PT775158E - Compostos organicos - Google Patents
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Description
- 1 - DESCRIÇÃO " CICLOPEPT ÓLIDOS "
Este invento está relacionado com ciclopeptólidos e com a sua utilização terapêutica como inibidores da expressão de moléculas de adesão.
As moléculas de adesão celular, tais como ICAM-1, VCAM-1 e selectina E, são expressas na superfície das células endoteliais, assim como nos queratinócitos no caso de ICAM-1, como resposta a mediadores inflamatórios incluindo TNFa, IFNy, IL-1 e LPS. Contraligandos correspondentes, e.g. LFA-1, VLA-4 e SLEX, são expressos na superfície de células do sangue circulante. A migração transendotelial de leucócitos durante os processos inflamatórios, assim como as interacções célula-célula extravasculares, são reguladas como resultado das interacções entre estas moléculas de adesão e os seus contraligandos. Consequentemente, os inibidores da expressão das moléculas de adesão constituem um potencial para o tratamento de muitas doenças. No entanto, presentemente não existem disponíveis inibidores de baixo peso molecular da expressão de moléculas de adesão.
Os ciclopeptólidos são moléculas cíclicas compreendendo resíduos de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas e pelo menos um resíduo carboxílico substituído com hidroxilo, que está ligado através do seu substituinte hidroxilo ao resíduo de aminoácido vizinho por uma ligação éster.
Descobrimos uma nova classe de ciclopeptólidos que são inibidores da expressão de ICAM-1, VCAM-1 e selectina E. -2-
O presente invento proporciona ciclo-heptapeptólidos da fórmula I
-2- C
-A-B
- R,Leu - Leu - C - X - Y □
I em que:: A é um resíduo de ácido butírico substituído em α com hidroxilo, facultativamente substituído em y por R6, o qual representa CN, COOR2, CONR3R4> COR5, CSNH2 ou alquilo, o qual pode ser substituído por azido, halogénio, alcoxilo, hidroxilo ou amino facultativamente substituído, vinilo, o qual pode ser substituído por alquilo, halogéneo ou CN, cicloalquilo, tetrazolilo ou -C=CH, em que R2 representa hidrogénio ou alquilo facultativamente substituído com arilo, R3 e R4 são iguais ou difentes e representam hidrogénio ou alquilo, ou formam em conjunto com azoto um anel de 3 a 6 membros, facultativamente contendo um segundo heteroátomo e R5 representa hidrogénio ou alquilo inferior, B é um resíduo de ácido octanóico substituído com a-amino-y-metilo; R-, é hidrogénio ou metilo;
C é um resíduo de triptofano ou de N-metil-triptofano da fórmula VI
em que R8 representa hidrogénio, alcoxilo, alquilo ou benzilo, Rg representa hidrogénio ou halogénio, R10 representa hidrogénio ou metilo e representa uma ligação simples ou dupla, X é um resíduo de ácido carboxílico (C2 a C14) substituído em a com amino, e Y é um resíduo de ácido carboxílico (C2 a C14) substituído em α com amino ou N-metil-amino. -3-
Na fórmula I a orientação C-terminal para N-terminal dos resíduos de aminoácidos está na direcção dos ponteiros do relógio e a ligação éster do peptólido está entre os resíduos A e Y. Quando R1 é metilo, os resíduos RrLeu e Leu são respectivamente resíduos de N-metil-leucina e de leucina.
Preferencialmente A é um resíduo do ácido a-hidroxibutírico, o qual é substituído em γ por ciano, COOR2', em que R2' representa hidrogénio ou metilo e R4' representa hidrogénio ou alquilo ou R3' e R4' formam em conjunto com o azoto um anel de 3 a 6 membros ou um anel morfolinilo, CH2OH, COR5', em que R5' representa hidrogénio ou alquilo inferior com 1 a 4 átomos de carbono, vinilo facultativamente substituído por CN, Br ou alquilo inferior com 1 a 4 átomos de carbono, alquilo facultativamente substitudio por azido, amino, hidroxilo, cloro ou alcoxilo, tetrazolilo, ciclopropilo, CSNH2 ou -C^CH.
Preferencialmente C é um resíduo N-metiltriptofano da fórmula VI, em que R8 representa hidrogénio ou halogénio. Preferenciamente X é um resíduo de ácido carboxílico (C4 a C8) substituído em a como amino, o qual é facultativamente substituído em β ou γ com alquilo (C-, a C4). Mais preferencialmente, X é um resíduo de ácido octanóico ou butírico substituído com a-amino-β- ou γ-alquilo (Cia C4), especialmente metilo.
Preferencialmente Y é um resíduo de ácido carboxílico(C2 a C4) substituído com N-metilo-a-amino, o qual é facultativamente substituído em β ou γ com alquilo (C: a C4). Mais preferencialmente Y é um resíduo N-metil-alanina ou N-metil-valina.
Os compostos da fórmula I compreendem átomos de C assimétricos e estes podem estar na configuração R ou S.
Os peptídeos de cadeia aberta ou peptólidos correspondendo aos -4- compostos da fórmula I podem, por exemplo, ser obtidos por clivagem da ligação éster entre os resíduos Y e A ou por clivagem de uma ligação amida entre quaisquer outros pares de resíduos de ácidos adjacentes. Os derivados de cadeia aberta preferidos são compostos das formulas IV e V. H-C-X-Y - A-B-R., Leu-Leu.OR7 IV e
HA-B-F^Leu-Leu-C-X-Y.OR.7 V em que R7 representa hidrogénio ou alquilo. Um grupo preferido de compostos do invento são os compostos da fórmula Ip j Ap · Bp ' ^Ip1-611 · L8U ' Cp · Xp
ip em que:
Ap é um resíduo de ácido isobutírico substituído em α com hidroxilo facultativamente substituído em y com R^, o qual representa CN, CH20H, COOR2p, CONR3pR4p, CORgp ou -CH=CH2 facultativamente protegido, pelo que R2p representa hidrogénio ou alquilo facultativamente substituído com arilo, R3p e R4p são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo ou formam em conjunto com o átomo de azoto um anel de 5 ou 6 membros facultativamente contendo um segundo heteroátomo e R5p representa hidrogénio ou alquilo inferior, Bp é um resíduo de ácido octanóico α-amino-y-metil-substituído; R1p é hidrogénio ou metilo; Cp é um resíduo triptofano ou N-metil-triptofano, o qual é facultativamente substituído com alcoxilo(C1 a C4) em Ν'; Xp é é um resíduo de ácido carboxílico (C2 a C14) substituído com amino em α e Yp é um resíduo de ácido carboxílico (C2 a C10) α-amino ou N-metil-a-amino-substituído. -5-
Um outro subgrupo de compostos do invento são os compostos da fórmula Γρ
R’1pLeu - Leu - C'p
l'P em que:
Ap' é um resíduo de ácido butírico substituído com hidroxilo em α e facultativamente substituído em γ com R^', o qual representa CN, COOR'2p, CONR'3pR'4p, COR^, alquilo, o qual pode ser substituído por azido, halogéneo, alcoxilo, hidroxilo ou amino facultativamente protegido, vinilo, o qual pode ser substituído por alquilo, halogénio ou CN, cicloalquilo, tetrazolilo ou -C=CH, em que R'2p representa hidrogénio ou alquilo facultativamente substituído com arilo, R'3p e R'4p são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo ou formam em conjunto com o azoto um anel de 3 a 6 membros facultativamente contendo um segundo heteroátomo e R'5p representa hidrogénio ou alquilo inferior, B'p é um resíduo de ácido octanóico α-amino-y-metil-substituído; R'1p é hidrogénio ou metilo; C'p é um resíduo de triptofano ou de N-metil-triptofano da fórmula
em que R'8p representa hidrogénio, alcoxilo, alquilo ou benzilo, R'9p representa hidrogénio ou halogénio, R’10p representa hidrogénio ou metilo e representa uma ligação simples ou dupla, X'p é um resíduo de ácido carboxílico (C6 a C14) -6-
substituído em α com amino, e Y'p é um resíduo de ácido carboxílico (C2 a C10) N-metil-a-amino substituído. O invento também inclui todos os compostos do invento na forma de sal ou de éster assim como na forma livre.
Os compostos das fórmulas II e III (daqui em diante referidos como compostos A e B respectivamente
(A) <B)
foram isolados a partir de culturas da estirpe de fungo F924471/08 que foi isolada a partir de uma amostra de palha colhida perto de La Plata, Argentina e que foi tentativamente inserida no género Bartalinia. Amostras da estirpe F92-4471/08 foram depositadas no US Department of Agriculture, colecção de culturas NRRL de acordo com o Tratado de Budapeste em 2 de Julho de 1993 e estão identificadas com o número de depósito NRRL 21123. As características da estirpe de fungo F92-4471/08 estão descritas a seguir no Exemplo 1. O invento inclui a estirpe F92-4471/08 (NRRL 21123) na forma isolada e seus mutantes e derivados assim como novos ciclopeptólidos que são produzidos por esta estirpe.
Os compostos A e B e compostos relacionados podem ser obtidos da cultura de F92-4471/08/NRRL 21123, ou de um seu mutante ou derivado ou de uma espécie de fungo semelhante, em meio nutritivo e recuperação dos compostos a partir dela, por exemplo como descrito no Exemplo 2.
As características dos compostos A e B estão apresentadas no
Exemplo 3.
Os compostos de acordo com o invento podem ser preparados por derivatização dos compostos A e B, a qual compreende a) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que Re representa COOR2', onde R2' é alquilo facultativamente substituído por arilo, reacção de compostos da fórmula I, em que Rg representa CN, com nucleófilos, preferencialmente um álcool, com catálise básica ou ácida adequada, preferencialmente com ácido clorídrico, em solventes orgânicos, preferencialmente éter, ou b) - para a preparação de. compostos da fórmula I, em que Rg representa
COalquilo, reacção de compostos da fórmula I, em que Rg representa CN, usando como nucleófilos compostos organo-metálicos, preferencialmente compostos de Grignard ou litio-alquilos, os quais reagem em solventes orgânicos apróticos, preferencialmente éteres, com ou sem catalisadores, ou c) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que Rg representa COOH, hidrólise dos compostos da fórmula I, em que Rg representa COOalquilo, com ácido mineral, preferencialmente ácido clorídrico, em solução alcoólica aquosa ou base ou d) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que R6 representa COOH, por métodos convencionais, preferencialmente por conversão em ácido clorídrico com e.g. cloreto de tionilo e tratamento com um álcool adequado na presença ou ausência de um fixador de ácidos, ou e) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que Rg representa CH2OH, redução de compostos da fórmula I, em que Rg representa COOR2, com hidretos de metal ou hidretos de boro, preferencialmente complexo dimetilsulfito de borano, em solventes orgânicos ou f) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que R6 representa CONR3R4, transformação dos compostos da fórmula I, em que Rg representa COOR2, por reacção com aminas, preferencialmente por conversão do ácido livre em cloreto ácido e reacção com a amina HNR3R4 ou g) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que Rg representa CHO, oxidação dos compostos da fórmula I, em que Rg representa CH2OH ou h) - para a preparação de compostos da formulai, emque Rg representa vinilo facltativamente substituído, reacção de compostos da fórmula I, em que Rg representa CHO, com um reagente metil-Wittig ou i) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que Rg representa alquilo facultativamente substituído, reacção dos compostos da fórmula I, em que Rg representa CH2OH ou j) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que Rg representa CH2NH2, -9- redução dos compostos da fórmula I, em que Rg representa CH2N3 ou k) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que Rg representa C=CH, reacção dos compostos da fórmula I, em que Rg representa CH=CBr2 ou l) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que Rg representa ciclopropilo, reacção de compostos da fórmula I, em que Rg representa vinilo, com diazometano ou m) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que Rg representa tetrazolilo, reacção de compostos da fórmula I, em que Rg é CN, com um composto de azida ou n) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que R8 representa hidrogénio, remoção de metoxilo dos compostos da fórmula I, em que R8 representa OCH3 ou o) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que o símbolo — representa uma ligação dupla ou p) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que R9 representa alquilo ou benzilo, introdução destes grupos em compostos da fórmula I, em que Rg representa halogénio, compostos de halogenação da fórmula I, em que R9 representa hidrogénio ou r) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que Ra representa alcoxilo e o símbolo representa uma ligação dupla, reacção dos compostos da fórmula I, em que R8 representa hidrogénio e o símbolo ™ representa uma ligação simples, com um tungstato alcalino e peróxido de hidrogénio e alquilação do intermediário N-hidroxi-indol ou s) - para a preparação de compostos da fórmula I, em que Rg representa CSNH2, reacção dos compostos da fórmula I com derivados de enxofre, preferencialmente com ácido difenilfosfmoditióico.
Os compostos do invento podem ser preparados também por síntese química; por exemplo, usando técnicas convencionais de síntese de peptídeos. - 10-
Tipicamente o passo final na preparação dos compostos é um passo de ciclização em que um peptídeo linear ou peptólido compreendendo os resíduos acídicos A, B, R^Leu, Leu, C, X e Y ligados uns aos outros na ordem adequada, é tomado cíclico através de uma reacção de formação de ligação amida ou éster.
Assim o invento inclui um processo para a preparação de um peptólido cíclico da fórmula I compreendendo ciclização de um peptídeo linear ou peptólido compreendendo os resíduos acídicos A, B, R^Leu, Leu, C, X e Y ligados uns aos outros na ordem adequada.
Os compostos do invento apresentam actividade farmacológica e são portanto úteis como fármacos. Em particular os compostos são inibidores da expressão estimulada das moléculas de adesão celular, especialmente inibidores da expressão de VCAM-1, selectina E e ICAM-1. O efeito na inibição de VCAM ocorre a nível da transcrição e após transcrição. Os ensaios que podem ser usados para detectar a inibição da expressão de ICAM-1, VCAM-1 e selectina E pelos compostos do invento estão descritos nos Exemplos. Assim os compostos são úteis no tratamento ou profiláxia de processos de doença que envolvam expressão de moléculas de adesão celular. Estes processos de doença incluem muitas doenças/perturbações adquiridas ou hereditárias em que o tráfico de leucócitos desempenha um papel importante no processo patogénico, mais preferencialmente inflamação aguda e crónica (e.g. alergia, asma, psoríase, ferimentos causados por reperfusão, artrite reumatóide e choque séptico) e estados autoimunes (e.g. esclerose múltipla). Outras indicações para os compostos do invento incluem metástases de tumores (e.g. melanoma, osteocarcinoma) e rejeição de auto-enxertos/transplantes, uma vez que se sabe que a inibição das moléculas de adesão celular podem aumentar grandemente o prognóstico destes processos. Todos os compostos do invento possuem potencial terapêutico em - 11 -
doenças hiperproliferativas da pele (e.g. psoríase) assim como várias doenças malignas face à sua actividade inibitória em concentrações submicromolares quando testados durante 72 horas em ensaios de proliferação baseados em queratinócitos e noutros.
Os compostos do invento são activos na inibição da produção de HIV induzida por TNFa ou IL-6 na linha celular monocítica Ul, conforme avaliado por Elisa de p24 e são portanto úteis no tratamento de imunodeficiências e doenças virais, especialmente no tratamento de SIDA.
Assim, o invento também inclui a utilização terapêutica dos compostos do invento e das composições terapêuticas que os incluam.
Em particular, o invento inclui métodos para o tratamento ou profiláxia de doenças que envolvem a expressão de moléculas de adesão os quais compreendem a administração a um indíviduo de uma quantidade terapêutica ou profílaticamente eficaz de um composto de acordo com o invento. O invento também inclui composições terapêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com o invento.
Ainda, o invento inclui a utilização de um composto de acordo com o invento para a preparação de um medicamento para aplicação no tratamento ou profiláxia de doenças que envolvam a expressão de moléculas de adesão.
As composições podem ser para utilização parentérica, oral, em aerossol ou tópica e geralmente compreende um ou mais veículos, diluentes ou - 12- excipientes farmaceuticamente aceitáveis e podem compreender aditivos tais como estabilizantes e similares.
As dosagens dos compostos usados podem variar dependendo, entre outros, do estado ou doença envolvida, se a utilização é para o tratamento ou profiláxia e do modo e via de administração. Em geral, obtem-se resultados satisfatórios com administração oral em dosagens entre cerca de 0,05 e cerca de 10 mg/Kg/dia, de preferência entre cerca de 0,1 e cerca de 7,5 mg/Kg/dia, mais preferencialmente entre cerca de 0,1 e cerca de 0,2 mg/Kg/dia administrado uma vez ou, em doses divididas, 2 a 4 vezes por dia. Como alternativa, para administração parentérica, e.g. por gota a gota ou infusão iv, podem ser usadas dosagens entre cerca de 0,01 e cerca de 5mg/Kg/dia, preferencialmente entre cerca de 0,05 e cerca de 1 mg/Kg/dia e mais preferencialmente entre cerca de 0,1 e cerca de 1,0 mg/Kg/dia.
Dosagens diárias adequadas para doentes humanos são assim entre cerca de 2,5 e cerca de 500 mg p.o., de preferência entre cerca de 5 e cerca de 250 mg p.o., mais preferencialmente entre cerca de 5 e cerca de 100 mg p.o.; ou entre cerca de 0,5 e cerca de 250 mg i.v., preferencialmente entre cerca de 2,5 e cerca de 125 mg i.v. e mais preferencialmente entre cerca de 2,5 e cerca de 50 mg i.v..
Os compostos podem ser administrados através de uma via adequada, incluindo a via entérica, parentérica e tópica ou por um inalador. São formas adequadas para a administração entérica as soluções para beber, comprimidos ou cápsulas. São formas parentéticas adequadas as soluções ou suspensões injectáveis. As formas adequadas para administração tópica incluem cremes, loções e similares, numa gama de concentrações que varia entre 0,01- -13- 10%, preferencialmente entre 0,1 e 1%, por peso para tais formulações. As formas de dosagem unitária adequadas para administração oral podem compreender entre 1 e 150 mg do composto, geralmente entre 1 e 10 mg. O composto do exemplo 4 é o composto preferido do invento e pode ser administrado a mamíferos maiores, por exemplo seres humanos, por métodos de administração semelhantes e dosagens semelhantes ou inferiores às convencionalmente empregues com padrões conhecidos para tais indicações. O invento é ainda descrito, apenas a título ilustrativo, nos exemplos que se seguem que se referem aos diagramas juntos em que:
Figura 1 mostra o espectro de UV dos compostos A (a) e B (b);
Figura 2 mostra o espectro de IV do composto A;
Figura 3 mostra o espectro de IV do composto B;
Figura 4 mostra o espectro NMR de protões do composto A;
Figura 5 mostra o espectro NMR de protões do composto B;
Figura 6 mostra o espectro NMR de 13C do composto A e
Figura 7 mostra o espectro NMR de 13C do composto B.
Nos exemplos que se seguem, os quais ilustram o invento sem o limitar, todas as temperaturas são dadas em graus Celsius e são usadas as abreviaturas que se seguem: - 14- Βζ = benzilo iPr = isopropilo nPr = n-propilo db = ligação dupla sb = ligação simples br - largo d = dupleto
Hba = ácido 2-hidroxibutírico modificado m - multipleto q = quarteto t = tripleto TFA = ácido trifluoroacético THF = tetra-hidrofurano
CO-
- 15- - 15- Χ* = -] NH-CH-CO-
I Τ2 CH-CH, (CH^-CHj Χ"= -NH-CH-CO- /Ç 0¾ CHj
-00- Y'=
0¾ CHj
CHjCHj
Exemplo 1: Caracterização da estirpe F/92-4471/08 (NRRL 21123) A estirpe de fungo NRRL 21123 que produz os compostos A e B foi isolada a partir de uma amostra de palha colhida perto de La Plata, Argentina.
Quando cultivada em Meio A com agar de malte a 2% (2% de extracto de malte, 0,4% de extracto de levedura, 2% de agar em água - 16- desionizada) a estirpe NRRL 21123 produz, após três dias de incubação a 27°C, colónias de 25 a 35 mm de diâmetro. As colónias geralmente desenvolvem um micélio aéreo curto que é branco a cinzento ou castanho acinzentado.
Medida pelos diâmetros das colónias em Meio A, a temperatura de crescimento situa-se entre 21° e 30°C, a temperatura mínima situa-se entre 0o e 6o e a temperatura máxima está entre 33° e 38°. A esporulação foi observada após quatro dias de incubação entre 21° e 33°. A estirpe de fungo NRRL 21123 produz conídios hialinos a castanho muito claro em células conidiógenas fialídicas ou anelídicas, em picnídios bem definidos. Os conídios são geralmente de cinco células, cilíndricos, geralmente ligeiramente encurvados e a maioria mede 24-26 x 2,6-4 um. Cada um dos conídeos é portador, num extremo, de um apêndice simples não ramificado hialino e na outra célula terminal dois a quatro (geralmente três) apêndices hialinos e não ramificados.
Com base nestas características morfológicas e seguindo as chaves de identificação presentes em: B.C. Sutton (1980): The Coelomycetes (publicado pela Commonwealth Mycological Institute, Surrey, England), a estirpe NRRL21123 pode ser inserida no género Bartalinia Tassi.
Exemplo 2: Fermentação A estirpe NRRL 21123 foi cultivada durante 15 dias a 21°C em agar inclinado contendo Meio A (2% de extracto de malte, 0,4% de extracto de levedura, 2% de agar, água desionizada). Os conídios de um agar inclinado foram ressuspensos em 10 ml de água da torneira esterilizada. 1 ml de suspensão de conídios foi inoculado em cada um de dois frascos Erlenmeyer de 500 ml contendo 200 ml de Meio B (2% de extracto de malte, 0,4% de extracto de - 17- levedura em água desionizada). Estes frascos foram incubados durante 6 dias a 21°C num agitador rotativo, a uma velocidade de 200 rpm, para produzir a pré-cultura. 2 ml da pré-cultura foram então inoculados em 200 frascos Erlenmeyer de 500 ml contendo 200 ml de Meio C (2,2% de maltose mono-hidratada, 0,72% de extracto de elevedura em água desionizada). Estes frascos foram incubados a 21°C num agitador rotativo a uma velocidade de 200 rpm e as culturas colhidas e combinadas após 6 dias para posterior processamento.
Exemplo 3: Isolamento de metabolitos, compostos A e B 501 de caldo de fermentação da estirpe NRRL21123, como descrito no Exemplo 2, foram filtrados usando Clareei como auxiliar de filtração. O micélio molhado foi colhido e extraído 3x com 15 1 de metanol-acetona (1:1). Os extractos combinados foram concentrados num rotavaporador in vacuo até aproximadamente 3 1 de solução aquosa residual. Esta foi extraída 4x com 1 1 de acetato de etilo. Os extractos de acetato de etilo foram combinados e concentrados in vacuo para se obter 25 g de resíduo oleoso, o qual foi então extraído 3x no sistema solvente de 90% de metanol aquoso e hexano, a fase inferior dando após concentração in vacuo 4,5 g de sólido bruto. Este sólido foi aplicado numa coluna de gel de silica de 5,5 cm d.i. x 38 cm (Merck, Kieselgel 60, 40-63 pm) e cromatografado com 1,4 1 de metil-tert-butiléter/metanol (98:2), depois com 11 (95:5). O fluxo foi mantido a 110 ml/min. Reuniram-se as fraeções que apresentaram actividade num ensaio de inibição de expressão de ICAM-1 como descrito no Exemplo 4 (90 ml cada), contendo o composto A (Nos. 9-10) ou o composto B (Nos. 11-25).
Composto A
As fraeções 9-10 combinadas da cromatografia em gel de silica descrita atrás foram evaporadas até secagem in vacuo para dar lg de material - 18- bruto. Este foi ainda purificado por HPLC preparativa, usando uma coluna Merck de 50 mm di x 250 mm com LiChrospher RP-18 de 7pm. Durante 60 minutos aplicou-se um gradiente linear de 80 —» 100% de metanol em água. O fluxo foi de 25 ml/min, colheram-se fracções de 25 ml e fez-se um controlo a 220 nm. As fracções 56-62 foram combinadas, baseado em UV, TLC e actividade biológica e depois concentrou-se in vacuo para dar 0,6 g de resíduo. A purificação final foi conseguida por cromatografia em Sephadex LH 20 com uma coluna de 2,7 cm d.i. x 86 cm e com eluição com metanol. As fracções da eluição, as quais contêm o composto A na forma pura, conforme determinado por TLC, são combinadas e evaporadas até secagem in vacuo para dar 580 mg de pó incolor. As propriedades do composto A estão apresentadas na Tabela 1 abaixo.
Composto B
As fracções combinadas 11-25 dão, após evaporação do sovente in vacuo. 2 g de material bruto, que é ainda purificado por HPLC preparativa, usando uma coluna Merck de 50 mm d.i. x 250 mm com LiChrospher RP-18 de 7 pm. A eluição foi realizada com um gradiente linear de 80 -»100% de metanol em água durante 60 minutos. O fluxo usado foi de 25 ml/min., colheram-se fracções de 25 ml e análise a 220 nm. As fracções 47-55 contem a maioria do composto B, baseado em UV, TLC e actividade biológica. As fracções foram combinadas, evaporadas in vacuo para dar 0,4 g de resíduo. Este foi ainda purificado por cromatografia em Sephadex LH 20 numa coluna de 2,7 cm x 86 cm e com eluição com metanol. Colheram-se fracções de 12 ml com controlo a 220 nm. Com base em UV, TLC e actividade biológica, combinaram-se as fracções 23-37, evaporaram-se in vacuo para dar 0,3 g de resíduo. Um passo final de cromatografia em gel de silica usando uma coluna de 2,2 cm d.i. x 16 cm, cheia com Merck Kieselgel 60, 40-63 μτη e com eluição de tolueno-etanol (95:5) dá o composto N puro, conforme determinado por TLC. As fracções resultantes foram combinadas e evaporadas até secagem in vacuo. para dar 145 mg de um - 19- pó incolor. As propriedades do composto B estão também apresentadas na Tabela 1 abaixo. A Tabela 1 abaixo refere-se às Figuras 1 a 7. TABELA 1 Pronriedade ComDOSto A Conroosto B 1. Aspecto pó incolor pó incolor 2. [cx]d25 -234° (MeOH, c = 1,11) -234° (MeOH, c=l ,08) 3. Espectro de massa (FAB) m/e = 977 (MH+) m/e = 949 (MH+) 4.Fórmula molecular C53H84N8°9 c51h80n8°9 5. Espectro UV (MeOH) Ver Fig. la Ver Fig. lb 6. Espectro IV (KBr) Ver Fig. 2 Ver Fig. 3 7. NMR de protões, 500 MHz, em CDCl3-DMSO-d6= em CDCl3-DMSO-d6= DMSO-dg como padrão interno 3:2, ver Fig. 4 4:1, ver Fig. 5 8. 13c NMR, 125.7 MHz, em CDCl3-DMSO-d6= em CDCl3-DMSO-d6= DMSO-dg como padrão interno. 3:2, ver Fig. 6 4:1, ver Fig. 7 9. Solubilidade solúvel em clorofórmio, metanol, DMSO, insolúvel em água e hexano 10.TLCa (valor de Rf) 0,31 0,24 11. HPLCb (Rt) 4,2 minutos 3,3 minutos aplaca de gel de silica de 5 cm x 20 cm 60 F254 (Merck); tolueno-MeOH (95:5) bMerck LiChrospher 100 RP-18 (5 pm), 4 x 125 mm; MeOH-H^O (9:1); 1,2 ml/min.; detecção a 220 nm usando um detector com um arranjo de fotofiodo Waters 996
Exemplo 4: Composto da fórmula I (A = A', Rg = COOCH3, B = B', R1 = CH3, C = C’, R8 = OCH3, ^ = db, X = X’, Y = Y’)
Uma solução fria de HC1 em éter (30 ml, 17% p/v, -20°C) foi adicionada a uma mistura de 2 g do composto A e 1,65 ml de metanol e mantida a -20°C durante 3 dias. A mistura de reacção foi então vertida sobre uma solução aquosa de bicabomato e extraída com acetato de etilo. O extracto orgânico foi seco sobre sulfato de sódio, filtrado e evaporado sob vácuo. O produto bruto foi dissolvido em 30 ml de metanol/HCl aquoso conc. (9/1) e agitado à temperatura ambiente durante 3 h. a solução foi então diluída com água e extraída com acetato de etilo. O extracto orgânico foi seco sobre sulfato de sódio, filtrado e evaporado sob vácuo. A mistura de reacção bruta foi purificada por cromatografía em fase reversa em LiChroprep RP-8 (gradiente: metanol/água = 8/2 a 10/0) e croma-tografia subsequente em gel de silica (gradiente tolueno/metanol = 100/0 até 95/5) para dar a substância do título como uma espuma incolor e 0 derivado de cadeia aberta da fórmula IV (R6 = COOCH3) como um sólido incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,41 (substância do título), Rf = 0,38 (derivado de cadeia aberta); fase reversa RP-8, metanol/água/ácido trifluoroacético = 95/4/1, Rf = 0,34 (substância do título), Rf = 0,51 (derivado de cadeia aberta).
Exemplo 5; Composto da fórmula I (A = A', Rg= COOH, B = B’, R, = CH3, C = C’, R8 = OCH3, ™ = db, X = X', Y = Y')
Uma solução de 209 mg do composto da fórmula I do exemplo 4 -21 - em 15 ml de t-butanol/HCl cone. aquoso (9/1) foi aquecido a 60°C durante 8 h. A mistura de reacção foi vertida sobre solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio e extraída com acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com tampão pH7, seca sobre sulfato de sódio e evaporada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 100/0 até 95/5) para dar a substância do título como uma espuma incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf= 0,25, RP-8 em fase reversa, metanol/água = 92/8, Rf= 0,34.
Exemplo 6: Composto da fórmula I
(A = A', R6= CO.NH.CH3, B = B', = CH3, C = C», R8 = OCH3, ™ = db, X = X’, Y = Yf)
Uma solução de 10 mg do composto do exemplo 5 em 0,5 ml de diclorometano foi arrefecido até 0°C e adicionado 50 μΐ de cloreto de tionilo. A mistura de reacção foi mantida a 0°C durante 1,5 h e depois evaporada a 0°C sob vácuo. O óleo amarelo residual foi dissolvido em 1 ml de diclorometano a 0°C e adicionou-se 100 μΐ de uma solução aquosa de metilamina a 40%. Após 45 min a mistura de reacção foi vertida sobre HC1 aquoso 0,1M, extraída com acetato de etilo e separada entre acetato de etilo e solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. A fase orgânica foi lavada com água salgada, seca sobre sulfato de sódio e evaporada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia em gel de silica (gradiente: tolueno/acetato de etilo/metanol = 100/0/0 a 65/25/10) para dar a substância do título como uma espuma incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,25; RP-8 em fase reversa, metanol/água = 95/5, Rf = 0,33.
De forma análoga ao descrito no exemplo 6 obtiveram-se os -22- compostos que se seguem da fórmula I (A = A', B = B', C=C', X=X', Y=Y' e R1 = CH3):
Ex: *6 R. — 7 OCH, db 8 -CO-N^ CH, M db 9 co.nC^ m db 10 •“"Q M ‘ 11 -CO-l/ ^ • db 12 -COIjKCH^.CHj CH, • db
Exemplo 13: Composto da fórmula I (A = A’, R6= COO.iPr, B = B’, R1 = CH3, C = C’, R8 = OCH3, = = db, X = X’, Y = Y·)
Uma solução de 15 mg do composto do exemplo 5 em 0,75 ml de -23- diclorometano foi arrefecido até 0°C e adicionado 75 μΐ de cloreto de tionilo. A mistura de reacção foi mantida a 0°C durante 2 h e depois evaporada a 0°C sob vácuo. O óleo amarelo residual foi dissolvido em 1 ml de diclorometano a 0°C e adicionou-se 30 μΐ de i-propanol. Após 3 ha 0o a mistura de reacção foi vertida sobre HC1 aquoso 0,1M, extraída com acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com água salgada, seca sobre sulfato de sódio e evaporada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 100/0 a 95/5) para dar a substância do título como uma espuma incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,47; RP-8 em fase reversa, metanol/água = 95/5, Rf = 0,37.
De forma análoga ao descrito no exemplo 9 foram obtidos os compostos que se seguem da fórmula I (A = A', B = B', C = C', X = X', Y = Y' e
Ri=CH3):
Ex: Re R3 ____ 14 -COO.C?Hr OCH, db 15 -COO.nPr tf db
Exemploló: Composto do fórmula I (A = A’, Rg= COCH3, B = B’, R, = CH3, C = C\ R„ = OCH3, ™ = db, X = X’, Y = Y’)
Uma solução de 200 mg do composto A em 2 ml foi adicionada a uma solução de Grignard metilada 2 mmol em 5 ml de éter e agitada à temperatura ambiente durante 24 h. Em seguida adicionou-se mais 2 mmoles de MeMgJ em éter e novamente agitou-se durante 24 horas à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi vertida sobre uma solução de HC1 0,1 M e extraída com -24- acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com solução de bicarbonato de sódio e água salgada, seca sobre sulfato de sódio e evaporada sob vácuo. A mistura de reacção bruta foi purificada por cromatografia em gel de silica (gradiente: tolueno/acetato de etilo/metanol = 100/0/0 a 68/27/5) para dar a substância do título assim como quantidades consideráveis de material de partida não modificado. TLC: gel desilica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,30.
Exemplo 17: Composto da fórmula I (A = A’, Rç= CH2OH, B = B', R, = CH3, C = C', R8 = OCH3, — = db, X = X’, Y = Y’) 0,5 ml de uma solução 2M do complexo dimetilsulfito de borano foram adicionados a uma solução de 27 mg do composto do exemplo 5 em 2 ml de tetra-hidrofurano à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi agitada durante 2,5 h, vertida sobre HC1 0,1M e extraída com acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com tampão de fosfatos (pH 7), seca sobre sulfato de sódio e evaporada sob vácuo. O material bruto foi purificado por cromatografia em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 100/0 a 95/5) para dar a substância do o título como uma espuma incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,27; PR-8 de fase reversa, metanol/água = 92/8 sem separação do material de partida.
Exemplo 18: Composto da fórmula I (A = A’, R6= CN, B = B*, R1 = CH3, C = C\ R8 = H, = = db, X = X’, Y = Y’) 18 mg de paládio sobre carbono activado (10%) foi adicionado a -25- uma solução de 53 mg do composto A e 66 mg de acetato de sódio em 4 ml de anidrido acético. O composto A e 66 mg de acetato de sódio em 4 ml de anidrido acético. A mistura de reacção foi agitada à temperatura ambiente sob atmosfera de hidrogénio durate 20 h (50% de conversão por TLC) e depois vertida sobre solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio e extraída com acetato de etilo. A solução orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e evaporada sob vácuo elevado. O produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa em material RP-8 (gradiente: metanol/água = 80/20 a 100/0) para dar a substância do título como uma espuma incolor. TLC: gel de sílica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,33; RP-8 de fase reversa, metanol/água = 92/8, Rf = 0,50 (material de partida Rf = 0,44).
Exemplo 19: Composto da fórmula I (A = A', Rg= ChO, B = B', R, = CH3, C = C\ R8 = OCH3, — = db, X = X’, Y = Y') 35 mg de reagente periodinano Dess-Martin (l,l,l-tris(acetoxi)-l,l-di-hidro-l,2-benziodoxol-3(lH)-ona) foi adicionado a uma solução de 50 mg do composto do exemplo 17 em 4 ml de diclorometano e a suspensão foi agitada a 20°C durante 3 horas. Em seguida a mistura de reacção bruta foi vertida sobre gel de silica e eluida com acetato de etilo. As fracções contendo o produto foram combinadas, evaporadas sob vácuo e purificadas por cromatografia em gel de silica (gradiente tolueno/metanol = 100/0 a 95/5) para dar a substância do título como uma espuma incolor. -26-
Exemplo 20: Composto da fórmula I (A = A', R6= CH=CH2, B = B', R, = CH3, C = C', R8 = OCH3, ^ = db, X = X', Y = Y’)
Uma solução de reagente metil-Wittig, preparado por agitação de uma mistura de brometo de metiltrifenilfosfónio e amida de sódio em THF seco, foi adicionado lentamente a 20°C a uma solução de 24,7 mg do composto do exemplo 19 em THF seco até a cor amarela do reagente permanecer. Em seguida a mistura de reacção foi vertida sobre ácido clorídrico 0,1M e extraída com acetato de etilo. O extracto orgânico foi evaporado sob vácuo e o resíduo de produto bruto foi purificado por cromatografia em gel de silica (gradiente tolueno/metanol = 100/0 a 97/3) para dar o composto do título como uma espuma incolor.
Exemplo 21: Composto da fórmula I (A = A', R6= CH=CH-C2H5, B = B', Rn = CH3, C = C', R8 = OCH3, ™ = db, X = X’, Y = Y') O composto do título foi preparado de forma análoga ao descrito no exemplo 20. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,44.
Exemplo 22; Composto da fórmula I (A = A’, R6= CH2N3, B - B’, R., = CH3, C = C’, R8 = OCH3, — - db, X - X’, γ = γ») A uma solução de 30 mg do composto do exemplo 17 e 12 mg de -27- trifenilfosfino em 3 ml de THF seco adicionou-se 150 μΐ de uma solução de ácido hidrazóico 0,3 8M em tolueno. Adicionou-se azodicarboxilato dietílico à temperatura ambiente até a solução ficar amarela e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reacção bruta foi vertida sobre 5 g de óxido de alumínio (neutro) e eluida com acetato de etilo. As fracções contendo o produto foram evaporadas sob vácuo e purificadas por cromatografia em gel de silica (gradiente:tolueno/metanol = 99,5/0,5 até 95/5) para dar a substância do título como uma espuma incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,46; RP-8 de fase reversa, metanol/água/TFA = 95/4/1, Rf = 0,41.
Exemplo 23: Composto da fórmula I (A = A', Rg= CH2.NH2, B = B\ R, = CH3, C = C’, R8 = OCH3, ^ = db, X = Χ',Υ-Υ')
Uma solução de 20mg do composto do exemplo 22 em 2 ml de metanol foi agitada numa atmosfera de hidrogénio a 4°C com 4 mg de paládio em carvão (10%) durante 20 horas. O catalisador foi removido por filtração e a mistura de reacção foi evaporada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa em RP-8 (gradiente:metanol/água 0,5% TFA = 80/20 a 100/0) para dar o composto do título como umã espuma incolor. TLC: RP-8 de fase reversa, metanol/água/TFA = 95/4/1, Rf = 0,69. -28-
Exemplo 24: Composto da fórmula I (A = A’, R6= CH=CBr2, B = B\ R, = CH3, C = C’, R8 = OCH3, — = db, X = X', Y = Y')
Uma solução de 225 mg do composto do exemplo 19 em 2,5 ml de diclorometano foi adicionado a uma mistura de 30 mg de pó de zinco, 120 mg de trifenilfosfino e 150 mg de tetrabromometano e agitada durante 30 min àtemperatura ambiente. A mistura foi então vertida sobre 5 g de óxido de alumínio e eluida com acetato de etilo. As fracções contendo o produto foram evaporadas sob vácuo e purificadas por cromatografia em egel de silica (gradiente:tolueno/metanol = 99,5/0,5 a 97/3) para dar a substância do título como uma espuma sólida incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,27.
Exemplo 25: Composto da fórmula I (A = A’, Rg= CHsCH, B = B’, R1 = CH3, C = C', R8 = OCH3, — = db, X = X\Y = Y’)
Uma solução de lítio n-butilo em hexano (3 molequivalentes) foi adicionada a 50 mg do composto do exemplo 24 a -78°C durante 2 horas. A mistura de reacção foi vertida sobre HC1 aquoso 0,1M e extraída com acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com uma solução de bicarbonato e água salgada e evaporada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 99,5/0,5 a 97/3) para dar a substância do título como uma espuma sólida incolor. -29-
TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,44. Exemplo 26: Composto da fórmula I (A = A’, Rg= CH=CH-CN, B = B', R1 = CH3, C = C\ R8 = OCH3, — = db, X = X’, Y = Y’)
Uma solução de 30 mg do composto do exemplo 19 e 270 mg de cianometilenotrifenilfosforano em 5 ml de tolueno foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas. Em seguida a mistura de reacçao bruta foi filtrada sobre óxido de alumínio (neutro) e eluida com acetato de etilo. As fracções contendo o produto foram combinadas e evaporadas sob vácuo. A substância do título é uma mistura de isómeros E/Z. TLC: gel de silica, tolueno/metano = 9/1, Rf = 0,39.
Exemplo 27: Composto da fórmula I (A = A’, Rg= CH2C1, B = B’, R, = CH3, C = C’, R8 = OCH3, — = db, X = X\ γ = γ»)
Uma solução de 20 mg do composto do exemplo 17 em 1 ml de tolueno foi adicionada a uma solução de 10 mg de diclorotrifenil fosforano em 1 ml de tolueno e agitada a 60°C. Após 2 h adicionou-se mais 35 mg de diclorotrifenilfosfmo. Após lha mistura de reacção foi filtrada sobre óxido de alumínio neutro e eluida com acetato de etilo. As fracções contendo o produto foram evaporadas e o material bruto foi purificado por cromatografia em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 100/0 a 97/3) para dar a substância do título -30- como uma espuma sólida incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf= 0,39.
Exemplo 28: Composto da fórmula I (A = A’, R6= CH2O.CH3, B = B’, R, = CH3, C = C’, R„ = OCH3, ™ = db, X = X', Y = Y’)
Uma solução de 34 mg do composto do exemplo 17 em 6 ml de diclorometano e 100 mg de gel de silica foi tratado com uma solução de diazometano em éter até o material de partida ser comsumido. Para eliminar o polimetileno formado no decurso da reacção, a mistura foi filtrada, evaporada e adicionados diclorometano e gel de silica frescos. Após evaporação final sob vácuo, o material bruto foi purificado por cromatografia em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 99,7/0,3 a 97/3) para dar a substância do título como uma espuma sólida incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf= 0,34.
Exemplo 29: Composto da fórmula I (A = A', Rg= —<^] , B = B’, ^ = CH3, C = C’, R8 = OCH3, ^ = db, X = X’, Y = Yf)
Uma solução de 13 mg do composto do exemplo 20 e 2,8 mg de acetato de paládio em 2,5 ml de diclorometano foi tratada com uma solução de diazometano em éter à temperatura ambiente até o material de partida se consumir. A fracção contendo o produto foi evaporada e o material bruto foi -31 - purificado por cromatografía em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 99,5/0,5 a 97/3) para dar a substância do título como uma espuma sólida incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,38; RP-8 de fase reversa, metanol/tampão de fosfatos pH7 = 92/8, Rf = 0,27.
Exemplo 30: Composto da fórmula I (A = A’, R6= COO.CH(C6H5)2, CH2, B = B’, R, = CH3, C = C’, R8 = OCH3, -“ = db, X = X', Y = Y')
Uma solução de 8,2 mg do composto do exemplo 5 e 3,1 mg de difenildiazometano em 0,5 ml de tolueno foi aqueicido 60°C durante 3 horas. A solução foi então aplicada directamente na coluna de cromatografía em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 100/0 a 97/3) para dar a substância do título como uma espuma sólida incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,46.
Exemplo 31: Composto da fórmula I
NH-N (A = A’, Re= -< ||, B = B', R1 = CH3, C = C’, R8 = OCH3, — = db, X =
N-N X’,Y = Y')
Uma solução de 50 mg do composto A em 1 ml de dimetilfor-mamida foi aquecida com 125 mg de cloreto de tributilestanho e 25 mg de azida de sódio a 100°C durante 8 dias. A mistura foi então vertida sobre HC1 aquoso 1M, extraída com acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com água salgada, -32- seca sobre sulfato de sódio e evaporada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografía em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 100/0,25 a 100/2,5) para dar a substância do título como uma espuma incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf =0,12; RP-8 de fase reversa, metanol/tampão de fosfatos pH 7, Rf = 0,48.
Exemplo 32: Composto da fórmula I (A = A', Rg= CN, B = B', R, = CH3, C = C’, R8 = CH3, — = db, X = X', Y = Y’)
Uma solução de 20 mg do composto do exemplo 18 em 1 ml de dimetilformamida seca foi misturada com 1 ml de iodometano e adicionou-se uma solução de 5 mg de bis(trimetilsilil)amida de sódio em 0,3 ml de dimetilformamida. Após agitação da mistura de reacção durante 1,5 h à temperatura ambiente, a mistura foi vertida sobre HC1 aquoso 0,1M, extraída com acetato de etilo e separada entre acetato de etilo e uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. A fase orgânica foi lavada com água salgada, seca sobre sulfato de sódio e evaporada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografía em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 100/0,25 até 100/2,5) para dar a substância do título como uma espuma incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf 0,43.
De forma análoga ao descrito no exemplo 32 obtiveram-se os compostos que se seguem da fórmula I(A = A', Re = CN, B = B’, X = X', Y = Y'): -33-
Exemplo C Re 33 C' c2h5 db 34 C' Bz db
Exemplo 35: Composto da fórmula I (A = A’, Rg= CN, B = B', R1 = CH3, C = C', R8 = CH2C(CH3)3 ™ = db, X = X’,Y = Y’) A uma solução de 38 mg do composto do exemplo 38 em 2 ml de ácido acético e 0,2 ml de pivalaldeído, adicionou-se 30 μΐ de uma solução do complexo borano-dimetilsulfito 2M em THF e a mistura foi agitada 5 min à temperatura ambiente. A mistura foi então vertida sobre bicarbonato/acetato de etilo e adicionada uma pequena quantidade de água. A fase orgânica foi separada, lavada com água salgada, seca sobre sulfato de sódio e evaporada sob vácuo. O óleo residual incolor (TLC: gel de silica, tolueno/metanol 9/1, Rf = 0,53) foi dissolvido em 3 ml de THF e uma solução de 2,3-dicloro-5,6-diciano-l,4-benzoquinona em THF (DDQ, 8 mg em 0,2 ml) foi adicionada à temperatura ambiente até a mistura de reacção ficar escura. A mistura foi filtrada sobre 5 g de gel de silica e eluida com tolueno/metanol = 100/0,5 a 95/5) para dar a substância do título como uma espuma incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol 9/1, Rf = 0,49.
De forma análoga ao descrito no exemplo 35 obtiveram-se os compostos que se seguem da fórmula I (A = A', R6 = CN, B = B', X = X', Y = Y'): -34-
Exemplo C Re ____ 36 C Bz sb 37 C' CH(CH,), db
Exemplo 38: Composto da fórmula I (A = A’, Rg= CN, B = B', C = C’, R8 = H, ™ = sb, X = X', Y = Y')
Uma mistura heterogénea de 25 mg do composto do exemplo 18, 1 ml de ácido trifluoroacético e 0,3 ml de trietilsilano foram agitados vigorosamente em atmosfera de argon a 4o durante 20 h. A mistura de reacção foi vertida sobre uma solução aquosa saturada de bicarbonato e extraída com acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com água salgada, seca sobre sulfato de sódio e evaporada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 100/0,5 a 100/5) para dar as substâncias do título como espumas incolores. TLC: gelde silica, tolueno/metanol = 9/1, indolina A Rf = 0,6, indolina B Rf = 0,10; RP-8 de fase reversa, metanol/água/TFA = 95/4/1, indolina A+B Rf = 0,71.
Exemplo 39: Composto da fórmula I (A = A’, R6= CN, B = B', C = C’, R„ = 0.(CH2)2.CH3, = = db, X = X', Y = Y') A uma solução de 30 mg do composto do exemplo 38 (mistura de diastereoisómeros) em 1 ml de metanol adicionou-se 100 mg de tungstato de sódio (Na2WO4.2H20) e 100 μΐ de uma solução de peróxido de hidrogénio a -35- 30%. A mistura de reacçào foi agitada à temperatura ambiente durante 20 min e depois purificada directamente via cromatografía de permeação em gel (Sephadex LH-20, metanol/acetato de etilo = 1:1). As fracções contendo o intermediário N-hidroxi-indol foram evaporadas, o resíduo foi ressuspenso em 2 ml de DMF seco, e adicionou-se 2 ml de iodeto de propilo e 7,5 mg de bis(trimetilsilil)amida de sódio. Após agitação 30 min à temperatura ambiente a mistura de reacção foi ertida sobre ácido clorídrico 0,1M e extraída com acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio e água salgada e foi evaporada sob vácuo. O produto foi purificado por cromatografía em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 100/0,5 a 98/2) e cromatografía em fase reversa (RP-8, gradiente metanol aquoso = 75 a 100%) para dar a substância do título como uma espuma incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 90/10, Rf = 0,51, RP-8, metanol/tampão de fosfatos pH 7 = 92/8, Rf = 0,30.
Exemplo 40: Composto da fórmula I (A = A’, Rg= CN, B = B',C = C', R8 = O.C2H5, — = db, X = X', Y = Y’> O composto do título foi preparado de forma análoga ao descrito no exemplo 39.
Exemplo 41: Composto da fórmula I (A = A’, Rg= CN, B = B', C = C", R8 = O.CH3, Rg = Br, ™ = db, X = X', Y = Y’)
Uma solução de 50 mg do composto A em 2 ml de tetracloro-metano foi agitada com 3 mg de limalha de ferro e adicionou-se uma solução de -36- 10 mg de brómio em tetraclorometano durante 1 hora. A mistura de reacção bruta foi vertida sobre uma solução aquosa de bicarbonato e extraída com acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com uma solução de tiossulfato de sódio e água salgada e evaporada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia em gel de silica) gradiente: tolueno/metanol = 99,5/0,5 a 97/3 para dar a substância do título como uma espuma sólida incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,48; fase reversa RP-8, metanol/água = 92/8, Rf = 0,19.
Exemplo 42; Composto da fórmula I (A = A’, R6= CSNH2, B = B', C = C’, R8 = OCH3, ™ = db, X = X’, Y = Y’)
Uma solução de 50 mg do composto A e 50 mg de ácido difenilfosfinoditióico em 4 ml de isopropanol foi aquecido a 60°C durante 3 dias. A mistura de reacção foi arrefecida até -20°C, o precipitado foi removido por filtração, a solução foi diluida com acetato de etilo e extraída com solução aquosa de bicarbonato de sódio. A fase orgânica foi evaporada in vacuo e o produto bruto purificado por cromatografia em gel de silica (gradiente: tolueno/metanol = 100/0,5 a 96/4) para dar a substância do título como uma espuma incolor. TLC: gel de silica, tolueno/metanol = 9/1, Rf = 0,29.
Actividade biológica
As actividade dos compostos do invento são testadas em ensaios de citotoxicidade e inibição da expressão de ICAM-1, VCAM-1 e selectina E, assim como proliferação celular. As concentrações do composto necessárias para se -37- obter metade da inibição máxima em cada ensaio (IC50) estão apresentadas na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2
Composto IC50(|oM) / Ensaio ICAM-1 ICAM-1 VCAM-1 Selectina E Citotox Prolif. celular (HaCat) (HMEC) (HMEC) (HUVEC) (24 hr.) (HaCat 72hr) composto A 0,009 0,06 0,002 0,04 >40 0,006 composto B 0,02 1,3 0,03 >40 0,05
Os ensaios foram realizados como se segue: Células HaCa, uma linha celular de queratinócitos humanos não tumorigénica, transformada espontaneamente, com as características de diferenciação fenotípica de queratinóctios normais altamente preservadas (Boukamp et al., J. Cell Biol. 106, 761-771), foram usadas tanto no ensaio de proliferação celular como na ELISA para ICAM-1 em células. A. Ensaio de ELISA para ICAM-1 em células I. ELISA para ICAM-1 em células de queratinócitos A Elisa para ICAM-1 em células, usada para determinar a inibição da expressão de ICAM-1, foi realizada essencialmente como descrito por Winiski e Foster (1992, J. Invest. Dermatol., 99, 48-52). Células HaCa foram semeadas em placas de microtitulação de 96 poços (2 x 104 células/poço em meio de cultura: DMEM com 5% FCS, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, piruvato de sódio lmM), crescidas até à -38- confluência e depois incubadas em meio fresco (como para cultura mas com 0,5% FCS em vez de 5%) com ou sem meio de estimulação com IFN-y/TNF-a (meio a testar + 1000 U/ml de IFN-γ / 3 ng/ml de TNF-α) tanto na presença como na ausência do composto A ou do composto B durante cerca de 24 horas. O meio foi então removido por lavagem e as monocamadas celulares foram fixadas com 1% de paraformaldeído. As monocamadas foram incubadas com quantidades saturantes de anticorpos primários (monoclonal de ratinho anti-ICAM-1) e secundário (conjugado de cabra anti-ratinho com peroxidase). A reacção subsequente com peroxidase usa 3-amino-9-etilcarbazole (AEC) como substrato e gera um produto corado insolúvel, o qual é facilmente medido num leitor de placas de microtitulação convencional. II. Medição de citotoxicidade
Após a reacção de AEC para detectar ICAM-1 estar completa, as monocamadas de HaCaT foram lavadas com PBS (200 μΐ), o PBS foi decantado das placas, que foram então secas sobre toalhas de papel para remover o excesso de líquido. As superfícies do fundo das placas de microtitulação foram suavemente limpas com tecido facial húmido e depois novamente com um tecido facial seco e lida a aborvância a 492 nm. Antes das monocamadas secarem adicionou-se 0,1 ml de uma solução a 0,1% de violeta de cristal em PBS (passado primeiro através de um filtro de 0,2 pm). As placas foram então incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos, lavadas 5x com PBS, o excesso de líquido foi removido como descrito atrás e a sua absorvância lida novamente a 492 nm antes das monocamadas secarem. A subtração das densidades ópticas antes e depois da coloração deu valores devidos à coloração com cristal de violeta e está portanto relacionada com as quantidades de monocamada celular presentes nos poços. Estes valores foram usados para corrigir os valores de AEC. -39- B. Ensaio de ELISA em células para VCAM-1. ICAM-1 e selectina E de células endoteliais O ensaio baseia-se num método de ELISA sobre células em placas de 96 poços usando a linha de células endoteliais microvasculares humanas HMEC-1 e células endoteliais da veia umbilical humaria (HUVEC). As células foram previamente tratadas durante quatro horas com o composto A ou composto B, estimuladas durante as 8-16 horas seguintes com TNFa, depois fixadas com paraformaldeído para subsequente avaliação da expressãode VCAM-1, ICAM-1 ou selectina E por uma técnica de coloração indirecta com imunoperoxidase. Os efeitos citotóxicos foram determinados contando o número relativo de células (coloração nuclear de Giemsa) após exposição às substâncias a testar, comparativamente com os poços de controlo (solvente e meio apenas). Os compostos foram considerados como positivos se apresentassem >50% de VCAM-1, ICAM-1 ou selectina E com <25% de perda de células.
Metodologia I. Linha celular: O ensaio para VCAM-1 e ICAM-1 utiliza uma linha celular endotelial microvascular humana imortalizada (antigénio T grande do vírus SV-40) (HMEC-1; Ades et al., Jrl Invest Dermatol 99: 683-690, 1992). As células HMEC-1 expressam constitutivamente níveis baixos de ICAM-1 que que são regulados positivamente por mediadores inflamatórios. No entanto, elas expressam apenas VCAM-1 após estimulação com citocinas. Realizaram-se experiências de dose resposta e de cinética para determinar as condições óptimas para indução da expressão de VCAM-1 e ICAM-1. II. Condições de crescimento: Células HMEC-1 foram cultivadas em frascos T-75 (Nunc) em condições convencionais (37°C, 5% C02) com 1,5 x 106 -40- células/ml de meio de cultura (CM = Meio Basal para células endoteliais [EBM; Clonetics] suplementado com 10% FCS, 10 ng/ml de EGF humano (Boehringer), 1 pg/ml de hidrocortisona (Sigma # 0888), 2,2 g/1 de NaHC03, Hepes 15 mM, 0,11 g/1 de piruvato de sódio, glutamina 4 mM, 100 U/ml de penicilina e 100 μ g/ml de estreptomicina). Após tripsinização suave (0,25% de tripsina + 0,1% EDTA durante 8 min) e ressuspensão, as células foram passadas a 1:3 cada 2-3 dias. III. ELISA para VCAM-1 e ICAM-1 sobre células
Plaxcas de microtitulação de fundo plano de 96 poços foram revestidas com fibronectina bovina (FN; Sigma #F1141)e depois semeadas com 2 x 104células/poço em 200 μΐ de meio de crescimento EBM e incubadas durante a noite. No dia seguinte o meio de cultura (CM) foi inicialmente substituído por 200 μΐ/poço de meio de ensaio EBM (CM suplementado com 5% de FCS em vez de 10%) e subsequentemente substituído com 180 μΐ de meio contendo (1) concentrações adequadas do composto A ou composto B, (2) concentrações correspondentes de meio extraído com solvente/metanol ou (3) meio de ensaio EBM sozinho e incubada durante 4 hr a 37°C. Cada ensaio de 96 poços foi realizado em poços em duplicado. As células foram então estimuladas pela adição de 20 μΐ de solução concentrada de citocinas (2000 U/ml de TNFa) e incubadas durante 16 hr a 37°C. A monocamada de células foi então lavada com 1% de paraformaldeído em meio EBM, fixada em 2% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente (t.a.) e lavada várias vezes com PBS. O PBS foi removido das células e a monocamada foi incubada durante 30 min em PBS contendo 10% de soro de cabra normal (NGS). A solução de NGS foi substituída por 100 μΐ/poço do anticorpo monoclonal anti-VCAM-1 ou ICAM-1 e incubada -41- durante a noite a 4°C. A solução de anticorpo monoclonal foi então removida e as células lavadas várias vezes com PBS, seguido de incubação com PBS contendo 10% NGS durante 30-60 min à t.a.. A solução de NGS foi removida e adicionados 100 μΐ de anticorpo de cabra (FAb')2 antilgG de ratinho conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Tago; diluição de 1:500 em PBS contendo 5% de NGS) e as placas foram incubadas durante 1 hora à t.a.. O segundo anticorpo foi então removido e as células lavadas em PBS, o qual foi então substituído por 150 μΐ/poço de uma solução de AEC (3-amino-9-etil-carbazole; Sigma) preparado de fresco e filtrada e as placas foram incubadas durante 45-60 min à t.a. O substrato da peroxidase foi removido e as células lavadas com PBS. Os valores de absorvância de AEC foram lidos num leitor de placas de microtitulação a 550 nm e corrigidas relativamente aos valores do "branco" ou da referência a 690 nm. IV. Ensaio da selectina E: O ensaio da selectina E foi realizado usando HUVEC isolado de fresco, essencialmente como descrito para VCAM-1 ou ICAM-1 exceptuando uma estimulação mais curta com TNFa (6-8 horas). V. Medição de citotoxicidade (Perda celular baseada na coloração nuclear):
As células endoteliais foram descoradas substituindo o PBS por etanol a 95% durante 20 min (duas mudas de 10 min) com controlo por observação ao microscópio. As células foram então lavadas em água destilada (Aquadest) e a monocamada coberta com solução de giemsa em Aquadest durante 5 min à t.a.. Os poços foram então lavados com Aquadest e secos ao ar durante pelo menos 15 min. A observação ao microscópio foi usada para verificar que apenas os núcleos estavam corados, sem praticamente nenhuma coloração citoplasmática. Os valores de absorvância são lidos num leitor de placas de microtitulação a 550 nm e corrigidos relativamente aos valores do "branco" (filas -42- sem células) a 690 nm. VI. Análise dos dados: Os valores de AEC para a expressão constitutiva de VCAM-1 ou selectina E (poços testemunha não estimulados) são essencialmente iguais aos de um mAb testemunha com o isotipo correspondente e representa a coloração de fundo. Em todas as placas de 96 poços, o valor constitutivo médio é subtraído do valor AEC médio para cada um dos grupos estimulados com citocinas (EBM e testemunhas de solventes, assim como a substância a testar), resultando num número que representa ICAM-1 regulada de forma positiva e VCAM-1 induzível ou expressão da molécula de adesão celular (CAM) selectina E (referida como AEC-CAM). Cada valor de AEC-CAM é então dividido pelo correspondente valor médio de Giemsa, resultando num número que calcula níveis relativos de expressão de CAM para uma determinada densidade celular, baseado no número de núcleos (referido como razão AEC:Giemsa). AEC (estimulada) - AEC (não estimulada) = AEC-CAM AEC-CAM/Giemsa = razão AEC:Giemsa
Assim, os valores reais de IC50 de CAM são determinados comparando os valores de AEC:Giemsa para uma substância a testar com o controlo estimulado (EBM, solvente). Estes valores são então analisados relativamente aos valores de IC50 para Giemsa sozinha. Critérios restrictos determinam se o perfil da inibição de CAM versus citotoxicidade indica um resultado "real" em que se deve investir.
C. Ensaio de proliferação das células HaCaT
As células HaCaT foram cultivadas em DMEM (Gibco # -43- 074-02100) suplementado com 2,2 g/1 de NaHHC03, 0,11 g/1 de piruvato de sódio, Hepes 15 mM, 5% de soro fetal de vitela (FCS), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml) e glutamina (para aumentar a concentração final em 4 mM). Para o ensaio de proliferação as células foram descoladas por tripsinização, suspensas em meio fresco e semeadas em placas de microtitulação de 96 poços numa densidade final de 4000 células(0,2 ml/poço. Após 24 horas (dia 0) o meio foi susbstituído por meio fresco contendo concentrações graduais de composto a testar. Após 3 dias de incubação a 37°C/5% C02, o grau de proliferação celular, comparativamente com as testemunhas de solvente, foi medido por um ensaio colorimétrico que mede a massa celular relativa usando o corante sulfo-rodamina B (Skehan et al., 1990, J. Natl. Câncer Inst. 82, 1107-1112). O "número de células de partida" foi determinado medindo a massa celular relativa no dia 0. Os resultados são expressos como % de inibição = 100 - % de absorvância do controlo (onde o controlo do solvente = 100%) e representa a média ± desvio padrão de três medições. Uma curva de dose-resposta foi representada de forma semi-logaritmica e a concentração necessária para haver metade da inibição máxima (IC50) foi determinada por interpolação linear. A inibição máxima sem perda de células é representada por "número de células de partida" e é geralmente entre 90-98%.
Espectro de NMR (CDC13)
Exemplo: Espectro 4 (3 confórmeros 55:44:3, confórmeros major e minor marcados com * e 0 respectivamente): 8,80* (d, J = 10 Hz, NH); 7,89* (d, J = 10 Hz, NH); 7,78° (d, J = 10 Hz, NH); 7,57° (d, J = 10 Hz, NH); 7,50*° (d, J = 7 Hz, MeMeOTrp H- 4'); 7,39*, 7,37° (2d, J= 8 Hz, MeMeOTrp H-7’); 7,20*° -44- (Mm, MeMeOTrp, H-6'); 7,11°, 7,06* (2s, MeMeOTrp H-2'); 7,03*° (2dd, MeMeOTrp H-5'); 6,16° (d, J = 10Hz, Leu NH); 5,95* (d, J = 6Hz Leu NH); 5,30° (m,al-H); 5,10* (d,d, ácido isobutírico al-H); 5,03 - 4,98 (m, al-H); 4,91 (dd, al-H); 4,85 (m, al-H); 4,71° (m, al-H); 4,45* (dd, al-H); 4,29* (m, al-H); 4,03*, 4,02° (2s, N-OMe); 3,87 (dd); 3,72*, 3,64° (2s, COOMe); 3,63-3,50 (m); 3,47* (q, J = 7Hz, MeAla al-H); 3,41° (s, N-Me); 3,36* (dd, MeMeOTrp β-Η); 3,23-3,17 (m); 3,20* (s, MeAla N-Me); 3,19° (s, N-Me); 2,91* (s, MeMeOTrp N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,51° (s, MeMeOTrp N-Me); 2,43-2,09 (m); 2,03-1,89 (m); 1,83-1,75 (m); 1,68-1,07 (m); 1,52* (d, J = 7Hz, MeAla β-Me); 1,48° (d, J = 7 Hz, MeAla β-Me); 1,04 (d, J = 6,05 Hz); 0,98 - 0,83 (m); 0,53* (b, J= 6,6 Hz, LeuMe); 0,01* (d, J = 6,6, LeuMe); -0,32 (dd, J = 3,6 Hz, J = 11,1 Hz, J = 14,5 Hz, Leu β-CH). 4 (derivado de cadeia aberta da fórmula IV): (2 confórmeros 68:32, confórmeros major e minor marcados com * e 0 respectivamente): 8,16, 8,12, 8,05, 8,00 (4d, NH); 7,58°, 7,55* (2d, J = 8 Hz, MeMeOTrp 4’-H); 7,38*° (d, MeMeOTrp OH-7’); 7,22*, 7,20ao (2m, MeMeOTrp H-6'); 7,15* 7,12° (2s, MeMeOTrp H-2'); 7,07*, 7,03° (2m, MeMeOTrp H-5'); 6,57 (s br, NH); 5,10° (bd, al-H); 5,17* (dd, ácido hidroxibutírico al-H); 5,11*° (m, MeLeu al-H); 5,04*° (dd, al-H); 4,99* (ddd, al-H); 4,88° (ddd, al-H); 4,51° (dd); 4,53* (m, Leu Al-H); 4,48° (m); 4,42* (m br, MeAla al-H); 4,05*, 4,03° (2s, N-OMe); 3,88 (q, J = 7 Hz, MeAla al-H); 3,71°, 3,68* (2s, COOH Me); 3,57* 3,54° (2s, COOMe); 3,47* (m br, MeMeOTrp al-H); 3,27°, 3,21* (2s, NMe); 3,2 (m, MeMeOTrp β-Η.,); 3,00* (s, NMe); 2,9 (m, MeMeOTrp β-Ηϋ); 2,64° (s, NMe); 2,32*, 2,28° (2s, NMe); 2,33- 2,13 (m); 2,20 (m); 1,86 (m); 1,7 - 1,1 (m); 1,50°, 148* (2d, J = 7Hz, MeAla β-Me); 0,97 - 0,93 (m); 0,90 - 0,76 (m). -45- 5 (3 confórmeros 2:2:1, confórmero menor marcado com *): 8,81 (d, J = 10 Hz, NH); 7,93 (d, J = 10 Hz, NH); 7,79 (d, J = 9 Hz, NH); 7,65 (m br, NH); 7,54 (m, MeMeOTrp H-4'); 7,38, 7,37 7,34* (ddd, J = 8 Hz, MeMeOTrp H-7'); 7,19 (m MeMeOTrp H-6'); 7,08 - 6,98 (m MeMeOTrp H-5'); 7,02 (s, MeMeOTrp H-2’); 6,14 (d, J = 10 Hz Leu NH); 6,29* (d, J - 7 Hz, Leu NH); 6,07 (d, J 6 Hz, Leu NH); 5,25 (m, al-H); 5,12- 4,92 (al-H); 4,84 (m, al-H); 4,69 (m, al-H); 4,43 (m, al-H); 4.29 (m, al-H); 4,03* , 4,02, 4,00 (3s, N-OMe); 3,98 (m, al-H); 3,63 -3,3 (m), 3,39 - 3,34* (s br NMe); 3,21 (s, NMe); 3,18* (s, NMe); 3,13 (m); 3,07* (s NMe); 3,04* (s, NMe); 2,91 (s, N-Me); 2,53 (s, NMe); 2,37 (s br, NMe); 2,5-1,05 (m); 1,47, 1,43, 1,41* (3d, J = 7Hz, MeAla β -Me); 1,03 (d, J = 6,5 Hz); 0,98- 0,83 (m); 0,68*, 0,55, 0,47, -0,02 (4d, J = 6,6 Hz, Leu Me); -0,32 (ddd, Leu β-CH). 6 (3 confórmeros 4:3:1, confórmero menor marcado com *): 8,82 (d, J = 10 Hz, NH); 7,95* (d, J = 9,3 Hz, NH); 7,90 (d, J = 9,8 Hz, NH; 7,80 (d, J = 9,4 Hz, NH); 7,59, 7,53 (2d, J = 8 Hz, MeMeOTrp H-4'); 7,45- 7.30 (m, MeMeOTrp H-7'); 7,23-7,15 (m, MeMeOTrp, H-6'); 7,20, 7,18 (2s, MeMeOTrp H-2'); 7,11 - 7,03 (m MeMeOTrp H-5'); 6,86 (q, J -5Hz, MfíMe); 6,23 (d, 9,5 Hz, Leu NH); 5,95 (d, J = 6,5 Hz, Leu NH; q, NHMe); 5,84* (d, J = 8,9 Hz, Leu NH); 5,55 (q, 5 Hz NMe); 5,3-4,95 (m, al-H); 4,84 (ddd, al-H); 4,69 (ddd, al-H); 4,42 (dd MeLeu al-H); 4,34 (ddd, Leu al-H); 4,05*, 4,03, 4,02 (3s, N-OMe); 3,98 (m, al-H); 3,63-3,52 (m, al-H); 3,47 (q, Ala al-H); 3,37, 3,35*, 3,24*, 3,22, 3,20 (5s, NMe); 3,3-3,2 (m); 3,03*, 2,92 (2s, NMe); 2,85, 2,74, 2,70* (3d, J = 5 Hz NH-Me); 2,53, 2,52 (2s, NMe); 2,23-1,93 (m); 1,85-1,05 (m); 1,53, 1,47, 1,44* (3d, J = 7 Hz, MeAla β-Me); 1,03 (d, J = 6,5 Hz); 0,98-0,90 (m); 0,57*, 0,55, 0,38*, 0,08 (4d, J = 6,6 Hz, Leu Me); -0,30 (ddd, Leu, β-CH). -46- 7 (3 confórmeros 40:53:7, marcados com * ° '): 8,81* (d, J = 10 Hz, C9AA NH); 7,88* (d, J = 10Hz, C9AA NH); 7,78° (d, J = 10 Hz, NH); 7,57° (d, J = 10 Hz, NH); 7,52*° (2d, J = 7 Hz, MeMeOTrp H-4’); 7,39*, 7,37° (2d, J = 8 Hz MemeOTip H-7'); 7,27* (s, MeMeOTrp H-2'); 7,20, 7,18 (2m, MeMeOTrp, H-6'); 7,17° (s, MeMeOTrp H-2'); 7,03°, 7,01* (2m, MeMeOTrp H-5’); 6,17° (d, J.= 10 Hz, Leu NH); 5,98° (d, J = 6 Hz, Leu NH); 5,77’ (d, J = 10 Hz, Leu NH); 5,31° (ddd, MeAla al-H); 5,19* (dd, ácido hidroxibutírico al-H); 5,05 - 4,94 (m, al-H); 4,88-4,83 (m, al-H); 4,70 - 4,74 (m, al-H); 4,48* (dd, MeLeu al-H); 4,32* (m, Leu al-H); 4,03*, 4,02° (2s, N-OMe); 3,93° (m, al-H); 3,7-3,5 (m, morfolina); 3,5-3,2 (m); 3,40° (s, N-Me); 3,34° (dd, MeMeOTrp H-pa); 3,22 (m, MeMeOTrp H-pb); 3,20° (s, N-Me); 3,17* (s, N-Me); 2,93* (s, MeMeOTrp N-Me); 2,54* (s, MeLeu N-Me); 2,53° (s, N-Me); 2,4-2,35(m); 2,2-1,9 (m); 1,83-1,05 (m); 1,53*, 1,50° (2d, J = 7 Hz, MeAla p-Me); 1,04 (d, J = 5 Hz, MeLeu Me); 1,00-0,77 (m); 0,57* (d, J = 6,6 Hz, LeuMe); 0,52', 0,34 (2d, J = 6,6 Hz, Leu Me); 0,09* (d, J 6,6 Hz, Leu Me); -0,25 (ddd, Leu P-CH). 8 (2 confórmeros 45:55, marcados com *°): 8,84* (d, J = 10 Hz, CgAA NH); 7,87* (d, J = 10 Hz C9AA NH); 7,77° (d, J = 10 Hz, NH); 7,57° (d, J = 10 Hz, NH), 7,55*, 7,52° (2d, J = 7 Hz, MeMeOTrp H-4'); 7,36*, 7,35° (2d, J = 8 Hz, MeMeOTrp H-7'); 7,36* (s, MeMeOTrp H-2’); 7,23* (s, MeMeOTrp H-2'); 7,20, 7,17 (2m, MeMeOTrp H-6'); 7,03°, 7,01* (2m, MeMeOTrp H-5'); 6,17° (d, J = 10 Hz, LeuNH); 5,95* (d, J = 6 Hz, Leu NH); 5,31° (ddd, MeAla al-H); 5,24* (dd, ácido hidroxibutírico al-H); 5,05-4,97 (m, al-H); 4,93 (dd, al-H); 4,87 (dd, al-H); 4,88-4,83 (m, al-H); 4,66-4,60 (m, al-H); 4,48* (dd, MeLeu al-H); 4,38* (dd, Leu al-H); 4,15-4,00 (m); 4,03*, 4,02° (2s, N-OMe); 3,98 -47- (m, al-H); 3,7-3,2 (m); 3,40 (s, N-Me); 3,20° (s, N-Me), 3,17* (s, N-Me); 3,05-2,9 (m); 2,99, 2,98 (2s, CON-Me); 2,96 (s, 2xCON-Me); 2,92* (s, MeMeOTtp N-Me); 2,54 (s, MeLeu N-Me e N-Me); 2,4-2,25 (m); 2,15-1,9 (m); 1,83-1,05 (m); 1,53*, 1,50° (2d, J = 7 Hz, MeAla β-Me); 1,04 (d, J = 6,5 Hz, MeLeu Me); 1,00-0,83 (m); 0,79, 0,74* (2d); 0,57* (d, J = 6,6 Hz, LeuMe); 0,13° (d, J = 6,6 Hz, Leu Me); -0,25 (dd, Leu β-CH). 9 (3 confórmeros 70:28:2, marcados com * 0 '): 8,89* (d, 10Hz, PrLeuô NH); 7,89* (d, 10 Hz, PrLeu2 NH); 7,77° (d, 10 Hz, PrLeuô NH); 7,52° (d, 8 Hz, indol H-4’); 7,50° (d, PrLeu2 NH); 7,48* (d, 8 Hz, indol H-4'); 7,38* (d, 8 Hz, indol H-T); 7,37° (d, 8Hz, indol H-7'); 7,19° (dd, indol H-6’); 7,18 (dd, indol H-6’); 7,13° (s, indol H-2’); 7,02* (s, indol H-2’); 6,99° (dd, indol H-5’); 6,90 (dd, indol H-5’) 6,18° (d br, 10 Hz, LeuNH); 5,93* (d, 6 Hz, Leu NH); 5,83’ (d, Leu NH); 5,30° (ddd, PrLeuô a-H); 5,30* (dd, Hba a-H); 5,02* (ddd, PrLeu6 a-H); 5,00° (ddd, PrLeu2 a-H); 4,89* (dd, MeTrp a-H); 4,84* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,71° (ddd, a-H); 4,44* (dd, MeLeu a-H); 4,37* (ddd, Leu a-H); 4,03*, 4,02° (2s, N-OMe); 3,63-3,52; 3,49* (q, 7 Hz MeAla α-H); 3,40° (s, N-Me); 3,38* (dd, MeTrp β-Ha); 3,26-3,20; 3,23* (s, MeAla N-Me); 3,21 (s, N-Me); 2,93* (s, MeTrp N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,52° (s, N-Me); 2,45-1,75; (2,33,2,15 (2m, aziridina); 1,56-1,07; 1,50* (d, 7 Hz, MeAla β-Me); 1,47° (d, 7 Hz, MeAla β-Me); 1,03* (d, 6,5 Hz, MeLeu, d-Me); 0,98-0,83; 0,48* (d, 6,6 Hz, Leu6’ -Me); -0,13° (d, 6,6 Hz, Leu Ô"-Me); -0,48* (ddd, Leu y-CH). 10 (3 confórmeros 45:51:4, marcados com * ° '): 8,86* (d, 10 Hz, PrLeuô NH); 7,87* (d, 10 Hz, PrLeu2 NH); 7,75° (d, 10 Hz, PrLeuô NH); 7,75* (d, 8Hz, indol H-4'); 7,41° (s, indol H-4'); 7,55° (d, PrLeu2 NH); 7,51° -48- (d, 8 Hz, indol H-4'); 7,41° (s, indol H-2’); 7,38* (d, 8 Hz, indol H-7'); 7,36°(d, 8Hz, indol H-7'); 7,29* (s, indol H-2'); 7,18 (dd, indol H-6'); 7,03° (dd, indol H-5’); 7,01* (dd, indol H-5'); 6,17° (d br, 10 Hz, Leu NH); 5,94* (d, 6 Hz, Leu NH); 5,79' (q, Leu NH); 5,30° (ddd, PrLeu 6a -H); 5,27* (dd, a-H); 5,27* (dd, a-H); 5,00* (ddd, PrLeuó a-H); 4,98° (ddd, a-H); 4,93° (dd, a-H); 4,87* (dd, a-H); 4,85* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,63° (ddd, a-H); 4,47* (dd, MeLeu a-H); 4,40 (m); 4,02* (ddd, Leu a-H); 4,01 (2s, N-OMe); 3,68-3,22; 3,40° (s, N-Me); 3,20° (s, N-Me); 3,18* (s, MeAla N-Me); 2,91* (s, MeTrp N-Me); 2,55° (s, N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,35-1,05; 1,54* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1.50° (d, 7 Hz, MeAla β-Me); 1,03* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,98-0,83; 0,78° (d, 6Hz, Leu δ'-Me); 0,73° (d, 6Hz, Leu δ''-Me); 0,57* (d, 6,6Hz, Leu δ'-Me); 0,16* (d, 6,6 Hz, Leu δ''-Me); -0,27* (ddd, Leu γ-CH). 11 (3 confórmeros 46:51:3 marcado com * ° '): 8,87* (d, 10Hz, PrLeuó NH); 7,87* (d, 10 Hz, PrLeu2 NH); 7,76° (d, 10 Hz, PrLeuó NH); 7,56° (d, PrLeu2 NH); 7,55* (d, 8Hz, indol H-4’); 7,52° (d, 8 Hz, indol H-4'); 7,37 (d, 8Hz, indol H); 7,36 (d, 8Hz, indol H); 7,36° (s, indol H-2'); 7,22* (s, indol H-2'); 7,20* (dd, indol H-6’); 7,18° (dd, indol H-6’); 7,03° (dd, indol H-5'); 7,00* (dd, indol H-5'); 6,16° (d, 10Hz, Leu NH); 5,94* (d, 6 Hz, Leu NH); 5,78’ (d, Leu NH); 5,31° (ddd, PrLeuó a-H); 4,47* (dd, MeLeu a-H); 4,33 (m); 4,03, 4,01 (2s, NOMe); 4,00 (ddd, a-H); 3,75-3,20; 3,40 (s, N-Me); 3,20 (s, N-Me); 3,18* (s, MeAla N-Me); 2,91* (s, MeTrp N-Me); 2,53 (s, N-Me); 2,53° (s, MeLeu N-Me); 2,45-1,07; 1,53* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,49° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,03* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,98-0,83; 0,79 (d, 6Hz, Me); 0,74 (d, 6Hz, Me); 0,55* (d, 6,6 Hz, Leu δ'-Me); 0,07* (d, 6,6Hz, Leu δ''-Me); -0,36* (ddd, Leu β-CH). -49- 12 (4 confórmeros 27:33:17:33 marcados com + 0 ' "): 98,9* (d, 10Hz, PrLeuó NH); 8,82' (d, 10Hz, PrLeuó NH); 7,9* (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,86' (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,76°(d, 10 Hz, Prleuó NH); 7,75* (d, 10Hz, PrLeuó NH); 7,24* (s, indol); 7,03* (dd, indol); 6,17” (d br, 10 Hz, Leu NH); 6,17° (d br, 10Hz, Leu NH); 6,03' (d, 6Hz, Leu NH); 4,02” (s); 4,02° (s); 4,02* (s); 4,02' (s); 3,40 (s, N-Me); 3,40 (s, N-Me); 3,20 (s, N-Me); 3,20 (s, N-Me); 3,17 (s, N-Me); 2,97 (s, N-Me); 2,94 (s, N-Me); 2,94 (s, N-Me); 2,93 (s, N-Me); 2,91 (s, N-Me); 2,56 (s, N-Me); 2,56 (s, N-Me); 2,53' (s, MeLeu N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 1,53* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,53' (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,50° (d, 7 Hz, MeAla β-Me); 1,50" (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,50” (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,03' (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 1.03* (d, 6,5 Hz, MeLeu d-me); 0,78° (d, 6,6 Hz, Leu δ'-Me); 0,77” (d, 6,6 Hz, Leu δ'-Me); 0,77" (d, 6,6Hz, Leu δ'-Me); 0,72" (d, 6,6Hz, Leu δ’’-Me); 0,72° (d, 6,6 Hz, Leu δ "'-Me); 0,61’ (d, 6,6Hz, Leu δ'-Me); 0,55* (d, 6,6Hz, Leu δ’-Me); 0,21’ (d, 6,6 Hz, Leu δ''-Me); -0,17' (ddd, Leu γ-CH); -0,31* (ddd, Leu γ-CH). 13 (2 confórmeros 55:45, confórmeros major e minor marcados com * e ° respectivamente): 8,80* (d, J = 10Hz, NH); 7,88* (d, J = 10Hz, NH); 7,70° (d, J = 10Hz, NH); 7,57° (d, J = 10Hz, NH); 7,52*, 7,51° (2d, J = 7Hz, MeMeOTrp H-4’); 7,39*, 7,37° (2d, J = 8Hz, MeMeOTrp H-7'); 7,20*° (m, MeMeOTrp, H-6'); 7,16°, 7,09* (2s, MeMeOTrp H-2'); 7,03*° (2dd, MeMeOTrp H-5'); 6,17° (d, J = 10Hz, Leu NH); 5,97* (d, J = 6Hz, Leu NH); 5,31° (m, MeAla al-H); 5,11-4,96 (m, al-H); 4,92* (dd, MeMeOTrp al-H); 4,87 (ddd, al-H); 4,69° (m, Leu al-H); 4,47* (dd, MeLeu al-H); 4,27* (dd, Leu al-H); 4,03*, 4,02° (2s, N-OMe); 3,92 (dd); 3,65-3,15 (m); 3,47* (q, J = 7Hz, MeAla al-H); 3,41° (s, N-Me); 3,21* (s, MeAla NMe); 3,20° (s, N-Me); 2,29* (s, MeMeOTrp N-Me); -50- 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,51° (s, N-Me); 2,35-2,75 (m), 2,35-2,75 (m); 1,7-1,05 (m); 1,53* (d, J = 7Hz, MeAla β-Me); 1,49° (d, J = 7Hz, MeAla β-Me); 1,28*, 1,25*, 1,23°, 1,18° (4d, J = 6Hz, COOCHMe2); 1,04 (d, J = 6,5 Hz, MeLeu Me); 0,98-0,83 (m); 0,55* (d, J = 6,6 Hz, Leu Me); 0,05* (d, J = 6,6, Leu Me); -0,31 (ddd, Leu β-CH).
14 (3 confórmeros 55:43:2, marcados com * ° '): 8,82* (d, J = 10Hz, CgAA NH); 7,85* (d, J = 10Hz, CgAA NH); 7,78° (d, J = 10Hz, NH); 7,58° (d, HJ = 10 Hz, NH); 7,52*, 7,51° (2d, J = 7Hz, MeMeOTrp H-4'); 7,39*, 7,37° (2d, J = 8 Hz, MeMeOTrp h-7'); 7,22*, 7,21° (2m, MeMeOTrp, H-6'); 7,14°, 7,08* (2s, MeMeOTrp H-2'); 7,03*° (2dd, MeMeOTrp H-5'); 6,17° (d, J = 10 Hz, Leu NH); 5,95* (d, J = 6 Hz, Leu NH); 5,78' (d, J = 10 Hz, Leu NH); 5,31° (ddd, MeAla al-H); 5,12* (dd, ácido hidroxibutírico al-H); 5,05-4,98 (m, al-H); 4,91* (dd, MeMeOTrp al-H); 4,86* (ddd, C9AA al-H) 4,73-4,68 (m, Leu al-H); 4,47* (dd, MeLeu al-H); 4,32-4,26 (m, Leu al-H); 4,25 (dq, J = 11Hz, J - 7Hz, COOCH2-); 4,15-4,07 (m, COOCtf2-); 4,04*, 4,03° (2s, N-OMe); 3,84° (m, al-H); 3,64-3,50 (m); 3,47* (q, J = 7 Hz, MeAla al-H); 3,41° (s, N-Me); 3,34° (dd, MeMeOTrp H^a); 3,22 (m, MeMeOTrp Η-βό); 3,20* (s, MeAla NMe); 3,19° (s, N-Me); 2,93* (s, MeMeOTrp N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,52° (s, N-Me); 2,4-2,1 (m); 2,05-1,9 (m); 1,83-1,76 (m); 1,7-1,07 (m); 1,53*, 1,49° (2d, J = 7Hz, MeAla β-Me); 1,30, 1,25 (2t, J = 7Hz, COOCH3); 1,04 (d, J = 6,5 Hz, MeLeu Me); 1,00-0,84 (m); 0,55* (d, J = 6,6 Hz, Leu Me); 0,03* (d, J - 6,6 Hz, Leu Me); -0,32 (ddd, Leu β-CH). (3 confórmeros 57:41:2, marcados com * ° '): 8,82* (d, J = 10 Hz, CgAA NH); 7,90* (d, J = 10 Hz, C9AA NH); 7,78° (d, J = 10 Hz, NH); 7,58° (d, J = 10 Hz, NH); 7,52*° (2d, J = 7 Hz, MeMeOTrp H-4’); 15 -51 - 7,39*, 7,38° (2d, J = 8Hz, MeMeOTrp H-7'); 7,22*, 7,21° (m, MeMeOTip, H-6'); 7,14°, 7,08* (2s, MeMeOTrp H-2'); 7,03°, 7,02*(2m, MeMeOTrp H-5'); 6,17° (d, J = 10 Hz, Leu NH); 5,98* (d, J = 6 Hz, Leu NH); 5,82’ (d, J = 10 Hz, Leu NH); 5,31° (ddd, MeAla al-H); 5,12* (dd, ácido hidroxibutírico al-H); 5,05-4,98 (m, al-H); 4.91* (dd, MeMeOTrp al-H); 4,86* (ddd, CgAA al-H) 4,73-4,68 (m, Leu al-H); 4,47* (dd, MeLeu al-H); 4,28* (m, Leu al-H); 4,2-3,95 (m, COOCfí2); 4,03*, 4,02° (2s, N-OMe); 3,90° (m, al-H); 3,64-3,42 (m); 3,47* (q, J = 7Hz, MeAla al-H); 3,41° (s, N-Me); 3,34° (dd, MeMeOTrp Η-ββ); 3,32 (m, MeMeOTrp Η-βό); 3,20* (s, MeAla NMe); 3,19°(s, N-Me); 2,93* (s, MeMeOTrp N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,52° (s, N-Me); 2,4-2,1 (m); 2,03-1,9 (m); 1,83-1,76 (m); 1,72-1,58 (m, COOCH2CH2CH3); 1,55-1,07 (m); 1,53*, 1,49° (2d, J = 7Hz, MeAla β-Me); 1,04 (d, J = 6,5 Hz, MeLeu Me); 1,00-0,84 (m); 0,54* (d, J = 6,6 Hz, Leu Me); 0,02* (d, J = 6,6 Hz, Leu Me); -0,34 (ddd, Leu β-CH). (2 confórmeros 70:30, marcados com * e 0 respectivamente): 8,92*, 7,87*, 7,75°, 7,58° (4d, J = 10Hz); 7,49* (d, J = 8 Hz, MeMeOTrp H-4'); 7,37* (d, J = 8Hz), MeMeOTrp H-7'); 7,20* (dt, MeMeOTrp H-6’); 7,18°, 7,03* (2s, MeMeOTrp H-2'); 7,03°, 6,97* (2 dt, MeMeOTrp H-5'); 6,20° (d, J = 10Hz, Leu NH); 5,96* (d, J = 7Hz, Leu NH); 5,33* (m, ácido hidroxibutírico al-H); 5,02 (m, al-H); 4,90* (dd, al-H); 4,83* (ddd, al-H): 4,79* (dd, al-H); 4,79* (dd, al-H); 4,70° (m, al-H); 4,39* (dd, al-H); 4,38° (m, al-H); 4,03* (s, N-Ome); 3,92° (m); 3,63-3,53 (m); 3,44-3,40 (m); 3,39°, 3,32° (2s, NMe); 3,32-3,18 (m); 3,17* (s, MeAla NMe); 2,94* (s, MeMeOTrp NMe); 2,53* (s, MeLeu NMe); 2,52° (s, NMe); 2,52-2,3 (m); 2,1-1,1 (m); 2,17*, 2,11° (2s, COMe); 1,51*, 1,48° (2d, J = 7Hz, MeAla β-Me); 1,03* (d, J = 6,5 Hz); 0,98-0,83 (m); 0,52*, -52- -52-
casa -0,11* (d, J = 6,6 Hz, Leu Me); -0,39* (ddd, Leu β-CH). 17 (3 confórmeros 45:40:15, marcados com * 0 '): 8,78° (d, J = 9,9 Hz, NH); 7,83* (d, H = 9,7 Hz, NH); 7,76' (d, NH); 7,59' (d, J = 7,8 Hz, MeMeOTrp H-4'); 7,57 (d, J = 9,5 Hz, NH); 7,56, 7,53 (2d, J = 8Hz, MeMeOTrp H-4'); 7,46' (s, MeMeOTrp H-2'); 7,42*, 7,39° (3d, J = 8,2 Hz, MeMeOTrp H-7'); 7,24*, 7,22°, 7,18' (3t, MeMeOTrp H-6'); 7,11*, 7,08', 7,06° (3t, MeMeOTrp H-5'); 7,04*, 7,03° (2s, MeMeOTrp H-2’); 6,52° (d, J - 9,5 Hz, Leu NH); 6,03* (d, J = 7Hz, Leu NH); 5,99' (d, J = 8,8 Hz, Leu NH); 5,28* (m, al-H); 5,13' (t, J = 4Hz, OH); 5,09-4,98 (m, al-H); 5,02 (t, J = 4Hz, OH); 4,97 (dd, al-H), 4,88 (dd, al-H); 4,84 (m, al-H); 4,78-4,70 (m, al-H); 4,41 (dd, MeLeu al-H); 4,18 (ddd, Leu al-H); 4,04, 4,02 (2s, N-OMe); 3,78 (m, al-H); 3,65-3,35 (m); 3,42°, 3,32', 3,22*, 3,20° (4s, NMe); 3,17-3,08 (m); 3,03', 2,92*, 2,52*, 2,51° (5s, Nme); 2,01-1,1 (m); 1,53, 1,49, 1,40' (3d, J = 7Hz, MeAla β-Me); 1,04 (d, J = 6,5 Hz); 0,98-0,83 (m); 0,72', 0,60*, 0,56', 0,03* (4d, J = 6,6 Hz, Leu Me); -0,16 (ddd, Leu β-CH). 18 (3 confórmeros 73:20:7, marcados com * ° '): 8,54° (d, J = 10Hz, NH); 8,38' (s br, MeTrp N’-H); 8,26*, 8,17° (2d br, J = 2 Hz, MeTrp N'-H); 8,13*, 8,03°, 8,01' (3d, J = 9,7 Hz, NH); 7,78* (d, J - 7,7 Hz, MeTrp H-4'); 7,74, 7,70', 7,63°, 7,63° (4d); 7,46*, 7,44°, 7,40' (3d, J = 8Hz MeTrp H-7'); 7,27* (dt, MeTrp H-6'); 7,20*, 7,17° (2dt, MeTrp H-5'); 7,09°, 7,03* (2d, J = 2Hz, MeTrp H-2'); 6,33° (d, J = 10Hz, Leu NH); 6,17* (d, J = 7,4 Hz, Leu NH); 5,97' (d, J = 9Hz, Leu NH); 5,38° (m, al-H); 5,27* (dd, ácido hidroxibutírico al-H); 5,21° (dd, al-H); 5,12* (ddd, al-H); 5,07* (dd, al-H); 4,96* (ddd, al-H); 4,87 (m); 4,55* (dd, MeLeu al-H); 4,29* (ddd, Leu al-H); 3,85-3,25 (m); 3,76* (q, J = 7Hz, MeAla al-H); 3,49°, 3,36' (2s, NMe); 3,13* (s, MeAla NMe); 3,29°, 3,13’ (2s, -53- NMe); 3,02* (s, MeTrp NMe); 2,62° (s, NMe); 2,60* (s, MeLeu NMe); 2,38-1,15 (m); 1,62*, 156°, 1,51' (3d, J = 7Hz, MeAla β-Me); 1,13* (d, J = 6,5 Hz MeLeu); 1,07-0,93 (m); 0,73’, 0,63*, 0,58', 0,02* (4d, J - 6,6 Hz, Leu Me); -0,28* (ddd, Leu β-CH). 19 (3 confórmeros 67:29:4, marcados com * ° '): 9,52* (t, J = 1,5Hz, CHO); 9,41° (t, J = 1Hz, CHO); 9,05’ (m, CHO); 8,73* (d, J = 10Hz, C9AA NH); 7,86* (d, J = 10 Hz, CgAA NH); 7,77° (d, J = 10Hz, NH); 7,60° (d, J = 10 Hz, NH); 7,47*° (2d, J = 7 Hz, MeMeOTrp H-4’); 7,38*° (ed, J = 8 Hz, MeMeOTrp H-7'); 7,20*° (2t, MeMeOTrp, H-6'); 7,15°, 7,04* (2s, MeMeOTrp H-2'); 7,03° (m, MeMeOTrp H-5'); 7,00* (dd, MeMeOTrp H-5); 6,22° (d, J = 10 Hz, Leu NH); 6,02* (d, J - 6 Hz, Leu NH); 5,87' (d, J = 10 Hz, Leu NH); 5,29° (ddd, MeAla al-H); 5,17* (dd, ácido hidroxibutírico al-H); 5,03-4,93 (m, al-H); 4,91* (dd, MeMeOTrp al-H); 4,84* (ddd, CgAA al-H); 4,79-4,64° (m, Leu al-H); 4,43* (dd, MeLeu al-H); 4,35* (ddd, Leu al-H); 4,04', 4,03*, 4,02° (3s, N-Ome); 3,81° (m, al-H); 3,63° (dd); 3,57-3,50 (m); 3,48-3,42 (m); 3,43* (q, J = 7Hz, MeAla al-H); 3,38° (s, N.-Me); 3,30-3,12 (m); 3,20° (s, N-Me); 3,15* (s, MeAla NMe); 2,93* (s, MeMeOTrp N-Me); 2,58° (s, N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,25 (m, Ctf2-CHO); 2,15-1,9 (m); 1,85-1,74 (m); 1,65-1,08 (m); 1,48*, 1,45° (2d, J = 7Hz, MeAla β-Me); 1,04* (d, J=6,5 Hz, MeLeu Me); 0,98-0,83 (m); 0,67', 0,58*, 0,52’, 0,01* (4d, J = 6,6 Hz, Leu Me); -0,20* (ddd, Leu β-CH). 20 (2 confórmeros 1:1): 8,77 (d, J = 10 Hz, C9AA NH); 7,79 (d, J = 10 Hz, CgAA NH); 7,73 (d, J = 10 Hz, NH); 7,65 (d, J = 10 Hz, NH); 7,44, 7,44, 7,39 (4d, MeMeOTrp H-4' e H-7'); 7,25, 7,22 (2t, MeMeOTrp, H-6'); 7,13-7,03 (m, MeMeOTrp H-5'); 7,02, 6,98 (2s, MeMeOTrp H-2’); 6,19 (d, J = 10 Hz, Leu NH); 6,00 (d, J = 6 Hz, Leu NH); 5,80-5,53 (m, -54- olefma-H); 5,31 (ddd, MeAla al-H); 5,08-4,67 (m, al-H, olefina-H); 4,47 (dd, MeLeu al-H); 4,15-3,98 (m); 4,05, 4,02 (2s, N-Ome); 3,7-3,0 (m); 3,44, 3,21, 3,20, 2,92, 2,52, 2,44 (6s, N-Me); 2,15-1,90 (m); 1,90-1,08 (m); 1,55, 1,50 (2d, J = 7 Hz, MeAla β-Me); 1,05 (d, J = 6,5 Hz, MeLeu Me); 1,0-0,8 (m); 0,60, 0,06 (2d, J = 6,6 Hz, Leu Me); -0,20 (ddd, Leu β-CH). 21 (3 confórmeros 44:53:3, marcados com * 0 '): 8,81* (d, 10 Hz, PrLeuó NH); 7,78, 7,73, 7,67 (3d, 10 Hz, NH); 7,43, 7,42 (2d, 8Hz, indol H-4'); 7,37 (d, 8 Hz, indol H-7'); 7,28-7,00; 7,02, 6,97 (2s, indol H-2'); 6,21° (d, 10 Hz, Leu NH); 5,97* (d, 6 Hz, Leu NH); 5,75' (d, Leu NH); 5,50-4,65; 4,47* (dd, MeLeu a-H); 4,05 (ddd, cx-H); 4,04 (s, OMe); 4,02 (s, OMe); 3,65-3,10; 3,44° (s, MeAla N-Me); 3,22 (s, MeAla N-Me); 3,19 (s, N-Me); 2,93* (s, Me Trp N-Me); 2,52, 2,39 (2s, N-Me); 2,15-0,82; 1,54*, 1,50° (2d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,04* (d, 6,5 Hz, MeLeu d-me); 0,57* (d, 6,6 Hz, Leu δ'-Me); 0,48’ (d, Leu δ'-Me); 0,26' (d, Leu δ"-Me); -0,04 (d, 6,6 Hz, Leu δ''-Me). 22 (3 confórmeros 47:48:5, marcado com * ° '):8,63, 7,87, 7,77, 7,63 (2d, 10 Hz, PrLeu NH); 7,49* (d, 7Hz, indol H-4'); 7,48° (d, 7Hz, indol H-4’); .7,43* (d, 8Hz, indol H-7'); 7,41° (d, 8Hz, indol H-7'); 7,27* (dd, indol H-6'); 7,23° (dd, indol H-6'); 7,13* (dd, indol H-5'); 7,08° (dd, indol H-5'); 7,04° (s, indol H-2'); 7,02* (s, indol H-2'); 6,98’ (s, indol H-2'); 6,2° (d, 10 Hz, Leu NH); 6,01* (d, 7Hz, Leu NH); 5,79' (d, 9 Hz, Leu NH); 5,30° (ddd, PrLeuó a-H); 5,07* (dd, Hba a-H); 5,03* (ddd, PrLeu6 a-H); 4,86* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,79 (dd, MeTrp a-H); 4,47* (dd, MeLeu a-H); 4,18* (ddd, Leu a-H); 4,06 (s, N-OMe); 4,05' (s, N-OMe); 4,03 (s, N-OMe); 3,71-3,50; 3,42 (s, N-Me); 3,23-3,05; 3,20 (s, N-Me); 3,18 (s, N-Me); 2,52 (s, N-Me); 2,51 (s, N-Me); 2,03-1,08; -55- 1,54* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,50° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,05* (d, 6,5 Hz, MeLeu d-Me); 0,98-0,84; 0,63* (d, 6,6 Hz, Leu δ'-Me): 0,53' (d, 7Hz, Leu δ'-Me); 0,34' (d, 7Hz, Leu δ''-Me); 0,11* (d, 6,6Hz, Leu δ "-Me); -0,13* (ddd, Leu γ-CH). 23 (3 confórmeros 40:40:20, marcados com * 0'): 8,50* (d, 10 Hz, PrLeu6 NH); 8,20 (m); 7,98* (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,57* (d, 8Hz, indol H-4'); 7,53-7,35; 7,25-7,18; 7,23* (s, indol H-2’); 7,13-7,06; 7,05° (s, indol H-2'); 6,69 (d); 6,29 (d, br); 6,22 (d, br); 6,14° (d, 7Hz, Leu NH); 6,07* (d, 9Hz, Leu NH); 5,5° (ddd, PrLeuô a-H); 5,26-4,63 (m, a-H); 4,36 (m, MeLeu a-H)M 4,18* (ddd, Leu a-H); 4,04 (s, OMe); 4,03' (s, OMe); 4,02 (s, OMe); 3,68-2,78; 3,34 (s, N-Me); 3,19 (s, N-Me); 3,12 (s, N-Me); 3,o3 (s, N-Me); 2,91 (s, N-Me); 2,53 (s, N-Me); 2,10-1,05; 1,03-0,78; 0,76 (d); 0,71 (d, 6,5Hz, Leu g-Me); 0,60 (d, 6,6Hz, Leu g-Me); 0,08 (d, 6,6 Hz, Leu g-Me); -0,10 (ddd, Leu y-CH). 24 (3 confórmeros 43:47:5, marcados com * 0 '): 8,68* (d, 10Hz, PrLeu6 NH); 7,87* (d, 10 Hz, PrLeu2 NH); 7,80° (d, 10 Hz, NH); 7,55-7,37 (m, indol); 7,27-7,10 (m, indol); 7,08° (s, indol H-2'); 7,03* (s, indol H-2'); 6,58 (t, 8 Hz C=C); 6,23 (t, 8 Hz C=C); 6,18° (d, 6,7 Hz, Leu NH); 6,03* (d, 10 Hz, Leu NH); 5,80' (d, Leu NH); 5,31° (ddd, PrLeuó a-H); 5,08-4,91 (a-H); 4,86* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,77-4,68 M, a-H); 4,46* (dd, MeLeu a-H); 4,14* (ddd, Leu a-H); 4,05° (s, OMe); 4,03* (s, OMe); 4,02' (s, OMe); 3,17° (q, 7Hz, MeAla a-H); 3,60* (q, 7 Hz, MeAla a-H); 3,53-3,00; 3,44° (s, MeAla N-Me); 3,23 (s, N-Me); 3,20 (s, N-Me); 2,93* (s, MeTrp N-Me); 2,52 (s, N-Me); 2,44 (s, N-Me); 2,20-0,83; 1,56* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,51° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,05* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,62* (d, ,6,6Hz, Leu δ’-Me); 0,57' (d, Leu δ’-Me); 0,40' (d, δ’’-Me); 0,10* (d, 6,6 Hz, Leu δ’’-Me); -0,17* (ddd, Leu y-CH). 25 (3 confórmeros 51:45:4, marcados com * 0 '): 8,68* )d, 10 Hz, PrLeuó NH); 7,87* (d, 10 Hz, PrLeu2 NH); 7,81° (d, 10Hz, PrLeuó NH); 7,63° (d, 10 Hz, PrLeu2 NH); 7,53 (d, 8Hz, indol H-4'); 7,51 (d, 8Hz, indol H-4'); 7,43 (d, 8Hz, indol H-7’); 7,40 (d, 8Hzm indol H-7'); 7,26 (dd, indol H-6'); 7,23 (dd, indol H-6'); 7,13 (dd, indol H-5'); 7,07° (s, indol H-2'); 7,07 (dd, indol H-5’); 7,03* (s, indol H-2'); 6,21° (d, 10Hz, Leu NH); 6,05* (d, 6Hz, Leu NH); 5,79' (d, 10Hz, Leu NH); 5,32° (ddd, PrLeuó a-H); 5,14* (dd, Hba a-H); 5,03* (ddd, PrLeuó a-H); 4,87* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,83* (dd, MeTrp a-H); 4,77° (ddd, Leu a-H); 4,51* (dd, MeLeu a-H); 4,13* (ddd, Leu a-H); 4,06° (s, OMe); 4,03* (s, OMe); 3,68 (m); 3,57* (q, 7Hz, MeAla α-H); 3,44° (s, MeAla N-Me); 3,36* (dd, MeTrp β-Ha); 3,23 (dd, Me Trp β-Hb); 3,22 (s, N-Me); 3,17 (s, N-Me); 3,14 (dd); 2,96 (m, CCH); 2,93* (s, MeTrp N-Me); 2,53 (s, N-Me); 2,49 (s, N-Me); 2,25-1,97; 1,86-1,78; 1,55* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,52° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,50-1,09; 1,06* (d, 6,5 Hz, MeLeu d-Me); 1,00-0,85; 0,63* (d, 6,6Hz, Leu δ'-Me); 0,58' (d, Leu δ'-Me); 0,38' (d, Leu Ô"-Me); 0,07* (d, 6,6Hz, Leu δ''-Me); -0,11* (ddd, Leu γ-CH). 26 (mistura de 6:4 dos izómeros E/Z com 3 confórmeros cada, são dados apenas os sinais característicos):8,61, 8,48, 7,93, 7,84, 7,82, 7,74 (d, 10Hz, PrLeuNH); 7,52 (d, 8Hz, indol); 7,08 s (indol H-2'); 6,44, 6,22 (2dt, Ctf=CHCN); 6,36-6,26 (m); 6,13, 6,07, 5,87 (3d, Leu NH); 5,33-5,28 (m); 5,24, 5,20 (2dm, CH=C7/CN); 5,06-4,97 (m); 4,92 (2d); 4,87-4,75 (m); 4,49, 4,46 (2dd, MeLeu a-H); 4,28, 4,18 (2ddd, Leu a-H); 4,07, 4,06, 4,05, 4,03 (4s, N-OMe); 3,88, 3,82 (2q, 7Hz, MeAla a-H); 3,43, 3,40, 3,23, 3,21, 3,19, 3,12, 2,93, 2,55, 2,53, 2,52, 2,51 (lis, N-Me); 1,54-1,49 (5d, MeAla β-Me); 1,06, 1,04 (2d, 7Hz, MeLeu d-Me); 0,74, 0,65, 0,52, 0,26, 0,08 (5d, Leu g-Me); -0,04 (ddd, Leu γ-CH). -57- 27 (3 confórmeros 51:46:3, marcados com * ° '): 8,71* (d, 10Hz, PrLeu6 NH); 7,90* (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,76° (d, 10Hz, PrLeuó NH); 7,6° (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,52* (d, 8Hz, indol H-4’); 7,48° (d, 8Hz, indol H-4’); 7,42 (d, 8Hz, indol); 7,40 (d, 8Hz, indol); 7,26* (dd, indol H-6’); 7,13* (dd, indol H-5’); 7,07° (dd, indol H-5’); 7,03* (s, indol H-2'); 7,02° (s, indol H-2’); 6,16° (d, br, 10Hz, Leu NH); 6,01* (d, 6Hz, Leu NH); 5,77’ (d, Leu NH); 5,31 (ddd, a-H); 5,05-4,97; 4,86 (ddd, a-H); 4,82 (dd, a-H); 4,74 (m); 4,46* (dd, MeLeu a-H); 4,17* (ddd, Leu a-H); 4,05* (s, N-Ome); 4,03° (s, N-OMe); 3,68 (m); 3,57 (m); 3,47* (m, CH2C1); 3,43 (s, N-Me); 3,28* (dd, Me Trp β-Ha); 3,23* (s, MeAla N-Me); 3,21 (s, N-Me); 3,20 (dd, Me Trp β-Hb); 2,92* (s, MeTrp N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,49 (s, N-Me); 2,23° (dd, indol H-6’); 2,05-1,1; 1,54* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,50° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,05* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,98-0,85; 0,57* (d, 6,6Hz, Leu δ’-Me); 0,52' (d, Leu δ'-Me); 0,28 (d, Leu δ’’-Me); 0,06 (d, Leu Ô"-Me); -0,32* (ddd, Leuy-CH). 28 (3 confórmeros 37:59:4, marcados com * 0 '): 8,73* (d, 10Hz, PrLeuó NH); 7,8* (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,73° (d, 10Hz, PrLeuó NH); 7,63° (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,49° (d, 8Hz, indol H-4'); 7,47* (d, 8Hz, indol H-4'); 7,42* (d, 8Hz, indol H-7'); 7,38° (d, 8Hz, indol H-7’); 7,25 (dd, indol); 7,22° (dd, indol H-6’); 7,12* (dd, indol H-5'); 7,06° (dd, indol H-5'); 7,04 (s, indol H.2'); 7,03 (s, indol H-2'); 6,22° (d, br, 10Hz, Leu NH); 6,00* (d, 6Hz, Leu NH); 5,78' (d, Leu NH); 5,31° (ddd, PrLeuó a-H); 5,05-4,90; 4,87 (ddd, a-H); 4,79 (dd, a-H); 4,72 (m); 4,49* (dd, MeLeu a-H); 4,11* (ddd, Leu -H); 4,05* (s, N-OMe); 4,03° (s, N-OMe); 3,75-3,50; 3,43 (s, N-Me); 3,38-3,13; 3,28 (s, OMe); 3,28 (s, OMe); 3,23 (s, N-Me); 3,21° (s, N-Me); 2,92* (s, MeTrp N-Me); 2,53* -58- (s, MeLeu N-Me); 2,48° (s, N-Me); 2,00-1,08; 1,55* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,50° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,05* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,98-0,85; 0,60* (d, 6,6 Hz, Leu δ'-Me); 0,05* (d, 6,6Hz, Leu δ''-Me); -0,18* (ddd, Leu γ-CH). 29 (2 confórmeros 50:50 marcados com * °): 8,70* (d, 10Hz, PrLeu6 NH); 7,80* (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,71° (d, 10Hz, PrLeu6 NH); 7,69° (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,47-7,35; 7,24 (dd, indol); 7,21 (dd, indol); 7,04 (dd, indol); 7,01 (dd, indol); 7,01 (s, indol H-2’); 6,97 (s, indol H-2'); 6,25° (d br, 10Hz, Leu NH); 6,00* (d, 6Hz, Leu NH)); 5,30° (ddd, PrLeu6 a-H); 5,10-4,69; 4,49* (dd, MeLeu a-H); 4,07* (ddd, Leu a-H); 4,04* (s); 4,02° (s); 3,72-3,02; 3,41 (s, N-Me); 3,20 (s, N-Me); 3,20* (s, MeAla N-Me); 2,91* (s, MeTrp N-Me); 2,53 (s, N-Me); 2,45 (s, N-Me); 2,07-0,82; 1,55* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,50° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,04* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,6* (d, 6,6Hz, Leu δ'-Me); 0,41 (m, ciPr); -0,03* (d, 6,6Hz, Leu δ''-Me); -0,24* (ddd, Leu γ-CH). 30 (3 confórmeros 63:35:2 marcados com * ° '): 8,78° (d, 10Hz, PrLeu6 NH); 7,93*, 7,77° (2d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,47* (d, 8Hz, indol H-7'); 7,43* (d, 8Hz, indol H-4'); 7,40-7,23; 7,17°, 7,13* (2dd, indol H-6'); 7,04, 7,03 (2s, indol H-2'); 6,93° (dd, indol H-5'); 6,97, 6,93 (2s, CH-Fe2); 6,74* (dd, indol H-5'); 6,14° (d, 10Hz, Leu NH); 5,92* (d, 6Hz, Leu NH); 5,78' (d, Leu NH); 5,27° (ddd, PrLeu6 a-H); 5,12* (dd, Hba a-H); 4,98* (ddd, PrLeu6 a-H); 4,96* (dd, MeTrp a-H); 4,85* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,70° (ddd, a-H); 4,47* (dd, MeLeu a-H); 4,18* (ddd, Leu a-H); 4,00*, 3,97° (2s, OMe); 3,57° (dd, MeTrp β-Ha); 3,53° (dd, MeTrp β-Hb); 3,37* (dd, MeTrp β-Ha); 3,27* (dd, MeTrp β-Hb); 3,20, 3,19, 2,93, 2,83 (4s, N-Me); 2,66 (q, 7Hz); 2,55-2,33; 2,52 (s, N-Me); -59- 2,46 (s, N-Me); 2,27-1,92; 1,80 (m); 1,68-1,05; 1,35°, 128* (2d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,03* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,96-0,83; 0,53' (d, Leu δ'-Me); 0,49* (d, 6,6 Hz, Leu δ'-Me); 0,32' (d, Leu Ô"-Me); -0,12* (d, 6,6Hz, Leu δ''-Me); -0,49* (ddd, Leu γ-CH). 31 (mistura de confórmeros, apenas são apresentados sinais seleccionados): 7,13, 7,03 (2s, indol H-2'); 4,56, 4,40 (2m, aH); 4,03 (s, N-OMe); 3,42, 3,23, 3,07, 2,94, 2,53 (5s, N-Me); 0,57, 0,53 (2d, 6,6Hz, Leu δ'-Me); 0,17, 0,03 (2d, 6,6 Hz, Leu δ’’-Me); -0,03, -0,27 (2ddd, Leu β-CH). 32 (3 confórmeros 78:16:6, marcados com * 0 '): 8,45* (d, J=10Hz, PrLeu6 NH); 8,04* (d, J=10Hz, PrLeu2NH); 7,83° (d, J=10Hz, NH); 7,68*, 7,53° (2d, J=7Hz, indol H-4’); 7,30* (d, J=8Hz, indol H-7’); 7,23* (m, indol H-6'); 7,10* (dd, indol H-5’); 6,87°, 6,79* (2s, indol H-2'); 6,28° (d, J=10Hz, Leu NH); 6,07* (d, J=6Hz, Leu NH); 5,83’ (d, J=10Hz, Leu NH); 5,31° (ddd, PrLeu a-H); 5,18* (dd, Hba α-H); 5,13° (dd, Hba a-H); 5,05* (ddd, PrLeuô a-H); 4,98° (ddd, Leu a-H); 4,93* (dd, MeTrp a-H); 4,84* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,78° (ddd, PrLeu2 a-H); 4,47* (dd, MeLeu a-H); 4,13* (ddd, Leu a-H); 3,8-3,5 (m); 3,72*° (2s, MeTrp Nl'-Me); 3,69* (q, J=7Hz, MeAla α-H); 3,40° (s, MeAla N-Me); 3,28* (s, MeAla N-Me); 3,20 (s, MeAla N-Me); 3,20 (dd, MeTrp β-Hb); 3,12* (dd, MeTrp β-Ha); 2,93* (s, MeTrp, N-Me); 2,53° (s, N-Me); 2,52* (s, MeLeu N-Me); 3,21° (s, N-Me); 2,25-2,08 (m, Hba y-CH2, β-Ha); 1,92* (m, Hba β-Hb); 1,83-1,75 (m); 1,7-1,07 (m); 1,53*, 1,48° (2d, J=7Hz, MeAla β-Me); 1,04 (d, J=6,5Hz, Me Leu δ-Me); 0,97-0,84 (m); 0,53* (d, J=6,6Hz, Leu Me); 0,28’ (d); -0,17* (d, J=6,6Hz, Leu Me); -0,53* (ddd, Leu y-CH). -60- 33 (3 confórmeros 80:14:6, marcados com * ° '): 8,48* (d, 10Hz, PrLeuô NH); 7,94° (d, 10Hz, PrLeu NH); 7,68* (d, 8Hz, indol H-4'); 7,54° (d, indol); 7,33* (d, 8Hz, indol H-7'); 7,31° (d, 8Hz, indol); 7,22* (dd, indol H-6'); 7,1* (dd, indol H-5'); 7,53° (d, PrLeu NH); 6,93° (s, indol H-2'); 6,84* (s, indol H-2’); 6,26° (d, br, Leu NH); 6,05* (d, 7,5Hz, LeuNH); 5,84' (d, Leu NH); 5,31° (ddd, PrLeu6 a-H); 5,18* (dd, Hba α-H; 5,13° (dd, Hba a-H); 5,06* (ddd, PrLeuó a-H); 4,99° (ddd, Leu a-H); 4,93* (dd, MeTrp a-H); 4,87* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,8° (ddd, PrLeu2 a-H); 4,47* (dd, MeLeu a-H); 4,16* (ddd, Leu a-H); 4,1* (m, N-CH2); 3,78-3,57; 3,69* (q, 7Hz, MeAla a-H); 3,47-2,90; 3,42° (s, MeAla N.Me); 3,32* (dd, MeTrp β-Ha); 3,3* (s, MeAla N-Me); 3,23* (dd, MeTrp β-Hb); 3,21° (s, N-Me); 3,06' (s, N-Me); 2,93* (s, Me Trp N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,52° (s, N-Me); 2,32-2,10; (1,93* (m, Hba γ-CHb); 1,83-1,08; 1,53* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,48° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,04* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,97-0,84; 0,52* (d, 6,6Hz, Leu δ'-Me); 0,26’ (d, Leu δ’’-Me); -0,17* (d, 6,6Hz, Leu δ’’-Me); -0,55* (ddd, Leu γ-CH). 34 (3 confórmeros 71:24:5, marcados com * 0 '): 8,50* (d, 10Hz, PrLeuó NH); 8,06* (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,94° (d, 10Hz, PrLeu NH); 7,77° (d, 8Hz, indol H-4’); 7,72* (d, 8Hz, indol H-4'); 7,53° (d, 10Hz, PrLeu NH); 7,40-7,05, 6,92° (s, indol H-2'); 6,88* (s, indol H-2'); 6,23° (d, 9,4Hz, Leu NH); 6,09* (d, 7,4Hz, Leu NH); 5,87' (d, Leu NH); 5,32° (ddd, PrLeuó a-H); 5,23* (AB; N1'-CH2); 5,20* (AB; N1’-CH2); 5,17* (dd, Hba α-H); 5,14° (dd, Hba a-H); 5,04* (ddd, PrLeuó a-H); 4,99° (ddd, PrLeu2 a-H); 4,96* (dd, MeTrp a-H); 4,87* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,78° (ddd, Leu a-H); 4,78° (ddd, Leu a-H); 4,47* (dd, MeLeu a-H); 4,21* (ddd, Leu a-H); 3,76° (q, 7Hz, MeAla a-H); 3,73-3,65, 3,67* (q, 7Hz, MeAla α-H); 3,58° (dd, MeLeu a-H); 3,50-3,37, 3,42° (s, MeAla -61-
N-Me); 3,33* (dd, Me Trp β-Ha); 3,27* (s, MeAla N-Me); 3,23° (s, N-Me); 3,23* (dd, MeTrp β-Hb); 2,92* (s, MeTrp N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,52° (s, N-Me); 2,28-1,08, 1,53* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,49° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,06* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,98-0,82, 0,50' (d, Leu δ'-Me); 0,45* (d, 6,6Hz, Leu δ'-Me); 0,28' (d, Leu δ''-Me); -0,11* (d, 6,6Hz, Leu Ô"-Me); -0,47* (ddd, Leu γ-CH). 35 (3 confórmeros 1:1:1): 8,62, 8,43, 8,07, 7,94, 7,87, 7,42 (6d, J =10Hz, NH); 7,12 (d, J=7,4Hz, indolina arom. H); 7,08-6,99 (m, indolina arom, H); 6,72, 6,69, (2dd indolina arom. H); 6,66-6,63 (m, indolina arom. H); 6,58 (d, J=8Hz, indolina arom. H); 6,29 (d, J=8Hz, Leu NH); 6,15 (m, br, Leu NH); 5,88 (d, J=8Hz, Leu NH); 5,28-4,98 (m, a-H); 4,93 (ddd, cc-H); 4,74 (ddd, a-H); 4,65 (m, a-H); 4,43 (dd, a-H); 3,80-3,66 (m); 3,55-3,0 (m); 3,46, 3,35, 3,31, 3,24, 3,22, 3,12, 3,00, 2,82, 2,57 (9s, NMe); 2,55-1,1 (m); 1,52, 1,48, 1,43 (3d, J=7Hz, MeAla β-Me); 1,13 (d, J=7Hz); 1,03-0,83 (m); 0,78, 0,76,0,73 (3d, J=6,5Hz). 36 (3 confórmeros 73:23:4, marcados com * 0 '): 8,53* (d, J=10Hz, PrLeu NH); 8,06* (d, J=10Hz, PrLeu' NH); 7,95° (d, J=10Hz, NH); 7,67*, 7,52° (2d, J=7Hz, indol 4-H’); 7,55° (d, J=10Hz, NH); 7,33*, 7,31° (2d, J=8Hz, indol H-7'); 7,19*, 7,17° (2dd, indol H-6'); 7,08*, 7,04° (2dd, indol H-5'); 6,98', 6,88°, 6,80* (3s, indol H-2’); 6,23° (d, J=9,3Hz, Leu NH); 6,05* (d, J=7,5Hz, Leu NH); 5,84' (d, Leu NH); 5,33° (ddd, PrLeu a-H); 5,18* (dd, Hba α-H); 5,14° (dd, Hba a-H); 5,05* (ddd, PrLeu a-H); 4,98° (ddd, Leu a-H); 4,93* (dd, indol a-H); 4,87* (ddd, PrLeu' a-H); 4,47* (dd, MeLeu a-H); 4,22* (ddd Leu a-H); 3,86-3,67 (m); 3,83* (s, t-Bu-Ci/2-Ν); 3,69* (q, J=7Hz, MeAla α-H); 3,5-3,2 (m); 3,43° (s, MeAla N-Me); 3,30* (s, MeAla N-Me); 3,22° (s, N-Me); 2,93* (s, MeMeTrp, N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,53° (s, N-Me); 2,25 (m, -62-
Hba g-CH2); 2,18 (m, Hba β-Ha); 2,0-1,08 (m); 1,54*, 1,49° (2d, J=7Hz, MeAla β-Me); 1,05 (d, J=6,5Hz, MeLeu Me); 0,97-0,84 (m); 0,52* (d, J=6,6Hz, Leu Me); 0,28' (d); -0,06* (d, J=6,6Hz, Leu Me); -0,49* (ddd, Leu γ-CH). 37 (3 confórmeros 79:19:3, marcados com * ° '): 8,52* (d, 10Hz, PrLeu6 NH); 8,06* (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,94° (d, 10Hz, PrLeu NH); 7,68* (d, 8Hz, indol H-4’); 7,53° (d, 8Hz, indol H-4'); 7,52° (d, 10Hz, PrLeu NH); 7,36* (d, 8Hz, indol H-7'); 7,33° (d, 8Hz, indol H-7’); 7,2* (dd, indol H-6'): 7,17° (dd, indol H-6’); 7,09* (dd, indol H-5’); 7,05° (dd, indol H-5'); 7,02° (s, indol H-2'); 6,91* (s, indol H-2’); 6,23 (d, 9,5Hz, Leu NH); 6,03* (d, 7,4Hz, Leu NH); 5,87' (d, Leu NH); 5,32° (ddd, PrLeu6 α-H); 5,14° (dd, Hba a-H); 5,05* (ddd, PrLeu6 a-H); 4,98° (ddd, PrLeu2 a-H); 4,93* (dd, MeTrp a-H); 4,87* (ddd, PeLeu2 a-H); 4,81° (ddd, Leu a-H); 4,60 (m, N-CH); 4,46* (dd, MeLeu a-H); 4,16* (ddd, Leu a-H); 3,75° (q, 7Hz, MeAla a-H); 3,70 (m); 3,69* (q, 7Hz, MeAla a-H); 3,45 (m); 3,42° (s, MeAla N-Me); 3,32* (dd, MeTrp β-Η); 3,31* (s, MeAla N-Me); 3,23* (dd, Me Trp β-Hb); 3,21° (s, N-Me); 2,93* (s, Me Trp N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,50° (s, N-Me); 2,28 (AB-XY); 2,18 (AB-XY), Hba g-CH2); 2,13* (m, Hba γ-CHb); 1,85-1,08; 1,53* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,47 (m, CHMe2); 1,04* (d, 6,5Hz, Me Leu d-Me); 0,98-0,83; 0,52' (d, Leu Ô’-Me); 0,51* (d, 6,6Hz, Leu δ'-Me); 0,34' (d, Leu Ô"-Me); -0,2* (d, 6,6Hz, Leu Ô"-Me); -0,60* (ddd, Leu γ-CH). 38 Indolina A (3 confórmeros 46:27:27, marcados com * 0 '): 8,62* (d, J=10Hz, PrLeu NH); 8,13° (d, J=10Hz, NH); 8,02° (d, J=10Hz, NH); 7,92° (d, J=10Hz, NH); 7,86* (d, J=10Hz, PrLeu’ NH); 7,40° (d, J=T0Hz, NH); 7,23° 7,16*, 7,09° (3d, J=7,4Hz, indolina arom. H); -63 -
7,05°, 7,02*, 7,02° (3dd, indolina arom. H); 6,76°, 6,72*, 6,71° (3dd, idolina arom. H); 6,64°, 6,62°, 6,58* (3d, J=7,7Hz, indolina arom. H); 6,32° (d, J=8Hz, Leu NH); 6,10° (m br, Leu NH); 5,94* (d, J=9Hz, Leu NH); 5,28-4,73 (m); 4,60° (dd, a-H); 4,13* (dd, a-H); 3,75-2,85 (m); 3,45*, 3,33°, 3,33*, 3,23°, 3,20°, 3,02*, 2,81°, 2,79°, 2,57° (9s, N-Me); 2,45-0,83 (m); 1,52°, 1,46°, 1,42°, 1,42* (3d, J=7Hz, MeAla β-Me). Indolina B (3 confórmeros 1:1:1); 8,62, 8,43, 8,07, 7,94, 7,87, 7,42 (6d, J=10Hz, NH); 7,12 (d, J=7,4Hz, indolina arom. H); 7,08-6,99 (m, indolina arom. H); 6,72, 6,69, (2dd indolina arom. H); 6,66-6,63 (m, indolina arom. H); 6,58 (d, J=8Hz, indolina arom. H); 6,29 (d, J=8Hz, Leu NH); 6,15 (m br, Leu NH); 5,88 (d, J=8Hz, Leu NH); 5,28-4,98 (m, a-H); 4,93 (ddd, a-H); 4,74 (ddd, a-H); 4,65 (m, a-H); 4,54 (dd, a-H); 4,43 (dd, a-H); 3,80-3,66 (m); 3,55-3,0 (m); 3,46, 3,35, 3,31, 3,24, 3,22, 3,12, 3,00, 2,82, 2,57, (9s, N-Me); 2,55-1,1 (m); 1,52, 1,48, 1,43 (3d, J=7Hz, MeAla β-Me); 1,13 (s, J=7Hz); 1,03-0,83 (m); 0,78, 0,76, 0,73 (3d, J=6,5Hz). 39 (3 confórmeros 76:18:6, marcados com * ° '): 8,49* (d, 10Hz,
PrLeu6NH); 8,05* (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,94° (d, 10Hz, PrLeu6 NH), 7,67* (d, 8Hz, indol H-4’); 7,53 (d, 8Hz, indol H-4'); 7,52° (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,4* (d, 8Hz, indol H-7’); 7,23* (dd, indol H-6'); 7,10° (dd, indol H-6'); 7,11* (dd, indol H-5'); 7,07° (dd, indol H-5'); 7,05° (s, indol H-2'); 7,01* (s, indol H-2'); 6,22° (d, br, Leu NH); 6,05* (d, 7,5Hz, Leu NH); 5,84’ (d, Leu NH); 5,31° (ddd, PrLeu6 α-H); 5,16° (dd, Hba a-H); 5,04* (ddd, PrLeuó a-H); 5,00 (ddd, PrLeu2 a-H); 4,94* (dd, Me Trp a-H); 4,87* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,81° (ddd, Leu a-H) 4,67’ (ddd, Leu a-H); 4,45* (dd, MeLeu a-H); 4,18* (ddd, Leu a-H); 4,14 (s, OPr); 3,80-3,55; 3,67* (q, 7Hz, MeAla a-H); 3,50-3,40; 3,42° (s, N-Me); 3,29* (dd, MeTrp β-Ha); 3,27* (s, MeAla N-Me); 3,21° (s, N- -64-
Me); 3,18* (dd, Me Trp β-Hb); 3,04' (s, N-Me); 2,93* (s, Me Trp N-Me); 2,55° (s, N-Me); 2,53* (s, MeLeu N-Me); 2,30-1,90; 1,80 (m, OPr); 1,53* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,48° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,08° (t, OPr); 1,07 (t, OPr); 1,05* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,98-0,85; 0,59' (d, Leu δ'-Me); 0,57* (d, 6,6Hz, Leu δ'-Me); 0,37' (d, Leu δ''-Me); -0,07* (d, 6,6Hz, Leu δ''-Me); 40 (3 confórmeros 73:21:6, marcados com * 0 '): 8,49* (d, 10Hz, PrLeu6NH); 8,05* (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,94° (d, 10Hz, PrLeuô NH), 7,67* (d, 8Hz, indol H-4'); 7,53 (d, 8Hz, indol H-4'); 7,52° (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,4* (d, 8Hz, indol H-7'); 7,23* (dd, indol H-6'); 7,19° (dd, indol H-6'); 7,11* (dd, indol H-5’); 7,07° (dd, indol H-5'); 7,05° (s, indol H-2'); 7,01* (s, indol H-2'); 6,22° (d, 9,4 Hz, Leu NH); 6,05* (d, 7,3Hz, Leu NH); 5,86' (d, Leu NH); 5,31° (ddd, PrLeuô a-H); 5,19* (dd, Hba α-H); 5,16° (dd, Hba a-H); 5,03* (ddd, PrLeuô a-H); 5o (ddd, PrLeu2 a-H); 4,94* (dd, Me Trp a-H); 4,87* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,81° (ddd, Leu a-H) 4,65' (ddd, Leu a-H); "4,46* (dd, MeLeu a-H); 4,26* (q, OEt); 4,26 (q, OEt); 4,19* (ddd, Leu a-H); 3,80-3,56; 3,67* (q, 7Hz, MeAla a-H); 3,45-3,33; 3,41° (s, MeAla N-Me); 3,29* (dd, MeTrp β-Ha); 3,27* (s, MeAla N-Me); 3,21° (s, N-Me); 3,19* (dd, Me Trp β-Hb); 3,04' (s, N-Me); 2,93* (s, Me Trp N-Me); 2,57° (s, N-Me); 2,52* (s, MeLeu N-Me); 2,32-1,08; 1,53* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,48° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,40° (t, OEt); 1,40* (t, OEt); 1,05* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,98-0,84; 0,60' (d, Leu δ'-Me); 0,37' (d, Leu δ''-Me); -0,07* (d, 6,6Hz, Leu δ''-Me); -0,36* (ddd, Leu γ-CH). 41 (3 confórmeros 63:32:5, marcados com * ° '): 8,45* (d, 10Hz, PrLeu6NH); 8,06* (d, 10Hz, PrLeu2 NH); 7,97° (d, 10Hz, PrLeu6 NH); 7,90' (d, 10 Hz, PrLeuó NH); 7,63* (d, 8Hz, indol H-4'); 7,56 (d, 10Hz,
PrLeu2 NH); 7,45° (d, 8Hz, indol H-4’); 7,4* (d, 8Hz, indol H-7'); 7,38° (d, 8Hz, indol H-7'); 7,23* (dd, indol H-6'); 7,2° (dd, indol H-6'); 7,13* (dd, indol H-5'); 7,08° (dd, indol H-5'); 6,2° (d, 10Hz, Leu NH); 6,07* (d, 7,5Hz, Leu NH); 5,77' (d, 8,5Hz Leu NH); 5,32° (ddd, PrLeuó a-H); 5,26' (dd, Hba a-H); 5,2* (dd, Hba α-H); 5,16° (dd, Hba a-H); 5,03* (ddd, PrLeu6 a-H); 4,97*(dd, MeTrp a-H); 4,87* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,67° (ddd, a-H); 4,46* (dd, MeLeu a-H); 4,13* (ddd, Leu a-H); 4,09* (s, N-OMe); 4,04' (s, N-OMe); 4,03° (s, N-OMe); 3,74° (q, 7Hz, MeAla a-H); 3,71* (q, 7Hz, MeAla a-H); 3,70-3,60; 3,54-3,50; 3,47° (s, MeAla N-Me); 3,28-3,17; 3,25* (s, MeAla N-Me); 3,20° (s, N-Me); 2,97* (s, Me Trp N-Me); 2,52* (s, MeLeu N-Me); 2,42° (s, N-Me); 2,40-2,14; 1,97 (m); 1,79 (m); 1,65-1,08; 1,53* (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,5° (d, 7Hz, MeAla β-Me); 1,04* (d, 6,5Hz, MeLeu d-Me); 0,98-0,83; 0,62' (d, Leu δ'-Me); 0,57* (d, 6,6Hz, Leu δ'-Me); 0,37' (d, Leu δ"-Me); -0,09* (d, 6,6Hz, Leu δ''-Me); -0,35* (ddd, Leu γ-CH). (3 confórmeros 44:30:26,marcados com * ° '): 8,85 (d, CSNH2); 8,60 (d, PrLeuó NH); 8,17 (d, CSNH2); 8,03, 8,00 (2d, NH); 7,88 (m, CSNH2); 7,6-7,1; 6,28* (d, 10Hz, Leu NH); 6,07° (d, 7Hz, Leu NH); 5,87' (d, 9Hz, Leu NH); 6,26* (ddd, PrLeu2 a-H), 5,22 (dd Hba a-H); 5,15-4,95, 5,08* (dd, Hba a-H); 4,83* (ddd, PrLeu2 a-H); 4,50* ddd, Leu a-H); 4,37* (dd, MeTrp a-H); 4,25* (ddd, Leu a-H); 4,09, 4,05, 4,03* (s, N-OMe); 3,89 (m, a-H); 3,65*, 3,63', 3,52° (3q, 7Hz, MeAla -66- 3,57 (m); 3,17, 3,16, 3,15, 3,22, 3,20, 3,05, 2,92, 2,55, 2,53 (9s, NMe); 1,8-1,1; (1,05 (d, 7Hz); 0,99-0,82, 0,60°, 0,55’, 0,23', 0,17° (4d, 7Hz, Leu δ-Me); -0,15°, -0,17' (ddd, Leu γ-CH). -66- Lisboa, 29 de Fevereiro de 2000
JORGE CRUZ
Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA
Claims (10)
- □ I REIVINDICAÇÕES 1. Um ciclopeptólido da fórmula IA-B -R,Leu -Leu-C-X-Y em que: A é um resíduo de ácido butírico substituído em α com hidroxilo facultativamente substituído em γ por Rg, que representa CN, COOR2, CONR3R4, COR5, CSNH2 ou alquilo, o qual pode ser substituído por azido, halogénio, alcoxilo, hidroxilo ou amino facultativamente substituído, vinilo, o qual pode ser substituído por alquilo, halogéneo ou CN, cicloalquilo, tetrazolilo ou -C=CH, em que R2 representa hidrogénio ou alquilo facultativamente substituído com arilo, R3 e R4 são iguais ou difentes e representam hidrogénio ou alquilo ou formam em conjunto com azoto um anel de 3 a 6 membros facultativamente contendo um segundo heteroátomo e R5 representa hidrogénio ou alquilo inferior, B é um resíduo de ácido octanóico substituído com oc-amino-y-metilo; R! é hidrogénio ou metilo; C é um resíduo de triptofano ou de N-metil-triptofano da fórmula VIem que R8 representa hidrogénio, alcoxilo, alquilo ou benzilo, R9 representa hidrogénio ou halogénio, R10 representa hidrogénio ou metilo e representa uma ligação simples ou dupla, X é um resíduo de ácido carboxílico (C2 a C14) substituído em cc com amino, e Y é um resíduo de ácido carboxílico (C2 a C14) substituído em α com amino ou N-metil-amino.
- 2. Um ciclopeptólido da fórmula IpWRipUu‘Leu'cp'em que: Ap é um resíduo de ácido isobutírico substituído em α com hidroxilo facultativamente substituído em γ por R6p, o qual representa CN, CH20H, COOR2p, CONR3pR4p, COR5p ou -CH=CH2 facultativamente protegido, em que R2p representa hidrogénio ou alquilo facultativamente substituído com arilo, R3p e R4p são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo ou formam em conjunto com o átomo de azoto um anel de 5 ou 6 membros facultativamente contendo um segundo heteroátomo e R5p representa hidrogénio ou alquilo inferior, Bp é um resíduo de ácido octanóico a-amino-y-metil-substituído; R1p é hidrogénio ou metilo; Cp é um resíduo triptofano ou N-metil-triptofano, o qual é facultativamente substituído com alcoxilo(C., a C4) em Ν'; Xp é um resíduo de ácido carboxílico (C2 a C14) substituído com amino em α e Yp é um resíduo de ácido carboxílico (C2 a C10) α-amino ou N-metil-a-amino-substituído.
- 3. Um ciclopeptólido da fórmula I'p• B'p - R,ipLeu'Leu c'p ·x'em que Ap' é um resíduo de ácido butírico substituído com hidroxilo em α -3- facultativamente substituído em γ com R^', o qual representa CN, COOR'2p, CONR'3pR'4p, COR'5p, alquilo, o qual pode ser substituído por azido, halogénio, alcoxilo, hidroxilo ou amino facultativamente protegido, vinilo, o qual pode ser substituído por alquilo, halogénio ou CN, cicloalquilo, tetrazolilo ou -C=CH, em que R'2p representa hidrogénio ou alquilo facultativamente substituído com arilo, R,3p e R'4p são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo ou formam em conjunto com o azoto um anel de 3 a 6 membros facultativamente contendo um segundo heteroátomo e R'5p representa hidrogénio ou alquilo inferior, B'p é um resíduo de ácido octanóico a-amino-y-metil-substituído; R'1p é hidrogénio ou metilo; C'p é um resíduo de triptofano ou de N-metil-triptofano da fórmula VTpem que R'8p representa hidrogénio, alcoxilo, alquilo ou benzilo, R'9p representa hidrogénio ou halogénio, R'10p representa hidrogénio ou metilo e representa uma ligação simples ou dupla, X'p é um resíduo de ácido carboxílico (C6 a C14) substituído em α com amino, e Y'p é um resíduo de ácido carboxílico (C2 a C10) N-metil-a-amino substituído.
- 4. O ciclpeptólido de acordo com a reivindicação 1 da fórmula I em que A é ~ OÇH(CH2)2R6 em que Rg é -COO-nPr, co I -4- Bé - NHCHCHjCHí^XCHjÍjCHj , CO I 1 CO c-é OCH3 R1 é CH3, Xé -NHCHCO-ÇH, e CHCH3 Y é -N(CH3)CH(CH3)CO-.
- 5. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores na forma de sal ou de éster.
- 6. Estirpe de fimgo F92-4471/08 depositada como NRRL 21123 ou um seu mutante ou derivado.
- 7. Um processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 1 que se caracteriza pela cultura de F92-4471/08 (NRRL 21123), ou um seu mutante, ou derivado, ou uma espécie de fungo semelhante, em meio nutritivo e recuperação do composto a partir dele.
- 8. Um composto de acordo com a reivindicação 1 para usar como fármaco. -5-
- 9. Um composto de acordo com a reivindicação 1 para usar no tratamento de esclerose múltipla.
- 10. Uma composição terapêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 1. Lisboa, 29 de Fevereiro de 2000Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA
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