PT2214491T - Análogos de quinolona e métodos com eles relacionados - Google Patents

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"Análogos de quinolona e métodos com eles relacionados" Âmbito da invenção A invenção refere-se a novos compostos de quinolona e suas composições farmacêuticas. A invenção refere-se igualmente a esses compostos e composições para utilização na inibição de proliferação celular e/ou na indução de apoptose celular. 0 documento WO 2006/034113 divulga análogos de quinolona que podem inibir proliferação celular e/ou induzir apoptose celular. Divulga também métodos de preparação de análogos de quinolona e métodos para os usar.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona novos compostos de quinolona e suas composições farmacêuticas que podem inibir proliferação celular e/ou induzir apoptose celular. Divulgam-se também métodos de preparação desses compostos de quinolona e composições, e métodos de tratamento de distúrbios de proliferação celular através da sua administração. A presente invenção proporciona um composto de Fórmula (VIII)

(Viri) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; na qual: A e V são, independentemente, H, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR1R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°; cada Q é, independentemente, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR!R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°; em cada -NR2R2, R1 e R2 juntamente com N podem formar um anel azacíclico, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; R1 é H ou alquilo C1-C6, opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, ou =0; R2 é H ou alquilo C1-C10, heteroalquilo C1-C10, alcenilo C2-C10 ou heteroalcenilo C2-C10, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbociclico ou heterociclico com 3-7 membros, opcionalmente substituído; R3 é um alquilo C1-C10, alcenilo C2-C10, arilo C5-C10 ou arilalquilo C6-C12 opcionalmente substituído ou uma sua heteroforma, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbociclico ou heterociclico com 3-6 membros, opcionalmente substituído; cada R4 é, independentemente, H ou alquilo C1-C6; ou R4 pode ser -W, -L-W ou -L-N(R)-W°; cada R é, independentemente, H ou alquilo C1-C6; R7 é H e R8 é alquilo C1-C4 substituído com um anel heterociclico aromático opcionalmente substituído; m é 0, 1, 2, 3 ou 4 ; néO, 1, 2, 3, 4 ou 5; p é 0, 1, 2 ou 3; L é um ligante alquileno C1-C10, heteroalquileno C1-C10, alcenileno C2-C10 ou heteroalcenileno C2-C10, podendo cada um deles estar opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados no grupo que consiste em halogéneo, oxo (=0) ou alquilo C1-C6; W é um anel azacíclico com 4-7 membros, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; e W° é um anel carbocíclico com 3-4 membros, opcionalmente substituído, ou um grupo alquilo C1-C6 substituído com 1 a 4 átomos de flúor.

Num outro aspeto, a invenção proporciona um composto de Fórmula (VII)

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; na qual: A e V são, independentemente, H, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR!R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W0 ou -L-N(R)-W°; cada Q é, independentemente, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR3R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°; em cada -NR3R2, R1 e R2 juntamente com N podem formar um anel azacíclico, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; R1 é H ou alquilo C1-C6, opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, ou =0; R2 é H ou alquilo C1-C10, heteroalquilo C1-C10, alcenilo C2-C10 ou heteroalcenilo C2-C10, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, ou =0 ou um anel carbocíclico ou heterocíclico com 3-7 membros, opcionalmente substituído; R3 é um alquilo C1-C10, alcenilo C2-C10, arilo C5-C10 ou arilalquilo C6-C12, opcionalmente substituído, ou uma sua heteroforma, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbocíclico ou heterocíclico com 3-6 membros, opcionalmente substituído; cada R4 é, independentemente, H ou alquilo C1-C6; ou R4 pode ser -W, -L-W ou -L-N(R)-W°; cada R é, independentemente, H ou alquilo C1-C6; m é 0, 1, 2, 3 ou 4; néO, 1, 2, 3, 4 ou 5; p é 0, 1, 2 ou 3; L é um ligante alquileno C1-C10, heteroalquileno C1-C10, alcenileno C2-C10 ou heteroalcenileno C2-C10, podendo cada um deles estar opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados no grupo que consiste em halogéneo, oxo (=0) ou alquilo C1-C6; W é um anel azacíclico com 4-7 membros, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; e W° é um anel carbocíclico com 3-4 membros, opcionalmente substituído, ou um grupo alquilo C1-C6 substituído com 1 a 4 átomos de flúor.

Num outro aspeto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um composto de Fórmula (VII) ou Fórmula (VIII), como aqui descrito em mais detalhe. Nalgumas formas de realização, a composição farmacêutica é adequada para administração oral. Noutras formas de realização, a composição farmacêutica é adequada para administração intravenosa.

Num outro aspeto, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula (VII) ou (VIII) para utilização num método para tratar ou melhorar um distúrbio de proliferação celular num indivíduo, como aqui descrito em mais detalhe.

Em certas formas de realização, o distúrbio de proliferação celular é um tumor ou cancro. Em certas formas de realização, o indivíduo é um indivíduo humano ou animal.

Também aqui se divulga um método para reduzir ou inibir proliferação celular compreendendo fazer contactar um sistema ou um indivíduo, que tenha necessidade disso, com uma quantidade eficaz do composto de Fórmula (VII) ou Fórmula (VIII) ou de uma sua composição farmacêutica, reduzindo ou inibindo assim a proliferação celular.

Também aqui se divulga um método para reduzir concentrações microbianas e/ou melhorar uma infeção microbiana compreendendo fazer contactar um sistema ou um indivíduo, que tenha necessidade disso, com uma quantidade eficaz do composto de Fórmula (VII) ou Fórmula (VIII) ou de uma sua composição farmacêutica e, opcionalmente, com um agente antimicrobiano, reduzindo assim as concentrações microbianas e/ou melhorando a referida infeção microbiana. 0 sistema pode ser uma célula ou tecido e o indivíduo pode ser um indivíduo humano ou animal. As concentrações microbianas e/ou a infeção microbiana podem ser concentrações virais, bacterianas ou fúngicas.

Também aqui se divulga um método para induzir morte celular e/ou induzir apoptose compreendendo administrar a um sistema ou a um indivíduo, que tenha necessidade disso, uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula (VII) ou Fórmula (VIII) ou de uma sua composição farmacêutica e, opcionalmente, com um procedimento e/ou um agente quimioterapêutico, induzindo assim morte celular e/ou induzindo apoptose. 0 sistema pode ser uma célula ou tecido e o referido indivíduo pode ser um indivíduo humano ou animal.

Em compostos de Fórmula (VII) ou (VIII), em cada -NR1!!2, R1 e R2 juntamente com N podem formar um anel azacíclico, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel.

Em compostos de Fórmula (VII) ou (VIII), R1 é H ou alquilo C1-C6, opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, ou =0. Muitas vezes, R1 é H ou metilo. R2, em compostos de Fórmula (VII) ou (VIII), é H ou alquilo C1-C10, heteroalquilo C1-C10, alcenilo C2-C10 ou heteroalcenilo C2-C10, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbocíclico ou heterocíclico com 3-6 membros opcionalmente substituído.

Em compostos de Fórmula (I), R3 é um alquilo C1-C10, alcenilo C2-C10, arilo C5-C10 ou arilalquilo C6-C12, opcionalmente substituído, ou uma sua heteroforma, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, ou um anel carbocíclico ou heterocíclico com 3-6 membros opcionalmente substituído; e em que as porções alquilo e alcenilo, e as suas heteroformas correspondentes, podem estar opcionalmente substituídas com =0.

Em compostos de Fórmula (VII) ou (VIII) , cada R4 é, independentemente, H ou alquilo C1-C6 opcionalmente substituído; ou R4 pode ser -W, -L-W ou -L-N(R)-W°. L, em compostos de Fórmula (VII) ou (VIII), é um ligante alquileno C1-C10, heteroalquileno C1-C10, alcenileno C2-C10 ou heteroalcenileno C2-C10, podendo cada um deles estar opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados no grupo que consiste em halogéneo, oxo (=0) ou alquilo C1-C6;

Em compostos de Fórmula (VII) ou (VIII), W é um anel azacíclico aromático, parcialmente insaturado ou saturado, com 4-7 membros, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; em que o anel W pode estar ligado, através da ligação identificada com R4 ou através do grupo de ligação -L-ou -L-N(R)-, em qualquer posição do anel azacíclico. Em compostos de Fórmula (VII) ou (VIII) , W° é um anel carbocíclico com 3-4 membros opcionalmente substituído ou um grupo alquilo C1-C6 substituído com de 1 a 4 átomos de flúor.

Em certas formas de realização, W contém pelo menos uma ligação dupla. Por exemplo, W pode ser um anel imidazole, imidazolina, pirrole, pirrolidina, piridina, di-hidropiridina, tetra-hidropiridina, pirimidina, pirazina ou piridazina opcionalmente substituído.

Noutras formas de realização, W é um anel azacíclico saturado opcionalmente substituído. Por exemplo, W pode ser um anel azetidina, pirrolidina, piperidina, piperazina, morfolina, tiomorfolina, homopiperazina, homomorfolina ou homotiomorfolina opcionalmente substituído.

Em certas formas de realização da Fórmula (VII), A e V são, independentemente, H, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR1R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N (R) -W°, onde R1, R2, -R3, -W, -L, -W° e R são definidos como acima.

Em certas formas de realização da Fórmula (VII), A e V são, independentemente, H e halo, preferivelmente fluoro. Em certas formas de realização preferidas, A e V são, cada um, H. Noutras formas de realização preferidas, A é fluoro e V é H.

Em certas formas de realização da Fórmula (VII), cada Q é, independentemente, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR1R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°. Subentende-se que cada posição opcionalmente substituída com um grupo Q é substituída com H quando m, n ou p é zero.

Numa forma de realização preferida, cada m e n é 0 ou 1.

Numa outra forma de realização preferida da Fórmula (VII), men são, cada um, 0.

Noutra forma de realização preferida da Fórmula (VII), p é 0 ou 1.

Numa forma de realização particularmente preferida, men são 0, p é 1 e Q é alquilo C1-C4, preferivelmente metilo.

Numa forma de realização preferida da Fórmula (VII), R4 é H ou alquilo C1-C4 ou cicloalquilo C3-C7. Numa forma de realização particularmente preferida, R4 é metilo. Numa outra forma de realização preferida, R4 é H.

Em certas formas de realização particularmente preferidas, o composto de Fórmula (VII) compreende duas ou mais características preferidas, por vezes três ou mais características preferidas.

Em certas formas de realização da Fórmula (VIII), A e V são, independentemente, H, halo, azido, -CN, -CF3, -CONí^R2, -NR4R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°, onde R1, R2, -R3, -W, -L, -W° e R são definidos como acima.

Em certas formas de realização, A e V são, independentemente, H e halo, preferivelmente fluoro. Em certas formas de realização preferidas, A e V são cada um H. Noutras formas de realização preferidas, A é fluoro e V é H.

Em certas formas de realização da Fórmula (VIII), cada Q é, independentemente, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR4R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°. Subentende-se que cada posição opcionalmente substituída com um grupo Q é substituída com H quando m, n ou p é 0.

Numa forma de realização preferida, cada m e n é 0 ou 1.

Numa outra forma de realização preferida da Fórmula (VIII), men são, cada um, 0.

Numa forma de realização preferida, men são 0.

Numa forma de realização preferida da Fórmula (VIII), R4 é alquilo C1-C4 ou cicloalquilo C3-C7. Numa forma de realização particularmente preferida, R4 é metilo. Numa outra forma de realização preferida, R4 é H.

Em certas formas de realização da Fórmula (VIII), R7 é H e R8 é um alquilo C1-4 substituído com um anel heterociclico aromático opcionalmente substituído. Em certas formas de realização preferidas, R8 é um alquilo C1-4 substituído com um anel imidazole, piridina, pirimidina, piridazina ou pirazina opcionalmente substituído.

Em certas formas de realização, R7 é H e R8 é um alquilo C1-4 substituído com um anel heterociclico aromático opcionalmente substituído. Em certas formas de realização, o anel heterociclico aromático opcionalmente substituído é selecionado entre piridina, pirimidina, pirazina, imidazole, pirrolidina e tiazole.

Em certas formas de realização preferidas da Fórmula (VIII), R7 é H e R8 é selecionado entre -CH2-(piridina), -CH2-(metilpiridina), -CH2-(metilpirimidina), -CH2-(metilpirimidina), -CH2-(pirazina), -CH2-(metilpirazina), -CH2-(imidazole), -CH2-(N-metilimidazole), -CH2-(pirrolidina), -CH2-(N-metilpirrolidina) , -CH2- (tiazole) e -CH2- (N-metiltiazole) .

Em certas formas de realização preferidas da Fórmula (VIII), R7 e R8 juntamente com N, em -NR7R8, formam um anel morfolina ou piperazina opcionalmente substituído.

Em certas formas de realização particularmente preferidas, o composto de Fórmula (VIII) compreende duas ou mais características preferidas, por vezes três ou mais características preferidas.

Formas de realização preferidas da presente invenção incluem os compostos apresentados nas Tabelas 1-8 e ao longo dos Exemplos.

Em certas formas de realização particularmente preferidas, o composto tem uma das seguintes estruturas:

ou um seu éster ou sal farmaceuticamente aceitável. A presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um composto tendo qualquer uma das Fórmulas (VII) ou (VIII) acima e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Num exemplo, a composição compreende um composto tendo qualquer uma das fórmulas acima, polietilenoglicol e propilenoglicol numa solução tampão.

Os compostos da invenção exercem atividade biológica em ensaios aqui descritos. Por exemplo, os compostos da invenção podem inibir a biogénese de ARN e podem suprimir o crescimento tumoral. Sem pretender limitar a invenção por qualquer teoria do seu funcionamento, crê-se que os compostos podem funcionar, em parte, por interação com regiões de formação de quadruplex de ácidos nucleicos e modulação da transcrição de ARN ribossómico. Os compostos da invenção podem também modular a interação de ácidos nucleicos de formação de quadruplex com nucleolina, uma proteina que está associada à apoptose; assim, a modulação da atividade, a localização ou a estabilidade da nucleolina também podem contribuir para a capacidade destes compostos induzirem apoptose. A presente invenção também proporciona métodos de preparação destes compostos e métodos para os usar.

Por conseguinte, são aqui divulgados métodos para reduzir proliferação celular e/ou induzir morte celular compreendendo fazer contactar um sistema com uma quantidade eficaz de um composto, tendo qualquer uma das fórmulas acima, ou de uma sua composição farmacêutica e, opcionalmente, em combinação com um agente quimioterapêutico, desse modo reduzindo a proliferação celular e/ou induzindo morte celular, tal como apoptose ou morte celular apoptótica, no referido sistema. 0 sistema pode ser uma célula ou um tecido. 0 sistema pode incluir uma célula pancreática, tal como uma célula de um indivíduo ou uma célula em cultura (e.g., in vivo ou ex vivo) . 0 sistema pode incluir uma célula de cancro pancreático. 0 sistema pode ser uma linhagem celular tal como PC3, HCT116, HT29, MIA Paca-2, HPAC, Hs700T, PanclO.05, Pane 02.13, PL45, SW 190, Hs 766T, CFPAC-1, PANC-1, MV-4-11, THP-1 e K-562.

Também são aqui divulgados métodos para tratar ou melhorar um distúrbio de proliferação celular, compreendendo administrar a um indivíduo que dele necessite uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula (VII) ou de Fórmula (VIII), ou de uma sua composição farmacêutica e, opcionalmente, em combinação com um agente quimioterapêutico, desse modo tratando ou melhorando o referido distúrbio de proliferação celular. Por exemplo, pode reduzir-se a proliferação celular e/ou induzir-se a morte celular, tal como apoptose ou morte celular apoptótica. O distúrbio de proliferação celular pode ser um tumor ou um cancro num indivíduo humano ou animal. O cancro pode ser cancro pancreático, incluindo tumores não endócrinos e endócrinos. Exemplos ilustrativos de tumores não endócrinos incluem, sem a eles se limitarem, adenocarcinomas, carcinomas de células acinares, carcinomas adenoescamosos, tumores de células gigantes, neoplasmas mucinosos papilares intraductais, cistadenocarcinomas mucinosos, pancreatoblastomas, cistadenomas serosos, tumores sólidos e pseudopapilares. Um tumor endócrino pode ser um tumor de células dos ilhéus.

Os métodos para reduzir proliferação celular e/ou induzir morte celular anteriores também podem ser praticados em combinação com um procedimento e/ou um agente quimioterapêutico. Exemplos de procedimentos que podem ser usados em combinação com os métodos aqui divulgados incluem radioterapia e cirurgia, sem se limitarem a estes. Em certas formas de realização, os compostos da presente invenção destinam-se a ser administrados em combinação com um agente quimioterapêutico e usados para reduzir a proliferação celular, induzir morte celular e/ou melhorar um distúrbio de proliferação celular.

Também são aqui divulgados métodos para reduzir ou inibir proliferação celular, compreendendo fazer contactar um sistema ou um indivíduo que tenha necessidade disso com uma quantidade eficaz do composto de Fórmula (VII) ou Fórmula (VIII) ou de uma sua composição farmacêutica, reduzindo ou inibindo assim a proliferação celular. São igualmente aqui divulgados métodos para reduzir concentrações microbianas compreendendo fazer contactar um sistema com uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VI'), (VII) ou (VIII) ou uma sua composição farmacêutica e, opcionalmente, com um agente antimicrobiano, reduzindo assim as concentrações microbianas. 0 sistema pode ser uma célula ou um tecido. A presente invenção também proporciona métodos para melhorar uma infeção microbiana compreendendo administrar a um indivíduo que dele necessite, uma quantidade eficaz de um composto, tendo qualquer uma das fórmulas acima, ou de uma sua composição farmacêutica e, opcionalmente, com um agente antimicrobiano, dessa forma melhorando a referida infeção microbiana. 0 indivíduo pode ser humano ou animal. As concentrações microbianas podem ser concentrações virais, bacterianas ou fúngicas. São igualmente aqui divulgados métodos para determinar a seletividade de interação entre um composto, tendo qualquer uma das fórmulas acima, e ácidos nucleicos capazes de formar uma estrutura em quadruplex compreendendo: a) fazer contactar um composto, na ausência de uma molécula competidora, com três ou mais ácidos nucleicos capazes de formar uma estrutura em quadruplex, onde nenhum ácido nucleico é um ácido nucleico telomérico; b) medir uma interação direta entre o composto e os referidos três ou mais ácidos nucleicos; e c) determinar a seletividade de interação a partir de uma comparação das medições da interação. Num exemplo, três ou mais ácidos nucleicos compreendem uma sequência nucleotidica localizada a 5' de uma sequência nucleotidica de oncogene. 0 oncogene pode ser MYC, HIF, VEGF, ABL, TGF, PDGFa, MYB, SPARC, HER, VAV, RET, H-RAS, EGF, SRC, BCL-1, BCL-2, DHFR ou HMGA. Para determinar a seletividade de interação, pode fazer-se ο composto contactar separadamente com cada um dos referidos três ou mais ácidos nucleicos num recipiente diferente. Além disso, a seletividade de interação pode ser determinada a partir de uma comparação dos valores de CI50.

Os compostos da presente invenção podem interagir ou não com regiões de ADN que podem formar quadruplexes. Em certas formas de realização, os compostos da presente invenção podem ligar e/ou estabilizar uma hélice quadruplex. Exemplos de quadruplexes em hélice incluem, sem a eles se limitarem, H-RAS, RET, BCL-1, DHFR, TGF-β, HIF-Ια, VEGF, c-Myc ou PDGFa. Numa outra forma de realização, o composto pode ligar e/ou estabilizar um quadruplex de conformação em cadeira ("chair-eller") ou em cesto ("basket"). Por exemplo, o composto pode ligar-se e/ou estabilizar BCL-2. São igualmente aqui divulgados métodos para induzir morte celular, tal como morte celular apoptótica (apoptose), compreendendo administrar a um sistema ou a indivíduo que disso necessite uma quantidade eficaz de um composto tendo qualquer uma das fórmulas (VII) ou (VIII) acima, ou uma sua composição farmacêutica e, opcionalmente com um agente quimioterapêutico. São igualmente aqui divulgados métodos para tratar ou melhorar um distúrbio mediado por sobre-expressão de oncogenes, tal como sobre-expressão de c-Myc, compreendendo administrar a um sistema ou a indivíduo que disso necessite uma quantidade eficaz de um composto tendo qualquer uma das fórmulas, ou uma sua composição farmacêutica e, opcionalmente, com um agente quimioterapêutico. 0 indivíduo pode ser humano ou animal e o sistema pode ser uma célula ou um tecido.

Os compostos das fórmulas acima podem ainda ser capazes de modular as atividades de várias proteína-quinases, uma vez que contêm características estruturais que se sabe que se ligam a proteína-quinases, e como tal são úteis para identificar moduladores de proteína-quinase usando métodos de seleção conhecidos na técnica. São aqui divulgados métodos de seleção representativos para certas quinases. Assim, divulga-se aqui um método para identificar um modulador de uma proteína-quinase que é por vezes um modulador potente de uma ou mais proteína-quinases particulares. Este método compreende a triagem de uma biblioteca, que contém pelo menos 10 compostos diferentes e, muitas vezes, pelo menos 100 desses compostos, dos compostos descritos aqui, sendo cada um de Fórmula (VII) ou (VIII), quanto à sua capacidade de modular a atividade de uma proteína-quinase.

Em alternativa, o método compreende a triagem de um conjunto de proteína-quinases, tal como pelo menos três ou pelo menos dez proteína-quinases, com um composto de Fórmula (VII) ou (VIII), para determinar um perfil de atividade diferencial. Estes métodos permitem ao utilizador identificar um composto possuindo um nível desejado de atividade e/ou de seletividade enquanto modulador de atividade de proteína-quinase, composto esse que pode ser usado para iniciar um programa de desenvolvimento de um fármaco. Assim, é igualmente aqui divulgada uma composição compreendendo uma proteína-quinase isolada complexada com um composto de Fórmula (VII) ou (VIII). Estes complexos são úteis pela informação que fornecem acerca do local de ligação de um composto de modulação à quinase particular, e como ferramenta de triagem para analisar a estrutura da quinase. Estes complexos também são úteis porque podem ser mais facilmente cristalizados do que a quinase não complexada, permitindo a cristalização e a determinação da estrutura do cristal onde isso não seria possível sem o composto de modulação ligado.

Também se divulga aqui um método para identificar uma molécula que modula uma interação entre um ácido nucleico ribossómico e uma proteina que interage com o ácido nucleico que compreende: (a) fazer contactar um ácido nucleico, contendo uma sequência nucleotidica ribossómica humana e a proteina, com uma molécula de teste tendo qualquer uma das estruturas divulgadas acima, em que o ácido nucleico é capaz de se ligar à proteina, e (b) detetar a quantidade do ácido nucleico ligado ou não ligado à proteina, pelo que a molécula de teste é identificada como uma molécula que modula a interação quando uma quantidade diferente do ácido nucleico se liga à proteina na presença da molécula de teste, comparando com a ausência da molécula de teste. A proteina pode ser selecionada no grupo que consiste em Nucleolina, Fibrilarina, RecQ, QPNl e fragmentos funcionais das anteriores.

Também se divulga aqui um método para identificar uma molécula que provoca deslocamento de nucleolina que compreende: (a) fazer contactar um ácido nucleico contendo uma sequência nucleotidica ribossómica humana e uma proteina nucleolina, com uma molécula de teste de Fórmula (VII) ou (VIII), em que o ácido nucleico é capaz de se ligar à proteina nucleolina, e (b) detetar a quantidade do ácido nucleico ligado ou não ligado à proteina nucleolina, pelo que a molécula de teste é identificada como uma molécula que provoca deslocamento de nucleolina quando menor quantidade do ácido nucleico se liga à proteina nucleolina na presença da molécula de teste do que na ausência da molécula de teste. A proteina nucleolina pode estar associada a um marcador detetável e, por vezes, a proteina nucleolina está associada a uma fase sólida. 0 ácido nucleico está, por vezes, em associação com um marcador detetável e o ácido nucleico pode estar em associação com uma fase sólida, em certas formas de realização. 0 ácido nucleico pode ser ADN, ARN ou um seu análogo, e pode compreender uma sequência nucleotidica descrita acima, em formas de realização especificas. É igualmente aqui divulgada uma composição compreendendo um ácido nucleico tendo uma sequência nucleotidica ribossómica proporcionada aqui, ou uma sua sequência consideravelmente idêntica, e/ou uma proteina que se liga à sequência nucleotidica (e.g., Nucleolina, Fibrilarina, RecQ, QPNl e fragmentos funcionais das anteriores) e um composto de Fórmula (VII) ou (VIII). É também aqui divulgado um método para identificar uma molécula que se liga a um ácido nucleico contendo uma sequência nucleotidica ribossómica humana, que compreende: (a) fazer contactar um ácido nucleico contendo uma sequência nucleotidica ribossómica humana aqui descrita, um composto que se liga ao ácido nucleico e uma molécula de teste de Fórmula (VII) ou (VIII), e (b) detetar a quantidade do composto ligado ou não ligado ao ácido nucleico, pelo que a molécula de teste é identificada como uma molécula que se liga ao ácido nucleico quando menor quantidade do composto se liga ao ácido nucleico na presença da molécula de teste do que na ausência da molécula de teste. 0 composto por vezes está em associação com um marcador detetável e por vezes está radiomarcado. 0 ácido nucleico pode estar em associação com uma fase sólida, em certas formas de realização. 0 ácido nucleico pode ser ADN, ARN ou um seu análogo e pode compreender uma sequência nucleotidica descrita acima em formas de realização especificas. 0 ácido nucleico pode formar um quadruplex, tal como um quadruplex intramolecular, em certas formas de realização. É também aqui divulgado um método para identificar um modulador de sintese de ácido nucleico que compreende fazer contactar um ácido nucleico molde, um oligonucleótido iniciador, tendo uma sequência nucleotidica complementar a uma sequência nucleotidica do ácido nucleico molde, nucleótidos de extensão, uma polimerase e uma molécula de teste de Fórmula (VII) ou (VIII), sob condições que permitam ao oligonucleótido iniciador hibridar com o ácido nucleico molde, em que o ácido nucleico molde compreende uma sequência nucleotidica ribossómica humana, e detetar a presença, ausência ou quantidade de um produto iniciador alongado sintetizado por extensão do ácido nucleico iniciador, pelo que a molécula de teste é identificada como um modulador de sintese de ácido nucleico quando é sintetizado menos produto iniciador alongado na presença da molécula de teste do que na ausência da molécula de teste. 0 método pode incluir a identificação de um modulador de sintese de ARN e incluir ainda a identificação de um modulador de sintese de ARN nucleolar. 0 ácido nucleico molde por vezes é ADN e outras vezes ARN e o molde pode incluir a titulo de exemplo, qualquer uma ou mais das sequências nucleotidicas ribossómicas descritas aqui. A polimerase por vezes é ADN-polimerase e outras vezes ARN-polimerase. Podem fazer-se contactar células com um composto de teste de Fórmula (VII) ou (VIII) e detetarem-se os niveis de ARN nas células, pelo que um composto de teste que reduz a quantidade de ARN em comparação com células não tratadas com o composto de teste, é identificado como uma molécula que modula a sintese de ARN. Neste último caso, podem avaliar-se niveis de ARN total e, nalguns casos, pode avaliar-se a quantidade total de ARN recém-sintetizado, tal como por incorporação e deteção de um nucleótido detetável no ARN (e.g., nucleótido marcado radioativamente) (e.g., nucleótido tritiado)), por exemplo.

Num ensaio especifico, divulga-se aqui um método para identificar uma molécula que modula a sintese de ARN ribossómico (ARNr) que compreende: fazer contactar células com uma molécula de teste de Fórmula (VII) ou (VIII), fazer contactar uma sequência nucleotidica ribossómica com um ou mais iniciadores que amplifiquem uma sua porção e uma sonda marcada que hibride com o produto de amplificação, e detetar a quantidade do produto de amplificação por hibridação da sonda marcada, pelo que uma molécula de teste que reduza ou aumente a quantidade de produto de amplificação é identificada como uma molécula que modula a sintese de ARNr. A sonda marcada pode ser adicionada depois de se adicionarem os iniciadores e do ARNr ser amplificado e, em certos casos, a sonda marcada e os iniciadores são adicionados ao mesmo tempo. A porção de sequência nucleotidica ribossómica amplificada está por vezes na extremidade 5' do ADN.

Também aqui se divulga uma biblioteca de compostos que compreende pelo menos 10 compostos de Fórmula (VII) ou (VIII). A biblioteca contém preferivelmente pelo menos 100 desses compostos. Esta biblioteca pode ser utilizada para identificar compostos tendo uma ou mais das atividades descritas aqui, ou uma combinação especifica dessas atividades, usando métodos conhecidos na técnica. O método é particularmente útil para identificar moléculas tendo um nivel limite de atividade biológica incluindo, mas sem se lhes limitar, (a) ligar-se a ácido nucleico quadruplex ou inibir a formação de ácido nucleico quadruplex (ADNr ou ARNr), (b) atividade contra uma proteina-quinase ou conjunto de proteína-quinases específicos e (c) atividade como modulador de ligação de um ácido nucleico a uma proteina, tal como nucleolina, por exemplo.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 mostra uma comparação de valores de AUC simples e de cassete para administração oral de compostos RBI.

Definições A presente invenção pode ser mais facilmente compreendida com referência à descrição detalhada que se segue das formas de realização preferidas da invenção e dos Exemplos incluídos aqui. Subentende-se que a terminologia aqui usada se destina apenas a descrever formas de realização especificas e não pretende ser limitativa. A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o significado vulgarmente entendido por uma pessoa competente na matéria a que esta invenção pertence.

Como aqui usado, "um" significa "pelo menos um" ou "um ou mais".

Como aqui usado, "cerca de" significa que o valor numérico é aproximado e que pequenas variações não afetam consideravelmente a prática da invenção. Quando se usa uma limitação numérica, a menos que o contexto indique de outra forma, "cerca de" significa que o valor numérico pode variar ±10% e manter-se dentro do âmbito da invenção.

Como aqui usado, o termo "alquilo" refere-se a um composto contendo carbono. Grupos "alquilo" podem ser lineares ou ramificados. Grupos alquilo cíclicos são referidos aqui como "cicloalquilo". "Heteroalquilo" refere-se a um composto no qual pelo menos um átomo de carbono da cadeia principal alquilo foi substituído por um heteroátomo, tipicamente N, 0 ou S. Porções "alcenilo" e "alcinilo" referem-se a porções alquilo contendo pelo menos uma ligação dupla ou uma ligação tripla, respetivamente.

Os substituintes opcionais, quando estão presentes numa porção alquilo, alcenilo ou alcinilo ou numa sua heteroforma, incluem, sem a eles se limitarem, OH, alcoxi Ci-6, amino opcionalmente substituído, amido, CN, carboxi, halo, =0, arilo, anéis heterocíclicos ou carbocíclicos opcionalmente substituídos ou substituintes inorgânicos.

Como aqui usado, o termo "carbociclo" refere-se a um composto cíclico contendo apenas átomos de carbono no anel, ao passo que um "heterociclo" se refere a um composto cíclico compreendendo um heteroátomo como membro do anel. As estruturas carbocíclicas e heterocíclicas abrangem compostos tendo sistemas monocíclicos, bicíclicos ou de múltiplos anéis e podem ser saturadas, parcialmente insaturadas ou aromáticas. Os anéis carbocíclicos e heterocíclicos podem estar opcionalmente substituídos com grupos substituintes adequados às suas estruturas.

Como aqui usado, o termo "azacíclico" ou "anel azacíclico" refere-se a um anel monocíclico com 3-7 membros ou a um sistema de anel bicíclico fundido com 8-12 membros, saturado, parcialmente insaturado ou aromático, contendo pelo menos um átomo de azoto. Estes anéis azacíclicos podem opcionalmente conter 1-2 heteroátomos adicionais, selecionados entre N, 0 e S, como membros do anel, e podem estar opcionalmente substituídos desde que essa substituição faça sentido em termos químicos.

Como aqui usado, o termo "arilo" refere-se a um substituinte hidrocarboneto polinsaturado, tipicamente aromático, ao passo que um "heteroarilo" ou "heteroaromático" se refere a um anel aromático contendo um heteroátomo como membro do anel. As estruturas arilo e heteroarilo abrangem compostos tendo sistemas monocíclicos, bicíclicos ou de múltiplos anéis e podem estar opcionalmente substituídas.

Como aqui usado, o termo "heteroátomo" refere-se a qualquer átomo que não seja carbono ou hidrogénio, tal como azoto, oxigénio ou enxofre. 0 termo "heteroforma", como aqui usado, refere-se a um grupo em que um ou mais átomos de carbono de uma porção hidrocarbilo foram substituídos por um heteroátomo, tipicamente N, 0 e S. Por exemplo heteroarilo é a heteroforma de arilo e heteroalquilo é a heteroforma de alquilo. Exemplos ilustrativos de heterociclos incluem, sem a eles se limitarem, tetra-hidrofurano, 1,3-dioxolano, 2,3-di-hidrofurano, pirano, tetra-hidropirano, benzofurano, isobenzofurano, 1,3-di-hidro-isobenzofurano, isoxazole, 4,5-di-hidro-isoxazole, piperidina, pirrolidina, pirrolidin-2-ona, pirrole, piridina, pirimidina, octa-hidropirrolo[3,4-b]piridina, piperazina, pirazina, morfolina, tiomorfolina, imidazole, imidazolidino-2,4-diona, 1,3-di-hidrobenzimidazol-2-ona, indole, tiazole, benzotiazole, tiadiazole, tiofeno, tetra-hidrotiofeno-1,1-dióxido, diazepina, triazole, guanidina, diazabiciclo[2.2.1]heptano, 2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptano, 2,3,4,4a,9,9a-hexa-hidro-lH-p-carbolina, oxirano, oxetano, tetra-hidropirano, dioxano, lactonas, aziridina, azetidina, piperidina, lactamas e também podem abranger heteroarilos. Outros exemplos ilustrativos de heteroarilos incluem, sem a eles se limitarem, furano, pirrole, piridina, pirimidina, imidazole, benzimidazole e triazole.

Exemplos ilustrativos de anéis azaciclicos incluem, sem a eles se limitarem, anéis aziridina, azetidina, imidazole, imidazolina, pirrole, pirrolina, pirrolidina, pirazole, pirazolina, oxazole, oxazolina, isoxazole, isoxazolina, tiazole, tiazolina, piridina, di-hidropiridina, tetra-hidropiridina, piperidina, piperazina, pirimidina, piridazina, pirazina, morfolina, tiomorfolina, homopiperazina, homomorfolina, homotiomorfolina, benzimidazole e indole, opcionalmente substituídos.

Substituintes preferidos quando estão presentes num anel azaciclico ou heterocíclico incluem halo, =0, acilo, aroilo, carbamoilo ou um anel carbocíclico ou heterocíclico opcionalmente substituído; ou alquilo Ci-6, alcenilo C2-6, alcinilo C2-6, opcionalmente substituídos, ou suas heteroformas; ou -OR5, -NR5R6, -C00R5 ou -C(0)NR5R6, onde cada R5 e R6 é, independentemente, H ou alquilo C1-C6, arilo ou arilalquilo, ou uma sua heteroforma; e onde, em cada -NR5R6, R5 e R6, juntamente com N, podem formar um anel com 5-6 membros opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S, como membro do anel.

Substituintes particularmente preferidos quando estão presentes num anel azaciclico aromático incluem um ou mais halo ou grupos alquilo Ci-e opcionalmente substituídos, em que os referidos substituintes opcionais são selecionados no grupo que consiste em halo, hidroxi e oxo (=0).

Substituintes preferidos quando estão presentes num anel arilo ou heteroarilo incluem alquilo Ci-6, alcenilo C2-6, alcinilo C2-6 opcionalmente substituídos; halo, -CN, -CF3, -OCF3, N02; ou -OR5, -NR5R6, -C00R5 ou -C(0)NR5R6, -S02NR5R6, -NC(0)R5, onde cada R5 e R6 é, independentemente, H ou alquilo C1-C6, arilo ou arilalquilo ou uma sua heteroforma; e onde em cada -NR5R6, R5 e R6, juntamente com N, podem formar um anel com 5-7 membros opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional, selecionado entre N, 0 e S, como membro do anel.

Como aqui usado, o termo "substituinte inorgânico" refere-se a substituintes que não contêm carbono ou contêm carbono ligado a elementos diferentes de hidrogénio (por exemplo, carbono elementar, monóxido de carbono, dióxido de carbono e carbonato). Exemplos de substituintes inorgânicos incluem, sem a eles se limitarem, nitro, halogéneo, sulfonilos, sulfinilos, fosfatos, etc.

Os termos "tratar", "tratamento" e "efeito terapêutico" como aqui usados referem-se a reduzir ou interromper uma taxa de proliferação celular (por exemplo, abrandar ou cessar o crescimento tumoral) ou reduzir o número de células cancerosas em proliferação (por exemplo, remover parte ou a totalidade de um tumor). Estes termos também são aplicáveis à redução de uma concentração de um microrganismo num sistema (isto é, célula, tecido ou indivíduo) infetado com um microrganismo, à redução da taxa de propagação microbiana, à redução do número de sintomas ou de um efeito de um sintoma associado à infeção microbiana e/ou à remoção de quantidades detetáveis do micróbio do sistema. Exemplos de microrganismos incluem, sem a eles se limitarem, vírus, bactérias e fungos.

Como aqui usado, o termo "agente quimioterapêutico" refere-se a um agente terapêutico que pode ser usado para tratar ou melhorar um distúrbio de proliferação celular, tais como tumores ou cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem, sem a eles se limitarem, um agente antineoplásico, um agente alquilante, um alcaloide vegetal, um agente antimicrobiano, uma sulfonamida, um agente antiviral, um agente de platina e outros agentes anticancerosos conhecidos na técnica. Exemplos particulares de agentes quimioterapêuticos incluem, sem a eles se limitarem, cisplatina, carboplatina, bussulfano, metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, ciclofosfamida, mefalano, vincristina, vinblastina, clorambucilo, paclitaxel, gencitabina e outros conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Goodman & Gilman's, The Pharmacological Basis of Therapeutics (9a Ed) (Goodman, et al., eds.) (McGraw-Hill) (1996) e 1999 Physician's Desk Reference (1998)).

Como aqui usado, o termo "apoptose" refere-se a uma autodestruição ou programa de suicidio intrínsecos da célula. Em resposta a um estimulo desencadeador, as células sofrem uma cascata de eventos que incluem contração celular, empolamento das membranas celulares e condensação e fragmentação cromáticas. Estes acontecimentos culminam em conversão das células em agrupamentos de partículas ligadas a membranas (corpos apoptóticos), que são em seguida "engolidos" por macrófagos.

Como aqui usado, o termo "indivíduo" refere-se a um indivíduo humano ou animal. Em certas formas de realização preferidas, o indivíduo é humano.

Descrição da Invenção A presente invenção refere-se a compostos tendo Fórmulas (VII) e (VIII) e seus sais, ésteres e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis. A invenção proporciona análogos de quinolona oralmente ativos que podem inibir proliferação celular e/ou induzir apoptose celular. A presente invenção também proporciona métodos para preparar esses análogos de quinolona oralmente ativos e métodos para tratar distúrbios de proliferação celular através da sua administração.

Os compostos da presente invenção podem ou não interagir com regiões de ADN que podem formar quadruplexes.

Os compostos da presente invenção tendo Fórmulas (VII) e (VIII) são reproduzidos em baixo:

onde A, V, Y, Ζ, U1, U2, X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, R4r RΊ, R8, Q, m, η e ρ são definidos como descrito aqui em mais detalhe.

Os compostos da presente invenção podem ser quirais. Como aqui usado, um composto quiral é um composto que é diferente da sua imagem no espelho e tem um enantiómero. Além disso, os compostos podem ser racémicos ou um enantiómero ou estereoisómero isolado. São bem conhecidos dos peritos na especialidade métodos de sintese de compostos quirais e de resolução de uma mistura racémica de enantiómeros. Ver, por exemplo, March, "Advanced Organic Chemistry", John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque, (1985).

Os compostos da presente invenção podem ser testados usando ensaios de triagem como os aqui descritos.

Os compostos descritos aqui podem interagir com regiões de ácidos nucleicos que podem formar quadruplexes. Como as regiões de ADN que podem formar quadruplexes são reguladoras de processos biológicos, tal como transcrição de oncogenes, podem utilizar-se moduladores de atividade biológica de quadruplex como medicamentos para cancro. As moléculas que interagem com regiões de ADN que podem formar quadruplexes podem exercer um efeito terapêutico sobre certos distúrbios de proliferação celular e condições relacionadas. Particularmente, a expressão de oncogenes anormalmente aumentada pode causar distúrbios de proliferação celular e as estruturas em quadruplex tipicamente regulam a expressão de oncogenes no sentido de a diminuir (infrarregulam). Exemplos de oncogenes incluem, sem a eles se limitarem, MYC, HIF, VEGF, ABL, TGF, PDGFA, MYB, SPARC, HUMTEL, HER, VAV, RET, H-RAS, EGF, SRC, BCL1, BCL2, DHFR, HMGA e outros oncogenes conhecidos pelos peritos na especialidade. Além disso, os compostos descritos aqui podem induzir morte celular (por exemplo, apoptose) e não interagir com regiões de ADN que podem formar quadruplexes.

Moléculas que se ligam a regiões de ADN que podem formar quadruplexes podem exercer um efeito biológico segundo diferentes mecanismos que incluem, por exemplo, estabilizar uma estrutura em quadruplex nativa, inibir a conversão de um quadruplex nativo em ADN duplex por bloqueio da clivagem de cadeias, e estabilizar uma estrutura em quadruplex nativa tendo uma substituição nucleotidica desestabilizadora de quadruplex e outras interações especificas da sequência. Portanto, compostos que se ligam a regiões de ADN que podem formar quadruplexes descritos aqui podem ser administrados a células, tecidos ou organismos com a finalidade de infrarregular a transcrição de oncogenes e dessa forma tratar distúrbios de proliferação celular.

Pode determinar-se se a atividade biológica de ADN nativo que pode formar quadruplexes é modulada numa célula, tecido ou organismo por monitorização da atividade biológica do quadruplex. Regiões que formam quadruplexes com atividade biológica de ADN podem ser monitorizadas em células, tecidos ou organismos, por exemplo, por deteção de uma redução ou aumento de transcrição génica em resposta ao contato do ADN que forma quadruplexes com uma molécula. A transcrição pode ser detetada por observação direta dos transcritos de ARN ou por observação dos polipéptidos traduzidos a partir dos transcritos, que são métodos bem conhecidos na especialidade.

Podem utilizar-se moléculas que interagem com ADN que forma quadruplexes e ácidos nucleicos que formam quadruplexes para tratar muitos distúrbios de proliferação celular. Distúrbios de proliferação celular incluem, por exemplo, cancros colorretais e distúrbios neoplásicos hematopoiéticos (isto é, doenças que envolvem células hiperplásicas/neoplásicas de origem hematopoiética como as que surgem de linhagens mieloides, linfoides ou eritroides ou suas células precursoras). As doenças podem surgir a partir de leucemias agudas pouco diferenciadas, por exemplo, leucemia eritroblástica e leucemia megacarioblástica aguda. Outros distúrbios mieloides incluem, sem a eles se limitarem, leucemia promieloide aguda (LPMA), leucemia mieloide aguda (LMA) e leucemia mieloide crónica (LMC) (Vaickus, Crit. Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-297 (1991)). Malignidades linfoides incluem, sem a elas se limitarem, leucemia linfoblástica aguda (LLA) , que inclui LLA de linhagem B e LLA de linhagem T, leucemia linfocitica crónica (LLC), leucemia prolinfocitica (LLP), leucemia de células pilosas (LCP) e macroglobulinemia de Waldenstrom (MW). Outras formas de linfomas malignos incluem, sem a elas se limitarem, linfoma não-Hodgkin e suas variantes, linfomas de células T periféricas, leucemia/linfoma de células T adultas (LCTA), linfoma cutâneo de células T (LCCT), leucemia de grandes linfócitos granulares (LGLG), doença de Hodgkin e doença de Reed-Sternberg. Distúrbios de proliferação celular também incluem cancro colorretal, cancros da mama, pulmão, figado, pâncreas, nódulos linfáticos, cólon, próstata, cérebro, cabeça e pescoço, pele, fígado, rim e coração. Compostos que interagem com regiões de ADN que podem formar quadruplexes também podem ser utilizados para atingir processos e condições relacionados com cancro, tal como angiogénese aumentada, inibindo a angiogénese num indivíduo.

Também aqui se divulga um método para reduzir a proliferação celular ou para tratar ou aliviar distúrbios de proliferação celular, compreendendo fazer contatar um sistema tendo um ADN nativo capaz de formar uma região quadruplex com um composto tendo qualquer uma das fórmulas acima. 0 sistema pode ser um grupo de células ou um ou mais tecidos. 0 sistema pode ser um indivíduo com necessidade de um tratamento de um distúrbio de proliferação celular (por exemplo, um mamífero tal como um ratinho, rato, macaco ou humano) . Também aqui se divulga um método para tratar cancro colorretal por administração de um composto que interage com uma região que forma quadruplexes c-MYC a um indivíduo que dele necessite, dessa forma reduzindo a proliferação de células de cancro colorretal. Além disso, é aqui divulgado um método para inibir angiogénese e, opcionalmente, tratar um cancro associado a angiogénese, compreendendo administrar um composto que interage com uma região que forma quadruplexes do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) a um indivíduo que dele necessite, dessa forma reduzindo a angiogénese e opcionalmente tratando um cancro associado a angiogénese.

Compostos que interagem com regiões que formam quadruplexes de ADN também podem ser usados para reduzir uma infeção microbiana, tal como uma infeção viral. Os retrovirus oferecem um manancial de alvos potenciais para medicamentos que visam o quadruplex G. Estruturas em quadruplex G têm sido apontadas como elementos funcionais em pelo menos duas estruturas secundárias formadas por ARN ou ADN viral no HIV, a estrutura de ligação dimérica (DLS) e o flap central do ADN (CDF) . Além disso, os aptâmeros de ADN que são capazes de adotar estruturas em quadruplex intermoleculares ou intramoleculares são capazes de inibir replicação virai. Num exemplo, os aptâmeros de ADN são capazes de inibir replicação virai visando a glicoproteína do envelope (supostamente). Num outro exemplo, os aptâmeros de ADN inibem a replicação virai visando a integrase do HIV respetivamente, sugerindo o envolvimento de estruturas em quadruplex nativas na interação com a enzima integrase.

As estruturas de ligação dimérica, que são comuns a todos os retrovirus, servem para ligar duas cópias do genoma virai através de uma interação não covalente entre as duas extremidades 5' das duas sequências do ARN virai. 0 dímero genómico está associado de modo estável à proteína gag na partícula virai madura. No caso do HIV, a origem desta ligação não covalente remonta a uma sequência de 98 pares de bases contendo várias séries de pelo menos duas guaninas consecutivas (por exemplo, a 3' para a formação de dímeros de ARN in vitro). Uma observação de dependência de catiões (potássio) para a formação e estabilidade do dímero in vitro, juntamente com a ausência de dimerização eficaz de uma sequência anti-sentido, revelou que a estrutura de ligação mais provável era um quadruplex G intermolecular.

Antes da integração no genoma do hospedeiro, o ADN viral transcrito inversamente forma um complexo de pré-integração (PIC) com pelo menos duas proteínas virais importantes, integrase e transcritase inversa, que é subsequentemente transportado para o núcleo. 0 flap central do ADN (CDF) refere-se à cauda em cadeia simples de 99 bases de comprimento da cadeia +, que ocorre próximo do centro do ADN virai em dupla hélice, que se sabe desempenhar um papel na importação nuclear do PIC. Demonstrou-se que miméticos oligonucleotídicos do CDF formam estruturas em quadruplex G intermoleculares em sistemas isentos de células.

Por conseguinte, compostos que reconhecem regiões que formam quadruplexes podem ser usados para estabilizar a estrutura de ligação dimérica e assim impedir o desacoplamento das duas cadeias de ARN. Além disso, ao ligar-se à estrutura em quadruplex formada pelo CDF, podem ser interrompidos acontecimentos de reconhecimento e/ou ligação de proteínas para transporte nuclear do PIC. Em qualquer caso, pode haver uma vantagem considerável sobre outros medicamentos antivirais. Os atuais regimes terapêuticos antirretrovirais de alta eficácia (HAART, do inglês "Highly Active Anti-Retroviral Therapeutic") baseiam-se no uso de combinações de fármacos orientados para a protease do HIV e a integrase do HIV. A exigência para regimes multifármacos é minimizar o aparecimento de resistência que normalmente se desenvolve rapidamente quando se usam agentes isolados. A causa dessa resistência rápida é a inconstância da enzima transcritase inversa que faz uma mutação aproximadamente uma vez em cada 10 000 pares de bases. Uma vantagem de visar estruturas virais em quadruplex em vez de visar proteínas, é que o desenvolvimento de resistência é lento ou é impossível. Uma mutação pontual do quadruplex alvo pode comprometer a integridade da estrutura em quadruplex e resultar numa cópia não funcional do vírus. Um único agente terapêutico baseado neste conceito pode substituir os regimes de múltiplos fármacos atualmente usados, com os benefícios concomitantes de custos reduzidos e da eliminação de interações fármaco/fármaco prejudiciais.

Divulga-se aqui um método para reduzir uma concentração microbiana num sistema, compreendendo fazer contatar um sistema tendo uma região que forma quadruplexes de ADN nativos, com um composto tendo qualquer uma das fórmulas acima. 0 sistema pode ser uma ou mais células ou tecidos. Exemplos de concentrações microbianas incluem, sem a elas se limitarem, concentrações virais, bacterianas ou fúngicas. 0 sistema pode ser um indivíduo com necessidade de um tratamento para uma infeção virai (por exemplo, um mamífero tal como um ratinho, rato, macaco ou humano). Exemplos de infeções virais incluem infeções por um vírus da hepatite (por exemplo, hepatite B ou C), vírus da imunodeficiência humana (HIV), rinovírus, vírus do herpes-zóster (VZV), vírus do herpes simples (por exemplo, HSV-1 ou HSV-2), citomegalovírus (CMV), vírus vaccinia, vírus influenza, vírus da encefalite, hantavirus, arbovirus, vírus do Nilo Ocidental, vírus do papiloma humano (HPV), vírus de Epstein-Barr e vírus sincicial respiratório. É também aqui divulgado um método para tratar infeção por HIV por administração de um composto tendo qualquer uma das fórmulas acima a indivíduo que dele necessite, dessa forma reduzindo a infeção por HIV.

Identificação de compostos que se podem ligar a regiões que formam quadruplexes de ADN

Os compostos descritos aqui podem ligar-se a regiões que formam quadruplexes de ADN onde uma atividade biológica dessa região, geralmente expressa como um "sinal", produzida num sistema que contém o composto é diferente do sinal produzido num sistema que não contém o composto. Embora se possam avaliar sinais de fundo de cada vez que uma nova molécula é testada no ensaio, não é necessário detetar o sinal de fundo de cada vez que uma nova molécula é analisada.

Para além de determinar se uma molécula de teste ou um ácido nucleico de teste dá origem a um sinal diferente, pode quantificar-se a afinidade da interação entre o ácido nucleico e o composto. Os valores limite de CI50, Kd ou Ki podem ser comparados com os valores de CI50 ou Kd medidos para cada interação e, assim, identifica-se uma molécula de teste como uma molécula que interage com quadruplexes ou um ácido nucleico de teste como um ácido nucleico que forma quadruplexes. Por exemplo, são frequentemente utilizados valores limite de CI50 ou Kd de 10 μΜ ou menos, 1 μΜ ou menos e 100 nM ou menos. Num outro exemplo, podem ser utilizados valores limite de 10 nM ou menos, 1 nM ou menos, 100 pM ou menos e 10 pM ou menos, para identificar moléculas que interagem com quadruplexes e ácidos nucleicos que formam quadruplexes.

Existem muitos ensaios disponíveis para identificar compostos que possuem afinidade para com regiões que formam quadruplexes de ADN. Nalguns desses ensaios, a atividade biológica é a ligação do ácido nucleico quadruplex a um composto e mede-se a ligação sob a forma de um sinal. Noutros ensaios, a atividade biológica é uma função de paragem da polimerase de um quadruplex e mede-se o grau de paragem sob a forma de uma diminuição num sinal. Em certos ensaios, a atividade biológica é transcrição e os níveis de transcrição podem ser quantificados sob a forma de um sinal. Num outro ensaio, a atividade biológica é morte celular e quantifica-se o número de células que sofre morte celular. Um outro ensaio monitoriza as taxas de proliferação de células cancerosas. Exemplos de ensaios são ensaios de ligação de fluorescência, ensaios de desvio de mobilidade em gel (ver, por exemplo, Jin & Pike, Mol. Endocrinol. (1996) 10:196-205), ensaios de paragem de polimerase, ensaios de repórter de transcrição, ensaios de proliferação de células cancerosas e ensaios de apoptose (ver, por exemplo, Amersham Biosciences (Piscataway, New Jersey)) e descrevem-se formas de realização destes ensaios no Exemplo 8 adiante. Além disso, podem utilizar-se ensaios de topoisomerase para determinar se as moléculas que interagem com quadruplexes têm atividade na via da topoisomerase (ver, por exemplo, TopoGEN, Inc. (Columbus, Ohio)).

Formulação de compostos

Como aqui usada, a expressão "seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis" inclui, sem a eles se limitarem, os sais carboxilato, os sais de adição de aminoácido, e os ésteres dos compostos, bem como as suas formas zwiteriónicas, que são conhecidos dos peritos na especialidade como adequados para uso em humanos e animais. (Ver, por exemplo, Gerge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts, "J. Pharm. Sei. (1977) 66:1-19.)

Pode preparar-se qualquer formulação adequada dos compostos descritos aqui. Nos casos em que os compostos são suficientemente básicos ou ácidos para formar sais de ácido ou de base não tóxicos estáveis, pode ser apropriada a administração dos compostos na forma de sais. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são sais de adição de ácidos orgânicos formados com ácidos que formam um anião fisiologicamente aceitável, por exemplo, tosilato, metanossulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, α-cetoglutarato e a-glicerofosfato. Também podem ser formados sais inorgânicos adequados, incluindo sais cloridrato, sulfato, nitrato, bicarbonato e carbonato. Obtêm-se sais farmaceuticamente aceitáveis usando procedimentos padrão bem conhecidos na técnica. Por exemplo, podem obter-se sais farmaceuticamente aceitáveis por reação de um composto suficientemente básico, tal como uma amina, com um ácido adequado dando um anião fisiologicamente aceitável. Também são produzidos sais de metal alcalino (por exemplo, sódio, potássio ou litio) ou de metal alcalino-terroso (por exemplo, cálcio) de ácidos carboxilicos.

Um composto pode ser formulado sob a forma de uma composição farmacêutica e administrado a um hospedeiro mamifero com necessidade desse tratamento. Numa forma de realização, o hospedeiro mamifero é humano. Pode usar-se qualquer via de administração adequada incluindo, mas sem a elas se limitar, as vias oral, parentérica, intravenosa, intramuscular, tópica e subcutânea.

Numa forma de realização, um composto destina-se a administração sistémica (por exemplo, oral) em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável, tal como um diluente inerte ou um transportador comestível assimilável. Podem estar contidos em cápsulas de gelatina dura ou mole, podem ser prensados em comprimidos ou incorporados diretamente na comida da dieta do paciente. Para administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser combinado com um ou mais excipientes e usado na forma de comprimidos para ingerir, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias e semelhantes. Estas composições e preparações devem conter pelo menos 0,1% do composto ativo. A percentagem das composições e preparações pode ser variada e pode estar, favoravelmente, entre cerca de 2 e cerca de 60% da massa de uma dada forma de dosagem unitária. A quantidade de composto ativo nestas composições terapeuticamente úteis é tal que se obtenha um nivel de dosagem eficaz.

Comprimidos, trociscos, pílulas, cápsulas e semelhantes também podem conter o seguinte: aglutinantes, tais como goma adragante, goma-arábica, amido de milho ou gelatina; excipientes tal como fosfato dicálcico; um agente desintegrante tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e semelhantes; um lubrificante tal como estearato de magnésio; e um agente adoçante tal como sacarose, frutose, lactose ou aspartame ou também se pode adicionar um agente aromatizante tal como hortelã, óleo de gaultéria ou aroma de cereja. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, pode conter, para além de materiais do tipo acima, um transportador líquido, tal como um óleo vegetal ou um polietilenoglicol. Podem estar presentes vários outros materiais, sob a forma de revestimentos ou para de outra maneira modificarem a forma física da forma de dosagem unitária sólida. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com gelatina, cera, goma-laca ou açúcar e semelhantes. Um xarope ou elixir pode conter o composto ativo, sacarose ou frutose como agente adoçante, metil- e propilparabenos como conservantes, um corante e aromatizante tal como aroma de cereja ou de laranja. Qualquer material usado na preparação de qualquer forma de dosagem unitária é farmaceuticamente aceitável e consideravelmente não tóxico nas quantidades utilizadas. Além disso, o composto ativo pode ser incorporado em preparações e dispositivos de liberação sustentada. 0 composto ativo também pode ser administrado por via intravenosa ou intraperitoneal, por infusão ou injeção. Podem preparar-se soluções do composto ativo ou dos seus sais numa solução tamponada, geralmente solução salina tamponada com fosfato, opcionalmente misturada com um tensioativo não tóxico. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos, triacetina e suas misturas e em óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, estas preparações contêm um conservante para impedir o crescimento de microrganismos. 0 composto é por vezes preparado sob a forma de uma formulação contendo uma polimatriz para essa administração (por exemplo, um lipossoma ou microssoma). Descrevem-se lipossomas por exemplo na Patente dos EUA N.° 5703055 (Feigner, et al.) e Gregoriadis, Liposome Technology, vols I a III (2a ed. 1993).

As formas de dosagem farmacêuticas adequadas para injeção ou infusão podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis ou pós estéreis, compreendendo o ingrediente ativo, que são adaptados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis para injeção ou infusão, opcionalmente encapsuladas em lipossomas. Em todos os casos, a forma de dosagem final deve ser estéril, fluida e estável nas condições de fabrico e armazenamento. O veiculo ou transportador líquido pode ser um solvente ou um meio de dispersão líquido compreendendo, por exemplo, água, etanol, um poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicóis líquidos e semelhantes), óleos vegetais, glicerilésteres não tóxicos e suas misturas adequadas. A fluidez correta pode ser mantida, por exemplo, pela formação de lipossomas, pela manutenção do tamanho de partícula no caso de dispersões ou pelo uso de tensioativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser efetuada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, tampões ou cloreto de sódio. Pode obter-se absorção prolongada das composições injetáveis, usando nas composições agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação do composto ativo, na quantidade requerida, no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme o necessário, seguida de esterilização por filtração. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são as técnicas de secagem a vácuo e de criodessecagem, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer outro ingrediente desejado presente nas soluções previamente esterilizadas por filtração.

Para administração tópica, os presentes compostos podem ser aplicados em forma líquida. Os compostos geralmente são administrados como composições ou formulações, em combinação com um transportador dermatologicamente aceitável, que pode ser um sólido ou um líquido. São conhecidos exemplos de composições dermatológicas úteis usadas para ministrar compostos na pele (ver, por exemplo, Jacquet, et al. (Patente dos EUA N.° 4608392), Geria (Patente dos EUA N.° 4992478), Smith, et al. (Patente dos EUA N.° 4559157) e Wortzman (Patente dos EUA N.° 4820508).

Os compostos podem ser formulados com um transportador sólido, que inclui sólidos finamente divididos, tal como talco, argila, celulose microcristalina, sílica, alumina e similares. Transportadores líquidos úteis incluem água, álcoois ou glicóis ou misturas de água-álcool/glicol, nas quais os presentes compostos podem ser dissolvidos ou dispersos em níveis eficazes, opcionalmente, com a ajuda de tensioativos não tóxicos. Podem adicionar-se adjuvantes, tais como fragrâncias e agentes antimicrobianos adicionais, para otimizar as propriedades para um determinado uso. As composições líquidas resultantes podem ser aplicadas a partir de pensos absorventes, usadas para impregnar ligaduras e outros curativos, ou pulverizadas sobre a área afetada usando pulverizadores do tipo bomba ou aerossóis. Também se podem usar espessantes, tais como polímeros sintéticos, ácidos gordos, sais e ésteres de ácidos gordos, álcoois gordos, celuloses modificadas ou materiais minerais modificados, com transportadores líquidos para formar pastas, géis, pomadas, sabões e semelhantes para espalhar, para aplicação direta na pele do utilizador.

Em geral, a concentração do composto numa composição líquida normalmente é de cerca de 0,1%, em massa, a cerca de 25%, em massa, por vezes de cerca de 0,5%, em massa, a cerca de 10%, em massa. A concentração numa composição semissólida ou sólida, tal como um gel ou um pó, geralmente é de 0,1%, em massa, a cerca de 5%, em massa, por vezes de cerca de 0,5%, em massa, a cerca de 2,5%, em massa. Pode preparar-se uma composição de composto sob a forma de uma forma de dosagem unitária preparada segundo técnicas convencionais conhecidas na indústria farmacêutica. Em termos gerais, essas técnicas incluem associar um composto a um ou mais transportadores e/ou excipientes farmacêuticos, em forma de líquido ou em forma de sólido finamente dividido, ou ambas, e em seguida conformar o produto se necessário.

Num exemplo particular, a composição farmacêutica compreende cerca de 2% m/m de um composto tendo a fórmula (I), cerca de 4% de manitol e cerca de 0,5% de sacarose. Em exemplos particulares, a formulação tem um pH de cerca de 3,5. Para formulações injetáveis, pode adicionar-se água para perfazer a massa final.

Pode formular-se a composição do composto em qualquer forma de dosagem, tal como comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis suaves, supositórios e enemas. As composições também podem ser formuladas sob a forma de suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem conter ainda substâncias que aumentam a viscosidade, incluindo por exemplo carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão também pode conter um ou mais estabilizantes. A quantidade do composto, ou de um seu sal ou derivado ativo, necessária para utilização no tratamento irá variar não somente com o sal específico escolhido, mas também com a via de administração, a natureza da condição a tratar e a idade e condição do paciente e, por fim, estará ao critério do médico ou clínico assistente.

Normalmente, determina-se uma dosagem de composto útil avaliando a sua atividade in vitro num sistema celular ou tissular, e/ou a sua atividade in vivo num sistema animal. Por exemplo, são conhecidos na técnica métodos para extrapolar uma dosagem eficaz em ratinhos e outros animais para humanos (ver, por exemplo, Patente dos EUA N.° 4938949). Estes sistemas podem ser usados para determinar a DL50 (a dose letal para 50% da população) e a DE50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) de um composto. A razão de doses entre um efeito tóxico e um efeito terapêutico é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão de DE50/DL50. A dosagem do composto encontra-se em geral numa gama de concentrações em circulação para as quais a DE50 está associada a pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa gama, dependendo da forma de dosagem usada e da via de administração utilizada. Para quaisquer compostos usados nos métodos aqui descritos, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Por vezes, uma dose é formulada para atingir uma gama de concentração no plasma circulante que abrange a CI50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge metade da inibição máxima dos sintomas) determinada em ensaios in vitro, visto que essa informação é normalmente usada para determinar de forma mais precisa as doses úteis em humanos. Os niveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta resolução.

Um outro exemplo de determinação da dose eficaz para um indivíduo é a capacidade de avaliar diretamente os níveis de composto "livre" e "ligado" no soro do indivíduo testado. Esses ensaios podem utilizar miméticos de anticorpos e/ou "biossensores" gerados por técnicas de impressão molecular. 0 composto é usado como molde, ou "molécula de impressão", para organizar espacialmente monómeros polimerizáveis antes da sua polimerização com reagentes catalíticos. A subsequente remoção da molécula impressa deixa uma matriz polimérica que contém uma "imagem negativa" repetida do composto e é capaz de religar seletivamente a molécula nas condições biológicas do ensaio (ver, por exemplo, Ansell, et al., Current Opinion in Biotechnology (1996) 7:89-94 e em Shea, Trends in Polymer Science (1994) 2:166-173). Estas matrizes de afinidade "impressas" são passíveis de ensaios da ligação de ligandos, por meio dos quais o componente anticorpo monoclonal imobilizado é substituído por uma matriz adequadamente impressa (ver, por exemplo, Vlatakis, et al., Nature (1993) 361:645-647). Através do uso de marcação com isótopos, pode monitorizar-se facilmente a concentração "livre" de composto e usar-se em cálculos de CI50. Essas matrizes de afinidade "impressas" também podem ser concebidas para incluir grupos fluorescentes cujas propriedades emissoras de fotões mudam de forma mensurável com a ligação seletiva e local do composto. Estas mudanças podem ser facilmente avaliadas em tempo real usando dispositivos de fibra ótica apropriados, permitindo que por sua vez a dose num indivíduo testado seja rapidamente otimizada com base na sua CI50 individual. Um exemplo de um tal "biossensor" está discutido em Kriz, et al. , Analytical Chemistry (1995) 67:2142-2144.

Nalgumas formas de realização, os compostos e composições proporcionados demonstram biodisponibilidade oral num indivíduo ratinho ou humano. Em formas de realização particulares, a presente invenção proporciona composições compreendendo o composto de Fórmula (VII) ou (VIII) que são pelo menos 15% biodisponíveis por via oral num indivíduo ratinho ou humano. Noutras formas de realização, as composições são pelo menos 20%, 30%, 40% ou 50% biodisponíveis por via oral num indivíduo ratinho ou humano. Numa forma de realização preferida, o indivíduo é humano. Sem pretender estar limitado pela teoria, crê-se que a biodisponibilidade oral demonstrada pelos compostos da presente invenção se pode dever, pelo menos em parte, ao estado de protonação da porção básica presente no grupo representado como -W, -L-W ou -L-N(R)-W°.

Compostos da presente invenção ilustrativos podem ser selecionados de modo a que o ácido conjugado da porção básica presente no grupo representado como -W, -L-W ou -L-N(R)-W° tenha um pKa entre cerca de 7 e 9, para que o grupo esteja cerca de 50% protonado numa gama de pH de cerca de 7,0 a cerca de 9,0. Nalgumas formas de realização, o anel homopiperazina nas Fórmulas (VII) e (VIII) pode servir como porção básica, como se descreve acima. A presente invenção proporciona ainda composições farmacêuticas, em forma de dosagem unitária, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um composto de Fórmula (VII) ou de Fórmula (VIII).

Em formas de realização específicas, a invenção proporciona uma composição farmacêutica, em forma de dosagem unitária, compreendendo um composto de Fórmula (VII) ou de Fórmula (VIII), em que uma administração oral única da forma de dosagem a um indivíduo proporciona uma AUC (8 h) de pelo menos 1000 ng/mL*h, preferivelmente maior do que 2000 ng/mL*h, mais preferivelmente maior do que 10 000 ng/mL*h. A biodisponibilidade (F) é uma medida da extensão em que uma dose de fármaco administrada atinge a circulação sistémica ou o local de ação desejado. A biodisponibilidade depende tanto da taxa de absorção como da extensão em que o fármaco é eliminado ou metabolizado antes de atingir a circulação sistémica. Por exemplo, um fármaco administrado oralmente passa pelo fígado antes de atingir a circulação sistémica e pode estar sujeito a metabolismo de primeira passagem no fígado ou a excreção biliar.

Para certas indicações terapêuticas, a dosagem oral é a via preferida de administração, devido à sua segurança, conveniência e vantagens económicas. 0 desenvolvimento de compostos altamente biodisponiveis por via oral é normalmente uma consideração importante no desenvolvimento de moléculas bioativas como agentes terapêuticos.

Uma biodisponibilidade por via oral fraca pode resultar numa exposição variável ao fármaco ativo e pode conduzir a falta de eficácia ou sobre-exposição a um agente particular. Por exemplo, a variabilidade polimórfica em enzimas de metabolização de fármacos, tais como as citocromo P450 ou metiltransferases, ou coadministração com fármacos que inibam essas enzimas, pode reduzir a depuração de primeira passagem e aumentar a exposição ao fármaco para niveis indesejados ou tóxicos. A absorção, que descreve a taxa e a extensão em que o fármaco deixa o seu local de administração, é influenciada por inúmeras variáveis incluindo propriedades fisico-quimicas do fármaco que afetam o transporte através das membranas e a forma de dosagem selecionada. Para os compostos administrados oralmente, a absorção ocorre predominantemente no trato gastrointestinal (GI) e é influenciada por fatores que incluem a área superficial disponível para absorção, a extensão do fluxo sanguíneo, o estado físico do fármaco e a concentração local do fármaco no sítio de absorção. Em particular, a solubilidade em água vai influenciar tanto a taxa como o sítio de absorção. Fármacos de baixa solubilidade apresentam normalmente biodisponibilidade fraca ou absorção irregular, em que a extensão da absorção é influenciada por fatores como o nível de dose, o estado de alimentação do paciente e a forma de dosagem. Em formas de dosagem sólidas, a taxa de dissolução pode ser o fator limitante na determinação da absorção. A solubilidade do fármaco é afetada pelo gradiente de pH no trato GI. Por exemplo, fármacos básicos que são solúveis no ambiente de pH baixo do estômago (pH ~1,2) podem tornar-se menos solúveis quando o fármaco atinge o ambiente de pH superior do intestino delgado (pH 5 a 7, tipicamente cerca de 6,5), dependendo do pKa do fármaco. Embora a forma não ionizada de um fármaco seja mais rapidamente absorvida que a forma ionizada num local particular do trato GI, a taxa global de absorção pelo intestino é maior do que pelo estômago, independentemente do estado de ionização, devido à maior área superficial disponível (Ver, por exemplo, Goodman & Gilman's, The Pharmacological Basis of Therapeutics (9a Ed) (Goodman, et al., eds.) (McGraw-Hill) (1996)).

Muitos fármacos são constituídos por ácidos fracos ou bases fracas que estão presentes em solução num equilíbrio entre as suas formas ionizada (i.e., carregada) e não ionizada. A extensão da ionização é determinada pelo pKa do fármaco, bem como pelo pH da solução. 0 pH influencia a taxa de dissociação tanto dos ácidos fracos como das bases fracas. Os ácidos fracos dissociam-se, tornando-se ionizados, num ambiente alcalino, enquanto as bases fracas se tornam ionizadas num ambiente ácido. A percentagem de ionização pode ser calculada usando a Eq. 1 para ácidos HA e a Eq. 2 para ácidos BH+: % de ionização = 100/(1 + io(pKa-pH)) (Eq. 1) % de ionização = 100/(1 + 10(pH-pKa>) (Eq. 2)

Quando o pH iguala o pKa, o composto estará 50% ionizado, i.e., a razão de fármaco ionizado para não ionizado será de 50:50. Na equação de Henderson-Hasselbalch, pKa = pH quando o log[base conjugada]/[ácido] = 1. Um aumento de uma unidade de pH em relação ao pKa (i.e., um aumento na alcalinidade da solução) provoca uma diminuição na percentagem de ionização do ácido BH+ para apenas 9,1% e faz com que um ácido HA passe a estar 90,9% na forma da base conjugada ionizada. Um aumento de duas unidades de pH fundamentalmente altera um ácido BH+ para a forma da base conjugada não iónica (0,99%), enquanto o ácido HA se torna quase completamente ionizado (99%). Verifica-se o oposto quando a solução se torna mais ácida em relação ao valor do pKa do fármaco (Ver e.g., Block, em Textbook of Organic Medicinal and Pharmaceutical Chemistry (10a Ed.) (Delgado & Reniers, eds.) (Lippincott-Raven) (1998)).

Num aspeto, seleciona-se um composto da composição da presente invenção ativo por via oral para que os compostos estejam aproximadamente 50% ionizados numa gama de pH de cerca de 7 a cerca de 9. Estes compostos podem demonstrar biodisponibilidade e eficácia por via oral ótimas.

Em certas formas de realização, os grupos preferidos para -W, -L-W e -L-N (R) -W° são os que apresentam uma constante de dissociação, pKa, em soluções aquosas de dimensão tal que pelo menos uma parte da amina esteja ionizada a valores de pH fisiológicos, e.g., a valores de pH entre cerca de 4 e cerca de 9. Podem ser especialmente adequadas aminas que apresentam um pKa entre cerca de 6 e cerca de 10, preferivelmente entre cerca de 7 e cerca de 9.

Farmacocinética

Podem determinar-se os parâmetros farmacocinéticos com base na quantidade de um composto em amostras colhidas em momentos diferentes. Os tipos de parâmetros farmacocinéticos e a metodologia para determinar os parâmetros podem ser selecionados adequadamente por uma pessoa competente na matéria. Exemplos de parâmetros farmacocinéticos que se podem avaliar incluem, sem a eles se limitarem, concentração máxima (pico) de fármaco no plasma (Cmax) (expressa normalmente em ng/ml); o momento em que ocorre concentração máxima de fármaco no plasma (momento do pico, Tmax) e a área sob a curva de concentração no fluido (e.g., plasma) em função do tempo (AUC) . Uma pessoa competente na matéria consegue calcular esses parâmetros (e.g., Mei et al., AAPS Journal (2006) 8(3) artigo 58 (endereço http www.aapsj.org)).

Pode avaliar-se a biodisponibilidade por via oral medindo a "área sob a curva" (AUC) ou Cmax, parâmetros bem conhecidos na técnica. Determina-se a AUC representando a concentração de fármaco no soro ou no plasma nas ordenadas (eixo dos Y) em função do tempo nas abcissas (eixo dos X) . Geralmente, os valores da AUC representam vários valores obtidos a partir de todos os indivíduos numa população de teste e são, portanto, valores médios calculados em toda a população de teste. A AUCo-8 (ng.h/ml) é a área sob a curva da concentração no plasma versus tempo desde o momento zero até às 8 horas e pode ser calculada usando a regra do trapézio linear segundo Gibaldi, M. e Perrier, D. Pharmacokinetics, Segunda Edição, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque (1982) . A AUCo-inf é a área sob a curva da concentração no plasma versus tempo extrapolada deste o momento zero até ao infinito (expressa em ng.h/ml).

Podem determinar-se outros parâmetros farmacocinéticos. Por exemplo, T1/2 é o tempo de semivida terminal (expresso em h) ; Vdss é o volume de distribuição no estado estacionário (expresso em L/kg) e Cls é a depuração sistémica (expressa em L/h/kg) .

Dosagens

Normalmente, determina-se uma dosagem de composto útil avaliando a sua atividade in vitro, num sistema celular ou tissular, e/ou a sua atividade in vivo, num sistema animal. Por exemplo, são conhecidos na técnica métodos para extrapolar uma dosagem eficaz em ratinhos e outros animais para humanos (ver, por exemplo, Patente dos EUA N.° 4938949). Estes sistemas podem ser usados para determinar a DL50 (a dose letal para 50% da população) e a DE50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) de um composto. A razão de doses entre um efeito tóxico e um efeito terapêutico é o indice terapêutico e pode ser expresso como a razão DE50/DL50. A dosagem do composto encontra-se em geral numa gama de concentrações em circulação para as quais a DE50 está associada a pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa gama, dependendo da forma de dosagem usada e da via de administração utilizada. Para quaisquer compostos usados nos métodos aqui descritos, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Por vezes, uma dose é formulada para atingir uma gama de concentrações no plasma circulante que abrange a CI50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge metade da inibição máxima dos sintomas) determinada em ensaios in vitro, visto que essa informação é normalmente usada para determinar de forma mais precisa as doses úteis em humanos. Os niveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia liquida de alta resolução.

Um outro exemplo de determinação da dose eficaz para um indivíduo é a capacidade de avaliar diretamente os niveis de composto "livre" e "ligado" no soro do indivíduo testado. Esses ensaios podem utilizar miméticos de anticorpos e/ou "biossensores" gerados por técnicas de impressão molecular. O composto é usado como molde, ou "molécula de impressão", para organizar espacialmente monómeros polimerizáveis antes da sua polimerização com reagentes catalíticos. A subsequente remoção da molécula impressa deixa uma matriz polimérica que contém uma "imagem negativa" repetida do composto e é capaz de religar seletivamente a molécula nas condições biológicas do ensaio (ver, por exemplo, Ansell, et ai., Current Opinion in Biotechnology (1996) 7:89-94 e em Shea, Trends in Polymer

Science (1994) 2:166-173).

Estas matrizes de afinidade "impressas" são passíveis de ensaios de ligação de ligandos, por meio dos quais o componente anticorpo monoclonal imobilizado é substituído por uma matriz adequadamente impressa (ver, por exemplo, Vlatakis, et al., Nature (1993) 361:645-647). Através do uso de marcação com isótopos, pode monitorizar-se facilmente a concentração "livre" de composto e usar-se em cálculos de CI50. Essas matrizes de afinidade "impressas" também podem ser concebidas para incluir grupos fluorescentes cujas propriedades emissoras de fotões mudam de forma mensurável com a ligação seletiva e local do composto. Estas mudanças podem ser facilmente avaliadas em tempo real usando dispositivos de fibra ótica apropriados, permitindo que por sua vez a dose num indivíduo testado seja rapidamente otimizada com base na sua CI50 individual. Um exemplo de um tal "biossensor" está discutido em Kriz, et al., Analytical Chemistry (1995) 67:2142-2144.

Doses ilustrativas incluem quantidades em miligramas ou microgramas do composto por quilograma de massa do indivíduo ou da amostra, por exemplo, cerca de 1 micrograma por quilograma a cerca de 500 miligramas por quilograma, cerca de 100 microgramas por quilograma a cerca de 5 miligramas por quilograma ou cerca de 1 micrograma por quilograma a cerca de 50 microgramas por quilograma. Subentende-se que as doses apropriadas de uma molécula pequena dependem da potência da molécula pequena em relação à expressão ou atividade a modular. Quando uma ou mais destas moléculas pequenas se destinam a ser administradas a um animal (por exemplo, um humano) para modular a expressão ou a atividade de um polipéptido ou ácido nucleico descrito aqui, um médico, veterinário ou investigador pode, por exemplo, prescrever inicialmente uma dose relativamente baixa, aumentando em seguida a dose até que seja obtida uma resposta apropriada. Além disso, subentende-se que o nível de dose específico para qualquer indivíduo animal particular vai depender de uma variedade de fatores que incluem a atividade do composto específico usado, a idade, a massa corporal, o estado geral de saúde, o género e a dieta do indivíduo, o momento de administração, a via de administração, a taxa de excreção, qualquer combinação de fármacos e o grau de expressão ou atividade a modular.

Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar, a invenção.

Exemplo de Referência 1

Adicionou-se N-metilpiperazina (3,10 mL, 27,95 mmol) a uma suspensão espessa de cloroéster (5,00 g, 13,94 mmol) em ACN (50 mL) e aqueceu-se a mistura em refluxo durante a noite. Arrefeceu-se a mistura reacíonal para a temperatura ambiente (ta) e recolheu-se o precipitado por filtração para dar o produto desejado sob forma de um sólido acastanhado (4,7 g, 80%). !H RMN (CDCls) δ: 9,47 (d, 1H) , 8,62 (d, 1H) , 7,74 (dd, 1H) , 7,51 (m, 1H) , 7,43 (m, 1H) , 6,89 (d, 1H) , 4,50 (q, 2H) ,

3,85 (t, 4H) , 2,62 (t, 4H) , 2,40 (t, 4H) , 1,49 (t, 3H) . LCMS (ES): m/z 423 [M+l]+.

Exemplo de Referência 2

Adicionou-se AICI3 (150 mg, 1,12 mmol) a uma solução de éster (150 mg, 0,34 mmol) e 2-metoxietilamina (0,50 mL, 5,80 mmol) em DCM (10 mL) . Agitou-se a mistura reacíonal à ta durante a noite. Diluiu-se a mistura reacíonal com DCM (100 mL) e NaOH 6 N (25 mL) e agitou-se durante 10 min.

Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x50 mL) , salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2SC>4.

Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em ACN para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco. LCMS (ES): m/z 470 [M+l]+.

Exemplo de Referência 3

Adicionou-se AICI3 (475 mg, 7,31 mmol) a uma solução de éster (1,45 mg, 3,44 mmol), piridin-2-ilmetanamina (1,00 mL, 9,78 mmol) e DBU (1,50 mL, 10,03 mmol) em DCM (40 mL).

Agitou-se a mistura reacional à ta durante a noite. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (400 mL) e NaOH 1 N (200 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x100 mL), salmoura (100 mL) e secou-se sobre Na2S04. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em ACN para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (1,07 g, 64%). !H RMN (CDCI3) δ: 11,24 (t, 1H) , 9,50 (d, 1H) , 8,62 (m, 2H) , 7,77 (dd, 1H), 7,65 (m, 1H) , 7,53 (m, 1H) , 7,49 (m, 2H) , 6,93 (d, 1H) , 4,89 (d, 2H) , 3,88 (t, 4H) , 2,63 (t, 4H) , 2,41 (s, 3H). LCMS (ES): m/z 485 [M+l]+.

Exemplo de Referência 4

Adicionou-se AICI3 (130 mg, 0,97 mmol) a uma solução de éster (150 mg, 0,34 mmol), (l-metil-lH-imidazol-4-

il)metanamina (0,15 mL, 1,35 mmol) e DBU (2,00 mL, 1,33 mmol) em DCM (10 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante a noite. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (100 mL) e NaOH 6 N (25 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x50 mL), salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se 0 solvente sob pressão reduzida e purificou-se a mistura reacional em bruto por TLC preparativa em sílica (MeOH a 10%/DCM) para dar o produto desejado. LCMS (ES) : m/z 506 [M+l] +.

Exemplo de Referência 5

Adicionou-se AICI3 (80 mg, 0,60 mmol) a uma solução de éster (72 mg, 0,17 mmol), (5-metilpirazin-2-il)metanamina (0,10 mL, 0,81 mmol) e DBU (0,20 mL, 1,34 mmol) em DCM (10 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante 30 min. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (100 mL) e NaOH 3 N (25 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x50 mL), salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em ACN para dar ο produto desejado sob forma de um sólido branco (60 mg, 71%). LCMS (ES): m/z 500 [M+l]+.

Exemplo de Referência 6

Adicionou-se DBU (0,35 mL) e AICI3 (130 mg) a uma solução de éster (100 mg, 0,238 mmol) e ciclopropilamina (37,7 mg, 0,66 mmol) em DCM (10 mL). Agitou-se a mistura reacional à ta durante 2 horas. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (30 mL) e NaOH 6 N (10 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x10 mL), salmoura (20 mL) e secou-se sobre Na2S04. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em acetato de etilo para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco. LCMS (ES): m/z 431 [M+l]+.

Exemplo de Referência 7

Adicionou-se 1-metilpiperazina (370 mg, 3,66 mmol) e cloreto de alumínio (487 mg, 3,66 mmol) a uma suspensão espessa de éster de morfolina (1,0 g, 2,44 mmol) em cloreto de metileno (20 mL) e deixou-se a mistura a agitar à ta durante 2 horas. Removeu-se o solvente in vacuo e adicionou-se HC1 1 N (10 mL) , seguido de 2 mL de uma solução saturada de ácido tartárico, e agitou-se a mistura durante 30 minutos, até à homogeneidade, e diluiu-se com 50 mL de água. Extraiu-se a mistura resultante com 3x20 mL de acetato de etilo (descartado) e depois basificou-se com NaOH 1 N. Recolheu-se o sólido resultante por filtração, secou-se e triturou-se com acetonitrilo (20 mL) . A filtração produziu o composto final sob forma de um sólido branco (1,184 g, ligeiramente humedecido com acetonitrilo). LCMS (ES): m/z 464 [M+l]+.

Exemplo de Referência 8

Adicionou-se 1,2-aminoetilpirrolidina (418 mg, 3,66 mmol) e cloreto de alumínio (487 mg, 3,66 mmol) a uma suspensão espessa de éster de morfolina (1,0 g, 2,44 mmol) em cloreto de metileno (20 mL) e deixou-se a mistura a agitar à temperatura ambiente durante 2 horas. Removeu-se o solvente in vacuo e adicionou-se HC1 1 N (10 mL) , seguido de 2 mL de uma solução saturada de ácido tartárico, e agitou-se a mistura durante 30 minutos, até à homogeneidade, e diluiu-se com 50 mL de água. Extraiu-se a mistura resultante com 3x20 mL de acetato de etilo (descartado) e depois basificou-se com NaOH 1 N. Recolheu-se o sólido resultante por filtração, secou-se e triturou-se com acetonitrilo (20 mL) . A filtração produziu o composto final sob forma de um sólido branco (900 mg, 77%). LCMS (ES): m/z 478 [M+l]+.

Exemplo de Referência 9

Adicionou-se morfolina (7,5 mL, 85,74 mmol) a uma suspensão espessa de cloroéster (15,00 g, 41,81 mmol) em ACN (150 mL) e aqueceu-se a mistura em refluxo durante a noite. Arrefeceu-se a mistura reacional à ta e recolheu-se o precipitado por filtração. Dissolveu-se então o sólido em CHCI3 (600 mL) e passou-se através de uma camada de CELITE™. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em ACN para dar o produto desejado sob forma de um sólido esbranquiçado (14,00 g, 82%). aH RMN (CDCI3) δ: 9,36 (d, 1H) , 8,60 (d, 1H) , 7,70 (dd, 1H) , 7,47 (m, 1H) , 7,37 (m, 1H) , 6,84 (d, 1H) , 4,51 (q, 2H) , 3,92 (t, 4H) , 3,77 (t, 4H), 1,49 (t, 3H). LCMS (ES): m/z 410 [M+l]+.

Exemplo de Referência 10

Adicionou-se HC1 (2,0 mL, 4 M em dioxano) a uma solução de 2-(2,5-di-hidro-lH-pirrol-l-il)etilcarbamato de t-butilo (160 mg, 0,75 mmol) em DCM (1 mL). Agitou-se a mistura reacional à ta durante 2h. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e dissolveu-se de novo em DCM (10 mL) e DBU (0,56 mL, 3,74 mmol). Adicionou-se o éster (150 mg, 0,37 mmol) à mistura reacional, seguido de AICI3 (150 mg, 1,12 mmol) e agitou-se durante lh à ta. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (100 mL) e NaOH 3 N (50 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x50 mL) , salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e purificou-se a mistura reacional em bruto em coluna de silica gel (MeOH a 0-10%/DCM) para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (130 mg, 75%). Ή RMN (CDC13) δ: 10,60 (t, 1H) , 9,44 (d, 1H) , 8,62 (d, 1H) , 7,75 (dd, 1H) , 7,48 (m, 1H) , 7,44 (m, 1H) , 6,91 (d, 2H) , 5,78 (s, 4H) , 3,94 (t, 4H) , 3,81 (t, 4H) , 3,66 (q, 2H) , 3,63 (s, 4H) , 2,96 (t, 2H) . LCMS (ES): m/z 476 [M+l]+.

Exemplo de Referência 11

Adicionou-se AICI3 (150 mg, 1,12 mmol) a uma solução de éster (150 mg, 0,37 mmol), (l-metil-lH-imidazol-5- il)metanamina (0,15 mL, 1,35 mmol) e DBU (0,20 mL, 1,34 mmol) em DCM (10 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante 1 h, adicionou-se mais DBU (0,30 mL, 2,01 mmol) e agitou-se por mais 30 minutos. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (150 mL) e NaOH 6 N (25 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x50 mL) , salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2S04. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e purificou-se a mistura reacional em bruto por TLC preparativa em silica (MeOH a 10%/DCM) para dar o produto desejado (100 mg, 58%) . LCMS (ES): m/z 475 [M+l]+.

Exemplo de Referência 12

Adicionou-se AICI3 (100 mg, 0,75 mmol) a uma solução de éster (100 mg, 0,24 mmol), 2-(piperazin-l-il)pirimidina (0,10 mL, 0,61 mmol) e DBU (0,10 mL, 0,67 mmol) em DCM (10 mL). Agitou-se a mistura reacional à ta durante 2h. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (150 mL) e NaOH 6 N (25 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x50 mL), salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e purificou-se a mistura reacional em bruto em coluna de silica (MeOH a 0-5%/DCM) para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (80 mg, 63%) . LCMS (ES) : m/z 528 [M+l]+.

Exemplo de Referência 13

Adicionou-se AICI3 (750 mg, 5,62 mmol) a uma solução de éster (750 mg, 1,83 mmol), (l-metil-lH-imidazol-2- il)metanamina (0,50 mL, 4,50 mmol) e DBU (0,80 mL, 5,35 mmol) em DCM (50 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante 3 h. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (200 mL) e NaOH 3 N (100 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x100 mL), salmoura (100 mL) e secou-se sobre Na2S04. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e purificou-se a mistura reacional em bruto em coluna de silica (MeOH a 0-5%/DCM) para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (275 mg, 32%) . 2Η RMN (CDCls) δ: 11,0 (t, 1H) , 9,45 (d, 1H) , 8,61 (d, 1H) , 7,76 (dd, 1H) , 7,50 (m, 1H) , 7,45 (m, 1H) , 6,99 (d, 1H) , 6,90 (d, 1H) , 6,83 (d, 1H) , 4,82 (d, 2H) , 3,93 (t, 4H) , 3,81 (t, 4H) , 3,70 (s, 3H). LCMS (ES): m/z 475 [M+l]+.

Exemplo de Referência 14

Adicionou-se AICI3 (350 mg, 2,62 mmol) a uma solução de éster (500 mg, 1,22 mmol), 2-(2-metil-lH-imidazol-l- il)etanamina (325 mg, 2,60 mmol) e DBU (1,00 mL, 6,69 mmol) em DCM (50 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante a noite. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (200 mL) e NaOH 3 N (50 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x50 mL), salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em ACN para dar o produto desejado sob forma de um sólido esbranquiçado (360 mg, 60%). 1H RMN (CDCI3) δ: 10,77 (t, 1H) , 9,47 (d, 1H), 8,60 (d, 1H), 7,78 (dd, 1H), 7,53 (m, 1H) , 7,44 (m, 1H) , 6,93 (m, 3H) , 4,15 (t, 2H) , 3,94 (t, 4H) , 3,83 (t, 4H) , 3,79 (q, 2H) , 2,42 (s, 3H) . LCMS (ES): m/z 489 [M+l] +.

Exemplo de Referência 15

Adicionou-se AICI3 (75 mg, 0,56 mmol) a uma solução de éster (105 mg, 0,26 mmol), (l-metil-lH-imidazol-4- il)metanamina (0,10 mL, 0,90 mmol) e DBU (0,10 mL, 71 mmol) em DCM (10 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante a noite. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (100 mL) e NaOH 6 N (50 mL) e tartarato de potássio e sódio saturado (50 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x50 mL), salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e purificou-se a mistura reacional em bruto por TLC preparativa em silica (MeOH a 5%/DCM) para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (40 mg, 33%) . LCMS (ES) : m/z 475 [M+l]+.

Exemplo de Referência 16

Adicionou-se morfolina (2,8 mL, 32,01 mmol) a uma suspensão espessa de cloroéster (6,08 g, 16,14 mmol) em ACN (100 mL) e a aqueceu-se a mistura em refluxo durante 3 horas. Arrefeceu-se a mistura reacional para a ta e recolheu-se o precipitado por filtração. Dissolveu-se então o sólido em CHCI3 (200 mL) e passou-se por uma camada de CELITE™. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em ACN para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (5,00 g, 73%) . 1H RMN (CDCI3) δ: 9,37 (d, 1H) , 8,29 (d, 1H) , 7,72 (dd, 1H) , 7,47 (m, 1H) , 7,42 (m, 1H) , 4,50 (q, 2H) , 3,94 (t, 4H) , 3,81 (t, 4H) , 1,48 (t, 3H) . LCMS (ES): m/z 428 [M+l]+.

Exemplo de Referência 17

Adicionou-se AICI3 (645 mg, 4,84 mmol) a uma solução de éster (700 mg, 1,64 mmol) e 2-(l-metilpirrolidin-2-il)etanamina (0,70 mL, 4,83 mmol) em DCM (10 mL). Agitou-se a mistura reacional à ta durante 1 h. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (150 mL) , NaOH 6 N (50 mL) e tartarato de potássio e sódio saturado (50 mL) e agitou-se durante 10 min.

Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x50 mL) , salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em Et20/Et0Ac (1:1) para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (690 mg, 83%) . RMN (CDCI3) δ: 10,45 (d, 1H) , 9,41 (d, 1H) , 8,29 (d, 1H) , 7,76 (dd, 1H) , 7,50 (m, 1H) , 7,49 (m, 1H) , 3,96 (t, 4H) , 3,85 (t, 4H) , 3,55 (m, 2H) , 3,06 (m, 1H) , 2,34 (s, 3H) , 2,17 (m, 1H) , 2,08 (m, 3H) 1,80 (m, 2H) , 1,56 (m, 2H) . LCMS (ES) : m/z 510 [M+l]+.

Exemplo de Referência 18

Adicionou-se DBU (0,98 mL) e AICI3 (352,3 mg) a uma solução de éster (515 mg, 1,20 mmol) e C-(1-metil-lH-imidazol-2-il)metilamina (199,5, 1,79 mmol) em DCM (40 mL). Agitou-se a mistura reacional à ta durante a noite. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (100 mL) e NaOH 6 N (25 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x50 mL), salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em acetato de etilo para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco. LCMS (ES): m/z 493 [M+l] +.

Exemplo de Referência 19

Adicionou-se AICI3 (305 mg, 2,29 mmol) a uma solução de éster (300 mg, 0,70 mmol) e 1-metilpiperazina (0,25 mL, 2 25 mmol) em DCM (15 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante 1 h. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (100 mL) , NaOH 6 N (50 mL) e tartarato de potássio e sódio saturado (50 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H20 (2x50 mL), salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2S04. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em Et20/Et0Ac (1:1) para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (280 mg, 83%). *H RMN (CDCls) δ: 9,37 (d, 1H) , 8,29 (d, 1H) , 7,65 (dd, 1H) , 7,48 (m, 1H) , 7,40 (m, 1H) , 3,95 (t, 4H) , 3,88 (m, 2H) , 3,82 (t, 4H) , 3,48 (m, 2H) , 2,54 (m, 2H) , 2,44 (m, 2H), 2,32 (s, 3H). LCMS (ES): m/z 482 [M+l]+.

Exemplo de Referência 20

Aqueceu-se uma suspensão espessa de cloroéster (800 mg, 2,25 mmol) e pirrolidina (0,40 mL, 4,79 mmol) em DMF (5,0 mL) a 65°C durante 15 minutos num micro-ondas. Diluiu-se a mistura reacional com EtOAc (50 mL) e recolheu-se o precipitado resultante por filtração para dar o produto desejado. LCMS (ES): m/z 391 [M+l]+.

Exemplo de Referência 21

Adicionou-se AICI3 (680 mg, 5,10 mmol) a uma solução de éster (675 mg, 1,73 mmol), 2-(l-pirrolidin-2-il)etanamina (0,65 mL, 5,13 mmol) e DBU (0,75 mL, 5,02 mmol) em DCM

(30 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante 1,5 h. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (100 mL) , NaOH 6 N (50 mL) e tartarato de potássio e sódio saturado (50 mL) e agitou-se durante 15 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x100 mL), salmoura (100 mL) e secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e purificou-se a mistura reacional em bruto em coluna de silica-gel (MeOH a 5%/TEA a 2%/DCM) para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (538 mg, 68%) . 2Η RMN (CDCI3) δ: 9, 91 (t, 1H), 8,90 (d, 1H) , 8,45 (d, 1H) , 7,37 (m, 3H) , 6,52 (d, 1H), 4,00-3, 40 (s lg, 4H) , 3,81 (s, 3H) , 3,65 (q, 2H) , 2,79 (t, 2H) , 2,63 (m, 4H) , 2,14 (m, 4H) 1,81 (m, 4H). LCMS (ES): m/z 459 [M+l]+.

Exemplo de Referência 22

Fez-se reagir o cloroéster (1,0 eq, 250 mg, 2,67 mmol) com morfolina (0,29 mL) em NMP (1 mL) , sob aquecimento em micro-ondas a 100°C durante 5 min. Filtrou-se o sólido que se formou após o arrefecimento e lavou-se com NMP. Tratou-se o material com ultrassons em AcOEt quente e filtrou-se após arrefecimento. Isolou-se o produto 2 sob forma de um sólido branco (173 mg, 62% de rendimento) . LCMS (ES) : 95-s puro, m/z 425 [M+l] +.

Exemplo de Referência 23

Misturaram-se éster (1,0 eq, 312 mg, 0,73 mmol) e 2-(l-metilpirrolidin-2-il) etanamina (2,0 eq, 0/21 mL, 1,45 mmol) com DBU (4,0 eq, 0,44 mL, 2,94 mmol) em CH2Cl2 (5 mL) . Adicionou-se cloreto de alumínio (2,0 eq, 196 mg, 1,47 mmol) e agitou-se a mistura reacional a 45°C durante 5 horas.

Removeu-se o solvente in vacuo e tratou-se o sólido com uma solução aquosa saturada de ácido tartárico durante uma hora. Após a adição de água, ajustou-se o pH para 12-14 por adição de NaOH. Extraiu-se o produto com CH2CI2 (4x) . Lavaram-se os extratos combinados com água e salmoura, secou-se sobre Na2SC>4 e removeu-se o solvente in vacuo. Triturou-se o residuo numa mistura de AcOEt e hexanos, filtrou-se e secou-se para dar o composto desejado sob forma de um sólido esbranquiçado (318 mg, 85% de rendimento) . LCMS (ES) : 95% puro, m/z 507 [M+l]+.

Preparam-se os compostos da invenção que seguem na Tabela 1 pelo mesmo método, usando as aminas e ésteres etílicos de quinolona apropriados.

Tabela 1

F.ypmplo de Referência 24

Agitou-se uma solução de éster (6,53 g, 15,97 mmol) em etanolamj-na (30 mL) a 150°C durante a noite. Diluiu-se a mistura reacional com H2O (100 mL) e recolheu-se o precipitado resultante por filtração. Lavou-se o sólido com H2O (2x) e ACN (2x) para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (5,75 g, 85%). Ή RMN (DMSO-d6) δ: 10,57 (t, 1H) , 9,32 (d, 1H) , 8,36 (d, 1H) , 7,99 (dd, 1H) , 7,55 (m, 1H) , 7,48 (m, 1H) , 7,18 (d, 1H) , 4,85 (t, 1H) , 3,82 (t, 4H) , 3,75 (t, 4H) , 3,56 (q, 2H), 3,43 (q, 2H). LCMS (ES): m/z 425 [M+l]+.

Exemplo de Referência 25

Adicionou-se MsCl (0,20 mL, 2,58 mmol) a uma solução de álcool (500 mg, 1,18 mmol) e TEA (0,50 mL, 3,58 mmol) em DCM (30 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante lhe depois diluiu-se com DCM (100 mL) e NH4CI saturado (50 mL) . Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (100 mL) , salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2S04. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se a mistura reacional em bruto em ACN para dar o produto desejado sob forma de um sólido amarelo pálido (400 mg, 68%) . Usou-se o material tal e qual, sem posterior purificação. LCMS (ES): m/z 503 [M+l]+.

Exemplo de Referência 26

Aqueceu-se uma solução de mesilato (90 mg, 0,18 mmol), 2-fluoroetanamina (40 mg, 0,40 mmol) e TEA (0,05 mL) em NMP (1,5 mL) a 130°C durante 20 minutos num micro-ondas. Diluiu-se a mistura reacional com ACN (5 mL) e recolheu-se o precipitado resultante por filtração. Purificou-se a mistura reacional em bruto por TLC em sílica-gel (MeOH a 10%/DCM) para dar o Produto desejado. LCMS (ES): m/z 470 [M+l]+. ^j^iSplo de Referência 27

Aqueceu-se uma solução de mesilato (50 mg, 0,10 mmol), oiclopropilamina (0,10 mL, 1,75 mmol), HC1 (1 N, 0,05 mL) e TEA (0,05 mL) em NMP (1,5 mL), a 130°C durante 20 minutos num micro-ondas· Purificou-se a mistura reacional em bruto por HPLC em fase reversa para dar o produto desejado. RMN (CDCla) δ: 10,64 (t, 1H) , 9,45 (d, 1H) , 8,63 (d, 1H) , 7,77 (dd, 1H) , 7,50 (m, 1H) , 7,42 (m, 1H) , 6,92 (d, 1H) , 3,94 (t, 4H) , 3,82 (t, 4H) , 3,66 (q, 2H) , 3,01 (t, 2H) , 2,00 (m, 1H) , 0,43 (m, 4H). LCMS (ES): m/z 464 [M+l]+.

Exemplo de Referência 28

Aqueceu-se uma solução de mesilato (100 mg, 0,20 mmol), ciclobutilamina (0,10 mL, 1,41 mmol), HC1 (1 N, 0,05 mL) e TEA (0,05 mL) em ACN (2,0 mL) , a 120°C durante 15 minutos num micro-ondas. Recolheu-se o precipitado resultante por filtração e purificou-se por TLC em sílica-gel (MeOH a 15%/DCM) para dar o produto desejado (65 mg, 98%). LCMS (ES): m/z 478 [M+l] +.

Exemplo de Referência 29

Aqueceu-se o éster (0,5 g, 1,16 mmol) e etanolamina (0,7 mL, 11,63 mmol) em 3 mL de NMP, a 160°C durante 20 minutos (micro-ondas). Filtrou-se o sólido formado, lavou-se várias vezes com MeOH e deixou-se secar sob vácuo. Obteve-se o álcool sob forma de um sólido esbranquiçado e usou-se na etapa seguinte sem mais purificação. Adicionou-se MsCl ao álcool (0,204 g, 0,46 mmol) e trietilamina em DCM (10 mL) , à temperatura ambiente. Agitou-se a mistura durante 30 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se diclorometano (100 mL) e lavou-se a solução resultante com solução saturada de bicarbonato de sódio (2x100 mL) , salmoura (100 mL) , secou-se com sulfato de sódio e concentrou-se sob vácuo até se obter o mesilato sob forma de um sólido amarelo.

Exemplo de Referência 30

Aqueceu-se uma solução de mesilato (50 mg) e ciclopropilamina (0,2 mL) em ACN (1 mL), a 100°C durante 20 minutos (micro-ondas). Removeu-se o solvente sob vácuo e triturou-se o composto com acetato de etilo para dar um sólido branco. LCMS (ES): m/z 482 [M+l]+.

Exemplo de Referência 31

Aqueceu-se uma solução de mesilato (54 mg), cloridrato de ciclobutilamina (0,2 g) e TEA (0,2 mL) em ACN (1 mL) , a 90°C durante 1 hora (micro-ondas). Removeu-se o solvente sob vácuo e purificou-se o resíduo por TLC em sílica-gel (MeOH a 10%/DCM) para dar um sólido branco. LCMS (ES): m/z 482 [M+l]+.

Exemplo de Referência 32

Adicionou-se AICI3 (650 mg, 4,87 mmol) a uma solução de éster (1,00 g, 2,34 mmol), (l-metilpirrolidin-2-il)metanamina (1,20 g, 5,99 mmol) e DBU (1,80 mL, 12,06 mmol), em DCM (40 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante a noite. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (150 mL) e NaOH 1 N (50 mL) e agitou-se durante 15 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x100 mL), salmoura (100 mL) e secou-se sobre Na2S04. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em ACN para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco. LCMS (ES): m/z 582 [M+l]+.

Exemplo de Referência 33

Adicionou-se HC1 (3,0 mL, 4 M em dioxano) a uma solução de Boc-amina (321 mg, 0,55 mmol) em DCM (3,0 mL) , e agitou-se à ta durante lh. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (150 mL) e NaOH 6 N (50 mL) e agitou-se durante 10 min.

Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (250 mg, 94%) . RMN (CDCL3) δ: 10,63 (t, 1H), 9,44 (d, 1H), 8,33 (d, 1H), 7,77 (dd, 1H), 7,53 (m, 1H) , 7,44 (m, 1H) , 3,91 (t, 4H) , 3,86 (t, 4H) , 3,61 (m, 1H) , 3,43 (m, 2H) , 3,03 (m, 1H) , 2,94 (m, 1H) , 1,97 (m, 1H) , 1,85 (m, 1H) , 1,75 (m, 1H) , 1,52 (m, 1H) . LCMS (ES) : m/z 482 [M+l]+.

Exemplo de Referência 34

Adicionou-se iodometano (0,05 mL) a uma solução de amina (40 mg, 0,08 mmol) em DCM (5,0 mL) e TEA (0,05 mL) , e agitou-se à ta durante 10 min. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em ACN.

Purificou-se a mistura reacional em bruto por TLC em sílica-gel (MeOH a 10%/DCM) para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco. LCMS (ES): m/z 496 [M+l]+.

Exemplo de Referência 35

Sintetizou-se a cloroamida desejada com um rendimento de 72% segundo o procedimento que usa as condições do cloreto de alumínio e cloroéster e amina. LCMS (ES) : 95% puro, m/z 427 [M+l]+.

Exemplo de Referência 36

Misturaram-se a cloroamida (1,0 eq, 100 mg, 0,23 mmol) e ácido benzenoborónico (2,0 eq, 57 mg, 0,47 mmol) com acetato de sódio (3,0 eq, 58 mg, 0,70 mmol) em DMF (1 mL) . Após a adição de PdCl2 (dppf) (0,1 eq, 19 mg, 0,02 mmol), aqueceu-se a mistura sob micro-ondas a 100°C durante 5 min. Filtrou-se a solução através de CELITE™ e precipitou-se o material por adição de acetato de etilo e hexanos. Após purificação por HPLC preparativa, isolou-se o produto desejado sob forma de um sólido castanho (51 mg, 47% de rendimento) · LCMS (ES) : 95% puro, m/z 469 [M+l]+.

Exemplo de Referência 38

Síntese do Composto AI

Adicionou-se N-metilpiperazina (3,10 mL, 27,95 mmol) a uma suspensão espessa de cloroéster (5,00 g, 13,94 mmol) em CH3CN (50 mL), e aqueceu-se a mistura em refluxo durante a noite. Arrefeceu-se a mistura reacional à ta e recolheu-se 0 produto por filtração para dar o produto desejado sob forma de um sólido acastanhado (4,7 g, 80%). ΧΗ RMN (CDCI3) δ: 9,47 (d, 1H) , 8,62 (d, 1H), 7,74 (dd, 1H), 7,51 (m, 1H), 7,43 (m, 1H) , 6,89 (d, 4H) , 4,50 (q, 2H) , 3,85 (t, 4H) , 2,62 (t, 4H) , 2,40 (s, 3H) 1,49 (t, 3H). LCMS (ES): m/z 423 [M+l]+.

Adicionou-se AICI3 (80 mg, 0,60 mmol) a uma solução de éster (72 mg, 0,17 mmol), (5-metilpirazin-2-il)metanamina (0,10 mL, 0,81 mmol) e DBU (0,20 mL, 1,34 mmol) em DCM (10 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante 30 min. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (100 mL) e NaOH 3 N (25 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x50 mL), salmoura (50 mL) e secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em ACN para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (60 mg, 71%). LCMS (ES): m/z 500 [M+l]+.

Exemplo 1 Síntese do Composto A2

A uma suspensão espessa de cloroéster (3,51 g, 9,7 mmol) em CH3CN (50 mL), adicionaram-se N-metil-homopiperazina (1,34 mL, 10 mmol) e trietilamina (1,49 mL, 10 mmol). Aqueceu-se a mistura em refluxo durante a noite. Arrefeceu-se a mistura reacional para a ta e recolheu-se o produto por filtração para dar o produto desejado sob forma de um sólido acastanhado (2,85 g). LCMS (ES): m/z 437 [M+l]+.

Adicionou-se AICI3 (2,67 g) a uma solução de éster (2,85 mg, 6,63 mmol), (5-metilpirazin-2-il)metanamina (2,45 mL) e DBU (2,93 mL) em DCM (100 L). Agitou-se a mistura reacional à ta durante 30 min. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (100 mL) e NaOH 4 N (100 mL) e agitou-se durante 15 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x100 mL) e salmoura (100 mL) , secou-se sobre Na2SC>4. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em ACN para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (1,98 g). LCMS (ES): m/z 514 [M+l]+.

Exemplo 2 Síntese em Larga Escala do Composto A2

A uma suspensão espessa de cloroéster (20,0 g, 55, 90 mmol) em ACN (300 mL) , adicionou-se N-metil- homopiperazina (13,9 mL, 111,70 mmol) e aqueceu-se a mistura em refluxo durante a noite. Arrefeceu-se a mistura reacional para a ta e recolheu-se o precipitado por filtração. Dissolveu-se o sólido resultante em CHCI3 (500 mL) e filtrou-se através de CELITE™. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida para dar o produto desejado sob forma de um sólido (16,07 g, 66%). LCMS (ES): m/z 437 [M+l]+.

Composto A2

Adicionou-se AICI3 (2,05 g, 15,39 iranol) a uma solução de éster (2,24 mg, 5,15 mmol), 2-(aminometil)-5-metilpirazina

(1,27 mL, 10,32 mmol) e DBU (2,3 mL, 15,38 mmol) em DCM

(50 mL) . Agitou-se a mistura reacional à ta durante 30 min. Diluiu-se a mistura reacional com DCM (200 mL) e NaOH 3 N (50 mL) e agitou-se durante 10 min. Separaram-se as camadas e lavou-se a camada orgânica com H2O (2x100 mL) e salmoura (100 mL) , secou-se sobre Na2S04. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o sólido resultante em ACN para dar o produto desejado (1,80 g) sob forma de um sólido amarelo pálido. 1H RMN (CDCI3) δ: 11,28 (t, 1H) , 9,52 (d, 1H) , 8,57 (m, 2H) , 8,45 (d, 1H) , 7,74 (m, 1H) , 7,44 (m, 2H) , 6,78 (d, 1H) , 4,86 (d, 2H) , 3,90 (lg, 4H) , 2,86 (m, 2H) , 2,65 (m, 2H) , 2,56 (s, 3H) , 2,42 (s, 3H) , 2,15 (m, 2H) . LCMS (ES): m/z 485 [M+l]+. LCMS (ES) : m/z 514 [M+l] + .

Exemplo de Referência 39 Síntese do Composto A3

Agitou-se uma solução de éster (6,53 g, 15,97 mmol) em etanolamina (30 mL) a 150°C durante a noite. Diluiu-se a mistura reacional com H2O (100 mL) e recolheu-se o precipitado resultante por filtração. Lavou-se o sólido com H2O (2x) e ACN (2x) para dar o produto desejado sob forma de um sólido branco (5,75 g, 85%). Ή RMN (DMSO-d6) δ: 10,57 (t, 1H) , 9,32 (d, 1H) , 8,36 (d, 1H) , 7,99 (dd, 1H) , 7,55 (m, 1H) , 7,48 (m, 1H) , 7,18 (d, 1H) , 4,85 (t, 1H) , 3,82 (t, 4H),3,75 (t, 4H) , 3,56 (q, 2H), 3,43 (q, 2H). LCMS (ES): m/z 425 [M+l]+.

Composto A3

Adicionou-se MsCl (1,70 mL, 21,964 mmol) a uma solução de álcool (4,810 g, 11,343 mmol) e TEA (4,75 mL, 34,076 mmol) em DCM (125 mL). Agitou-se a mistura reacional à ta durante 2 h, diluiu-se com DCM (200 mL) e NH4CI sat. (50 mL). Separaram-se as camadas e secou-se a camada orgânica sobre Na2S04. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o produto da reação em bruto em ACN para dar o mesilato. Aqueceu-se uma solução desse mesilato, ciclopropilamina (2,20 mL, 33,570 mmol), HC1 (1 N, 1,0 mL) e TEA (4,75 mL, 34,076 mmol) em ACN (100 mL) , em refluxo durante a noite. Recolheu-se o precipitado por filtração e purificou-se em coluna de sílica-gel para dar a amina desejada sob forma de um sólido branco (1,2 g) . Ή RMN (CDCI3) δ: 10,64 (t, 1H) , 9,45 (d, 1H) , 8,63 (d, 1H) , 7,77 (dd, 1H) , 7,50 (m, 1H) , 7,42 (m, 1H) , 6,92 (d, 1H) , 3,94 (t, 4H) , 3,82 (t, 4H) , 3,66 (q, 2H) , 3,01 (t, 2H) , 2,00 (m, 1H) , 0,43 (m, 4H) . LCMS (ES) : m/z 464 [M+l]+.

Exemplo de Referência 40

Preparou-se o composto do Exemplo de Referência 40 pelo mesmo método do composto Al, usando a amina e o éster etílico de quinolona adequados. MM 499,6; LCMS (ES): m/z 500 [M+l]+.

Exemplo 3

Preparou-se o composto do Exemplo 3 pelo mesmo método do composto A2, usando a amina e o éster etílico de quinolona adequados. MM 501,61; LCMS (ES): m/z 502 [M+l]+.

Preparam-se os análogos (compostos da invenção) que se seguem na Tabela 6 pelo mesmo método, usando a amina e o éster etílico de quinolona adequados.

Tabela 6

Exemplo 4

Atividade Moduladora da Proliferação Celular

Descreve-se a seguir um protocolo de ensaio de proliferação celular representativo, usando corante Alamar Blue (armazenado a 4°C, 20 ul por poço).

Preparação da placa de 96 poços e tratamento com o composto a. Dividir e tripsinizar as células. b. Contar as células usando um hemocitómetro. c. Plaquear 4000 - 5000 células por poço, em 100 μΐ de meio, e semear numa placa de 96 poços segundo a seguinte disposição na placa. Adicionar nos poços B10 a B12 apenas meio de cultura celular. Os poços Bl a B9 têm células, mas não se adicionou composto.

d. Adicionar 100 μΐ de 2X diluição de fármaco a cada poço numa concentração mostrada na disposição de placa acima. Ao mesmo tempo, adicionar 100 μΐ de meio aos poços de controlo (poços B10 a B12). O volume total é de 200 μΐ/poço. e. Incubar durante quatro (4) dias a 37°C, CO2 a 5%, numa incubadora humidificada. f. Adicionar de 20 μΐ de reagente Alamar Blue a cada poço. g. Incubar durante quatro (4) horas a 37°C, CO2 a 5%, numa incubadora humidificada. h. Registar a fluorescência a um comprimento de onda de excitação de 544 nm e a um comprimento de onda de emissão de 590 nm usando um leitor de microplacas.

Nos ensaios, as células são cultivadas com um composto de teste por aproximadamente quatro dias, depois adiciona-se o corante às células e deteta-se a fluorescência do corante não reduzido passadas aproximadamente quatro horas. Podem utilizar-se diferentes tipos de células nos ensaios (e.g., células de carcinoma colorretal humano HCT-116, células de cancro da próstata humano PC-3 e células de carcinoma pancreático humano MiaPaca). São aqui facultados a seguir os efeitos antiproliferativos de compostos representativos.

Exemplo 5

Medição de valores de ARNm em Ensaios Celulares

Pode usar-se o método de PCR quantitativa (QPCR) em tempo real para detetar as alterações das cópias dos genes GAPDH de referência endógeno e c-myc alvo no mesmo tubo. Genericamente, semeiam-se células (15 000 células/poço) em placas de fundo plano de 96 poços (Corning, NI) e incubam-se em condições normais de crescimento durante a noite. No dia seguinte, substitui-se o meio de cultura por um que contenha os fármacos anticancerosos em várias concentrações e incuba-se por 4 h numa atmosfera humidificada de C02 a 5%, a 37°C. Extrai-se o ARN total (ARNt) usando o kit RNeasy 96 Kit (QIAGEN, CA) . Determina-se a concentração do ARNt com o Reagente de Quantificação de ARN RiboGreen (Molecular Probes, OR).

Pode realizar-se uma reação de transcrição inversa (RT) usando 50 ng de ARNt de cada poço em 25 μΐ de mistura reacional contendo tampão RT TaqMan lx, exâmeros aleatórios 2,5 uM, MgCl2 5,5 mM, cada desoxinucleósido-trifosfato (dNTP) 0,5 mM cada, transcritase inversa MultiScribe, 30 U, e inibidor de ARNase, 10 U. Incubam-se as reações de RT por 10 min a 25°C, realiza-se a transcrição reversa por 30 min a 48°C, inativam-se por 5 min a 95°C e colocam-se a 4°C. Todos os reagentes da RT podem ser adquiridos em Applied Biosystems, CA.

Pode realizar-se uma reação QPCR em tempo real em 50 μΐ de mistura reacional contendo os 5 μΐ de ADNc, mistura Universal de PCR Universal PCR Master Mix lx, conjunto de Sonda e Iniciadores pré-desenvolvidos para c-myc lx e conjunto de Sonda e Iniciadores pré-desenvolvidos para GAPDH 0,8x. Devido à abundância relativa de gene GAPDH em Hela, a concentração de sonda e iniciadores de GAPDH pode ser ajustada para obter ciclos limiares (Ct) precisos para os dois genes no mesmo tubo. 0 ciclo limiar (Ct) indica o número fracionário de ciclos a que a quantidade alvo amplificado alcança um limiar fixado. Ao fazer isso, a amplificação de GAPDH é interrompida antes de poder limitar os reaqentes comuns disponíveis para amplificação do c-myc. 0 valor ARn representa o sinal repórter normalizado menos o sinal de referência. 0 ARn aumenta durante a PCR à medida que o número de cópias de produto amplificado aumenta, até a reação se aproximar de um patamar. A sonda de c-myc é marcada com corante 6FAM™-MGB e a sonda de GAPDH é marcada com corante VIC™-MGB. Realiza-se pré-incubação durante 2 min, a 50°C, para ativar a enzima AmpErase UNG e depois durante 10 min, a 95°C, para ativar a ADN-Polimerase AmpliTaq. O ADN é amplificado por 40 ciclos de 15 s a 95°C e de 1 min a 60°C. Os ADNc de GAPDH e c-myc humanos são amplificados, detetados e quantificados em tempo real usando o sistema ABI Prism 7000 Sequence Detection (Applied Biosystems, CA), configurado para detetar os corantes repórter 6-FAM e VIC simultaneamente.

Os dados podem ser analisados usando o sistema ABI PRISM Sequence Detection e o Excel da Micosoft. Faz-se a quantificação relativa usando o método da curva padrão e o método do Ct comparativo ao mesmo tempo, dando os dois métodos resultados equivalentes. Sabe-se que o ciclo no qual o gráfico da amplificação cruza o Ct reflete rigorosamente valores de ARNm relativos. (Ver, Heid, et al., Genome Res. (1996) 6:986- 994; Gibson, et al., Gemome Res. (1996) 6:995-1001).

Preparam-se reações QPCR em triplicado para cada amostra de ADNc e calcula-se a média dos valores de Ct em triplicado. Todos os reagentes, incluindo o conjunto de sonda e iniciadores pré-desenvolvidos, podem ser adquiridos em Applied Biosystems, CA.

Exemplo 6

Caracterização in vitro

Podem usar-se vários métodos para a caracterização in vitro dos compostos da presente invenção, incluindo, mas sem a eles se limitar, i) ensaios de interrupção; ii) ensaio de competição quadruplex/duplex; iii) pegadas de quadromas (quadrome footprint) e iv) ensaio direto na ausência de uma molécula competidora.

Ensaios de Interrupção

Os ensaios de interrupção são um primeiro passo de rastreio de elevado desempenho para a deteção de fármacos que se ligam e estabilizam o quadruplex G alvo. Genericamente, é criado um oligonucleótido molde de ADN que contém a sequência de nucleótidos do quadruplex "alvo" em relação à qual se pretende rastrear o fármaco. Depois, hibrida-se um ADN iniciador marcado com fluorescência à extremidade 3' do ADN de molde. Introduz-se então uma ADN-polimerase como a polimerase Taq para sintetizar uma cadeia complementar de ADN por extensão a partir do iniciador marcado com fluorescência. Quando a progressão da polimerase Taq não tem obstáculos, esta sintetiza uma cópia de comprimento total do molde. A adição de um fármaco de teste que apenas se liga ao ADN duplex, mas que não se liga seletivamente à região quadruplex, resulta numa diminuição na síntese do produto de comprimento total e num aumento concomitante de cópias de ADN de comprimento variável. Se, contudo, o fármaco de teste se ligar seletivamente ao quadruplex e o estabilizar, a progressão da polimerase detém-se apenas no quadruplex e é sintetizado um "Produto de Interrupção" característico.

Os compostos são inicialmente rastreados numa única concentração e os "êxitos" são novamente testados numa gama de doses para determinar um valor de CI50 (i.e., a concentração de fármaco necessária para produzir uma razão produto de interrupção/produto de comprimento total de 1:1) . Estes produtos são visualizados por eletroforese capilar.

Ensaio de Competição Quadruplex/Duplex. A seletividade dos compostos para a sequência de quadruplex alvo relativamente ao ADN duplex pode ser medida usando um ensaio de competição (i.e., "triagem da seletividade"). Esta triagem da seletividade usa o ensaio de interrupção como sistema repórter para medir a capacidade relativa de uma sequência de ADN adicionada externamente competir com a estrutura quadruplex alvo formada no molde de ADN pela ligação ao fármaco. Por exemplo, os competidores são a sequência de quadruplex de c-myc, que é idêntica à sequência de quadruplex presente no ADN molde; ou um ADN plasmídico que imita o ADN duplex genómico complexo. 0 grau até ao qual cada competidor "absorve" com sucesso o fármaco em solução é refletido pela diminuição quantitativa na síntese do produto de interrupção. Desta forma, determinam-se as afinidades relativas de ligação do fármaco a ambos os ADN, duplex e quadruplex alvo.

Pegadas de Quadromas ("Quadrome Footprint").

Os compostos também podem ser avaliados quanto à sua capacidade de se ligar a outras estruturas quadruplex nativas de relevância biológica, incluindo elementos de controlo de quadruplex que regulam uma gama de oncogenes diferentes. Os dados resultantes são usados para criar vestígios de Quadroma.

Ensaio de Interação Direta.

Os compostos podem ser avaliados quanto à sua capacidade de interagir diretamente com ácidos nucleicos capazes de formar uma estrutura quadruplex, onde o ácido nucleico não é um ácido nucleico telomérico. 0 ensaio pode ser efetuado no mesmo recipiente ou em recipientes diferentes. Por exemplo, pode fazer-se contactar um composto com cada ácido nucleico no mesmo recipiente. Em alternativa, um composto pode contactar separadamente com cada um dos ácidos nucleicos testados num recipiente diferente. Um ácido nucleico telomérico, como é aqui usado, representa uma região de ácido nucleico altamente repetitiva na extremidade de um cromossoma. Conforme aqui usado, uma interação direta é medida sem a presença de um ácido nucleico competidor.

Uma interação entre o composto e o ácido nucleico pode ser determinada, por exemplo, medindo valores de CI50, que são indicativos da ligação e/ou estabilização do quadruplex. A seletividade das interações pode ser determinada, por exemplo, comparando os valores de CI50 medidos. Por exemplo, os valores de CI50 mais baixos podem ser usados para indicar uma interação forte entre o composto e o ácido nucleico, enquanto valores de CI50 mais altos mostram uma interação fraca; indicando assim seletividade de interação. Os produtos da reação podem ser caracterizados por eletroforese capilar.

Exemplo 7

Propriedades Farmacêuticas de Compostos RBI

Utilizou-se um procedimento de dosagem em cassete para determinar as propriedades farmacêuticas de compostos aqui divulgados. Neste procedimento, os compostos são selecionados para cada cassete (i.e., cocktail) assumindo que os sinais da espectrometria de massa para cada composto não vão interferir uns com os outros aquando da análise de espectrometria de massa (por exemplo, não se vão sobrepor) . A concentração de cada composto na cassete de dosagem é geralmente cerca de 20 mg/mL, para atingir um nivel de dose oral de 25 mg/kg em ratinhos ICR. Aspetos do procedimento de dosagem em cassete estão aqui descritos em seguida.

Desenvolvimento do método MS/MS

Preparar 0,5 mL de solução de dosagem a 20 mg/mL (em PBS ou veiculo de formulação) de 12 compostos de teste. Diluir uma solução de dosagem 20 vezes por transferência de 10 μ! de solução-mãe em 190 μΡ de acetonitrilo contendo ácido fórmico a 0,1%, para obter uma concentração final de 1 mg/mL. Diluir adicionalmente uma solução a 1 mg/mL, 1000 vezes, por transferência de 1 μL de solução-mãe em 999 μύ de acetonitrilo contendo ácido fórmico a 0,1%, para obter uma concentração final de 1 μρ/πΛ. Usar a solução a 1 μρ/mL para o desenvolvimento do método de espectrometria de massa com base em infusão direta. Determinar os espectros de massa precursor/produto de cada composto usando monitorização de reação múltipla (MRM). Comparar os espectros de massa precursor/produto de cada composto para assegurar que não ocorre interferência de reações cruzadas durante as medições de LC-MS/MS. Determinar a composição de todas as cassetes, com base nos espectros de massa de MRM.

Preparação da cassete de dosagem

Misturar 250 μ]1 de quatro soluções de dosagem preparadas e um padrão FC interno oral (20 mg/mL cada) de acordo com a conceção da cassete para obter uma concentração final de 4 mg/mL. Submeter as cassetes a vórtice severo e aplicar ultrassons para obter uma solução límpida ou uma suspensão homogénea. Usar as soluções em cassete para administrar a animais, por via de administração oral, doses de 25 mg/kg.

Animais e dosagem

Todas as experiências in vivo seguem protocolos aprovados pelo Comité para Uso e Cuidados com os Animais. Adquirem-se ratinhos ICR fêmeas (IcrTar:ICR), de 8-10 semanas de idade, na

Taconic (Hudson, Nova Iorque). Os ratinhos são mantidos num ciclo de 12h/12h de luz/escuridão com acesso ad libitum a água e comida. Após um periodo minimo de aclimatação de duas semanas, distribuem-se aleatoriamente os ratinhos em grupos com um tamanho de grupo minimo de quatro. Os animais usados para estudos farmacocinéticos têm uma gama de massa corporal de 25-35 g. Administra-se oralmente uma dose de 25 mg/kg (4 mg/ml) de uma cassete descrita no Exemplo 1 a ratinhos que foram mantidos em jejum durante a noite.

Preparação da amostra de sangue

Após a administração do composto, recolhem-se amostras de sangue em série, por punção retro-orbital com um tubo capilar, em vários momentos temporais (15, 30 minutos e 1, 2, 4, 6 e 8 horas) . Transferem-se as amostras para um tubo de microcentrifuga de 0,5 mL heparinizado e colocam-se em gelo. Separa-se o plasma por centrifugação e armazenam-se as amostras a -80°C até ao ensaio.

Preparação das soluções padrão de trabalho

Diluir uma solução de dosagem em cassete (4 mg/mL) quatro vezes por transferência de 25 μυ da solução-mãe em 75 μ]8 de acetonitrilo a 50%, contendo ácido fórmico a 0,1%, para obter uma concentração de 1 mg/mL. Diluir adicionalmente esta solução-mãe por diluições em série para fazer soluções padrão de trabalho de 0,01, 0,1, 1 e 5 μg/mL.

Preparação de uma solução de desativação

Preparar 500 mL de uma solução a 0,5 μg/mL de padrão interno bioanalitico usando acetonitrilo a 100% com ácido fórmico a 0,1%. Armazenar a solução de desativação num frasco bem selado, a 4°C.

Preparação do Padrão de Calibração para Análise

Transferir 15 μία de plasma de ratinho "branco" para uma placa de 96 poços e precipitar as proteinas do plasma pipetando 120 μ]1 de solução de desativação para todas as aliquotas de plasma. Cobrir a placa com uma cobertura de placa correspondente e misturar bem durante 30-60 segundos usando um agitador vertical de vários tubos.

Adicionar 15 μΙ; da solução padrão de trabalho da cassete correspondente ao plasma desativado e submeter a placa a vórtice por mais 30-60 segundos. Depois, centrifugar a placa a 4000 rpm, durante 10 minutos, a 4°C. Sem desfazer o sedimento de proteinas do plasma, transferir 120 μ]1 do sobrenadante para uma nova placa de 96 poços e secar a amostra sob azoto usando um evaporador de placas TurboVap® (Caliper Life Sciences; Hopkinton Massachusettes) . Reconstituir os residuos secos com 120 μL de acetonitrilo a 20% contendo ácido fórmico a 0,1%. Submeter a placa a vórtice durante 30-60 segundos e a análise LC-MS/MS (descrita posteriormente).

Preparação de Amostra de Estudo para Análise

Transferir 15 μΡ de plasma de ratinho "branco" para uma placa de 96 poços e precipitar as proteinas do plasma pipetando 120 μΡ de solução de desativação para todas as aliquotas de plasma. Cobrir a placa com uma cobertura de placa correspondente e misturar bem durante 30-60 segundos usando um agitador vertical de vários tubos.

Adicionar 15 μΡ da solução padrão de trabalho da cassete correspondente ao plasma desativado e submeter a placa a vórtice por mais 30-60 segundos. Adicionar 15 μΤ de acetonitrilo a 50%, contendo ácido fórmico a 0,1%, ao plasma desativado para corresponder à matriz e submeter a placa a vórtice por mais 30-60 segundos. Depois, centrifugar a placa a 4000 rpm, durante 10 minutos, a 4°C. Sem desfazer o sedimento de proteinas do plasma, transferir 120 μL do sobrenadante para uma nova placa de 96 poços e secar a amostra sob azoto usando um evaporador de placas TurboVap® (Caliper Life Sciences; Hopkinton Massachusettes). Reconstituir os residuos secos com 120 μL de acetonitrilo a 20% contendo ácido fórmico a 0,1%.

Submeter a placa a vórtice durante 30-60 segundos e a análise LC-MS/MS (descrita posteriormente).

Análise LC-MS/MS

Analisar as misturas reacionais quanto à quantidade de cada entidade quimica nas cassetes para a forma precursora, de acordo com as seguintes condições de HPLC:

Coluna: PHENOMENEX® Synergi™ Polar RP, 20,0 x 2,0 mm, 3 μΜ

Coluna de Guarda: PHENOMENEX® C18, 4,0 x 2,0 mm

Caudal: 0,25 mL/min

Temperatura da Coluna: 40°C

Temperatura da Amostra: 10°C

Volume de Injeção: 10 μ]1

Tempo de Execução: 3,5 min

Sistema de Solventes para Gradiente:

Solvente A: Ácido Fórmico a 0,1% em Água Solvente B: Ácido Fórmico a 0,1% em Acetonitrilo

Perfil do Gradiente de Solventes:

Parâmetros de Espectrometria de Massa:

Modo de MS: ESI (+)

Capilaridade: 3,5 kV Cone: 40 V Extrator: 3 V Lente RF: 0,2 V T da Fonte: 120°C T de Dessolvatação: 300°C Gás de Dessolvatação: 450 L/h Gás de Cone: 72 L/h Resolução LM: 15,0 Resolução HM: 15,0 Energia de Iões: 0,5 Multiplicador: 650

Análise Farmacocinética

Aplicar análise farmacocinética não compartimentada para administração oral. Registar as Cmax e Tmax observadas. Usar a regra do trapézio linear para calcular a AUC (0-8) de acordo com Gibaldi, M. e Perrier, D. Pharmacokinetics, Segunda Edição, Mercel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1982). São proporcionadas para referência dosagens em cassete e dados de biodisponibilidade representativos na Tabela 8, em conjunto com o ensaio de inibição de proliferação celular (do ensaio com Alamar Blue (AB)) (e.g., o Exemplo 4 aqui descrito) e o teste de inibição de ARNr (da PCR quantitativa (QPCR) ) (e.g., o Exemplo 5 aqui descrito).

Tabela 8. Dosagem em cassete, Dados de Biodisponibilidade e Dados de Atividade Farmacêutica Representativos

Exemplo 8

Avaliação de Propriedades Farmacocinéticas

Investigam-se as propriedades farmacocinéticas de fármacos em ratinhos ICR após um bólus intravenoso (IV) e doses orais (PO) de fármaco de 5 mg/kg e 25 mg/kg, respetivamente. Recolhem-se amostras de sangue em momentos predeterminados e separa-se o plasma. Separa-se o plasma das amostras de sangue recolhidas aos 5, 15 e 30 minutos e às 1, 2, 4, 8 e 24 horas pós-dosagem.

Quantificam-se os niveis de fármaco através do método de LC/MS/MS descrito acima. Recorre-se a análise farmacocinética não compartimentada para administração intravenosa. Usa-se uma regra do trapézio linear para calcular a AUC(0-24) ou a AUC (0-8) . Calculam-se os ti/2 terminal e Co usando os três últimos e os três primeiros pontos de informação, respetivamente.

Realiza-se a bioanálise usando um instrumento de LC/MS/MS Quattro Micro no modo de deteção MRM, com um padrão interno (IS) . Em resumo, preparam-se amostras de plasma de 15 μΕ para análise usando precipitação de proteinas com 120 μ]1 de acetonitrilo. Transferem-se os sobrenadantes para uma placa de 96 poços e sujeitam-se a análise LC-MS/MS usando uma coluna de HPLC PHENOMENEX® Polar-RP. As fases móveis são NH4HCO3 10 mM em água (Solução-A) e NH4HCO3 10 mM em metanol (Solução-B) . Equilibra-se a coluna inicialmente com Solução-B a 25% e, em seguida, com Solução-B a 100%, durante 5 minutos. O método tem uma gama dinâmica que varia entre 1 e 10 000 ng/mL. Realiza-se a quantificação de analitos em modo descontinuo com duas curvas de calibração de escalonamento de acordo com a lista de amostras bioanaliticas.

Exemplo 9

Ensaio de Inibição do Citocromo P450 (CYP450)

Os compostos da presente invenção podem ser avaliados quanto à atividade inibitória potencial contra isoenzimas do citocromo P450. Geralmente, preparam-se seis tubos de reação com 100 μΐ de uma solução contendo fosfato de potássio 50 mM, pH 7,4, NADP+ 2,6 mM, glicose-6-fosf ato 6,6 mM, 0,8 U de glicose-6-fosfato-desidrogenase/ml e diluições sucessivas de 1:6 do composto de teste, juntamente com seis tubos de diluições sucessivas de 1:6 de um inibidor de controlo positivo adequado. Iniciam-se as reações pela adição de 100 μΐ. de uma solução pré-aquecida de enzima/substrato aos tubos de reação. Prepara-se uma reação de controlo no momento zero por adição de 50 μΕ de acetonitrilo a 100 μΕ de solução de cofactor para inativar as enzimas e, em seguida, adição de 100 μΕ solução de enzima/substrato. Também pode ser preparada uma reação de controlo sem inibidor. Depois de uma incubação adequada a 37°C, suspendem-se as reações pela adição de 50 μΕ de acetonitrilo. Analisam-se as reações quanto às formas de metabolitos do substrato sonda usando LC/MS/MS.

Exemplo 10

Avaliação da Eficácia do Composto na Supressão de Tumores

Pode conceber-se uma experiência representativa para avaliar a eficácia dos compostos da presente invenção, em modelos de ratinho nu atimico de carcinoma humano, da seguinte maneira. Usam-se animais machos ou fêmeas (ratinho, Sim) (NCR, nu/nu) com idades de cinco a seis semanas e pesando mais de 20 gramas. Os animais são criados com esta finalidade e são experimentalmente naive no inicio do estudo. Os tumores são propagados a partir de células injetadas ou pela passagem de fragmentos de tumor. As linhagens celulares a serem usadas incluem, sem a elas se limitarem, alia Paca-2, HPAC, Hs700T, PanclO,05, Pane 02,13, PL45, SW 190, Hs 766T, CFPAC-1 e PANC-1.

Implantação de células. Inoculam-se por via subcutânea um a dez milhões de células suspensas em 0,1 ml de meio de cultura, com ou sem Matrigel (Collaborative Biomedical Products, inc, Bedford, MA)), no flanco direito de sessenta animais. Aplica-se apenas uma injeção por animal. Passados 7-14 dias da injeção, desenvolvem-se tumores até um tamanho adequado para uso no estudo, de aproximadamente 1,0 cm3. Considera-se um pequeno subgrupo de animais (<10/60). Os dadores e tumores crescem por 10-28 dias e até um tamanho de 1,5 cm3 para serem usados para transplantes em série.

Transplante de fragmentos. Sacrificam-se os animais doadores por eutanásia e retiram-se cirurgicamente os tumores e cortam-se em fragmentos de 2 mm3 de tamanho usando técnica asséptica. Anestesiam-se levemente com isoflurano os animais que vão ser implantados. Limpa-se a área a implantar com álcool a 70% e betadine. Implanta-se então um único fragmento subcutaneamente usando um trocarte.

Estudos de eficácia. Dividem-se aleatoriamente os animais portadores de tumor em grupos de 50 - 60. Por exemplo, num estudo representativo, podem dividir-se aleatoriamente os animais em três a oito grupos contendo 7 animais cada, como descrito na Tabela 9.

Tabela 9

*Veículo/Diluente **Usam-se compostos anticancerosos comercialmente disponíveis incluindo, mas não se limitando a, Taxol, CPT11 e Gencitabina, como controlos positivos.

Procedimento de Dosagem. Administram-se os compostos QD, QOD, Q3D ou uma vez por semana, por via IP, IV (veia lateral da cauda) ou PO. Doseiam-se os animais numa ordem sistemática que distribui o tempo de administração igualmente por todos os grupos. Para administração de bólus IP e PO, imobilizam-se os animais manualmente. Para administração de bólus IV ou infusão IV de curta duração (um minuto), imobilizam-se os animais mecanicamente, mas não são sedados. Usam-se seringas estéreis descartáveis para cada animal/dose. Testa-se também um composto de teste em combinação com cerca de 10-100 mg/kg (por exemplo, cerca de 40 mg/kg) de agente quimioterapêutico como gencitabicina, normalmente por administração IP uma vez por semana.

Exemplo 11

Avaliação das Doses Máximas Toleradas

Pode conceber-se uma experiência representativa para avaliar a dose máxima tolerada (DMT) dos compostos da presente invenção, da seguinte maneira.

Estudos de Toxicidade Aguda. Num estudo representativo para determinar a DMT depois de uma única dose, dividem-se aleatoriamente sessenta animais naive, por exemplo, em grupos de 10 animais (5 machos e 5 fêmeas) , e estes recebem um composto através de duas vias de administração ou dois compostos através de uma única via de administração. Verificou-se que uma única dose IV de 50 mg/kg era tolerada e é usada como niveis de dose baixos preliminares. A dose baixa para estudos orais baseia-se na tolerabilidade projetada e pode ser ajustada no sentido de a diminuir, se necessário. Um padrão representativo de niveis de dose, volumes de dose e concentração da solução na dose estão descritos na Tabela 10.

Tabela 10

Estudos Subcrónicos. Num estudo representativo para caracterizar as relações dose-resposta depois de dosagem repetida, dividem-se aleatoriamente vinte e cinco animais naive, por exemplo, em grupos contendo 5 animais cada, como descrito na Tabela 11. Cada estudo de duas semanas testa apenas um composto através de uma única via de administração numa dose ótima, proveniente dos dados recolhidos nos estudos anteriores de toxicidade aguda.

Tabela 11

Procedimentos de Dosagem. Administram-se os compostos QD, QOD, Q3D ou Q7D, por via IV (veia lateral da cauda) ou PO. Doseiam-se os animais numa ordem sistemática que distribui o tempo de administração igualmente por todos os grupos. Para dosagem PO, imobilizam-se manualmente os animais. Para dosagem de bólus IV ou infusão IV de curta duração (um minuto), imobilizam-se mecanicamente os animais, mas não são sedados. Usam-se seringas estéreis descartáveis para cada animal/dose.

Exemplo 12

Atividade Farmacêutica dos Compostos Al, A2 e A3

Determinou-se a atividade inibidora da proliferação celular dos Compostos Al, A2 e A3, usando um ensaio de viabilidade celular Alamar Blue (e.g., Exemplo 39 aqui descrito), utilizando uma variedade de tipos celulares que são representativos de diferentes cancros. Apresentam-se valores de inibição (Ciso) em concentrações micromolares na tabela seguinte (Tabela 12).

Tabela 12

Testaram-se também os Compostos Al, A2 e A3 quanto à inibição de tumores em roedores xenoenxertados. Administraram-se a roedores com tumores de xenoenxerto de células A375 doses de 100 mg/kg, 75 mg/kg e 100 mg/kg de Composto Al, A2 e A3, respetivamente, oralmente duas vezes por dia. Cada um destes compostos inibiu significativamente o crescimento do tumor A375 durante um período de sete dias, relativamente a um grupo de controlo não tratado.

Administraram-se também a roedores com tumores de xenoenxerto de MiaPaCa doses de 100 mg/kg de Composto AI e A3, oralmente duas vezes por dia. Cada um destes compostos inibiu significativamente o crescimento do tumor MiaPaCa durante um período de vinte e dois dias, relativamente a um grupo de controlo não tratado.

Exemplo 13

Dados representativos de CI50 com base em células

Determinou-se a atividade inibidora da proliferação celular de compostos representativos da invenção usando um ensaio de viabilidade celular Alamar Blue (e.g., Exemplo 39 aqui descrito), utilizando uma variedade de tipos celulares que são representativos de diferentes cancros. Na Tabela 13 e na Tabela 14 apresentam-se valores de inibição (CI50) em concentrações micromolares. O indica a estrutura e dados apresentados para referência.

Tabela 13

* * * * 1 1 1 1 1 1 1

*

Tabela 14

*

* *

Exemplo 14. Formas de Realização Representativas

As formas de realização seguintes são facultadas para ilustrar, mas não para limitar, a invenção. 1. Um composto de fórmula (VIII),

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; na qual: A e V são, independentemente, H, halo, azido, -CN, -CF3, -CONRiR2, -NR1R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°; cada Q é, independentemente, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR1R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°; em cada -NR1R2, R1 e R2 juntamente com N podem formar um anel azaciclico, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; R1 é H ou alquilo C1-C6, opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, ou =0; R2 é H ou alquilo C1-C10, heteroalquilo C1-C10, alcenilo C2-C10 ou heteroalcenilo C2-C10, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbocíclico ou heterocíclico com 3-7 membros, opcionalmente substituído; R3 é um alquilo C1-C10, alcenilo C2-C10, arilo C5-C10 ou arilalquilo C6-C12 opcionalmente substituído ou uma sua heteroforma, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbocíclico ou heterocíclico com 3-6 membros opcionalmente substituído; cada R4 é, independentemente, h ou alquilo C1-C6; ou R4 pode ser -W, -L-W ou -L-N(R)-W°; cada R é, independentemente, H ou alquilo C1-C6; R7 é H e R8 é alquilo C1-C4 substituído com um anel heterocíclico aromático opcionalmente substituído; m é 0, 1, 2, 3 ou 4; néO, 1, 2, 3, 4 ou 5; p é 0, 1, 2 ou 3; L é um ligante alquileno C1-C10, heteroalquileno C1-C10, alcenileno C2-C10 ou heteroalcenileno C2-C10, podendo cada um deles estar opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados no grupo que consiste em halogéneo, oxo(=0) ou alquilo C1-C6; W é um anel azacíclico com 4-7 membros, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como um membro do anel; e W° é um anel carbocíclico com 3-4 membros, opcionalmente substituído, ou um grupo alquilo C1-C6 substituído com 1 a 4 átomos de flúor. 2. 0 composto da forma de realização 1, no qual o anel heterocíclico aromático 0pcionalmente substituído é selecionado entre piridina, pirimidina, pirazina, imidazole, pirrolidina e tiazole. 3. Um composto de Fórmula (VII),

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; na qual: A e V são, independentemente, H, halo, azido, -CN, -CF3, -CONFER2, -NR!R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°; cada Q é, independentemente, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR!R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°; em cada -NR4R2, R1 e R2 juntamente com N podem formar um anel azaciclico, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; R1 é H ou alquilo C1-C6, opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, ou =0; R2 é H ou alquilo C1-C10, heteroalquilo C1-C10, alcenilo C2-C10 ou heteroalcenilo C2-C10, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbocíclico ou heterocíclico com 3-7 membros, opcionalmente substituído; R3 é um alquilo C1-C10, alcenilo C2-C10, arilo C5-C10 ou arilalquilo C6-C12, opcionalmente substituído, ou uma sua heteroforma, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbocíclico ou heterocíclico com 3-6 membros, opcionalmente substituído; cada R4 é, independentemente, H ou alquilo C1-C6; ou R4 pode ser -W, -L-W ou -L-N(R)-W°; cada R é, independentemente, H ou alquilo C1-C6; m é 0, 1, 2, 3 ou 4; néO, 1, 2, 3, 4 ou 5; p é 0, 1, 2 ou 3; L é um ligante alquileno C1-C10, heteroalquileno C1-C10, alcenileno C2-C10 ou heteroalcenileno C2-C10, podendo cada um deles estar opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados no grupo que consiste em halogéneo, oxo (=0) ou alquilo C1-C6; W é um anel azacíclico com 4-7 membros, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; e W° é um anel carbocíclico com 3-4 membros, opcionalmente substituído, ou um grupo alquilo C1-C6 substituído com 1 a 4 átomos de flúor. 4. 0 composto da forma de realização 3, no qual A e V são, independentemente, H ou halo. 5. 0 composto da forma de realização 3 ou 4, no qual R4 é H ou alquilo C1-C4. 6. 0 composto da forma de realização 3, 4 ou 5, no qual men são, cada um, 0. 7. 0 composto de qualquer uma das formas de realização 3-6, no qual pé 0 ou 1. 8. 0 composto de qualquer uma das formas de realização 3-7, tendo a estrutura:

ou um seu sal ou éster farmaceuticamente aceitável. 9. Um composto selecionado no grupo que consiste em:

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 10. Um composto selecionado no grupo que consiste nos compostos das Tabelas 1 e 6 e nos Exemplos, que não os facultados como referência, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 11. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer uma das formas de realização anteriores, ou um seu sal ou éster farmaceuticamente aceitável, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. 12. Uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um composto da forma de realização 1 ou um seu sal ou éster farmaceuticamente aceitável e um excipiente farmaceuticamente aceitável. 13. Um composto de fórmula (VIII) para utilização num método para tratar ou melhorar um distúrbio de proliferação celular num indivíduo,

(vm) Γ ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; no qual A, V, X, Q, m, n e p, R4, R7 e R8, são definidos como na forma de realização 1; desse modo tratando ou melhorando o referido distúrbio de proliferação celular. 14. Um composto para utilização num método para tratar ou melhorar um distúrbio de proliferação celular num indivíduo compreendendo administrar, a um indivíduo que dele necessite, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de qualquer uma das formas de realização 1-13, desse modo tratando ou melhorando o referido distúrbio de proliferação celular. 15. 0 composto para utilização da forma de realização 13 ou 14 em que o indivíduo é humano.

Embora a invenção tenha sido descrita em considerável detalhe em referência a uma ou mais formas de realização especificas, as pessoas competentes na matérias reconhecerão que se podem fazer alterações às formas de realização divulgadas especificamente neste pedido e ainda assim essas modificações e melhoramentos estão dentro do âmbito da invenção. A invenção aqui descrita de forma ilustrativa pode ser posta em prática de forma adequada na ausência de qualquer ou quaisquer elementos não especificamente aqui divulgados. Assim, por exemplo, em cada caso aqui considerado, qualquer dos termos "compreendendo", "consistindo fundamentalmente em" e "consistindo em" pode ser substituído por qualquer um dos outros dois.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composto de fórmula (VIII),

   (VIII) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; na qual: A e V são, independentemente, H, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR!R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°; cada Q é, independentemente, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR2R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°; em cada -NR2R2, R1 e R2 juntamente com N podem formar um anel azaciclico, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; R1 é H ou alquilo C1-C6, opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, ou =0; R2 é H ou alquilo C1-C10, heteroalquilo C1-C10, alcenilo C2-C10 ou heteroalcenilo C2-C10, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbocíclico ou heterociclico com 3-7 membros, opcionalmente substituído; R3 é um alquilo C1-C10, alcenilo C2-C10, arilo C5-C10 ou arilalquilo C6-C12 opcionalmente substituído, ou uma sua heteroforma, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbocíclico ou heterocíclico com 3-6 membros, opcionalmente substituído; cada R4 é, independentemente, H ou alquilo C1-C6; ou R4 pode ser -W, -L-W ou -L-N(R)-W°; cada R é, independentemente, H ou alquilo C1-C6; R7 é H e R8 é alquilo C1-C4 substituído com um anel heterocíclico aromático opcionalmente substituído; m é 0, 1, 2, 3 ou 4; néO, 1, 2, 3, 4 ou 5; p é 0, 1, 2 ou 3; L é um ligante alquileno C1-C10, heteroalquileno C1-C10, alcenileno C2-C10 ou heteroalcenileno C2-C10, podendo cada um deles estar opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados no grupo que consiste em halogéneo, oxo(=0) ou alquilo C1-C6; W é um anel azacíclico com 4-7 membros, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; e W° é um anel carbocíclico com 3-4 membros, opcionalmente substituído, ou um grupo alquilo C1-C6 substituído com 1 a 4 átomos de flúor.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R8 é um alquilo Ci-4 substituído com um anel heterocíclico aromático, opcionalmente substituído, selecionado entre piridina, pirimidina, pirazina, imidazole, pirrolidina e tiazole.
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 que tem a Fórmula (VII),

   ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; na qual: A e V são, independentemente, H, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR4R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°; cada Q é, independentemente, halo, azido, -CN, -CF3, -CONR1R2, -NR4R2, -SR2, -OR2, -R3, -W, -L-W, -W° ou -L-N(R)-W°; em cada -NR1R2, R1 e R2 juntamente com N podem formar um anel azacíclico, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; R1 é H ou alquilo C1-C6, opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, ou =0; R2 é H ou alquilo C1-C10, heteroalquilo C1-C10, alcenilo C2-C10 ou heteroalcenilo C2-C10, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbocíclico ou heterocíclico com 3-7 membros, opcionalmente substituído; R3 é um alquilo C1-C10, alcenilo C2-C10, arilo C5-C10 ou arilalquilo C6-C12 opcionalmente substituído, ou uma sua heteroforma, podendo estar cada um deles opcionalmente substituído com um ou mais halogéneos, =0 ou um anel carbocíclico ou heterocíclico com 3-6 membros, opcionalmente substituído; cada R4 é, independentemente, H ou alquilo C1-C6; ou R4 pode ser -W, -L-W ou -L-N(R)-W°; cada R é, independentemente, H ou alquilo C1-C6; m é Ο, 1, 2, 3 ou 4; néO, 1, 2, 3, 4 ou 5; p é 0, 1, 2 ou 3; L é um ligante alquileno C1-C10, heteroalquileno C1-C10, alcenileno C2-C10 ou heteroalcenileno C2-C10, podendo cada um deles estar opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados no grupo que consiste em halogéneo, oxo (=0) ou alquilo C1-C6; W é um anel azacíclico com 4-7 membros, opcionalmente substituído, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional selecionado entre N, 0 e S como membro do anel; e W° é um anel carbocíclico com 3-4 membros, opcionalmente substituído, ou um grupo alquilo C1-C6 substituído com 1 a 4 átomos de flúor.
4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 3, em que A e V são, independentemente, H ou halo.
5. 5. Composto de acordo com a reivindicação 3, em que R4 é H ou alquilo Cl-4.
6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 3, em que m e n são, cada um, 0.
7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 3, em que p é 0 ou 1.
8. 8. Composto de acordo com a reivindicação 3, possuindo a estrutura:

   ou um seu sal farmaceuticamente aceitavel.
9. 9. Composto de acordo com a reivindicação 1 que é selecionado no grupo que consiste em:

   ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
10. 10. Composição farmacêutica compreendendo um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
11. 11. Composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para utilização num método para tratar um distúrbio de proliferação celular.
12. 12. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o distúrbio de proliferação celular é um tumor ou cancro.
13. 13. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o distúrbio de proliferação celular é um distúrbio neoplásico hematopoiético.
14. 14. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o distúrbio de proliferação celular é um cancro colorretal, um cancro da mama, pulmão, figado, pâncreas, nódulos linfáticos, cólon, próstata, cérebro, cabeça e pescoço, pele, figado, rim e coração.