PT512693E

PT512693E - Preparacao de agentes de diagnostico

Info

Publication number: PT512693E
Application number: PT92303236T
Authority: PT
Inventors: Andrew Derek Sutton; Peter James Senior; David Heath; Richard Alan Johnson
Original assignee: Quadrant Healthcare Uk Ltd
Priority date: 1991-04-10
Filing date: 1992-04-10
Publication date: 2000-12-29
Also published as: HUT62805A; DE69233489T2; JPH11128232A; EP0512693B1; JP2865866B2; KR0129861B1; AU691196B2; EP0681843A3; ZA922636B; HU9203891D0; DE69233489D1; EP0972526A3; EP0681843B1; WO1992018164A1; IE921140A1; IL123038A0; AU1589192A; RU2109521C1; ATE246519T1; DE69231195T2

Description

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DESCRIÇÃO

“Preparação de agentes de diagnóstico” O presente invento refere-se à preparação de agentes de diagnóstico que compreendem microcápsulas ocas, utilizadas para melhorar a imagiologia por ultra-sons. O facto de se poderem utilizar bolhas de ar no corpo humano para a realização de ecocardiografias é já conhecido de algum tempo. Podem-se injectar líquidos que contêm bolhas na corrente sanguínea, para este fim (veja-se Ophir et al. (1980) "Ultrasonic Imaging" 2, 67-77, que estabilizaram bolhas numa membrana de colagénio, US-A-4 446 442 (Schering) e EP-A-131 540 (Schering)) e EP-A-224934 e EP-A-324938 descrevem a utilização de bolhas preparadas por sujeitar a ultra-sons uma solução de albumina. No entanto, a distribuição de tamanhos das bolhas é aparentemente incontrolável e as bolhas desaparecem quando submetidas à pressão sentida no ventrículo esquerdo (Shapiro et al. (1990) J. Am. Coll. Cardiology, 16(7), 1603-1607).

Em EP-A-52575 descrevem-se, para o mesmo fim, partículas sólidas que englobam gás, sendo o gás libertado das partículas para a corrente sanguínea.

Em EP 458 745 (Sintética) descreve-se um processo para a preparação de microbalões cheios de ar ou gás. por polimerização interfacial de polímeros sintéticos como poliláctidos e poliglicólidos. Em WO 91/12823 (Delta) descreve-se um processo semelhante utilizando albumina. Wheatley et al. (1990) Biomaterials 11, 713-717, descreve a gelificação ionotrópica do alginato, para formar microbolhas com mais de 30 pm de diâmetro. Em WO 91/09629 descrevem-se lipossomas para utilização como agentes de contraste em ultra-sons.

Os requerentes verificaram agora que um processo de atomização de uma solução de um agente que forma microcápsulas, e em seguida a insolubilização das microcápsulas que se formam, conduz a um produto melhorado. Przyborowski et al. (1982 Eur. J. Nucl. Med. 7, 71-72) descreve a preparação de microesferas de albumina de soro humano (HSA) por secagem por pulverização, para marcação radioactiva e utilização subsequente em imagiologia cintigráfica do pulmão. Não foi referido que as microesferas fossem ocas e, na repetição do trabalho pela requerente, apenas se obtêm microesferas sólidas. A menos que as partículas sejam ocas, elas não são adequadas para a ecocardiografia. Para além disso, as microesferas foram preparadas num processo de um passo, que a requerente verificou não ser

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ΕΡ Ο 512 693/PT adequado para a preparação de microcápsulas adequadas para a ecocardiografia; era necessário no processo anterior remover a albumina não desnaturada das microesferas (o que não é necessário no processo da requerente) e obtiveram-se, aparentemente, microesferas com uma gama alargada de tamanhos, dado ter sido necessário um outro passo de crivagem. Assim, não só não era óbvia a escolha do processo de Przyborowski et al. para a preparação de microcápsulas úteis na imagiologia ultra-sónica, como também as partículas produzidas não eram adequadas para esse fim. A requerente desenvolveu melhorias consideráveis, em relação ao processo anterior. O artigo de Przyborowski et al. refere-se a duas descrições anteriores de métodos para obtenção de partículas de albumina para cintigrafia do pulmão. Aldrich & Jonhston (1974), Int. J. Appl. Rad. Isot. 25, 15-18 descrevem a utilização de um disco centrifugador para produzir partículas com 3-70 prn de diâmetro, que são em seguida desnaturadas em óleo quente. O óleo é removido e as partículas são marcadas com radioisótopos. Raju et al. (1978) Isotopenpraxis 14(2), 57-61 utilizaram a mesma técnica de disco centrifugador, mas desnaturaram a albumina, simplesmente por aquecimento das partículas. Em nenhum dos casos foram mencionadas microcápsulas ocas e as partículas preparadas não eram adequadas para ecocardiografia.

Em US-A-4 089 800 e EP-A-0 381 543 descreve-se a atomização de materiais não proteicos num banho líquido. Em EP-A-0 091 555 descreve-se a secagem por pulverização de materiais à base de silício, para formar microcápsulas de 5-300 pm de diâmetro para utilização como filtros.

Num aspecto, proporciona-se um processo para formar um pó estéril que compreende microcápsulas ocas que são suspensas num meio injectável parentericamente, para formar uma suspensão adequada para a imagiologia por ultra-sons, quando administrada intravenosamente, compreendendo o referido processo: (a) proporcionar uma solução ou dispersão, num líquido, de um material que forma uma parede; (b) atomizar a referida solução ou dispersão num gás aquecido, de modo que o referido líquido evapora, formando desse modo microcápsulas ocas do referido material que forma uma parede; (c) aquecer as referidas microcápsulas para reduzir a solubilidade em água do referido

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ΕΡ Ο 512 693 /PT material que forma uma parede, obtendo-se assim as referidas microcápsulas na forma de um pó; e (d) tomar o referido pó estéril.

Os passos (b) e (c) podem ser realizados como um processo único, ou o produto intermediário do primeiro passo pode ser recolhido e tratado separadamente no segundo passo. Estas duas possibilidades são referidas daqui para a frente como processos de um passo e de dois passos. O material que forma uma parede e as condições do processo deverão ser escolhidos de forma a que o produto seja suficientemente não-tóxico e não-imunogénico nas condições de utilização, que irão claramente depender da dose administrada e da duração do tratamento. O material que forma uma parede pode ser um derivado de amido, um polímero sintético tal como tert-butiloxicarbonilmetilpoliglutamato (Patente US N° 4 888 398) ou um polissacárido, como a polidextrose.

Geralmente, o material que forma uma parede pode ser seleccionado a partir de polímeros mais hidrófilos, biodegradáveis, fisiologicamente compatíveis. De entre estes polímeros, podem-se mencionar os polissacáridos de baixa solubilidade em água, poliláctidos e poliglicólidos e os seus copolímeros, copolímeros de láctidos e lactonas, como a e-caprolactona, 5-valerolactona, polipéptidos e proteínas como a gelatina, colagénio, globulinas e albuminas. Outros polímeros adequados incluem poli-(orto)ésteres (veja-se por exemplo US-A-4,093,709; US-A-4,131,648; US-A-4,138,344; US-A-4,180,646; ácido poliláctico e poliglicólico e os seus copolímeros, por exemplo DEXON (veja-se J. Heller (1980) Biomaterials 1, 51; poli(DL-lactido-co-ô-caprolactona), poli(DL-lactido-co-ô-valerolactona), poli(DL-lactido-co-g-butirolactona); polialquilcianoacrilatos; poliamidas, poli-hidroxibutirato; polidioxano; ροΐΐ-β-aminocetonas (Polymer 23 (1982), 1693); polifosfazenos (Science 193 (1976), 1214); e polianidridos. As referências sobre polímeros biodegradáveis podem ser encontradas em R. Langer et al. (1983) Macromol. Chem. Phys. C23, 61-125. Os poliaminoácidos, como os ácidos poliglutâmico e poliaspártico também podem ser utilizados, bem como os seus derivados, i.e. ésteres parciais com álcoois ou glicóis inferiores. Um exemplo útil destes polímeros é o poli-(t-butil-glutamato). Os copolímeros com outros aminoácidos como a metionina, leucina, valina, prolina, glicina, alanina, etc, também são possíveis. Recentemente, foram referidos alguns novos derivados de ácido poliglutâmico e poliaspártico com uma biodegradabilidade controlada (veja-se WO 87/03891; US 4,888,398 e EP 130 935, aqui incorporadas para referência). Estes polímeros

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(e copolímeros com outros aminoácidos) têm fórmulas do seguinte tipo: -(NH-CHA-CO)x(NH-CHX-CO)v em que X designa a cadeia lateral de um resíduo de aminoácido e A é um grupo de fórmula -(CH^COOR^RrOCOR (II), em que R1 e R: são H ou alquilos inferiores, e R é alquilo ou arilo; ou ReR' estão ligados um ao outro por um membro de ligação substituído ou não substituído, para proporcionar anéis de 5 ou 6 membros. A também pode representar grupos de fórmula: -(CH:)„COO-CHR'COOR (I) e -(CH;)11CO(NH-CHX-CO)mNH-CH(COOH)-(CH2)pCOOH (III) e anidridos correspondentes. Em todas estas fórmulas, n, m e p são números inteiros inferiores (que não excedem 5) e x e y são também números inteiros, seleccionados para se obterem pesos moleculares não inferiores a 5000.

Os polímeros acima mencionados são adequados para o fabrico de microesferas de acordo com o invento e, dependendo da natureza dos substituintes R, R1, R2 e X, as propriedades da parede podem ser controladas, por exemplo, a resistência, elasticidade e biodegradibilidade. Por exemplo, X pode ser metil(alanina), isopropil(valina), isobutil(leucina e isoleucina) ou benzil(fenilalanina).

De preferência, o material que forma uma parede é proteico. Por exemplo, pode ser colagénio, gelatina ou albumina (de soro), sendo em cada caso, de preferência de origem humana (i.e. derivado a partir de humanos ou correspondente em estrutura à proteína humana). Mais preferencialmente, é albumina de soro humano (HA) derivada a partir de sangue de dadores ou, idealmente, a partir da fermentação de microorganismos (incluindo linha celulares), que foram transformados ou transfectados para expressar HA.

As técnicas para expressar HA (termo que inclui análogos e fragmentos de albumina humana, por exemplo os de EP-A-322094 e polímeros de albumina monomérica) são descritos, por exemplo, em EP-A-201239 e EP-A-286424. Todas as referências são aqui incluídas para referência. Em "Análogos e fragmentos" de HA incluem-se todos os 5 84 597 ΕΡΟ 512 693 /PT polipéptidos (i) que são capazes de formar uma microcápsula no processo de acordo com o invento e (ii) dos quais uma região contínua de pelo menos 50% (de preferência pelo menos 75%, 80%, 90% ou 95%) da sequência de aminoácidos é pelo menos 80% homóloga (de preferência pelo menos 90%, 95% ou 99% homóloga) com uma região contínua de pelo menos 50% (de preferência 75%, 80%, 90% ou 95%) da albumina humana. A HA produzida por técnicas de ADN recombinante é particularmente preferida. Assim, a HA pode ser produzida através da expressão de uma sequência nucleotídica que codifica para HA, em levedura, ou noutro microorganismo, e purificação do produto, como é conhecido na arte. Este material não tem os ácidos gordos associados com o material derivado de soro. De preferência, a HA é substancialmente isenta de ácidos gordos; i.e. contém menos de 1% do nível de ácidos gordos do material derivado do soro. De preferência, não se detectam ácidos gordos na HA.

Na descrição seguinte das formas de concretização preferidas, utiliza-se o termo "proteína", uma vez que este é o preferido pela requerente, mas deve entender-se que se podem utilizar outros materiais que formam paredes, biocompatíveis, como acima discutido. A solução ou dispersão de proteínas é de preferência 0,1 a 50% p/v, mais preferencialmente cerca de 5,0-25,0% de proteína, particularmente quando a proteína é albumina. Cerca de 20% é óptimo. Podem-se utilizar misturas de materiais que formam paredes, caso em que as percentagens nas duas últimas frases se referem ao conteúdo total de material que forma paredes. A preparação a ser pulverizada pode conter substâncias, que não o material que forma paredes, e um solvente ou líquido transportador. Assim, a fase aquosa pode conter 1-20% em peso de compostos hidrófilos solúveis em água, como os açúcares e polímeros como estabilizantes, e.g. álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polietilenoglicol (PEG), gelatina, ácido poliglutâmico e polissacáridos como o amido, dextrano, agar, xantano e semelhantes. Podem-se utilizar fases aquosas semelhantes como líquido transportador, em que o produto final de microesferas é suspenso antes de utilização. Podem-se utilizar emulsionantes (0,1-5% em peso), incluindo a maioria dos emulsionantes fisiologicamente aceitáveis, por exemplo lecitina de ovo ou lecitina de soja, ou lecitinas sintéticas, como as lecitinas sintéticas saturadas, por exemplo dimiristoílfosfatidilcolina, dipalmitoílfosfatidilcolina ou distearoílfosfatidilcolina ou lecitinas sintéticas insaturadas, como a dioleilfosfatidilcolina ou dilinoleilfosfatidilcolina. Os emulsionantes também incluem agentes tensioactivos como ácidos gordos livres, ésteres de ácidos gordos com compostos de polioxialquileno, como o polioxipropilenoglicol e polioxietilenoglicol; éteres

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sscZgSE? de álcoois gordos com polioxialquilenoglicóis; ésteres de ácidos gordos com sorbitano polioxialquilado; sabões; estearato de glicerol-polialquileno; ricinoleato de glicerol-polioxietileno; homo- e copolímeros de polialquilenoglicóis, óleo de soja e óleo de rícino polietoxilados, bem como derivados hidrogenados; éteres e ésteres de sacarose, ou outros hidratos de carbono com ácidos gordos, álcoois gordos, sendo estes opcionalmente polioxialquilados, mono-, di- e triglicéridos de ácidos gordos saturados ou insaturados, glicéridos, ou óleo de soja e sacarose.

Podem-se incorporar aditivos na parede das microesferas para modificar as propriedades físicas, como a dispersibilidade, elasticidade e permeabilidade à água.

De entre os aditivos úteis, podem-se mencionar compostos que podem "hidrofobizar" a parede, de modo a decrescer a permeabilidade à água, como gorduras, ceras e hidrocarbonetos de elevado peso molecular. Os aditivos que melhoram a dispersibilidade das microesferas no líquido-transportador injectável são compostos anfipáticos, como os fosfolípidos; também aumentam a permeabilidade à água e a taxa de biodegradabilidade.

Os aditivos que aumentam a elasticidade da parede são agentes flexibilizantes, como o miristato de isopropilo e semelhantes. Além disso, exemplos de aditivos muito úteis são os constituídos por polímeros semelhantes ao da própria parede, mas com um peso molecular relativamente baixo. Por exemplo, quando se utilizam co-polímeros do tipo poliláctico/poliglicólico como material que forma a parede, as propriedades da parede podem ser modificadas com vantagem (amaciamento e biodegradabilidade melhorada) por incorporação de poliglicólidos ou poliláctidos de baixo peso molecular (1.000 a 15.000 daltons), como aditivos. O polietilenoglicol de PM baixo a moderado (e.g. PEG 2.000) é um aditivo amaciador útil. A quantidade de aditivos a ser incorporados na parede é extremamente variável e depende da necessidade. Nalguns casos, não se utiliza nenhum aditivo; noutros casos, são possíveis quantidades de aditivos que podem atingir cerca de 20% em peso, relativamente à parede. A solução ou dispersão de proteína (de preferência solução), referida daqui para a frente como "preparação de proteína", é atomizada e seca por pulverização por qualquer técnica adequada que resulte em microcápsulas discretas de 1,00-50,00 pm de diâmetro. Estes números referem-se a pelo menos 90% da população de microcápsulas, sendo o diâmetro medido com um dimensionador Coulter Master Sizer II. O termo "microcápsulas"

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significa partículas ocas que englobam um espaço, o qual é cheio com um gás, ou vapor, mas não com qualquer material sólido. Não se formam partículas de favo de mel, semelhantes à guloseima comercializada em UK como "Maltesers" (Marca registada). Não é necessário que o espaço seja totalmente englobado (embora isso seja preferido) e não é necessário que as microcápsulas sejam precisamente esféricas, embora sejam geralmente esféricas. Se as microcápsulas não são esféricas, os diâmetros acima referidos referem-se ao diâmetro de uma microcápsula esférica correspondente, com a mesma massa, e englobando o mesmo volume de espaço oco que a microcápsula não esférica. A atomização compreende a formação de um aerosol a partir da preparação de proteína, por exemplo, forçando a preparação através de pelo menos um orifício, sob pressão, ou utilizando um atomizador centrífugo numa câmara de ar quente, ou outro gás inerte. A câmara deverá ser suficientemente grande para que as maiores gotas ejectadas não choquem com as paredes, antes da secagem. O gás, ou vapor, na câmara é limpo (i.e., de preferência estéril e isento de pirogénio) e não-tóxico, quando administrado na corrente sanguínea, nas quantidades concomitantes com a administração das microcápsulas em ecocardiografia. A taxa de evaporação do líquido da preparação de proteína deverá ser suficientemente elevada para formar microcápsulas ocas, mas não demasiado elevado para romper as microcápsulas. A taxa de evaporação pode ser controlada, variando o caudal de gás, a concentração de proteína na preparação de proteína, a natureza do transportador líquido, a taxa de alimentação da solução e, de maior importância, a temperatura do gás encontrado pelo aerosol. Com uma concentração de albumina de 15-25% em água, uma temperatura de entrada de gás de pelo menos cerca de 100°C, de preferência pelo menos 110°C, é geralmente suficiente para assegurar um interior oco e a temperatura pode ser tão elevada quanto 250°C, sem que as cápsulas se rompam. Uma temperatura de cerca de 180-240°C, de preferência cerca de 210-230°C, e mais preferencialmente cerca de 220 °C, é óptima, pelo menos para a albumina. A temperatura pode, na versão de um passo do processo de acordo com o invento, ser suficiente para insolubilizar pelo menos parte (normalmente o exterior) do material que forma a parede e, frequentemente, substancialmente todo o material que forma a parede. Uma vez que a temperatura do gás encontrado pelo aerosol depende também da taxa a que o aerosol é fornecido e do conteúdo líquido da preparação de proteína, a temperatura de saída pode ser monitorizada para assegurar uma temperatura adequada na câmara. Verificou-se ser adequada uma temperatura de saída de 40-150°C . À parte este factor, no entanto, verificou-se que o controlo do caudal não é tão útil como o controlo de outros parâmetros.

No processo em dois passos, as microcápsulas intermédias compreendem tipicamente

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96-98% de HA monomérico e têm um tempo de vida in vivo limitado, para imagiologia por ultra-sons, ou podem ser armazenadas e transportadas antes de o segundo passo do processo de dois passos ser realizado. Estas constituem, portanto, um outro aspecto do invento. As microcápsulas podem, no entanto, ser utilizadas para imagiologia por ultra-sons.

No segundo passo do processo, as microcápsulas intermédias preparadas no primeiro passo são fixadas e tomadas menos solúveis em água. de forma que persistem por mais tempo, não sendo ao mesmo tempo demasiado insolúveis e inertes para não poderem ser biodegradáveis. Este passo fortalece também as microcápsulas, de modo que estas têm uma maior capacidade para suportar o rigor da administração, resistir ao rasgamento vascular e pressão ventricular. Se as microcápsulas rebentam, tomam-se menos ecogénicas. Schneider et al. (1992), Invest. Radiol. 27, 134-139 mostraram que as microbolhas de albumina sujeitas a ultra-sons da arte anterior não têm esta resistência e perdem rapidamente a sua ecogenecidade, quando submetidas a pressões típicas do ventrículo esquerdo. O segundo passo do processo pode utilizar calor (por exemplo calor de micro-ondas, calor radiante ou ar quente, por exemplo num forno convencional), irradiação ionizante (com, por exemplo, uma dose de 10,0-100,0 kGy de raios gama) ou reticulaçào química utilizando, por exemplo, formaldeído, gluteraldeído, óxido de etileno ou outros agentes para reticulação de proteínas, e é realizado nas microcápsulas intermediárias substancialmente secas, formadas no primeiro passo, ou numa suspensão destas microcápsulas num liquido em que as microcápsulas são insolúveis, por exemplo um solvente adequado. Na versão do processo em um passo, pode-se pulverizar um agente de reticulação, como o gluteraldeído, na câmara de secagem por pulverização, ou este pode ser introduzido na preparação de proteínas, imediatamente a \ jusante dos meios de pulverização. Altemativamente, a temperatura na câmara pode ser suficientemente elevada para insolubilizar as microcápsulas. O produto final, medido do mesmo modo que as microcápsulas intermediárias pode, se desejado, consistir de microcápsulas com um diâmetro de 0,05 a 50,0 pm, mas atinge 0,1 a 2,0 pm e obtêm-se especialmente 1,0 a 8,0 pm com o processo de acordo com o invento e estas são preferidas para a ecocardiografía. A requerente verificou que uma gama de cerca de 0,5 a 3,0 pm pode ser especialmente adequada para a produção de uma imagem de baixo contraste e para a utilização em imagiologia Doppler de cor, enquanto que uma gama de cerca de 4.0 a 6,0 pm pode ser mais adequada para a produção de imagens finas. É necessário ter em conta o facto de o segundo passo poder alterar o tamanho das microcápsulas, ao fazer a determinação do tamanho produzido no primeiro passo.

Verificou-se que o processo de acordo com o invento pode ser controlado de modo a

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ΕΡ Ο 512 693/PT 9 obter microesferas com caracteristicas desejadas. Assim, a pressão a que a solução de proteína é fornecida ao tubo de descarga de pulverização pode variar, por exemplo de 1,0-10,0 x 10" Pa, de preferência de 2,0-6,0 x 10’ Pa e é mais preferencialmente cerca de 5 x 10’ Pa. Podem-se variar outros parâmetros, como descrito acima e a seguir. Deste modo, podem-se obter novas microesferas. O processo de acordo com o invento pode proporcionar microesferas ocas estéreis, em que mais de 30%, de preferência mais de 40%, 50% ou 60% das microesferas têm um diâmetro na gama de 2 pm e pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95% a 99%, têm um diâmetro dentro da gama de 1,0-8,0 pm.

Assim, a gama interquartil pode ser de 2 pm, com um diâmetro mediano de 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 ou 6,5 pm.

Assim, pelo menos 30%, 40%, 50% ou 60% das microesferas podem ter diâmetros na gama de 1,5-3,5 pm, 2,0-4,0 pm, 3,0-5,0 um, 4,0-6,0 pm, 5,0-7,0 pm ou 6,0-8,0 pm. De preferência, uma percentagem referida das microesferas tem diâmetros dentro de uma gama de 1,0 pm, como por exemplo 1,5-2,5 pm, 2,0-3,0 pm, 3,0-4,0 pm, 4,0-5,0 pm, 5,0-6,0 pm, 6,0-7,0 pm ou 7,0-8,0 pm. O processo de acordo com o invento pode proporcionar microesferas ocas, estéreis com paredes proteicas, em que pelo menos 90%, de preferência peio menos 95% ou 99% das microesferas têm um diâmetro na gama de 1,0-8,0 pm; pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95% ou 99%, das microesferas têm uma espessura de parede de 40-500 nm, de preferência 100-500 nm e pelo menos 50% da proteína nas paredes das microesferas é reticulada. De preferência, pelo menos 75%, 90%, 95%, 98,0%, 98,5% ou 99% da proteína é suficientemente reticulada para ser resistente à extracção com uma solução de HC1 a 1%, durante 2 minutos. A proteína extraída é detectada utilizando o teste de proteínas de Bradford, com azul de Coomassie. O nível de reticulação é controlado variando o aquecimento, irradiação ou tratamento químico da proteína. Durante o processo de reticulação, o monómero de proteína é reticulado e toma-se rapidamente indisponível num processo de dissolução simples, tal como detectado por HPLC de permeação em gel, ou electroforese em gel, como se mostra no Exemplo 8, a seguir. O tratamento continuado conduz a nova reticulação do material já reticulado, de modo que este se toma indisponível na extracção com HC1 acima descrita. Durante o aquecimento a 175°C, as microesferas de rHA de acordo com o invento perdem cerca de 99% da proteína extractável com HC1 ao longo de 20 minutos, enquanto que a 150°C um aquecimento de 20 minutos remove apenas

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ΕΡ Ο 512 693/PT ΙΟ cerca de 5% da proteína extractável com HC1, a 30 min remove 47,5%, a 40 min 83%, a 60 min 93%, a 80 min 97% e a 100 min remove 97% da proteína extractável com HC1. A fim de de se obterem bons níveis de reticulação, as microesferas podem, portanto, ser aquecidas a 175°C, durante pelo menos 17-20 minutos, a 150°C durante pelo menos 80 min e a outras temperaturas durante períodos de tempo correspondentemente maiores ou menores. O processo de acordo com o invento pode ainda proporcionar microesferas ocas, estéreis, predominantemente com 1,0-10,0 μιη de diâmetro, sendo pelo menos 10% das microesferas, quando suspensas em água, capazes de sobreviver a uma aplicação durante 0,25 seg de uma pressão de 2,66 x 104 Pa, sem se romper, colapsar ou encher de água. A pressão máxima transiente no ventrículo esquerdo humano é de cerca de 200 mmHg (2,66 x 104 Pa). De preferência, 50%, 75%, 90% ou 100% sobrevivem à referida aplicação, durante 0,25 seg de 2,66 x 104 Pa quando testadas como acima, i.e. permanecem ecogénicas. In vivo, de preferência, as mesmas percentagens permanecerão ecogénicas durante a passagem através de ambos os ventrículos do coração.

As microesferas injectáveis preparadas de acordo com o presente invento podem ser armazenadas secas na presença ou na ausência de aditivos, para melhorar a conservação e impedir a colaescência. Como aditivos, pode-se seleccionar de 0,1 a 25% em peso de compostos fisiologicamente aceitáveis solúveis em água, como o manitol, galactose, lactose ou sacarose ou polímeros hidrófilos como o dextrano, xantano, ágar, amido, PVP, ácido poliglutâmico, álcool polivinílico (PVA) e gelatina. O tempo de vida útil das microesferas na fase transportadora líquida, i.e. o período durante o qual se observam os sinais ecográficos úteis, pode ser controlado para durar desde alguns minutos a vários meses, dependendo da necessidade; isto pode ser feito controlando a porosidade, solubilidade ou grau de reticulação da parede. Estes parâmetros podem ser controlados seleccionando, de forma adequada, os materiais que formam paredes e os aditivos, e ajustando a taxa de evaporação e temperatura na câmara de secagem por pulverização.

De forma a minimizar qualquer aglomeração de microcápsulas, as microcápsulas podem ser moídas com um excipiente inerte adequado, utilizando um moinho Fritsch de pinos centrífugo equipado com um crivo de 0,5 mm, ou um moinho Glen Creston de impacto por jacto de ar. Os excipientes adequados são pós finamente moídos, inertes e adequados para utilização intravenosa, como a lactose, glucose, manitol, sorbitol, galactose, maltose ou cloreto de sódio. Uma vez moída, a mistura microcápsulas/excipiente pode ser suspensa num meio aquoso para facilitar a remoção de microcápsulas não funcionais/defeituosas. Aquando da reconstituição na fase aquosa, é desejável incluir uma quantidade vestigial de agente 11 84 597 ΕΡ Ο 512 693 /PT tensioactivo, para prevenir a aglomeração. Os agentes tensioactivos aniónicos, catiónicos e não-iónicos adequados para este fim, incluem poloxameros, ésteres de sorbitano, polisorbatos e lecitina. A suspensão de microcápsulas pode ser deixada a flutuar, ou pode ser centrifugada para sedimentar quaisquer partículas defeituosas que têm defeitos de superfície, que iriam, por utilização, fazer com que se enchessem com líquido, deixando de ser ecogénicas. A suspensão de microcápsulas pode ser então misturada de novo, para assegurar uma distribuição uniforme de partículas, lavadas e reconstituídas num tampão adequado para injecção intravenosa, como NaCl 0,15M Tris 0,01 mM pH 7,0. A suspensão pode ser dividida em alíquotas para liofilização e subsequente esterilização através de, por exemplo, irradiação gama, calor seco ou óxido de etileno.

Um método alternativo para a desaglomeração das microcápsulas insolubilizadas ou fixadas é suspendê-las directamente num meio aquoso contendo um tensioactivo, seleccionado a partir de poloxameros, ésteres de sorbitano, polisorbatos e lecitina. A desaglomeração pode então ser realizada utilizando um homogeneizador adequado. A suspensão de microcápsulas pode então ser deixada flutuar ou pode ser centrifugada para sedimentar as partículas defeituosas, como acima, e tratada como acima.

Embora as microesferas produzidas de acordo com o presente invento possam ser comercializadas no estado seco, mais particularmente quando são concebidas com um tempo de vida limitado após injecção, pode ser desejável comercializar também preparações prontas para utilização, i.e. suspensões de microesferas num transportador líquido aquoso, pronto para injecção. O produto, no entanto, é geralmente fornecido e armazenado na forma de um pó seco e é suspenso num líquido estéril adequado, não pirogénico, imediatamente antes da administração. A suspensão é geralmente administrada por injecção de cerca de 1,0-10,0 ml numa veia adequada, como a veia cubital ou outro vaso sanguíneo. Uma concentração de microcápsulas de 1,0 x 10^ a 1,0 x 1012 partículas/ml é adequada, de preferência cerca de 5,0 x 105a5,0x 109.

Embora a imagiologia ultra-sónica seja aplicável a vários sistemas de órgãos animais e humanos, uma das suas principais aplicações é na obtenção de imagens de tecido do

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ΕΡ Ο 512 693 /PT 12 miocárdio e padrões de perfusão ou fluxo sanguíneo.

As técnicas utilizam equipamento de varrimento ultra-sónico que consiste de um aparelho de varrimento de imagem. O equipamento produz imagens visuais de uma área pré-determinada, neste caso a região do coração de um corpo humano. Tipicamente, o transdutor é colocado directamente na pele sobre a área a ser visualizada. O aparelho de varrimento inclui vários componentes electrónicos incluindo transdutores ultra-sónicos. O transdutor produz ondas de ultra-sons que fazem um varrimento sectorial da região do coração. As ondas ultra-sónicas são reflectidas pelas várias porções da região do coração e são recebidas pelo transdutor receptor e processadas de acordo com métodos pulso-eco, conhecidos na arte. Após o processamento, os sinais são enviados para o aparelho de imagiologia (também bem conhecido na arte), para visualização.

Na utilização das microcápsulas, após o paciente estar "preparado" e o aparelho de varrimento estar em posição, injecta-se a suspensão de microcápsulas, por exemplo através de uma veia do braço. O agente de contraste flui através da veia para o lado venoso direito do coração, através da artéria pulmonar principal, até ao pulmão, através dos pulmões, através dos capilares para a veia pulmonar e finalmente até ao átrio esquerdo e cavidade ventricular esquerda do coração.

Com as microcápsulas produzidas de acordo com o presente invento, podem-se fazer observações e diagnósticos relativamente à quantidade de tempo necessária para que o sangue passe através dos pulmões, padrões de fluxo sanguíneo, tamanho do átrio esquerdo, competência da válvula mitral (que separa o átrio esquerdo e ventrículo esquerdo), dimensão da câmara na cavidade do ventrículo esquerdo e anomalias no movimento da parede. Por injecção do agente de contraste do ventrículo esquerdo, pode-se também analisar a competência da válvula aórtica. bem como a fracção ou percentagem de volume ejectado a partir do ventrículo esquerdo. Finalmente, os padrões de contraste no tecido irão indicar que áreas, se algumas, não estão a ser perfusadas de forma adequada.

Em resumo, um padrão de imagens deste tipo irá ajudar a diagnosticar características não normais de fluxo sanguíneo no coração, competência valvular, tamanho das câmaras e movimento das paredes e irá proporcionar um indicador potencial da perfusão do miocárdio.

As microcápsulas podem permitir a imagiologia da parte esquerda do coração a partir de injecções intravenosas. As microcápsulas de albumina, quando injectadas numa veia periférica podem ser capazes de efectuar uma passagem transpulmonar. Isto resulta numa

8.4 597

ΕΡ Ο 512 693 /PT 13 opacificação ecocardiográfica da cavidade do ventrículo esquerdo (LV), bem como do tecido do miocárdio.

Além do aparelho de varrimento descrito de forma sumária acima, existem outros aparelhos de varrimento ultra-sónico, cujos exemplos estão descritos nas Patentes US Nos 4,134,554 e 4,315,435, cuja descrição é aqui incorporada para referência. Basicamente, estas patentes referem-se a várias técnicas, incluindo a ecografia dinâmica transversal (DCE) para a produção de imagens a duas dimensões sequenciais de cortes transversais de anatomia animal ou humana, por meio de energia de ultra-sons. a uma taxa de imagem suficiente para permitir a visualização dinâmica de órgãos em movimento. Os tipos de aparelho utilizados em DCE são geralmente designados por aparelhos de varrimento DCE e transmitem e recebem pulsos curtos, sónicos, na forma de feixes, ou linhas, estreitos. A força do sinal reflectido é uma função do tempo, que é convertido numa posição, utilizando uma velocidade do som nominal, e é disposto num tubo de raios catódicos, ou outro dispositivo adequado, de um modo semelhante aó dispositivo radar ou sonar. Apesar de o DCE poder ser utilizado para produzir imagens de muitos sistemas de órgãos, incluindo o fígado, vesícula biliar, pâncreas e rim, é frequentemente utilizado para visualização de tecidos e vasos sanguíneos principais do coração.

As microcápsulas podem ser utilizadas para imagiologia de uma grande variedade de áreas, mesmo quando injectadas num local venoso periférico. Essas áreas incluem (sem limitação): (1) o sistema venoso de drenagem para o coração: (2) o tecido do miocárdio e características de perfusão durante um teste de prova de esforço ou semelhante: e (3) tecido do miocárdio após a ingestão oral, ou injecçào intravenosa de medicamentos concebidos para aumentar o fluxo sanguíneo para o tecido. Adicionalmente, as microcápsulas podem ser úteis para delinear alterações na perfusão do tecido do miocárdio devido a intervenções como (1) enxerto de veia na artéria coronária; (2) angioplastia da artéria coronária (dilatação de um balão de uma artéria estreitada); (3) utilização de agentes trombóticos (como a estreptoquinase) para dissolver coágulos nas artérias coronárias; ou (4) defeitos ou alterações na perfusão, devido a um ataque cardíaco recente.

Além disso, na altura da realização de um angiograma coronário (ou de um angiograma de subtracção digital), uma injecçào de microcápsulas poderá proporcionar dados respeitantes a características de perfusão de tecidos, que irão incrementar e complementar os dados obtidos a partir do angiograma, o qual identifica apenas a anatomia dos vasos sanguíneos.

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Através da utilização de microcápsulas produzidas de acordo com o presente invento, outros sistemas de órgãos não cardíacos, incluindo o fígado, baço e rim que são actualmente visualizados por técnicas de ultra-sons, podem ser utilizados para se obter uma melhoria das imagens actualmente obtidas e/ou para a produção de novas imagens que mostrem a perfusão e características de fluxo que não era anteriormente possível visualizar, utilizando as técnicas de imagiologia por ultra-sons da arte anterior.

Em seguida serão descritos aspectos preferidos do presente invento, a título de exemplo e com referência a:

Figura 1, que é uma perspectiva de um corte parcial da frente e um dos lados de um aparelho de secagem por pulverização adequado para a primeira fase do processo do invento,

Figura 2, que é um gráfico que mostra como o grau de fixação das paredes da microesfera (neste caso a albumina) pode ser controlado variando a temperatura e o tempo de aquecimento no segundo passo do processo, e

Figura 3, que é um gráfico que mostra como a resistência das microesferas à pressão pode ser variada, alterando o período do tempo de aquecimento no segundo passo do processo.

Exemplo 1

Existe um aparelho de secagem por pulverização (Figura 1) adequado, disponível em AJS Niro Atomizer, Soeborg, Dinamarca, sob a designação registada "Mobile Minor". Os pormenores da sua construção são fornecidos aqui, imediatamente antes das reivindicações. Este compreende um atomizador centrífugo (tipo M-02/B Minor), movido por uma turbina de ar, a uma pressão de ar mínima de 4 bar e até um máximo de 6 bar. A 6 bar atinge-se uma velocidade da roda do atomizador de aproximadamente 33.000 rpm. O ligar e desligar do ar comprimido para o atomizador é feito por meio de uma válvula colocada no painel de instrumentos. O consumo máximo de ar comprimido em relação ao atomizador, é de 17 NrnVh a uma pressão de 6 bar. Todas as partes que entram em contacto com o líquido alimentado e pó são fabricadas em aço inoxidável AISI 316, excepto o tubo de alimentação da bomba e a roda do atomizador, que são fabricados em aço inoxidável AISI 329, concebido para resistir a forças centrífugas elevadas. A câmara de secagem tem um interior fabricado em aço inoxidável AISI 316, bem

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isolado com lã mineral e o exterior coberto com uma cobertura de aço macio. A câmara de secagem é provida de uma luz lateral e painel de observação, para inspecção durante a operação. O tecto da câmara de secagem é fabricado no interior em aço inoxidável AISI 316, e no exterior em aço inoxidável AISI 304.

Utiliza-se um dispersador de ar de aço inoxidável AISI 304 para distribuição do ar na câmara de secagem, de modo a conseguir o melhor efeito de secagem possível. Uma conduta de ar fabricada em aço inoxidável AISI 316 proporciona o transporte lateral do ar de escape e pó para o ciclone, que é fabricado em aço inoxidável AISI 316 e concebido para separar o pó e o ar.

Utiliza-se uma válvula de fecho do tipo borboleta, também fabricada em aço inoxidável AISI 316 com um vedante de borracha de silicone, para descarga do pó sob o ciclone, num vaso de vidro colector de pó, colocado bem ajustado sob o ciclone, por meio de um dispositivo de mola.

Um ventilador fabricada em silumina. completado com um motor trifásico em gaiola de esquilo, de 0,25 kW e accionamento por correia trapezoidal com protecção da correia, * retira o ar e o pó através da câmara de secagem e ciclone.

Um aquecedor de ar aquece o ar de secagem por meio de electricidade (consumo total de 7,5 kWh/h. infinitamente variável) e pode originar temperaturas de ar na entrada de até cerca de 350°C, embora isto seja geralmente demasiado elevado para preparar as microcápsulas de acordo com o invento.

Pode-se adicionar um equipamento para atomização por injector de dois fluidos, que é fabricado em aço inoxidável AISI 316, consistindo de um tubo de entrada com suporte de injector e injector a ser colocado no tecto da câmara de secagem. O equipamento inclui um separador óleo/água, uma válvula de redução e um indicador de pressão para ar comprimido destinado ao injector de dois fluidos. Consumo de ar comprimido: 8-15 kg/h a uma pressão de 0,5-2,0 bar (0,5-2,0 x 103 Pa).

Um exemplo de uma bomba de alimentação adequada para o transporte de uma preparação formadora de parede até ao dispositivo atomizador é uma bomba peristáltica. A bomba é provida de um motor (1 x 220 V, 50 Hz, 0,18 kW) e um redutor de velocidade variável de forma contínua, para ajuste manual. Um tubo de alimentação fabricado em mangueira de silicone conduz desde um tanque de alimentação (fornecimento local), ao

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longo da bomba de alimentação, até ao dispositivo de atomização.

Utiliza-se um filtro de ar absoluto, que consiste num pré-filtro, corpo de filtro em aço inoxidável e filtro de ar absoluto para o tratamento do ar de secagem de entrada, de modo a tomá-lo completamente limpo.

Bombeou-se uma solução a 20% de rHA isento de pirogénio, estéril, em água isenta de pirogénio (adequada para injecção) no injector de um atomizador por injector de dois fluidos, montado na unidade de pulverização comercial acima descrita. A velocidade da bomba peristáltica foi mantida a uma taxa de aproximadamente 10 ml/minuto, de forma que com uma temperatura de ar de entrada de 220°C, a temperatura do ar de saída se manteve a 95°C.

Fomeceu-se ar comprimido ao atomizador por injector de dois fluidos a 2,0-6,0 bar (2,0-6,0 x IO3 Pa). Nesta gama, obtêm-se microcápsulas com um tamanho médio de 4,25-6,2 μηι.

Tipicamente, um aumento no tamanho médio de partícula (por pressão de atomização reduzida) conduziu a um aumento na quantidade de microcápsulas com um tamanho superior a 10 pm (veja-se Tabela 1).

Tabela 1

EFEITOS DA PRESSÃO DE ATOMIZAÇÃO NA FREQUÊNCIA DE MICROCÁPSULAS COM MAIS DE 10 pm DE DIÂMETRO

Pressão de atomização (x 103 Pa) % da frequência com mais de 10 pm 6,0 0,8 5,0 0,3 3,5 6,6 2,5 8,6 2,0 13,1

No segundo passo do processo, aqueceram-se 5 g de microcápsulas num recipiente de vidro utilizando um forno com ventilador Gallenkamp. Foi suficiente uma temperatura de 175°C durante 1 hora para se obterem microcápsulas com uma fixação de 100%, como

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ΕΡ Ο 512 693 /PT 17 determinado por HPLC. O efeito desta fixação por calor era aumentar a semi-vida ecògénica in vitro, de alguns segundos para mais de 30 minutos. Alterando a temperatura e duração da incubação é possível variar o grau de fixação entre cerca de 5% e 100%. Na Figura 2 são apresentados exemplos de perfis de fixação de calor de várias temperaturas. A seguir à fixação pelo calor, as microcápsulas foram desaglomeradas e dispersas em água numa de duas maneiras. O método 1 envolveu primeiro a mistura das esferas fixas pelo calor com um peso igual de lactose finamente moída (diâmetro médio de 5 pm). A mistura foi em seguida passada através de um mòinho centrífugo Fritsch, com um crivo de 0,5 mm e um rotor de 12 dentes. As esferas moídas foram recolhidas e passadas através do moinho uma segunda vez. para assegurar uma mistura completa. O pó moído foi então re-suspenso em água contendo lmg.ml'1 de Pluronic F68. Tipicamente, adicionam-se 10 g de microcápsulas e lactose a 100 ml de água e Pluronic F68. O método 2 para a desaglomeração envolve a adição de 5 g de microcápsulas fixadas pelo calor, a 100 ml de água contendo 100 mg de Pluronic F68. As microcápsulas foram dispersas utilizando um homogeneizador Silverson (modelo L4R com uma sonda de homogeneização tubular de 2,54 cm e um crivo de alto corte) e homogeneizando durante 60 segundos.

As esferas re-suspensas foram separadas em esferas intactas (contendo gás) e quebradas, utilizando a técnica de flotação. Observou-se as esferas que contêm gás a flutuarem até à superfície durante um período de 1 hora, e em seguida estas foram decantadas da fracção sedimentada, que não contém o gás desejado. O processo de separação pode ser acelerado por centrifugação. Uma centrifugação de 30 segundos a 5000 x g é suficiente para separar as duas fracções.

Após separação, as microcápsulas intactas foram liofilizadas na presença de lactose e Pluronic F68. As condições óptimas para a liofilização envolveram a re-suspensão de 30 mg de microcápsulas em 5 ml de água contendo 50 mg de lactose e 5 mg de Pluronic F68. As microcápsulas liofilizadas podem ser redispersas num líquido (e.g. água, solução salina) para originar uma distribuição monodispersa.

Exemplo 2 O processo do Exemplo 1 foi repetido mas com as seguintes diferenças no primeiro passo: Utilizou-se um atomizador centrífugo em vez de um injector de dois fluidos; a temperatura de entrada era de 150°C (sendo a temperatura de saída ainda mantida a 105°C); e

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ΕΡ Ο 512 693 /PT 18 fomeceu-se ar comprimido ao injector a 1,0-6,0 x IO3 Pa. A roda rodou a 20-40.000 rpm e forneceu gotas, e subsequentemente microcápsulas, com um diâmetro médio na gama de 1,0-8,0 μηι.

Exemplo 3

No segundo passo do processo do Exemplo l ou 2 fez-se uma variação, como se segue. Aqueceu-se uma pequena alíquota de microcápsulas (0,5 g) num fomo de micro-ondas de modo que estas receberam 300-350 Watt.hora de calor proveniente das micro-ondas, a 2500 mHz. Isto originou microcápsulas em que 90-95% do rHA monomérico era insolúvel (como determinado por cromatografia de permeação em gel) e como resultado desta fixação pelo calor a sua semi-vida ecogénica in vitro aumentou de alguns segundos, para mais de 30 minutos.

Exemplo 4

No segundo passo do processo do Exemplo l ou 2 fizeram-se variações, como se segue. Selou-se uma pequena alíquota de microcápsulas (0,5 g) sob árgon, num frasco de vidro. O frasco foi arrefecido a 4°C e em seguida irradiado com uma fonte de radiação gama de h0Co para fornecer uma dose de 15,0 kGy de raios gama. A irradiação resultou na fonnação de microcápsulas em que 10-15% da albumina monomérica era insolúvel.

Exemplo 5

No segundo passo do processo do Exemplo 1 ou 2 fizeram-se variações, como se segue. Selou-se uma pequena alíquota de microcápsulas (0,5 g) sob árgon, num frasco de vidro. O frasco foi arrefecido a 4°C e em seguida irradiado com uma fonte de radiação gama de 60Co para fornecer uma dose de 50,0 kGy de raios gama às microcápsulas. A seguir à irradiação, as microcápsulas foram incubadas em oxigénio a 50°C durante 6 horas. A irradiação resultou na formação de microcápsulas em que 50-60% do rHA monomérico era insolúvel.

Exemplo 6

No segundo passo do processo do Exemplo 1 ou 2 fizeram-se variações como se segue.

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Re-suspendeu-se uma pequena alíquota de microcápsulas (0,5 g) em 5 ml de etanol, clorofórmio ou cloreto de metileno contendo a) 1,5% de gluteraldeído, b) 2,0% de cloreto de diftaloílo ou c) 5,0% de formaldeído. As microcápsulas foram agitadas durante períodos de tempo variáveis, de 10 minutos a 3 horas. As microcápsulas foram removidas por filtração e lavadas no tampão orgânico original contendo etanolamina a 5%, de modo a remover o excesso de agente de reticulação. Por fim. as microcápsulas foram lavadas num solvente orgânico e secas sob vácuo para remover quaisquer solventes residuais. A extensão de insolubilização pode variar de 5-100% por este método, resultando no aumento da semi-vida ecogénica in vitro, de 1-2 minutos para mais de uma hora.

Exemplo 7

Os dois passos independentes da formação de microcápsulas e insolubilização do invólucro podem ser combinados num único processo. Neste exemplo, a formação das microcápsulas e a insolubilização do material polimérico são realizadas em simultâneo, durante o processo de secagem por vaporização.

Alimentou-se uma solução de rHA por meio de uma bomba peristáltica a uma câmara de reacção pequena, tendo uma linha de alimentação separada que fornece uma solução a 5% de um agente de reticulação adequado, e.g. gluteraldeído, cloreto de diftaloílo ou formaldeído. O tempo de residência na câmara de reacção era tal que se obteve a formação de um aducto inicial entre o agente de reticulação e a proteína, mas impediu-se a reticulação intra-proteína. A saída do vaso reaccional foi alimentada directamente nos atomizadores por injector de dois fluidos montados numa unidade de secagem por pulverização, especialmente adaptada, capaz de lidar com solventes voláteis. As condições de secagem por pulverização foram as delineadas no Exemplo 1. As microcápsulas foram incubadas secas à temperatura ambiente para permitir a formação de reticulações intra-proteína e em seguida foram suspensas em etanol contendo etanolamina a 5%, para neutralizar qualquer agente de reticulação remanescente. Realizou-se uma lavagem das microcápsulas, e por fim as microcápsulas foram secas sob vácuo, para remover o solvente residual.

Exemplo 8: Teste de rHA monomérico livre em microcápsulas

Adicionou-se um volume de 1 ml de etanol a 100 mg de microcápsulas numa garrafa de vidro de 20 ml e sujeitou-se a ultra-sons durante 30 segundos. Adicionaram-se 19 ml de H:0 a esta suspensão.

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A mistura foi centrifugada numa microcentrífuga de bancada (Gilson) durante 20 segundos e testou-se a fracção limpa. O teste foi realizado carregando automaticamente 50 ml da fracção num HPLC Shimadzu LC6A. e realizando a cromatografia numa coluna de permeação em gel TSK, a um caudal de 1 ml.minuto'1, utilizando tampão fosfato de sódio (pH 7,0).

As alturas dos picos que representam o monómero de rHA foram registadas e utilizadas para determinar a concentração de monómero, utilizando uma curva padrão entre 1 e 10 mg.ml'1 de rHA monomérico. A % de rHA monomérico livre foi calculada medindo a concentração de monómero nas microcápsulas fixadas e representando este valor como uma percentagem da concentração de monómeros das microcápsulas não fixadas. Os resultados são apresentados na Figura 2. O aquecimento das microcápsulas secas por pulverização num forno (como descrito no Exemplo 1) resulta num decréscimo na quantidade de monómero que pode ser detectada (veja-se Figura 2). Este decréscimo no rHA monomérico detectável é devido à desnaturação e reticulação do rHA monomérico em polímeros insolúveis, que não podem ser testados pelo método de HPLC acima mencionado.

Utilizando o método de HPLC para determinar os níveis de monitorização de rHA, é óbvio pela Figura 2 que após 15 minutos de incubação não há rHA monomérico livre presente nas microcápsulas de rHA. No entanto, ainda é possível reticular mais as microcápsulas de rHA, por meio de aquecimento durante períodos maiores.

Este aquecimento prolongado resulta num nível aumentado de reticulação das microcápsulas, que por sua vez produz microcápsulas com uma maior resistência, que são correspondentemente mais resistentes à pressão.

Por controlo cuidadoso da temperatura e tempo de incubação, é possível produzir microcápsulas com uma gama controlada de reticulação (e portanto de resistência à pressão).

Exemplo 9: Efeitos do tempo de incubação a 175°C na resistência à pressão das microcápsulas

Dividiu-se um lote de microcápsulas de rHA em alíquotas de 5 g e cozeram-se a

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ΕΡ Ο 512 693 /PT 21 175°C durante diferentes períodos de tempo, como se mostra na Figura 3

Após fixação pelo calor, determinou-se a quantidade de monómero livre como descrito no Exemplo 8. Para cada uma das incubações apresentadas não foi detectado nenhum rHA monomérico.

As microcápsulas fixadas pelo calor foram desagregadas utilizando um moinho centrífugo Fritsch (como descrito acima) e recuperaram-se microcápsulas intactas, contendo ar, pela técnica de flotação acima mencionada. As microcápsulas recuperadas foram suspensas em H20 contendo Pluronic F68 (1 mg.ml"), a uma concentração de 0,5 x 108 cápsulas, ml'1.

As microcápsulas re-suspensas, contendo ar, foram submetidas a pressão atmosférica aumentada, aplicando pressão com uma seringa de 50 ml, contendo ao mesmo tempo esta suspensão num recipiente fechado (recipiente de poliestireno de 25 ml).

Para cada uma das pressões testadas, a suspensão de microcápsulas individual foi pressurizada até à pressão seleccionada e mantida a essa pressão durante 5 segundos, antes de libertar a pressão. Para cada suspensão analisada, o aumento de pressão foi realizado 3 vezes. A pressão no recipiente fechado foi determinada por um manómetro RS, manuseado manualmente.

Após a pressurização, as suspensões de microcápsulas foram analisadas por microscopia óptica e análise de imagem, e determinou-se a % de microcápsulas que contêm ar, relativamente às que não contêm ar. Esta análise é realizada uma vez que apenas as microcápsulas que contêm ar são funcionais em aumentar o ecocontraste por ultra-sons.

Como se pode ver pela Figura 3, as microcápsulas que são fixadas durante 60 minutos a 175°C, como descrito no Exemplo 1, são estáveis a todas as pressões a que foram submetidas nesta experiência.

Por controlo cuidadoso da duração da incubação a esta temperatura particular (175°C), é possível produzir lotes de microcápsulas com diferentes graus de reticulação, que por sua vez são resistentes a vários graus de aumento de pressão.

Utilizando este controlo cuidadoso, por ajuste da duração e temperatura de incubação, é possível produzir lotes de microcápsulas contendo ar, que são especificamente concebidos

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ΕΡ Ο 512 693 /PT 22 para suportar um aumento de pressão determinado. A temperatura utilizada para reticular as microcápsulas pode variar infinitamente, bem como a duração do tempo de incubação.

Exemplo 10: Classificação de microcápsulas

Uma vantagem do processo de acordo com o invento é a de permitir que o tamanho mediano e a distribuição de tamanho das microesferas sejam controlados. No entanto, podem-se ainda seleccionar tamanhos desejados, se assim se pretender, por exemplo por flotação. Numa dispersão homogénea de microesferas, as partículas maiores irão atingir a superfície mais depressa que as partículas menores, devido à menor densidade (mais ar encapsulado) das partículas maiores. Assim, deixando a dispersão em repouso, a distribuição de tamanhos das partículas irá variar a qualquer nível da solução, dependendo do tempo.

As microcápsulas foram dispersas em 2.000 ml de solução aquosa que contém 6% p/v de cloreto de sódio e 0,1% p/v de Pluronic F68 numa garrafa de vidro, obtendo-se uma coluna de líquido de aproximadamente 165 mm. Colocou-se um tubo de amostragem 50 mm abaixo da superfície do líquido superior, de modo a permitir a remoção de amostras a intervalos controlados.

Alterando o tempo de repouso e a concentração de cloreto de sódio foi possível produzir uma variedade de distribuições de tamanho de partícula e classificar as microcápsulas até aos 2 pm.

Outras técnicas húmidas para classificação incluem a cromatografía hidrodinâmica e o fraccionamento em fluxo líquido. As técnicas "secas" que utilizam os princípios da elutriação e separação em corrente cruzada estão comercialmente disponíveis na forma de classificadores Microsplit (British Rem.), Zig-Zag (Alpine) e Turbo (Nissuin). O classificador de jacto em cotovelo, fabricado pela Nitettsu Mining Co. utiliza um princípio diferente (efeito Coanda), que também permitiu alcançar bons resultados para a classificação de microcápsulas.

Detalhes adicionais da construção do atomizador

Na Figura 1, o número de referência 1 refere-se ao dispositivo de alimentação. 2 é um dispersador de tecto de ar que assegura o controlo eficaz do tipo de fluxo de ar. O ar em espiral é dirigido em tomo do atomizador de disco com válvula. 3 é um atomizador rotativo ou atomizador por injector. 4 mostra um sistema de tubo de interligação de aço inoxidável, que pode ser facilmente removido para lavagem. 5 são degraus para acesso ao topo da 23 * 84 597

ΕΡ Ο 512 693/PT câmara. 6 é ο comutador para uma válvula de ar para activação do dispositivo de elevação pneumática, quando se pretende abrir a tampa da câmara. 7 é um ciclone de aço inoxidável de alto rendimento, em que se separam o pó e o ar de secagem de escape. 8 é um recipiente de vidro em que se recupera o pó. 9 é um painel de instrumentos localizado ao centro. 10 é um ventilador de escape centrífugo com um motor trifásico. 11 é um amortecedor, para o controlo do fluxo de ar e 12 é um aquecedor de ar eléctrico que proporciona temperaturas de ar de secagem até 350°C. A temperatura do ar de secagem pode ser ajustada continuamente utilizando um temporizador percentual. O consumo máximo de potência é de 7,5 kW.

Capacidade de evaporação

Ar de secagem Temperatura do ar de entrada Temperatura do ar de saída Capacidade de evaporação 85 kg/h 150°C 80°C 1,3 kg/h 85 kg/h 170°C 85°C 1,7 kg/h 80 kg/h 200°C 90°C 2,5 kg/h 80 kg/h 240°C 90°C 3,4 kg/h 75 kg/h O o o 90°C 7,0 kg/h

Peso e dimensão Peso 280 kg

Comprimento 1800 mm

Altura 2200 mm

Largura 925 mm

Energia A unidade apenas pode ser operada com um fornecimento de energia em 3-fases (50 ou 60 Hz) a voltagens alternativas de 440, 415, 400, 380, 220, 200 V.

Todas as partes que entram em contacto com o líquido ou o produto, são fabricadas em aço inoxidável AISI 316, resistente a ácido.

Lisboa, 14. SET. 2òu0

Por QUADRANT HEALTHCARE (UK) LIMITED - O AGENTE OFICIAL -

Claims

.. 84 597 ΕΡ Ο 512 693/PT REIVINDICAÇÕES 1 - Processo para a formação de um pó estéril que compreende microcápsulas ocas que podem ser suspensas num meio injectável parentericamente, a fim de formar uma suspensão adequada para imagiologia por ultra-sons, quando administrada intravenosamente, em que o referido processo compreende: (a) proporcionar uma solução ou dispersão de um material que forma paredes, num líquido; (b) ãtomizar a referida solução ou dispersão num gás aquecido, de forma que o referido líquido evapora, formando desse modo microcápsulas ocas do referido material que forma paredes; (c) aquecer as referidas microcápsulas para reduzir a solubilidade em água do referido material que forma paredes, obtendo-se assim as referidas microcápsulas como um pó; e (d) tomar o referido pó estéril.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o pó compreende microcápsulas ocas, em que pelo menos 90% destas têm um diâmetro de 0,05 a 50,0 pm.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o pó compreende microcápsulas ocas, em que pelo menos 90% destas têm um diâmetro de 0,05 a 20,0 pm.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, em que o pó compreende microcápsulas ocas, em que pelo menos 90% destas têm um diâmetro de 0,1 a 20,0 pm.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 3, em que o pó é tomado estéril realizando os passos (a) a (c) sob condições estéreis.
6 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o material que forma paredes é solúvel em água.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o material que forma paredes é uma proteína. 84 597 ΕΡ Ο 512 693 / ΡΤ 2/2
8 - Processo de acordo com a reivindicação 7. em que a proteína é colagénio, gelatina ou albumina humana.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a proteína é albumina humana ou um análogo ou fragmento seu derivado, preparado por técnicas de ADN recombinante ou isolado a partir de soro humano.
10 - Processo de acordo com qualquer das reivindicação 7 a 9, em que a solução ou dispersão de proteínas compreende 10,0 a 30,0% p/v de proteína.
11 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 10, em que o produto do passo (b) compreende 96-98% de proteína monomérica.
12 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 11, em que o produto do passo (c) não compreende mais que 5% de proteína monomérica.
13 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, em que as condições do passo (b) são de forma a realizar-se o passo (c) substancialmente em simultâneo.
14 - Microcápsulas obteníveis através de um processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13. Lisboa, -J4 -ff 2000 Por QUADRANT HEALTHCARE (UK) LIMITED - O AGENTE OFICIAL -

ED36.e AMTONfO I0ÃGÍ SA CU14HA FERREiRA Ag. Of. Pr. Ind. Rko das Flores, 74-4.° 1 £ OO LISBOA