 12. HERSTELLUNG VON 2,6-BIS{[(2- {[BIS(CARBOXYMETHYL)]-AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)]AMINOMETHYL}-4-(AMINO)PHENOL (Vergleichsbeispiel)
  • Annähernd 264 mg von nach dem Verfahren von Beispiel 11 hergestelltem 2,6-Bis{[(2-{[bis(carboxymethyl)]amino}ethyl)(carboxymethyl)]aminomethyl}-4-(acetamido)phenol wurden in ein 5 mm NMR-Röhrchen gegeben und in einem Gemisch aus D&sub2;O (0,5 ml) und DCL (0,5 ml, 20 %) aufgelöst. Das NMR-Röhrchen wurde kurze Zeiträume in ein heißes Wasserbad (85ºC) gegeben, und der Reaktionsfortgang durch NMR überwacht (Verschwinden der Acetamidmethylprotonen und Erscheinen von Essigsäure). Nach 35 Minuten war die Reaktion abgeschlossen. Das Reaktionsgemisch wurde gefriergetrocknet, wobei das rohe Aminhydrochlorid als ein dunkler Feststoff erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde in einer Minimalmenge Wasser aufgelöst und auf eine Q-Sepharose Säule (1,5 cm x 50 cm, Acetatform) geladen und unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 1 M Ammoniumacetat über 3 Stunden bei 2 ml/min eluiert. Die Absorption bei 300 nm wurde beobachtet. Das Produkt war im dritten Hauptpeak enthalten. Dieser wurde isoliert und gefriergetrocknet, wobei ein blaß bernsteinfarbener Feststoff (122 mg) zurückblieb, der ein Gemisch aus dem erwünschten Aminprodukt und aus Ammoniumchlorid war. Das Produktgemisch wurde durch Protonen- und Kohlenstoff-NMR und Elementaranalyse charakterisiert. Das Salz-enthaltende Produkt (250 mg aus vereinten Chargen) wurde über Q-Sepharose (1,5 cm x 50 cm, Formiatform) unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 10 % Ameisensäure über 4 Stunden weiter gereinigt. Die Absorption bei 300 nm wurde beobachtet. Der erste Hauptpeak enthielt das erwünschte Produkt. Dieser wurde isoliert und gefriergetrocknet, wobei 8,3 mg eines weißen kristallförmigen Feststoffs erhalten wurden. Die Struktur wurde durch Protonen- und Kohlenstoff-NMR und Fast Atom Bombardment Massenspektrometrie bestätigt. (Siehe Tabelle I).
    • Beispiel 13. HERSTELLUNG VON 2,6-BIS{[(2-{[BIS(CARBOXYMETHYL)AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)]AMINOMETHYL}-4- (ISOTHIOCYANATO)PHENOL (Vergleichsbeispiel)
  • Durch das Verfahren von Beispiel 12 hergestelltes Produkt, das 2,6-bis{[(2-{[bis(carboxymethyl)]amino}ethyl)(carboxymethyl)]aminomethyl}-4-(amino)phenol und anorganisches Salz enthielt (208 mg, 15 % in NH&sub4;Cl), wurde in einer Minimalmenge Wasser aufgelöst und über eine Sephadex G-10 (Pharmacia, Inc.) Entsalzungsäule (1 cm x 35 cm) geleitet. Das salzfreie Amin wurde mit Wasser eluiert und gefriergetrocknet (11,5 mg). Das Amin wurde in Wasser (10 ml) gelöst und in einen Rundkolben gegeben. In Methylenchlorid (1 ml) gelöstes Thiophosgen (0,015 ml, 10 äq) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde dann mit mehreren Mengen Methylenchlorid gewaschen, um überschüssiges Thiophosgen zu entfernen und die wäßrige Schicht wurde gefriergetrocknet, wobei das Isothiocyanato-Rohprodukt erhalten wurde, das durch Fast Atom Bombardment Massenspektrometrie charakterisiert wurde. (Siehe Tabelle I).
    • Beispiel 14. HERSTELLUNG VON 2-({[BIS(CARBOXYMETHYL)]AMINO}METHYL)-4-(ACETAMIDO)PHENOL. (Vergleichsbeispiel)
  • Deionisiertes Wasser (35,3 g), 35,3 g 98 %-ige Iminodiessigsäure (0,25 Mol) und 29,9 g einer 50 %-igen wäßrigen Natriumhydroxidlösung wurden in einen Rundkolben eingewogen, der mit einem wassergekühlten Rückflußkühler, mechanischen Rührer, Thermometer mit Temperatursteuerung und einem Zugabetrichter ausgerüstet war. Das Gemisch wurde unter Rühren auf eine Temperatur von 55ºC erwärmt. Eine wäßrige 37 %-ige Formaldehydlösung (21,5 g) wurde in den Zugabetrichter gegeben und zu dem Reaktionskolben über eine Zeitdauer von 15 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 55ºC ungefähr 45 Minuten erwärmt, abgekühlt und in einen Zugabetrichter überführt. Zu einem Rundkolben, ausgestattet wie oben, wurden 38,7 g (0,25 Mol) 98 %-iges 4- Acetamidophenol, 35,3 g deionisiertes Wasser und 12,2 g einer 50 %-igen wäßrigen Natriumhydroxidlösung zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren auf eine Temperatur von ungefährt 65ºC erwärmt und die Formaldehyd-Iminodiessigsäure- Adduktlösung über eine Zeitdauer von 30 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 65ºC weitere 12 Stunden erwärmt und abgekühlt. Konzentrierte Salzsäure (55,5 g) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch eine Stunde gerührt. Die Lösung wurde einige Wochen stehengelassen und dann wurde der kristalline Niederschlag filtriert, mit deionisiertem Wasser gewaschen und in einem Vakuumofen bei 65ºC einige Stunden getrocknet. Ungefähr 17,4 g Feststoffe wurden erhalten. Die Struktur wurde durch Proton-NMR bestätigt. (Siehe Tabelle I).
    • Beispiel 15. HERSTELLUNG VON 2-({[BIS(CARBOXYMETHYL)]- AMINO}METHYL)-6-{[({[BIS(CARBOXYMETHYL)]AMINO}ETHYL)(CARBOXYMETHYL)AMINO]METHYL}-4-(ACETAMIDO)PHENOL. (Vergleichsbeispiel)
  • Ungefähr 5,7 g ungereinigte 2-Oxo-1,4-piperazindiessigsäure, hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel C und 38,6 g deionisiertes Wasser wurden zu einem Becherglas gegeben und gemischt bis Auflösung des Lactams erreicht wurde. Eine Alkalilösung (13,5 g einer 50 %-igen Lösung von Natriumhydroxid) wurde zugegeben, während die Temperatur bei weniger als 30ºC durch Kühlen in einem Eiswasserbad gehalten wurde. Die Lösung wurde dann in ein Glasröhrchen überführt und für 10 Minuten in ein 90ºC Wasserbad eingetaucht und dann in einem Eiswasserbad gekühlt. Die Umwandlung des Lactams zu dem Trinatriumsalz von Ethylendiamintriessigsäure wurde durch Protonen-NMR bestätigt. Die alkalische Lösung wurde dann auf einen pH von ungefähr 11,9 durch die Zugabe von Salzsäure eingestellt. Die Temperatur wurde bei weniger als 25ºC durch Kühlen in einem Eiswasserbad gehalten. Die Lösung wurde in ein Reaktionsgefäß überführt und 1,5 g einer wäßrigen 37 %igen Formaldehydlösung Tropfen für Tropfen über eine Zeitdauer von 20 Minuten zugegeben. Eine kleine Menge wäßriger Alkalilösung wurde ebenfalls während dieser Zeit zur pH-Einstellung zugegeben. Das Gemisch wurde eine weitere Stunde gerührt mit regelmäßigen Zugaben von wäßrigen Natriumhydroxid um den pH zwischen 11,0 bis 11,5 zu halten.
  • Zu einem getrennten Reaktionsgefäß wurden 1,5 g 2-({[Bis(carboxymethyl]amino}methyl)-4-(acetamido)phenol, hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 12 und 2,5 g deionisiertes Wasser zugegeben. Wäßriges 25 %-iges Natriumhydroxid wurde unter Kühlen in einem Eisbad zugegeben, um einen pH von ungefähr 11 zu erhalten. Die obige hergestellte Formaldehydaddukt-Lösung wurde dann über eine Zeitdauer von 30 Minuten zu der phenolischen Verbindung bei einer Temperatur von ungefähr 30ºC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde gemischt und für weitere 10 Stunden bei 70ºC erwärmt und dann abgekühlt. Aceton (100 g) wurden in einem Becherglas vorgelegt und mit einem Magnetrührfisch gerührt. Ungefähr 10 g des rohen Reaktionsgemisches wurden zu dem Aceton gegeben, was zur Präzipitation eines gummiartigen Materials führte. Der Acetonanteil wurde dekantiert und weitere 50 g Aceton zu dem Material zugegeben und das Produkt mit Aceton verrieben. Die Acetonschicht wurde durch Dekantieren entfernt und die Feststoffe in einem Vakuumofen bei 60 bis 65ºC einige Stunden getrocknet. Das gewünschte Produkt wurde aus dem rohen Gemisch durch Leiten einer wäßrigen Lösung der Feststoffe über eine Q- Sepharose -Säule und Isolieren der gewünschten Fraktion wie in Beispiel 11 isoliert. (Siehe Tabelle I).
    • Beispiel 16. HERSTELLUNG VON N,N'-DI(2-HYDROXY, 5- ACETAMIDOBENZYL)ETHYLENDIAMIN-N,N'-DIESSIGSÄURE (Vergleichsbeispiel)
  • Ethylendiamin-N,N'-diessigsäure (10 g, 0,056 Mol), 25 g deionisiertes Wasser, 7,0 g 50 % Natriumhydroxidlösung und 5,0 g Methanol wurden in einen mit einem wassergekühlten Rückflußkühler, mechanischen Rührer, Thermometer mit Temperaturregler und einem Zugabetrichter ausgestatteten Rundkolben gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 55ºC erhitzt. Wäßrige 37 %-ige Formaldehydlösung (9,2 g, 0,11 Mol) wurde in den Zugabetrichter eingewogen und während eines Zeitraums von 20 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 55ºC erhitzt und dann gekühlt und in einen anderen Zugabetrichter transferiert. In einem wie oben ausgestatteten Reaktionskolben wurden 17,2 g 4-Acetamidophenol (0,11 Mol), 36 g deionisiertes Wasser, 2,0 g 50 % Natriumhydroxidlösung und 36 g Methanol vorgelegt. Das Gemisch wurde auf 65ºC erhitzt und die wäßrige Formaldehyd/Ethylendiamin-N,N'-diessigsäureadduktlösung wurde über einen Zeitraum von 1 Stunde und 15 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 12 Stunden bei 64 bis 65ºC erhitzt und dann abgekühlt. Ein Teil des Reaktionsprodukts wurde eingeengt und das Methanol unter Vakuum entfernt. Die Lösung wurde mit Salzsäure auf einen pH von 1,5 bis 2,0 eingestellt, was zur Präzipitation des Acetylprodukts führte. Das Material wurde filtriert, mit deionisiertem Wasser gewaschen und mehrere Stunden in einem Vakuumofen bei 55 bis 60ºC getrocknet. Die Struktur wurde durch Protonen-NMR bestätigt.
    • Beispiel 17. HERSTELLUNG VON N,N'-DI(2-HYDROXY-5- AMINOBENZYL)ETHYLENDIAMIN-N,N'-DIESSIGSÄURE, HYDROCHLORID (Vergleichsbeispiel)
  • Zu annähernd 0,9 g des in Beispiel U isolierten Produkts wurden 12,5 g deionisiertes Wasser und 8 g konzentrierte Salzsäure zugegeben. Die Lösung wurde in einem Rundkolben 1 Stunde unter Rückfluß erhitzt und gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden (in vacuo) entfernt und das Aminhydrochloridprodukt mehrere Stunden in einem Vakuumofen bei 50 bis 60ºC getrocknet. Die Struktur wurde durch Protonen- NMR bestätigt.
    • Beispiel 18. HERSTELLUNG VON ETHYLENDIAMINDI[(2-HYDROXY-5- ACETAMIDOPHENYL)ESSIGSÄURE] (Vergleichsbeispiel)
  • Wäßrige (50 %) Glyoxalsäure (30,0 g, 0,20 Mol), 98 % 4-Acetamidophenol (30,9 g, 0,20 Mol) und deionisiertes Wasser (22 g) wurden in einen mit einem wassergekühlten Rückflußkühler, mechanischen Rührer und einem Thermometer mit einem Temperaturregler ausgestatteten Rundkolben gegeben. Der Kolben wurde mittels eines Eiswasserbades gekühlt und 19,0 g 50 % Natriumhydroxidlösung wurden langsam unter Rühren zugegeben, während die Temperatur unterhalb von 30ºC gehalten wurde. Ethylendiamin (6,1 g, 0,10 Mol) wurde bei einer Temperatur von weniger als 30ºC zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch erhitzt und 5 Stunden bei 85 bis 86ºC gerührt. Annähernd 20 g des wäßrigen Reaktionsprodukts wurden mit 10 g Ethylether behandelt. Die Etherschicht wurde entfernt und das Vorgehen nochmals wiederholt. Der wäßrige Teil wurde dann mit Salzsäure auf einen pH von annähernd 4,2 eingestellt und mit 35 g Aceton bewegt. Die Acetonschicht wurde entfernt und verworfen. Zum verbleibenden Material wurden unter Rühren 65 g Methanol zugegeben. Die entstandenen Feststoffe wurden abfiltriert und mehrere Stunden in einem Vakuumofen bei 55 bis 60ºC getrocknet.
    • Beispiel 19. HERSTELLUNG VON ETHYLENDIAMINDI[(2-HYDROXY-5- AMINOPHENYL)ESSIGSÄURE] (Vergleichsbeispiel)
  • Zu annähernd 4,5 g der obigen Feststoffe wurden 6 g deionisiertes Wasser und 21 g konzentrierte Salzsäure zugegeben. Das Gemisch wurde filtriert und 6 g Wasser zugegeben. Die Lösung wurde in einen mit einem wassergekühlten Rückflußkühler, mechanischen Rührer und einem Thermometer ausgestatteten Rundkolben gegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde bei 100 bis 103ºC erhitzt und dann abgekühlt. Die flüchtigen Stoffe wurden in vacuo entfernt und das Produkt, das Hydrochlorid von Ethylendiamindi(2-hydroxy-5- aminophenyl)essigsäure, wurde mehrere Stunden in einem Vakuumofen bei 60ºC getrocknet. Hydrolyse der Acetylfunktionalität wurde mittels Protonen-NMR verfolgt.
    • KOMPLEXHERSTELLUNG UND BESTIMMUNG DES KOMPLEX-PROZENTSATZES
  • In den folgenden Beispielen wurden die folgenden Begriffe verwendet: konz. bedeutet konzentriert; OAc bedeutet die Acetatgruppierung, OCOCH&sub3;; TLC bedeutet Dünnschichtchromatographie; Umgebungstemperatur bedeutet Raumtemperatur oder etwa 20 bis 25ºC; über Nacht bedeutet von etwa 9 bis 18 Stunden; SP-Sephadex C-25 Harz ist ein Kationenaustauschharz mit Sulfonsäurefunktionalität, vertrieben von Pharmacia, Inc.
  • Die Yttrium- und/oder Samariumkomplexe mehrerer der Verbindungen wurden hergestellt und der Komplexierungs- Prozentsatz wie folgt bestimmt:
    • Yttriumkomplex-Herstellung:
  • Komplexe wurden hergestellt durch Herstellen einer 0,0003 M Yttriumlösung in Wasser. (YCl&sub3; 6H&sub2;O, 303,26 g/Mol; Y(OAc)&sub3;, 12,1 % H&sub2;O). Radioaktives YCl&sub3; (Oakridge National Laboratories) wurde zugegeben, um die erwünschte Anzahl Zählimpulse zu ergeben. 10 µl Ligandenlösung (bei 0,03 M) wurden zu 990 µl der Y-Lösung zugegeben, um ein Ligand zu Metallverhältnis von 1:1 zu ergeben. (Die zehnfache Menge von Ligandenlösung wurde verwendet für ein Verhältnis von Ligand zu Metall von 10:1). Der pH wurde unter Verwendung von Mikrolitermengen von Salzsäure oder Natriumhydroxid auf 7,4 eingestellt. Die Lösung wurde dann unter Verwendung des unten angegebenen Kationenaustauschverfahrens auf die Menge an komplexiertem Yttrium untersucht.
    • Bestimmung des Komplex-Prozentsatzes:
  • Eine 10 ml Wegwerf-Plastiksäule (Biorad) wurde mit 1 bis 2 ml wassergequollenem Sephadex C-25 Kationenaustauschharz gefüllt. Das Wasser wurde an die Oberseite des Harzes druckeluiert. 15 µl des Komplexes (oder mehr, falls die Zählimpulse niedrig waren) wurden an der Oberseite des Harzes zugegeben. Dies wurde gefolgt von 2 ml einer 4:1 (V:V) Lösung von isotonischer Salzlösung:konz. Ammoniumhydroxid als ein Eluent, die in ein Zählröhrchen tropfengelassen wurde. Dies wurde ebenso an die Oberseite des Harzes druckeluiert. Weitere 2 ml des Eluenten wurden zugefügt und die Säule druckeluiert, um alle Flüssigkeit zu entfernen. Das getrocknete Harz wurde dann in ein drittes Zählröhrchen gegeben und die drei Röhrchen unter Verwendung eines mit einem Computer verbundenen Canberra Multikanalanalyzers in einem NaI-Zähler mit Probenkanal gezählt. Der Komplex-Prozentsatz wurde bestimmt durch Teilen der Anzahl von Zählimpulsen in den zwei Elutionen durch die Gesamtzahl von Zählimpulsen in den Elutionen plus in der Säule, jeweils mal 100. Bei diesem Verfahren verblieb nichtkomplexiertes Yttrium in der Säule.
    • Samariumkomplex-Herstellung/Bestimmung des Komplex- Prozentsatzes:
  • Samariumkomplexe wurden hergestellt, wie vorstehend für Yttriumkomplexe beschrieben, außer daß 0,0003 M Samarium hergestellt wurde durch Auflösung von Sm&sub2;O&sub3; (348,7 g/Mol) in 0,1 M Salzsäure. Radioaktives Sm-153 wurde als eine 0,0003 M Lösung in 0,1 M Salzsäure vom University of Missouri Research Reactor, Columbia, Missouri erhalten. Die Bestimmung des Komplex-Prozentsatzes wurde in der gleichen Weise wie für den Yttriumkomplex durchgeführt. Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt. Tabelle II Komplexierungsdaten***
  • *Ligand/Metallverhältnis betrug ungefähr 1:1;
  • ** Ligand/Metallverhältnis betrug ungefähr 50:1;
  • *** Komplexbeispiel Nr. 30 ist gemäß der Erfindung, wogegen Komplexbeispiel Nr. 20 bis 29 und 31 bis 37 Vergleichsbeispiele darstellen.
    • Beispiel VIII und Vergleichsbeispiele I-VII und IX-XXI IN VIVO REIHENUNTERSUCHUNG BIFUNKTIONELLER CHELATE
  • Die Stabilität bestimmter Seltenerdchelate wurde mit in vivo Untersuchungen in Tieren korreliert. Zum Beispiel berichten Rosoff et al. im International Journal of Applied Radiation and Isotopes, 14, 129-135 (1963) über die Verteilung radioaktiver Seltenerd-Chelate in Mäusen für bestimmte Aminocarbonsäuren. Die festgestellte Korrelation war, daß in vivo "die Kompetition zwischen dem Chelatbildner und Körperbestandteilen (anorganisch und organisch) um das Seltenerd-Ion seine Ablagerung und Ausscheidung bestimmt". Es wird angenommen, daß die starken Seltenerd-Chelate sehr wenig disoziieren und ausgeschieden werden können, während die schwachen Chelate und Chelate einer mittleren Stärke leichter disoziieren und demnach in Organen wie der Leber abgelagert werden. Die Konzentration von Radionuklid in der Leber ist jedoch nicht immer auf schwache Komplexbildung zurückzuführen, sondern sie ist in manchen Fällen auf die Affinität zurückzuführen, die das Metallchelat für die Leber hat (siehe Vergleichsbeispiele XVI und XVII in Tabelle III). Tatsächlich wurden Verbindungen hergestellt und zur Auswertung von Leberfunktionen verwendet (Fritzberg, Alan R., Radiopharmaceuticals: Progress and Clinical Perspectives 1, (1986); US-Patente 4,088,747 und 4,091,088 (Hunt et al.)).
  • Die Bioverteilung verschiedener der hierin offenbarten Samarium- und/oder Yttriumchelate wurde bestimmt und der Dosis-Prozentsatz in der Leber als ein in vivo Reihenuntersuchungsverfahren verwendet, um die Stabilität der Chelate qualitativ abzuschätzen. NTA- und EDTA-Chelate werden zum Vergleich eingeschlossen. Ebenso wurde Samarium als Samariumchlorid in nicht-chelierter Form injiziert.
  • Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 150 bis 200 g wurden von Charles River Laboratories erworben. Diese Tiere wurden in Käfige gegeben und mit Wasser und Nahrung ad libitum gefüttert. Die Tiere wurden vor Verwendung mindestens 5 Tage akklimatisiert. Vor Injektion des Komplexes wurden die Tiere unter eine Heizlampe gegeben (15 bis 30 Minuten), um die Schwanzvene zu erweitern. Dann wurde das Tier in einen Festhaltekäfig gegeben, der Schwanz mit einem Alkoholtupfer gereinigt und dem Tier über die Schwanzvene die Injektion (15 bis 200 µl) verabreicht. Nach der Injektion wurde das Tier zwei Stunden in einen anderen Käfig gegeben, wonach das Tier durch cervikale Dislokation geopfert wurde. Das Tier wurde dann seziert, die Teile mit deionisiertem H&sub2;O gespült, trockengetupft und in ein tariertes Zählröhrchen eingewogen. Für jede Injektionsmenge wurden mindestens drei Standards desselben Materials hergestellt und mit den Tierteilen gezählt. Dosis-Prozentsatz ist die Anzahl von Zählimpulsen im Organ geteilt durch die Anzahl von Zählimpulsen im Standard mal 100 (siehe Tabelle III). Tabelle III Bioverteilungsdaten**
  • * Die Komplexe wurden bei Ligand/Metallverhältnissen von 10:1 für Beispiele I-XI, XIII und XV; bei 1:1 für Beispiel XII & XIV; bei 5:1 für Beispiel XVIII und bei ungefähr 300:1 für Beispiele XIX und XX hergestellt.
  • ** Das biologische Beispiel Nr. VIII ist ein Beispiel der Erfindung; Nr. I-VII und IX-XXI sind zum Vergleich angegeben.
    • BEISPIELE VON BIOVERTEILUNGSDATEN
  • Komplexe wurden hergestellt durch Mischen einer Lösung von Ligand und Metall wonach der pH auf 7 bis 8 eingestellt wurde. Die Menge des an Ligand komplexierten Metalls wurde durch Kationenaustauschchromatographie bestimmt. Freies Metall wurde durch das Harz zurückgehalten, Metall in der Form eines Komplexes nicht.
  • 100 µl der Komplexe wurden in die Schwanzvene von drei Sprague Dawley Ratten injiziert. Zwei Stunden nach der Injektion wurden die Ratten durch Verrenken des Rückgrats getötet und Gewebsproben wurden entnommen. Die Gewebe wurden gewogen und die Strahlungsmenge in jedem Gewebe durch Messen der Zahl der Impulse unter Verwendung eines NaI-Sondenzählers und Vergleich zu Standards bestimmt. Die Prozentdosis in Blut wurde bestimmt unter der Annahme, daß das Gewicht von Blut 6,5 % des Tiergewichts betrug. Muskel wurde berechnet unter Verwendung von 46 % des Körpergewichts. Die Menge in Knochen war 25 mal die Prozentdosis in einem Oberschenkelknochen. Die unten stehenden Beispiele unterscheiden sich in dem verwendeten Liganden, der verwendeten Menge an Liganden und der verwendeten Menge an Metall. Nicht-radioaktives Metall wurde verwendet, um die erwünschten Ligand zu Metallverhältnisse zu erhalten und als Tracer wurde radioaktives Metall verwendet, um die Bioverteilung zu erhalten.
    • BEISPIEL XXII
  • Der Ligand von Beispiel 10 wurde mit einer Sm-153 Lösung gemischt. Die Konzentration von Sm betrug 3x10&supmin;&sup4;M und der Ligand wurde mit einem 300-fachen molaren Überschuß verwendet. Die Bioverteilung zeigte 52,7 % im Knochen, 0,12 % in der Leber, 0,005 % in der Milz, 0,23 % im Muskel und 0,05 % im Blut.
    • BEISPIEL XXIII
  • Der Ligand von Beispiel 10 wurde mit Ho-166 komplexiert. Die Konzentration an Ho betrug 3x10&supmin;&sup4;M und die Formulierung enthielt den 300-fachen molaren Überschuß an Ligand. Die Bioverteilung zeigte 52,9 % im Knochen, 0,26 % in der Leber, 0,007 % in der Milz, 1,1 % im Muskel und 0,09 % im Blut.
    • BEISPIEL XXIV
  • Der Ligand von Beispiel 10 wurde mit Sm-153 komplexiert unter Verwendung einer Konzentration von Sm von 3x10&supmin;&sup4;M und dem 10- fachen molaren Überschuß an Ligand. Die Bioverteilung zeigte 48,5 % im Knochen, 1,3 % in der Leber, 0,01 % in der Milz, 0,73 % im Muskel und 0,18 % im Blut.
    • BEISPIEL XXV
  • Ein Kaninchen wurde in der gleichen Weise wie die Ratten mit einer Formulierung injiziert, die Y-90 mit Y bei 3x10&supmin;&sup4;M und den Liganden von Beispiel 10 bei 10-fachem molaren Überschuß aufwies. Es wurde gefunden, daß die Aktivität sich im Knochen (59 %) konzentrierte, wobei Leber (1,1 %), Milz (0,19 %), Muskel (1,5 %) und Blut (0,68 %) minimale Aufnahme zeigten.
    • BEISPIEL XXVI
  • Der Ligand von Beispiel 1 wurde komplexiert unter Verwendung von Y-90 als Tracer. Die Y-Konzentration betrug 3x10&supmin;&sup4;M und der Ligand wurde in einem 10-fachen molaren Überschuß zugegeben. Die Bioverteilung in Ratte (Mittel von zwei Ratten) zeigte 56,1 % im Knochen, 0,87 % in der Leber, 0,03 % in der Milz, 0,78 % im Muskel und 0,57 % im Blut.
    • BEISPIEL XXVII
  • Ein Hund wurde vorgestellt mit einem Osteosarcoma in dem rechten proximalen Oberarmknochen und ging mit deutlichem Hinken. Ein Komplex wurde hergestellt unter Verwendung des Liganden von Beispiel 10 mit einer Sm-153-Lösung. Die Konzentration von Sm betrug 3x10&supmin;&sup4;M und der Ligand wurde mit einem 300-fachem molaren Überschuß verwendet. Die spezifische Aktivität des Sm-153 betrug 30 mCi/ml. Dem Hund wurde eine I.V.-Injektion dieses Komplexes, enthaltend 0,95 mCi von Sm- 153 pro kg Körpergewicht des Hundes verabreicht. Eine Woche nach der Injektion war der Gang des Hundes merklich verbessert. TABELLE I: ALLGEMEINE STRUKTUR TABELLE I: fortgesetzt TABELLE I: fortgesetzt TABELLE I: fortgesetzt TABELLE I: fortgesetzt TABELLE I: fortgesetzt

Claims (12)

1. Chelatbildner, der eine Ortho-Ligationsfunktionalität besitzt, mit der Formel
worin Z' Wasserstoff, NH&sub2;, NO&sub2;, NHC(O)CH&sub3; oder N(R')&sub2; darstellt,
wobei R' Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub3; Alkyl darstellt;
X Wasserstoff, C&sub1;-C&sub3; Alkyl oder CR&sub3;R&sub4;COOH darstellt;
worin R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, CO&sub2;H oder eine C&sub1;-C&sub3; Alkylgruppe darstellen;
R'&sub1; und R'&sub2; jeweils Wasserstoff oder COOH darstellen, unter der Voraussetzung, daß mindestens einer COOH darstellt;
R'&sub3;, R'&sub4;, R'&sub5; und R'&sub6; unabhängig Wasserstoff oder CR&sub3;R&sub4;COOH darstellen, unter der Voraussetzung, daß mindestens drei CR&sub3;R&sub4;COOH darstellen;
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
2. Chelatbildner nach Anspruch 1, worin R'&sub1; und R'&sub2; COOH darstellen, R'&sub3;, R'&sub4;, R'&sub5; und R'&sub6; CH&sub2;COOH darstellen.
3. Chelatbildner nach Anspruch 2, worin Z' NHC(O)CH&sub3; und X Wasserstoff darstellt.
4. Komplex, der einen Chelatbildner nach einem der Ansprüche 1 bis 3, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon umfaßt,
komplexiert mit einem Metallion ausgewählt aus La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y oder Sc.
5. Komplex nach Anspruch 4, worin das Metallion ¹&sup5;³Sm, ¹&sup6;&sup6;Ho, &sup9;&sup0;Y, ¹&sup4;&sup9;Pm, ¹&sup5;&sup9;Gd, ¹&sup4;&sup0;La, ¹&sup7;&sup7;Lu, ¹&sup7;&sup5;Yb, &sup4;&sup7;Sc oder ¹&sup4;²Pr ist.
6. Konjugat, umfassend einen Komplex nach Anspruch 4 oder 5, welcher kovalent an einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gebunden ist.
7. Konjugat nach Anspruch 6, worin der Antikörper oder das Fragment davon ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
8. Konjugat nach Anspruch 7, worin der Antikörper oder das Antikörperfragment CC-46, CC-49, CC-49 F(ab')&sub2;, CC-83, CC- 83 F(ab')&sub2; oder B72.3 ist.
9. Pharmazeutische Formulierung, umfassend einen Komplex nach Anspruch 4 oder 5 und einen physiologisch verträglichen Träger.
10. Pharmazeutische Formulierung, umfassend ein Konjugat nach Anspruch 6 und einen physiologisch verträglichen Träger.
11. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 9 oder 10 zur Behandlung von Krebs.
12. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 9 oder 10 zur Behandlung von Knochenschmerzen.
DE68927271T 1988-10-31 1989-10-31 Chelatbildende Verbindungen die eine orthobindende Gruppe besitzen und ihre Komplexe Expired - Lifetime DE68927271T2 (de)

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